JP6532783B2

JP6532783B2 - 観察窓部を有する細胞培養容器、細胞培養装置及び培養細胞の側面からの観察方法

Info

Publication number: JP6532783B2
Application number: JP2015144945A
Authority: JP
Inventors: 健東ヶ▲崎▼
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2015-07-22
Filing date: 2015-07-22
Publication date: 2019-06-19
Anticipated expiration: 2035-07-22
Also published as: JP2017023049A

Description

本発明は、培養細胞の観察技術に関する。

一般的な細胞培養プレートやシャーレ等で培養する平面的な２次元培養に対して、縦方向の厚みを持たせて細胞を培養する３次元培養が知られており、この３次元培養は２次元培養よりも生体内の組織細胞の状態に近く、より生体に近い反応が観察できるとして、生体内環境を模した実験モデルの確立に適しているとされている。
例えば、３次元培養された細胞は細胞間の刺激伝達が３次元的であり、細胞塊の内部と外部とで培地や薬剤の供給経路が異なるなど生体に近い環境を再現できることや、肝細胞など２次元培養ではすぐに活性が低下してしまう細胞でも、３次元培養では長期間にわたって活性を維持できること、さらには、幹細胞から各種細胞への分化において効率を高めることができるなど、３次元培養を使用した組織モデルに関する研究報告がなされている。
また、このような３次元培養を行う培養容器が開発されている（特許文献１、２参照）。

一方、生体内環境を模した試験モデルにおいては、生きたままの細胞組織や生体分子を観察することが不可欠である。
一般的な２次元培養による細胞は、細胞培養器の底面部にカバーガラスを配置したガラスボトムデッシュやカバーガラスチャンバーと呼ばれる培養容器を使用して、正立・倒立顕微鏡により観察を行うことができる。
これに対し、３次元培養は、ガラスボトムデッシュの上に透明のポリカーボネート膜等の支持体を有するインサートを載せ、共焦点顕微鏡を使用して観察を行うと、３次元培養の「ＸＹ面」を観察することができる（特許文献１、３を参照）。
また、共焦点顕微鏡を使用して「Ｚ方向」に複数枚スキャンすれば３次元の画像構築が可能であり、３次元培養の側面部の画像を得ることができるものの、分解能は焦点深度の厚みに依存するために著しく低下することに加え、複数回細胞をスキャンすることで光毒性、蛍光標識の褐色が発生するなど問題も多い。
さらに、組織を固定して切片を作成する観察手法は広く知られており、これを利用すれば、３次元培養の側面観察も可能であるが、生きたままの細胞側面を観察することは不可能である。

特開２０１３−０２７３８４号公報特開２０１２−１１５２６２号公報特開２０１５−０８９３６３号公報

そこで、本発明は、細胞、多数の細胞の凝集体であるスフェロイド、３次元に積層化させた組織細胞を生きたままの状態で、顕微鏡等を使用して側面から観察する手段を開発することを目的としている。

本発明は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞を培養し観察する容器について、細胞を播種する支持体上の培養面に対して６０度から１２０度の範囲の角度をなす様に観察窓部を配置したものである。これにより、細胞、多数の細胞の凝集体であるスフェロイド、３次元に積層化させた組織細胞を生きたままの状態で観察できることとなった。

本発明は、具体的には次の事項を要旨とする。
１．細胞を播種する支持体上の培養面に対して、６０度から１２０度の範囲の角度をなすように配置された観察窓部を有する細胞培養容器。
２．細胞を播種する支持体の素材が、ポリカーボネート、コラーゲン、ポリスチレン、ガラスのいずれかより選択されることを特徴とする１．記載の細胞培養容器。
３．観察窓部が、顕微鏡観察に適した部材により覆われていることを特徴とする、１．または２．記載の細胞培養容器。
４．観察窓部が、顕微鏡観察用のカバーガラスにより覆われていることを特徴とする、１．または２．記載の細胞培養容器。
５．細胞を播種する支持体によって区切られた第１室と第２室とを備えることを特徴とする１．から４．のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
６．細胞を播種する支持体が、ポリカーボネート膜またはコラーゲン膜から選択されることを特徴とする５．記載の細胞培養容器。
７．第１室に細胞植え付け用及び培地注入交換用の開口部を、第２室に培地注入交換用の開口部を有することを特徴とする５．または６．記載の細胞培養容器。
８．第１室及び第２室のそれぞれの開口部は、着脱可能に取り付けられるキャップを有し、前記キャップは液密性と気体の流通を許容するガス透過領域とを備えることを特徴とする７．記載の細胞培養容器。
９．１．から８．のいずれか一項に記載の細胞培養容器が連続して隣接していることを特徴とする、細胞培養装置。
１０．細胞培養容器の観察窓部が連続して１つの窓部を構成するように配置されたことを特徴とする、９．記載の細胞培養装置。
１１．１．から８．のいずれか一項に記載の細胞培養容器または、９．または１０．記載の細胞培養装置を用いて、３次元培養した培養細胞の側面方向を、観察窓部を通して側面方向から観察する方法。
１２．観察する対象が３次元皮膚モデルであることを特徴とする、１１．記載の観察方法。

１．培養している細胞組織を側面から観察できる細胞培養容器を実現した。
本発明の細胞培養容器は、培養面に対して６０度から１２０度の範囲の角度をなす様に配置された観察窓部を有するので、培養面を下から観察する従来の細胞培養容器では観察することができなかった、細胞の側面や、細胞増殖により形成される組織構造の側面の観察を、細胞が生きたままの状態で容易に行うことを可能とする。
２．本発明の細胞培養容器は、培養面に対して６０度から１２０度の範囲の角度をなす様に配置された観察窓部が、顕微鏡観察に適したカバーガラス等の部材で覆われているので、簡便に解像度の高い３次元培養細胞の側面観察画像を得ることを可能とする。また、培養面を下から観察する従来の細胞培養容器に比べて、スキャン回数を大きく減らすことができるので、光毒性、蛍光標識の褐色化等の問題も無く、時間経過による培養細胞の変化を捉えるビデオ撮影やタイムラプスイメージング撮影を可能とする。
また、本発明の細胞培養容器は、培養細胞の側面方向の経時変化を映像や画像として捉えることを可能とするので、細胞接着の形成過程の解明に有用である。
３．本発明の細胞培養容器は、細胞植え付け用と培地注入交換用の開口部があり、それぞれ着脱可能に取り付けられるキャップを有し、前記キャップは液密性と気体の流通を許容するガス透過領域とを備えているので、培養細胞の観察を継続させながら、培養条件を調整することを可能とする。
４．本発明の細胞培養容器を連続して隣接させた細胞培養装置は、実験条件が異なる培養細胞を同時に並べて観察することを可能とし、実験効果の検証効率を向上させることができる。
５．本発明の細胞培養容器や細胞培養装置は、層状構造を有する上皮系の細胞層の各層または組織構造の側面を同時に観察することを可能とするほか、３次元皮膚モデルを使用して皮膚の分化や浸透性を側面から観察することを可能とするので、将来的に、化粧品や医薬品の効果検証にも応用することが可能である。

本発明の一例の細胞培養容器Ａを模式的に示す斜視図である。本発明の一例の細胞培養容器Ｂを模式的に示す図であり、図２（ａ）は斜視図、図２（ｂ）は正面図、図２（ｃ）は側面図である。本発明の一例の細胞培養容器Ｂの製作方法を示す図であり、図３（ａ）は市販の細胞培養容器の切断面を示す図、図３（ｂ）は接着前の各パーツを示す図、図３（ｃ）は接着後の培養容器を示す図である。従来の２次元培養の観察方法を示す模式図である。従来の３次元培養の観察方法を示す模式図である。本発明の３次元培養の側面観察容器の概念図である。本発明の３次元培養の側面観察の概念図であり、図７（ａ）は細胞培養容器を立てた状態で観察する場合であり、図７（ｂ）は細胞培養容器を横にした状態で観察する場合である。本発明の多室型細胞培養装置Ｄを模式的に示す図である。実施例１の単層細胞の側面観察（顕微鏡写真）の図である。実施例１の単層細胞の側面観察において、細胞が移動する様子の観察図（顕微鏡写真）である。実施例２の積層化人工皮膚モデルの側面観察（顕微鏡写真）の図である。

本発明は、細胞を培養し観察する容器について、細胞を播種する支持体上の培養面に対して６０度から１２０度の範囲の角度をなす様に観察窓部を配置したことを特徴とするものであり、細胞、多数の細胞の凝集体であるスフェロイド、３次元に積層化させた組織細胞を生きたままの状態で、容易に、解像度高く、継続的に、側面からの観察を可能とするものである。
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明するが、本発明の技術範囲はこれに限定されるものではない。

＜基本構造＞
図１は、本発明の一例の細胞培養容器Ａを模式的に示す側面図である。
本発明の細胞培養容器Ａは、図１に示すように、細胞を播種する支持体１上の細胞２の培養面３に対して、角度をなす様に配置された観察窓部４を備える。培養面３に対して観察窓部４を配置する方向は、概ね垂直方向であればよく、具体的には、培養面３と観察窓部４のなす角度が、６０度から１２０度の範囲で配置することができる。顕微鏡の光路によっては、光の反射やエバネッセント波を避けるために、培養面３と観察窓部４のなす角度を厳密な垂直からずらした方が良い場合がある。細胞培養容器Ａは、培養液を入れてもよい皿状容器５に載置されている。
細胞培養容器Ａは、一般に細胞を培養する容器に使用される材質であればよく、細胞接着を極力低下させる材質であれば好ましく、容量は目的に応じて適宜設定できるが、少なくとも顕微鏡観察に適した容量とする。
細胞を播種する支持体１の素材としては、ポリカーボネート、コラーゲン、ポリスチレン、ガラス等が挙げられる。特に、皿状容器５に培養液を入れて使用する場合には、細胞を播種する支持体１は、ポリカーボネート膜、コラーゲン膜等の播種した細胞２の接着性を向上させる素材であって、細胞培養に必要な栄養成分を透過する能力を有する素材であることが好ましい。

＜実施態様１＞
図２は、本発明の細胞培養容器Ｂを模式的に示す図であり、図２（ａ）は斜視図、図２（ｂ）は正面図、図２（ｃ）は側面図である。
本発明の細胞培養容器Ｂは、図２に示すように、細胞を播種する支持体１１により第１室１２と第２室１３に区切られており、第１室１２は細胞植え付け用の開口部１４を、第２室１３は培地注入交換用の開口部１５を有している。
さらに、細胞を播種する支持体１１に対して概ね垂直に位置する細胞培養容器Ｂの１つの壁面１６にあって、細胞を播種する支持体１１の界面を含む位置に観察窓部１７が設けられている。この観察窓部１７の大きさは、細胞を播種する支持体１１上に培養される細胞組織の側面が見える大きさでなければならないが、その形は、四角い窓部や丸い窓部等観察に適した形状であればよい。
支持体によって区切られた第１室１２と第２室１３を備える細胞培養容器Ｂの支持体１１は、播種した細胞の接着性を向上させる素材であり、細胞培養に必要な栄養成分を透過する能力を有する素材であることが好ましく、それら素材としては、例えば、ポリカーボネート膜、コラーゲン膜等が挙げられる。
また、観察窓部１７は、顕微鏡観察に適した光透過性の高いカバーガラス等の部材１８で覆う。この部材１８の素材としてはガラスが好ましいが、光の透過性が高く、光の屈折率が低いものであれば、アクリル樹脂などの樹脂製であってもよい。さらに、細胞接着を極力低下させる材質であることが好ましい。
２つの開口部１４と１５は、それぞれ着脱可能に取り付けられるキャップ１９を有し、このキャップ１９は、液密性と気体の流通を許容するガス透過領域とを備えていると、細胞を培養する上で好ましい。

図３は、本発明の細胞培養容器Ｂの作成方法を示す図であり、図３（ａ）は市販されている細胞培養容器Ｃの切断面を、図３（ｂ）は接着前の各パーツを、図３（ｃ）は接着後の培養容器を模式的に示している。
本発明の細胞培養容器Ｂは、図３に示すように、市販されている細胞培養容器Ｃに穴Ｙをあけ切断面Ｘで切断したパーツを２つ作成し、細胞を播種する支持体１１、観察窓部１７の一部を有する第１室１２及び、観察窓部１７の一部を有する第２室１３の３つのパーツを接着させ、観察窓部１７を覆う部材１８を設置することにより作成できる。
本発明の細胞培養容器の作成方法の一例を説明するが、本発明はこの説明に何ら限定されるものではない。
市販されている細胞培養容器Ｃ（例えば、ファルコン社製の培養面積１２．５ｃｍ^２、容量２５ｍｌのもの）の培養面の中央部に、観察窓部１７となる観察用の穴Ｙ（例えば、直径１０ｍｍ程度）を開け、観察用の穴Ｙの直径を含みフラスコ開口部Ｚと水平になる切断面Ｘを持つように容器Ｃを切断する。
切断された容器の開口部Ｚを有するパーツを２つ使用して、ポリカーボネート（例えば、ミリポア社製のもの）等の細胞を播種する支持体１１を挟み、細胞毒性の低い接着剤（例えば、コニシ社製のバスボンドＱ）を使用して接着し、さらに、観察窓部１７を覆うようにカバーガラス（例えば、松浪硝子工業社製のもの）等の部材１８を細胞毒性の低い接着剤で接着することにより、本発明の細胞培養容器Ｂを得ることができる。
カバーガラスの素材としてはガラスが好ましいが、光の透過性が高く、光の屈折率が低いものであれば、アクリル樹脂などの樹脂製であってもよい。
接着剤による接着は、超音波溶接に代えてもよいが、ポリカーボネート等の細胞を播種する支持体１１とカバーガラス等の部材１８が概ね直交するように配置することが重要である。また、液漏れが起こらないようにする必要もある。

＜従来例＞
図４は、従来の２次元培養の観察方法を示す図である。
従来の２次元培養の観察方法は、図４に示すように、細胞培養容器の底面部にカバーガラス２１を配置したガラスボトムデッシュやカバーガラスチャンバーと呼ばれる細胞培養容器２２を使用して、培養細胞２３を正立・倒立顕微鏡２４により観察を行うことができる。
図５は、従来の３次元培養の観察方法を示す図である。
従来の３次元培養の観察方法は、図５に示すように、ガラスボトムデッシュ２５の上に透明のポリカーボネート膜等の支持体を有するインサート２６を載せ、３次元培養細胞２７を共焦点顕微鏡２８により観察を行うと、３次元培養細胞２７の底面（「ＸＹ面」）を観察することができる
この状態で、共焦点顕微鏡を使用して「Ｚ方向」に複数枚スキャンすれば３次元の画像構築が可能であることは上述のとおりであるが、解像度の低さや細胞毒性等の問題により、実用性は低いものである。

＜観察方法＞
図６は、本発明の３次元培養の側面観察容器の概念図である。
本発明の３次元培養の側面観察容器３１は、図６に示すように、ポリカーボネート膜やコラーゲン膜等の支持体３２の上に、３次元培養された組織細胞３３が積層されており、支持体３２と直交して配置されたカバーガラス３４を介して顕微鏡３５により観察を行うと、３次元に積層化させた組織細胞３３を生きたままの状態で、容易に、解像度高く、継続的に、側面から観察できる。
また、培養細胞の側面方向の経時変化を映像や画像として捉えることができるので、細胞接着の形成過程の解明や、層状構造を有する上皮系の細胞層の各層を同時に観察することが可能である。
図７は、本発明の３次元培養の側面観察の概念図であり、図７（ａ）は細胞培養容器３１を立てた状態で観察する場合であり、図７（ｂ）は細胞培養容器３１を横にした状態で観察する場合である。
図７（ａ）、（ｂ）に示すように、使用する顕微鏡３５に応じて本発明の細胞培養容器３１の載置面を変えて観察することが可能である。

＜実施態様２＞
図８は、本発明の多室型細胞培養装置Ｄを模式的に示す図である。
本発明の多室型細胞培養装置Ｄは、図８に示すように、細胞を播種する支持体４２により区切られた第１室４３、第２室４４を有する本発明の細胞培養容器が連続して隣接しており、支持体４２に対して概ね直交して配置されたカバーガラス４５が、全ての第１室４３と第２室４４を覆うように配置されているために、支持体４２上に３次元に積層化させた組織細胞それぞれを同時に並べて観察することが可能であるので、実験条件が異なる組織モデルを比較しやすいという利点を有する。
本発明の細胞培養装置Ｄは、細胞植え付け用の開口部４６と培地注入交換用の開口部（図は省略）を有しており、細胞培養に適した条件を設定しながら、生きたままの細胞組織の観察を継続することを可能とする。

本発明の細胞培養容器の支持体上に、所望の細胞を播種し、好適な条件下で播種した細胞を単層または多層培養することにより、組織モデルを構築することができる。
組織モデルの形態は限定されないが、例えば、被蓋上皮細胞や腺上皮細胞などを培養して構築できる上皮組織モデル、線維芽細胞や脂肪細胞などを培養して構築できる結合組織モデル、筋芽細胞や心筋細胞や平滑筋細胞などを培養して構築できる筋組織モデル、および神経細胞やグリア細胞などを培養して構築できる神経組織モデル、真皮由来の線維芽細胞をコラーゲンゲル内に包埋培養して真皮様組織を再構築し、さらに表皮角化細胞を重層培養することで得られる皮膚モデルなどが挙げられる。特に、医薬品、生理活性物質、化粧品あるいは洗剤等の化学物質の生体に対する作用を評価できる組織モデルの形態としては、生体に暴露あるいは投与された化学物質の移行経路の反映できる組織モデルの構築が重要となる。この視点からは、化学物質が最初に暴露される上皮細胞あるいは内皮細胞のみで構成される「組織シート（１種類細胞）」モデル、上皮細胞あるいは内皮細胞の次に化学物質に暴露される間充織細胞まで含めた上皮細胞と間充織細胞あるいは内皮細胞と間充織細胞の２種類の細胞で構成される「器官様プレート（２種類細胞）」モデル、さらに化学物質の移行に伴い暴露が進行する上皮細胞と間充織細胞と内皮細胞の３種類の細胞で構成される「器官様プレート（３種類細胞）」モデル等を例示することができる。

以下、実施例により本発明の図２に示す細胞培養容器Ｂを使用して細胞を培養し、観察する方法について詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

＜実施例１＞単層細胞培養とその観察方法
新生児ヒト表皮ケラチノサイト(NHEKneo)を1×10⁵cells/cm²の濃度となるよう、細胞植え付け用の開口部１４から細胞懸濁液を播種し、第２室１３に気泡が入らないように１２mL、第１室１２に３mLのEpilife（Life technologies/#M-EPI-500-CA）を用いて２日間培養後、細胞核と細胞膜を汎用の蛍光プローブにより染色した。その後、共焦点顕微鏡（オリンパス社/FV1000）を用いてカバーガラス面１８より観察を行った。
図９、１０は、１日培養後の単層細胞の側面観察像を示す図であり、図９（ａ）は核を、（ｂ）は細胞膜を、（ｃ）はmerge像の固定細胞の観察図であり、図１０は細胞が移動する様子の観察図である。

＜実施例２＞ヒト表皮３次元積層化組織の培養とその観察方法
HPEKp細胞(CELLnTEC社/#HPEKp)を3×10⁶cells/cm²の濃度となるよう、細胞植え付け用の開口部から細胞懸濁液を播種し、CnT-PR培地(CELLnTEC社/#CnT-PR)を第２室１３に１２mL、第１室１２に３mLを加え３日間培養後、第１室１２の培地を除去し、３次元化のための培地CnT-PR-3D（CELLnTEC社/#CnT-PR-3D)に交換して、７日間積層化培養した。細胞核と細胞膜を汎用の蛍光プローブにより染色した。その後、共焦点顕微鏡（オリンパス社/FV1000）を用いてカバーガラス面１８より観察を行った。
図１１は、積層化人工皮膚モデルの側面観察像を示す図であり、（ａ）は核を、（ｂ）は細胞膜を、（ｃ）はmerge像の固定細胞の観察図である。
図１１に示すように、細胞が４層程度に積層化されている様子が確認できた。

Ａ：細胞培養容器
１：細胞を播種する支持体
２：細胞
３：培養面
４：観察窓部
５：皿状容器
６：窓部を覆う部材
Ｂ：細胞培養容器
１１：細胞を播種する支持体
１２：第１室
１３：第２室
１４：細胞植え付け用の開口部
１５：培地注入交換用の開口部
１６：壁面
１７：観察窓部
１８：部材
１９：キャップ
Ｃ：市販の細胞培養容器
Ｘ：切断面
Ｙ：穴
Ｚ：開口部
２１：カバーガラス
２２：従来の細胞培養容器
２３：培養細胞
２４：顕微鏡
２５：ガラスボトムデッシュ
２６：インサート
２７：３次元培養細胞
２８：共焦点顕微鏡
２９：ポリカーボネート膜
３１：側面観察容器
３２：細胞を播種する支持体
３３：３次元培養組織細胞
３４：カバーガラス
３５：顕微鏡
Ｄ：多室型細胞培養装置
４２：細胞を播種する支持体
４３：第１室
４４：第２室
４５：カバーガラス
４６：細胞植え付け用の開口部

Claims

細胞を播種する支持体上の培養面に対して、６０度から１２０度の範囲の角度をなすように配置された観察窓部を有する細胞培養容器。
細胞を播種する支持体の素材が、ポリカーボネート、コラーゲン、ポリスチレン、ガラスのいずれかより選択されることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
観察窓部が、顕微鏡観察に適した部材により覆われていることを特徴とする、請求項１または２記載の細胞培養容器。
観察窓部が、顕微鏡観察用のカバーガラスにより覆われていることを特徴とする、請求項１または２記載の細胞培養容器。
細胞を播種する支持体によって区切られた第１室と第２室とを備えることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
細胞を播種する支持体が、ポリカーボネート膜またはコラーゲン膜から選択されることを特徴とする請求項５記載の細胞培養容器。
第１室に細胞植え付け用及び培地注入交換用の開口部を、第２室に培地注入交換用の開口部を有することを特徴とする請求項５または６記載の細胞培養容器。
第１室及び第２室のそれぞれの開口部は、着脱可能に取り付けられるキャップを有し、前記キャップは液密性と気体の流通を許容するガス透過領域とを備えることを特徴とする請求項７記載の細胞培養容器。
請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞培養容器が連続して隣接していることを特徴とする、細胞培養装置。
細胞培養容器の観察窓部が連続して１つの窓部を構成するように配置されたことを特徴とする、請求項９記載の細胞培養装置。
請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞培養容器または、請求項９または１０記載の細胞培養装置を用いて、３次元培養した培養細胞の側面方向を、観察窓部を通して側面方向から観察する方法。
観察する対象が３次元皮膚モデルであることを特徴とする、請求項１１記載の観察方法。