CN118109271A - 一种数字式微生物平板培养芯片及其使用方法和应用 - Google Patents

一种数字式微生物平板培养芯片及其使用方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118109271A
CN118109271A CN202410348062.5A CN202410348062A CN118109271A CN 118109271 A CN118109271 A CN 118109271A CN 202410348062 A CN202410348062 A CN 202410348062A CN 118109271 A CN118109271 A CN 118109271A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
chip
substrate layer
microorganism
digital
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410348062.5A
Other languages
English (en)
Inventor
李刚
胡天保
刘燕舞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing University
Original Assignee
Chongqing University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing University filed Critical Chongqing University
Priority to CN202410348062.5A priority Critical patent/CN118109271A/zh
Publication of CN118109271A publication Critical patent/CN118109271A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物培养技术领域，具体公开了一种数字式微生物平板培养芯片及其使用方法和应用。本发明的数字式微生物平板培养芯片，包括基片层、盖片层；所述基片层上包含至少1个微腔阵列，所述微腔阵列包含至少1000个微腔；所述盖片层的组成成分包括水凝胶；所述芯片组装时，所述盖片层覆盖基片层所有微腔。该芯片具有低成本、高通量、操作简单、分离效率高和适应于更复杂、精细研究的优势，并且兼具固体培养基表面附着培养和液体培养基悬浮培养双重培养模式以及实时跟踪观察的优势，可以满足现代微生物学对简便、快速、多功能集成、复杂性微生物分析的需求。本发明还提供该微生物平板培养芯片的制备方法和使用方法及其应用。

Description

一种数字式微生物平板培养芯片及其使用方法和应用
技术领域
本发明涉及生物培养技术领域，尤其是涉及一种数字式微生物平板培养芯片及其使用方法和应用。
背景技术
微生物分析技术对于了解微生物及其在生态学、人类健康和工业生物技术中的作用至关重要，尽管微生物分析技术取得了巨大进步，但是目前基于培养的方法仍然是微生物分析的“黄金标准”。传统的基于平板培养的微生物分析方法存在操作繁琐、周转时间长(24h以上)和资源消耗大的问题，严重影响了微生物检测或分析的效率。近年来为了实现微生物的快速检测和分析，一些基于分子检测的微生物分析方法得到了发展，如聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)，尽管这些方法在分析微生物时具有高度的敏感性和特异性，但是其在应用中存在较大的局限性，包括需要额外的样品预处理、昂贵的试剂、繁琐的核酸扩增或抗原-抗体反应，以及需要经过专门培训的技术人员执行操作。更重要的是，基于分子检测的微生物分析方法无法给出微生物的生态信息和不同微生物种属之间的相互作用关系。另外，最近基质辅助激光解析/飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术也在微生物分析方面受到极大关注，正在成为临床微生物学实验室中快速分析、鉴定细菌的一项重要技术，但MALDI-TOF MS在微生物分析应用中仍存在一些较大的局限，例如无法区分一些特定种属的细菌、定量能力不足、技术复杂性高以及设备和耗材成本高，而且该技术通常仍需要预培养过程来提高细菌浓度或纯度。
近年来，液滴微流控技术被引入微生物学研究，正发展成为微生物学分析最强大和最有前景的工具之一。该技术具有可实现单个微生物随机封装和隔离培养的能力，从而为各种微生物学研究开辟了新的途径，包括病原菌的快速检测和药敏测试、稀有和难以培养的微生物的分离、微生物的精确计量、改良菌株的快速高通量筛选、同一菌落群体的表型异质性研究和环境微生物多样性研究。然而，液滴微流控技术在微生物研究应用中仍存在一些难以克服的问题：(1)该技术在微生物培养过程中，相邻液滴很容易发生融合，这极易影响微生物的分离，尽管利用表面活性剂可以提高油相中液滴的稳定性，但通常表面活性剂存在一定的细胞毒性，难以在高液滴稳定性和低细胞毒性之间取得平衡；(2)该技术的液滴内物质交换能力有限，给长期培养带来困难，尤其是对于代谢活跃的微生物而言；(3)该技术在实验中液滴是可以自由移动的，因而很难对大量单个液滴进行时序检测，因此不适合研究与时间相关的微生物问题；(4)该技术采用液体培养基培养模式，仅适用于悬浮生长型微生物的培养，不利于观察和记录微生物的生长形态；(5)目前大多数液滴微流控系统均依赖昂贵、庞大的驱动泵装备和复杂的流体控制，这对于普通实验室和非专业人士来说具有极大的挑战性。这些技术问题导致液滴微流控技术在微生物研究中的应用受到限制。
因此，为了突破传统微生物平板培养法和新发展的基于分子或质谱的微生物分析技术以及最新的液滴微流控微生物培养技术的局限，满足现代微生物学对简便、快速、多功能集成、复杂性微生物分析的需求，亟需发展高效、多功能、通用型的微生物培养技术。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种数字式微生物平板培养芯片。本发明的数字式微生物平板培养芯片适用于微生物或细胞的分离、纯化、鉴定、筛选、定量、药敏分析、多样性分析或异质性分析等多方面的应用，具有低成本、高通量、操作简单、分离效率高和适应于更复杂、精细研究的优势，并且兼具固体培养基表面附着培养和液体培养基悬浮培养双重培养模式以及实时跟踪观察的优势，可以满足现代微生物学对简便、快速、多功能集成、复杂性微生物分析的需求，并适用于细胞学相关研究。
本发明还提供上述数字式微生物平板培养芯片的制备方法。
本发明还提供上述数字式微生物平板培养芯片的使用方法。
本发明还提供上述数字式微生物平板培养芯片的应用。
本发明的第一方面，提供一种数字式微生物平板培养芯片，包括基片层、盖片层；
