CN114746741A - 在厌氧条件下使用试卤灵监测细胞代谢活性 - Google Patents

在厌氧条件下使用试卤灵监测细胞代谢活性 Download PDF

Info

Publication number
CN114746741A
CN114746741A CN202080080563.XA CN202080080563A CN114746741A CN 114746741 A CN114746741 A CN 114746741A CN 202080080563 A CN202080080563 A CN 202080080563A CN 114746741 A CN114746741 A CN 114746741A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
resorufin
cell culture
microwells
platform
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080080563.XA
Other languages
English (en)
Inventor
J·邓恩
T·杰维尔
A·哈洛克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Separation Biology Co
Original Assignee
Separation Biology Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Separation Biology Co filed Critical Separation Biology Co
Publication of CN114746741A publication Critical patent/CN114746741A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于鉴定在厌氧大气中的包括试卤灵的细胞培养物中的至少一个细胞的状态的方法。在该方法中，使细胞培养物保持在厌氧大气中的同时，测量细胞培养物中的试卤灵还原为二氢试卤灵的程度。细胞培养物可装载到位于厌氧箱中的微制造芯片的微孔中，并且该测量可基于细胞培养物的荧光。

Description

在厌氧条件下使用试卤灵监测细胞代谢活性
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月13日提交的第63/009,398号美国临时申请和2019年10月18日提交的第62/923321号美国临时申请的优先权，其中每一项申请的公开内容均以引用方式整体并入本文。
背景技术
细胞活力、代谢活性和/或细胞增殖的测定在广泛的应用中很重要。
刃天青(7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮-10氧化物)是一种蓝色染料，本身呈弱荧光，直到不可逆地还原为粉红色且高荧光的试卤灵。还原环境与细胞生长密切相关，并且已知试卤灵无毒，因此它常用于动物细胞、细菌和真菌的细胞培养物分析，诸如细胞计数、细胞存活和细胞增殖。
刃天青的还原如下图所示：
Figure BDA0003650622570000011
在有氧(氧化)条件下，刃天青从氧化状态开始，通过细胞生长或细胞增殖还原为试卤灵。因此，监测刃天青的变化(即颜色和/或荧光)可用于指示在有氧条件下的细胞生长或细胞增殖。然而，在厌氧环境中，无法以同样的方式使用刃天青，由于环境本身会还原分子，因此无法区分细胞生长/增殖在哪里发生或没有发生。
用于指示厌氧箱中的细胞代谢活性的最常见方法是(1)比色指示剂和(2)光密度。然而，由于其低灵敏度，此类方法难以在微小体积的反应室中产生可靠的结果。
发明内容
在一方面中，本公开提供了一种用于鉴定在厌氧大气中的包括试卤灵的细胞培养物中的至少一个细胞的状态的方法。在该方法中，使细胞培养物保持在厌氧大气中的同时，测量细胞培养物中的试卤灵还原为二氢试卤灵的程度。
在一些实施例中，该测量包括测量细胞培养物的荧光。
在一些实施例中，该至少一个细胞可装载到微制造芯片的一个或多个微孔中。在一些实施例中，该至少一个细胞可装载到基于液滴的平台上的一个或多个液滴中。
该至少一个细胞可包括原核细胞、真核细胞或细菌细胞。
在一些实施例中，多次执行该测量。
在一些实施例中，可首先通过将试卤灵与培养基混合，然后将至少一个细胞与载有试卤灵的培养基组合，制备细胞培养物。
在一些实施例中，至少一个细胞的状态可包括至少一个细胞的代谢活性。
在一些实施例中，该方法还包括：基于测得的试卤灵还原为二氢试卤灵的程度，确定细胞培养物中存在或不存在至少一种生物实体。
