WO2007037301A1 - 有用物質の製造法 - Google Patents

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WO2007037301A1
WO2007037301A1 PCT/JP2006/319244 JP2006319244W WO2007037301A1 WO 2007037301 A1 WO2007037301 A1 WO 2007037301A1 JP 2006319244 W JP2006319244 W JP 2006319244W WO 2007037301 A1 WO2007037301 A1 WO 2007037301A1
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dna
culture
useful substance
seq
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PCT/JP2006/319244
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Kiyotaka Hara
Makiko Kato
Hideo Mori
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing useful substances using microorganisms.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 There have been many reports on the production of useful substances using the ATP supply activity of microorganisms (Non-Patent Documents 1 to 4). However, in these reports, detailed investigations have been conducted on enzymes that produce useful substances using ATP, but detailed analysis has not been conducted on the complex enzyme activity or cell activity that supplies ATP. Absent. The above report only describes that ATP is supplied using the energy obtained by catabolism of glucose, and the complex enzyme system involved in ATP supply has been fully analyzed. Absent.
  • Non-patent Document 5 the entire nucleotide sequence of chromosomal DNA has been clarified.
  • Non-patent Document 6 there is a known method for deleting a specific gene or chromosomal DNA region on a chromosomal DNA of a microorganism as intended using a homologous recombination technique.
  • Non-Patent Document 9 A mutant strain of Escherichia coli in which the ⁇ gene is disrupted can be obtained from Nara Institute of Science and Technology (Non-patent Document 10). However, it is not known that microorganisms lacking the nlED gene are useful in the production of useful substances.
  • Non-patent literature l Appl. Microbiol. Biotechnol. (Applied Microbiology and Biotechnology), 48, 693 (1997)
  • Non-patent literature 2 Biosci. Biotechnol. Biochem. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry), 61, 960 (1997)
  • Non-Patent Document 3 Nature Biotechnol., 16, 847 (1998)
  • Non-Patent Document 4 J. Appl. Biochem. (Journal of Applied Biochemistry), 5, 43 (1983)
  • Non-Patent Document 6 J. Bacteriol., 180, 2063 (1998)
  • Non-Patent Document 7 J. Biochem. Mol. Biol., J. Nanochem Biochemistry and Molecular Technology, 37 , 83 (2004)
  • Non-Patent Document 8 Nature Biotechnol. (Nichiya Biotechnology), 20, 1018 (2002)
  • Non-Patent Document 9 J. Bacteriol. (Journal of Battereriology), 176, 1630 (1994) Special Reference 10: http: / ⁇ ecoli.aist—nara.ac.jp/uB5/search.jsp
  • An object of the present invention is to provide an efficient production method of a useful substance using ATP as an energy source.
  • the present invention relates to the following (1) to (7).
  • microorganism or cell is a microorganism whose ability to produce useful substances is enhanced by a method selected from the following [1] to [5] Manufacturing method.
  • Microbial power Azotobacter genus, Erwinia genus, Escherichia. Klebsiella genus, Methylobacillu S genus, Pseudomonas genus, or Salmonella genus, any one of the above (1) to (4) production method .
  • the useful substance is a useful substance selected from the group consisting of proteins, peptides, amino acids, nucleic acids, vitamins, sugars, sugar alcohols, alcohols, organic acids, physiologically active low molecular weight compounds, and lipids. (6) One of the manufacturing methods.
  • useful substances produced using ATP as an energy source can be efficiently produced.
  • the microorganism used in the production method of the present invention includes a gene encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 on the chromosomal DNA (hereinafter also referred to as NlpD protein), or the amino acid represented by SEQ ID NO: 1.
  • NlpD protein chromosomal DNA
  • a gene includes a structural gene and a region having a specific control function such as a promoter and an operator.
  • a part or all of a gene encoding an NlpD protein or a gene encoding an NlpD homolog protein (hereinafter referred to as a gene or a homologous gene thereof) is a base of the gene on chromosomal DNA.
  • the microorganism (3) can be mentioned.
  • the microorganism of the above (3) is a microorganism that does not express an active protein because a part or all of the structural gene is deleted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. I can give you. If the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 loses its activity, the partial deletion is a deletion of one base in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. However, it is preferable to delete 5 to: L00 bases in the structural gene, more preferably 10 to 100 bases in the gene, and still more preferably 50 to 100 bases in the gene.
  • the microorganism used in the production method of the present invention is any microorganism as long as it is a microorganism lacking a part or all of the M £ ⁇ gene or its homologous gene on the chromosomal DNA as described above.
  • it can be a prokaryotic organism, more preferably a bacterium.
  • a fine cattle belonging to the genus Azotobacter, Erwinia, Escherichia.Klebsiella, Methvlopacill, Pseudomonas, or Salmonella more preferably Azotobat er vinelandiu Erwinia carotovora.
  • Examples include Pseudomonas fluorescens. Pseudomonas putida and salmonella thvDimurium, and more preferably E. soli. 2. Preparation of microorganisms used in the production method of the present invention
  • the microorganism used in the production method of the present invention is (1) a method in which a part or all of the ⁇ gene or its homologous gene present on the chromosomal DNA of a microorganism capable of producing useful substances is deleted, or ( 2) It can be prepared by a method that imparts the productivity of useful substances to microorganisms that are deficient in part or all of the gene on the chromosomal DNA or its homologous gene.
  • the microorganism having the ability to produce a useful substance may be any microorganism as long as it has the ability to produce one or more useful substances.
  • the strain itself, microorganisms and the like that have been artificially imparted with the ability to produce the desired useful substance by known methods can be mentioned.
  • the known method (a) a method of mitigating or canceling at least one of the mechanisms controlling the biosynthesis of useful substances,
  • a microorganism capable of producing one or more amino acids can be prepared.
  • Microorganisms lacking the ⁇ gene or its homologous gene on the chromosomal DNA are not limited as long as the microorganism can be obtained.
  • the base of the ⁇ gene or its homologous gene on the chromosomal DNA of the microorganism It can be obtained by a method of introducing a deletion.
  • the base sequence of the homologous gene of the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ gene is the Southern Nobleridase for the chromosomal DNA of various microorganisms, using as a probe all or part of the structural gene in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the homologous gene of the H! ED gene was identified and obtained by Chillon, or the primer DNA designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 was used, and the gene was obtained by PCR using the chromosomal DNA of various microorganisms in a saddle shape. After the homologous gene is identified and obtained, it can be determined by analyzing the base sequence of the gene by a conventional method.
  • the chromosomal DNA subjected to Southern hybridization and PCR may be any chromosomal DNA, preferably Azotobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Methvlobacillusfe, Pseudomonasfe.
  • 3 ⁇ 4k organisms belonging to the genus aalmonella more preferred ⁇ Azotobater vinelandu, Erwinia carotovora, Escherichia coli, Kle bsiella pneumoniae ⁇ Methvlobacillus flagellatus ⁇ Pseudomonas fluorescens, Pseudom Chromosomal DNAs such as onas putida and Salmonella thvpimurium can be mentioned.
  • “noid hybridization” means that DNA having a specific base sequence or a part of the DNA contains DNA. It is to hybridize.
  • the DNA having the specific nucleotide sequence or a part thereof can be used as a probe for Northern or Southern blot analysis, or can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis.
  • DNA used as a probe include DNA of at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more, and DNA used as a primer is at least 10 bases or more. A DNA having 15 bases or more is preferable.
  • Hybridization is preferably performed under stringent conditions! /.
  • the stringent conditions are: DNA-immobilized filter and probe DNA are 50% formamide, 5 X SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6). , 5 X Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 g / 1 denatured salmon sperm DNA at 42 ° C and incubated, for example, 0.2 X SSC at about 65 ° C Conditions that wash the filter in solution are preferred, but lower stringent conditions can also be used.
  • Stringent conditions can be changed by adjusting the concentration of formamide (the lower the formamide concentration, the lower the stringent), and changing the salt concentration and temperature conditions.
  • Low stringency conditions include, for example, 6 X SSCE (20 X SSCE is 3 mol / l sodium chloride, 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4), 0.5% Incubate at 37 ° C in a solution containing SDS, 30% formamide, 100 ⁇ g / 1 denatured salmon sperm DNA, and then use 1 X SSC, 0.1% SDS solution at 50 ° C. Conditions for cleaning can be raised. And even lower stringent Examples of the conditions include conditions for washing after performing hybridization using a solution having a high salt concentration (for example, 5 ⁇ SSC) under the low stringent conditions described above.
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used to suppress the background of the hybridization experiment.
  • the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by changes in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • the DNA that can be hybridized under the stringent conditions described above is, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 when calculated based on the above-described parameters using BLAST, FASTA, etc. And at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • H! ED gene homologues include n Diwfe from Azotobater vinelandii: ⁇ S ⁇ IJ (Genbank accession no.AF421351), nbD from Erwinia carotov ora Shionogi II (Genbank accession no.BX950851), base sequence of nlpD.
  • Examples of a method for introducing a base deletion into a gene on the chromosomal DNA of a microorganism include a method using homologous recombination.
  • a method using homologous recombination a mutant gene introduced with a base deletion cannot replicate autonomously in the host cell into which the deletion is introduced!
  • Examples thereof include a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligation with plasmid DNA.
  • a transformant in which the plasmid for homologous recombination is incorporated into chromosomal DNA by homologous recombination using drug resistance as an indicator select is applied to the drug-containing agar medium and the drug-free agar medium, By selecting a strain that does not grow on the former medium but can grow on the latter medium, a strain that has undergone the second homologous recombination on chromosome DNA can be obtained. By determining the base sequence of the region where the gene into which the deletion on the chromosomal DNA is introduced exists, the chromosome
  • microorganisms capable of introducing a base deletion into a target gene on chromosomal DNA by the above method include microorganisms belonging to the genus Escherichia. Further, as a method using homologous recombination that efficiently introduces a base deletion into a plurality of genes, a method using linear DNA can be mentioned.
  • linear DNA containing regions existing on both sides of the region on the chromosomal DNA to be introduced into the base deletion is taken into the cell, and the chromosomal DNA is introduced into the introduced linear DNA.
  • This is a method of causing homologous recombination between the two.
  • This method can be applied to any microorganism as long as it efficiently incorporates linear DNA.
  • Preferred microorganisms include the genus Escherichia, more preferably Escherichia coli, and still more preferably phage-derived recombinant proteins ( Escherichia coli expressing Red recombinant system) can be mentioned.
  • pKD46 available from the Escherichia coligenetic stock center (Yale University, USA)
  • Escherichia coli JM101 stock examples include Escherichia coli JM101 stock.
  • any drug resistance gene can be used as long as it is a drug resistance gene that imparts drug resistance to a drug to which the host microorganism is sensitive.
  • examples of drug resistance genes include kanamycin resistance gene, chloramphee-chol resistance gene, gentamicin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene and ampicillin resistance gene. Etc.
  • a gene that can be used for negative selection refers to a gene that is lethal to the microorganism under certain culture conditions when the gene is expressed in a host microorganism.
  • a ⁇ gene derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus Appl. Environ. Microbiol, 59, 1361-1366 (1993)]
  • a gene derived from a microorganism belonging to the genus Escherichia [Genomics, 72, 99-104 (2001)].
  • the DNA located at both ends of the above linear DNA and located outside both ends of the region to be introduced with the base deletion on the chromosomal DNA and the DNA having homology and homology with the DNA are:
  • the linear DNA is arranged in the same direction as that on the chromosomal DNA, and its length is preferably about 10 to 100 bp, more preferably about 20 to 50 bp, and more preferably about 30 to 40 bp.
  • the nucleotide sequence recognized by Flp recombinase derived from yeast is not particularly limited as long as it is recognized by the protein and catalyzes homologous recombination, but is preferably a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3. And a DNA having a base sequence in which one to several bases are deleted, substituted or added in the DNA, and having a base sequence that is recognized by yeast-derived Hp recombinase and catalyzes homologous recombination be able to.
  • the term "having homology” means that the linear DNA has homology to such an extent that homologous recombination occurs in a target region on the chromosomal DNA. 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 100%.
  • the homology of the base sequence can be determined using a program such as BLAST or FASTA.
  • the linear DNA can be prepared by PCR.
  • the target linear DNA can be obtained by treatment with a restriction enzyme.
  • Examples of methods for introducing base deletion, substitution or addition into chromosomal DNA of microorganisms include the following methods 1 to 4.
  • Method 1 Introduce the linear DNA (a) or (d) above into the host microorganism, and select a transformant in which the linear DNA is inserted into the chromosomal DNA by homologous recombination using drug resistance as an index. Method.
  • Method 2 By introducing the linear DNA of (b) above into the transformed strain obtained by Method 1 above and deleting the drug gene inserted into the chromosomal DNA by the method, A method of substituting or deleting a region of.
  • the linear DNA of (c) above is introduced into a host microorganism, and a transformant in which the linear DNA is inserted into chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.
  • DNA that is homologous to DNA and ligated in the same direction as that on the chromosomal DNA is synthesized and introduced into the transformant obtained in [1] above.
  • the linear DNA of (d) above is introduced into a host microorganism, and a transformant in which the linear DNA is inserted into chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.
  • any method can be used as long as it introduces DNA into the microorganism.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]
  • protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-2483942
  • electo mouth position method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)], etc. I can give you.
  • the above methods 2 to 4 are methods that do not leave a foreign gene such as a drug resistance gene and a gene that can be used for negative selection on the chromosomal DNA of the finally obtained transformant, use this method.
  • the bases can be easily added to two or more regions having different positions on the chromosomal DNA. Microorganisms with deletions, substitutions or additions can be produced.
  • the useful substance produced by the production method of the present invention is industrially useful, which requires ATP directly or indirectly in its biosynthesis when produced using ATP and the metabolic capacity of microorganisms or cells.
  • examples of such substances are preferably proteins, peptides, amino acids, nucleic acids, vitamins, sugars, sugar alcohols, alcohols, organic acids, bioactive low molecular weight compounds and lipids.
  • More preferable proteins include inosine kinase, Glutamate 5-kinase (EC 2.7.2.11), Glutamate-5- semialdehyde dehydrogenase (E 1.2.1.41), Pyrroline-5-carboxylate reduc tase ( EC 1.5.1.2), y-glutamylcystine synthase (EC 6.3.2.2), glutathione synthetase (EC 6.3.2.3), human granulocyte colony-stimulating factor, xylose reductase, P450
  • the peptide can include dartathione, and the amino acids include L-alanin, glycine, L-glutamine, L-glutamic acid, L-asparagine, L-aspartic acid, L-lysine, L-methionine, L —Threonine, L Leucine, L-Norine, L—Isoleucine, L—Proline, L—Histidine, L—Arginine
  • Nucleic acids can include inosine, guanosine, inosinic acid, guaric acid and the like, and vitamins include riboflavin, thiamine, ascorbic acid and the like.
  • the sugar can be xylose
  • examples of the sugar alcohol include xylitol
  • examples of the alcohol include ethanol
  • examples of the organic acid include lactic acid and succinic acid
  • examples of the bioactive low molecular weight compound include dartathione.
  • Examples of lipids include EPA (eicosapentaenoic acid) and DHA (docosahexaenoic acid).
  • a method for producing a useful substance of the present invention 1) a method of culturing the microorganism of the above 2 in a medium, producing and accumulating the useful substance in the culture, and collecting the useful substance from the culture, and 2) Microorganism culture or treatment product of 2 above, enzyme having activity to produce useful substance using ATP as energy source, culture of cell having this activity or treatment product of culture, carbon A source and a precursor of the useful substance can coexist in the medium, and a useful substance can be generated and accumulated in the medium, and the useful substance can be collected from the medium.
  • the microorganism can be cultured in a medium according to the usual method used for culturing microorganisms.
  • the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the microorganism, and the microorganism can be cultured efficiently, the! Can be used.
  • carbon source carbon, glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch, starch hydrolyzate, etc. are acceptable as long as the microorganism can assimilate. Hydrates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphates, and other inorganic or organic acid ammonium salts. Nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, and digested products thereof can be used. .
  • inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. may be used. it can.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C.
  • the culture time is usually 5-7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline should be added to the medium.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • a microorganism transformed with an expression vector using the k £ promoter a microorganism transformed with an expression vector using isopropyl 1 ⁇ -D-thiogalatatopyranoside or the like with an im promoter is used.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • the collection of useful substances produced and accumulated in the culture can be performed by a conventional method using activated carbon, ion-exchange resin, or the like, or extraction with an organic solvent, crystallization, thin-layer chromatography, high-speed liquid chromatography Etc.
  • the culture of the above two microorganisms used in the above method 2) can be obtained by culturing the above two microorganisms by the above-described culture method (1).
  • the treated product of the microorganism culture is not particularly limited as long as the treated product has an activity to produce ATP.
  • the concentrate of the culture, the dried product of the culture, and the frozen product of the culture can be used.
  • Freeze-dried product treated product obtained by lowering the osmotic pressure of the culture, cells obtained by centrifuging the culture, dried product of the cells, freeze-dried product of the cells, interface of the cells
  • a treated product that retains the shape of the cell such as an activator-treated product, an enzyme-treated product of the microbial cell, a solvent-treated product of the microbial cell, and an immobilized product of the cell, and has substantially the same activity as the culture;
  • a sonication product of the microbial cell, a crude enzyme extract such as a mechanically ground product of the microbial cell, and the like can be given.
  • the medium water, an aqueous medium or an organic solvent, or a mixed liquid of water or an aqueous medium and an organic solvent is used.
  • a buffer such as a phosphate buffer, a HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid) buffer, or a tris [tris (hydroxymethyl) aminomethane] hydrochloric acid buffer is used. It is done. Any organic solvent may be used as long as it does not inhibit the reaction. For example, acetone, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, xylene, methyl alcohol, ethyl alcohol, butanol and the like are used.
  • the aqueous medium include a culture solution used for culturing the microorganism of the above (1) and a culture supernatant obtained by culturing the microorganism.
  • the enzyme having the activity of producing a useful substance using ATP as an energy source is not particularly limited as long as it is an enzyme that requires ATP for the reaction of the enzyme.
  • the enzyme include ⁇ -daltamylcystine cystase and dartathione synthetase.
  • cells having an activity of generating useful substances using sputum as an energy source include metabolic systems in which sputum is directly or indirectly involved in the process of generating useful substances by metabolizing precursors of the useful substances.
  • it is a cell having any of the above, it is not particularly limited, and examples thereof include microorganisms, animal cells, plant cells, insect cells and the like, preferably microorganisms.
  • the microorganism is preferably a microorganism artificially imparted with the ability to produce a desired useful substance by the above method 2.
  • the treated product of the cell culture is not particularly limited as long as the treated product has an ability to produce a useful substance using a koji.
  • the carbon source is not particularly limited as long as it is a carbon source that can be metabolized by the microorganism used in the production method of the present invention and used for the production of ATP.
  • ATP a carbon source that can be metabolized by the microorganism used in the production method of the present invention and used for the production of ATP.
  • glucose, fructose, sucrose examples thereof include molasses, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol.
  • the precursor of the useful substance is not particularly limited as long as it is a substance that is metabolized in the cell and converted into the useful substance, and is appropriately selected from substances upstream of the known biosynthetic pathway of the desired useful substance. You can choose.
  • phosphoric acid may be added to the medium as necessary.
  • surfactants such as Triton X-100, Benzalkol-um chloride and sodium dodecyl sulfate may be added to the media as required! / ⁇ .
  • concentration of the surfactant may be any concentration as long as it does not interfere with the production of useful substances, but it may be 0.05 to 5%, preferably 0.1 to 2%, more preferably 0.2 to 1%. it can.
  • the amount of cells having an activity to produce a useful substance using ATP as an energy source in the production method of 2) above varies depending on its specific activity, for example, lmg of useful substance 5 to 1000 mg, preferably 10 to 400 mg as a wet weight is added to each precursor.
  • the amount of the enzyme having the activity to produce a useful substance using ATP as an energy source is 0.01 to 100 mg, preferably 0.1 to 10 mg, per mg of the precursor of the useful substance.
  • the reaction is preferably performed at 20 to 50 ° C, particularly preferably at 25 to 37 ° C.
  • the reaction time varies depending on the amount of enzyme source used and the specific activity, and is usually 2 to 150 hours, preferably 6 to 120 hours.
  • Useful substances having medium strength can be collected by the method (1).
  • E. coli BW25113 AnbD :: km (hereinafter referred to as E. soliA nlpD-K strain) from which the nlED gene was destroyed by a kanamycin resistance marker from Nara Institute of Science and Technology.
  • the chromosomal DNA of the E. coH CGSC7465 strain (available from the Coli Genetic Stock Center operated by Yale University in the United States) that has transposon TnlO on the chromosomal DNA is used for the V-type, and is represented by SEQ ID NOs: 4 and 5.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence as a primer set.
  • LA-Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) was used, and a 100 ⁇ l reaction solution containing 10 ng of chromosomal DNA and 50 pmol each of primer DNA was prepared according to the instructions attached to LA-Taq. After the incubation, the cycle of 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 20 seconds, 68 ° C for 90 seconds was repeated 30 times, and then the temperature was maintained at 72 ° C for 10 minutes.
  • the DNA fragment was also excised and purified. 1 ⁇ 1 of the purified DNA solution is used as a bowl, and the DNA with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 is used as a primer set to carry a tetracycline resistance gene in the center and nbD DNA fragments having sequences homologous to the 5 'end and 3' end of the gene were amplified.
  • LA-Taq For PCR, use LA-Taq to prepare 50 ⁇ l of a reaction solution containing 40 ⁇ mol of Lng type and 40 ⁇ mol each of primer DNA according to the instructions attached to LA-Taq, and incubate at 94 ° C for 2 minutes. A cycle of 15 seconds at 55 ° C, 20 seconds at 55 ° C and 2 minutes at 68 ° C was repeated 30 times, and then the temperature was maintained at 72 ° C for 10 minutes. The amplified DNA fragment was purified using a QIA quick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN) to obtain a 30 ⁇ 1 DNA solution.
  • QIA quick PCR Purification Kit manufactured by QIAGEN
  • a competent cell of E. coH BW25113 / pKD46 strain (available from Coli Genetic Stock Center operated by Yale University, USA) is described in the literature [Gene, 246, 321-330 (2000)]. According to the method, transformation was performed using the previously prepared 0.51 DNA solution. Transformation was performed in a 0.1 cm cuvette (BioRad) at 1.8 KV and 25 ⁇ F. This was done by means of a recto mouth position.
  • Transformed cells were treated with 1 ml of LB liquid medium [lOg / 1 pacttryptone (Difco), 5 g / 1 bacto yeast extratate (Difco), 5 g / l sodium chloride, lml / LB containing 1 g glucose, 15 g / ml tetracycline, 100 g / ml ampicillin after culturing at 30 ° C for 2 hours using lm ol / l sodium hydroxide added at a ratio of 1]
  • the mixture was spread on an agar plate (LB liquid medium containing 1.5% agar) and cultured at 30 ° C.
  • the strain that has grown is E. coH
  • a PI phage stock was prepared from the E. coH A nlpD-T strain by the following method.
  • E. cd i A nlpD-T LB liquid medium containing 15 ⁇ g / ml tetracycline and 100 ⁇ g / ml ampicillin (lOg / 1 Batatotryptone (Difco), 5 g / l Bacto East Extraato (Manufactured by Difco), 5g / l sodium chloride, lmol / 1 lmol / 1 sodium hydroxide was added at 30 ° C, and 0.5 ml The culture was taken and mixed with 1.4 ml of fresh LB liquid medium and 100 1 of 0.1 mol / 1 calcium chloride solution.
  • Sputum is a high-energy phosphate compound essential for various reactions in the body, and is a coenzyme. Luciferase emits light using luciferin and cocoon as substrates. Escherichia coli has soot production activity, and the soot production ability of Escherichia coli can be evaluated using luminescence as an index.
  • the E. coH BW25113 AnlpD strain and its parent E. coH BW25113 strain were cultured with shaking in LB liquid medium (LBG medium) containing 1 ml of 3% glucose for 24 hours at 30 ° C.
  • LBG medium liquid medium
  • OD590nm a wavelength of 590 nm
  • Resulting culture 200 1 were centrifuged respectively to precipitate the cells, after had divided The supernatant, 100 i ul of 40 mmol / l Tris-HCl buffer (0 ° C, pH7.4) by using the The cells were washed once and then suspended in 30 ⁇ l of 40 mmol / l Tris-HCl buffer (0 ° C., pH 7.4). A 30 ⁇ l GT solution (40% glucose, 0.8% Triton X-100) was added to the resulting cell suspension to prepare a cell suspension for measuring the production activity of strawberries.
  • Dartathione is a peptide substance that also has the power of three types of amino acids (glutamic acid, cysteine, and glycine).
  • ⁇ -daltamylcystine synthase and dartathione synthase By the action of ⁇ -daltamylcystine synthase and dartathione synthase, the above three amino acids are condensed to biosynthesize dartathione.
  • ⁇ is a coenzyme essential for this condensation reaction.
  • Escherichia coli has soot-producing activity, and the soot-producing activity of Escherichia coli can be evaluated using the productivity of dartathion as an index.
  • the strain that possesses the plasmid is stored as FERM BP-337 in the Patent Microorganism Depositary, National Institute of Technology and Evaluation. It is. FERM BP-337 strain The plasmid was isolated and named pGS600 and used in the following experiments.
  • the E. coH BW25113 strain and the E. coH A nlpD-K strain which is an nl ⁇ gene-deficient strain that is the parent strain of E. coH BW25113, were obtained using the calcium chloride method [Molecular Crowning 3rd Edition, Cold Spring No. Transformed by the Uber Laboratory Press, 2001]. Transformations were selected using LB agar plates containing 20 g / ml of chloramfecol and were named E. coH BW25113 / pGS600 strain and E. coH BW25113 AnlpD / pGS600 strain, respectively.
  • E. coH BW25113 / pGS600 strain and E. coH BW25113 A nlpD / pGS600 strain were used at 30 ° C for 24 hours using LB liquid medium (LBG medium) containing 2.5 ml of 3% glucose, respectively. After shaking culture for a period of time, 200 ⁇ l of the resulting culture was inoculated into an Erlenmeyer flask containing 20 ml of fresh LBG medium and cultured at 30 ° C. for 24 hours with shaking. 7 turbidities (OD 590nm) measured at the end of the culture are listed on the table.
  • Each of the obtained cultures was centrifuged to precipitate the cells, and the cells were washed twice with 5 ml of lOOmmol / 1 Tris hydrochloride buffer (0 ° C, pH 7.4).
  • a 200 ⁇ l GT solution (20% glucose, 0.4% Triton X-100) was added to the obtained washed cells to prepare a cell suspension.
  • a DNA fragment containing the chloramphee-chol-resistant gene is amplified by PCR using PHSG398 plasmid DNA (purchased from Takara Bio Inc.) as a cage and using the DNA with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 as a primer set. did.
  • PHSG398 plasmid DNA purchased from Takara Bio Inc.
  • SEQ ID NOs: 8 and 9 the DNA with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 as a primer set. did.
  • EX-Taq (Takara Bio) to prepare a reaction solution 100 1 containing 20 ng of purified plasmid DNA and 50 pmol of each primer DNA according to the instructions attached to EX-Taq at 95 ° C. After a 1 minute incubation, a cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 64 ° C. for 30 seconds, 72 ° C.
  • the amplified DNA fragment was purified using QIA quick PCR Purification Kit (manufactured by QIAG EN) to obtain a 30 ⁇ l DNA solution.
  • EX-Taq For PCR, use EX-Taq to prepare 100 ⁇ l of the reaction solution containing 10 ng of vertical DNA and 50 pmol of each primer DNA according to the instructions attached to EX-Taq, and incubate at 95 ° C for 1 minute 94 ° C for 30 seconds, 51 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute The cycle was repeated 30 times, followed by incubation at 72 ° C for 3 minutes, and the amplified DNA fragment was purified by the same method as described above.
  • E. coH B W25113 / pKD46 strain was transformed with 1 ⁇ g of the DNA by the same electroporation as in Example 1.
  • the transformed cells were cultured for 3 hours at 30 ° C in 1 ml of SOC liquid medium containing 2 mmol / l IPTG, and then LB agar plates containing 50 g / ml chloramphenol (in LB liquid medium).
  • Agar containing 1.5% agar hereinafter abbreviated as LBcm agar plate) and cultured at 37 ° C.
  • the growing strain was confirmed to be a strain in which the gene on the chromosomal DNA of E. coH BW25113 / pKD46 was replaced with the chloramphee-chol-resistance gene, and the strain was identified as E. coH A putA-C. The strain was named.
  • E. coH A putA-C strain power PI phage was obtained in the same manner as in Example 1.
  • a 200 ⁇ l aliquot of the E. coH W3110 strain cultured in Ca LB liquid medium at 30 ° C. for 4 hours was collected, and 1 ⁇ l of fuzzy stock was added. After incubating at 37 ° C. for 10 minutes, 5 ml of LB liquid medium and 200 ⁇ l of lmol / 1 sodium quenate solution were added and stirred.
  • E. coH W3110 strain into which DU tA gene deficiency “ ⁇ putA :: Cm1 was transduced was obtained and named E. coH W3110 ⁇ put A strain.
  • E. coH A nlpD-T strain-derived PI phage stock prepared in Example 1 in the same manner as the above-mentioned phage transduction (1), the inheritance from the E. coH A nlpD-T strain Transfect the deficient [A nl_pD :: tet1 into the S. coli W3110 A putA strain and introduce 20 mg / l tetracitary A transduced strain was selected as a strain exhibiting resistance to erythrocytes and named E. coHW3110 ⁇ putA ⁇ nlpD strain.
  • a 4 kbp DNA fragment containing the operon was amplified by PCR using the chromosomal DNA of the E. coH W3110 strain as a saddle and using the DNA comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 12 and 13 as a primer set.
  • LA-Taq was used to prepare 25 1 reaction solutions containing 10 ng of chromosomal DNA and 20 pmol each of primer DNA according to the instructions attached to LA-Taq, and incubated at 94 ° C for 3 minutes.
  • a cycle of 15 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, and 68 ° C. for 4 minutes was repeated 30 times, and then the temperature was maintained at 72 ° C. for 10 minutes.
  • the plasmid pPCR proBA was prepared by cloning into the plasmid pPCR-Script Amp.
  • Point mutation proB74 (Gene, 64, 199-205 (1988)) was introduced into bile B of pPCR proBA using QuickChange Kit (QIAGEN) according to the instructions attached to the kit, and plasmid pPCR proB74A was introduced. Produced.
  • the nucleotide sequence of primer DNA used for introducing the mutation point is shown in SEQ ID NO: 14.
  • Plasmid pPCR proB74A was made into a saddle type, PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 15 and 16 as primers, and restriction enzyme sites for SD sequence, EamHI and Hiadin were attached. The proB74A gene was amplified.
  • PCR use Pyrobest (manufactured by Takara Bio Co., Ltd.) to prepare a reaction solution of 25 ⁇ 1 containing 100 ng of plasmid DNA and 20 pmol each of primer DNA, and incubate at 98 ° C for 2 minutes, then at 98 ° C for 10 seconds, 55 A cycle of 30 seconds at ° C and 2.5 minutes at 72 ° C was repeated 25 times.
  • the amplified fragment was purified, cleaved with restriction enzymes S IHI and tlindm, the vector portion of pQE80 (Qiagen) treated with the same restriction enzymes was separated and cut out by agarose gel electrophoresis, purified, and TaKaRa Both fragments were ligated with the Ligation Kit to produce recombinant DNA.
  • E. coH DH10B manufactured by Invitrogen was transformed with the recombinant DNA and applied to an LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin. The product was purified.
  • the obtained plasmid was a plasmid having a desensitized proline biosynthesis enzyme gene inducible with IPTG, and was designated as pQE80proB74A.
  • E. coH W3110 A putA strain and E. coH W3110 A putA A nlpD strain using pQE8 0proB74A, respectively. was transformed by. Transformants were selected using LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin and named E. coH A putA / pQE 80proB74A strain and E. coH A putA A nlpD / pQE80proB74A strain, respectively.
  • Each of the above transformants contained 5 ml of Med4 liquid medium (2% glucose, 1% polypeptone, 0.5% bacto yeast extratate, 1% sodium chloride sodium, 2% calcium carbonate).
  • a test tube was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C for 20 hours to obtain a culture.
  • 3001 of the culture was added to 30 ml of Med7 liquid medium (4% glucose, 0.8% peptone, 0.1% potassium dihydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate, 0.002% calcium chloride, 2% carbonate.
  • Med7 liquid medium 4% glucose, 0.8% peptone, 0.1% potassium dihydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate, 0.002% calcium chloride, 2% carbonate.
  • a 300 ml Erlenmeyer flask containing calcium, 1% ammonium sulfate, 0.2% sodium chloride, 0.03% iron sulfate was inoculated and cultured at 30 ° C with shaking. When the turbidity (OD660 nm) reached 0.7, IPTG was added to a final concentration of mol / 1.
  • the nlE ⁇ gene-deficient strain had a proline productivity of 1.7 times or more compared to the control strain. This result shows that gene-deficient strains can be used not only for the production of substances in which cocoons are directly involved in the biosynthetic pathway, but also in the production of various substances using microorganisms and cells in which cocoons are indirectly involved. It shows what you can do.
  • SEQ ID NO: 3 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 4 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 11 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 12 Description of artificial sequence
  • SEQ ID NO: 14 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 15 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 16 Description of artificial sequence; synthetic DNA

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Abstract

　本発明によれば、染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物を培地中で培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法が提供される。

Description

有用物質の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、微生物を用いた有用物質の製造法に関する。
背景技術
[0002] 微生物の ATP供給活性を用いた有用物質の製造法については、これまでに数多 くの報告がある (非特許文献 1〜4)。し力しながらこれらの報告では、 ATPを使用し て有用物質を生産する酵素について詳細な検討がなされているが、 ATPを供給する 複合的な酵素活性あるいは菌体活性について、詳しい解析はなされていない。上記 報告では、グルコースの異化代謝によって得られるエネルギーを利用して ATPを供 給していることが記載されているにすぎず、 ATP供給に関与する複合的な酵素系は 十分には解析されていない。
[0003] 多くの微生物では、その染色体 DNAの全塩基配列が明らかになつている（非特許 文献 5)。また、相同組換え手法を用いて、微生物の染色体 DNA上にある特定の遺 伝子または染色体 DNA上の領域を意図した通りに欠損させる方法は知られて 、る ( 非特許文献 6)。また染色体 DNAの全塩基配列情報、および相同組換え手法を利 用して微生物の染色体 DNA上の各遺伝子を網羅的に破壊した変異株ライブラリ一 、および 20kbp程度の削除可能な染色体 DNA上の領域のそれぞれを網羅的に欠 損させた変異株ライブラリーなども作製されて ヽる (非特許文献 7および 8)。
[0004] E. coliの nbD遣伝子産物は、リポ蛋白質であることが知られており、大腸菌の nbD 遺伝子破壊株は、長期間放置した場合の生菌数が野生株に比べ減少することが報 告されている（非特許文献 9)。また、 ηΐββ遺伝子が破壊された大腸菌の変異株は、 奈良先端科学技術大学院大学より入手することが可能である (非特許文献 10)。 し力しながら、 nlED遺伝子が欠損した微生物が有用物質の生産において有用であ ることは知られていない。
非特許文献 l :Appl. Microbiol. Biotechnol. (アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー）， 48, 693 (1997) 非特許文献 2 : Biosci. Biotechnol. Biochem. (バイオサイエンス バイオテクノロジー アンド バイオケミストリー）， 61, 960 (1997)
非特許文献 3： Nature Biotechnol. (ネーチヤ一 バイオテクノロジー）， 16, 847 (1998) 非特許文献 4 :J. Appl. Biochem. (ジャーナル ォブ アプライド バイオケミストリー）， 5, 43 (1983)
特干文献 5 : http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html
非特許文献 6 :J. Bacteriol. (ジャーナル ォブ バタテリォロジ一）， 180, 2063 (1998) 非特許文献 7 : J. Biochem. Mol. Biol. (ジャーナノレ ォブ バイオケミストリー アンド モレキュラー ノ ィォロジ一）， 37, 83 (2004)
非特許文献 8 : Nature Biotechnol. (ネーチヤ一 バイオテクノロジー）， 20, 1018 (2002 )
非特許文献 9 :J. Bacteriol. (ジャーナル ォブ バタテリォロジ一）， 176, 1630 (1994) 特干文献 10： http:/ノ ecoli.aist— nara.ac.jp/ uB5/ search.jsp
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の目的は、 ATPをエネルギー源として用いる有用物質の製造法において、 効率のよい該製造法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明は、以下の（1)〜（7)に関する。
(1)染色体 DNA上の配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードす る遺伝子、または配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有する 蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物を培地中で培 養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物中より該有用物質を採取す ることを特徴とする有用物質の製造法。
(2)染色体 DNA上の配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードす る遺伝子、または配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有する 蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物の培養物または 該培養物の処理物、 ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵 素または該活性を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、炭素源、および 該有用物質の前駆物質を媒体中に共存せしめ、該媒体中に有用物質を生成、蓄積 させ、該媒体中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
(3)配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番 号 2で表される塩基配列を有する遺伝子である、上記（1)または（2)の製造法。
(4)微生物または細胞が以下の [ 1]〜 [5]から選ばれる方法によって有用物質を生 産する能力が強化された微生物である、上記（1)〜（3)の 、ずれか 1つの製造法。
[1]有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法 [2]有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法
[3]有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増加さ せる方法
[4]有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路 の少なくとも 1つを弱化または遮断する方法
[5]野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択 する方法
(5)微生物力 Azotobacter属、 Erwinia属、 Escherichia . Klebsiella属、 Methylobacillu S属、 Pseudomonas属、または Salmonella属に属する微牛.物である、上記（1)〜（4)の いずれか 1つの製造法。
(e 微牛.物 ) Azotobater vinelandiu Erwinia carotovora. Escherichia coii、 Klebsiella pneumoniae. Methvlobacillus flagellatus. Pseudomonas fluorescens. Pseudomonas pu tida、または Salmonella thvpimuriumである上記（ 1 )〜（5)の 、ずれか 1つの製造法。 (7)有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、 アルコール、有機酸、生理活性低分子化合物および脂質からなる群より選ばれる有 用物質である、上記（1)〜（6)の 、ずれか 1つの製造法。
発明の効果
本発明により、 ATPをエネルギー源として製造される有用物質を、効率よく製造す ることがでさる。
発明を実施するための最良の形態 [0008] 1.本発明の製造法に用いられる微生物
本発明の製造法で用いられる微生物としては、染色体 DNA上の配列番号 1で表さ れるアミノ酸配列を有する蛋白質 (以下、 NlpD蛋白質とも称す)をコードする遺伝子、 または配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、より好 ましくは 95%以上、さらに好ましくは 97%以上、特に好ましくは 98%以上、最も好ま しくは 99%以上の相同性を有する蛋白質 (以下、 NlpDホモログ蛋白質とも称す)をコ ードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物をあげることができる。なお 、本明細書中では、遺伝子は構造遺伝子およびプロモーター、オペレーターなどの 特定の制御機能を有する領域を含んで 、る。
[0009] アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAS T[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods EnzymoL, 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLAST Nや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol, 215, 403(1990)]。 BLASTに基づ 、て BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例 えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによって アミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えば score=50、 wordlength=3と する。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフオル トパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http：〃 www. ncbi.nlm.nih.gov.)。
[0010] NlpD蛋白質をコードする遺伝子、または NlpDホモログ蛋白質をコードする遺伝子（ 以下、 遺伝子またはそのホモログ遺伝子と称す)の一部または全部が欠損して いるとは、染色体 DNA上の該遺伝子の塩基配列中に塩基の欠失があるため、 (l)nl 遺伝子またはそのホモログ遺伝子のプロモーターまたはオペレーターなどの転写 制御が機能せず、 遺伝子またはそのホモログ遺伝子にコードされる蛋白質を発 現しない微生物、（2)η 遺伝子またはそのホモログ遺伝子中の構造遺伝子にフレ ームシフトが生じ、 NlpD蛋白質またはそのホモログ蛋白質が活性ある蛋白質として発 現しない微生物、（3)n 遺伝子またはそのホモログ遺伝子中の構造遺伝子の一部 または全部が欠損しているため活性ある蛋白質を発現しない微生物、などをあげるこ とができ、好ましくは（3)の微生物をあげることができる。
[0011] 上記（3)の微生物として、より具体的には、配列番号 2で表される塩基配列におい て、構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため活性ある蛋白質を発現しない 微生物をあげることができる。一部が欠損しているとは、配列番号 1で表されるァミノ 酸配列を有する蛋白質がその活性を喪失する欠損であれば、配列番号 2で表される 塩基配列中の 1塩基の欠失でもよぐ好ましくは構造遺伝子中の 5〜： L00塩基、より 好ましくは該遺伝子中の 10〜 100塩基、さらに好ましくは該遺伝子中の 50〜 100塩 基の欠失をあげることができる。
[0012] また、本発明の製造法で用いられる微生物は、上記したように染色体 DNA上の M£ β遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損している微生物であれ ば、いずれの属に属する微生物であってもよぐ好ましくは原核生物、より好ましくは 細菌をあげることができる。
糸田菌としては Azotobacter属、 Erwinia属、 Escherichia . Klebsiella属、 Methvlopacill 属、 Pseudomonas属、または Salmonella属に属する微牛.物、より好ましくは Azotobat er vinelandiu Erwinia carotovora. bschenchia coli、 Klebsiella pneumoniae. Methvlob acillus flagellatus. Pseudomonas fluorescens. Pseudomonas putidaおよび salmonella t hvDimuriumなどをあげるこ ができ、さらに好ましくは E. soliをあげることができる。 2.本発明の製造法に用いられる微生物の調製
本発明の製造法で用いられる微生物は、（1)有用物質を生産する能力を有する微 生物の染色体 DNA上に存在する ηΐββ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部また は全部を欠損させる方法、または（2)染色体 DNA上の 遺伝子またはそのホモ口 グ遺伝子の一部または全部が欠損した微生物に、有用物質の生産性を付与する方 法により調製することができる。
[0013] 有用物質を生産する能力を有する微生物は、 1種以上の有用物質を生産する能力 を有する微生物であればいずれの微生物であってもよぐ該微生物としては自然界 から分離された株自身が該能力を有する場合は該株そのもの、公知の方法により所 望の有用物質を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることができる。 当該公知の方法としては、 (a)有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法、
(b)有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法、
(c)有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増加さ せる方法、
(d)有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の 少なくとも 1つを弱化または遮断する方法、および
(e)野生型株に比べ、有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する 方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることがで きる。
[0014] 上記 (a)〜（e)の具体的な方法は、例えば有用物質がアミノ酸である場合について は、上記（a)の方法に関しては Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、 J. BacterioL,
110. 761- 763(1972)および Appl. Microbiol. BiotechnoL, 39, 318- 323(1993)などに 記載されている。上記（b)の方法に関しては、 Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979) および J. BacterioL, U0, 761-763(1972)などに記載されている。上記（c)の方法に関 しては、 Appl. Microbiol. BiotechnoL, 39, 318- 323(1993)および Agric. Biol. Chem., 3 9, 371-377(1987)などに記載されている。上記（d)の方法に関しては、 Appl. Environ.
MicribioL, 38, 181- 190(1979)および Agric. Biol. Chem., 42, 1773- 1778(1978)など に記載されている。上記（e)の方法に関しては、 Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684( 1972)、 Agric. Biol. Chem., 41, 109—116(1977)、 Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1 973)および Agric. Biol. Chem., 51, 2089- 2094(1987)などに記載されている。上記文 献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することがで きる。
[0015] さらに上記 (a)〜（e)のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄 積する能力を有する微生物の調製方法については、 Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (Vし H Verlagsgesellschaft mbH, Weinneim, 1996) s ection 14a, 14bや Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1—35 (20 03)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（1986)に多くの例が記載されてお り、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製 方法は、特開 2003- 164297、 Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、 Agric. Biol. C hem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭 58- 13599、 J. Gen. Appl. Microbiol, 4, 272-283 (1958)、特開昭 63- 94985、 Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、 W097/15673, 特開昭 56-18596、特開昭 56-144092および特表 2003-511086など数多くの報告があ り、上記文献等を参照することにより 1種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生 物を調製することができる。
[0016] アミノ酸以外の有用物質を生産する能力を微生物に付与する方法もまた、多くの報 告があり、従来知られているすべての方法は、本発明の製造法に用いられる微生物 の製造に用いることができる。
染色体 DNA上の ηΐΕβ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損 した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが 、例えば下記した微生物の染色体 DNA上の配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有 する蛋白質をコードする遺伝子、または nbD遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列情 報を利用して、微生物の染色体 DNA上にある ηΐββ遺伝子またはそのホモログ遺伝 子に塩基の欠失を導入する方法により取得することができる。
[0017] ηΐΕβ遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列は、配列番号 2で表される塩基配列中の 構造遺伝子の全部または一部をプローブに用いた、各種微生物の染色体 DNAに 対するサザンノヽイブリダィゼーシヨンにより H!ED遺伝子のホモログ遺伝子を同定、取 得し、または配列番号 2で表される塩基配列に基づき設計したプライマー DNAを用 V、、各種微生物の染色体 DNAを铸型とした PCRにより 遺伝子のホモログ遺伝 子を同定、取得した後、常法により該遺伝子の塩基配列を解析することにより決定す ることがでさる。
[0018] サザンハイブリダィゼーシヨンおよび PCRに供する染色体 DNAは、いずれの微生 物の染色体 DNAであってもよく、好ましくは Azotobacter属、 Erwinia属、 Escherichia 晨、 Klebsiella属、 Methvlobacillusfe, Pseudomonasfeま 7こ【ま aalmonella属に属する ¾k 生物、より好 し ^Azotobater vinelandu、 Erwinia carotovora, Escherichia coli、 Kle bsiella pneumoniae ^ Methvlobacillus flagellatus^ Pseudomonas fluorescens、 Pseudom onas putidaおよび Salmonella thvpimuriumなどの染色体 DNAをあげることができる [0019] 上記で!/、う「ノヽイブリダィゼーシヨン」とは、特定の塩基配列を有する DNAまたは該 DNAの一部に DNAがハイブリダィズすることである。したがって、該特定の塩基配 列を有する DNAまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブと して用いることができ、また PCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる DNAである。プローブとして用いられる DNAとしては、少なくとも 100塩基以上、好 ましくは 200塩基以上、より好ましくは 500塩基以上の DNAをあげることができ、プラ イマ一として用いられる DNAとしては、少なくとも 10塩基以上、好ましくは 15塩基以 上の DNAをあげることができる。
[0020] DNAのハイブリダィゼーシヨン実験の方法はよく知られており、例えば当業者であ れば本願明細書に従い、ハイブリダィゼーシヨンの条件を決定することができる。該 ハイブリダィゼーシヨンの条件は、モレキュラー 'クローユング第 2版、第 3版（2001年 )、 Methods for General ana Molecular Bacteriolgy, ASM Press (1994)、 Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科 書に従っておこなうことができる。
[0021] ハイブリダィゼーシヨンはストリンジェントな条件下で行うことが好まし!/、。ストリンジェ ントな条件とは、 DNAを固定化したフィルターとプローブ DNAとを 50%ホルムアミド、 5 X SSC (750mMの塩化ナトリウム、 75mMのクェン酸ナトリウム）、 50mMのリン酸ナトリ ゥム（pH7.6)、 5 Xデンハルト溶液、 10%の硫酸デキストラン、および 20 g/1の変性さ せたサケ精子 DNAを含む溶液中で 42°Cでー晚、インキュベートした後、例えば約 65 °Cの 0.2 X SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリン ジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃 度調整 (ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジヱントになる）、塩濃度および温 度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば 6 X SSCE (20 X SSCEは、 3mol/lの塩化ナトリウム、 0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、 0.02mol/lの EDTA、 pH7.4)、 0.5%の SDS、 30%のホルムアミド、 100 μ g/1の変性させたサケ精子 DNAを含む溶液中で、 37°Cでー晚インキュベートした後、 50°Cの 1 X SSC、 0.1%SDS 溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな 条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度 (例えば 5 X SSC) の溶液を用いてハイブリダィゼーシヨンを行った後、洗浄する条件をあげることができ る。
[0022] 上記した様々な条件は、ノ、イブリダィゼーシヨン実験のバックグラウンドを抑えるた めに用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。 上記したブロッキング試薬の添カ卩は、条件を適合させるために、ハイブリダィゼーショ ン条件の変更を伴ってもょ 、。
上記したストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズ可能な DNAとしては、例えば上 記した BLASTや FASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づ 、て計算したときに、 配列番号 2で表される塩基配列と少なくとも 90%以上、好ましくは 95%以上、より好 ましくは 97%以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以上の相同性を 有する DNAをあげることができる。
[0023] 具体的な H!ED遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列としては、 Azotobater vinelandii 由来の n Diwfe子の : 酉 S歹 IJ (Genbank accession no.AF421351)、 Erwinia carotov ora由来の nbD遣伝子の塩某配歹 II (Genbank accession no.BX950851)、 Pseudomona s fluorescens由来の nlpD.遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.AF245440)、 Ps eudomonas Dutida由来の n D遣伝子の塩某配歹 H (Genbank accession no.AF260132) 、 Salmonella thvpimurium由来の n D遣 子の 列 (Genbank accession no.AEO 08833)などをあげることができる。
[0024] 微生物の染色体 DNA上の遺伝子に塩基の欠失を導入する方法としては、相同組 換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法とし ては、塩基の欠失が導入された変異遺伝子を、該欠失の導入対象である宿主細胞 内では自立複製できな!/ヽ薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド DNAと連結して作製で きる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。
[0025] 該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標に して相同組換えによって染色体 DNA上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形 質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しな!ヽ培地で数時間〜 1 日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、 前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体 DN A上において 2回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体 DNA 上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体
DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失が導入されたことを確認することができる。
[0026] 上記方法により、染色体 DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失を導入することができ る微生物としては、例えばェシエリヒア属に属する微生物をあげることができる。 また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失を導入する相同組換えを利用した方法 としては、直鎖 DNAを用いた方法をあげることができる。
具体的には、塩基の欠失の導入対象である染色体 DNA上の領域の両外側に存 在する領域を含有する直鎖 DNAを細胞内に取り込ませ、染色体 DNAと導入した直 鎖 DNAとの間で相同組換えが起こさせる方法である。本方法は、直鎖 DNAを効率 よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物として はェシエリヒア属、より好ましくはェシエリヒア'コリ、さらに好ましくはえファージ由来の 組換えタンパク質群 (Red組換え系）を発現しているェシエリヒア'コリをあげることがで きる。
[0027] λ Red組換え系を発現しているェシエリヒア'コリとしては、 λ Red組換え系遺伝子 を有するプラスミド DNAである pKD46 [ェシエリヒア'コリジェネティックストックセンタ 一（米国エール大学)より入手可能]を保有するェシエリヒア'コリ JM101株等をあげる ことができる。
相同組換えに用いられる DNAとしては、
(a)塩基の欠失の導入対象である染色体 DNA上の領域の両外側に存在する DNA または該 DNAと相同性を有する DNAを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖 DN A、
(b)塩基の欠失の導入対象である染色体 DNA上の領域の両外側に存在する DNA または該 DNAと相同性を有する DNAを直接連結した直鎖 DNA、
(c)塩基の欠失の導入対象である染色体 DNA上の領域の両外側に存在する DNA または該 DNAと相同性を有する DNAを、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレク シヨンに用いることができる遺伝子を有する DNAの両端に有する直鎖 DNA、および (d)上記 (a)の直鎖 DNAにお 、て、薬剤耐性遺伝子と塩基の欠失の導入対象であ る染色体 DNA上の領域の両外側に存在する DNAまたは該 DNAと相同性を有する DNAの間に、さらに酵母由来の Flp recombinase [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 5 875 (1985)〕が認識する塩基配列を有する DNA、
などをあげることができる。
[0028] 薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付 与する薬剤耐性遺伝子であれば、 ヽずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる 。宿主微生物にェシエリヒア'コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば 、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフエ-コール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺 伝子、スぺクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリ ン耐性遺伝子等をあげることができる。
[0029] ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を 発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のこ とをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来の^遺伝子〔 Appl. Environ. Microbiol, 59, 1361- 1366 (1993)〕、およびェシエリヒア属に属する微 生物由来の 遺伝子 [Genomics, 72, 99-104(2001)〕等をあげることができる。
[0030] 上記の直鎖 DNAの両末端に存在する、染色体 DNA上の塩基の欠失の導入対象 となる領域の両端の外側に位置する DNAおよび該 DNAと相同性と相同性を有する DNAは、直鎖 DNAにおいて、染色体 DNA上の方向と同じ方向に配置され、その 長さは 10bp〜100bp程度が好ましぐ 20bp〜50bp程度がより好ましぐ 30〜40bp程度 力 Sさらに好ましい。
酵母由来の Flp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組 換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号 3で表 される塩基配列を有する DNA、および該 DNAにおいて 1個〜数個の塩基が欠失、 置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来の Hp recombinaseが認識し、 相同組換えを触媒する塩基配列を有する DNAをあげることができる。
[0031] 相同性を有するとは、上記直鎖 DNAが、染色体 DNA上の目的とする領域におい て、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては 、 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 100% の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記した BLASTや FASTA等のプログラムを用いて決定 することができる。
上記直鎖 DNAは、 PCRにより作製することができる。また上記直鎖 DNAを含む D NAをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖 DNAを得ることも できる。
微生物の染色体 DNAに塩基の欠損、置換または付加を導入する方法としては、 以下の方法 1〜4があげられる。
方法 1：上記 (a)または (d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に 該直鎖 DNAが染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択す る方法。
方法 2：上記方法 1により取得された形質転換株に、上記 (b)の直鎖 DNAを導入し、 該方法により染色体 DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物 の染色体 DNA上の領域を置換または欠失させる方法。
方法 3 :
[ 1 ]上記 (c)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]染色体 DNA上の塩基の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置する
DNAと相同性を有する DN Aを、染色体 DNA上における方向と同一の方向で連結 した DNAを合成し、上記 [ 1 ]で得られた形質転換株に導入する、
[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、 上記 [2]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬 剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体 D
NA上から削除された株として選択する方法。
方法 4 :
[ 1 ]上記 (d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、 [2]上記 [ 1 ]で得られた形質転^ に Hp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入 し、該遺伝子を発現させた後、上記 [1]で用いた薬剤に感受性である株を取得する 方法。
[0033] 上記方法で用いられる、直鎖 DNAを宿主微生物に導入する方法としては、該微生 物へ DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムィ オンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（ 特開昭 63- 2483942)、エレクト口ポレーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988) 〕等をあげることができる。
[0034] 方法 2または方法 3 [2]で用いられる直鎖 DNAにおいて、該 DNAの中央部付近に 、染色体 DNA上に挿入した 、任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖 DNAを用いること により、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体 DNA上 に挿入することができる。
上記方法 2〜4では、最終的に得られる形質転換株の染色体 DNA上には薬剤耐 性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子 を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およ びネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り 返すことにより、容易に染色体 DNA上の位置の異なる 2つ以上の領域に塩基の欠失 、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
3.本発明の有用物質の製造法
本発明の製造法で製造される有用物質は、 ATPおよび微生物または細胞が有す る代謝能を用いて製造する際、その生合成において直接または間接的に ATPを必 要とする、工業上有用とされている物質であればいずれでもよぐ該物質としては、好 ましくはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコー ル、有機酸、生理活性低分子化合物および脂質などをあげることができ、より好ましく はタンパク質としては、イノシンキナーゼ、 Glutamate 5- kinase (EC 2.7.2.11)、 Glutam ate— 5— semialdehyde dehydrogenase (Eし 1.2.1.41)、 Pyrroline— 5— carboxylate reduc tase (EC 1.5.1.2)、 y—グルタミルシスティン合成酵素 (EC 6.3.2.2)、グルタチオン合 成酵素 (EC 6.3.2.3)、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、キシロースレダクターゼ、 P450な どをあげることができ、ペプチドとしてはダルタチオンなどをあげることができ、アミノ酸 としては、 Lーァラニン、グリシン、 L—グルタミン、 L—グルタミン酸、 Lーァスパラギン 、 L ァスパラギン酸、 L リジン、 L—メチォニン、 L—スレオニン、 L ロイシン、 L- ノ リン、 L—イソロイシン、 L—プロリン、 L—ヒスチジン、 L—アルギニン、 Lーチロシン 、 L トリプトファン、 L フエ-ルァラニン、 L セリン、 L システィン、 L 3—ヒドロ キシプロリン、 L— 4—ヒドロキシプロリンなどをあげることができ、核酸としては、イノシ ン、グアノシン、イノシン酸、グァ-ル酸などをあげることができ、ビタミンとしては、リボ フラビン、チアミン、ァスコルビン酸などをあげることができ、糖としては、キシロースな どをあげることができ、糖アルコールとしては、キシリトールなどをあげることができ、ァ ルコールとしてはエタノールなどをあげることができ、有機酸としては乳酸、コハク酸 などをあげることができ、生理活性低分子化合物としてはダルタチオンなどをあげるこ とができ、脂質としては、 EPA (エイコサペンタエン酸)や DHA (ドコサへキサェン酸）な どをあげることができる。
[0035] 本発明の有用物質の製造法としては、 1)上記 2の微生物を培地に培養し、培養物 中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から有用物質を採取する方法、および 2) 上記 2の微生物の培養物または該培養物の処理物、 ATPをエネルギー源として有用 物質を生成する活性を有する酵素または該活性を有する細胞の培養物または該培 養物の処理物、炭素源、および該有用物質の前駆物質を媒体中に共存せしめ、該 媒体中に有用物質を生成、蓄積させ、該媒体中より該有用物質を採取する方法をあ げることができる。
(1)発酵法による有用物質の製造
上記 1)の方法において、該微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用 V、られる通常の方法に従って行うことができる。
[0036] すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生 物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の!/ヽずれも用いること ができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース 、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭 水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール 類等を用いることができる。
[0037] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカ一、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化 物等を用いることができる。
[0038] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは 3.0〜9 .0に保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ ゥム、アンモニア等を用いて行う。
[0039] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添カロしてちょい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 k£プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル一 β—D—チォガラタトピラノシド等を、 imプロモーターを用いた発 現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地 に添カ卩してもよい。
[0040] 培養物中に生成、蓄積した有用物質の採取は、活性炭やイオン交換榭脂などを用 いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高 速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
(2)上記 2の微生物を ATPの供給源として用いる方法
上記 2)の方法で用いられる上記 2の微生物の培養物は、上記（1)の培養方法で上 記 2の微生物を培養することにより取得することができる。 [0041] 微生物の培養物の処理物としては、該処理物が ATPを生産する活性を有する限り 、特に制限されないが、例えば、該培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物の凍 結乾燥物、培養物の浸透圧を下げて得られる処理物、培養物を遠心分離して得られ る菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該 菌体の酵素処理物、該菌体の溶媒処理物および該細胞の固定化物などの細胞の形 態を保持し、該培養物と実質的に同じ活性を有する処理物、並びに該菌体の超音波 処理物、該菌体の機械的摩砕物などの粗酵素抽出物などをあげることができる。
[0042] 媒体としては、水、水性媒体もしくは有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶 媒との混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、 HEPES (N-2- ヒドロキシェチルピペラジン- N-エタンスルホン酸）緩衝液、トリス [トリス (ヒドロキシメチ ル)ァミノメタン]塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害 しないものであればいずれでもよぐ例えば、アセトン、酢酸ェチル、ジメチルスルホ キシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等が用いられる。 また水性媒体としては、上記（1)の微生物を培養する際に用いる培養液、および該 微生物を培養して得られる培養物の上清もあげることができる。
[0043] ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素としては、該酵素 が担う反応に ATPが必要な酵素であれば、特に制限されない。該酵素としては、例え ば γ —ダルタミルシスティンシテターゼおよびダルタチオンシンテターゼなどをあげる ことができる。また ΑΤΡをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する細胞 としては、該細胞が有用物質の前駆体を代謝して該有用物質を生成する過程に直 接または間接的に ΑΤΡが関与する代謝系を有する細胞である限り、特に制限されず 、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などをあげることができ、好ましくは微生物 をあげることができる。該微生物としては、上記 2の方法により、所望の有用物質を生 産する能力を人為的に付与した微生物が好ましい。
[0044] 該細胞の培養物の処理物としては、該処理物が ΑΤΡを用いて有用物質を製造する 能力を有する限り特に制限されないが、例えば培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、 培養物の凍結乾燥物、培養物の浸透圧を下げて得られる処理物、培養物を遠心分 離して得られる細胞、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性 剤処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞の溶媒処理物および該細胞の固定化物な どの細胞の形態を保持し、該培養物と実質的に同じ活性を有する処理物、並びに該 細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕物、該細胞から抽出される蛋白質分画 物、および酵素の固定ィ匕物などの粗精製酵素などをあげることができる。
[0045] 炭素源としては、本発明の製造法で用いられる微生物が代謝し、 ATPの生成に用 いることができる炭素源であれば特に制限されないが、例えばグルコース、フラクトー ス、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の 炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコー ル類等をあげることができる。
[0046] 有用物質の前駆物質としては、細胞内で代謝されて有用物質に変換される物質で あれば、特に限定されず、所望の有用物質の公知の生合成経路上流にある物質か ら適宜選択することがでさる。
また、上記 2)の製造法において、必要に応じてリン酸を媒体に添加してもよい。 さらに、媒体には必要に応じて、例えばトライトン X- 100、ベンザルコ -ゥムクロライド およびドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を添加してもよ！/ヽ。界面活性剤の濃 度は、有用物質の生成を妨げない濃度であれば、いずれでもよいが、 0.05〜5%、好 ましくは 0.1〜2%、より好ましくは 0.2〜1%をあげることができる。
[0047] 上記 2)の製造法にぉ 、て用いられる微生物、および ATPをエネルギー源として有 用物質を生成する活性を有する細胞の量は、その比活性等により異なる力 例えば 、 lmgの有用物質の前駆物質あたり、湿重量として 5〜1000mg、好ましくは 10〜400mg 添加する。 ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素の量は 、有用物質の前駆物質 lmgあたり 0.01〜100mg、好ましくは 0.1mg〜10mg添加する。 反応は 20〜50°Cで行なうことが好ましぐ特に 25°C〜37°Cで行なうことが好ましい。反 応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なる力 通常 2〜150時間、好ま しくは 6〜120時間である。
[0048] 媒体力もの有用物質の採取は、上記（1)の方法により行うことができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、 以下の実施例における DNA操作等に関する方法は、 Molecular Cloning, A Laborat ory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載の方 法を適宜用いることができる。
実施例 1
[0049] nbD遺伝子欠損株の作製
奈良先端科学技術大学院大学より、カナマイシン耐性マーカーによって nlED遺伝 子が破壊されている E. coli BW25113 A nbD::km (以下、 E. soliA nlpD- K株と表記す る)を入手した。
トランスポゾン TnlOを染色体 DNA上に持つ E. coH CGSC7465株（米国 Yale大学で 運営されている Coli Genetic Stock Centerから入手可能）の染色体 DNAを铸型に用 V、、配列番号 4および 5で表される塩基配列からなる DNAをプライマーセットに用い た PCRを行った。 PCRは、 LA-Taq (タカラバイオ社製)を用い、染色体 DNA 10ng、 プライマー DNA各 50pmolを含む 100 μ 1の反応液を LA-Taqに添付の指示書に従い 調製し、 94°Cで 2分間保温後、 94°Cで 15秒間、 55°Cで 20秒間、 68°Cで 90秒間のサイ クルを 30回繰り返した後、 72°Cで 10分間保温すると 、う条件で行った。
[0050] 目的とする DNA断片が増幅して!/、ることをァガロースゲル電気泳動法にて確認し た後、該 DNA断片をゲル力も切り出して精製した。精製した DNA溶液 1 μ 1を铸型と して、配列番号 6および 7で表される塩基配列力 なる DNAをプライマーセットとして 用いた PCRにより、テトラサイクリン耐性遺伝子を中央部に持ち、雨端に nbD遣伝子 の 5 '末端側ならびに 3 '末端側と相同な配列を有する DNA断片を増幅した。 PCRは 、 LA-Taqを用いて、铸型 lng、プライマー DNA各 40pmolを含む反応液 50 μ 1を LA- Taqに添付の指示書に従い調製し、 94°Cで 2分間保温後、 94°Cで 15秒間、 55°Cで 20 秒間、 68°Cで 2分間のサイクルを 30回繰り返した後、 72°Cで 10分間保温するといぅ条 件で行った。増幅 DNA断片を QIA quick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用 Vヽて精製し、 30 μ 1の DNA溶液を得た。
[0051] E. coH BW25113/pKD46株（米国 Yale大学で運営されている Coli Genetic Stock Ce nterから入手可能）のコンビテントセルを、文献 [Gene, 246, 321-330 (2000)]に記載 の方法に従って調製し、先に調製した 0.5 1の DNA溶液を用いて形質転換を行つ た。形質転換は、 0.1cmのキュベット (BioRad社製)中で、 1.8KV、 25 μ Fの条件で、ェ レクト口ポレーシヨンにより行った。
[0052] 形質転換した細胞を、 1mlの LB液体培地 [lOg/1パクトトリプトン (ディフコ社製）、 5g /1バクトイーストエキストラタト（ディフコ社製）、 5g/l塩ィ匕ナトリウム、 lml/1の割合で lm ol/l水酸ィ匕ナトリウムを添加]を用いて 30°Cで 2時間培養した後、 15 g/mlのテトラサ イクリン、 100 g/mlのアンピシリン、 1%グルコースを含む LB寒天プレート（LB液体 培地に寒天を 1.5%含むもの）上に塗布し、 30°Cでー晚培養した。生育してきた株は 、 E. coH
Figure imgf000020_0001
遺伝子と置換された株 [E. coH BW25113/pKD46
Figure imgf000020_0002
該株を E. co li A nlpD- T株と命名した。
[0053] 次に E. coH A nlpD-T株から PIファージストックを以下の方法により調製した。 E. cd i A nlpD- T株を 15 μ g/mlのテトラサイクリン、 100 μ g/mlのアンピシリンを含む LB液体 培地 [lOg/1バタトトリプトン (ディフコ社製）、 5g/lバクトイーストエキストラタト (ディフコ 社製）、 5g/l塩ィ匕ナトリウム、 lml/1の割合で lmol/1水酸ィ匕ナトリウムを添加]を用いて 30°Cにてー晚培養した後、そこから 0.5mlの培養物をとり、 1.4mlの新しい LB液体培地 および 100 1の 0. lmol/1塩化カルシウム溶液を加え混合した。
[0054] 該混合溶液を 30°Cで 5〜6時間振とう培養した後、 400 μ 1の該混合液を滅菌したチ ユーブに移した。そこに 2 1の P1ファージストック溶液を添カ卩し、 37°Cで 10分間保温 した後、 50°Cに保温したソフトァガー溶液（lOg/1バタトトリプトン、 5g/lバクトイースト エキストラタト、 5mmol/l塩化カルシウム、 15g/l寒天、 lml/1の割合で lmol/1水酸化 ナトリウムを添加）を 3ml添加して、よく攪拌し、 Ca— LB寒天培地プレート（lOg/1バタ トトリプトン、 5g/lバクトイーストエキストラタト、 5mmol/l塩化カルシウム、 15g/l寒天、 1 ml/1の割合で lmol/1水酸化ナトリウムを添加。プレートの直径は 15cm)上にまいた。
[0055] 該プレートを 37°Cで 7時間培養した後、スプレッダ一でソフトァガ一部分を細力べ砕 いて回収し、 1500 X g、 4°Cの条件下で 10分間遠心分離した。上清 1.5mlに対し 100 1 のクロ口ホルムを添カ卩し、 4°Cにてー晚保存した。翌日、溶液を 15000 X gにて 2分間遠 心分離し、上清をファージストツクとして 4°Cで保存した。
E. coH A nlpD- T株を LB寒天培地 [lOg/1バタトトリプトン (ディフコ社製）、 5g/lバタ トイーストエキストラタト (ディフコ社製）、 5g/l塩ィ匕ナトリウム、 15g/l寒天、 lml/1の割合 で lmol/1水酸ィ匕ナトリウムを添加]上に塗布し、 43°Cで一晩培養した。複数のコロニー を 100 μ g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地と含まない LB寒天培地に同時にスポ ットし、アンピシリンを含まな!/、LB寒天培地のみで生育したコロニーを選択することに より、 E. £2lL A nlpD-T株カゝら温度感受性プラスミド pKD46が脱落した株を取得し、 E. coli BW25113 Δ nlpD株と命名した。
実施例 2
ηΐββ遺伝子欠損株の ATP生産活性の測定
ΑΤΡは生体の様々な反応に必須な高エネルギーリン酸ィヒ合物であり、補酵素であ る。ルシフェラーゼはルシフェリンと ΑΤΡを基質として発光する。大腸菌は ΑΤΡ生産活 性を有しており、発光を指標として大腸菌が有する ΑΤΡ生産能力を評価することがで きる。
(1)菌体の処理
E. coH BW25113 A nlpD株とその親株である E. coH BW25113株を、それぞれ lmlの 3 %グルコースを含む LB液体培地 (LBG培地）を用いて、 30°Cで 24時間、振盪培養し た。培養終了時に濁度を測定 (590nmの波長光で測定。以下、 OD590nmと表記する） したところ、 BW25113株の値を 100としたとき、 E. coH BW25113 A nlpD株は 109であつ た。得られた培養物 200 1をそれぞれ遠心分離して菌体を沈殿させ、上清を取り除 いた後に、 100 iu lの40mmol/lトリス塩酸バッファー（0°C、 pH7.4)を用いて該菌体を 1 回洗浄した後、 30 μ 1の 40mmol/lトリス塩酸バッファー（0°C、 pH7.4)に懸濁した。得ら れた菌体懸濁液に 30 μ 1の GT溶液（40%グルコース、 0.8%トライトン X- 100)を加えて ΑΤΡ生産活性測定用の菌体懸濁液を調製した。
(2) ΑΤΡの生産活性の測定
90 μ 1の反応液（0.5 mmol/1 D-ルシフェリン、 1.25 μ g/ml ホタルルシフェラーゼ、 5 mmol/1 硫酸マグネシウム、 lOOmmol/1エチレンジアミンテトラ硫酸、 lmmol/1ジチォ スレイトール、 0.4%トライトン X- 100、 15mmol/lリン酸一カリウム、 25mmol/lトリシンバッ ファー、 pH7.4)に、上記（1)で取得した菌体懸濁液を 10 1添カ卩して室温で 3分間発 光を測定した。発光値の測定には、パーキンエルマ一社製のプレートリーダーを用い た。発光値とは、測定器に依存する相対的な発光の検出値で、一般的に RLUと呼ば れているものである。
[0057] RLUの時間変化 [RLU (3分）— RLU (0分）] Z3から ATPの生産速度を比較したとこ ろ、 E. coH BW25113株の ATPの生産速度を 100としたとき、 E. coH BW25113 A nlpD 株の ATPの生産速度は 182であった。この結果は、 nlE^遺伝子欠損株では ATP生産 活性が上昇して!/、ることを示して！/、る。
実施例 3
[0058] nbD遺伝子欠損株によるダルタチオンの生産
ダルタチオンは、 3種類のアミノ酸 (グルタミン酸、システィン、グリシン)力もなるぺプ チド性物質である。 γ—ダルタミルシスティン合成酵素とダルタチオン合成酵素の働 きにより、前述の 3つのアミノ酸が縮合しダルタチオンが生合成される。 ΑΤΡは、この 縮合反応に必須な補酵素である。大腸菌は ΑΤΡ生産活性を有しており、ダルタチォ ンの生産性を指標として大腸菌が有する ΑΤΡ生産活性を評価することができる。 (1)ダルタチオン生合成酵素遺伝子の取得
特開昭 58-20196号および J. Gen. Microbiol, 128, 1047-1052(1982)に記載の方法 に従い、ダルタチオンによる γ —ダルタミルシスティン合成酵素の阻害が解除された 変異株 (大腸菌 RC912株)を作製する。本菌株は微工研条寄第 47号として入手する ことちでさる。
[0059] 次に特開平 2- 31690号および Appl. Environ. Microbiol, 44, 1444-1448 (1982)に 記載の方法に従い、大腸菌 RC912株染色体上の γ —ダルタミルシスティン合成酵素 構造遺伝子を含む l断片を、プラスミド PBR322上にクローユングする。
さらに特開平 2- 31690号および Agric. Biol. Chem., 47, 1381-1383 (1983)に記載の 方法に従!ヽ、大腸菌 RC912株染色体上のダルタチオン合成酵素構造遺伝子を含む Hindlll断片を、プラスミド pBR322上にクローニングする。また特開平 2-31690号およ び Bioprocess TechnoL, 19, 159-183(1994)に記載の方法に従い、それら二つのクロ ーン化断片を一つのベクタープラスミド PBR325上に導入し、特開平 2-31690号または Bioprocess TechnoL, 19, 159-183(1994)に記載の pBR325- gshl'IIまたは pGS500と 同様のプラスミドを作製することもできる。該プラスミドを保有する株は FERM BP-337 株として独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに保存さ れている。 FERM BP-337株力 該プラスミドを分離し、 pGS600と命名して以下の実験 に用いた。
(2) ΠΙΕ^:損株ならびに親株へのプラスミド導入と菌体取得
E. coH BW25113株、および E. coH BW25113を親株とする nl^遺伝子欠損株である E. coH A nlpD- K株を、 pGS600を用いて塩化カルシウム法 [モレキュラークローユング 第 3版、コールドスプリングノヽーバーラボラトリープレス、 2001年]により形質転換した 。形質転^ ¾は 20 g/mlのクロラムフエ-コールを含む LB寒天プレートを用いて選 択し、それぞれ E. coH BW25113/pGS600株、および E. coH BW25113 A nlpD/pGS60 0株と命名した。
[0060] E. coH BW25113/pGS600株、および E. coH BW25113 A nlpD/pGS600株を、それぞ れ 2.5mlの 3%グルコースを含む LB液体培地（LBG培地）を用いて、 30°Cで 24時間、 振盪培養し、得られた培養物 200 μ 1を 20mlの新しい LBG培地が入った三角フラスコ に植菌し、 30°Cで 24時間、振盪培養した。培養終了時に測定した濁度 (OD 590nm)を 表上に己載し 7こ。
得られた培養物はそれぞれ遠心分離して菌体を沈殿させ、 5mlの lOOmmol/1トリス塩 酸バッファー（0°C、 pH7.4)を用いて該菌体を 2回洗浄した。得られた洗浄菌体に 200 μ 1の GT溶液 (20%グルコース、 0.4%トライトン X- 100)をカ卩えて菌体懸濁液を調製し た。
(3)ダルタチオンの生産
900 μ 1の反応液（2%グルコース、 20mmol/l硫酸マグネシウム、 20mmol/l硫酸二力 リウム、 0.22mmol/l酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、 0.14mmol/lフラビ ンモノヌクレオチド、 5mmol/lグルタミン酸、 5mmol/lシスティン、 5mmol/lグリシン、 0.4 %トライトン X- 100、 15mmol/lリン酸一カリウム、 200 mmol/1 MOPSバッファー、 pH7.8 )に、上記（2)で取得した菌体懸濁液を 100 1添加して 30°Cで 60分間振盪しながら 反応を行った。反応液中に蓄積したダルタチオンの定量は、ダルタチオン定量キット (同仁ィ匕学研究所社製)を用いて行った。結果を表 1に示す。
[0061] [表 1] 表 1
Figure imgf000024_0001
[0062] 表 1に示すとおり、 nbD遺伝子欠損株のダルタチオン生産量は、親株に比べ菌体 量の増加割合以上に多カゝつた。この結果から nbD遺伝子欠損株の ATP合成活性の 向上は、物質の生産性の向上につながることが示された。
実施例 4
[0063] nlE^遺伝子欠損株を用いたプロリン生産
(1)プロリン分解酵素遺伝子 EI 欠損株の作製
PHSG398プラスミド DNA (タカラバイオ社より購入）を铸型にし、配列番号 8および 9 で表される塩基配列力もなる DNAをプライマーセットとして用いた PCRにより、クロラ ムフエ-コール耐性遺伝子を含む DNA断片を増幅した。 PCRは、 EX- Taq (タカラバ ィォ社製）を用いて、精製プラスミド DNA 20ng、プライマー DNA各 50pmolを含む反 応液 100 1を EX-Taqに添付の指示書に従い調製し、 95°Cで 1分間保温後、 94°Cで 3 0秒間、 64°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間のサイクルを 30回繰り返した後、 72°Cで 3分間保 温するという条件で行った。増幅 DNA断片を QIA quick PCR Purification Kit (QIAG EN社製)を用いて精製し、 30 μ 1の DNA溶液を得た。
[0064] 次に、混入して 、る微量のプラスミド pHSG398を分解するため、該 DNA溶液に制 限酵素 Esilと lそれぞれを 10Uずつ添カ卩し、 37°Cで 2時間保温後、増幅 DNA断片 を QIA quick PCR Purification Kitを用いて精製し、 30 μ 1の DNA溶液を得た。
次に、該 DNA溶液 0.1 μ 1を铸型として、配列番号 10および 11で表される塩基配 列からなる DNAをプライマーセットとして用いた PCRにより、クロラムフエ-コール耐 性遺伝子を中央部に持ち、両端に m 遺伝子の 5'末端側ならびに 3'末端側と相同 な塩基配列を有する DNA断片を増幅した。 PCRは、 EX-Taqを用いて、铸型 DNA 1 0ng、プライマー DNA各 50pmolを含む 100 μ 1の反応液を EX- Taqに添付の指示書に 従い調製し、 95°Cで 1分間保温後、 94°Cで 30秒間、 51°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間の サイクルを 30回繰り返した後、 72°Cで 3分間保温するという条件で行い、増幅 DNA断 片を上記と同様の方法で精製した。
[0065] 次に、該 DNA1 μ gを用いて実施例 1と同様のエレクト口ポレーシヨンにより E. coH B W25113/pKD46株の形質転換を行った。形質転換した細胞を、 2mmol/lの IPTGを含 む lmlの SOC液体培地を用いて 30°Cで 3時間培養した後、 50 g/mlのクロラムフエ- コールを含む LB寒天プレート（LB液体培地に寒天を 1.5%含むもの。以下、 LBcm 寒天培地プレートと略す）上に塗布し、 37°Cでー晚培養した。
[0066] 生育してきた株は、 E. coH BW25113/pKD46株の染色体 DNA上の 遺伝子が クロラムフエ-コール耐性遺伝子と置換された株であることを確認し、該株を E. coH A putA-C株と命名した。
次に、 E. coH A putA-C株力 実施例 1と同様の方法で PIファージを取得した。 Ca LB液体培地で 30°C、 4時間培養した E. coH W3110株の培養液を 200 μ 1分取し、フ ァージストックを 1 μ 1添カ卩した。 37°Cで 10分間保温した後、 5mlの LB液体培地と 200 μ 1の lmol/1のクェン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。
[0067] 1500 X g、 25°Cの条件下で 10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に 1 mlの LB液体培地と 10 μ 1の lmol/1のクェン酸ナトリウム溶液を加え 30°Cで 2時間保温 した。 100 μ 1の該溶液を 50mg/lのクロラムフエ-コールを含むアンチバイオティックメ ディウム 3寒天平板培地（0.15%肉エキス、 0.15%酵母エキス、 0.5%ペプトン、 0.1%グ ルコース、 0.35%塩化ナトリウム、 0.132%リン酸水素二カリウム、 1.5%寒天、 pH7.0)に 塗布し、 30°Cで一晩培養した。
[0068] 出現したコロニー 24個をそれぞれ、 50mg/lのクロラムフエ-コールを含むアンチバイ ォテイツタメディウム 3寒天平板培地に塗布し、その薬剤感受性を確認し、クロラムフ ェ-コール耐性株を選抜することにより、 DUtA遣伝子欠損「 Δ putA::Cm1が形質導入 された E. coH W3110株を取得し、 E. coH W3110 Δ put A株と命名した。
(2) E. W3110 Δ putA株の 遺伝子欠損株の作製
実施例 1で作製した E. coH A nlpD-T株由来の PIファージストックを用いて、上記（1 )のファージによる形質導入と同様の方法にて、 E. coH A nlpD-T株由来の 遺伝 子欠損 [ A nl_pD::tet1を S. coliW3110 A putA株へ形質導入し、 20mg/lのテトラサイタリ ンに耐性を示す株として形質導入株を選択し、 E. coHW3110 Δ putA Δ nlpD株と命名 した。
(3)脱感作型 Em オペロンを保有するプラスミドの作製
(i)変異型 Em オペロンを保有するプラスミドの作製
E. coH W3110株の染色体 DNAを铸型として、配列番号 12および 13で表される塩 基配列からなる DNAをプライマーセットとして用いた PCRにより、 オペロンを含 む 4kbpの DNA断片を増幅した。 PCRは、 LA-Taqを用いて、染色体 DNA 10ng、プ ライマー DNA各 20pmolを含む 25 1の反応液を LA-Taqに添付の指示書に従い調 製し、 94°Cで 3分間保温後、 94°Cで 15秒間、 55°Cで 20秒間、 68°Cで 4分間のサイクル を 30回繰り返した後、 72°Cで 10分間保温する条件で行った。
[0069] 目的とする DNA断片が増幅されて ヽることをァガロースゲル電気泳動法にて確認 した後、該 DNA断片をゲルから切り出して精製し、 PCR-Script Cloning Kit (QIAGE N社製）を用いて、プラスミド pPCR- Script Ampにクローン化しすることで、プラスミド pP CR proBAを作製した。 QuickChange Kit (QIAGEN社製）を用いて pPCR proBAの胆 Bに点突然変異 proB74〔Gene, 64, 199-205 (1988)〕を該 Kitに添付されている指示書 に従って導入し、プラスミド pPCR proB74Aを作製した。変異点導入のために用いた プライマー DN Aの塩基配列は配列番号 14に示した。
[0070] プラスミド pPCR proB74Aを铸型にし、配列番号 15および 16で表される塩基配列か らなる DNAをプライマーとして用いて PCRを行い、 SD配列、 EamHIおよび Hiadinの 制限酵素サイトを付カ卩した proB74A遺伝子を増幅した。 PCRは Pyrobest (タカラバイ ォ社製）を用いてプラスミド DNA 100ng、プライマー DNA各 20pmolを含む 25 μ 1の反 応液を調製し、 98°Cで 2分間保温後、 98°Cで 10秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 2.5分間 のサイクルを 25回繰り返す条件で行った。
[0071] 増幅断片を精製し制限酵素 S IHI、 tlindmを用いて切断し、同じ制限酵素で処理 した pQE80 (キアゲン社製)のベクター部分をァガロースゲル電気泳動で分離し切り 出した後精製し、 TaKaRa Ligation Kitで両断片を連結し、組換え体 DNAを作製し た。該組換え体 DNAを用いて E. coH DH10B (Invitrogen社製）を形質転換し、 50 g/mlのアンピシリンを含有する LB寒天培地に塗布し、出現したコロニーよりプラスミ ドを精製した。得られたプラスミドは、 IPTGで誘導可能な脱感作型プロリン生合成酵 素遺伝子を有するプラスミドであり、 pQE80proB74Aと命名した。
[0072] E. coH W3110 A putA株、および E. coH W3110 A putA A nlpD株を、それぞれ pQE8 0proB74Aを用いて塩化カルシウム法 [モレキュラークローユング第 3版、コールドスプ リングノヽーバーラボラトリープレス、 2001年]により形質転換した。形質転換株は 50 g /mlのアンピシリンを含む LB寒天培地を用いて選択し、それぞれ E. coH A putA/pQE 80proB74A株および E. coH A putA A nlpD/pQE80proB74A株と命名した。
[0073] 上記形質転換株を、それぞれ 5mlの Med4液体培地（2%グルコース、 1%ポリぺプト ン、 0.5%バクトイーストエキストラタト、 1%塩ィ匕ナトリウム、 2%炭酸カルシウム）が入つ た試験管に植菌し、 30°Cにて 20時間、振とう培養し培養物を得た。
300 1の該培養物を、 30mlの Med7液体培地（4%グルコース、 0.8%ペプトン、 0.1 %リン酸二水素カリウム、 0.05%硫酸マグネシウム '七水和物、 0.002%塩化カルシ ゥム、 2%炭酸カルシウム、 1%硫酸アンモ-ゥム、 0.2%塩ィ匕ナトリウム、 0.03%硫酸 鉄）が入った 300ml容の三角フラスコに植菌し、 30°Cで振とう培養した。濁度（OD660n m)が 0.7に到達した段階で、 IPTGを終濃度 mol/1になるように添加した。
[0074] 培養開始から 41時間目で培養を終了し、培養物の一部をサンプリングして遠心分 離し、その上清を 1000倍に希釈してダイオネタス社製のアミノ酸直接分析システム D Xa— 500を用いて培養物中のプロリン蓄積量を測定した。結果を表 2に示す。
[0075] [表 2]
表 2
Figure imgf000027_0001
[0076] 表 2に示すとおり、 nlE^遺伝子欠損株は、対照株に比べプロリン生産性が 1.7倍以 上であった。この結果は、 遺伝子欠損株は、 ΑΤΡがその生合成経路上で直接的 に関与する物質生産のみならず、 ΑΤΡが間接的に関与する、微生物および細胞を用 いた様々な物質の生産にも利用できることを示している。
産業上の利用可能性 [0077] 本発明により、有用物質を効率よく生産することができる。 配列表フリーテキスト
[0078] 配列番号 3 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 4 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 5—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 6—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 7—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 8—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 9 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 10—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 11 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 12—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 13 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 14 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 15 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 16 人工配列の説明；合成 DNA

Claims

請求の範囲 [1] 染色体 DNA上の配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺 伝子、または配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有する蛋白 質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物を培地中で培養し、 培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物中より該有用物質を採取すること を特徴とする有用物質の製造法。 [2] 染色体 DNA上の配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺 伝子、または配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有する蛋白 質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物の培養物または該培 養物の処理物、 ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素ま たは該活性を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、炭素源、および該有 用物質の前駆物質を媒体中に共存せしめ、該媒体中に有用物質を生成、蓄積させ 、該媒体中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。 [3] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番号 2 で表される塩基配列を有する遺伝子である、請求項 1または 2記載の製造法。 [4] 微生物または細胞が以下の（1)〜（5)から選ばれる方法によって有用物質を生産す る能力が強化された微生物である、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の製造法。
(1)有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法
(2)有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法
(3)有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増加さ せる方法
(4)有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路 の少なくとも 1つを弱化または遮断する方法
(5)野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択 する方法
[¾」 微生物力 ^Azotobacter属、 Erwinia属、 Escherichia . Klebsiella属、 Methylobacillus属 、 Pseudomonas属、または Salmonella属に属する微牛.物である、請求項 1〜4のいず れか 1項に記載の製造法。 微生物力 Azotobater vinelandii, Erwinia carotovora, Escherichiacoli, Klebsiella pneu moniae. Methvlobacillus flagellatus、 Pseudomonas fluorescens. Pseudomonas putida 、または Salmonella thvpimuriumである請求項 1〜5のいずれ力 1項に記載の製造法 有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アル コール、有機酸、生理活性低分子化合物および脂質からなる群より選ばれる有用物 質である、請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の製造法。
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