所述基片层上包含至少1个微腔阵列，所述微腔阵列包含至少1000个微腔；
所述盖片层的组成成分包括水凝胶；
所述芯片组装时，所述盖片层覆盖所述基片层所有微腔。
根据本发明的具体实施方式，本发明提供的数字式微生物平板培养芯片，至少具有如下有益效果：该数字式微生物平板培养芯片具有微型化、数字化和模块化三个典型特征，具有操作简便、高通量和低成本的优势，可以进行单个微生物或细胞的隔离培养，兼具固体培养基表面附着培养和液体培养基悬浮培养双重培养模式的优势，并且可以通过更换固体培养基盖片，实现快速、灵活调节单个微生物的生长微环境，具有高效筛选效率和实时跟踪观察能力，可以用于更大规模层次的微生物突变菌株筛选、多样性和生理通路研究。
本发明的数字式微生物平板培养芯片主要由两个功能层构成，基片层上含有至少1个高密度微腔阵列，每个微腔阵列包含至少1000个微腔，且每个微腔阵列中所有微腔的几何形状和大小均一致。盖片层的组成成分包括固体培养基，固体培养基的主要成分为水凝胶，固体培养基中还可以包含其它化学成分，如营养物质、筛选或鉴定用化合物、生物活性分子或药物。
根据本发明的一些实施方式，所述基片层的形状包括圆形、椭圆形、矩形、正方形或多边形，多边形的边数为N，N≥5。
根据本发明的一些实施方式，所述微腔为柱形，所述微腔的横截面为圆形、正三角形、正方形或规则正多边形，多边形的边数为N，N≥5。
根据本发明的一些实施方式，所述微腔的横截面直径或外接圆直径为10～1000μm。
根据本发明的一些实施方式，所述微腔的横截面直径或外接圆直径为10～500μm。
根据本发明的一些实施方式，所述微腔的横截面直径或外接圆直径为20～200μm。
根据本发明的一些实施方式，所述微腔的横截面直径或外接圆直径为50～100μm。
根据本发明的一些实施方式，所述基片层的结构面表面呈现疏水特性。
本发明数字式微生物平板培养芯片的基片层的结构面为疏水特性，以利于通过表面张力作用实现液样在微腔阵列中的离散化。
根据本发明的一些实施方式，所述基片层的材质为硅胶或环烯烃共聚物。
根据本发明的一些实施方式，所述基片层的材质为以硅胶或环烯烃共聚物为结构面、聚对苯二甲酸乙二醇酯为支撑基底的复合结构材质。
根据本发明的一些实施方式，所述硅胶为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
根据本发明的一些实施方式，所述盖片层的组成成分还包括营养成分、筛选或鉴定用化合物、或药敏分析的药物。
根据本发明的一些实施方式，所述盖片层的组成成分还包括营养成分，和，筛选或鉴定用化合物、或药敏分析的药物。
根据本发明的一些实施方式，所述筛选或鉴定用化合物为能特异性筛选某一类微生物或细胞的化合物，或，能与某一类微生物或细胞的代谢物产生颜色反应的化合物。
根据本发明的一些实施方式，所述水凝胶的制备原料包括琼脂、明胶或硅胶中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述盖片层的组成成分还包括生物活性分子。
根据本发明的一些实施方式，所述盖片层为固体培养基，所述固体培养基中还含有筛选或鉴定用化合物、或药敏分析的药物。
根据本发明的一些实施方式，所述盖片层的厚度为0.1～10mm。
根据本发明的一些实施方式，所述盖片层的厚度为0.2～5mm。
根据本发明的一些实施方式，所述盖片层的厚度为1～5mm。
根据本发明的一些实施方式，所述盖片层与基片层的贴合面为完全平整的平面。
根据本发明的一些实施方式，所述盖片层在使用前根据实验或检测需要临时配置，或使用商业化的即用型固体培养基平板。
本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述的数字式微生物平板培养芯片的制备方法，包括以下步骤：
S1、基片层制备：使用软光刻技术制备集成微腔阵列的基片层，灭菌处理；
S2、盖片层制备：配置水凝胶溶液，灭菌后倒入底部平整光滑的模具中，冷却固化后剥离，即得盖片层。
根据本发明的一些实施方式，所述水凝胶溶液中还包括营养成分、筛选或鉴定用化合物、或药敏分析的药物。
根据本发明的一些实施方式，所述灭菌处理的方法为10～20min的110～130℃高温灭菌处理。
本发明数字式微生物平板培养芯片的制备方法简单高效，适于大规模工业化生产，既可以根据实验需要临时制备，又可以制备成多种型号的预制即用型平板培养芯片，根据实验需要进行选择。
本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的数字式微生物平板培养芯片的使用方法，包括以下步骤：
S1、样品加载和离散化：将样品液加入到基片层的微腔中，实现样品溶液在基片层微腔阵列中的离散化分配；
S2、基片层表面除杂：将灭菌的胶带贴于步骤S1得到的基片层微腔阵列表面，快速剥离除去微腔外基片层表明残余的样品液；
S3、芯片组装：将盖片层贴附于步骤S2得到的基片层表面，覆盖所有微腔；
S4、培养：将组装的芯片置于适宜温度、湿度环境下培养；
S5、观察分析：将完成培养的芯片置于显微镜下，对芯片中形成的菌落进行计数、形态特征分析或光学特性分析。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S1的样品加载和离散化的具体步骤可以选自S11、S12中的任意一种：
S11、将基片层浸入样品液中，3～5min后垂直提起，利用不连续去润湿效应实现样品液在微腔阵列中的离散化分配；
S12、将基片层与集成了进样微管道阵列的PDMS盖片对准贴合，置于真空容器中进行至少30min脱气处理，取出后在盖片进样口滴加样品液，通过微腔/微管道中负压驱动进样口样品液进入并充满芯片整个微腔/微管道体系，剥离PDMS盖片，实现样品溶液在基片层微腔阵列中的离散化分配。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S2的胶带包括3M胶带。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S4的培养具体为在饱和湿度盒中适当温度下温育一定时间。
根据本发明的一些实施方式，所述观察分析还包括挑取菌落进行基因鉴定分析。
根据本发明的一些实施方式，所述数字式微生物平板培养芯片用于微生物或细胞分离、鉴定时，盖片层中还使用了鉴定化学成分，通过待鉴定微生物或细胞产生的代谢产物与鉴定化学成分的反应现象来进行鉴定。
根据本发明的一些实施方式，所述数字式微生物平板培养芯片用于微生物或细胞分离、鉴定时，所述使用方法的步骤还包括A)或B)中的一种；其中，
A)使用包含鉴定化学成分的固体培养基作为盖片层，组装芯片，培养，通过培养过程中待鉴定微生物产生的代谢产物与盖片中鉴定化学成分的反应现象来进行鉴定；
B)使用未包含鉴定化学成分的固体培养基作为盖片层，组装芯片，培养一定时间后，将包含鉴定化学成分的溶液滴加至固体培养基盖片上，鉴定化学成分通过毛细作用被固体培养基盖片吸收，并通过扩散作用进入基片层各微腔，与微腔中待鉴定微生物产生的代谢产物发生反应，通过反应现象实现鉴定。
