CN106566863B - 一种基于微流控芯片的细胞双向侵袭监测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于微流控芯片的细胞双向侵袭监测方法,使用微流控芯片进行细胞双向侵袭的监测,可以同时观察比较不同细胞或因子对目标细胞发生侵袭的诱导或抑制作用,也可以同时观察某种细胞或因子对不同目标细胞发生侵袭的诱导或抑制作用。所述的微流控芯片主要由3个主通道及两个胶原通道组成,三个用于细胞培养的主通道横向与两个用于细胞迁移观察的胶原通道相连通;中间主通道(1)左连左侧胶原通道(2),右连右侧胶原通道(4),左侧胶原通道(2)左连左侧主通道(3),右侧胶原通道(4)右连右侧主通道(5)。该方法具有对细胞运动实时追踪的特点,能够实现对细胞运动的准确定位,同时观察比较细胞侵袭的能力和选择性。
Description
技术领域
本发明涉及将微流控芯片技术应用到实时监测的细胞生物学研究的技术领域,具体涉及一种基于微流控芯片的细胞双向侵袭监测方法。
背景技术
细胞生物学发展至今,主要的培养和研究依赖于孔板和商品化的transwell小室,集中观察单一或者多种因素刺激下细胞形态变化、生长过程、侵袭和增殖行为等。细胞侵袭一般起始于细胞对其微环境刺激的感应,微环境刺激通过细胞表面受体激活一系列的胞内信号转导通路与基因转录,并进而通过细胞极性的改变、细胞的粘附及去粘附、细胞骨架的重排等多个环节,最终完成细胞形态和位置的改变。尤其对于肿瘤细胞而言,其侵袭过程与肿瘤转移密切相关,肿瘤转移是一个多步骤连续性很强的主动过程,可分为以下几个步骤,即局部浸润、渗入血管、随血液循环系统转移并在其中存活、肿瘤细胞外渗移出血管、在新的部位定居并增殖。肿瘤细胞侵袭涉及到肿瘤细胞从二维的血管微环境进入周围三维微组织的过程,也是肿瘤转移发生过程决速步的过程。在这个过程中,如能比较不同细胞的侵袭能力以及细胞对不同因子诱导侵袭的不同响应,在药物研发以及医学研究中有着重要的意义。孔板或者Transwell小室很难在体外构建二维平面到三维空间的界面转换,所以想模拟和重现上述细胞侵袭过程是比较困难的。
微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术,已经在生物医学领域展现了其独特的优势,更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控,易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。它对于实验结果能够实时追踪,不仅能够获得最终结果,也可以得到细胞侵袭过程中出现的暂时性信息,为细胞侵袭过程提供常规分析中有可能缺失的重要生物学信息。而目前,利用微流控芯片进行细胞发生侵袭过程监测已有初步研究,但已有的微流控芯片设计无法实现同时观察比较,在研究中进行平行多组实验容易造成不同组间的差异,影响实验数据的准确性。能够同时观察比较细胞从二维平面选择性侵袭运动到三维基质过程的研究分析还处于空白阶段。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的细胞双向侵袭监测方法,特别针对细胞从二维平面选择性侵袭运动到三维基质中的过程,该方法具有对细胞运动实时追踪的特点,同时能够实现对细胞运动的准确定位,同时观察比较细胞侵袭的能力和选择性。
一种基于微流控芯片的细胞双向侵袭监测方法,使用微流控芯片进行细胞双向侵袭的监测,可以同时观察比较不同细胞或因子对目标细胞发生侵袭的诱导或抑制作用,也可以同时观察某种细胞或因子对不同目标细胞发生侵袭的诱导或抑制作用。
所述的微流控芯片主要由3个主通道及两个胶原通道组成,三个用于细胞培养的主通道横向与两个用于细胞迁移观察的胶原通道相连通;中间主通道左连左侧胶原通道,右连右侧胶原通道,左侧胶原通道连接左侧主通道,右侧胶原通道连接右侧主通道。
所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成,主通道高度为300μm,胶原通道高度为100μm。
同时观察比较不同细胞或因子对细胞侵袭的诱导或抑制作用时,将细胞A接种于中间主通道,左侧主通道、右侧主通道分别接种细胞B、C或加入不同的因子D、E,可以观察到细胞A受细胞B、C或因子D、E的作用向左侧胶原通道、右侧胶原通道发生不同选择性的侵袭。
同时观察比较某种细胞或因子对不同细胞侵袭的诱导或抑制作用时,在左侧主通道、右侧主通道接种不同的细胞B、C,中间主通道接种细胞A或加入某种因子D,可以观察到细胞B、C受细胞A或因子D的作用向左侧胶原通道、右侧胶原通道发生不同选择性的侵袭,比较细胞B、C的侵袭能力。
