CN103305421A

CN103305421A - 基于pdms的三维细胞共培养模型及制备方法

Info

Publication number: CN103305421A
Application number: CN2013102480386A
Authority: CN
Inventors: 林洪丽; 张团儿; 滕佳琪
Original assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Priority date: 2013-06-21
Filing date: 2013-06-21
Publication date: 2013-09-18

Abstract

本发明公开了一种基于PDMS的三维细胞共培养模型，包括模型体，在模型体内侧设有左培养池和右培养池，在左培养池和右培养池之间设有隔层，在隔层上设有连通左培养池和右培养池的开口，在左培养池和右培养池内均配有与所述隔层的侧面相贴合的挡块。本发明的基于PDMS的三维细胞共培养模型，可建立两种细胞在同一平面的三维共培养体系，可以实现对两种细胞相互作用的动态观察，可以进行细胞迁移、趋化、侵袭以及成管实验，便于在原位或收集细胞进行分子生物学检测，并且克服了垂直共培养无法排除重力干扰的缺陷，可以反复使用并具有简单易行、重复性好、廉价安全等优点。本发明还公开了模型的制备方法，该方法工艺简单、好操作、易控制。

Description

基于PDMS的三维细胞共培养模型及制备方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养模型及制备方法，特别是一种基于PDMS的三维细胞共培养模型及制备方法。

背景技术

体外细胞共培养（co-culture）是将两种细胞（可以来自同一种组织，也可以来自不同的组织）混合共同培养，从而使其中一种细胞的形态和功能稳定表达，并维持较长时间。细胞共培养技术能模拟体内生成的微环境，便于更好的观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能作用的靶点，填补了单层细胞培养和整体动物实验的鸿沟。

该技术能够主要涉及以下几方面的实验和应用：1. 细胞与细胞之间的接触作用，引起胞质膜的直接接触并产生细胞外基质 ECM，其含有间质胶原、纤连蛋白、蛋白多糖及层粘连蛋白等成分，从而模拟了与体内相似的微环境，维持细胞的立体构形及促进细胞的功能。2. 细胞与细胞之间的相互作用，观察细胞共培养后其功能、性状和生长行为的变化，如某一细胞的分泌物对另外一种细胞基因表达的影响，细胞与细胞之间的“对话”等。3. 研究药物对细胞形态、功能的影响及相关机制，为新药研发提供重要技术支持。

目前常见的细胞共培养方法可以大致分为直接接触式共培养和非直接接触式共培养。直接接触式共培养是指在适宜条件下，将两种及两种以上细胞按照一定比例接种于同一培养皿中共同培养，使两种细胞直接接触，并通过旁分泌、自分泌作用产生细胞因子等进行相互作用。其缺点是两种细胞分离较困难，不便于观察和后续检测。非直接接触式共培养是指将两种及两种以上细胞分别接种于不同的载体上，然后将这些载体置于同一个培养环境之中，不同种细胞间不存在直接接触。由于两种细胞容易分离，便于观察和不影响后续的检测，主要包括以下几种技术方法：1. 用一种细胞的培养上清液（含有不同生长因子）与另外一种细胞共培养。其操作简单，但无法动态观察细胞运动的变化。2. 将接种一种细胞的玻片放入培养另一种细胞的培养皿中进行共培养。此方法操作简单，但是不能动态观测细胞间的相互作用和细胞运动。3. 将两种细胞先后接种于同一培养皿中垂直共培养，中间以基质胶或聚碳酸酯膜分隔的夹心式共培养法。4. Transwell共培养法：应用一类有通透性的杯状装置，杯子底部覆有具通透性的膜聚碳酸酯膜（孔径大小有0.1-12.0um）将 Transwell 小室放入培养板中，细胞A种在上室内，下层培养板中接种细胞B 并且其培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。以上两种方法的优点是可以模拟体内环境中细胞的生长结构层次关系，但是其垂直结构对于细胞运动的检测无法排除重力干扰也不利于进行动态观测。5. 基于微流控芯片的细胞共培养：根据实验的不同需要设计特殊结构的微流控芯片，使两种细胞可以在同一芯片的不同培养池中进行共培养。其优点是操作简单，规模化，节省样品用量等，也可以排除重力干扰因素，但不利于收集细胞进行分子生物学检测。