在另一方面，提供了一种使用包括多个实验单位的高密度细胞培养平台的方法。该方法包括：将样本装载到高密度细胞培养平台上，使得多个实验单位中的至少一个实验单位包括至少一个细胞、一定量的营养物和试卤灵；在厌氧大气中培养来自至少一个实验单位中的至少一个细胞的多个细胞；并且测量至少一个实验单位的内容物的荧光。在一些实施例中，高密度细胞培养平台是微制造装置，该微制造装置的顶部表面将微孔阵列限定为实验单位，这些微孔的表面密度为每平方厘米至少500个微孔或每平方厘米至少750个微孔。在一些实施例中，这些微孔各自的体积不超过5nL。在一些实施例中，该方法还包括：基于测得的荧光，确定至少一个实验单位中存在或不存在至少一种生物实体。在一些实施例中，该方法还包括：基于测得的荧光，确定是否从多个细胞中选择一些细胞并将其转移到一个或多个目标位置。
在一些实施例中，高密度细胞培养平台是基于液滴的平台，并且多个实验单位各自包括基于液滴的平台上的液滴。
附图说明
图1是示出了根据一些实施例的微制造装置或芯片的透视图。
图2A至图2C分别是示出了根据一些实施例的微制造装置或芯片的尺寸的顶视图、侧视图和端视图。
图3A和图3B分别是示出了根据一些实施例的微制造装置或芯片的分解图和顶视图。
图4A示出了具有微孔阵列的微制造芯片在培养0小时、15小时和39小时时的图像；图4B示出了孔在0小时和15小时时的荧光信号强度；图4C示出了孔在0小时和39小时时的荧光信号强度。
图5是示出了使用本发明的方法的实施例从在微制造芯片平台上培养的特定粪便样本中回收的种级分离物的柱形图。
图6是示出了使用本发明的方法的实施例利用不同培养基从在微制造芯片平台上培养的特定粪便样本中回收的相关属级菌株种群的柱形图。
具体实施方式
本发明部分涉及细胞活力、代谢活性、细胞增殖和细胞毒性分析，特别适用于高通量装置。
本公开主题的一个目的是提供一种使用试卤灵基于细胞生长、代谢活性和/或活力来分析和/或筛选在厌氧条件或厌氧大气中的细胞的方法。
在一些实施例中，在高密度细胞培养平台上实施本公开的方法。培养平台可以是高度分区的系统，该系统包括一个或多个高密度微型实验单位阵列，其中，每个微型实验单位可容纳一个或多个细胞并且提供独立且与其他微型实验单位分开的环境，以供细胞培养、生长和增殖。
在一些实施例中，高密度细胞培养平台可以是微制造装置(或“芯片”)。如本文所用，微制造装置或芯片可限定高密度微孔(或实验单位)阵列。例如，包括“高密度”微孔的微制造芯片可包括每平方厘米约150个微孔至每平方厘米约160,000个或以上的微孔(例如每平方厘米至少150个微孔、每平方厘米至少250个微孔、每平方厘米至少400个微孔、每平方厘米至少500个微孔、每平方厘米至少750个微孔、每平方厘米至少1,000个微孔、每平方厘米至少2,500个微孔、每平方厘米至少5,000个微孔、每平方厘米至少7,500个微孔、每平方厘米至少10,000个微孔、每平方厘米至少50,000个微孔、每平方厘米至少100,000个微孔，或每平方厘米至少160,000个微孔)。微制造芯片的基板可包括约10,000,000个或10,000,000个以上的微孔或位置。例如，微孔阵列可包括至少96个位置、至少1,000个位置、至少5,000个位置、至少10,000个位置、至少50,000个位置、至少100,000个位置、至少500,000个位置、至少1,000,000个位置、至少5,000,000个位置，或至少10,000,000个位置。微孔阵列可以形成网格图案，并分组成单独的区域或区段。微孔的尺寸范围可以从纳米级(例如，直径从约1纳米到约100纳米)到微米级。例如，每个微孔的直径可为约1μm至约800μm、约25μm至约500μm或约30μm至约100μm。微孔的直径可为约1μm或小于1μm、约5μm或小于5μm、约10μm或小于10μm、约25μm或小于25μm、约50μm或小于50μm、约100μm或小于100μm、约200μm或小于200μm、约300μm或小于300μm、约400μm或小于400μm、约500μm或小于500μm、约600μm或小于600μm、约700μm或小于700μm，或约800μm或小于800μm。在示例性实施例中，微孔的直径可为约100μm或更小，或50μm或更小。微孔的深度可为约25μm至约100μm，例如约1μm、约5μm、约10μm、约25μm、约50μm、约100μm。微孔还可以具有更大的深度，例如约200μm、约300μm、约400μm、约500μm。微制造芯片可具有两个主表面：顶部表面和底面，其中微孔在顶部表面具有开口。微孔中的每个微孔可具有任何形状的开口或横截面，例如圆形、六边形、方形或其他形状。每个微孔可包括侧壁。对于其开口或横截面不是圆形的微孔，本文所述的微孔的直径是指具有等效面积的圆形的有效直径。例如，对于边长为10微米×10微米的方形微孔，具有等效面积(100平方微米)的圆的直径为11.3微米。每个微孔可包括一个或多个侧壁。侧壁可具有笔直、倾斜和/或弯曲的横截面轮廓。每个微孔包括底部，底部可以是平的、圆形的或其他形状。微制造芯片(其上具有微孔)可由聚合物(例如环烯烃聚合物)通过精密注射成型或一些其他工艺(诸如压花)制造。也可以使用其他结构材料，诸如硅和玻璃。芯片可具有基本上平坦的主表面。图1示出了微制造芯片的示意图，其边缘大体上平行于芯片上微孔的行和列的方向。
