JP4664646B2 - 細胞培養用マイクロチャンバーおよび細胞構造構築法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の状態を顕微鏡観察しながら、マイクロチャンバーの構造を細胞培養中に変更でき、かつ、細胞培養中に自由に培養液を交換できる新しい細胞培養マイクロチャンバーに関する。

細胞培養は細胞を取り扱う最も基本的な技術である。細胞培養は、単に細胞を増やす以外にも、たとえば細胞の状態の変化や、細胞の薬物等に対する応答を観察するのにバイオアッセイとして使用される。従来のバイオアッセイでは、一般的に細胞培養中に測定対象物を加えて細胞の増殖状態やイオンポンプの変動を見る。

あるいは、近年の再生医療に係り、細胞を培養して細胞を組織的な構造体に構築することも試みられている。すでに上皮細胞を培養し、シート状にする技術などが確立している。しかし、多くの場合、細胞培養で行われる細胞は均一なクローンであり、細胞間のインタラクションや細胞接触による高次細胞構築に関しては、我々の知識的蓄積はそれほど多くないのが現状である。このため、細胞を再構築して機能的な構造体を得ようとする試みは新しい生物学を切り開くとともに、これからの再生医療分野の重要な課題となると言える。

細胞再構築に関しては、たとえば、神経細胞において、人工的に少数の神経細胞からなる比較的単純な神経回路網を構築し、制御された環境下で、細胞ネットワークの情報処理機能を明らかにしようとする研究も盛んに行われている（非特許文献１−３）。

細胞群の細胞の１つ１つを最小構成単位とする情報処理モデルの計測のために重要なものは、多点同時計測技術と、細胞ネットワークパターンの制御技術であるが、電極アレー基板上で神経細胞を培養し、計測する方法が開発されている。

また、細胞のネットワークパターンを化学的、あるいは物理的な手法を用いて制御する技術についても、古くから多くの研究がなされている。たとえば、化学的方法では、Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ達が、神経細胞を培養する基板表面にラミニンなどの細胞接着性の基質でパターンを描き、神経突起をパターンに沿って伸展させることに成功している（例えば、非特許文献４）。

物理学的方法では、基板表面に神経細胞の伸展にとって障壁となる段差を構築した基板上で培養することで、障壁の高さが１０μｍ程度以上であれば神経細胞の伸展・移動を制限することが可能という報告がある（例えば、非特許文献５−６）。

発明者らのグループは、特定の一細胞のみを選択し、その一細胞を細胞株として培養する技術、および、細胞を観察する場合に、細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、あるいは相互作用する細胞を特定しながら培養観察する技術を開発している（特許文献１）。また、細胞培養を行いながら集束光を照射して加熱した領域の細胞培養容器の形状を自在に変化させることが可能な細胞培養マイクロチャンバーを開発している（特許文献２）。

特開２００４−８１０８６号公報 特開２００４−８１０８５号公報 Dichter, M.A. Brain Res., 149, 279-293 (1978) や、Mains R.E., Patterson P. H. J. Cell. Biol., 59, 329-345 (1973) Potter S.M., DeMarse T.B., J. Neurosci. Methods, 110, 17-24 (2001) Jimbo Y., Tateno T., Robinson H.P.C., Biophys. J. 76, 670-678 (1999) Letourneau P.C.: Dev. Biol., 66, 183-196 (1975) Stopak D. et al.: Dev. Biol., 90, 383-398 (1982) Hirono T.,Torimitsu K., Kawana A., Fukuda J., Brain Res., 446, 189-194 (1988)

たとえば、従来のバイオアッセイでは、細胞を組織断片として扱うか、培養細胞のように１細胞として扱うかのいずれかであった。細胞を１細胞ずつ用いる場合は、本来、多細胞組織の細胞として機能している細胞を、引き離された独立した状態の細胞として使用するために、細胞同士のインタラクションの影響が現れなくなる。組織断片では常に同じ条件の検体を得ることが実質不可能である。このため正確な薬剤レスポンスすなわちバイオアッセイデータを得る上で問題がある。従って、同一の細胞群、あるいは必要に応じて異種細胞群を構成的に配置したバイオアッセイを行えるデバイスやシステムを開発することが唯一上記問題を解決する道である。

また、再生医療分野においても、必要に応じた機能を組み合わせた細胞回路のようなものを自在に作れる手法を開発することが重要な課題と考えている。

本発明は、以上のような従来技術の問題点を解消し、細胞の機能を明らかにするため、また、薬剤などに対する細胞レスポンス検査（バイオアッセイ）や任意の細胞を用いた構造体を形成する培養技術の開発を目的している。すなわち、少数の異種細胞間ネットワークを制御しながら、細胞ネットワークを構築することのできる新しい技術手段を提供することを課題としている。

上記問題を解決するためには、
１）同種あるいは異種の細胞を任意の位置配置で任意の順番で配置することとのできる細胞培養チャンバー、
２）自在に薬剤を投与し、各細胞の生理活性を誘導する、あるいは、培養液を常にフレッシュなもので置換することのできる構造として、細胞培養中に任意の物質を添加する機構を組み込んだ培養マイクロチャンバー、
３）同様に薬剤投与や培養環境制御を容易に行える機構を組み込んだ培養マイクロチャンバー、
４）細胞ネットワーク構築後、細胞培養に使用した培養チャンバーを除去して、形成した細胞ネットワークの回収ができる回収機構を組み込んだ細胞培養用マイクロチャンバー、
が必要であるとともに、このようなマイクロチャンバーを用いた細胞構造構築法が必要である。

本発明では、セルロース膜上にアガロースゲル膜を形成した構造の支持体を細胞培養チャンバー用の材料として用いる。アガロースゲルは加熱により溶融することが可能で、この性質を用いて細胞培養用の空間を形成する。たとえば、十分な量の水系溶液中にアガロースゲル膜を設置し、これに、水に吸収される波長のレーザー集束光、例えば、１４８０ｎｍの集束レーザー光を照射すると、集束レーザー光はアガロースゲルに吸収され、発熱してアガロースゲルを溶かすことができる。溶融したアガロースは溶液中に拡散してゲル化に必要な限界濃度以下になるので、一旦溶融したアガロースゲル部分は再度ゲル化することは無い。

この技術を用いることで、１ｎｍ程度の分解能を持つ細胞保持ウェルやウェル間の接続流路を形成することができる。本技術で重要なのは、各ウェルで所定の数の所定の細胞を培養し、細胞膜の一部が延びて隣接する細胞とジャンクションを形成しようとするときに、細胞の伸びる方向とシャンクションを形成する細胞の順番を制御できることである。すなわち、培養中に任意に細胞培養用マイクロチャンバーの形状を変えられることが重要である。これができると、たとえば、Ａ，Ｂ，Ｃの三種の細胞が独立したウェル内で１細胞ごとに４個ずつ培養されているときに、まず４個の細胞種Ａと４個の細胞種Ｂを各々独立に接合させた後、細胞種Ａの４個のグループの１個と細胞種Ｂの４個のグループの１個とを結合させる。次いで、残りの細胞種Ａの４個のグループの１個と細胞種Ｃの４個のグループの１個とを接合させる、といったことが任意にできるようになる。これにより上記１）の課題が解決される。

集束光加熱によるアガロースゲル膜の加工は、セルロース膜の上に形成されたアガロースゲル膜が溶液中に存在する場合や、ガラスの様に透明な基板上に設置されている場合には容易に実行することができる。不透明な構造体の上に設置されている場合は別の発明技術を用いる。不透明な構造体とは、たとえば、後に述べるように、アガロースゲル膜の加工のために照射された波長の集束光レーザーを吸収したり散乱したりする材質による構造体である。

不透明な構造体がある場合、光を吸収するニードル先端をアガロースゲルに接触させ、ニードルの一部に不透明な構造体を避けて集束光を当てながら、ニードルを移動させることで任意のパターンの流路をアガロースゲル上に作る。これにより、アガロースゲルがどのような基板上に存在しても、特定の細胞培養ウェル間を、希望の順番に沿って繋ぎ、任意の細胞回路を形成することができる。ここで、シリコンやＳＵ８が完全には透明でない構造体であり、集束光レーザーの照射にとっては不利であるのに、これを使用するのは、これらに対するマイクロファブリケーションの技術が、試薬添加や培地交換用のマイクロ構造体を形成するのに有用であるからである。

上記２）、３）の課題を解決するには、セルロース膜を利用することに加え、セルロース膜がシリコンやＳＵ８で形成されたマイクロストラクチャーの上に設置されることにより、容易に実現できる。細胞培養では、細胞を収納したウェル内と細胞液槽とを構造上分離し、一方、細胞液は透過させる半透膜が必要である。この半透膜を通してアガロースゲル膜に集束光を照射する場合には、半透膜は上記集束光でダメージを受けずらい材質であることが必要である。この材質としては、たとえばセルロース膜を使用するのが良い。

本発明における細胞培養用のマイクロチャンバーは半透膜上に形成し、更に、半透膜を介した部分にはマイクロファブリケーションの技術を用いたマイクロ流路が接しており、半透膜を介してマイクロ流路から培養液の交換やバイオアッセイ用の添加物を添加したり、あるいは細胞面に添加物を加えたりした後、細胞が添加物の添加に対応して放出する分子を流路を介して回収することができるようにする。これにより、上記課題２）３）が解決される。

最後に、このようにして形成した細胞回路を基板から剥離させる。細胞間接着はそれほど強い力ではないので、機械的に引き剥がすことはできない。細胞はセルロース膜に食い込んでいると考えてよい。アガロースゲルの方は体積が大きいこと、熱を加えると細胞が痛むことを考慮し、支持体としてそのまま用いる。セルロース膜を除去し、基板からアガロースゲルごと細胞を引き離す必要があるが、これにはセルラーゼを用いてセルロースそのものを分解する。この状態で細胞回路はアガロースゲル膜に保持された状態であるので、このようにして調製した複数のアガロースゲル膜を重ねることで、３次元的に細胞ネットワーク構造を形成することも可能である。

本発明によれば、細胞を培養しながら任意の細胞ネットワークを構築することができる。細胞ネットワークは、外部から常に活動に必要な培地の供給が受けられるため、安定して生存することができる。また、種々の薬剤に対する感受性を容易に評価することができる。更に、任意の細胞回路を構築した後、細胞接着面を切断することなく基板から剥がすことができる。このため、細胞を、形状を保ったまま使用することが必須な、再生医療に用いる機能性材料としての細胞を供給することが可能となる。

（実施例１）
図１（Ａ）は、実施例１の細胞培養マイクロチャンバーの鳥瞰図を示し、（Ｂ）は、Ａ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。アガロースゲル膜１はセルロース膜２の上に一体として形成され、ガラス基板３上に設置されている。アガロースゲル膜１には細胞を保持するウェル５が複数形成されている。このような細胞培養マイクロチャンバー１は容器６の中に置かれる。容器には培地７が存在し、マイクロチャンバー１は実質的に培地に沈んでいる。図１（Ａ）では、分かりやすくするために、アガロースゲル膜１、セルロース膜２およびガラス基板３を離して描画したが、図１（Ｂ）に示すように、これらは、密着している。

アガロースゲル膜１の作り方を述べる。２０ｍｍ×２０ｍｍ×１．１ｍｍ（ｔ）のガラス基板３上に水に膨潤したセルロース膜２（分画分子量１０００００ダルトン）を乗せ、スピンコーターのチャックに設置する。セルロース膜２はガラス基板３より大きいものを使用し、アガロースがゲル化した後に周囲を切り落とす。１．５％アガロースの０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４溶液（あらかじめ電子レンジで加熱して、アガロースを溶解したもので、６０℃前後に冷却したもの）０．５ｍｌを塗布し、たとえば１００ｒｐｍで１０秒間回転する。湿潤箱中で室温で３０分間放置しアガロースをゲル化させる。これにより、ほぼ１００μｍのアガロースゲル膜を形成できる。ゲルの膜厚は形成条件に左右されるので、回転速度とゲルの温度を変えて調製する。

この状態では、まだ細胞を収納するウェル５やウェル５間を連結する溝などは形成されていない。ウェル５の大きさは、たとえば、直径３０μｍで、この部分だけアガロースゲルが取り除かれた構造をしているものとする。ウェル５の形成法としては水が吸収する波長域のレーザーの収束光、たとえば１４８０ｎｍのレーザーの収束光、をアガロースゲル膜１に照射することで、レーザーに照射された部分を加熱してアガロースゲルを溶融除去する。容器６内には十分な量の培地７が存在するので、溶融したアガロースゲルは拡散し、アガロースのゲル化濃度限界を下回るので再度ゲル化することはない。この方法で任意の数のウェル５を任意の位置に形成する。

図２は細胞回路を形成した細胞培養マイクロチャンバーの一例を示す平面図である。１０は細胞回路を形成した細胞培養マイクロチャンバーである。マイクロピペット（図示しない）を用いて細胞をウェル５に挿入する。たとえば８×２の配置のウェル（ウェル間隔１００μｍ）のウェル８個に神経細胞を１個ずつウェルに挿入する。残りの８ウェルには心筋拍動細胞を１個ずつ入れる。神経細胞の入ったウェル５のグループを１２、心筋拍動細胞の入ったウェル５のグループを１３とする。所定の時間培養を続けると神経細胞と心筋拍動細胞は突起を出してくる。突起はお互いランダムな方向に伸び始めるが、この時点ではアガロースゲル膜１に邪魔されて細胞同士のジャンクションを生成できない。

まず、神経細胞の入った８個のウェル群１２の各ウェル５間のアガロースゲル膜１部分にウェルを作成するときと同様に、１４８０ｎｍの集束レーザー光を照射し、ウェル５とウェル５を溝１１−１で連結し、各神経細胞の突起をアガロースゲル膜１にできた溝１１−１に誘導する。これにより、神経細胞同士のギャップジャンクションを形成する。同様に、心筋拍動細胞の入った８個のウェル群１３の各ウェル５間のアガロースゲル膜部分を溝１１−２で連結し、心筋拍動細胞同士の回路を形成する。ここで、あらかじめウェル５間の溝を掘った状態で細胞培養を始めないのは、これらの細胞がランダムな方向に突起を出して、１個の細胞が複数の細胞と接合するのを防ぎ、各１列の細胞回路を形成するためである。これは、予め１１−１，１１−２の溝が掘ってあると、ウェル５を飛び越えて、隣のウェルの細胞と接合する可能性があるからである。すなわち、活性の高い細胞があるとすると、この細胞はいろんな方向に触手を伸ばす。一方、これに隣接するウェルの細胞が活性が低いと、あまり触手を伸ばさない。この場合、活性の高い細胞は、複数の細胞と結合する可能性がある。このため、予め溝を掘って置くことはせず、細胞間を結合させるときに溝を掘るのが良い。また、ウェル群１２の各ウェル５に、たとえば、種類の異なる神経系の細胞を入れると、細胞間を結合の順番を厳密に管理する必要がある。よって細胞の触手が伸びてきてから溝を掘るほうが有効である。

最後に、ウェル群１２の神経細胞とウェル群１３の心筋拍動細胞の回路をつなぐべく、両者の間のアガロースゲルに収束光レーザーを照射する。これにより、神経細胞８個と心筋拍動細胞８個が溝１１−３で一箇所でつながった細胞回路が形成できる。この例では、実験において、信号の流れが1次元、すなわち、ウェル群１３のウェル５の心筋拍動細胞に、ウェル群１２のウェル５の神経細胞からの信号が入った場合、ウェル群１３のウェル５の心筋拍動細胞に、この信号がどのように伝わるかを調べるには1次元、すなわち、ウェル群１２，１３の端部のウェル５間で繋いだ方がデータ解析しやすい。ウェル群１２のウェル５の神経細胞とウェル群１３のウェル５の心筋拍動細胞間の、より複雑な回路での信号伝達の解析をしたいときには、目的に応じて、任意のウェル５間で繋げば良い。

このような細胞回路網では、たとえば神経細胞のいずれかに電気刺激あるいはイオン状態を変化させると、心筋拍動細胞の周期的な拍動に変化をきたすのが観察できる。すなわち、各種薬剤などのバイオアッセイ用の細胞回路として使用できる。細胞数が８個ずつにしてあるのは、心筋拍動細胞や神経細胞では、単独の細胞よりも４個以上の複数個の細胞が、お互いに突起でつながった状態になったときに、細胞同士の協調性が得られるからである。特に細胞数が８個以上になると心筋拍動のばらつき等が１０％程度まで（単独では５０％程度のばらつきがある）抑えることができるからである。

実施例１では、アガロースゲル膜１でできたウェル５の上面は開放になっているが、一般に、１００μｍの壁があると通常の動物細胞は乗り越えることができないので問題ない。必要に応じてウェル５の上全体に他のセルロース膜を張ることで細胞の不用意な移動を防ぐこともできる。

最後に、セルロース膜２を除去して、その上に、さらにファイブロブラストを一面貼り付ける方法について説明する。

図３は、図２のＢ−Ｂ位置で、矢印方向に見た、セルロース膜２１上のファイブロブラストシート２２の上に神経細胞２３と心筋拍動細胞２４の回路が固定された細胞構造構築物２０の例を示す断面図である。

まず、図１を参照して説明したガラス基板３上に形成されたセルロース膜２とアガロースゲル膜１でできた構造体を離し、ガラス基板３から分離し、容器６の中で浮いた状態とする。このために、セルラーゼを細胞回路が出来上がった細胞培養マイクロチャンバー１０を入れている容器６の培地７に加える。このときのセルラーゼの量は、最終的な濃度が５０ｍｇ／ｍｌになる値に選ばれる。この状態で、３７℃でインキュベートすると、ガラス基板３上のセルロース膜２は自然に分解する。

別途、シート状に培養したファイブロブラストを準備しておき、これに、アガロースゲル膜１のセルロース膜２を溶解した面を接触させる。このままの状態で培養を続けると、ファイブロブラスト層２２の上にアガロースゲル膜１が、直接張り付いた細胞構造構築物２０ができる。ここで、左側のウェル５には神経細胞２３が入れられ、は右側のウェル５には心筋拍動細胞２４が入れられていて、両者は、溝１１-３で触手を伸ばして結合している。なお、図３において、参照符号２１で示すのはセルロース膜であるが、これは、シート状のファイブロブラストを構成する後述の説明から分かるように、アガロースゲル膜１の形成に使用したセルロース膜２とは別物である。

先にも述べたように、本発明では、結合させたい細胞のウェル間に、細胞の培養中に溝を形成するものであるから、ガラス基板３上にセルロース膜２とアガロースゲル膜１でできた構造体を形成した後、アガロースゲル膜１にウェル５を形成して細胞を入れ、ウェル５を繋ぐ溝を形成する。すなわち、最初に細胞を入れて細胞回路網を作成した後、セルラーゼでセルロース膜２を溶かし、その後、ファイブロブラストシート２２にセルロース膜２を接触させる。神経細胞２３や心筋拍動細胞２４はファイブロブラストシート２２に触手を伸ばし、くっつく。

ファイブロブラストを培養してシート状にするには、血清入りの培地１を５ｍｌ入れたディッシュ（６０ｍｍ）上にゼラチンを塗布したセルロース膜（分画分子量３万ダルトン、５５ｍｍφ）２１を敷く。３０分間５％ＣＯ_２、３７℃でプレインキュベーションし、セルロース膜に培地をなじませる。ファイブロブラスト細胞の懸濁液０．５ｍｌを加え、ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃の温度条件で培養する。この培養中に、必要なら、培地を新鮮なものと交換する。培養が進むとセルロース膜２１のほぼ全体にファイブロブラスト心筋拍動細胞がシート状に広がる。ファイブロブラストがセルロース膜２１上でシート状になった状態を模式的に２２に示す。

（実施例２）
実施例１では、セルロース膜２を平坦なガラス基板３の上面に乗せたものとしたが、実施例２では、セルロース膜２を保持する支持体を工夫し、アガロースゲル膜１のウェル５に入れた細胞の培養時の細胞コントロールを、よりしやすくした例を説明する。

図４（Ａ）は、細胞培養マイクロチャンバーの鳥瞰図を示し、（Ｂ）は、Ｂ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図である。基板１００は６０×６０ｍｍのガラス板３の上面に厚さ２ｍｍの構造体１０１が作成されている。構造体１０１は形を作りポリジメチルシロキサンを重合させて作成してもよいし、ガラス３の代わりに２と１０１全体を一体としてプラスチックから切削で作成してもよい。あるいは１０１をＳＵ８で作成してもよい。構造体１０１に、培地等の溶液の流通する菱形状の深さ２ｍｍのプール１０２を形成するとともに、プール１０２内に、幅１ｍｍ×高さ２ｍｍの複数の梁１０３を形成する。梁１０３間はおおむね１ｍｍである。各梁１０３の末端部はプール１０２の周辺部から離れて形成されている。プール１０２の対向する２箇所に、溶液出し入れ用の空間１０４が形成されている。梁１０３の間に液が満遍なく行きわたるように高さ１．５ｍｍの拡散板１０５が空間１０４と梁１０１の間に形成されている。

２はセルロース膜であり、構造体１０１の上面の全面を覆う大きさであり、厚さは製品により異なるが、おおよそ３０〜１００μｍ程度と想定される。１１１は開口であり、溶液出し入れ用の空間１０４に対応する位置に設けられる。

１１５はプラスチック薄板であり、厚さは１００μｍ程度である。プラスチック薄板１１５の厚さはアガロースゲル膜１の厚さと同じにするのが良い。プラスチック薄板１１５はセルロース膜２の支持体として用いられるとともに、アガロースゲル膜１を形成するための壁材でもある。プラスチック薄板１１５の中央部の菱形状のプール１０２に対応する位置にアガロースゲル膜１が形成されるが、これについては後述する。また、プラスチック薄板１１５の両端部の溶液出し入れ用の空間１０４に対応する位置には開口１１６が形成される。図４（Ａ）では、セルロース膜２およびプラスチック薄板１１５は離して描画されるとともに、構造体１０１の上面からも離して描画されているが、これらは、図４（Ｂ）に示すように、密着状態に重ねられるものである。

ここで、セルロース膜２はアガロースゲル膜１が形成される前に、プラスチック薄板１１５と接着材で接着して置いても良いし、単にセルロース膜２をＳＵ８の構造体１０１の上面に載せて、プラスチック薄板１１５で挟むだけでも良い。いずれの場合でも、セルロース膜２とプラスチック薄板１１５とは一体化された形で構造体１０１の上面に載せて、アガロースゲル膜１を形成する前に組み立てておく。

アガロースは融解温度が６５℃程度のものを濃度１．５％で使用する。電子レンジで溶融したアガロースを、プラスチック薄板１１５と一体化されたセルロース膜２の形成領域のセルロース膜２に塗布し、室温湿潤状態で３０分間放置する。その結果、セルロース膜２上にアガロースゲル膜１を張ったプラスチック薄板１１５を得ることができる。

ウェル５およびウェル５間を結ぶ溝１１の形成法を述べる。実施例１と異なり、基板１００は、波長１４８０ｎｍの収束光に対して必ずしも透明ではない。よってこのままの状態では、実施例１と同じように、単純に収束光を照射してウェル５およびウェル５間を結ぶ溝１１を形成する、と言うことができない。

ウェル５に関しては、セルロース膜２が、アガロースゲル膜１が形成される前にプラスチック薄板１１５と接着材で接着されている場合には、アガロースゲル膜１を形成したプラスチック薄板１１５を基板１００からはずし、収束光に対して透明なガラス基板上で加工をすることが可能である。しかし、セルロース膜２が、アガロースゲル膜１が形成される前にプラスチック薄板１１５と構造体１０１の上面との間に挟まれているだけのときには別の工夫が必要である。また、細胞培養をはじめた後の加工が必要となる溝の形成も、同様に、別の工夫が必要である。

このように、収束光に対して透明なガラス基板上で加工をすることができない場合には、水による光の吸収が実質的に無視できる波長の収束光（たとえば波長１０６４ｎｍの収束光）を利用する。水による光の吸収が実質的に無視できる波長の収束光では、この光がアガロースゲル膜１に照射されても、アガロースゲル膜１はこれを吸収して熱に変換することはできないから、加工ができない。このため、この収束光をトランスデューサーとして機能するマイクロニードルに照射して、マイクロニードルで収束光を熱に変換し、この熱でアガロースゲル膜１を加工する。

図５は、マイクロニードルを使用して、マイクロニードルで収束光を熱に変換し、この熱でアガロースゲル膜１を加工するシステムの概要を説明する模式図である。ガラス基板３、構造体１０１、セルロース膜２およびアガロースゲル膜１が形成されたプラスチック薄板１１５が一体化された細胞培養マイクロチャンバーは培地を入れたチャンバー（図示せず）の中にいれステージ５９上に置かれる。ステージ５９は、パソコン４１の駆動信号により動作する駆動装置３５によりＸＹの任意の方向に駆動される。３１はカメラ、例えば、ＣＣＤカメラであり、レンズ３２，３３を介してアガロースゲル膜１の加工面を撮影する。この際、光源３４を用意し、レンズ３２，３３の間に設けられたハーフミラー３５を介して入れ、矢印３６の方向から照明する。なお、加工面の照明は、ハーフミラー３５を使用しないで、細胞培養マイクロチャンバーの上方から、直接、光を当てるものとしても良い。４１は、いわゆる、パソコンであり、必要なプログラムを格納しているとともに、カメラ３１から加工面の情報を与えられるとともに、使用者による操作信号４２が入力される。ここで、図示は省略したが、パソコン４１には表示装置が設けられ、カメラ３１から入力された加工面が表示される。

１２０はアガロースゲル膜１を加工するためのマイクロニードルである。マイクロニードル１２０には、レーザー光１２１がレンズ１２２で焦点を合わせて収束光として照射されている。マイクロニードル１２０はたとえばシリコンやカーボンで先端が２μｍの径のものを使用する。このマイクロニードルの先端部分に波長１０６４ｎｍのレーザー光１２１をレンズ１２２で収束光とし照射する。するとマイクロニードル１２０先端の温度が上昇し、アガロースゲル膜１を溶解することができる。アガロースゲル膜１の加工面を監視しながら、ステージ５９をＸＹ方向に移動させて、必要な範囲のアガロースゲルを、溶解させ、除去することができる。

マイクロニードル１２０は、使用者のパソコン４１を介しての指示により、アガロースゲル膜１の加工面から上方に離れることができる。マイクロニードル１２０が上方に離れるときは、収束光１２１の照射は停止するのが良い。アガロースゲル膜１の加工面を監視しながら、マイクロニードル１２０と収束光１２１によって、一つのウェル５を形成したら、使用者は、マイクロニードル１２０を上げる指示をパソコン４１に与えると、マイクロニードル１２０の上下動駆動装置４７にマイクロニードル１２０を上げる指示が与えられ、マイクロニードル１２０は上に動き、アガロースゲル膜１の加工面から離れる。一点差線４８は上下動駆動装置４７とマイクロニードル１２０との連係を意味する。マイクロニードル１２０をアガロースゲル膜１の加工面から離した状態で、使用者は、次の、ウェル５を形成するために、パソコン４１にステージ５９の移動指示を与える。この指示に応じて、パソコン４１は駆動装置３７に駆動信号を与え、ステージ５９は駆動される。

使用者は、マイクロニードル１２０の先端をモニターしておき、マイクロニードル１２０の先端が他のウェル５を形成するべき位置に到達したらステージ５９を止める。新しい位置で、上述したように、マイクロニードル１２０を下げ操作し、収束光１２１を照射して他のウェル５を形成する。

図６は、図５と同様にして、マイクロニードルを使用して、細胞培養中に、アガロースゲル膜１のウェル５間を形成する状況の概要を説明する模式図である。図６では、図２に示したウェル５間を繋ぐ溝１１−３を形成している様子を模式的に示している。ガラス基板３、ＳＵ８の構造体１０１、セルロース膜２およびアガロースゲル膜１が形成されたプラスチック薄板１１５が一体化された細胞培養マイクロチャンバーは、図４（Ｂ）で説明した通りである。アガロースゲル膜１の加工面を監視しながら、隣接したウェル５の一方から、マイクロニードル１２０と収束光１２１で溝１１−３を彫っていけば良い。この方法は、アガロースゲルがどのような基板上に存在しても、特定の細胞培養ウェル間を順番にそってつなぎ、任意の細胞回路を形成することができる。

実施例２では、図４（Ａ）から分かるように、ガラス基板３、構造体１０１、セルロース膜２およびアガロースゲル膜１が形成されたプラスチック薄板１１５が一体化された細胞培養マイクロチャンバーは開口１１６，１１１を通して、チューブ１１７，１１８をＳＵ８の構造体１０１に形成した菱形状のプール１０２の溶液出し入れ用の空間１０４に差し込むことができる。従って、これらチューブ１１７，１１８を介してアガロースゲル膜１の反対側からセルラーゼを注入して、直接、セルロース膜２に接することで効率的にセルロース膜２を分解することができし、細胞培養中は培地を交換したり、添加物を入れたり除去したりすることが容易にできる。

（その他）
上述の実施例では、細胞培養用マイクロチャンバーは、いずれも、完成された細胞培養用マイクロチャンバーとして説明した。しかし、細胞培養用マイクロチャンバーは、これを使用する研究者等が細胞等を細胞培養区画５に入れること、溝を形成することが必要である。したがって、実施例１で見れば、半透膜（セルロース膜）２とこの上に形成されたアガロースないしアガロースの誘導体でできたゲル膜１、場合によっては、ゲル膜１に細胞培養区画５を形成した素材が商品として供給され、これを購入した研究者等が、適当なガラス基板に乗せて、培養液を準備し、細胞等を細胞培養区画５に入れ、細胞培養を進めながら、溝を形成することにするのが実用的である。

実施例２でも、同様に、セルロース膜２をプラスチック薄板１１５と接着材で接着し、プラスチック薄板１１５のアガロースゲル膜１の形成領域にアガロースゲル膜を形成し、場合によっては、ゲル膜１に細胞培養区画５を形成した素材が商品として供給され、さらに、培地等の溶液の流通する菱形状のプール１０２とアガロースゲル膜１の支持材となる複数の梁１０３を形成した構造体１０１およびチューブ１１７，１１８が細胞培養用マイクロチャンバーキットとして供給され、これを購入した研究者等が、培養液を準備し、細胞等を細胞培養区画５に入れ、細胞培養を進めながら、溝を形成することにするのが実用的である。

（Ａ）は、実施例１の細胞培養マイクロチャンバーの鳥瞰図を示し、（Ｂ）は、Ａ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。 細胞回路を形成した細胞培養マイクロチャンバーの一例を示す平面図である。 図２のＢ−Ｂ位置で、矢印方向に見た、セルロース膜２１上のファイブロブラストシート２２の上に神経細胞２３と心筋拍動細胞２４の回路が固定された細胞構造構築物２０の例を示す断面図である。 （Ａ）は、細胞培養マイクロチャンバーの鳥瞰図を示し、（Ｂ）は、Ｂ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図である。 マイクロニードルを使用して、マイクロニードルで収束光を熱に変換し、この熱でアガロースゲル膜１を加工するシステムの概要を説明する模式図である。 図５と同様にして、マイクロニードルを使用して、細胞培養中に、アガロースゲル膜１のウェル５間を形成する状況の概要を説明する模式図である。

符号の説明

１…アガロースゲル膜、２，２１…セルロース膜、３…ガラス基板、５…ウェル、６…容器、７…培地、１０…細胞回路を形成した細胞培養マイクロチャンバー、１２…神経細胞の入ったウェルのグループ、１３…心筋拍動細胞の入ったウェルのグループ、１１−１，１１−２，１１−３…溝、２０…細胞構造構築物、２２…ファイブロブラストシート、２３…神経細胞、２４…心筋拍動細胞、３１…ＣＣＤカメラ、３４…光源、３５…ハーフミラー、３７…駆動装置、４１…パソコン、４２…操作信号、４７…上下動駆動装置、５９…ステージ、１０１…構造体、１０２…プール、１０３…梁、１０４…溶液出し入れ用の空間、１０５…拡散板、１１５…プラスチック薄板、１１１，１１６…開口、１１７，１１８…チューブ、１２０…マイクロニードル、１２１…レーザー光、１２２…レンズ。

Claims (7)

1. (i) セルロース膜、
   (ii) 前記セルロース膜上に形成されたアガロースないしアガロースの誘導体でできたゲル膜、
   (iii) 前記ゲル膜に形成された、細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の区画、ならびに
   (iv) 前記(i)〜(iii)および培養液を容れるための容器を備え、
   (a) 前記アガロースゲル膜は、前記区画内で細胞培養中に収束光により溶融除去することによって任意の前記区画間を連結する溝が形成され得、前記複数の区画内の細胞間インタラクションを許容し得、
   (b) 前記セルロース膜は、前記区画内で細胞を培養した後、セルラーゼを作用させることによって除去され得る、
   細胞回路網構築用マイクロチャンバー。
2. 請求項１に記載の細胞回路網構築用マイクロチャンバーを準備する工程、
   前記複数の区画に細胞を挿入し培養を行う工程、
   前記細胞の培養中に、前記アガロースゲル膜を収束光により溶融除去して任意の前記区画間を連結する溝を形成して、各前記区画内の細胞間インタラクションを許容する工程、および
   前記細胞培養後、前記セルロース膜にセルラーゼを作用させて該セルロース膜を除去する工程、
   を含む細胞回路網構築法。
3. 前記アガロースゲル膜の溝の形成が、細胞培養の過程において、アガロースゲル膜に接触させられたマイクロニードルの一部にレーザー収束光を照射することによる局所加熱でなされる請求項２記載の細胞回路網構築法。
4. セルロース膜、
   前記セルロース膜上に貼り付けられ、中央部が開口とされた薄板、
   前記薄板の開口部に形成され、前記セルロース膜で支持されたアガロースないしアガロースの誘導体でできたゲル膜、
   前記ゲル膜に形成された、細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の区画、および
   培養液を保持するためのプールを有する平板構造体であって、該プール内に前記セルロース膜を支持するための複数の梁が形成された平板構造体、
   を備え、
   前記セルロース膜が前記平板構造体上に配置され、
   前記平板構造体は、基板上に所定の形状の平板構造体を重ねるか、あるいは平板構造体の一部を切除することによって前記プールを形成したものであり、
   前記構造体の前記プールの位置が前記薄板の前記開口部の位置に対応しており、
   前記プール内に連通する培養液を出し入れするための開口部が設けられており、
   前記アガロースゲル膜は、前記区画内で細胞培養中に収束光により溶融除去することによって任意の前記区画間を連結する溝が形成され得、前記複数の区画内の細胞間インタラクションを許容し得、
   前記セルロース膜は、前記区画内で細胞を培養した後、セルラーゼを作用させることによって除去され得る、細胞回路網構築用の細胞培養装置。
5. 請求項４に記載の細胞培養装置を用いて、
   前記細胞区画に細胞を挿入し培養を行う工程、
   前記細胞の培養中に、前記アガロースゲル膜を収束光により溶融除去して任意の前記区画間を連結する溝を形成し、各前記区画の細胞間インタラクションを許容する工程、および
   前記細胞を培養した後、前記セルロース膜にセルラーゼを作用させて前記セルロース膜を除去する工程を含む、細胞回路網構築法。
6. 前記細胞培養が所定の段階に達したとき、前記プールに連通するチューブを介して前記プールに所定の濃度のセルラーゼを供給し、前記セルロース膜を溶解させ、除去する請求項５記載の細胞回路網構築法。
7. 請求項１に記載の細胞回路網構築用マイクロチャンバーまたは請求項４に記載の細胞培養装置を含む、細胞回路網構築用キット。

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