RU220260U1 - Устройство для культивирования биопленочных форм микроорганизмов - Google Patents

Abstract

Полезная модель относится к области микробиологии. Устройство для культивирования биопленочных форм микроорганизмов имеет нижнюю емкость, в которую помещена верхняя емкость, снабженная обжимными кольцами, между которыми расположена двухслойная полупроницаемая мембрана, при этом верхняя емкость выполнена с крышкой, имеющей отверстие круглой формы для загрузки питательной среды и инокуляции микроорганизма, а соотношение объемов верхней и нижней емкостей составляет 1:10. Технический результат: расширение функциональных возможностей устройства. 2 ил., 1 пр.

Description

Полезная модель относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности к устройствам для культивирования микроорганизмов, предназначенных для изучения антагонистического взаимодействия биопленочных форм двух культур микроорганизма.

Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) является одним из самых опасных условно-патогенных оппортунистических микроорганизмов, изучаемых в настоящее время (1). Антагонистическая активность бактерий определяет их взаимодействие в микробном консорциуме (2). При этом антагонистическая активность обусловлена способностью синтезировать и экскретировать во внешнюю среду различные антимикробные вещества. В частности, синегнойная палочка обладает способностью выделять во внешнюю среду большое количество вторичных метаболитов, таких как феназиновые пигменты (пиоцианин, пиомеланин, пиорубин и др.), пиролы, производные индола, бактериоцины (пиоцины), органические кислоты, обладающие выраженным антибактериальным действием. Патогенность P. aeruginosa обусловлена в том числе способностью псевдомоносов существовать в форме биопленок, а в совокупности со способностью к синтезу вторичных метаболитов обеспечивает преимущества синегнойным палочкам в колонизации определенного экотопа, включая ткани макроорганизма (3).

Изучение механизма межмикробных взаимодействий, в частности путем взаимного влияния вторичных метаболитов, вырабатываемых биопленочными формами синегнойных палочек позволит разрабатывать на основе полученных знаний методические подходы к созданию новых способов исследования штаммов P. Aeruginosa (4).

Известно устройство для выращивания микроорганизмов, характеризующееся наличием вертикально-ориентированной ферментационной емкости, наличием перфорированной горизонтально-ориентированной перегородки в ней, позиционированной так, что она разделяет вертикально-ориентированную ферментационную емкость на верхний и нижний объемы (5).

Однако известное устройство не позволяет культивировать биопленки и отличается сложностью, неприемлемой для культивирования микроорганизмов в маленьких объемах и большом количестве повторностей, что ограничивает его использование для изучения большого количества микроорганизмов за короткие сроки.

Известно устройство для активации и наращивания биопрепаратов, включающее вертикальный корпус, инокулятор, аэрирующее устройство и перемешивающее устройство, которое также снабжено терморегулятором, биофильтрами для воды и воздуха, а также емкостью для питательной среды и емкостью для биогенных компонентов, при этом инокулятор, емкость для питательной среды и емкость для биогенных компонентов соединены с вертикальным корпусом трубопроводами с дозаторами, вертикальный корпус выполнен герметичным, двухслойным с размещенным между слоями терморегулятором, биофильтр для воды расположен на вертикальном герметичном корпусе, а аэрирующее устройство расположено в нижней части вертикального герметичного корпуса и соединено с биофильтром для воздуха (6).

Недостатком данного устройства является то, что оно не может быть использовано для изучения и выращивания биопленочных форм микроорганизмов.

Известно устройство для проведения микробиологических тестов, выполненное в виде чашки с выпуклым дном и бортиком и плотно насаженной крышкой. На крышке выполнены радиальные пазы. Чашка выполнена из оптически прозрачного материала, дно чашки отполировано и на него нанесена координатная сетка. Крышка выполнена из эластичного релаксирующего материала, на дно чашки нанесена питательная среда (7).

Несмотря на то, что простота и универсальность данного устройства позволяет изучать, в том числе антагонизм микроорганизмов, изучение антагонизма биопленочных форм затруднительно, ввиду сложности выявления самого факта образования биопленок на твердой питательной среде.