微制造芯片上的高密度微孔可用于容纳包括至少一种生物实体(例如，至少一种细胞)的样本。术语“生物实体”可包括但不限于生物体、细胞、细胞组分、细胞产物和病毒，术语“物种”可用于描述分类的单元，包括但不限于，操作分类单元(OTU)、基因型、种系型、表现型、生态型、履历、行为或相互作用、产物、变体和进化显著单元。微制造芯片上的高密度微孔可用于进行各种实验，诸如各类物种的细菌和其他微生物体(或微生物)诸如需氧、厌氧和/或兼性需氧微生物的生长、培养或筛选。微孔可用于进行真核细胞诸如哺乳动物细胞的实验。此外，微孔可用于进行各种基因组或蛋白质组学实验，并可包含细胞产物或组分，或其他化学或生物物质或实体，诸如细胞表面(例如，细胞膜或细胞壁)、代谢物、维生素、激素、神经递质、抗体、氨基酸、酶、蛋白质、糖类、ATP、脂质、核苷、核苷酸、核酸(例如，DNA或RNA)、化学品，例如，染料、酶底物等。
微制造芯片上的微孔的荧光筛选可能涉及通过光谱法检测微孔，例如，使用荧光检测器检测微孔发出的荧光，或微孔发出的荧光缺失，并且可选择那些被确定为满足特定标准(例如，发出特定波长的荧光或不发出特定波长的荧光)的微孔，并且将至少一个微孔的内容物或至少一个微孔的内容物的一部分转移到第二位置。
在一些实施例中，高密度细胞培养平台可以是基于液滴的，例如，分散液滴群可用于保持细胞、培养基以及用于细胞培养的其他组分，从而代替在微制造芯片上用作实验单位的孔阵列。液滴生成方法(尤其是与芯片上细胞分选仪类型的仪器结合使用时)可用于使复杂的环境样本中的微生物生长并对其进行筛选。可在几百赫兹下产生液滴，这意味着可在几个小时内产生数百万滴。可使用简单的基于微流控芯片的装置来生成液滴，并且可将液滴设计成包含单个细胞。用于生成含有细胞悬浮液的液滴的系统可含有一个细胞或少量细胞。液滴可以是乳液、双重乳液、水凝胶、气泡和复合颗粒等。例如，水性液滴可悬浮在不混溶液体中，使它们彼此分开并且不接触或污染任何表面。液滴的体积可介于10fL到1μL之间，高度单分散的液滴可制成为直径从几纳米至500μm。基于液滴的微流控系统可用于生成、操纵和/或培养小液滴。细胞存活和增殖可类似于本体溶液中的对照实验。可在芯片上以例如每秒500滴的速率进行液滴的荧光筛选。可将液滴合并以形成新液滴或添加到液滴中的试剂。可将液滴通过排成单行的微通道，并通过光谱法进行检测，例如，使用荧光检测器检测液滴发出的荧光，或检测液滴发出的荧光缺失，并且可经由分流至可汇集或收集液滴的分支通道，选择确定满足特定标准的液滴(例如，发出特定波长的荧光或不发出特定波长的荧光)。可通过阀门、泵、施加外部电场等来实现流体的分流或切换。
在各种实施例中，细胞可以是古细菌、细菌或真核生物(例如真菌)。例如，细胞可以是微生物，诸如需氧、厌氧或兼性需氧微生物。病毒可以是噬菌体。其他细胞组分/产物可包括但不限于蛋白质、氨基酸、酶、糖类、三磷酸腺苷(ATP)、脂质、核酸(例如DNA和RNA)、核苷、核苷酸、细胞膜/细胞壁、鞭毛、菌毛、细胞器、代谢物、维生素、激素、神经递质和抗体。
为了培养细胞，通常提供营养物。营养物可以是限定的(例如限定化学成分培养基或合成培养基)或不限定的(例如基础培养基或复合培养基)。营养物可包括实验室配制的和/或商业制造的培养基(例如，两种或多种化合物的混合物)，也可以是其组分。营养物可包括液体营养培养基(即，营养肉汤)，诸如海洋肉汤、溶原肉汤(例如，Luria肉汤)等，也可以是其组分。营养物可包括与琼脂混合的液体培养基以形成固体培养基和/或市售制造的琼脂平板，诸如血琼脂，也可以是其组分。
营养物可包括选择性培养基，也可以是选择性培养基的组分。例如，选择性培养基可用于仅特定生物实体的生长或仅用于具有特定特性(例如，抗生素抗性或特定代谢物的合成)的生物实体的生长。营养物可包括差异培养基，也可以是其组分，以在存在特定指示剂(例如，中性红、酚红、曙红y或亚甲基蓝)的情况下，通过使用生化特征将一种类型的生物实体与另一种类型的生物实体或其他类型的生物实体区分开来。