相对于传统的二维化单层细胞培养而言，三维细胞培养技术 (three dimensional cell culture, TDCC) 是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞载体复合物。三维细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中，细胞外基质 (extra cellular matrix, ECM) 蛋白充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构，以此创建的细胞生长环境可以最大程度地模拟体内环境。目前细胞三维培养应用的生物材料主要包括：人工软骨、PET聚乙烯酯、纤维蛋白支架、胶原支架、旋转生物反应器、微胶囊和中空纤维等。

虽然目前有很多不同的细胞共培养方法和细胞三维培养方法被广泛应用，但是均受到技术问题所限，存在各自的缺点和不足，无法同时满足细胞在水平方向进行共培养、动态观察细胞的相互作用和细胞三维生长和运动变化、收集足量的细胞进行后续分子生物学检测等几方面的实验需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种结构简单、成本低廉、具有两个分隔细胞培养池、便于三维动态观察细胞间相互作用产生的形态和运动变化、有利于收集细胞进行分子生物学检测的基于PDMS的三维细胞共培养模型及制备方法，克服现有技术的不足。

本发明的基于PDMS的三维细胞共培养模型，包括模型体，在模型体内侧设有左培养池和右培养池，在左培养池和右培养池之间设有隔层，在隔层上设有连通左培养池和右培养池的开口，在左培养池和右培养池内均配有与所述隔层的侧面相贴合的挡块；模型体、挡块的材料为SYLGARD 184硅橡胶，该硅橡胶是由液体组分组成的双组分套件产品，包括基本组分与固化剂，基本组分与固化剂按10:1质量比完全混合。

本发明的基于PDMS的三维细胞共培养模型，其中所述的开口在宽度方向上呈下宽上窄形状；所述的左培养池和右培养池相对于隔层对称设置。

本发明的基于PDMS的三维细胞共培养模型，其中所述的模型体和隔层的高度为8—12mm；所述的开口位于隔层的中间位置，开口的下宽为2.5—3.5 mm，上宽为1.5—2.5 mm。

本发明的基于PDMS的三维细胞共培养模型的制备方法：

所述的基于PDMS的三维细胞共培养模型中的模型体、挡块的材料为SYLGARD 184硅橡胶，该硅橡胶是由液体组分组成的双组分套件产品，包括基本组分与固化剂，基本组分与固化剂按10:1质量比完全混合；

模具的准备：包括模具体，在模具体内部有模具体内腔，在模具体内腔的内部放置有对称的呈半圆状的右内模和左内膜，右内膜内部有右内膜腔，左内膜内部有左内膜腔；右内模和左内膜之间有间隙；模具体、右内模和左内膜均为不锈钢材料；模具体内腔的深度、右内模和左内膜的深度均为8—12mm；

将上述完全混合的物料倒入模具体内腔、右内模腔和左内膜腔中，在 80℃下烘烤固化2小时，形成本发明的PDMS模型；

待冷却后，将固化物从模具体中剥离，拆除嵌入其中的右内模和左内膜，并将右内膜腔和左内膜腔内形成的半圆形固化物取出，最后形成一个环形的有两个培养池且两个培养池中间有隔层的PDMS模型体和两个半圆形的PDMS模块；

将模型体中间的隔层取中点截断，修剪出所述的开口；

将两个半圆形PDMS模块切割成长方体状形成两个可紧贴在隔层侧面的挡块。

本发明的基于PDMS的三维细胞共培养模型，可建立两种细胞在同一平面的三维共培养体系，可以实现对两种细胞相互作用的动态观察，可以进行细胞迁移、趋化、侵袭以及成管实验，便于在原位或收集细胞进行分子生物学检测，并且克服了垂直共培养无法排除重力干扰的缺陷，可以反复使用并具有简单易行、重复性好、廉价安全等优点。本发明的方法工艺简单，好操作，易控制。