根据本发明的一些实施方式，所述数字式微生物平板培养芯片用于“未培养/难培养”微生物分离培养时，所述样品液为“未培养/难培养”微生物样品液，所述步骤S4的培养还包括将芯片置于“未培养/难培养”微生物采集的原生环境，或，收集“未培养/难培养”微生物采集的原生环境中的提取液滴加至固体培养基盖片层。
根据本发明的一些实施方式，所述数字式微生物平板培养芯片用于“未培养/难培养”微生物分离培养时，所述样品液为“未培养/难培养”微生物样品液，所述使用方法的步骤还包括C)或D)中的一种；
C)使用未包含营养物质、生物活性分子或药物的固体培养基作为盖片层，组装芯片，利用中空夹具固定组装后的芯片，确保固体培养基盖片覆盖微腔阵列区域暴露，将夹具固定的芯片埋入或浸入待培养的“未培养/难培养”微生物采集的原生环境，培养一定时间后，取出并解离芯片，将芯片微生物培养基片层置于显微镜下观察微菌落生长情况，并逐一挑取菌落进行基因鉴定分析；
D)使用未包含营养物质、生物活性分子或药物的固体培养基作为盖片层，组装芯片，利用中空夹具固定组装后的芯片，确保固体培养基盖片覆盖微腔阵列区域暴露，周期性收集待培养的“未培养/难培养”微生物采集区域原生环境中的提取液，并滴加至夹具固定芯片的固体培养基盖片层暴露区域，培养一定时间后，取出并解离芯片，将芯片微生物培养基片层置于显微镜下观察微菌落生长情况，并逐一挑取菌落进行基因鉴定分析。
本发明数字式微生物平板培养芯片的使用方法具有操作简便、无需繁琐的手动涂板、分离效率高等优势。
本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的数字式微生物平板培养芯片和本发明第三方面所述的使用方法在a)～h)中的一种或多种的应用：
a)微生物或细胞的分离；
b)微生物或细胞的纯化；
c)微生物或细胞的鉴定；
d)微生物或细胞的筛选；
e)微生物或细胞的定量；
f)微生物或细胞的药敏分析；
g)微生物或细胞的多样性分析；
h)微生物或细胞的异质性分析。
本发明的有益效果：
(1)本发明的数字式微生物平板培养芯片具有微型化、数字化和模块化三个典型特征；
(2)操作更简便，无需繁琐的手动涂板；
(3)具有高通量的优势，可以根据需要调整微腔数量范围，并且试剂和样本的消耗量很少；
(4)可以封装单个微生物于微腔中，进行隔离培养，避免了因不同菌种生长速度差异和种间竞争导致的培养偏倚，有利于研究复杂样本中的稀有和生长缓慢的微生物，可以大幅提高稀有菌株的分离效率，可以在大的动态范围内实现准确菌落计数；
(5)可以通过更换固体培养基盖片，实现快速、灵活调节单个微生物的生长微环境，有利于实现更复杂、精细的微生物研究；
(6)可以在大规模微生物群体中快速、高效筛选稀有的突变菌株；
(7)可以在单细胞层次实现快速、准确的细菌药敏测试；
(8)可以更准确地揭示微生物群体异质性；
(9)可以在更大规模层次上揭示环境微生物的复杂多样性；
(10)纳升甚至皮升级微腔中微生物产生的代谢物可以快速积累，有助于加快基于生化分析的微生物鉴定和基于浓度依赖的生理通路(如群体感应等)的研究；
(11)兼具固体培养基表面附着培养和液体培养基悬浮培养双重培养模式的优势，适用于更多种类微生物的培养；
(12)易于与显微镜装置结合，实时跟踪微生物生长过程；
(13)在细胞相关研究如功能性单细胞分离和筛选中同样具备上述优点。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明的一种数字式微生物平板培养芯片及应用概念示意图；
图2为本发明的一种数字式微生物平板培养芯片使用流程示意图；
图3为本发明实施例1制作的数字式微生物平板培养芯片应用于微生物分离纯化培养流程示意图；
图4为本发明实施例2制作的数字式微生物平板培养芯片应用于微生物快速分离和鉴定流程示意图；
图5为本发明实施例3制作的数字式微生物平板培养芯片应用于微生物样品的活菌准确定量流程示意图；
图6为本发明实施例4制作的数字式微生物平板培养芯片应用于微生物异质耐药性研究流程示意图；
图7为本发明实施例5制作的数字式微生物平板培养芯片应用于工业微生物育种筛选流程示意图；
图8为本发明实施例6制作的数字式微生物平板培养芯片应用于病原菌药敏测试流程示意图；
图9为本发明实施例7制作的数字式微生物平板培养芯片应用于“未培养/难培养”微生物分离培养流程示意图；
图10为本发明实施例8制作的数字式微生物平板培养芯片应用于功能性单细胞分离、筛选流程示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供数字式微生物平板培养芯片在微生物分离纯化培养中的应用，以数字式微生物平板培养芯片应用于从土壤中分离解磷菌为例，应用示意图如图3所示，具体实施步骤如下：
(1)微生物培养基片层的制备：
利用传统软光刻技术制作集成微腔阵列的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄片作为数字式微生物平板培养芯片的微生物培养基片层，PDMS薄片的面积和载玻片大小一致，薄片上有约11万个微腔，每个微腔的直径70μm，深60μm，将制备的芯片基片层进行15min的121℃高温灭菌处理，作为微生物培养基片层备用。
(2)样本制备：
取植物根部附近的土壤10g，放入盛有90mL无菌水的三角杯中，振荡分散均匀，制成稀释倍数为10-1的土壤悬液，静置后，取上清液进行10倍梯度稀释，依次制备得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度的包含土壤微生物的样品液。
(3)固体培养基盖片层的制备：
称取适量PVK培养基(解磷菌无机磷固体培养基)，加入去离子水，搅拌后加热促溶，调pH为7.0，121℃高温灭菌15min，快速倒入一个底部平整光滑的矩形方框中，并用胶片加盖压平，待室温中冷却固化后，从方框中剥离取出制备的PVK培养基盖片，厚度为3mm，作为固体培养基盖片层备用。
(4)样品液填充和离散化：
将步骤(1)制得的基片层与一片集成了管道和进样口的PDMS盖片层对准贴合，置于真空容器中进行至少30min的脱气处理，去除“基片/盖片”组合体，迅速在进样口加入30μL步骤(2)准备的稀释度为10-4的微生物样品液，利用脱气PDMS袖手微管道/微腔中空气形成负压，驱动样品液进入微管道，填充微管道/微腔空间，待芯片所有微管道/微腔空间全部充满样品液后，将PDMS盖片层从基片层上剥离，使得基片层上所有微腔中样品液各自独立，形成数字化、离散样液。
(5)基片表面除杂：
将一片经灭菌处理的3M胶带轻轻贴附于步骤(4)完成样品离散化的基片层表面，并快速剥离，以清除基片层微腔腔室外上表面的残余样品液。
(6)芯片组装：
将步骤(3)制备的固体培养基盖片层贴附于经步骤(5)完成表面除杂的基片层表面，保证盖片层覆盖基片层的所有微腔。