Наиболее близким к заявляемому устройству - прототипом, является устройство для культивирования биопленок микроорганизмов, представляющее собой катушку с внешним диаметром основания D=44 мм, высотой Н=56 мм и диаметром центрального стержня d=16 мм, в которую заправляется рентгенографическая пленка, в верхней части основания предусмотрена технологическая перфорация, предназначенная для беспрепятственного проникновения жидкой питательной среды между слоями пленки, там же расположен подвес, необходимый для помещения устройства в микробиологическую колбу или в ферментер, где проводят культивирование микроорганизмов (8).

Недостатком данного устройства является то, что сокультивирование двух разных культур микроорганизмов в биопленочной форме в данном устройстве невозможно.

Задачей, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, является расширение арсенала устройств для культивирования биопленок микроорганизмов, а также обеспечение возможности сокультивирования двух биопленочных форм разных культур микроорганизмов и раздельной оценки их позитивного и негативного воздействия друг на друга.

Технический результат: расширение функциональных возможностей устройства и расширение арсенала устройств для культивирования биопленок микроорганизмов.

Поставленная задача достигается устройством для культивирования биопленочных форм микроорганизмов, которое включает нижнюю емкость, в которую помещена верхняя емкость, имеющая обжимные кольца, между которыми расположена двухслойная полупроницаемая мембрана. Верхняя емкость имеет крышку с отверстием круглой формы для загрузки питательной среды и инокуляции микроорганизма. Объем верхней и нижней емкостей соотносится как 1/10, для обеспечения минимального влияния метаболитов культуры из верхней емкости, на метаболизм культуры из нижней емкости.

Культура, выращиваемая в нижней емкости, формирует биопленку на нижней части мембраны, что исключает накопление седиментированных бактериальных клеток и позволяет визуализировать образовавшуюся биопленку как микроскопически, так и методом с кристалл-виолетом, предварительно разъединив мембраны с биопленками разных культур.

На фиг. 1 представлена общая схема устройства.

На фиг. 2 представлена боковая проекция устройства, вид спереди,

где 1 - верхняя емкость; 2 - обжимные кольца верхней емкости; 3 - двухслойная полупроницаемая мембрана; 4 - крышка верхней емкости; 5 - отверстие для загрузки питательной среды и инокуляции микроорганизма; 6 - нижняя емкость.

Предлагаемое устройство включает верхнюю емкость (1), размещенную в вертикально ориентированной нижней емкости (6), двухслойную полупроницаемую мембрану (3), расположенную между обжимными кольцами (2) верхней емкости (1), при этом верхняя емкость (1) выполнена с крышкой (4) имеющей отверстие круглой формы (5) для загрузки питательной среды и инокуляции (внесения) микроорганизма, а соотношение объемов верхней и нижней емкостей составляет 1:10, соответственно. Обжимные кольца (2) обеспечивают фиксацию двухслойной полупроницаемой мембраны к наружной поверхности верхней емкости. Емкости могут быть выполнены из оптически прозрачного материала, например, стекла или из синтетического полимера (полипропилена, полистирола).

Заявляемое устройство для культивирования биопленочных форм микроорганизмов используют следующим образом.

В стерильных условиях между обжимными кольцами (2) верхней емкости (1) размещают двухслойную полупроницаемую мембрану (3), затем в нижнюю емкость (6) вносят питательную среду и одну культуру P.aeruginosa, затем в нижнюю емкость (6) помещают верхнюю емкость (1) имеющую крышку (4) с отверстием (5), через которое в верхнюю емкость (1) вносят питательную среду и другую культуру P.aeruginosa. Размещение верхней емкости (1) в нижней емкости (6) обеспечивает контакт испытуемых культур только через двухслойную полупроницаемую мембрану (3), которая обеспечивает свободную диффузию разных низкомолекулярных соединений, пептидов вторичных метаболитов, вырабатываемых P. aeruginosa.

Пример.

В экспериментах использовали культуры Pseudomonas aeruginosa №6490 и №115 из коллекции экстремофильных микроорганизмов ИХБФМ СО РАН. В жидкую питательную среду LB (Luria-Bertani Broth) добавляли 6-ти часовую культуру P.aeruginosa №115,предварительно разведенную до концентрации 0,4 McFarlands units в пропорции 100 мкл культуры на каждые 10 мл питательной среды. Аналогичным образом подготавливали культуру P.aeruginosa №6490.

Антагонистическую активность между различными штаммами проводили следующим образом:

В стерильных условиях между обжимными кольцами (2) верхней емкости (1) размещали двухслойную полупроницаемую мембрану (3), затем в нижнюю емкость (6) вносили питательную среду и одну культуру P.aeruginosa №115, далее в нижнюю емкость (6) помещали верхнюю емкость, в которую, через отверстие (5) крышки (4), вносили питательную среду и другую культуру P.aeruginosa №6490, обеспечивая контакт испытуемых культур только через полупроницаемую мембрану, которая создает условия для свободной диффузии разных низкомолекулярных соединений, пептидов вторичных метаболитов, вырабатываемых Р. aeruginosa. Культивирование проводили в течение 72 часов при комнатной температуре.

В качестве контроля сравнения выращивали одну и ту же культуру в нижней и верхней емкостях. По завершении сокультивирования биопленки фиксировали 30% спиртом и окрашивали ДНК бактерий красителем SYBRGreen, а белки красителем SyproRuby Protein Gel.

С помощью люминесцентной микроскопии устанавливали рост биопленок культуры P.aeruginosa, выращенной в верхней емкости, и подавление роста биопленок культуры P.aeruginosa, выращенной в нижней емкости, в сравнении с контролем.

Предлагаемое устройство позволяет проводить сокультивирование разных культур микроорганизмов в форме биопленок в верхней и нижней емкостях в жидкой питательной среде на сопряженных друг с другом полупроницаемых мембранах, что обеспечивает возможность раздельной оценки позитивного и негативного воздействия друг на друга разных низкомолекулярных соединений, пептидов и вторичных метаболитов, вырабатываемых сокультивируемыми микроорганизмами, на интенсивность формирования бактериальных биопленок, исключая накопление седиментированных бактериальных клеток, что, в свою очередь облегчает в дальнейшем визуализацию биопленок.

Источники информации

1. Boucher, H.W., Talbot, G.H., Bradley, J.S., Edwards, J.E., Gilbert, D., Rice, L.B., Scheld, M., Spellberg, В., Bartlett, J., 2009. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clin. Infect. Dis. 48, c. 1-12.

2. Бухарин О.В. Ассоциативный симбиоз: научное издание / под ред. О.В. Бухарина; РАН, УрО, Ин-т клеточного и внутриклеточного симбиоза. -Екатеринбург, 2007. - 265 с.

3. Гриценко В.А. Антагонистические взаимоотношения Pseudomonas aeruginosa с грамотрицательными бактериями. БОНЦ УрО РАН 2016, №4, 11 с.

4. Кузнецова М.В. Оценка потенциальной патогенности P. Aeruginosa. Бюллетень сибирской медицины. 2012, №4,с. 494-51.

5. Патент RU 160091 U1, опубл. 27.02.2016.

6. Патент RU 105622 U1, опубл. 20.06.2011.

7. Патент RU 173302 U1, опубл. 21.08.2017.

8. Патент RU 206813 U1, опубл.29.09.2021.

Claims (1)

1. Устройство для культивирования биопленочных форм микроорганизмов, включающее вертикально установленную емкость для культивирования микроорганизма, отличающееся тем, что оно имеет нижнюю емкость, в которую помещена верхняя емкость, снабженная обжимными кольцами, между которыми расположена двухслойная полупроницаемая мембрана, при этом верхняя емкость выполнена с крышкой, имеющей отверстие круглой формы для загрузки питательной среды и инокуляции микроорганизма, а соотношение объемов верхней и нижней емкостей составляет 1:10.