附图说明

图1是本发明具体实施方式的结构示意图；

图2是图1所示的俯视示意图；

图3是图1所示的A-A剖视示意图；

图4是图2所示的在培养池中加入挡块后的结构示意图；

图5是制作本发明的基于PDMS的三维细胞共培养模型的模具结构示意图；

图6是图5所示的俯视示意图。

具体实施方式

如图1、2、3、4所示：1为模型体，呈回转体形状，在模型体1内侧有两个培养池，即左培养池3和右培养池4。在左培养池3和右培养池4之间设有与模型体1成一体结构的隔层2，在隔层2上设有连通左培养池3和右培养池4的开口8。开口8位于隔层2的中间位置，即左培养池3和右培养池4相对于隔层2对称设置。在左培养池3和右培养池4内各配有一个与隔层2的侧面相贴合的挡块7，当两个挡块7靠合在隔层2上时，在开口8处形成了一个空隙。上述开口8在宽度方向上可呈下宽上窄形状。开口8的下宽6为3 mm ，即在2.5—3.5 mm之间均可，上宽5为2 mm ，即在1.5—2.5 mm之间均可。模型体1和隔层2的高度为10 mm ，即在8—12mm之间均可。模型体1、挡块7的材料为SYLGARD 184硅橡胶，该硅橡胶是由液体组分组成的双组分套件产品，包括基本组分与固化剂，基本组分与固化剂按10:1质量比完全混合。

本发明的基于PDMS的三维细胞共培养模型制备方法如下：模型体1的材料为SYLGARD 184硅橡胶，该硅橡胶是由液体组分组成的双组分套件产品，包括基本组分与固化剂。基本组分与固化剂按10:1质量比完全混合，中等粘度混合液的稠度与SAE 40机油相似。

如图5、6所示：10为模具体，有模具体内腔11，在模具体内腔11的内部放置有对称的呈半圆状的右内模12和左内膜15，右内膜12内部有右内膜腔13，左内膜15内部有左内膜腔14。右内模12和左内膜15之间有间隙。模具体10、右内模12和左内膜15均为不锈钢材料。模具体内腔11的深度、右内模12和左内膜15的深度均为10 mm ，即在8—12mm之间均可。

将上述完全混合的物料倒入模具体内腔11、右内模腔13和左内膜腔14中，在 80℃下烘烤固化2小时，形成本发明的PDMS模型。

待冷却后，将固化的PDMS模型从模具体10中剥离，拆除嵌入其中的右内模12和左内膜15，并将右内膜腔13和左内膜腔14内形成的半圆形固化物取出，最后形成一个环形的有两个培养池且两个培养池中间有隔层2的PDMS模型体1和两个半圆形的PDMS模块。

将模型体1中间的隔层2取中点截断，修剪出上述的开口8。

将两个半圆形PDMS模块切割成适当大小的长方体模块形成两个挡块7。

本发明的模型的使用：使用前将上述模型进行高压灭菌和紫外线照射灭菌。

实验例1：基于PDMS的三维细胞共培养模型应用于两种细胞水平方向共培养及观察二者的相互作用。

将本模型体1置入6孔板内并压紧使其底部紧贴6孔板底，将两个长方体状的挡块7分别紧贴在隔层2的开口8的两侧，使其形成一处空隙，将20ul基质胶（美国BD公司）注入空隙，37℃孵育1小时使其凝固，待基质胶凝固后取出两侧的长方体状的挡块7。此时，通过凝固的基质胶分隔出两个培养池，即右培养池4和左培养池3。

将一种细胞接种于左培养池3，将另一种细胞接种入右培养池4，两者的培养液可以通过基质胶，可以实现水平方向的两种细胞共培养以及进行动态观察、原位检测和收集细胞检测。

以肾小球内皮细胞为例，将其接种于右培养池4，左培养池3空置，光镜下可见本模型体培养池中的细胞和正常培养板中的细胞相比较，细胞生长状态相同，外观形态相同，以Real time-PCR、Western blot和免疫荧光检测细胞骨架蛋白F-actin表达无差异，细胞凋亡检测结果无差异。之后将肾小球足细胞接种于左培养池，与右侧培养池中的肾小球内皮细胞共培养24小时，内皮细胞生长曲线、PCNA检测结果提示在本模型中共培养足细胞能显著刺激肾小球内皮细胞的增殖，其结果与应用传统Transwell体系的实验结果相比具有一致性。

实验例2：本发明的模型应用于一种细胞（或培养液中的成分）影响另一种细胞三维形态和运动的实验。

模型放置和细胞接种方法同实验例1。将一种细胞（或含有某成分的培养液）接种于左侧培养池，将另一种细胞接种于右侧培养池，可以动态观察前者对后者的作用，以及使后者向基质胶内生长、迁移的影响作用，从而观察细胞三维形态和运动的变化。适用于细胞迁移、趋化、侵袭、血管内皮细胞体外血管形成、肿瘤细胞侵袭等实验。

例如，在本模型的右培养池4中接种肾小球内皮细胞，左培养池3分别加入正常培养液、含VEGF（50pg/ml）的培养液、接种足细胞，观察这三组的肾小球内皮细胞在光镜下的形态、迁移、成管的变化。结果显示VEGF和足细胞均能显著刺激肾小球内皮细胞向基质胶中迁移并形成管状结构，其结果与应用传统Transwell体系的实验结果相比具有一致性，但是应用本发明的基于PDMS的三维细胞共培养模型具有更便于进行动态观察的优点。

Claims

1.一种基于PDMS的三维细胞共培养模型，其特征在于：包括模型体（1），在模型体（1）内侧设有左培养池（3）和右培养池（4），在左培养池（3）和右培养池（4）之间设有隔层（2），在隔层（2）上设有连通左培养池（3）和右培养池（4）的开口（8），在左培养池（3）和右培养池（4）内均配有与所述隔层（2）的侧面相贴合的挡块（7）；模型体（1）、挡块（7）的材料为SYLGARD 184硅橡胶，该硅橡胶是由液体组分组成的双组分套件产品，包括基本组分与固化剂，基本组分与固化剂按10:1质量比完全混合。

2.根据权利要求1所述的基于PDMS的三维细胞共培养模型，其特征在于：所述的开口（8）在宽度方向上呈下宽上窄形状；所述的左培养池（3）和右培养池（4）相对于隔层（2）对称设置。

3.根据权利要求2所述的基于PDMS的三维细胞共培养模型，其特征在于：所述的模型体（1）和隔层（2）的高度为8—12mm；所述的开口（8）位于隔层（2）的中间位置，开口（8）的下宽（6）为2.5—3.5 mm，上宽（5）为1.5—2.5 mm。

4.一种如权利要求1或2或3所述的基于PDMS的三维细胞共培养模型的制备方法，其特征在于：

所述的基于PDMS的三维细胞共培养模型中的模型体（1）、挡块（7）的材料为SYLGARD 184硅橡胶，该硅橡胶是由液体组分组成的双组分套件产品，包括基本组分与固化剂，基本组分与固化剂按10:1质量比完全混合；

模具的准备：包括模具体（10），在模具体（10）内部有模具体内腔（11），在模具体内腔（11）的内部放置有对称的呈半圆状的右内模（12）和左内膜（15），右内膜（12）内部有右内膜腔（13），左内膜（15）内部有左内膜腔（14）；右内模（12）和左内膜（15）之间有间隙；模具体（10）、右内模（12）和左内膜（15）均为不锈钢材料；模具体内腔（11）的深度、右内模（12）和左内膜（15）的深度均为8—12mm；

将上述完全混合的物料倒入模具体内腔（11）、右内模腔（13）和左内膜腔（14）中，在 80℃下烘烤固化2小时，形成本发明的PDMS模型；

待冷却后，将固化物从模具体（10）中剥离，拆除嵌入其中的右内模（12）和左内膜（15），并将右内膜腔（13）和左内膜腔（14）内形成的半圆形固化物取出，最后形成一个环形的有两个培养池且两个培养池中间有隔层（2）的PDMS模型体（1）和两个半圆形的PDMS模块；

将模型体（1）中间的隔层（2）取中点截断，修剪出所述的开口（8）；

将两个半圆形PDMS模块切割成长方体状形成两个可紧贴在隔层（2）侧面的挡块（7）。