营养物可包括源自自然环境的提取物或培养基，也可以是其组分。例如，营养物可源自对特定类型的生物实体而言是天然的环境、不同的环境或多个环境。环境可包括但不限于以下中的一者或多者：生物组织(例如，结缔组织、肌肉、神经、上皮、植物表皮、血管、地面等)、生物流体或其他生物产物(例如，羊水、胆汁、血液、脑脊液、耵聍、渗出液、粪便、胃液、间质液、细胞内液、淋巴液、牛奶、粘液、瘤胃内容物、唾液、皮脂、精液、汗液、尿液、阴道分泌物、呕吐物等)、微生物悬浮液、空气(包括例如不同的气体含量)、超临界二氧化碳、土壤(包括例如矿物质、有机物质、气体、液体、生物体等)、沉积物(例如农业、海洋等)、活有机物质(例如植物、昆虫、其他小生物和微生物)、死有机物质、饲料(例如草、豆类、青贮饲料、作物残余物等)、矿物、油或油产品(如动物、植物、石化)、水(例如天然淡水、饮用水、海水等)和/或污水(例如卫生、商业、工业和/或农业废水和地表径流)。
图1是示出了根据一些实施例的微制造装置或芯片的透视图。芯片100包括以显微镜载玻片形式成形的基板，在顶部表面102上具有注模特征结构。这些特征结构包括四个单独的微孔阵列(或微阵列)104以及喷射器标记106。每个微阵列中的微孔以网格图案排列，芯片100的边缘周围以及微阵列104之间具有无孔边缘。
图2A至图2C分别是示出了根据一些实施例的芯片100的尺寸的顶视图、侧视图和端视图。在图2A中，芯片100的顶部约为25.5mm×75.5mm。在图2B中，芯片100的端部约为25.5mm×0.8mm。在图2C中，芯片100的侧面约为75.5mm×0.8mm。
在将样本装载到微制造装置上之后，可将膜施用到微制造装置的至少一部分上。图3A是根据一些实施例的从图3B中的俯视图所示的微制造装置300的分解图。装置300包括具有孔阵列302的芯片，孔阵列302容纳有例如土壤微生物。膜304放置在孔阵列302的顶部。垫圈306放置在膜304的顶部。具有填充孔310的盖308放置在垫圈306的顶部。最后，将密封带312施用到盖308上。
膜可覆盖包括一个或多个实验单位或微孔的微制造装置的至少一部分。例如，将样本装载到微制造装置上之后，可将至少一张膜施用于高密度微孔阵列的至少一个微孔上。可将多张膜施用于微制造装置的多个部分上。例如，可将单独的膜施用于高密度微孔阵列的单独子区段上。
膜可以连接、附着、部分附着、贴附、密封和/或部分密封至微制造装置以将至少一种生物实体保持在高密度微孔阵列的至少一个微孔中。例如，可使用层压法将膜可逆地贴附到微制造装置上。可将膜刺破、剥离、分离、部分分离、移除和/或部分移除，以接近高密度微孔阵列的至少一个微孔中的至少一个生物实体。
可将至少一个实验单位、孔或微孔中的细胞群的一部分附着于膜(例如通过吸附)。如果是这种情况，可通过剥离膜来取样至少一个实验单位、孔或微孔中的细胞群，使得至少一个实验单位、孔或微孔中的一部分细胞群保持附着于膜。
在一些实施例中，至少一个实验单位、孔或微孔中的细胞群可通过使用取样装置(诸如针或抽吸装置)刺穿膜并且将该至少一个实验单位中的细胞群的一部分转移到目标位置进行取样。
膜可以是不可渗透的、半渗透的、选择性渗透的、差异渗透的和/或部分渗透的，以允许至少一种营养物扩散到高密度微孔阵列的至少一个微孔中。例如，膜可包含天然材料和/或合成材料。膜可包括水凝胶层和/或滤纸。在一些实施例中，选择孔径足够小的膜，以将至少部分或全部细胞保持在微孔中。对于哺乳动物细胞，孔径可能只有几微米，但仍能保持细胞。然而，在一些实施例中，孔径可小于或等于约0.2μm，诸如0.1μm。不可渗透的膜的孔径接近于零。应当理解，膜可具有复杂的结构，其可能具有也可能不具有限定的孔径。
在一方面，本发明提供了一种用于评估在厌氧条件或厌氧大气中的纯细胞培养物或混合细胞培养物中的至少一个细胞的状态(例如代谢活性)的方法。可将细胞培养物装载在传统的细胞培养平台上，诸如皮氏培养皿或96孔板、384孔板的隔室中。也可以将它们装载在本文所述的高密度细胞培养平台的一个或多个实验单位中。可将细胞培养平台保持在供应有在厌氧条件下的细胞代谢活性所需的二氧化碳和氢气的厌氧箱。细胞培养物可由可渗透此类气体的膜覆盖。可通过试卤灵发出的荧光的强度对受监测区域(例如，板孔，或微制造芯片上的微孔，无论是否需要剥离膜)内的试卤灵的转化进行监测，分辨率足以区分培养平台中的不同细胞装载位置。测量结果能够指示细胞培养物中的一个或多个细胞的代谢活性水平。
如本文所用，细胞的代谢活性包括细胞生长、细胞分裂和增殖中的细胞活性。该至少一个细胞可包括原核细胞、真核细胞、细菌细胞等。
在一些实施例中，基于测得的试卤灵的荧光，确定细胞培养物中是否存在至少一种生物实体。例如，根据测得的荧光，可确定是否存在厌氧菌种类。在一些实施例中，基于测量结果，可从细胞培养物中选择/挑选一些细胞并将其转移到目标位置。