(7)温育培养：
将步骤(6)组装的芯片放入一个饱和湿度盒中，并置于培养箱中，于30℃培养36h。
(8)纯化：
将完成温育培养的芯片置于显微镜下，对芯片中形成的菌落进行观察，挑取周围出现透明圈的微菌落接种于相应平板，这是因为解磷菌阳性菌落可溶解培养基中的磷酸盐而使其呈现透明状。继续培养，培养条件同步骤(7)，进一步纯化培养分离的解磷菌。若芯片中未观察到周围出现透明圈的微菌落，则取稀释度为10-3、10-2的样品液继续重复上述实验步骤；若芯片中出现微菌落的微腔过于密集，则取稀释度为10-5、10-6的样品液继续重复上述实验步骤。
实施例2
本实施例提供数字式微生物平板培养芯片在微生物快速分离和鉴定中的应用，以数字式微生物平板培养芯片应用于鉴定泳池水样中是否存在绿脓杆菌为例，应用示意图如图4所示，具体实施步骤如下：
(1)微生物培养基片层的制备：
利用传统软光刻技术制作集成微腔阵列的PDMS薄片作为数字式微生物平板培养芯片的微生物培养基片层，PDMS薄片的面积和载玻片大小一致，薄片上有约11万个微腔，每个微腔的直径70μm，深60μm，将制备的芯片基片层进行15min的121℃高温灭菌处理，作为微生物培养基片层备用。
(2)样本制备：
取泳池水样进行十倍梯度稀释，依次制备得到10-1、10-2、10-3稀释度的样品液。
(3)固体培养基盖片层的制备：
称取适量溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(Cetrimide Agar)，加入去离子水，搅拌后加热促溶，121℃高温灭菌15min，快速倒入一个底部平整光滑的矩形方框中，并用胶片加盖压平，待室温中冷却固化后，从方框中剥离取出制备的溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基盖片，厚度为3mm，作为固体培养基盖片层备用。
(4)样品液填充和离散化：
将步骤(1)制得的基片层浸入步骤(2)制备的稀释度为10-2的样品液中，浸没3min，将基片层从样品液中缓慢垂直提出，利用不连续去润湿效应(Discontinuous Dewetting)实现样品液在微腔阵列中的离散化分配。
(5)基片表面除杂：
将一片经灭菌处理的3M胶带轻轻贴附于步骤(4)完成样品离散化的基片层表面，并快速剥离，以清除基片层微腔腔室外上表面的残余样品液。
(6)芯片组装：
将步骤(3)制备的固体培养基盖片层贴附于经步骤(5)完成表面除杂的基片层表面，保证盖片层覆盖基片层的所有微腔。
(7)温育培养：
将步骤(6)组装的芯片放入一个饱和湿度盒中，并置于培养箱中，于36℃培养6.5h。
(8)鉴定：
将完成温育培养的芯片置于显微镜下，对芯片中形成的菌落进行观察，若出现黄绿色微菌落则证明水样中存在绿脓杆菌，这是因为绿脓杆菌生长过程中会产生黄色的荧光素和绿色的绿脓菌素。若芯片中未观察到微菌落，则取稀释度为10-1和原始的样品液继续重复上述实验步骤；若芯片中出现微菌落的微腔过于密集，则取稀释度为10-3的样品液继续重复上述实验步骤。
实施例3
本实施例提供数字式微生物平板培养芯片在微生物样品的活菌准确定量中的应用，以数字式微生物平板培养芯片应用于检测湖水中细菌总量为例，应用示意图如图5所示，具体实施步骤如下：
(1)微生物培养基片层的制备：
利用传统软光刻技术制作集成微腔阵列的聚PDMS薄片作为数字式微生物平板培养芯片的微生物培养基片层，PDMS薄片的面积和载玻片大小一致，薄片上有约11万个微腔，每个微腔的直径70μm，深60μm，将制备的芯片基片层进行15min的121℃高温灭菌处理，作为微生物培养基片层备用。
(2)样本制备：
取湖水样进行十倍梯度稀释，依次制备得到10-1、10-2、10-3稀释度的样品液。
(3)固体培养基盖片层的制备：
称取适量平板计数琼脂培养基(PCA)，加入去离子水，搅拌后加热促溶，121℃高温灭菌15min，快速倒入一个底部平整光滑的矩形方框中，并用胶片加盖压平，待室温中冷却固化后，从方框中剥离取出制备的平板计数琼脂培养基盖片，厚度为3mm，作为固体培养基盖片层备用。
(4)样品液填充和离散化：
将步骤(1)制得的基片层浸入步骤(2)制备的稀释度为10-2的样品液中，浸没3min，将基片层从样品液中缓慢垂直提出，利用不连续去润湿效应实现样品液在微腔阵列中的离散化分配。
(5)基片表面除杂：
将一片经灭菌处理的3M胶带轻轻贴附于步骤(4)完成样品离散化的基片层表面，并快速剥离，以清除基片层微腔腔室外上表面的残余样品液。
(6)芯片组装：
将步骤(3)制备的固体培养基盖片层贴附于经步骤(5)完成表面除杂的基片层表面，保证盖片层覆盖基片层的所有微腔。
(7)温育培养：
将步骤(6)组装的芯片放入一个饱和湿度盒中，并置于培养箱中，于37℃培养6.5h。
(8)菌落计数：
将完成温育培养的芯片置于显微镜下，对芯片中形成菌落的微腔进行统计计数，然后利用泊松统计公式推算原始液样中细菌浓度。若芯片中未观察到微菌落，则取稀释度为10-1和原始的样品液继续重复上述实验步骤；若芯片中出现微菌落的微腔过于密集，则取稀释度为10-3的样品液继续重复上述实验步骤。
实施例4
本实施例提供数字式微生物平板培养芯片在细菌异质性耐药研究中的应用，以数字式微生物平板培养芯片应用于研究氨苄西林敏感的大肠杆菌(Escherichia coli)异质性耐药为例，应用示意图如图6所示，具体实施步骤如下：
(1)微生物培养基片层的制备：
利用传统软光刻技术制作6片集成微腔阵列的PDMS薄片作为数字式微生物平板培养芯片的微生物培养基片层，PDMS薄片的面积和载玻片大小一致，薄片上有约11万个微腔，每个微腔的直径70μm，深60μm，将制备的芯片基片层进行15min的121℃高温灭菌处理，作为微生物培养基片层备用。
(2)样本制备：
接种环挑取保存的氨苄西林敏感的大肠杆菌转移至装有LB液体培养基的三角瓶中，37℃下振荡培养12h，将菌液稀释103备用。
(3)固体培养基盖片层的制备：
称取适量LB琼脂培养基，加入去离子水，搅拌后加热促溶，分成12份，分别与不同浓度的氨苄西林溶液混合，制得氨苄西林终浓度分别为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5μg/mL的LB琼脂培养基溶液各1份和氨苄西林终浓度为5μg/mL的LB琼脂培养基溶液6份，121℃高温灭菌15min，快速倒入一个底部平整光滑的矩形方框中，并用胶片加盖压平，待室温中冷却固化后，从方框中剥离取出，厚度为3mm，作为固体培养基盖片层备用。
(4)样品液填充和离散化：
取6片步骤(1)中制备的芯片基片层，每片基片层与一片集成了管道和进样口的PDMS盖片层对准贴合，置于真空容器中进行至少30min脱气处理，然后取出“基片/盖片”组合体，并迅速在每个组合体的进样口加入30μL步骤(2)制备的菌液，利用脱气PDMS吸收微管道/微腔中空气形成负压，驱动进样口液样进入微管道，填充芯片微管道/微腔空间；待每个芯片所有微管道/微腔空间全部充满液样后，将其PDMS盖片从基片层上剥离，使得每个基片层上所有微腔中液样各自独立，形成数字化、离散液样。
(5)基片表面除杂：
将6片经灭菌处理的3M胶带轻轻贴附于步骤(4)完成样品离散化的基片层表面，并快速剥离，以清除基片层微腔腔室外上表面的残余样品液。
(6)芯片组装：
将步骤(3)制备的氨苄西林终浓度分别为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5μg/mL的LB固体培养基盖片层贴附于经步骤(5)完成表面除杂的6片基片层表面，保证盖片层覆盖基片层的所有微腔。
(7)温育培养：
将步骤(6)组装的芯片放入一个饱和湿度盒中，并置于培养箱中，于37℃培养72h，使得每片芯片中的大肠杆菌受到不同亚致死剂量(氨苄西林抑制敏感型大肠杆菌生长的最小浓度为5μg/mL)氨苄西林的作用。
(8)异质性耐药分析：
将完成温育培养的所有芯片取出，并剥离其固体培养基盖片层，再用胶带除杂处理每片基片表面，然后将步骤(3)制备的6片氨苄西林终浓度为5μg/mL的LB固体培养基盖片层分别贴附于每片基片层表面，并将芯片置于37℃湿盒中温育12hr；最后，将芯片取出，置于荧光显微镜下观察，统计每个芯片中形成微菌落的数目，也就是氨苄西林抗性大肠杆菌亚群的数量，分析氨苄西林敏感型大肠杆菌暴露于不同亚致死剂量氨苄西林对菌落组成演变的影响，证明大肠杆菌异质耐药性的存在。
实施例5
本实施例提供数字式微生物平板培养芯片在工业微生物育种筛选中的应用，以数字式微生物平板培养芯片应用于筛选α-淀粉酶高产地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)菌株为例，应用示意图如图7所示，具体实施步骤如下：
(1)微生物培养基片层的制备：
利用传统软光刻技术制作集成微腔阵列的PDMS薄片作为数字式微生物平板培养芯片的微生物培养基片层，PDMS薄片的面积和载玻片大小一致，薄片上有约11万个微腔，每个微腔的直径70μm，深60μm，将制备的芯片基片层进行15min的121℃高温灭菌处理，作为微生物培养基片层备用。
(2)样本制备：
取10μL培养至对数生长期的地衣芽孢杆菌菌液，涂布于经过灭菌消毒的不锈钢板上，并利用常压室温等离子体法处理涂布的地衣芽孢杆菌20s左右；然后，冲洗不锈钢板上细菌并收集清洗液，适当稀释后涂布在LB培养基平板上，将平板在37℃下温育直至形成菌落；再挑取形成的菌落加入装有TB(terrific broth)液体培养基的三角瓶中，37℃下振荡培养12h，最后，将菌液稀释103备用。
(3)固体培养基盖片层和鉴定盖片层制备：
称取适量LB琼脂培养基，加入去离子水，搅拌后并加热促溶，121℃高温灭菌15min，快速倒入一个底部平整光滑的矩形方框中，并用胶片加盖压平，待室温中冷却固化后，从方框中剥离取出制备的LB琼脂固体培养基盖片，厚度为3mm，作为固体培养基盖片层备用。称取适量的琼脂粉和荧光素标记的淀粉，利用上述同样流程，配制用于鉴定的琼脂盖片。
(4)样品液填充和离散化：
将步骤(1)中制备的芯片基片层与一片集成了管道和进样口的PDMS盖片层对准贴合，置于真空容器中进行至少30min脱气处理，然后取出“基片/盖片”组合体，并迅速在进样口加入30μL步骤(2)制备的菌液，利用脱气PDMS吸收微管道/微腔中空气形成负压，驱动进样口液样进入微管道，填充芯片微管道/微腔空间；待芯片所有微管道/微腔空间全部充满液样后，将PDMS盖片从基片层上剥离，使得基片层上所有微腔中液样各自独立，形成数字化、离散液样。
(5)基片表面除杂：
将一片经灭菌处理的3M胶带轻轻贴附于步骤(4)完成样品离散化的基片层表面，并快速剥离，以清除基片层微腔腔室外上表面的残余样品液。
(6)芯片组装：
将步骤(3)制备的固体培养基盖片层贴附于经步骤(5)完成表面除杂的基片层表面，保证盖片层覆盖基片层所有微腔。
(7)温育培养：
将步骤(6)组装的芯片放入一个饱和湿度盒中，并置于培养箱中，于37℃培养6.5h。
(8)菌种筛选：
将完成温育培养的芯片取出，并剥离固体培养基盖片层，再用胶带除杂处理基片表面，然后将步骤(3)制备的鉴定琼脂盖片层贴附于基片层表面，并将芯片置于37℃湿盒中温育10min左右；最后，将芯片取出，置于荧光显微镜下观察。若有微腔出现绿色荧光则说明该微腔中包含α-淀粉酶高产的地衣芽孢杆菌菌株，这是因为α-淀粉酶水解淀粉骨架释放荧光素至周围溶液中。可以挑取相应微腔中的菌落进行后续鉴定或进行后续工业化扩大培养。
实施例6
本实施例提供数字式微生物平板培养芯片在病原菌药敏测试中的应用，以数字式微生物平板培养芯片应用于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)药敏测试为例，应用示意图如图8所示，具体实施步骤如下：
(1)微生物培养基片层的制备：
利用传统软光刻技术制作8片集成微腔阵列的PDMS薄片作为数字式微生物平板培养芯片的微生物培养基片层，PDMS薄片的面积和载玻片大小一致，薄片上有约11万个微腔，每个微腔的直径70μm，深60μm，将制备的芯片基片层进行15min的121℃高温灭菌处理，作为微生物培养基片层备用。
(2)样本制备：
挑取肺炎患者痰液标本平板培养的肺炎克雷伯菌菌落，转移至装有MH液体培养基(Mueller-Hinton broth)的三角瓶中，37℃下振荡培养12h，将菌液稀释103备用。
(3)固体培养基盖片层的制备：
称取适量LB琼脂培养基，加入去离子水，搅拌后并加热促溶，分为8份，分别与不同浓度的亚胺培南(imipenem)溶液混合，制得亚胺培南终浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16μg/mL的LB琼脂培养基溶液各1份；将8份溶液121℃高温灭菌15min后，分别快速倒入8个底部平整光滑的矩形方框中，并用胶片加盖压平，待室温中冷却固化后，从方框中剥离取出，即制得8份含不同亚胺培南浓度的LB固体培养基盖片，厚度为3mm，作为固体培养基盖片层备用。
(4)样品液填充和离散化：
取8片步骤(1)中制备的芯片基片层，每片基片层与一片集成了管道和进样口的PDMS盖片层对准贴合，置于真空容器中进行至少30min脱气处理，然后取出“基片/盖片”组合体，并迅速在每个组合体的进样口加入30μL步骤(2)制备的菌液，利用脱气PDMS吸收微管道/微腔中空气形成负压，驱动进样口液样进入微管道，填充芯片微管道/微腔空间；待每个芯片所有微管道/微腔空间全部充满液样后，将其PDMS盖片从基片层上剥离，使得每个基片层上所有微腔中液样各自独立，形成数字化、离散液样。
(5)基片表面除杂：
将8片经灭菌处理的3M胶带轻轻贴附于步骤(4)完成样品离散化的8片基片层表面，并快速剥离，以清除基片层微腔腔室外上表面的残余样品液。
(6)芯片组装：
将步骤(3)制备的8片含不同亚胺培南浓度的LB固体培养基盖片分别贴附于经步骤(5)完成表面除杂的8片基片层表面，完成组装。
(7)温育培养：
将经步骤(6)组装后的所有芯片放入一个饱和湿度盒中，并置于培养箱中37℃培养6.5h，使得每片芯片中的肺炎克雷伯菌受到不同剂量亚胺培南的作用。
(8)药敏分析：
将完成温育培养的所有芯片取出，置于荧光显微镜下观察，统计每个芯片中形成微菌落的数目，分析肺炎克雷伯菌对不同剂量亚胺培南的敏感性，确定亚胺培南对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(minimuminhibitory concentration,MIC)，指导临床用药。
实施例7
本实施例提供数字式微生物平板培养芯片在“未培养/难培养”微生物分离培养中的应用，以数字式微生物平板培养芯片应用于分离培养珊瑚粘液中“未培养/难培养”微生物为例，应用示意图如图9所示，具体实施步骤如下：
(1)微生物培养基片层的制备：
利用传统软光刻技术制作1片集成微腔阵列的PDMS薄片作为数字式微生物平板培养芯片的微生物培养基片层，PDMS薄片的面积和载玻片大小一致，薄片上有约11万个微腔，每个微腔的直径70μm，深60μm，将制备的芯片基片层进行15min的121℃高温灭菌处理，作为微生物培养基片层备用。
(2)样本制备：
收集鹿角杯形珊瑚(Pocillopora damicornis)表面粘液，将其稀释103备用。
(3)固体培养基盖片层的制备：
称取适量琼脂粉，加入去离子水，搅拌后并加热促溶，快速倒入一个底部平整光滑的矩形方框中，并用胶片加盖压平，待室温中冷却固化后，从方框中剥离取出，即制得一片纯的琼脂凝胶盖片，厚度为3mm，作为固体培养基盖片层备用。
(4)样品液填充和离散化：
取步骤(1)中制备的芯片基片层，与一片集成管道和进样口的PDMS盖片层对准贴合，置于真空容器中进行至少30min脱气处理，然后取出“基片/盖片”组合体，并迅速在芯片组合体的进样口加入30μL步骤2制备的样品液，利用脱气PDMS吸收微管道/微腔中空气形成负压，驱动进样口液样进入微管道，填充芯片微管道/微腔空间；待芯片所有微管道/微腔空间全部充满液样后，将其PDMS盖片从基片层上剥离，使得每个基片层上所有微腔中液样各自独立，形成数字化、离散液样。
(5)基片表面除杂：
将一片经灭菌处理的3M胶带贴附于步骤(4)完成样品液离散化的基片层表面，并快速剥离，以清除基片层微腔腔室外上表面的残余样品溶液。
(6)芯片组装：
将步骤(3)制备的琼脂凝胶盖片贴附于经步骤(5)完成表面除杂的基片层表面，并用一对中空结构的夹具固定芯片组装体。
(7)原生环境培养：
将经步骤(6)组装固定后的芯片浸入一个饲养有鹿角杯形珊瑚的鱼缸中，室温培养30天。
(8)微生物回收、鉴定：
将完成培养的芯片取出，并拆解芯片，剥离凝胶盖片层，将微生物培养基片层置于显微镜下，观察芯片中形成微菌落的情况，并逐一挑取菌落进行基因鉴定分析。
实施例8
本实施例提供数字式微生物平板培养芯片在功能性单细胞分离、筛选的应用，以数字式微生物平板培养芯片应用于筛选分泌抑制血管紧张素转换酶1(angiotensinconverting enzyme1，ACE-1)的单克隆抗体的杂交瘤细胞为例，应用示意图如图10所示，具体实施步骤如下：
(1)芯片基片层的制备：
利用传统软光刻技术制作1片集成微腔阵列的PDMS薄片作为数字式微生物平板培养芯片的微生物培养基片层，PDMS薄片的面积和载玻片大小一致，薄片上有约11万个微腔，每个微腔的直径70μm，深60μm，将制备的芯片基片层进行15min的121℃高温灭菌处理，作为芯片基片层备用。
(2)样本制备：
收集经细胞融合处理的杂交瘤细胞，并用培养基将其稀释至1×106cells/mL，然后与ACE-1溶液混合，制备含有ACE-1的杂交瘤细胞悬液，且细胞悬液中ACE-1的终浓度为1.6ng/nL。
(3)芯片盖片层的制备：
称取适量琼脂粉，加入去离子水，搅拌后并加热促溶，然后，与ACE-1荧光底物溶液混合，快速倒入一个底部平整光滑的矩形方框中，并用胶片加盖压平，待室温中冷却固化后，从方框中剥离取出，即制得一片包含ACE-1荧光底物琼脂凝胶盖片，厚度为3mm，作为芯片盖片层备用。
(4)样品液填充和离散化：
取步骤(1)中制备的芯片基片层，与一片集成管道和进样口的PDMS盖片层对准贴合，置于真空容器中进行至少30min脱气处理，然后取出“基片/盖片”组合体，并迅速在芯片组合体的进样口加入30μL步骤2制备的样品液，利用脱气PDMS吸收微管道/微腔中空气形成负压，驱动进样口液样进入微管道，填充芯片微管道/微腔空间；待芯片所有微管道/微腔空间全部充满液样后，将其PDMS盖片从基片层上剥离，使得每个基片层上所有微腔中液样各自独立，形成数字化、离散液样。
(5)基片表面除杂：
将一片经灭菌处理的3M胶带贴附于步骤(4)完成样品液离散化的基片层表面，并快速剥离，以清除基片层微腔腔室外上表面的残余样品溶液。
(6)芯片组装：
将步骤(3)制备的琼脂凝胶盖片贴附于经步骤(5)完成表面除杂的基片层表面，并用一对中空结构的夹具固定芯片组装体。
(7)温育培养：
将经步骤(6)组装后的芯片放入一个饱和湿度盒中，并置于培养箱中37℃培养6h。
(8)细胞鉴定和筛选：
将完成培养的芯片取出，置于荧光显微镜下观察。若有微腔出现强的绿色荧光，说明该微腔中没有杂交瘤细胞或者包含的杂交瘤细胞不具有分泌ACE-1抑制抗体的能力，这是因为ACE-1酶解ACE-1荧光底物2产生荧光分子至周围溶液中；若有微腔中没有出现绿色荧光或者荧光强度非常弱，则说明该微腔中包含有能分泌抑制ACE-1的单克隆抗体的杂交瘤细胞。然后，剥离盖片层，利用单细胞显微挑取仪吸取基片层相应微腔中的杂交瘤细胞进行后续进一步鉴定或进行后续工业化扩大培养。
实施例9
本实施例提供数字式微生物平板培养芯片在环境微生物多样性研究中的应用，以数字式微生物平板培养芯片应用于研究海底沉积物样品中微生物多样性，具体实施步骤如下：
(1)微生物培养基片层的制备：
利用传统软光刻技术制作集成微腔阵列的PDMS薄片作为数字式微生物平板培养芯片的微生物培养基片层，PDMS薄片的面积和载玻片大小一致，薄片上有约11万个微腔，每个微腔的直径70μm，深60μm，将制备的芯片基片层进行15min的121℃高温灭菌处理，作为微生物培养基片层备用。
(2)样本制备：
将1g海底沉积物样品加入包含9ml海水SRB培养基的离心管中，涡旋振荡，再以80μm滤膜过滤去除大的颗粒杂质，取过滤收集液进行十倍梯度稀释，依次制备得到10-1、10-2、10-3稀释度的样品液。
(3)固体培养基盖片层的制备：
称取适量海水SRB琼脂培养基，加入去离子水，搅拌后加热促溶，121℃高温灭菌15min，快速倒入一个底部平整光滑的矩形方框中，并用胶片加盖压平，待室温中冷却固化后，从方框中剥离取出制备的平板计数琼脂培养基盖片，厚度为3mm，作为固体培养基盖片层备用。
(4)样品液填充和离散化：
将步骤(1)制得的基片层与一片集成了管道和进样口的PDMS盖片层对准贴合，置于真空容器中进行至少30min的脱气处理，去除“基片/盖片”组合体，迅速在进样口加入30μL步骤(2)准备的稀释度为10-1的样品液，利用脱气PDMS吸收微管道/微腔中空气形成负压，驱动样品液进入微管道，填充微管道/微腔空间，待芯片所有微管道/微腔空间全部充满样品液后，将PDMS盖片层从基片层上剥离，使得基片层上所有微腔中样品液各自独立，形成数字化、离散样液。
(5)基片表面除杂：
将一片经灭菌处理的3M胶带轻轻贴附于步骤(4)完成样品离散化的基片层表面，并快速剥离，以清除基片层微腔腔室外上表面的残余样品液。
(6)芯片组装：
将步骤(3)制备的固体培养基盖片层贴附于经步骤(5)完成表面除杂的基片层表面，保证盖片层覆盖基片层的所有微腔。
(7)温育培养：
将步骤(6)组装的芯片放入一个饱和湿度盒中，并置于厌氧培养箱中，于室温培养7天。
(8)分离鉴定：
将完成温育培养的芯片置于显微镜下，观察芯片中形成微菌落的情况，并逐一挑取菌落进行16S rRNA基因组测序，并基于测序结果进行OTU(Operational TaxonomicUnits)聚类分析和物种注释。
实验例
1、同时采用数字式微生物平板培养芯片和传统琼脂平板法进行α-淀粉酶高产地衣芽孢杆菌菌株筛选，并比较两者的实验结果。
对比实验流程：取实施例5的步骤(2)制备的样品液涂在包含荧光素标记淀粉的琼脂固体平板上，同时取实施例5的步骤(2)制备的样品液填充并离散分配至数字式微生物平板培养芯片。然后，将琼脂平板和芯片均置于饱和湿度环境和培养箱中，37℃培养下培养，芯片6.5h，平板24h。
结果显示，平板中形成的菌落数过于密集，出现大量发荧光的菌落，未发现不发荧光的单菌落(可能被荧光菌落掩盖)，未能实现α-淀粉酶高产地衣芽孢杆菌菌株筛选的筛选。而在数字式微生物平板培养芯片中可清晰地分辨出2～3个不发荧光的单微菌落，通过挑取后进行后续扩大培养和鉴定，证实这几个菌落是α-淀粉酶高产地衣芽孢杆菌菌株。
上述对比实验显示数字式微生物平板培养法筛选突变型菌株的效率远高于琼脂平板法。主要原因是由于诱导突变产生突变菌株的概率极低，约为1/105～1/108，而传统琼脂培养法的有效使用范围为30～300个菌落/平板，若要实现突变型菌株的有效筛选，往往需要采用高度稀释的样品液，经过大量涂板重复。相对而言，数字式微生物平板芯片无需使用高度稀释的样品液，其大规模离散化能力可实现较高浓度菌液的单菌隔离式独立培养，极易实现稀有突变型菌株与大量野生型菌株的分离，从而为有效鉴定筛选稀有突变株提供了可能。
2、同时采用数字式微生物平板培养芯片和传统琼脂平板法进行海底沉积物样品中细菌微生物多样性研究，并比较两者的实验结果。
对比实验流程：取实施例9的步骤(2)制备的稀释度为10-1、10-2和10-3的样品液分别涂在三块预制的海水SRB琼脂固体平板上，同时取实施例9的步骤(2)制备的稀释度为10-1的样品液填充并离散分配至数字式微生物平板培养芯片。然后，将琼脂平板和芯片均置于饱和湿度环境和厌氧培养箱中，室温下培养，芯片5天，平板7天。
结果显示，接种稀释度为10-1和10-2的样品液的平板中形成的菌落数过于密集，出现大量菌落融合，难以实现单菌落分离鉴定。而接种稀释度为10-3的样品液的平板中形成数十个单菌落，可用于分离鉴定。
相对而言，在数字式微生物平板培养芯片中可获得大量独立的单微菌落，单个芯片上形成的可用于分离鉴定的单菌落数可达数百至上千个，显然，相较于传统琼脂平板法，数字式微生物平板培养法可获得更高的菌群丰富度。基因测序结果也显示数字式微生物平板培养法获得的微生物物种丰富度和均匀度均远高于琼脂平板法。主要原因可能是由于数字式微生物平板芯片的大规模离散化为每个微生物提供了相对独立的生长空间，使得一些慢生长的微生物物种也能获得培养。
综上所述，本发明提供了数字式微生物平板培养芯片的制备方法和微生物分离、纯化、鉴定、定量、异质耐药性研究、育种筛选、病原菌药敏测试以及功能性单细胞分离和筛选中的应用方法，其具有微型化、数字化和模块化三个典型特征，使得本发明的数字式微生物平板培养芯片相较于现有的相关技术具有多种优势：该数字式微生物平板培养芯片应用时操作更简便，无需繁琐的手动涂板；具有高通量的优势，可以根据需要调整微腔数量范围，并且试剂和样本的消耗量很少；本发明可以封装单个微生物于微腔中，进行隔离培养，避免了因不同菌种生长速度差异和种间竞争导致的培养偏倚，有利于研究复杂样本中的稀有和生长缓慢的微生物，可以大幅提高稀有菌株的分离效率，可以在大的动态范围内实现准确菌落计数；本发明可以通过更换固体培养基盖片，实现快速、灵活调节单个微生物的生长微环境，有利于实现更复杂、精细的微生物研究；本发明还可以再大规模微生物群体中快速、高效筛选稀有的突变菌株；本发明可以在单细胞层次实现快速、准确的细菌药敏测试；本发明可以更准确地揭示微生物群体异质性；本发明可以在更大规模层次上揭示环境微生物的复杂多样性；本发明的纳升甚至皮升级微腔中微生物产生的代谢物可以快速积累，有助于加快基于生化分析的微生物鉴定和基于浓度依赖的生理通路(如群体感应等)的研究；本发明兼具固体培养基表面附着培养和液体培养基悬浮培养双重培养模式的优势，适用于更多种类微生物的培养；此外本发明还易于与显微镜装置结合，实时跟踪微生物生长过程；本发明在细胞研究如功能性单细胞分离和筛选中同样具备上述部分优点。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种数字式微生物平板培养芯片，其特征在于，包括基片层、盖片层；
所述基片层上包含至少1个微腔阵列，所述微腔阵列包含至少1000个微腔；
所述盖片层的组成成分包括水凝胶；
所述芯片组装时，所述盖片层覆盖所述基片层所有微腔。
2.根据权利要求1所述的数字式微生物平板培养芯片，其特征在于，所述基片层的形状包括圆形、椭圆形、矩形、正方形或多边形，多边形的边数为N，N≥5；
优选地，所述微腔为柱形，所述微腔的横截面为圆形、正三角形、正方形或规则正多边形，多边形的边数为N，N≥5；
优选地，所述微腔的横截面直径或外接圆直径为10～1000μm。
3.根据权利要求1所述的数字式微生物平板培养芯片，其特征在于，所述基片层的结构面表面呈现疏水特性。
4.根据权利要求3所述的数字式微生物平板培养芯片，其特征在于，所述基片层的材质为硅胶或环烯烃共聚物，或，以硅胶或环烯烃共聚物为结构面、聚对苯二甲酸乙二醇酯为支撑基底的复合结构材质；
优选地，所述硅胶为聚二甲基硅氧烷。
5.根据权利要求1所述的数字式微生物平板培养芯片，其特征在于，所述盖片层的组成成分还包括营养成分、筛选或鉴定用化合物、或药敏分析的药物。
6.如权利要求1～5任一项所述的数字式微生物平板培养芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、基片层制备：使用软光刻技术制备集成微腔阵列的基片层，灭菌处理；
S2、盖片层制备：配置水凝胶溶液，灭菌后倒入底部平整光滑的模具中，冷却固化后剥离，即得盖片层。
7.如权利要求1～5任一项所述的数字式微生物平板培养芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、样品加载和离散化：将样品液加入到基片层的微腔中，实现样品溶液在基片层微腔阵列中的离散化分配；
S2、基片层表面除杂：将灭菌的胶带贴于步骤S1得到的基片层微腔阵列表面，快速剥离除去微腔外基片层表明残余的样品液；
S3、芯片组装：将盖片层贴附于步骤S2得到的基片层表面，覆盖所有微腔；
S4、培养：将组装的芯片置于适宜温度、湿度环境下培养；
S5、观察分析：将完成培养的芯片置于显微镜下，对芯片中形成的菌落进行计数、形态特征分析或光学特性分析。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述数字式微生物平板培养芯片用于微生物或细胞分离、鉴定时，盖片层中还使用了鉴定化学成分，通过待鉴定微生物或细胞产生的代谢产物与鉴定化学成分的反应现象来进行鉴定。
9.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述数字式微生物平板培养芯片用于“未培养/难培养”微生物分离培养时，所述样品液为“未培养/难培养”微生物样品液，所述步骤S4的培养还包括将芯片置于“未培养/难培养”微生物采集的原生环境，或，收集“未培养/难培养”微生物采集的原生环境中的提取液滴加至固体培养基盖片层。
10.如权利要求1～5任一项所述的数字式微生物平板培养芯片或权利要求7～9任一项所述的使用方法在a)～h)中的一种或多种的应用：
a)微生物或细胞的分离；
b)微生物或细胞的纯化；
c)微生物或细胞的鉴定；
d)微生物或细胞的筛选；
e)微生物或细胞的定量；
f)微生物或细胞的药敏分析；
g)微生物或细胞的多样性分析；
h)微生物或细胞的异质性分析。
CN202410348062.5A 2024-03-26 2024-03-26 一种数字式微生物平板培养芯片及其使用方法和应用 Pending CN118109271A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410348062.5A CN118109271A (zh) 2024-03-26 2024-03-26 一种数字式微生物平板培养芯片及其使用方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410348062.5A CN118109271A (zh) 2024-03-26 2024-03-26 一种数字式微生物平板培养芯片及其使用方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118109271A true CN118109271A (zh) 2024-05-31

Family

ID=91217035

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410348062.5A Pending CN118109271A (zh) 2024-03-26 2024-03-26 一种数字式微生物平板培养芯片及其使用方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118109271A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20050084923A1 (en) Methods for cultivating and analyzing microbial individual cell cultures
EP2132301B1 (en) Systems and methods for anaerobic environmental microbial compartmentalized cultivation
CN102643751B (zh) 一种快速分离纯化小球藻的方法
US20170247652A1 (en) Device and Method for High Throughput Bacterial Isolation
CN1957089A (zh) 污染测量
CN1696305A (zh) 计数并鉴别微生物的方法
Zhang et al. Agarose-based microwell array chip for high-throughput screening of functional microorganisms
FI57128C (fi) Saett att identifiera mikroorganismer
US9249382B2 (en) Devices and methods for the selective isolation of microorganisms
CN111534454B (zh) 一种基于pdms微孔阵列芯片的细菌分离培养方法
CN118109271A (zh) 一种数字式微生物平板培养芯片及其使用方法和应用
JP2019520825A (ja) 磁性粒子を用いたハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置および方法
EP1999248B1 (en) Devices and methods for the isolation and cultivation of microorganisms
CN110261267B (zh) 一种渔用光合细菌制剂产品的检测方法
US20230227920A1 (en) Method And System Of Producing A Library Of Microorganisms
CN1333374A (zh) 微生物易感性的快速测定
US20210115367A1 (en) Use of Resorufin for Monitoring Metabolic Activity of Cells under Anaerobic Condition
CN117801931A (zh) 一种利用共培养进行微生物原位高通量分离的装置
CN114540462A (zh) 用于耐药基因检测的蓝藻环境样品胞内外dna分离提取方法
Tandogan Isolation and Study of Bacteria Using Physical Constrictions
Ingham et al. Can We Improve on the Petri Dish with Porous Culture Supports?

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination