JPH04507191A

JPH04507191A - 薄膜上の細胞の培養方法

Info

Publication number: JPH04507191A
Application number: JP2503955A
Authority: JP
Inventors: スニース　ピーター　ヘンリー　アンドゥリュー
Original assignee: ユニバーシティー　オブ　レイセスター
Priority date: 1989-03-04
Filing date: 1990-02-28
Publication date: 1992-12-17
Also published as: WO1990010056A1; CA2048606A1; US5264344A; AU5168490A; EP0461153A1; GB8905001D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】薄膜上の細胞の培養方法［背景］本発明は細胞の培養に関する。

用語“成長”および“増殖”は５細胞に適用する限りにおいて、この発表の目的上で同義である。

原核細胞と真核細胞とは限りない製薬・工業的価値を有する材料を生産可能である。それらの材料は真核ハイブリドーマ細胞により生産される単クローン抗体であるか、または原核細胞と表現されそれから分泌またはその他の方法で得られる真核オリジンの遺伝子の産物、もしくは操作可能な組替え核酸方法論の介在なしの生物体により正確に表現されそれから分泌される原核オリジンの真の産物である。

そのような細胞代謝状態は、生成を決定し、産物の排出を決定するのに重要である。

たとえば、多くの一般的微生物は普通はそれらが成長阻止の段階へ入るよう誘導されたときそのような産物のみをを生成し分泌する、そしてそわばとりわけても栄養枯渇、栄養剤もしくは酸素についての他の微生物との競合、微生物生息地環境変化もしくは近辺に成長する微生物の別の系統からの抗代謝物質の産出によって引き出される。

成長阻止された微生物が産出する生成物の例としては、マイトマイシンＣ、シトラターゼのような抗生物質、抗腫瘍剤および例えば洗浄パウダーに使用できる耐熱酵素である。

その種生成物を産出することが潜在的に可能である微生物の培養用の当初ふるい分は手順は、例えば、土壌の原料懸濁を適当な増殖培地（ワクチンなどを）へ植え付けることを含むかもしれない。増殖培地は適当な条件のもとて加温放置され、微生物の混合培養が得られる。成長阻止の段階へ誘導されないかぎり、有用な微生物生成物の目立った量の産出、もしくはすくな（とも排出はみられない。その上、そのようなふるいわけ手順において、かなりの量の増殖培地および多数の培養容器が、成長阻止されずに過成長してしまった細胞集落もしくはその近辺の集落によって消耗される。

従来のように、同じ培地でも成長速度の相違するかも知れない、多数の株を包含した混合集落を含む微生物の細胞集落では、ゆっくりと成長阻止段階に達するが、一旦阻止されると、それから原位置ふるい分は手順の使用で興味の対象となる微生物の株を識別することが、たとえ不可能でないとしても、困難である濃いヘテロ　マスを生じる。

［発明の概要］本発明は、細胞が生成物を産出するよう助長し、滲出された生成物を識別する方法、すなわち細胞をある量の培地面上で培養し、培地の面を多数の増殖区域に分割することにより細胞が利用できる増殖培地の量を制限し、前述の生成物が産出される代謝期に達するようにし、そこで現位置のふるい分は手順を使用して生成物を識別することに特徴づけられる、細胞の培養方法である。

細胞に利用できる増殖培地は細胞に利用できる増殖培地の表面区域の境界を限ることにより限定してもよい。

増殖培地の表面区域は１表面と接触する膿を使って境界を限ってもよい。

膜は、実質上酸素を通さないプラスチック・フィルム材料でよい。

プラスチック・フィルム材料はポリエタンでもよい。

膜は、金属材料であってもよい。

膜は、その上に細胞が成長できる増殖培地表面の区域を限定する間隔配置孔多数を有してもよい。

膜は、膜を堅くするに役立つ裏打ち層を含んでもよい。

膜は、多数の膜が重ね合わされ、半浸透性の一枚のシートへ接着される、多層張り合わせでもよい。上述のシートはそれ自体が多層張り合わせでもよく、蛋白質や類似寸法の分子を透過させなくてよい。

膜は、ペトリ皿にまたは、細菌、動物もしくは植物細胞のいずれでもの細胞培養に使用されるその他の適当な容器内に保持されるように改造してもよい。

できるならば孔は０．８ないし１１３ｍｍ”の区域境界を限定するものとする。

より望ましくは、孔は０．８ないし５１ｍｍ＋”の区域境界を限定するものとし、最も望ましくは、孔は３ないし１３關２の区域境界を限定するものとする。

孔は大体において円断面を有するものとし、６ないし１０ｍ５＋の間隔をおいてよい。

孔は膜上へ横幾列かにまたは縦幾列かに配置してよく、それによって膜内の孔の正方形配置としてよい。

各膜は独自の方法で、例えば一連番号付けして、識別してよい。

一連番号は、培地へ接触しそれによって培地へ部分的に転移される膜の表面に無毒な着色材料で印刷適用してもよく、それにより増殖培地が同様に番号付けされる。

膜を増殖培地の表面から外したとき、孔の周囲の膿へくっついた残存する細胞集落を増殖培体上に残存する相当集落から位置決めできるように、膜を正しく位置付ける方法を含んでもよい。

前述の方法は、膜内の各部分を切りぬくことでも可能となる。膜はそれを増殖培地表面へ無菌昇降しやすくする突出しを有してもよい。

より望ましいくは、上記の方法に、培地に接触し、それによって培地へ部分的に転移される膜の表面へ適用される無毒の着色材料のグリッドを含むものとする。

増殖媒体への転移を助長するため洗浄材を着色材料へ添加してもよい。

前記の洗浄材はポリオキシエチレンソルビタン、より望ましくはそのモノラウレート誘導体でよい。

前記の無毒、着色材はペリカン・ファウント墨汁でよい。

細胞の培養の多数の複製を作るために膿の積み重ねを使用してもよい。細胞は増殖培地の区域を限定する膜の孔の中で成長させてもよい。増殖培地のある区域が細胞の成長と融合する場合は、膿の積み重ねを分解して、増殖培地のさらに進んだ供給を植え付けるために膜を使用してもよい。

膜の積み重ねは、例えばシリコーン化薬品のような剥離薬品で処理してもよい。

細胞生成物のふるい分けには、その集落に指示薬品を適用し、前記集落の周囲の指示薬の変化がそれによって検知され上記の生成物の生成を指示するように指示薬品を固定かしてもよい。

指示薬品は微生物でよく、あるいは化学指示薬であってもよい。

代替としであるいは追加として、前記の生成物は免疫学的方法、例えば、前記の生成物の抗体への反応、もしくは前記の生成物がそれ自体抗体である場合には真の抗原への反応で検知してもよい。

前記の抗体もしくは抗原は、標識化してもよい。標識化には、蛍光マーカもしくはその他の適当なマーカを使用してよい。

細胞の代謝期は成長阻止してよく、細胞は原核であってもよい。細胞が原核であり代謝期に成長が阻止されるときは、指示薬は軟寒天内で固定化される大腸菌のような微生物であっても、あるいは化学薬品であってもよい、化学薬品は、指示薬と体代謝きっ抗物質との間の化学反応が、もしくはその他の微生物生成物が、微生物より下の増殖培地内で検知できるならば、軟寒天内にもしくはスプレーのような他の方法に加えてもよい。

指示薬は、成長阻止微生物をとり囲む培地へ加えた色原体基質でよい。

たとえば特定酵素の生成のための成長阻止微生物のふるい分けは、軟寒天内の大腸菌の異体型でよい突然変異体指示細胞ラインを成長阻止微生物上に加えることを含めてもよい。細胞ライン内の突然変異は、変異細胞が酵素、砂糖、またはアミノ酸のような要素が補給されない培地内で成長出来ないようなものであってもよい。もし成長阻止微生物が突然変異細胞ラインの成長に必要な要素を生成する場合は、変異細胞の成長が検知されるであろう。

本発明は、発明を具体化する方法のひとつの形とその方法を実施するための装置とを示す添付図面のい（っかの図に参照づけられる下記の説明で一層明白となるであろう。

図示において、第１図は、増殖培地の膜境界区域を内容とするペトリ皿の断面を示し、第２図は、第１図に示すペトリ皿の平面図であり、第３図は、膜の積み重ねを内容とする別のベトリ皿の断面を示し、第４図は、膜の孔の望ましい配置を示し、第５図は、増殖培地の表面と接触する裏打ち材を含む本発明にしたがった膜を示し、第６図は、真核細胞の培養用に改造された膜の、とりわけ単クローン抗体を生成する膜の、形状を示す。

これらの図は、細胞が同定可能な生成物を生成できるよう細胞を培養する方法を図示するものであり１図中で細胞（１ｏ）は１個の培地（１１）の表面で培養され、培地の表面を多数の増殖区域（１２）に分割して細胞（１０）が利用できる培地（１１）の量を制限することによりそこで前記の生成物が生成される代謝期に細胞（１０）が到達するようにし、それによって生体内原位のふるい分は手順を使用した生成物の同定を行なう。

細胞に利用できる培地は、細胞（１０）が利用できる培地の表面の区分を境界付けることにより限定される。

培地（１１）の表面区分は、表面と接触する膜（１３）で境界付けられる。

膜（１３）は、実質的に酸素を通さないポリエタンのようなプラスチック・フィルムで作られる。できれば、培地に接触する部分以外の膜表面にはろう状の性質をもたせることにより膜上面に水分が広がらないようにする。

特定の用途には本発明による膜をアルミニューム・ウェファのような金属材料で作成することの妥当性が認識されるであろう。

膜（１３）は、細胞（１０）が増殖する培地面の区域（１１）を限定する間隔をおいて配置された多数の孔（１４）を有する。

膜（１３）は、直径が約１０ｃ鵬のベトリ皿（１５）、もしくは細菌、動物もしくは植物細胞のいずれでも細胞培養に使用されるその他の適当な容器の中に保持されるように改造される。

孔（１４）のそれぞれは、面積が０．８ないし１１３１１ｍ”の範囲内に、できれば０．８ないし５１ｍ５＋”の範囲内に、最も望ましくは３ないし１３■園２の範囲内に制限される。

第２図に示すように、孔はぼ円形断面とする。

孔（１４）は、それぞれの間隔を６ないし１０ｍ５”とするが、いくつかの間隔は用途によって熟慮される（下記を参照）。

孔（１４）は、膜（１３）上に横列または縦列に位置し、したがって第４図に示すように膜（１３）上には孔（１４）の正方形配置（１５）が行なわれる。

培地の面へ膜を位置決めするための転写可能なインキがついた膜の場合は、面を中心におく正方形配置は避けることが望ましい（下記を参照）。

各膜は、一連番号付け（１６）により独自に識別される。識別は、膜から培地面への転写のかたちで、また膜（１３）上に保持されるかたちでもたらされる。

一連番号（１６）は培地に接触する膜（１２）の面へ無毒性の着色材を施すことにより膜に適用すれば、それが培地へ部分的に転写され、したがって培地も同様に番号付けされる。同一番号を膜の非接触面へ消えないインキで印す。

膿をまえもって培地の面に接触させ、それにより培地に残留する細胞集落が膜内の相当する孔から識別できるよう培地の面に対して位置決めしてよい。

膜は培地面上の特定点に相当する膜内の切りぬき断面（１７）をもたらすことで位置決めしてよい、膜は培地面への膜の無菌昇降しやす（する突出しく２８）を有している。

より望ましくは、ペリカン・ファウント墨汁のような無毒性着色材のグリッド（１８）が培地（１１）へ接触する膜（１３）の面に適用され、したがってインキは培地へ部分的に転写される。グリッド（１８）の縦横の列に同じインキで文字や数字を記入してもよい。培地面へのインキの部分的な転写を助けるために清浄材がインキに添加される。

清浄材は生物学的に比較的良性であり、できればポリオキシエチレンソルビタンのモノラウレート誘導体が望ましい。

細胞培養の多数のコピーを製造するため（１３）の積み重ね（２０）が使われる。使用時は、細胞は膿の積み重ね内の孔で課せられた培地面の境界に達するまで培地（１１）の面上に増殖する。細胞の増殖は細胞が利用できる培地の限界で阻止される。細胞が孔を埋めると、膿の積み重ねは孔の周囲が汚染される。膜の積み重ねは分解され、個々の膜は増殖培地のその後の供給を植え付けるために使用される。

膜（１３）の積み重ね（２０）は、たとえばシリコン化薬剤のような剥離剤を使用して処理される。

細胞生成物用のふるい分けは、その集落への指示薬（１９）の適用と指示薬の固定化を含み、前記の集落あたりでの（１９ａ）に示す指示薬の変化を検知し、前記生成物の生成を指示する。

指示薬（１９）には微生物もしくは化学指示薬品を使用できる。

代替としであるいは追加として、前記生成物は免疫学的方法、例えば、前記の生成物の抗体への反応、もしくは前記の生成物がそれ自身抗体である場合には真の抗原への反応で検知してもよい。

前記の抗体もしくは抗原は、蛍光体もしくはその他の適当なマーカを使用して標識化してもよい。

細胞が成長阻止微生物細胞である場合、選別法は、増殖阻止微生物のコロニーに指示剤１９を与える段階と、この指示剤を固定する段階とを含み、増殖阻止微生物のコロニーまわりに第１図に１９ａで概略的に示す指示剤の変化を検出して有用微生物生成物の産生を示すことができる。

実際には、指示剤は、軟らかい寒天内で固定することのできるＥ、ｃｏｌｉのような微生物であってもよい。代謝拮抗物質または他の微生物生成物を、増殖阻止した生成物産生微生物１０ａのまわりのＥ、ｃｏｌｉのリーシス増殖低下領域によって示すことができる。たとえば、これは、生成物を産生じている増殖阻止微生物１０ａのコロニーまわりの、Ｅ、ｃｏｌｉを含有する寒天内の透明な領域１９ａとして表わすことができる。指示微生物が代謝拮抗物質を産生ぜずにコロニーのまわりで増殖することができる場合には、寒天は不透明となる。

しかしながら、指示剤は化学薬剤、たとえば、微生物生成物に優先的に結合し、発色反応で検出することのできる染料であってもよいことは了解されたい。

化学薬剤は、指示剤と代謝拮抗物質または他の微生物生成物との化学反応が微生物の下方の増殖媒質内で検出され得るならば、軟らかい寒天に添加するか、あるいは、別の方法、たとえば、スプレーによって適用できる。

増殖阻止微生物の産生じた天然生成物、たとえば、酵素は、増殖阻止微生物を囲む媒質に色原体物質を添加することによって検出できる。たとえば、ニトロセフインを増殖媒質に添加し、たとえば、ペニシリナーゼの微生物産生の検出を容易にすることができる。これは、ペニシリナーゼがニトロセフインと反応したときに、ニトロセフインの黄色が赤色に変わるからである。

酵素その他の天然生成物の選別では、ミュータント指示細胞ライン（Ｅ、ｃｏｌｉのミュータント形態であり得る）を軟らかい寒天内の増殖阻止微生物上に与えてもよい。指示細胞ラインの突然変異は、ミュータント細胞がファクタを補充していない媒質内で増殖できないようなものである。もし増殖阻止微生物がミュータント・細胞ラインの増殖に必要なファクタを産生するならば、ミュータント細胞ラインは増殖することになり、見えるようになる。ファクタとしては、酵素があり、これはミュータント指示細胞の酵素不足を補う。あるいは、ミュータント指示細胞が増殖に必要とする代謝物質、たとえば、砂糖やアミノ酸もファクタとなり得る。

さらに別の実施例では、指示細胞ラインは、定められた試薬が指示細胞の増殖にとって有毒であるか、あるいは、それを抑制するようなものであり得る。試薬は、指示細胞が増殖阻止微生物上に層をなしている軟らかい寒天に添加してもよい。たとえば、試薬は抗生物質あるいは化学的に改質した抗生物質である。増殖阻止微生物の産生じた微生物生成物は試薬を分解あるいは改質し、指示細胞を増殖させてしまうかも知れない。指示細胞の溶菌よりもむしろ増殖が定められたクラスの微生物生成物の増殖阻止微生物による産生の証拠である。突然変異が指示細胞ラインで行われて指示細胞が試薬に敏感となる可能性がある。

単一コロニーの増殖阻止微生物の多段選別を実施することができる。たとえば、増殖培地に指示剤を入れ、軟らかい寒天に異なった指示剤を入れ、次にこれを増殖阻止微生物上に層状に重ねることによって５２種類の微生物生成物の産生を検出することができる。

本発明による膜を使用することによって、多数の微生物あるいは細胞を伴う作業の速度を高めると共に、番孔が純粋な、あるいは、はぼ純粋な培養菌を含む可能性を高めることができる。

これらの膿の使用により、産業プロセスでの細胞培養を伴う技術の自動化および規格化力呵能となる。また、これらの膜の使用により、自動接種や、主として指定位置（番号を明示するか、あるいは、行と列による番号付は位置を含む）に細胞の増殖を限定することによって必要な細胞生成物の自動検出を助けることができる。

膿の孔へ播種した細胞が真核細胞、たとえば、抗体産生ハイブリドーマである場合、膜をコラーゲンまたはゼラチン基体の表面に置（と好ましいが、フィブリンと寒天あるいはアガロースゲル、または、適当なその誘導体を含む任意他の適当な固形支持培地も用い得る。

実際には、膜は適当な栄養塩を含む固形支持培地上に置（。

混合母集団の抗体産生細胞を次に培地内へ接種するが、このとき、平均して１つの孔あたり１つに満たない活力ある細胞がある程度の密度で行う。細胞が増殖したら、膜を２番目の増殖培地に移し、膿の孔の周縁に付着している種々のクローンを生きた状態で保存する。最初の培地は細胞生成物についてテストする。

生成物が抗体である場合、先の孔の位置における培地を、そこに標識抗原を付与することによって検出する。この抗原は蛍光染料で標識付けされているが、もっと便利には、間接法を用いて、抗原を孔の位置に加え、この抗原に対して免疫的に異なった生物に生じる第２抗体に蛍光標識付けを行い、かつそこを境する方法がある。所望のクローンは、膜上の対応した孔から今や第２増殖培地に置かれ、必要に応じて精製され、大量に増殖する。

膜７１は、第５図に示す膜を剛性化するのに役立つバッキング層７２を包含し得る。

このような細胞が前記固体増殖培地で適当に増殖できない場合には、第６図に示す変形例の多層膜２１を使用する。これは、比較的厚みのあるポリエチレン膜３１からなる第１層を包含し、孔１４が浅いくぼみ３２を構成している。これが半透膜４１に重ねられ、結合される。この半透膜は、第１層３１の孔に一致する寸法、形態の孔１４を有し、細孔サイズはおそらくは０．５マイクロメートルである。層４１は、同様の材料で作っであるが、孔を持っていない別の層５１に結合する。層５１は、さらに、セロファンのような材料のシート６１に結合される。

これは水やビタミンのような小さい分子の通過を許すが、タンパク質、特に、抗体のような分子の通過は阻止する。

４つの層からなる膜２１を液状栄養培地に浮かべ、上記のように、すなわち、１つの孔１４あたり１つに満たない活力ある細胞を与える密度で細胞を接種する。

細胞のクローンが孔１４に生じ、それによって産生された抗体が、Ｏｌ・５ミクロンの細孔サイズを持つが、孔を持たない第３の層５１に拡散する。抗体は第４の層６１、すなわち、セロファン様材料で作った層には拡散しない。適切な細胞増殖の後、上方の膜を第２の増殖培地に移し、下方２つの膜を抗体の存在についてテストする。

所望の抗体を産生じた細胞クローンは、次に、今や第２増殖培地にある膜の上方層の対応した孔に隔離される。

明らかなように、ここでは、本発明を上記の実施例のみに限定するつもりはな（、請求の範囲に定義した発明の範囲から逸脱することなく多（の変更が当業者によって容易に実施し得る。

たとえば、多層膜を所定位置で核酸分子の検出するのに用いることができる。この場合、上方膜は、原核細胞を含む成る種の細胞をセロファンまたは同様の材料の層に隣接した下方層に向かって下向きに増殖させることができる程度に大きな細孔を持つ。膜によって構成される上方２つの層を次に取り出し、第２の増殖培地に移し、下方層の細胞を変性させ、そこの核酸を公知の探計法で探る。

多層膜の上方層はフィブロネクチン等の分子で被覆して細胞増殖を促進してもよい。

本方法の使用によって有用と考えられる細胞は公知手段によって増殖させることができ、本方法によるものと考えられる生成物をそれから精製することができる。

補正書の写しく翻訳文）提出（特許法第１８４条の８）１１国際出願番号　ＰＣＴ／ＧＢ９０１００３１６２、発明の名称住　所　イギリス国　レイセスタ−ＬＥＩ　７ＲＨユニバージテイー　ロード　（番地なし）名　称　ユニバージティー　オプ　レイセスタ−国　籍　イギリス国４、代理人住　所　東京都港区芝３丁目４番１１号５、補正書の提出年月日　１９９１年２月２７日６、添付書類の目録浄書（内容に変更なし）し訂と端ｊ（→すａ〕６、請求の範囲第３項記載の方法において、膜が金属材料からなることを特徴とする方法。

７、請求の範囲第３項から第６項までのうちいずれが１つの項に記載の方法において、膜が、細胞が増殖し得る増殖培地表面の領域を定める？ｊｌ数の間隔を置いた孔を包含することを特徴とする方法。

８、請求の範囲第３項記載の方法において、膜が多層構造であり、複数の膜が半透膜シート上に重なり、結合していることを特徴とする方法。

９、請求の範囲第８項記載の方法において、前記シートが多層構造であり、タンパク質や同様のサイズの分子に対して不透過性であることを特徴とする方法。

１０、請求の範囲第３項から第８項までのいずれか１つの項に記載の方法において、膜がペトリディッシュ内に保持されるようになっていることを特徴とする方法。

】１．　請求の範囲第７項から第１０項までのいずれか１つの項に記載の方法において、前記孔がほぼ円形の横断面のものであり、０．８〜１１３平方ミリメートルの面積を定めていることを特徴とする方法。

１２、特許請求の範囲第１１項記載の方法において、前記孔がほぼ円形横断面のものであり、０．８〜５１平方ミリメートルの面積を定めていることを特徴とする方法。

１３、請求の範囲第１２項記載の方法において、前記孔がほぼ円形横断面のものであり、０．８〜１３平方ミリメートルの面積を定めていることを特徴とする方法。

１４、　請求の範囲第７項から第１３項までのいずれか１つの項に記載の方法において、前記孔が６〜１０ミリメートルの間隔となっていることを特徴とする方法。

１５、請求の範囲第７項から第１４項までのいずれか１つの項に記載の方法において、前記孔が行あるいは列として膜上に設けてあり、膜に正方形配列の孔を設けたことを特徴とする方法。

１６、請求の範囲第３項から第１５項までのいずれか１つの項に記載の方法において、膜が、たとえば、順次に番号付けすることによって容易に識別できることを特徴とする方法。

１７、請求の範囲第１６項記載の方法において、膜の培地と接触している面に無毒の着色材料で連続番号が付けてあり、それを部分的に培地に転写し、それによって、増殖培地にも番号付けすることを特徴とする方法。

２、特許請求の範囲第２２項記載の方法において、前記洗剤がポリオキシエチレンソルビタンであることを特徴とする方法。

２、特許請求の範囲第２０項から第２３項のうちいずれか１つの項に記載の方法において、前記無毒着色材料がインディアンインクであることを特徴とする方法。

２、特許請求の範囲第３項記載の方法において、前記膜の積重体を用いて細胞培地の多数のコピーを作り、膜の孔によって定められた増殖培地領域が細胞増殖と融合したときに、膜の積重体を分化し、接種に用いる膜がさらに増殖培地の供給源となることを特徴とする方法。

２、特許請求の範囲第２５項記載の方法において、前記膜を剥離削、たとえば、シリコン化剤で処理したことを特徴とする方法。

２、特許請求の範囲第３項から第２６項までのいずれか１つの項に記載の方法において、細胞生成物の選別段階が、膜の孔内に位置した細胞のコロニー上に指示剤を塗布し、この指示剤を固定し、それによって、前記コロニーまわりの指示剤の変化を検出し、前記生成物の産生を指示することができることを特徴とする方法。

２、特許請求の範囲第２７項記載の方法において、指示剤が微生物であることを特徴とする方法。

２、特許請求の範囲第２７項記載の方法において、前記指示剤が化学的指示薬であることを特徴とする方法。

３０、請求の範囲第２７項記載の方法において、前記指示剤が軟らかい寒天内で細胞に付与されることを特徴とする方法。

３１、　請求の範囲第２７項記載の方法において、前記指示剤がスプレーで細胞に付与され、指示剤と生成物の化学反応を細胞の下の増殖培地において検出できることを特徴とする方法。

３２、　請求の範囲第２９項から第３１項のうちいずれか１つの項に記載の方法において、指示剤が細胞を囲む増殖培地に添加された色原体基材であることを特徴とする方法。

３３、　請求の範囲第２７項記載の方法において、前記生成物が免疫手段によって検出され、生成物が抗体または抗原と反応することを特徴とする方法。

３４、　請求の範囲第３３項記載の方法において、前記抗体あるいは抗原が標識付けしであることを特徴とする方法。

３５、　請求の範囲第３４項記載の方法において、抗体あるいは抗原が蛍光染料で標識付けしであることを特徴とする方法。

３６、　請求の範囲第１項記載の方法において、細胞の代謝段階が増殖阻止であり、細胞が原核細胞であることを特徴とする方法。

３７、　細胞を培養し、生成物を産生するように細胞を促すのに使用する膜であって、複数のほぼ円形の横断面を持つ孔を包含し、番孔が０．８〜１１３平方ミリメートルの面積を構成していることを特徴とする膜。

３８、　請求の範囲第３７項記載の膜において、ベトリディッシュに保持されるようになっていることを特徴とする膜。

３９、　請求の範囲第３７項または第３８項に記載の膜において、孔が６〜１０ミリメートルの間隔で隔たっていることを特徴とする膜。

４０、請求の範囲第３７項から第３９項までのいずれか１つの項に記載の膜において、前記孔が行または列で膜上に設けてあり、正方形配列の孔を膜に設けたことを特徴とする膜。

４１、　実質的に本文に説明したことを特徴とする膜。

平成３年ｌＯ月　３日

Claims

【特許請求の範囲】

１．生成物を産生する細胞を培養し、これらの細胞を生成物を産生するように促し、こうしてできた生成物を識別する方法であって、細胞を或る量の増殖培地の表面で増殖させ、この表面を複数の増殖領域に分割しておき、それによって、生成物が産生される代謝段階に達するように細胞に利用できる増殖培地の量を制限し、こうして産生された生成物をその場の選別手順で識別することを特徴とする方法。
２．請求の範囲第１項記載の方法においで、細胞に利用できる増殖培地を増殖培地表面積を境することによって制限することを特徴とする方法。
３．請求の範囲第２項記載の方法において、増殖培地の表面積がこの表面と接触している膜によって境されていることを特徴とする方法。
４．請求の範囲第３項記載の方法において、膜が、ほとんビ酸素を透過させないプラスチック・フィルム材料からなることを特徴とする方法。
５．請求の範囲第３項記載の方法において、プラスチック・フィルム材料がｐｏｌｙｅｔｈｅｎｅであることを特徴とする方法。
６．請求の範囲第３項記載の方法において、膜が金属材料からなることを特徴とする方法。
７．請求の範囲第３項から第６項までのうちいずれか１つの項に記載の方法において、膜が、細胞が増殖し得る増殖培地表面の領域を定める複数の間隔を置いた孔を包含することを特徴とする方法。
８．請求の範囲第３項記載の方法において、膜が多層構造であり、複数の膜が半透膜シート上に重なり、結合していることを特徴とする方法。
９．請求の範囲第８項記載の方法において、前記シートが多層構造であり、タンパク質や同様のサイズの分子に対して不透過性であることを特徴とする方法。
１０．請求の範囲第３項から第８項までのいずれか１つの項に記載の方法において、膜がペトリディッシュ内に保持されるようになっていることを特徴とする方法。
１１．請求の範囲第７項から第１０項までのいずれか１つの項に記載の方法において、前記孔がほぼ円形の横断面のものであり、０．８〜１１３平方ミリメートルの面積を定めていることを特徴とする方法。
１２．請求の範囲第７項から第１０項までのいずれか１つの項に記載の方法において、前記孔がほぼ円形横断面のものであり、０．８〜５１平方ミリメートルの面積を定めていることを特徴とする方法。
１３．請求の範囲第７項から第１０項までのいずれか１つの項に記載の方法において、前記孔がほぼ円形横断面のものであり、０．８〜１３平方ミリメートルの面積を定めていることを特徴とする方法。
１４．請求の範囲第７項から第１３項までのいずれか１つの項に記載の方法において、前記孔が６〜１０ミリメートルの間隔となっていることを特徴とする方法。
１５．請求の範囲第７項から第１４項までのいずれか１つの項に記載の方法において、前記孔が行あるいは列として膜上に設けてあり、膜に正方形配列の孔を設けたことを特徴とする方法。
１６．請求の範囲第３項から第１５項までのいずれか１つの項に記載の方法において、膜が、たとえば、順次に番号付けすることによって容易に識別できることを特徴とする方法。
１７．請求の範囲第１６項記載の方法において、膜の培地と接触している面に無毒の着色材料で連続番号が付けてあり、それを部分的に培地に転写し、それによって、増殖培地にも番号付けすることを特徴とする方法。
１８．請求の範囲第３項から第１７項までのいずれか１つの項に記載の方法において、膜が、それをひとたび増殖培地の表面から除去したときに、孔の周縁で膜に付着し続けている細胞のコロニーを増殖培地に残っている対応したコロニーに置くことができるように膜を方向付ける手段を包含することを特徴とする方法。
１９．請求の範囲第１８項記載の方法において、前記手段が膜に設けたカットアウト部であることを特徴とする方法。
２０．請求の範囲第１８項記載の方法において、前記手段が増殖培地と接触している膜面に塗布した無毒の着色材料の格子であり、それを部分的に増殖培地に転写するようにしたことを特徴とする方法。
２１．請求の範囲第２０項記載の方法において、前記格子の行と列が番号付けあるいは文字化してあることを特徴とする方法。
２２．請求の範囲第２０項記載の方法において、着色材料に洗剤を添加して増殖培地への転写を助けるようにしたことを特徴とする方法。
２３．請求の範囲第２２項記載の方法において、前記洗剤がポリオキシエチレンソルビタンであることを特徴とする方法。
２４．請求の範囲第２０項から第２３項のうちいずれか１つの項に記載の方法において、前記無毒着色材料がインディアンインクであることを特徴とする方法。
２５．請求の範囲第２４項記載の方法において、前記インクがＰｅｌｉｃａｎ　Ｆｏｕｎｔ　Ｉｎｄｉａｎ　Ｉｎｋであることを特徴とする方法。
２６．請求の範囲第３項記載の方法において、前記膜の積重体を用いて細胞培地の多数のコピーを作り、膜の孔によって定められた増殖培地領域が細胞増殖と融合したときに、膜の積重体を分化し、接種に用いる膜がさらに増殖培地の供給源となることを特徴とする方法。
２７．請求の範囲第２６項記載の方法において、前記膜を剥離剤、たとえば、シリコン化剤で処理したことを特徴とする方法。
２８．請求の範囲第３項から第２７項までのいずれか１つの項に記載の方法において、細胞生成物の選別段階が、膜の孔内に位置した細胞のコロニー上に指示剤を塗布し、この指示剤を固定し、それによって、前記コロニーまわりの指示剤の変化を検出し、前記生成物の産生を指示することができることを特徴とする方法。
２９．請求の範囲第２８項記載の方法において、指示剤が微生物であることを特徴とする方法。
３０．請求の範囲第２８項記載の方法において、前記指示剤が化学的指示薬であることを特徴とする方法。
３１．請求の範囲第２８項記載の方法において、前記指示剤が軟らかい寒天内で細胞に付与されることを特徴とする方法。
３２．請求の範囲第２８項記載の方法において、前記指示剤がスプレーで細胞に付与され、指示剤と生成物の化学反応を細胞の下の増殖培地において検出できることを特徴とする方法。
３３．請求の範囲第３０項から第３２項のうちいずれか１つの項に記載の方法において、指示剤が細胞を囲む増殖培地に添加された色原体基材であることを特徴とする方法。
３４．請求の範囲第２８項記載の方法において、前記生成物が免疫手段によって検出され、生成物が抗体または抗原と反応することを特徴とする方法。
３５．請求の範囲第３４項記載の方法において、前記抗体あるいは抗原が標識付けしてあることを特徴とする方法。
３６．請求の範囲第３５項記載の方法において、抗体あるいは抗原が蛍光染料で標識付けしてあることを特徴とする方法。
３７．請求の範囲第１項記載の方法において、細胞の代謝段階が増殖阻止であり、細胞が原核細胞であることを特徴とする方法。
３８．細胞を培養し、生成物を産生するように細胞を促すのに使用する膜であって、複数のほぼ円形の横断面を持つ孔を包含し、各孔が０．８〜１１３平方ミリメートルの面積を構成していることを特徴とする膜。
３９．請求の範囲第３８項記載の膜において、ペトリディッシュに保持されるようになっていることを特徴とする膜。
４０．請求の範囲第３８項または第３９項に記載の膜において、孔が６〜１０ミリメートルの間隔で隔たっていることを特徴とする膜。
４１．請求の範囲第３８項から第４０項までのいずれか１つの項に記載の膜において、前記孔が行または列で膜上に設けてあり、正方形配列の孔を膜に設けたことを特徴とする腹。
４２．実質的に本文に説明したことを特徴とする腹。