在厌氧条件下，刃天青很容易被细胞培养基或环境还原，因此不适合用作细胞的代谢活性的指示剂。在此类环境下，试卤灵＝>二氢试卤灵反应需要更多的还原电位，并且可按类似于更常见的用于检测细胞代谢活性的刃天青＝>试卤灵的方式使用试卤灵还原为二氢试卤灵。优选地，当在此类背景中使用试卤灵时，细胞可保持在高于试卤灵的还原电位，但仍然足够低以去除氧气并保持细胞存活。培养基的类型、PH值、试剂或培养基中的其他物种可能会影响细胞的还原电位和试卤灵的还原电位。
可获得粉末形式的试卤灵。然后，将其引入厌氧大气中的细胞培养基中，例如厌氧箱。任何残留在细胞培养物中的氧气可通过真空/利用CO2、N2和/或其他气体冲洗厌氧箱的方式排出。然后，可将装载有试卤灵的培养基装载到培养平台中，以进行荧光监测。
在其他实施例中，提供了一种使用包括多个实验单位的高密度细胞培养平台的方法，该方法包括：将样本装载到平台上，使得至少一个实验单位包括至少一个细胞、一定量的营养物(或培养基)和试卤灵；在厌氧大气中培养来自至少一个实验单位中的至少一个细胞的多个细胞；并且测量至少一个实验单位的内容物的荧光。在添加试卤灵一段预定时间之后，或直到最后两次测量结果之间的差异在预设容差范围内之前，可在培养过程期间的多个时间点进行测量。
在一些实施例中，高密度细胞培养平台是微制造装置，该微制造装置的顶部表面将微孔阵列限定为实验单位，这些微孔的表面密度为每平方厘米至少500个微孔或每平方厘米至少750个微孔。在一些实施例中，这些微孔各自的体积不超过5nL。
在一些实施例中，基于测得的荧光，确定至少一个微孔中是否存在至少一种生物实体。在一些实施例中，基于测得的荧光，该方法还包括从至少一个实验单位(例如，微孔)中选择一些细胞(一个或多个细胞)，并且将所选的至少一个细胞转移到目标位置(例如，在同一芯片上的另一个微孔、目的细胞培养室或96孔板中的孔等)。
示例1
在本例中，使用试卤灵指示剂监测在厌氧条件下的微制造芯片的微孔上的脆弱拟杆菌的生长。图4A示出了在培养0小时、15小时和39小时(以532nm激发的荧光)时的微制造芯片，其中，单个孔中的细菌的生长表示为荧光强度(或亮度)降低；图4B示出了在0小时与15小时时的信号强度，而图4C示出了在0小时与39小时时的信号强度，其中，代表信号减弱的微孔的蓝色(较暗)点为“阳性”并且包含细菌，而灰色(较浅阴影点)点为“阴性”并且是空的。通过将细菌细胞从微孔转移到96孔板中，结果得到了进一步证实，其中，阴性保持阴性，而阳性引发进一步生长(表示为培养基混浊)。
示例2
在本例中，对人体肠道微生物群(HGM)样本进行了处理和分析。更具体地，在微制造芯片上对人类粪便样本中的克隆菌群进行了厌氧培养，回收了许多存在于不到1％的微生物群体中的分离物。
组合分离库的一个关键方面是确保它们能够代表它们所衍生的微生物群落。使用皮氏培养皿进行培养时，可能会遗漏稀有物种和/或生长缓慢的物种。尽管它们可能只占微生物总体混合物的一小部分，但是稀有物种和/或生长缓慢的物种可能是维持群落整体平衡的关键因素，甚至可能是关键物种。如果稀有物种无法很好地适应所使用的培养基，或者如果它们天生生长缓慢，或者如果它们无法竞争得过数量众多且生长迅速的菌株，那么它们就可能会被遗漏。
在本示例中，经适当稀释的复合样本被稀释并分配到微制造装置的微孔(或阵列)中，使得每个微孔只包含单个细菌，从而菌株之间不会存在直接的生长竞争。其次，由于能够在高密度阵列平台上轻松且快速地进行多个并行实验，因此通过战略性地测试多种不同培养基来增加库多样性是切实可行的。
微制造芯片及其操作完全在厌氧箱内进行，使得所有步骤——从阵列装载和密封、阵列培育、阵列成像以进行培养物生长监测、将代谢活性培养物转移到96孔板中并密封以扩大规模，这些96-孔板的培育——均可以在样本从未离开厌氧箱的情况下完成，也无需管理数十个或数百个皮氏培养皿。
试卤灵用作HGM样本的厌氧代谢指示剂。由厌氧发酵的代谢副产物将试卤灵生物还原为二氢试卤灵的速度比由H2对试卤灵进行非生物还原更快，从而可以将空孔与包含培养物的孔区分开来。在厌氧条件下的这种区分是通过观察每个孔从零点时间到后续任何时间点的信号变化来实现。与空孔显示的非生物背景信号变化相比，荧光减弱幅度更大的孔被指定为培养物阳性。
方法
培养了具有配对宏基因组数据(马里兰州CosmosID)的健康人类粪便样本(科罗拉多州TheBioCollective)。对所有样本进行了初步实验，以确定合适的装载到微制造芯片的微孔阵列上的细胞密度，以实现最佳泊松分布，即包含单个细菌的孔的数量最大化，包含多个细菌的孔的数量最小化。每个孔装载0.3个细胞的目标通常会实现最佳的单独占用孔的数量。
