CN101874105B - 用于细菌悬液的贮存的组合物和方法 - Google Patents

用于细菌悬液的贮存的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101874105B
CN101874105B CN2008801093735A CN200880109373A CN101874105B CN 101874105 B CN101874105 B CN 101874105B CN 2008801093735 A CN2008801093735 A CN 2008801093735A CN 200880109373 A CN200880109373 A CN 200880109373A CN 101874105 B CN101874105 B CN 101874105B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacterium
media compositions
bacterial suspension
luminous
compositions
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2008801093735A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101874105A (zh
Inventor
尼日特·尤利特则尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHECK LIGHT Ltd
Original Assignee
CHECK LIGHT Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHECK LIGHT Ltd filed Critical CHECK LIGHT Ltd
Publication of CN101874105A publication Critical patent/CN101874105A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101874105B publication Critical patent/CN101874105B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供了一种介质组合物。该介质组合物包括约1.0-3.0％的NaCl/KCl、0.5-7.0％的肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖、0.0-300mM的Mg/Ca、0.01-0.05％的酵母提取物/酸水解酪素、0.02-1.0％的牛血清白蛋白/卵白蛋白和0.1-3.5％的乙醇/甲醇/丙醇。

Description

用于细菌悬液的贮存的组合物和方法
技术领域
本发明涉及用于贮存细菌的介质组合物和方法，其中细菌贮存的方式能够保存被贮存细菌的理想特征。
背景技术
分析发光细菌发出的光是一种对水和其它流体进行卫生监测和毒性测试的快速、有效的方法。在基于发光细菌的化验中，细菌发出的光的减少与样品中毒性物质的存在成正比。这种类型的化验是灵敏的、定量且快速的。
现有技术中可获得的系统，该系统用于在对发光细菌发出的光进行分析的基础上进行的毒性测试，通常依赖于提供活性细菌培养试液或者提供再生细菌试液(例如冻干培养物的再水化)。活性细菌培养试液可以从封闭培养或者开放生长系统中提供。
在封闭培养系统中生长的细菌，包括发光细菌，表现出各种不同的生长阶段：滞后期、加速期、指数期、减速期和死亡期。封闭式批量培养容器中含有处于细胞周期的各个阶段的微生物的混合物。在培养物的不同生长期中，微生物的数量会以不同的速率增加，且培养物最终将衰败和死亡。随着培养物中有机体数量的上升，这些有机体生存的环境改变了。许多细胞成分例如ATP、DNA和蛋白质响应这些改变，从而使得它们的生化反应(发光)中的个体差别发生变化。
在开放式生长系统中，生长基质(介质)不断输入，废物、细胞和不使用的基质不断被除去。在生长过程中可以监测一些参数例如pH值、氧、温度等，例如通过物质添加来刺激或延迟生长，从而对生长过程中发生的变化进行自动补偿。在开放式生长或者连续培养系统中，指数生长期被无限期地延长，作为连续培养的增补和脱除。
现有技术中，准连续毒性试验通常采用再水化冻干细菌悬液。美国专利5,801,052描述了用于再造干细菌的设备。
有些文献描述了发光细菌的培养，例如文献[Zavoruev and Mezhevikin(1983)Prikl.Biokhim.Mikrobiol.19，pp.564-568]。而文献[D’Souza，2001 Biosens Bioelectron.2001Aug；16(6)：337-53]则提出了一种重组细菌生物传感器系统。
美国专利6,949,382描述了一种含有肌糖和镁的细胞培养介质。
文献[Rupani et al.，Biotechnol Prog(1886)12：367-392]描述了用乙醇作为细胞生长诱导剂。
发明内容
在本发明的一个示范性实施例中，提供一种介质组合物，该组合物包括约：
NaCl/KCl(％)                       1.0-3.0；
肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖(％)        0.5-7.0；
Mg/Ca(mM)                          0.0-300；
酵母提取物/酸水解酪素(％)          0.01-0.05；
牛血清白蛋白(BSA)/卵白蛋白(％)     0.02-1.0；和
乙醇/甲醇/丙醇(％)                 0.1-3.5。
选择性地，所述介质组合物包括约：
NaCl/KCl(％)                       2.0-3.0；
肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖(％)        5.0-7.0；
Mg/Ca(mM)                          1.0-200；
酵母提取物/酸水解酪素(％)          0.01-0.05；
BSA/卵白蛋白(％)                   0.02-0.1；和
乙醇/甲醇/丙醇(％)                 1.0-3.5。
选择性地，所述介质组合物包括约：
NaCl/KCl(％)                       2.0；
肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖(％)        5.0；
Mg/Ca(mM)                          2.0；
酵母提取物/酸水解酪素(％)          0.05；
BSA/卵白蛋白(％)                      0.05；和
乙醇/甲醇/丙醇(％)                    1.5。
选择性地，所述介质组合物包括抗生素。
选择性地，所述介质组合物为液体。
在本发明一个示范性实施例中，提供一种细菌悬液，该细菌悬液包括如上所述的介质组合物，细菌悬浮于该介质组合物中。
选择性地，所述细菌包括发光细菌。
在本发明一个示范性实施例中，提供一种制备如上所述的细菌悬液的方法，该方法包括：
将具有细菌培养的纤维润湿，以形成湿纤维；
将湿纤维冻干，以形成塞子；和
将塞子浸入介质组合物中，以形成细菌悬液。
在本发明一个示范性实施例中，提供一种贮存细菌的方法，该方法包括：
(a)使细菌悬浮在权利要求1-3中任一项所述的介质组合物中，以便形成细菌悬液；和
(b)将所述细菌悬液贮存在用于维持细菌存活并防止细菌扩张的条件下。
选择性地，悬浮步骤包括将纤维上的冻干细菌浸入所述介质组合物中。
选择性地，所述细菌包括发光细菌。
选择性地，所述维持细菌存活和防止细菌扩张在2-8℃进行至少2周。
选择性地，所述介质组合物包括至少一种抗生素。
选择性地，所述至少一种抗生素包括选自氯霉素和氨苄青霉素的至少一种化合物。
选择性地，所述至少一种抗生素的浓度约为15mg/L。
选择性地，所述条件还包括维持所述发光细菌的发光。
在本发明一个示范性实施例中，提供一种制品，包括：
(a)根据权利要求1-3任一项所述的介质组合物；和
(b)用于将细菌悬浮在所述介质组合物中以形成细菌悬液和将细菌贮存在-2～+8℃的说明书。
附图说明
现在仅仅通过举例的方式、参照附图来对本发明作详细说明。在具体参照附图时，需要强调的是，图中所示内容只是一种示例，其目的是用图示的方式讨论本发明的优选实施方式，图中展示的实施例被认为对于理解本发明的原理和概念最有用、最容易理解。在这方面，除了出于让读者基本理解本发明的需要之外，没有企图更详细地展示本发明的结构特征。本说明书及附图能够让本领域技术人员明了本发明的几种形式并予以实施。
在附图中：
图1为根据本发明一个实施方式的细菌悬液贮存方法简化流程图，所述方法用于在一个延长的时期内将细菌悬液贮存于冷藏温度下；
图2是发光的相对发光单位随时间变化的曲线图，该图展示了白蛋白浓度的不同所造成的影响；
图3是发光的相对发光单位随时间变化的曲线图，该图展示了醇浓度的不同所造成的影响；
图4是发光的相对发光单位随时间变化的曲线图，该图展示了糖浓度的不同所造成的影响；
图5是发光的相对发光单位随时间变化的曲线图，该图展示了二价阳离子浓度的不同所造成的影响；
图6是发光的相对发光单位随时间变化的曲线图，该图展示了一价盐浓度的不同所造成的影响；
图7是发光的相对发光单位随时间变化的曲线图，该图展示了pH值的不同所造成的影响；
图8是发光的相对发光单位随时间变化的曲线图，该图展示了蛋白质混合物浓度的不同所造成的影响；和
图9是发光的相对发光单位随时间变化的曲线图，该图展示了抗生素的不同所造成的影响。
具体实施方式
本发明的实施方式涉及介质组合物，在一些实施方式中，所述介质组合物可用来贮存细菌悬液，可在冷藏温度下将细菌悬液贮存至少2周，选择性地，也可以贮存3、4或5周，同时维持悬液的经选择的特性处于理想范围。在本发明的一个实施方式中，所述方法采用一种介质，该介质具有一组新成分，这些成分具有经选择的浓度。
特别地，本发明的一些实施方式可用于维持处于静止悬液中的细菌的发光。在本发明的一个实施方式中，所述发光用于对液态(水)样品中的一种或多种毒性物质进行分析。
根据本发明具体实施方式的方法和/或装置的原理和操作将借助于附图和相伴的描述得到更好的理解。
在对本发明的至少一种实施方式进行具体说明之前，必须理解：本发明不限于下面描述的具体内容或者实施例中述及的具体内容。本发明可以有其它的实施方式，或者说可以用不同的方式予以实施。还有必须理解，在此采用的措辞和术语只是为了描述的需要，而不应被视为一种限制。
本发明人通过艰苦的实验和筛选，合成了一种新的介质组合物，该介质组合物可用于在延长的时间段内、将细菌的发光保持在理想范围。
所述介质组合物(溶液)包括一价盐、糖、可选的二价阳离子源、蛋白质混合物、白蛋白和醇。选择性地，所述介质组合物包括至少一种抗生素。选择性地，所述蛋白质混合物包括非蛋白成分，如维生素和/或脂肪酸和/或血脂。
在本发明的一个实施方式中，所述一价盐包括NaCl和/或KCl。选择性地，所述一价盐的浓度约为1-3％，优选约2％。在本发明的一个实施方式中，采用2％的NaCl。
在本发明的一些实施方式中，约0.8％的一价盐浓度是有用的。选择性地，0.8％的NaCl可用于维持转基因大肠杆菌发光。
在本发明的一个实施方式中，所述糖选自肌糖、乳糖、海藻糖和葡聚糖。选择性地，提供的所述糖的浓度至少为约0.5％，但不大于约7％。在本发明的一个实施方式中，采用5-7％的肌糖。
在本发明的一个实施方式中，所述二价阳离子包括镁离子。选择性地，提供的所述镁离子的浓度约为1-200mM。
在本发明的一个实施方式中，所述蛋白质混合物包括酵母提取物和/或酸水解酪素。选择性地，所述蛋白质混合物包括浓度至少约为0.01％、但不超过约0.05％的酵母提取物。
在本发明的一个实施方式中，所述白蛋白包括牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。选择性地，提供的BSA的浓度至少约为0.02％、但不超过约1.0％。
在本发明的一个实施方式中，所述醇选自乙醇、甲醇和丙醇。选择性地，所述醇包括浓度至少约为0.01％、但不超过约5％、优选为1.5％的乙醇。
在本发明的采用抗生素的实施方式中，可以使用氯霉素和/或氨苄青霉素，其浓度可选择为约15mg/L。
因此，根据本发明的一个实施方式，提供一种介质组合物，包括：1.0-3.0％的一价盐(例如NaCl和/或KCl)、0.5-7.0％的糖(例如肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖)、0-300mM的二价阳离子(例如镁离子或钙离子)、0.01-0.05％的氨基酸源(例如酵母提取物或酸水解酪素)、0.02-1.0％的白蛋白(例如BSA或者卵白蛋白)以及0.1-3.5％的醇(例如乙醇、甲醇或者丙醇)。
在本发明的另一个实施方式中，所述介质组合物包括：2.0-3.0％的一价盐(例如NaCl和/或KCl)、5.0-7.0％的糖(例如肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖)、1-200mM的二价阳离子(例如镁离子或钙离子)、0.01-0.05％的氨基酸源(例如酵母提取物或酸水解酪素)、0.02-1.0％的白蛋白(例如BSA或者卵白蛋白)以及1.0-3.5％的醇(例如乙醇、甲醇或者丙醇)。
在本发明的另一个实施方式中，所述介质组合物包括：约2％的一价盐(例如NaCl和/或KCl)、约5％的糖(例如肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖)、约2mM的二价阳离子(例如镁离子或钙离子)、约0.05％的氨基酸源(例如酵母提取物或酸水解酪素)、约0.05％的白蛋白(例如BSA或者卵白蛋白)以及约1.5％的醇(例如乙醇、甲醇或者丙醇)。
根据本发明的各种不同实施方式，所述介质组合物可为固态或液态。可用琼脂、琼脂糖或其它固化剂形成固态组合物。
这里所描述的介质组合物可用消过毒的试剂制得。可选择地或附加地，可在制得所述介质组合物后再对其进行消毒。一旦组合物制备完成，细菌就可以悬浮于其中。
列出来的介质组合物的成分可通过多种途径从市场上获得。例如，NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、肌糖、乳糖、海藻糖、葡聚糖、甲醇、乙醇、丙醇、酵母提取物、BSA、卵白蛋白可从例如Sigma-Aldrich Co.公司(位于美国密苏里州圣路易斯市)购得。酸水解酪素可从例如Becton Dickinson and Co.公司(位于美国新泽西州富兰克林湖)购得。
如实施例1-13所述，本发明的介质组合物可用于建立在细菌发光基础上的毒性测试中。
因此，根据本发明的另一个方面，提供一种贮存细菌的方法。上面披露的和下面实施例中描述的介质可用于贮存自然发光细菌(例如鳆发光杆菌、费氏弧菌、哈维氏弧菌)和/或细菌表达外源基因(例如费式弧菌的大肠杆菌包藏发光系统)。选择性地，毒素敏感促进剂可用于调节发光基因。
在本发明的一些实施方式中，用与发光无关的生化性质作为化验的基础。
在本发明这一方面的一个实施方式中悬浮着细菌的冻干颗粒。选择性地，可将羊毛或棉纤维浸在细菌培养液中，冻干并保持相当长时间的贮存，直到悬浮在贮存溶液中。在本发明的一个实施方式中，细菌在纤维间的分散有助于再悬浮的缓解。选择性地，细菌培养物可沉淀(例如：通过离心过滤)并悬浮在前述的介质溶液中，以形成细菌悬液。
所述细菌悬液可贮存于-2～+8℃，可选择-1～+6℃，还可选择+2～+5℃，最优选约4℃，贮存至少2周，同时保持悬液的经选择的性质处于理想范围。在本发明的一个实施方式中，所述经选择的性质包括在使用发光细菌时，细菌悬液的发光度。选择性地，或者附加地，也可采用其它生化性质(例如颜色或者经选择的酶活性)。选择性地，所述介质维持所述悬液的所述经选择的性质处于理想范围达3、4或5周，或者中间或更长的时间段。
现在看附图，图1展示了贮存细菌的方法100。方法100包括：提供包括一价盐、糖、二价阳离子源、蛋白质混合物、白蛋白和醇的介质组合物(步骤110)。选择性地，所述介质组合物包括至少一种抗生素。选择性地，所述蛋白质混合物包括非蛋白成分，例如维生素和/或脂肪酸和/或血脂。
根据图中的方法，使细菌悬浮在介质组合物中、以形成细菌悬液(步骤120)。在本发明的一个实施方式中，细菌的冻干颗粒悬浮着。选择性地，可将羊毛或棉纤维浸在细菌培养液中，冻干并保持相当长时间的贮存，直到悬浮在介质组合物中。在本发明的一个实施方式中，细菌在纤维间的分散有助于再悬浮的缓解。选择性地，细菌培养物可沉淀(例如：通过离心过滤)并悬浮在介质组合物中，以形成细菌悬液。
接着可将所述细菌悬液贮存在-2～+8℃、优选-1～+6℃、更优选+2～+5℃、最优选约4℃至少2周，同时维持悬液的经选择的性质处于理想范围(步骤130)。在本发明的一个实施方式中，所述经选择的性质包括细菌悬液的发光度。选择性地，所述介质维持组合物所述悬液的所述经选择的性质处于理想范围达3、4或5周，或者中间或更长的时间段。
除非另有说明，否则在此使用的所有技术和科学术语均具有本领域普通技术人员通常理解的相同的涵义。虽然与本文述及的方法和材料类似或相同的方法和材料也可用于本发明的实践或测试中，但这里描述的是比较合适的方法和材料。当存在冲突时，专利说明书，包括定义，将控制冲突。此外，所述材料、方法和实施例均只是示例性的而不是限制性的。
措辞“基本由...组成”或者类似的表述在此用于说明述及的特征、等分试样、步骤或者成分，但并不排除附加一种或多种另外的特征、等分试样、步骤、成分或它们的集合，如果这些另外的特征、等分试样、步骤、成分或它们的集合不会实质性地改变本发明要求保护的组合物、设备或方法的基本的和新的特点的话。
术语“方法”是指为了完成给定的任务而采取的方式、手段、技术和程序，包括但不限于那些从微生物学和/或毒理学技术人员已知的方式、手段、技术和程序中知道的或者容易地发展出来的方式、手段、技术和程序。
除非另有说明，否则通常以粉末或晶体形式提供的化学品(例如盐、糖和蛋白质)的百分比(％)是指重量/体积比(weight per volume，W/V)。除非另有说明，否则通常以液体形式提供的化学品(例如醇)的百分比(％)是指体积/体积比(volume per volume，V/V)。
在这里，所谓“悬液的经选择的性质处于理想范围”是指例如可以通过重组增殖表现的可行性，所述重组增殖是在合适的生长条件、共培养、基因表达、生长/表达诱导(例如IPTG诱导)及报告基因活性(如发光)、理想的催化活性(如益生菌活性或矿物燃料水解)的孵化下进行的。
术语“包括”和“具有”及类似词在此是指“包括但不限于”。
在本发明的一些实施方式中，所述介质组合物被提供为制品的一部分。选择性地，所述介质被提供为无菌和/或计量单位。选择性地，每一计量单位位于单个容器中。
选择性地，所述介质具有用于使细菌悬浮于其中以形成细菌悬液的导向，所述细菌悬液的经选择的性质一段时间内被维持在-2～+8℃的理想范围，所述一段时间为至少2-5周。在本发明的一个实施方式中，所述经选择的性质包括发光度。
在本发明的另一实施方式中，所述介质具有悬浮于其中的细菌，并被提供为带标签的冷藏制品，所述标签标示了一段时间内、-2～+8℃温度下、维持悬液的经选择的性质处于在理想范围内的办法，所述一段时间为至少2-5周。在本发明的一个实施方式中，所述经选择的性质包括发光度。
在本发明的一个实施方式中，每一计量单位被装在一个容器中提供，所述容器被配置为可附加到自动毒性试验仪器上。选择性地，计量单位可供应特定数量的试验。通常，一次毒性试验使用10-50μl的细菌悬液(如：处于1-5ml反应体积中)，因此，1ml悬液足够20-100次试验使用。假设每次试验持续15-60分钟，那么50ml计量单位足够供应10-50天的试验使用。在本发明的一个实施方式中，提供有50、100、150、200、250、300或400ml(或者中间体积)的计量单位，且给单个仪器内的多个测试室提供等分的细菌悬液。
选择性地，可将多个计量单位提供给单个仪器并按顺序使用。在本发明的一个实施方式中，按顺序使用的2个或2个以上计量单位有助于在自动化仪器2次维修之间的时间段内使用。
预计在本专利的专利权期限内，细菌毒物的许多有关影响将被开发出来，术语“试验/测试/化验”的范围将先验性地包括所有这些新技术。
在此，术语“约”是指±5％或±10％。
对本领域技术人员而言，本发明的另外的目的、优点和新特征将随着下面的非限制性实施例的描述而变得清晰。此外，上面描述的以及权利要求书中要求保护的本发明的各个实施方式和方面中的每一个均能在下面的实施例中找到实验支持。
实施例
下面参考实施例，这些实施例与上面的描述一起，以非限制性的方式，展示了本发明。
实施例1
通用滴定程序
为了确定适合用于发光细菌(例如鳆发光杆菌、费氏弧菌、哈维氏弧菌)悬液的长期介质的贮存条件，需要就不同浓度的一价盐、糖、二甲阳离子源、蛋白质混合物、白蛋白和醇进行测试。
NaCl被选择为代表性的一价盐，因为在细菌培养介质中常常使用它。相信也可使用类似浓度的其它一价盐，这些一价盐包括但不限于KCl。
镁离子被选择为代表性的二价阳离子，因为在细菌培养介质中常常使用它。在这里描述的实验中，镁离子以MgCl2的形式添加。也可以使用类似浓度的其它的二价阳离子，包括但不限于钙离子。
由于设想大量介质的商业生产，因此对于每种成分均选择市场上有售的产品。
乙醇被选择为代表性的醇，虽然也可以使用其它的醇(如甲醇或丙醇)。
酵母提取物被选择为代表性的蛋白质混合物，虽然也可以使用其它的蛋白质混合物(如酸水解酪素)。
肌糖被选择为代表性的糖，虽然也可以使用其它糖(如乳糖、海藻糖和葡聚糖)。选择性地，可根据要悬浮和贮存在溶液中的细菌的特定类型来选择糖。
牛血清白蛋白(BSA)被选择为代表性的白蛋白，虽然也可以使用其它的白蛋白(如卵白蛋白)。
下表1概括了介质成分和试验检测范围。
表1：滴定范围概要
  成分类型   采用的成分示例   滴定范围   在滴定其它成分时的用量
  一价盐   NaCl   NaCl 0.1-4.5％   2％
  糖   肌糖   0-11％；   5％
  二价阳离子源   氯化镁   0-1M   2mM
  蛋白质混合物   酵母提取物   0-0.2％   0.05％
  白蛋白   BSA   0-3％   0.05％
  醇   乙醇   0-5％   1.5％
介质的pH值也被滴定在pH 5.5-8范围内。
单独检测每种介质成分(包括pH值)，同时保持所有其它成分为表1所示的不变浓度。在滴定其它成分时，将pH值保持在7.2不变。处于每一测试浓度(或pH值)的每种成分对细菌发光的影响在为期数周的一段时间后确定。
为了进行介质成分的滴定，在生长一夜之后，将细菌培养物涂覆在平板(LA plate)上，每板约300菌落。从具有ASW(artificial seawater，人工海水)的平板上收集菌落并进行离心分离(10000g，10分钟，4℃)。将获得的细菌再次悬浮在不同的溶液中，以形成实验用细菌悬液。
将实验用细菌悬液贮存在-2～+4℃。
每周都将每个实验用细菌悬液的等分试样倒入人工海水(ASW：含有0.5M的NaCl、50mM的MgSO4.7H2O、10mM的CaCl2.2H2O、10mM的KCl)中稀释，所述人工海水中补充有50ppm的酵母提取物/葡萄糖，且在26-28℃温度下培养。30分钟后记录发光度。
每种成分的滴定结果列示在下文中。用冻干细菌颗粒来制备实验用悬液也获得了类似的结果(数据未列出)。
实施例2
BSA滴定结果
为了确定在冷藏温度下的长期贮存过程中白蛋白对发光的影响，将BSA添加到介质中，BSA的浓度分别为0.02、0.1、0.4、0.5、1和3％。将不含BSA的介质作为阴性对照组。BSA的影响试验如实施例1所述。
图2概要展示了发光度(相对光单位)随时间(天)变化的实验结果。结果表明，0.5-1％的BSA比其它测试浓度更好地减缓了发光的衰减。当所有其它成分都经过优化时，选择0.05％的BSA浓度。
实施例3
乙醇滴定结果
为了确定在冷藏温度下的长期贮存过程中醇对发光的影响，将乙醇添加到介质中，乙醇的浓度分别为0.1、1、1.5、3、3.5和5％。将不含乙醇的介质作为阴性对照组。乙醇的影响试验如实施例1所述。
图3概要展示了发光度(相对光单位)随时间(天)变化的实验结果。结果表明，1.5％或1.5％以上的乙醇比1.5％以下的测试浓度更好地减缓了发光的衰减。
实施例4
肌糖滴定结果
为了确定在冷藏温度下的长期贮存过程中糖对发光的影响，将肌糖添加到介质中，肌糖的浓度分别为0.5、5、7和11％。将不含肌糖的介质作为阴性对照组。肌糖的影响试验如实施例1所述。
图4概要展示了发光度(相对光单位)随时间(天)变化的实验结果。结果表明，5％的肌糖比其它测试浓度更好地减缓了发光的衰减。7％的肌糖在28-50天时具有相似的效果，但是在更短的时间内效力不如5％的肌糖。
实施例5
镁离子滴定结果
为了确定在冷藏温度下的长期贮存过程中二价阳离子对发光的影响，将镁离子(MgCl2)添加到介质中，镁离子的浓度分别为1、50、200、300、600和1000mM。将不含镁离子的介质作为阴性对照组。镁离子的影响试验如实施例1所述。
图5概要展示了发光度(相对光单位)随时间(天)变化的实验结果。结果表明，200mM的镁离子比其它测试浓度更好地减缓了发光的衰减。300mM的镁离子在0-14天时最有效，但是在第28天时却比对照溶液发光更弱。当所有其它成分都经过优化时，选择2mM的镁离子浓度。
实施例6
NaCl滴定结果
为了确定在冷藏温度下的长期贮存过程中一价盐对发光的影响，将NaCl添加到介质中，NaCl的浓度分别为0.1、0.5、2.0、3.0和4.5％。没有设置阴性对照组，因为很低浓度的NaCl会杀死细菌。NaCl的影响试验如实施例1所述。
图6概要展示了发光度(相对光单位)随时间(天)变化的实验结果。结果表明，2-3％的NaCl比其它测试浓度更好地减缓了发光的衰减。2％的NaCl在0-14天时最有效，但是3％的NaCl在第28天后最有效。这两个浓度在14-28天时间段内得到相似的结果。
实施例7
pH值滴定结果
为了确定在冷藏温度下的长期贮存过程中pH值对发光的影响，测试了pH值为5.5、6.0、6.5、7.2、7.5和8.0的贮存溶液。pH值的影响试验如实施例1所述。
图7概要展示了发光度(相对光单位)随时间(天)变化的实验结果。结果表明，7.2-7.5％的pH值比其它pH值更好地减缓了发光的衰减。7.2的pH值直到第28天都最有效，但28天以后，7.5的pH值最有效。
令人惊讶的是，6.0的pH值直到第14天为止提供了最高的发光度，之后发光度快速下降。
实施例8
酵母提取物滴定结果
为了确定在冷藏温度下的长期贮存过程中蛋白质混合物对发光的影响，测试了含有浓度为0.01、0.05和0.2％的酵母提取物的贮存溶液。将没有添加酵母提取物的介质作为阴性对照组。酵母提取物的影响试验如实施例1所述。
图8概要展示了发光度(相对光单位)随时间(天)变化的实验结果。结果表明，0.01％的酵母提取物比其它测试浓度更好地减缓了发光的衰减。当所有其它成分都经过优化时，选择0.05％的酵母提取物浓度。
实施例9
不同抗生素的影响
为了确定在冷藏温度下的长期贮存过程中不同抗生素对发光的影响，测试了分别含有浓度为15mg/L的氨苄青霉素、氯霉素、新霉素和卡那霉素的贮存溶液。将没有添加抗生素的介质作为阴性对照组。另外还测试了含有所有四种抗生素的介质(每种抗生素的浓度为15mg/L)。抗生素的影响试验如实施例1所述。
图9概要展示了发光度(相对光单位)随时间(天)变化的实验结果。结果表明，氨苄青霉素和氯霉素比其它被测试的抗生素更好地减缓了发光的衰减。
实施例10
示范性介质和示范性成分的范围
表2列出了示范性介质的组成和基于实施例2-9中实验结果的示范性范围。
表2：根据本发明各个实施方式的细菌介质的示范性组成和所述介质的示范性成分的示范性范围
  成分   方案   范围I   范围II
  NaCl(％)   2.0   2.0-3.0   1.0-3.0
  肌糖(％)   5.0   5.0-7.0   0.5-7.0
  Mg(mM)   2.0   1.0-200   0.0-300
  酵母提取物(％)   0.05   0.01-0.05   0.01-0.05
  BSA(％)   0.05   0.62-1.0   0.02-1.0
  乙醇(％)   1.5   1.0-3.5   0.1-3.5
“方案”一栏表示当综合考虑所有滴定结果时，用于介质的示范性浓度。
“范围I”一栏表示与指定成分的阴性对照组相比提供了显著进步的浓度范围。
“范围II”一栏表示相对于指定成分的阴性对照组没有产生负面影响的浓度范围。
在有些情形下，将溶液中镁离子的浓度降低至0.0mM比较好。
实施例11
通用滴定程序
在待测样品与细菌接触之后，在测量细菌发光度偏离基线的变化的基础上进行毒性物质的存在测试。因此，可以使用一种悬液，该悬液不含随着时间推移其密度不变的活细胞。但最初的基线必须足够高，从而使得变化能被测量出来。
为了确定整个实验期间的细胞密度，连续稀释的来自表2所示示范性介质的细菌悬液被镀出，计算菌落的数量，从而确定细菌悬液中活细胞的密度。结果列示在下表3中。
表3：随时间变化的活细胞密度
  第1天   第7天   第14天   第21天   第28天   第35天
  细胞/mL   3×108   1.5×108   1.85×108   7.7×107   2.5×107   1×106
表3中的结果表明，在第一个7天中，活细胞(鳆发光杆菌、大肠杆菌)的浓度降低了约50％，然后保持相对稳定，直到第21天，到第28天总共下降一个数量级，到第35天总共下降2个数量级。表3显示了对每个菌株进行3次重复实验所获得的平均数。
表3中的结果表明，至少在28-35天时还能获得用于毒性分析的足够的发光。
实施例12
随时间变化的灵敏度
为了确定贮存在根据本发明一个实施方式的溶液中的细菌悬液在多长时间内能够用于进行毒性测试，随着时间的推移重复进行毒性测试(实验仪器为以色列Qiryat Tivon市CheckLight Ltd公司生产的ToxScreen-II)。
在测试过程中，在30天内的4个时间点处，从介质中的细菌悬液(鳆发光杆菌)中取出0.01mL的等分试样，并用矿泉水稀释的缓冲液中的化学毒物培养所述等分试样。30分钟后、27℃时确定发光度。
表4：鳆发光杆菌对各种毒物的灵敏度(mg/L)
  第1天   第7天   第18天   第30天
  PbCl2   2   2.5   3   2.5
  CdCl2   0.2   0.25   0.3   0.4
  DDT   0.007   0.006   0.004   0.006
  K2Cr2O7   0.5   0.7   0.5   0.6
表4中的结果表明，实施例11所述活细胞数量的下降不会干扰作为毒性测试基质的被贮存细菌悬液的有用性。在表4概括的实验中，每种被测毒物的测试结果随着时间的推移是稳定的，存在这种生物测定所期望的偏离。
实施例13
利用转基因细菌
为了证明根据本发明实施方式的贮存溶液在发光(发光是基因操作的结果)细菌中的效用，对费式弧菌的大肠杆菌包藏发光系统进行实施例6所述的NaCl浓度滴定(数据没有列出)。测出0.8-0.85％的盐浓度可用于这些细菌中。
采用多种数值指标来描述仪器的各组成部分和/或仪器与水源之间的关系。应当理解：即使进一步根据结合到本发明中的多种工程原则、材料、用途和设计来说，这些数值指标也是可以变化的。此外，属于本发明的实施方式并被描述为单个单元的组成部分和/或动作可以分成若干子单元。相反地，属于本发明的实施方式并被描述为子单元的组成部分和/或动作也可结合成具有描述/描写的功能的单个单元。
选择性地，或者附加地，用于描述方法的特征可用来刻画仪器，且用于描述仪器的特征也可用来刻画方法。
还应当理解，上面描述的各个特征可被结合到所有可能的组合和子组合中，以形成本发明的示范性实施方式。上面的实施例在本质上是示范性的，不用于限制本发明的范围，本发明的范围只由权利要求确定。特别地，本发明只描述了水系统的情况，但是本发明也可用于其它流体的分析。
所有本说明书中提及的出版物、专利和专利申请均以整体被本说明书所引用。此外，本申请中对参考文件的引用或鉴定不得被解释为承认本发明是现有技术。

Claims (17)

1.一种介质组合物，该组合物包括约：1.0-3.0％的NaCl/KCl、0.5-7.0％的肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖、0.0-300mM的Mg/Ca、0.01-0.05％的酵母提取物/酸水解酪素、0.02-1.0％的牛血清白蛋白/卵白蛋白和0.1-3.5％的乙醇/甲醇/丙醇。
2.根据权利要求1所述的介质组合物，其特征在于，包括约：2.0-3.0％的NaCl/KCl、5.0-7.0％的肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖、1.0-200mM的Mg/Ca、0.01-0.05％的酵母提取物/酸水解酪素、0.02-0.1％的牛血清白蛋白/卵白蛋白和1.0-3.5％的乙醇/甲醇/丙醇。
3.根据权利要求2所述的介质组合物，其特征在于，包括约：2.0％的NaCl/KCl、5.0％的肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖、2.0mM的Mg/Ca、0.05％的酵母提取物/酸水解酪素、0.05％的牛血清白蛋白/卵白蛋白和1.5％的乙醇/甲醇/丙醇。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的介质组合物，其特征在于：包括抗生素。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的介质组合物，其特征在于：所述介质组合物为液体。
6.一种细菌悬液，其特征在于：包括权利要求1-3所述的介质组合物和悬浮于所述介质组合物之中的细菌。
7.根据权利要求6所述的细菌悬液，其特征在于：所述细菌包括发光细菌。
8.制备根据权利要求6或7所述的细菌悬液的方法，该方法包括：
将具有细菌培养的纤维润湿，以形成湿纤维；
将湿纤维冻干，以形成塞子；和
将塞子浸入介质组合物中，以形成细菌悬液。
9.贮存细菌的方法，该方法包括：
(a)使细菌悬浮在权利要求1-3中任一项所述的介质组合物中，以便形成细菌悬液；和
(b)将所述细菌悬液贮存在用于维持细菌存活并防止细菌扩张的条件下。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤(a)包括将纤维上的冻干细菌浸入所述介质组合物中。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述细菌包括发光细菌。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述维持细菌存活并防止细菌扩张的条件在2-8℃保持至少2周。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述介质组合物包括至少一种抗生素。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述至少一种抗生素包括选自氯霉素和氨苄青霉素的至少一种化合物。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述至少一种抗生素的浓度约为15mg/L。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述条件还包括维持所述发光细菌的发光。
17.一种制品，包括：
(a)根据权利要求1-3任一项所述的介质组合物；和
(b)用于将细菌悬浮在所述介质组合物中以形成细菌悬液和将细菌贮存在-2～+8℃的说明书。
CN2008801093735A 2007-09-25 2008-09-18 用于细菌悬液的贮存的组合物和方法 Expired - Fee Related CN101874105B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US96031207P 2007-09-25 2007-09-25
US60/960,312 2007-09-25
PCT/IL2008/001254 WO2009040793A1 (en) 2007-09-25 2008-09-18 Compositions and methods for storage of bacterial suspensions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101874105A CN101874105A (zh) 2010-10-27
CN101874105B true CN101874105B (zh) 2012-07-18

Family

ID=40090307

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008801093735A Expired - Fee Related CN101874105B (zh) 2007-09-25 2008-09-18 用于细菌悬液的贮存的组合物和方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20100190237A1 (zh)
EP (1) EP2193192A1 (zh)
CN (1) CN101874105B (zh)
WO (1) WO2009040793A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533555B (zh) * 2010-12-23 2015-11-18 王一鸿 接种物及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1455243A (zh) * 2002-04-29 2003-11-12 拜尔公司 检测生物活性物质的方法和装置
WO2007037301A1 (ja) * 2005-09-29 2007-04-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 有用物質の製造法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62166885A (ja) * 1986-01-21 1987-07-23 Fuji Yakuhin Kogyo Kk 微生物によるプロテア−ゼの製造方法
US5770208A (en) * 1996-09-11 1998-06-23 Nabi Staphylococcus aureus B-linked hexosamine antigen

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1455243A (zh) * 2002-04-29 2003-11-12 拜尔公司 检测生物活性物质的方法和装置
WO2007037301A1 (ja) * 2005-09-29 2007-04-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 有用物質の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009040793A1 (en) 2009-04-02
US20100190237A1 (en) 2010-07-29
EP2193192A1 (en) 2010-06-09
CN101874105A (zh) 2010-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hayden et al. The extracytoplasmic stress factor, σE, is required to maintain cell envelope integrity in Escherichia coli
Sørensen et al. Soil and rhizosphere as habitats for Pseudomonas inoculants: new knowledge on distribution, activity and physiological state derived from micro-scale and single-cell studies
Pompermayer et al. The influence of temperature on the adhesion of mixed cultures of Staphylococcus aureus and Escherichia coli to polypropylene
Reichenbach et al. The myxobacteria
EP2918672B1 (en) Method for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial substances
Coquet et al. Resistance of artificial biofilms of Pseudomonas aeruginosa to imipenem and tobramycin.
Noirot-Gros et al. Functional imaging of microbial interactions with tree roots using a microfluidics setup
Hibbing et al. Inhibition and dispersal of Agrobacterium tumefaciens biofilms by a small diffusible Pseudomonas aeruginosa exoproduct (s)
Munna et al. Influence of aeration speed on bacterial colony forming unit (CFU) formation capacity
Morton et al. Phenotypic analyses of Agrobacterium
JPH04507191A (ja) 薄膜上の細胞の培養方法
CN101874105B (zh) 用于细菌悬液的贮存的组合物和方法
Sandhu et al. Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 displays plasticity in the attachment phenotype when grown in different soybean root exudate compounds
JP5493387B2 (ja) 選択培地の製造方法及びその利用
Dutta et al. High-throughput identification of genes influencing the competitive ability to obtain nutrients and performance of biocontrol in Pseudomonas putida JBC17
US20070275451A1 (en) Devices and methods for the selective isolation of microorganisms
Guo et al. Magnesium modulates Bacillus subtilis cell division frequency
US20180274005A1 (en) Cord blood therapy to treat chronic disease caused by l-form bacteria
CN108676738A (zh) 一株产碱性蛋白酶嗜盐菌及其应用
Magbojos et al. Preparation of the blood-enriched agar with the use of red cell suspension
Vaksman et al. Myxococcus xanthus growth, development, and isolation
Day et al. Cultivation of algae and protozoa
IL194085A (en) Devices and methods for isolating and cultivating microorganisms
Wahyuni et al. Isolation and characterization of amylase-producing microbes from the digestive tract of tilapia
Mukriani et al. Production and characterization of L-Asparaginase enzyme from symbiont bacteria of red algae Eucheuma spinosum

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120718

Termination date: 20140918

EXPY Termination of patent right or utility model