CN114958725B - 基于亲疏水阵列芯片的三维细胞球悬滴培养及共培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于亲疏水阵列芯片的三维细胞球悬滴培养及共培养方法，属于三维细胞共培养领域。本发明公开了一种基于亲疏水阵列芯片的三维细胞共培养技术，能够实现高通量的三维细胞球共培养，为研究三维条件下细胞间相互作用以及药物筛选等提供了一种方法。该方法的具体步骤为：制备亲疏水阵列芯片，并使用悬滴法在亲疏水阵列芯片上培养三维细胞球，细胞球成球之后，将两个不同细胞球阵列上下对接融合，并移走上层的芯片，将下层的芯片继续悬滴培养，直至液滴内两种细胞球生长到一起，根据要求对组装体进行实时观察和具体分析。
Description
技术领域
本发明涉及三维细胞共培养领域，更具体地，涉及基于亲疏水阵列芯片的三维细胞球悬滴培养及共培养方法。
背景技术
传统二维细胞培养方法存在诸多弊端，主要包括存在二维平面培养无法模拟生理状态下细胞的三维生长环境，长期培养会导致细胞表型改变，为生物医学研究带来障碍，例如一些用于组织工程的细胞分化和形态发生过程已被证明优先发生在三维培养而非二维培养中。此外，二维培养相较于三维培养受限于平面的空间，无法实现大规模的细胞扩增。
目前在进行三维细胞培养方法，主要采用了基于支架的技术，例如基于水凝胶和聚合物硬质材料等的支撑，和无支架技术，例如悬滴微孔板、磁悬浮和具有超低附着涂层的球体微孔板等。在这些方法中，基于支架的培养方式而往往需要预先制备支架，耗时耗力，增加三维细胞培养成本。无支架的细胞培养，虽然操作相对简单，但是对技术要求高，且得到的细胞球体均一性不好控制，应用受限。
悬滴法作为无支架三维细胞培养的典型代表，具有操作简单，实用性强等特点，但是目前商业化的悬滴培养装置价格较贵，且无法实现两种或者多种细胞的共培养。由此，亟待开发出一种简单可操作性强的三维细胞共培养技术。
发明内容
针对现有三维细胞培养技术通量低，操作复杂，商业化的培养装置和材料价格昂贵，且无法实现多种细胞共培养，本发明提出一种基于亲疏水阵列芯片的三维细胞球悬滴培养及共培养方法。在亲疏水阵列芯片的亲水区域滴加细胞悬液，然后将所述芯片接种细胞的一面朝下，悬空放置在细胞培养板中，进行悬滴成球培养；通过芯片对接使两种细胞球融合到一个液滴中，进行悬滴共培养。本发明能够实现大量三维细胞球体培养，且能够精确控制细胞球体大小，保证细胞球均一性。
根据本发明第一方面，提供了一种基于亲疏水阵列芯片的三维细胞球悬滴培养方法，在亲疏水阵列芯片的亲水区域滴加细胞悬液，然后将所述芯片接种细胞的一面朝下，悬空放置在细胞培养板中，进行悬滴成球培养。
优选地，所述亲疏水阵列芯片的制备具体为：利用激光雕刻机在聚二甲基硅氧烷膜或聚四氟乙烯膜上雕刻出亲疏水阵列，将所述亲疏水阵列和玻璃片进行等离子处理，再进行共价键合，即得到所述亲疏水阵列芯片；所述亲疏水阵列芯片中的亲疏水阵列的玻璃片裸露区域为亲水区域，共价键合区域为疏水区域。
优选地，所述细胞为脂肪细胞、乳腺肿瘤细胞、肠类器官细胞培养物或血管内皮细胞。
根据本发明另一方面，提供了一种基于亲疏水阵列芯片的三维细胞球共培养方法，包括以下步骤：
(1)在各个亲疏水阵列芯片的亲水区域分别滴加不同的细胞悬液，然后将所述芯片接种细胞的一面朝下，分别悬空放置在细胞培养板中，进行悬滴成球培养；
(2)在步骤(1)所述细胞悬液培养成细胞球后，将不同的细胞球阵列上下对接，使两片芯片的亲水区域的液滴融合，并移走上层的芯片，将下层的芯片继续悬滴培养，直至液滴内的细胞球融合生长，实现三维细胞共培养。
优选地，所述亲疏水阵列芯片的制备具体为：利用激光雕刻机在聚二甲基硅氧烷膜或聚四氟乙烯膜上雕刻出亲疏水阵列，将所述亲疏水阵列和玻璃片进行等离子处理，再进行共价键合，即得到所述亲疏水阵列芯片；所述亲疏水阵列芯片中的亲疏水阵列的玻璃片裸露区域为亲水区域，共价键合区域为疏水区域。
优选地，所述不同的细胞分别为脂肪细胞和乳腺肿瘤细胞，或者分别为肠类器官细胞培养物和血管内皮细胞。
优选地，所述步骤(2)之后，还包括将融合生长的细胞球与其它的不同的细胞球阵列上下对接，待液滴融合后进行悬滴培养。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明利用了芯片表面亲水区域的吸附特性以及悬滴培养的方法，能够实现高通量三维细胞球体培养，且通过改变加入阵列细胞悬液密度或者体积能够精确控制细胞球体大小，保证细胞球均一性，操作过程简单快速，对于研究高通量药物筛选，组织工程，干细胞分化，个性化医疗，个性化疾病模型等领域都有着重要意义。
(2)利用本发明，可实现两种甚至多种三维细胞球共培养，有利于揭示在三维共培养环境下两种或者多种细胞间的相互作用。
附图说明
图1为本发明的亲疏水阵列制作过程示意图。
图2为本发明悬滴培养装置制作示意图。
图3为细胞球的制备及培养示意图。
图4为共培养球体形成及培养示意图。
图5为MCF-7细胞球成球过程及活性验证图。
图6为脂肪细胞球体形成图。
图7脂肪-乳腺肿瘤组装体实验示意图。
图8为脂肪-乳腺肿瘤组装体长时共培养图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
一种基于亲疏水阵列芯片的三维细胞共培养方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备亲疏水阵列芯片：芯片表面具有多个亲水区域，每个所述亲水区域可吸附一个细胞悬液液滴；
(2)制备悬滴培养装置：在培养器皿中放置支架，以支撑阵列芯片的悬滴培养；
(3)制备三维细胞球体：使用目标芯片通过悬滴培养分别制备不同种类的三维细胞球体；
将一定浓度的细胞悬液，接种到亲疏水阵列中的亲水区域，接种细胞后，将芯片接种细胞的一面朝下，悬空放置在细胞培养板中，进行悬滴成球培养，每个液滴内可形成一个细胞球；
(4)两种细胞球共培养：通过芯片对接使两种细胞球融合到一个液滴中，进行悬滴共培养；
待两块阵列细胞球长好后，将目标芯片上下对接，让两片芯片的亲水区域的液滴融合，使上面芯片的细胞球通过液面张力和重力等作用进入下面的液滴中，移走上层芯片，将下层芯片继续按照(3)中的悬滴培养。得到的目标芯片即为双球共培养阵列芯片，所述的芯片的每个亲水区域都吸附有一个目标液滴，每个液滴都有两个细胞球。
本发明一种基于亲疏水阵列芯片的三维细胞共培养方法，制备亲疏水阵列芯片，并使用悬滴法在亲疏水阵列芯片上培养三维细胞球，细胞球成球之后，将两个不同细胞球阵列上下对接，让两片芯片的亲水区域的液滴融合，并移走上层的芯片，将下层的芯片继续悬滴培养，直至液滴内的多细胞球生长到一起，根据具体实验要求对细胞球组装体进行实时观察和具体分析。
一些实施例中，制作和使用高通量亲疏水阵列芯片，包括但不限于使用玻璃片和PDMS膜键合制作亲疏水阵列芯片。
一些实施例中，将接种细胞的阵列进行悬滴培养，以获取大量的三维细胞球体(包含类器官、肿瘤球等)。
一些实施例中，形成的三维细胞球体大小可以通过控制接种悬液体积严格控制，在一片阵列上可形成细胞球体大小梯度。
一些实施例中，能够同时获取大量两种或者多种细胞球的组装体；包括但不限于脂肪-乳腺肿瘤组装体和肠类器官-血管组织组装体，可以是任何两种或者多种能进行相互作用的细胞经过如上培养形成的多球组装体。
一些实施例中，悬滴培养的细胞成球后，可以对接融合多次，形成两种、三种甚至多种三维细胞球组装体。
实施例1：本发明结合脂肪-乳腺肿瘤组装体详细阐述
(1)首先，将直径75mm玻璃片清洗干净后氮气吹干备用；
(2)利用激光雕刻机在PDMS膜上雕刻如图1所示的阵列；
(3)将玻璃片及雕刻好的PDMS阵列一面朝上，放入等离子清洗机中，打5min的等离子体后取出并快速共价键合，由此亲疏水阵列芯片制作完成，其中玻璃片裸露区域为亲水区域，可接种细胞悬液，PDMS键合区域为疏水区域，将制备好的芯片放入干净培养皿中备用；
(4)制备用于悬滴培养的固定支架：利用激光雕刻机在一面贴有双面胶的亚克力板上雕刻如图2中的(a)所示两种方块，并将两种方块组装成图2中的(a)所示阶梯方块；
(5)将步骤(3)制备的阵列芯片接入细胞后和步骤(4)阶梯方块，放入超净台中紫外灭菌30min，并按照图2中的(b)进行组装，细胞培养皿中放入无菌滤纸并加入无菌水保湿；
(6)消化乳腺肿瘤细胞(MCF-7细胞)，并制备终浓度为2.5×104个/mL的细胞悬液，接种至步骤(3)中的阵列中，每个亲水点接种8uL细胞悬液；按照图3所示进行悬滴培养；如图5中的(a)所示，经过48小时培养，细胞成球较好。图5中的(b)显示，细胞球大小均一。使用钙黄绿素AM(Calcein AM)和碘化丙啶(PI)对48h的细胞球进行死活染色并通过共聚焦显微成像，如图5中的(c)显示除了有个别死细胞(红色)，其余都为活细胞(绿色)，说明细胞球活性较好。
(7)准备小鼠胚胎成纤维细胞(3T3-LI细胞)经过诱导成熟的脂肪细胞，取六孔板的一个孔进行消化，将消化的脂肪细胞转移到15ml的无菌离心管中，并加入培养液至7.5ml，轻轻吸打混匀，静置3min后吸取液面细胞接种至步骤(3)中的制备好的阵列中，每个亲水点接种8uL细胞悬液；按照图3所示进行悬滴培养；如图6所示，脂肪细胞球成球较好，且脂肪细胞中有大量的脂滴(红色)。
(8)分别将步骤(6)和步骤(7)制备的细胞球培养阵列，放置到步骤(5)中的培养皿中进行悬滴培养48h，并进行实时观察；
(9)待步骤(8)中的两片目标芯片的细胞成球后，将两片培养不同种类细胞的目标芯片按照图4所示进行上下对接，让两片芯片的亲水区域的液滴融合2s，使上面芯片的细胞球融合进入下面的液滴中，移走上层芯片；
(10)将下层芯片继续按照步骤(8)中的悬滴培养24h；得到的目标芯片即为双球共培养阵列芯片，所述的芯片的每个亲水区域都吸附有一个目标液滴，每个液滴都有两种细胞的细胞球；完整的培养过程及操作如图7中的左图所示，图7中的右图为细胞球培养装置实物图。
(11)根据实验要求对步骤(10)中融合好的脂肪细胞-乳腺肿瘤细胞组装体进行必要处理和分析。如图8所示，经过96h的培养，MCF-7细胞球和脂肪细胞球逐渐融合为一个大的脂肪细胞-乳腺肿瘤细胞组装体，组装体随着培养时间的延长，逐渐变圆。在共培养的过程中，发现MCF-7肿瘤细胞将脂肪细胞包裹，现象的发现启发了我们对肿瘤-脂肪组织的相互作用的理解，后续可通过一系列实验验证肿瘤-脂肪相互作用的生物学机制。
实施例2：本发明结合肠类器官-血管组织组装体详细阐述。
(1)首先，将直径75mm玻璃片清洗干净后氮气吹干备用；
(2)利用激光雕刻机在聚四氟乙烯膜上雕刻如图1所示的阵列；
(3)将雕刻好的聚四氟乙烯膜通过热键和在玻璃片上，由此亲疏水阵列芯片制作完成，其中玻璃片裸露区域为亲水区域，可接种细胞悬液，聚四氟乙烯膜区域为疏水区域，将制备好的芯片放入干净培养皿中备用；
(4)制备用于悬滴培养的固定支架：利用激光雕刻机在一面贴有双面胶的亚克力板上雕刻如图2中的(a)所示两种方块，并将两种方块组装成图2中的(a)所示阶梯方块；
(5)将步骤(3)制备的阵列芯片接入细胞后和步骤(4)阶梯方块，放入超净台中紫外灭菌30min，并按照图2中的(b)进行组装，在细胞培养皿中放入无菌滤纸并加入无菌水保湿；
(6)消化人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)，并制备终浓度为2.5×105个/mL的细胞悬液，接种至步骤(3)中的阵列中，每个亲水点接种8uL细胞悬液；按照图3所示进行悬滴培养；
(7)准备从原代肠道内皮细胞经过诱导成熟的肠道类器官，接种至步骤及(3)中的制备好的阵列中；按照图3所示进行悬滴培养；
(8)分别将步骤(6)和步骤(7)制备的细胞球培养阵列，放置到步骤(5)中的培养皿中进行悬滴培养48h，并进行实时观察；
(9)待步骤(8)中的两片目标芯片的细胞成球后，将两片培养不同种类细胞的目标芯片按照图4所示进行上下对接，让两片芯片的亲水区域的液滴融合2s，使上面芯片的细胞球融合进入下面的液滴中，移走上层芯片；
(10)将下层芯片继续按照步骤(8)中的悬滴培养24h；得到的目标芯片即为双球共培养阵列芯片，所述的芯片的每个亲水区域都吸附有一个目标液滴，每个液滴都有两个细胞球；
(11)根据实验要求对(10)中融合好的肠类器官-血管组装体进行必要处理和分析。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种基于亲疏水阵列芯片的三维细胞球悬滴培养方法，其特征在于，在亲疏水阵列芯片的亲水区域滴加细胞悬液，然后将所述芯片接种细胞的一面朝下，悬空放置在细胞培养板中，利用亲水区域的吸附特性进行悬滴成球培养；
所述亲疏水阵列芯片的制备具体为：使用聚二甲基硅氧烷膜或聚四氟乙烯膜上制备出阵列，将所述阵列和玻璃片进行共价键合或热键合制备得到亲疏水阵列；
所述芯片悬空放置具体步骤为：先制备用于悬滴培养的固定支架，将支架与接种有细胞的亲疏水阵列芯片组装并放入到培养皿中，使接种有细胞的一面在培养皿中悬滴培养。
2.如权利要求1所述的基于亲疏水阵列芯片的三维细胞球悬滴培养方法，其特征在于，所述细胞为脂肪细胞、乳腺肿瘤细胞、肠类器官细胞培养物或血管内皮细胞。
3.一种基于亲疏水阵列芯片的三维细胞球共培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在各个亲疏水阵列芯片的亲水区域分别滴加不同的细胞悬液，然后将所述芯片接种细胞的一面朝下，分别悬空放置在细胞培养板中，利用亲水区域的吸附特性进行悬滴成球培养；
（2）在步骤（1）所述细胞悬液培养成细胞球后，将不同的细胞球阵列上下对接，使两片芯片的亲水区域的液滴融合，并移走上层的芯片，将下层的芯片继续悬滴培养，直至液滴内的细胞球融合生长，实现三维细胞共培养；
所述亲疏水阵列芯片的制备具体为：在聚二甲基硅氧烷膜或聚四氟乙烯膜上制备出阵列，将所述阵列和玻璃片进行共价键合或热键合制备得到亲疏水阵列；
所述芯片悬空放置具体步骤为：先制备用于悬滴培养的固定支架，将支架与接种有细胞的亲疏水阵列芯片组装并放入到培养皿中，使接种有细胞的一面在培养皿中悬滴培养。
4.如权利要求3所述的基于亲疏水阵列芯片的三维细胞球共培养方法，其特征在于，所述不同的细胞分别为脂肪细胞和乳腺肿瘤细胞，或者分别为肠类器官细胞培养物和血管内皮细胞。
5.如权利要求3所述的基于亲疏水阵列芯片的三维细胞球共培养方法，其特征在于，所述步骤（2）之后，还包括将融合生长的细胞球与其它的不同的细胞球阵列上下对接，待液滴融合后进行悬滴培养。
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