阵列和所有塑料消耗品和设备均已经通过在厌氧箱内脱气一夜以适应厌氧条件。装载装置的所有部件在使用之前均已经过高压灭菌。在待测试的各种培养基中制备了细胞稀释液，与生长指示剂试卤灵混合至50μM的最终浓度，并且3.0mL的量装载到厌氧箱内的每个阵列上，然后进行密封。接下来，对阵列进行了扫描，以提供来自试卤灵的绿色荧光在零点时间的读数，并在37℃下厌氧培育16小时至65小时，每日成像以鉴定包含活性培养物的孔。将从显示阳性生长的一子组孔中取出的等分试样从阵列转移到96孔板中，并在厌氧条件下培育5日到10日。利用部分16SRNASanger测序鉴定出了分离物；那些在分类级别上分辨率不足的被排除在进一步分析之外。
在本示例中评估的培养基为岐阜厌氧培养基(GAM)、脑心浸液(BHI)、布鲁氏菌血琼脂(BRU)、蛋白胨酵母膏葡萄糖肉汤(PYGB)和含有碳水化合物的酵母酪蛋白脂肪酸琼脂(YCFAC)。
结果
对来自健康供体的具有配对宏基因组数据的六份独特人类粪便样本进行培养，并且产生了2790份分离物。分离物的Sanger测序表明具有5门9纲12目19科27属45种；柱形图示出了至少回收了六份分离物的23个物种(图5示出了从六名健康供体的粪便样本中回收的种级分离物)。
在有五份或更少份分离物的六份样本中鉴定出了另外的22个物种(见下表1)。
表1分离物≤5个的物种
Figure BDA0003650622570000101
Figure BDA0003650622570000111
在培养物中捕获这些分离物不仅相对罕见，而且几乎在每种情况下，配对宏基因组数据已经预测到在样本中发现的这些物种或属的普及率为≤0.2％。
用于种级鉴定的Sanger16SRNA测序数据与宏基因组数据预测的普及率的对比突出了基于微制造芯片的高密度培养平台在捕获稀有微生物群落成员方面的优势。从样本HGM-6中分离出来的33个物种代表5门8纲10目16科20属(见表2：从单个样本(HGM-6)中回收的分离物的种级分类群，其相对丰度百分比由宏基因组学(MTG)确定。在这些33个物种中，预计有18个物种的丰度＜1.0％，表明该系统能够分离稀有菌株。基于高密度平台的方法学也鉴定出了同一样本中的宏基因组分析未鉴定出的七个物种。
Figure BDA0003650622570000121
Figure BDA0003650622570000131
此外，对多个培养基进行了平行评估，以确定存在样本中可能存在的难以培养的菌株。参见图6，示出了在不同培养基捕获的属级菌株的相对数量。
本领域技术人员将理解，在不脱离大体上描述的本发明的精神或范围的情况下，可对如特定实施例中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施例在所有方面均被视为是说明性的而非限制性的。

Claims (17)

1.一种用于鉴定在厌氧大气中的包括试卤灵的细胞培养物中的至少一个细胞的状态的方法，所述方法包括：
使所述细胞培养物保持在厌氧大气中的同时，测量所述细胞培养物中的试卤灵还原为二氢试卤灵的程度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述测量包括测量所述细胞培养物的荧光。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个细胞装载到微制造芯片的一个或多个微孔中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个细胞装载到基于液滴的平台上的一个或多个液滴中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个细胞包括原核细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个细胞包括真核细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个细胞包括细菌细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，多次执行所述测量。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，首先通过将试卤灵与培养基混合，然后将所述至少一个细胞与所述载有试卤灵的培养基组合，制备所述细胞培养物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个细胞的状态包括所述至少一个细胞的代谢活性。
11.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：基于测得的试卤灵还原为二氢试卤灵的程度，确定所述细胞培养物中存在或不存在至少一种生物实体。