同时观察比较不同细胞或因子对细胞侵袭的诱导或抑制作用时,具体步骤为:
(1)芯片胶原灌注
用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原通道,加1mLPBS缓冲液于培养皿中,将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min,促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶,凝胶过程结束后,细胞主通道加入新鲜的细胞培养液;
(2)芯片细胞接种及培养
细胞A消化后,调整细胞密度为3×106/mL,取10μL细胞悬液加入中间主通道,左侧主通道、右侧主通道可接种不同的细胞B、C或含不同因子D、E的细胞培养基,在光学显微镜下观察到细胞均匀分布,将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次,并拍照记录细胞所在位置;
(3)芯片细胞侵袭实时监测
将固定芯片的培养皿放入载物台培养箱,调节焦距及拍摄参数,每隔12小时拍照一张,记录细胞运动位置及形态改变;
同时观察某种细胞或因子对不同目标细胞发生侵袭的诱导或抑制作用具体步骤为:
(1)芯片胶原灌注
用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原通道,加1mLPBS缓冲液于培养皿中,将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min,促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶,凝胶过程结束后,细胞主通道加入新鲜的细胞培养液;
(2)芯片细胞接种及培养
细胞B消化后,调整细胞密度为1×106/mL,取10μL细胞悬液加入左侧主通道,立即将芯片竖立,并移入37℃培养箱中放置。竖立方向为左侧主通道朝上,而左侧胶原通道朝下;竖立放置10min后,取出观察,如果细胞紧贴在主通道与胶原的交汇处,可以在三维基质界面形成细胞层;37℃培养箱中培养6小时,将细胞C消化,调整细胞密度为1×106/mL,取10μL细胞悬液加入右侧主通道,立即将芯片竖立,并移入37℃培养箱中放置。竖立方向为右侧主通道朝上,而右侧胶原通道朝下;竖立放置10min后,取出观察,如果细胞紧贴在主通道与胶原的交汇处,可以在三维基质界面形成细胞层;中间主通道可接种细胞A或含某种因子D的细胞培养基,将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次,并拍照记录细胞所在位置;
(3)芯片细胞侵袭实时监测
将固定芯片的培养皿放入载物台培养箱,调节焦距及拍摄参数,每隔12小时拍照一张,记录细胞运动位置及形态改变。
细胞侵袭入胶原后蛋白表达检测,具体为:
细胞接种到芯片上,培养3天后,进行细胞免疫荧光染色,具体步骤如下:多聚甲醛固定,缓冲液冲洗;致孔剂作用,缓冲液冲洗;封闭血清作用,一抗4℃过夜孵育,缓冲液冲洗;二抗常温孵育,缓冲液冲洗后,加入细胞核标记染料,荧光显微镜下拍照,记录细胞内检测蛋白的表达情况。
本发明提供的基于微流控芯片技术的细胞双向侵袭监测方法,所述胶原为I型鼠尾胶原或matrigel基质胶,低温下是呈粘稠状的液体,当pH=7,温度达到37℃的情况下,孵育30min,可呈现果冻状的凝胶。
本发明提供的基于微流控芯片技术的细胞双向侵袭监测方法,可采用生物学上常用的细胞检测手段对迁移运动到胶原中的细胞进行检测,包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、PCR检测、蛋白质检测等。
附图说明
图1a本发明微流控芯片整体结构示意图;b本发明微流控芯片截面图;
图2本发明微流控芯片整体结构实物图;
图3高糖、低糖对U87细胞侵袭能力的不同影响;
图4高糖诱导U87-HIF和U87发生的不同程度侵袭;
其中1中间主通道,3左侧主通道,5右侧主通道,2左侧胶原通道,4右侧胶原通道。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明,但并不因此而限制本发明。
本发明微流控芯片整体结构示意图如图1所示,本发明微流控芯片整体结构实物图如图2所示。
所述的微流控芯片主要由3个主通道及两个胶原通道组成,三个用于细胞培养的主通道横向与两个用于细胞迁移观察的胶原通道相连通;中间主通道1左连左侧胶原通道2,右连右侧胶原通道4,左侧胶原通道2连接左侧主通道3,右侧胶原通道4连接右侧主通道5。
所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成,主通道高度为200-300μm,胶原通道高度为70-100μm。
本发明提供的微流控芯片,由上下两层不可逆封接而成,上层材料为可透光透气的PDMS聚合物,下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃或PDMS聚合物。
本发明提供的微流控芯片,上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理,然后氧等离子体处理60s进行封接。
以下实施例中黑色区域的芯片高度为300μm,灰色区域的芯片高度为100μm。
实施例1
高糖、低糖对U87细胞侵袭能力的不同影响
将4mg/mL的胶原灌注到芯片胶原通道凝结后,将U87接种于中间主通道1,左侧主通道3加入低糖培养基(葡萄糖5.5mM),右侧主通道5加入高糖培养基(葡萄糖25mM),可以观察到U87同时受高糖及低糖作用向左侧胶原通道2、右侧胶原通道4发生不同选择性的侵袭,高糖明显促进了U87细胞的侵袭。
细胞接种到芯片24h后,隔12小时拍照一张,将固定芯片的培养皿放入载物台培养箱。调节焦距及拍摄参数,每显微镜拍照实时记录细胞运动位置及形态改变,共拍摄108小时,第48小时拍摄结果如图3所示。
实施例2
高糖诱导U87-HIF和U87发生的不同程度侵袭
将4mg/mL的胶原灌注到芯片胶原通道凝结后,在左侧主通道3接种U87细胞,右侧主通道5接种U87-HIF细胞,中间主通道1加入高糖培养基(葡萄糖25mM),可以观察到U87、U87-HIF受高糖的作用向左侧胶原通道2右侧胶原通道4发生不同程度的侵袭,U87-HIF细胞的侵袭能力明显强于U87细胞。细胞接种到芯片24h后,将固定芯片的培养皿放入载物台培养箱。调节焦距及拍摄参数,显微镜拍照实时记录细胞运动位置及形态改变,共拍摄108小时,第48小时拍摄结果如图4所示。
Claims (1)
1.一种基于微流控芯片的细胞双向侵袭监测方法,其特征在于,使用微流控芯片进行细胞双向侵袭的监测,同时观察某种细胞或因子对不同目标细胞发生侵袭的诱导或抑制作用;所述的微流控芯片主要由3个主通道及两个胶原通道组成,三个用于细胞培养的主通道横向与两个用于细胞迁移观察的胶原通道相连通;中间主通道(1)左连左侧胶原通道(2),右连右侧胶原通道(4),左侧胶原通道(2)左连左侧主通道(3),右侧胶原通道(4)右连右侧主通道(5);
所述3个主通道高度均为300μm;两个胶原通道高度均为100μm;
同时观察比较某种细胞或因子对不同细胞侵袭的诱导或抑制作用时,在左侧主通道(3)、右侧主通道(5)接种不同的细胞B、C,中间主通道(1)接种细胞A或加入某种因子D,可以观察到细胞B、C受细胞A或因子D的作用向左侧胶原通道(2)、右侧胶原通道(4)发生不同选择性的侵袭,比较细胞B、C的侵袭能力;
同时观察某种细胞或因子对不同目标细胞发生侵袭的诱导或抑制作用具体步骤为:
(1) 芯片胶原灌注
用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原通道,加1mLPBS 缓冲液于培养皿中,将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min,促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶,凝胶过程结束后,细胞主通道加入新鲜的细胞培养液;所述胶原为I 型鼠尾胶原或matrigel基质胶;
(2)芯片细胞接种及培养
细胞B消化后,调整细胞密度为1×106/mL,取10μL 细胞悬液加入左侧主通道(3),立即将芯片竖立,并移入37℃培养箱中放置,竖立方向为左侧主通道(3)朝上,而左侧胶原通道(2)朝下;竖立放置10min 后,取出观察,使细胞紧贴在主通道与胶原的交汇处,在三维基质界面形成细胞层;37℃培养箱中培养6小时,将细胞C消化,调整细胞密度为1×106/mL,取10μL 细胞悬液加入右侧主通道(5),立即将芯片竖立,并移入37℃培养箱中放置,竖立方向为右侧主通道(5)朝上,而右侧胶原通道(4)朝下;竖立放置10min 后,取出观察,使细胞紧贴在主通道与胶原的交汇处,在三维基质界面形成细胞层;中间主通道(1)接种细胞A或含因子D的细胞培养基,将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、每隔24h 换液一次,并拍照记录细胞所在位置;
(3) 芯片细胞侵袭实时监测
将固定芯片的培养皿放入载物台培养箱,调节焦距及拍摄参数,每隔12小时拍照一张,记录细胞运动位置及形态改变。
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