12.一种使用包括多个实验单位的高密度细胞培养平台的方法，所述方法包括：
将样本装载到所述高密度细胞培养平台上，使得所述多个实验单位中的至少一个实验单位包括至少一个细胞、一定量的营养物和试卤灵；
在厌氧大气中培养来自所述至少一个实验单位中的所述至少一个细胞的多个细胞；以及
测量所述至少一个实验单位的内容物的荧光。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述高密度细胞培养平台是微制造装置，所述微制造装置的顶部表面将微孔阵列限定为实验单位，所述微孔的表面密度为每平方厘米至少500个微孔或每平方厘米至少750个微孔。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述微孔各自的体积不超过5nL。
15.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括：基于测得的荧光，确定所述至少一个实验单位中存在或不存在至少一种生物实体。
16.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括：基于测得的荧光，确定是否从所述多个细胞中选择一些细胞并将其转移到一个或多个目标位置。
17.根据权利要求12所述的方法，其中，所述高密度细胞培养平台是基于液滴的平台，并且所述多个实验单位各自包括所述基于液滴的平台上的液滴。
CN202080080563.XA 2019-10-18 2020-10-18 在厌氧条件下使用试卤灵监测细胞代谢活性 Pending CN114746741A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962923321P 2019-10-18 2019-10-18
US62/923,321 2019-10-18
US202063009398P 2020-04-13 2020-04-13
US63/009,398 2020-04-13
PCT/US2020/056208 WO2021077057A1 (en) 2019-10-18 2020-10-18 Use of resorufin for monitoring metabolic activity of cells under anaerobic condition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114746741A true CN114746741A (zh) 2022-07-12

Family

ID=75490944

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080080563.XA Pending CN114746741A (zh) 2019-10-18 2020-10-18 在厌氧条件下使用试卤灵监测细胞代谢活性

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20210115367A1 (zh)
EP (1) EP4045897A4 (zh)
JP (1) JP2023500796A (zh)
CN (1) CN114746741A (zh)
AU (1) AU2020365149A1 (zh)
CA (1) CA3154848A1 (zh)
IL (1) IL292224A (zh)
WO (1) WO2021077057A1 (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030162164A1 (en) * 2001-04-20 2003-08-28 Biolog, Inc. Comparative phenotype analysis of cells, including testing of biologically active compounds
US7901947B2 (en) * 2006-04-18 2011-03-08 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based particle sorting
CA2966007C (en) * 2014-10-28 2019-10-22 The Governing Council Of The University Of Toronto Electrochemical metabolic activity detecting device
WO2017203046A1 (en) * 2016-05-26 2017-11-30 University College Cork - National University Of Ireland, Cork Methods for increasing proliferation of mammalian cells
AU2017289055A1 (en) * 2016-06-30 2018-12-20 General Automation Lab Technologies, Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods using magnetic beads for high throughput microbiology applications
US20190271693A1 (en) * 2016-11-28 2019-09-05 Sonanutech Inc. Methods, compositions, and kits for detecting bacteriophage in a sample
US20190300927A1 (en) * 2018-03-27 2019-10-03 SeLux Diagnostics, Inc. Metabolic assay for bacterial growth and gram typing

Also Published As

Publication number Publication date
IL292224A (en) 2022-06-01
JP2023500796A (ja) 2023-01-11
CA3154848A1 (en) 2021-04-22
EP4045897A4 (en) 2023-12-20
US20210115367A1 (en) 2021-04-22
AU2020365149A1 (en) 2022-04-28
WO2021077057A1 (en) 2021-04-22
EP4045897A1 (en) 2022-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107810277B (zh) 用于高通量微生物学应用的高分辨率系统、试剂盒、设备和方法
US20180023045A1 (en) High resolution systems, kits, apparatus, and methods using combinatorial media strategies for high throughput microbiology applications
US20170247652A1 (en) Device and Method for High Throughput Bacterial Isolation
US20190374945A1 (en) Method for assaying biological sample on microfabricated chip
JP2019520825A (ja) 磁性粒子を用いたハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置および方法
CN114746741A (zh) 在厌氧条件下使用试卤灵监测细胞代谢活性
JP2019535245A (ja) ハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置、並びに微生物その他のスクリーニング方法
US20220193666A1 (en) Screening of fluorescent microbes using microfabricated device
US20200347337A1 (en) Method of selecting microorganism isolates on a high-density growth platform
US20200360922A1 (en) Method for assaying biological sample on microfabricated chip
JP2019520826A (ja) ハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置、並びに結合的な媒体戦略を使用する方法
EP3478650B1 (en) Methods using lateral flow for high throughput microbiology applications

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination