WO2007037300A1 - 有用物質の製造法 - Google Patents

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WO2007037300A1
WO2007037300A1 PCT/JP2006/319243 JP2006319243W WO2007037300A1 WO 2007037300 A1 WO2007037300 A1 WO 2007037300A1 JP 2006319243 W JP2006319243 W JP 2006319243W WO 2007037300 A1 WO2007037300 A1 WO 2007037300A1
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dna
microorganism
seq
strain
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PCT/JP2006/319243
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English (en)
French (fr)
Inventor
Makoto Hibi
Hideo Mori
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing useful substances using microorganisms.
  • Patent Document 1 As a method for producing useful substances using microorganisms other than the above (1) to (3), a method for producing lysine using E. soli in which the E gene encoding a protein having an activity of reducing the growth rate is disrupted is used.
  • Patent Document 1 is known. However, in general, it is difficult to identify genes that are indirectly involved in promoting biosynthesis of useful substances or suppressing degradation.
  • Non-patent Document 4 the entire nucleotide sequence of chromosomal DNA has been clarified.
  • Non-patent Document 5 a method for deleting a specific gene or a region on a chromosomal DNA as intended by using a homologous recombination technique.
  • Non-patent document 8 There are also reports that the YhhC gene product is essential for the growth of E. coli (Patent Documents 2 and 3). On the other hand, a mutant strain in which the YhhC gene on the chromosomal DNA of Escherichia coli is disrupted has been prepared and can be obtained from Nara Institute of Science and Technology (Non-Patent Documents 9 and 10).
  • Patent Document 1 JP 2002-306191 A
  • Patent Document 2 Japanese Translation of Special Publication 2002-541819
  • Patent Document 3 Japanese Translation of Special Publication 2002-541820
  • Non-Patent Document 1 Microbial Production of L-Amino Acids, ADVANCES IN BIOCHEMI
  • Non-Patent Document 2 Nucleic Acid Fermentation, Kodansha Scientific Corporation, 1976
  • Non-Patent Document 3 J. Biosci. Bioeng. (Journal of Bioscience and Bioengineering), 90, 522 (2000)
  • Non-Patent Document 5 J. Bacteriol. (Journal of Battereriology), 180, 2063 (1998)
  • Non-Patent Document 6 Protein Nucleic Acid Enzyme, 46, 2386, 2001
  • Non-patent literature 7 Nature Biotechnol., 20, 1018
  • Non-patent literature 8 Science, 277, 1453 (1997)
  • the present invention relates to the following (1) to (6).
  • a method for producing a useful substance comprising culturing a microorganism partially or wholly deficient in a medium, producing and accumulating a useful substance in the culture, and collecting the useful substance from the culture.
  • the gene encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: The production method of (1) above, which is a gene having the base sequence represented by No. 2.
  • Fine cattle ⁇ Escherichia rot, Erwinia genus, Pseudomonas genus, Rhodobacter rot, aalmonell genus, Serratia ⁇ , Vibrio genus, Xanthomonas genus, or gila genus, (1) to (3) above No, one manufacturing method.
  • the useful substance is a useful substance selected from the group consisting of proteins, peptides, amino acids, nucleic acids, vitamins, sugars, sugar alcohols, alcohols, organic acids and lipids 1 Manufacturing methods.
  • the microorganism used in the production method of the present invention includes a gene encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 on the chromosomal DNA (hereinafter also referred to as YhbC protein), or SEQ ID NO: 1. 80% or more, preferably 90% or less with the amino acid sequence represented More preferably, it encodes a protein having homology of 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more (hereinafter sometimes referred to as YhbC protein homolog). Examples include microorganisms that are deficient in part or all of the genes to be processed.
  • the gene in the present specification includes a structural gene and a region having a specific control function such as a promoter and an operator.
  • a gene encoding a YhbC protein or a gene encoding a YhbC protein homolog (hereinafter also referred to as an ih £ gene or a homologous gene thereof) is partially or completely deleted.
  • the microorganism of the above (3) is a microorganism that does not express an active protein because a part or all of the structural gene is missing in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Partial deletion is the amino acid represented by SEQ ID NO: 1. If the protein having an acid sequence is a defect that loses its activity, it may be a deletion of one base of the structural gene part in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, preferably 5 to 100 bases in the structural gene, More preferable examples include 10 to 100 bases in the gene, and more preferable 50 to: LOO base deletion in the gene.
  • vitamins include riboflavin, thiamine, and ascorbic acid.
  • sugars include xylose.
  • sugar alcohols include xylitol. Ethanol etc. can be raised, lactic acid, succinic acid etc. can be raised as organic acid, and lipid can be raised as Examples include EPA (eicosapentaenoic acid) and DHA (docosahexaenoic acid).
  • the microorganism used in the production method of the present invention is any microorganism as long as it is a microorganism lacking a part or all of the yk £ gene or its homologous gene on the chromosomal DNA as described above.
  • the microorganism may be a prokaryotic organism, more preferably a bacterium.
  • More preferred microorganisms belonging to the genus Escherichia Erwinia deer, Pseudomonas deer, Rhodobacterfe, Salmonel genus, Serratia genus, Vibrio genus, Xanthomonas genus or ⁇ ylella genus Preferred are Escherichia coli, Erwinia carotovom, Pseudomonas putida.Pseudomonasfluo rescens.Pseudomonas aeruginosa.Rhodobacter capsulatus, Salmonella typhimurium ⁇ Serratia marcescens. be able to.
  • Microorganisms used in the production method of the present invention are (1) a method of deleting part or all of the yh £ gene or its homologous gene present on the chromosomal DNA of a microorganism capable of producing useful substances, Alternatively, (2) it can be prepared by a method of imparting productivity of useful substances to a microorganism deficient in yh £ gene on chromosomal DNA or a part or all of its homologous gene.
  • the microorganism having an ability to produce a useful substance may be any microorganism as long as it has the ability to produce one or more kinds of useful substances.
  • the strain itself and microorganisms artificially imparted with the ability to produce a desired useful substance by a known method can be mentioned.
  • the method for obtaining a microorganism lacking a part or all of the yh £ gene or its homologous gene on the chromosomal DNA as long as the microorganism can be obtained.
  • the base sequence information of the gene encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 on the microbial chromosomal DNA described below or the homologous gene of the y kC gene Can be obtained by introducing a base deletion into the yh £ gene or its homologous gene.
  • the base sequence of the homolog gene of the y kC gene is the chromosomal DNA of various microorganisms using all or part of the DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a probe.
  • the homologue of the y £ gene was identified and obtained by Southern hybridization, or the primer DNA designed based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO. After identifying and obtaining a homologous gene of y ⁇ gene by PCR, it can be determined by analyzing the base sequence of the gene by a conventional method.
  • the chromosomal DNA to be subjected to Southern hybridization and PCR may be any chromosomal DNA, preferably Escherichia, Erwinia, Pseudomona S, Rhodobacter, Salmonella, Serratia spp., Vibrio rot, Xanthomonasfe. 3; ⁇ ⁇ ylellafe 3 ⁇ 4-color DNA such as marcescens. Vibrio fischeri. Xanthomonas caDestris and Xylella fastidiosa.
  • nucleotide sequence or a part thereof can be used as a probe for Northern or Southern blot analysis, or can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis.
  • DNA used as a probe include DNA of at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more, and DNA used as a primer is at least 10 bases or more. A DNA having 15 bases or more is preferable.
  • Hybridization is preferably performed under stringent conditions!
  • the stringent conditions are: DNA-immobilized filter and probe DNA are 50% formamide, 5 X SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6). , 5 X Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 g / 1 denatured salmon sperm DNA at 42 ° C and incubated, for example, 0.2 X SSC at about 65 ° C Conditions that wash the filter in solution are preferred, but lower stringent conditions can also be used. Stringent conditions can be changed by adjusting the concentration of formamide (the lower the formamide concentration, the lower the stringent), and changing the salt concentration and temperature conditions.
  • Low stringency conditions include, for example, 6 X SSCE (20 X SSCE is 3 mol / l sodium chloride, 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4), 0.5% Incubate at 37 ° C in a solution containing SDS, 30% formamide, 100 ⁇ g / 1 denatured salmon sperm DNA, and then use 1 X SSC, 0.1% SDS solution at 50 ° C. Conditions for cleaning can be raised. Further, the lower stringent conditions may include conditions for washing after performing hybridization using a solution having a high salt concentration (for example, 5 ⁇ SSC) under the low stringent conditions described above. it can.
  • 6 SSCE (20 X SSCE is 3 mol / l sodium chloride, 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4), 0.5% Incubate at 37 ° C in a solution containing S
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used to suppress the background of the hybridization experiment.
  • the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by changes in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • the DNA that can be hybridized under the stringent conditions described above is, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 when calculated based on the above-described parameters using BLAST, FASTA, etc. And at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • nucleotide sequence of the homologous gene of yh £ gene include the vhbC generogen Shijuku IJ (Genbank accession no. BX950851) derived from Erwinia carotovora, the vhbC gene derived from Pseudomonas flu orescens Salt arrangement (Genbank accession no. AAAT00000000), vhb-derived fe + derived from Xanthomonas capestns (uenbank accession no. AE0 08922), and the like.
  • Examples of a method for introducing a base deletion into a gene on the chromosomal DNA of a microorganism include a method using homologous recombination.
  • a mutant gene introduced with a base deletion cannot replicate autonomously in the host cell into which the deletion is introduced!
  • Examples thereof include a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligation with plasmid DNA.
  • a transformant in which the plasmid for homologous recombination is incorporated into the chromosomal DNA by homologous recombination using drug resistance as an indicator. select.
  • the obtained transformed strain does not contain the drug!
  • After culturing for several hours to one day in a sputum medium it is applied to the drug-containing agar medium and the drug-free agar medium, and does not grow on the former medium.
  • a strain in which the second homologous recombination has occurred on chromosome DNA can be obtained.
  • By determining the base sequence of the region where the gene introduced with the base deletion on the chromosomal DNA is present it can be confirmed that the base deletion has been introduced into the target gene on the chromosomal DNA.
  • linear DNA containing regions existing on both sides of the region on the chromosomal DNA to be introduced into the base deletion is taken into the cell, and the chromosomal DNA is introduced into the introduced linear DNA.
  • This is a method of causing homologous recombination between the two.
  • This method can be applied to any microorganism as long as it efficiently incorporates linear DNA.
  • Preferred microorganisms are from the genus Escherichia, more preferably from Escherichia coli, and even more preferably from phages. Examples include Escherichia coli expressing a recombinant protein group (Red recombinant system).
  • pKD46 available from Escherichia coligenetic stock center (Yale University, USA)
  • Escherichia coligenetic stock center Yamamoto University, USA
  • Escherichia coli JM101 stock examples include Escherichia coli JM101 stock.
  • the linear DNA of (a) above has DNA homologous to the DNA present on both outer sides of the region on the chromosomal DNA into which the deletion of the drug resistance gene and the base is to be introduced.
  • DNA located at both ends of the above-described linear DNA, outside of both ends of the region to be introduced with the base deletion on the chromosomal DNA, or DNA having homology with the DNA is directly
  • the strand DNA is arranged in the same direction as that on the chromosomal DNA, and its length is preferably about 10 bp to 100 bp, more preferably about 20 bp to 50 bp, and more preferably about 30 to 40 bp.
  • the nucleotide sequence recognized by Flp recombinase derived from yeast is not particularly limited as long as it is recognized by the protein and catalyzes homologous recombination, but is preferably a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3. And a DNA having a base sequence in which one to several bases are deleted, substituted or added in the DNA and having a base sequence that is recognized by yeast-derived H recombinase and catalyzes homologous recombination. Can do.
  • homology means that the linear DNA has homology to such an extent that homologous recombination occurs in a target region on the chromosomal DNA.
  • Specific homology is as follows: 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 100% homology.
  • the homology of the base sequence can be determined using a program such as BLAST or FASTA.
  • the linear DNA can be prepared by PCR.
  • the target linear DNA can be obtained by treatment with a restriction enzyme.
  • Examples of methods for introducing base deletions, substitutions or additions into the chromosomal DNA of microorganisms include the following methods 1 to 4.
  • Method 1 Introduce the linear DNA (a) or (d) above into the host microorganism, and select a transformant in which the linear DNA is inserted into the chromosomal DNA by homologous recombination using drug resistance as an index. Method.
  • Method 2 The linear DNA of (b) above is introduced into the transformant obtained by Method 1 above, A method of substituting or deleting a region on a chromosomal DNA of a microorganism by deleting a drug gene inserted on the chromosomal DNA by the method.
  • the linear DNA of (c) above is introduced into a host microorganism, and a transformant in which the linear DNA is inserted into chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.
  • DNA that is homologous to DNA and ligated in the same direction as that on the chromosomal DNA is synthesized and introduced into the transformant obtained in [1] above.
  • the linear DNA of (d) above is introduced into a host microorganism, and a transformant in which the linear DNA is inserted into chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.
  • any method for introducing linear DNA into a host microorganism used in the above method any method can be used as long as it introduces DNA into the microorganism.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-2483942), electo mouth position method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)], etc. I can give you.
  • any medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism and capable of efficiently cultivating the microorganism can also use the! it can.
  • the carbon source as long as the microorganism can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, Alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium or organic acid salts.
  • Nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, and digested products thereof can be used. .
  • inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. may be used. it can.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C.
  • the culture time is usually 5-7 days.
  • pH is 3.0-9 Hold at .0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • a microorganism transformed with an expression vector using a 1 ⁇ promoter a microorganism transformed with an expression vector using an im promoter and isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalatatopyranoside is used.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • E. coH BW 25113 Ay hCllkil (hereinafter referred to as E. coH AyhbC strain) lacking the y k £ gene obtained from Nara Institute of Science and Technology.
  • E. soli W3110 strain and E. SQUMG1655 strain were transformed with the obtained phage.
  • 200 ⁇ l of the cultures of E. coH W3110 strain and E. coli MG 1655 strain cultured in Ca—LB liquid medium at 30 ° C. for 4 hours were collected and 1 ⁇ l of phage stock was added. After incubating at 37 ° C for 10 minutes, 5 ml of LB liquid medium and 200 ⁇ l of lmol / 1 sodium citrate solution were added and stirred.
  • E. coH W3110 and E. coH MG1655 strains transduced with the vhbC gene deficiency “ ⁇ vhbC :: km1” were obtained (hereinafter referred to as E. ⁇ HW3110 AyhbC strain, E. coH MG1655, respectively). AyhbC strain).
  • ⁇ of vhbC gene-deficient E. coli BW25113 AyhbC strain, E. coH W3110 AyhbC strain and E. coH MG1655 AyhbC strain was 0.34, 0.34 and 0.35, respectively.
  • the ⁇ of the parent strains E. SQHBW25113, E. coH W3110 and E. coH MG1655 were 0.31, 0.28 and 0.28, respectively. That is, all of the xhh £ gene-deficient strains showed significantly improved growth characteristics in the M9 minimal liquid medium compared to the parent strain.
  • E. coH BW25113 strain The ability to produce xylitol was given to E. coH BW25113 strain by the following method. (1) Construction of E. coH W3110red strain capable of homologous recombination on chromosomal DNA with linear DNA
  • PI phage was prepared in the same manner as in Example 1 from E. coH KM22 strain [Gene, 24 6, 321-330 (2000)] capable of homologous recombination on chromosomal DNA with linear DNA.
  • 100 1 of the solution was spread on an antibiotic medium 3 agar plate containing 20 mg / l kanamycin and cultured overnight at 30 ° C.
  • an antibiotic medium 3 agar plate containing 20 mg / l kanamycin By applying 24 colonies that appeared for each of the introduced strains to each antibiotic medium 3 agar plate containing 20 mg / l kanamycin, confirming its drug sensitivity, and selecting kanamycin resistant strains.
  • a W3110red strain was obtained in which a chromosomal DNA region [A (recC ptr recB recD) :: Plac- red kan] that enables homologous recombination on chromosomal DNA by linear DNA was transduced.
  • the lkbp DNA fragment containing the xylose reductase gene (OmJJ) was amplified by PCR using the chromosomal DNA of Kluweromvces ksik as a saddle type and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 4 and 5 as a primer set.
  • LA_Taq (Takara Bio Inc.) to prepare a 25 ⁇ l reaction solution containing 10 ng of chromosomal DNA and 20 pmol each of primer DNA according to the instructions attached to LA-Taq, and incubate at 94 ° C for 2 minutes. Thereafter, a cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute was repeated 30 times, and then the temperature was maintained at 72 ° C. for 10 minutes.
  • Plasmid pDrive-XYL1 was obtained.
  • the Shine-Dalgarno sequence and xylose vortex enzyme gene ( XV 1E ) Containing a 1.5 kbp DNA fragment.
  • XV 1E The Shine-Dalgarno sequence and xylose vortex enzyme gene
  • LA-Taq was used to prepare 25 1 reaction solution containing 10 ng of chromosomal DNA and 20 pmol each of primer DNA according to the instructions attached to LA-Taq, and incubated at 94 ° C for 2 minutes. A cycle of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1.5 minutes was repeated 30 times, and then the temperature was maintained at 72 ° C for 10 minutes.
  • the DNA fragment is also excised and purified, and cloned into plasmid pDrive using PCR Cloning Kit. Plasmid pDrive-tet was obtained.
  • DNA fragments containing mi are separated by agarose electrophoresis and gelled using QIA quick Gel Extraction Kit (QIAG EN). Recovered and purified.
  • plasmid pQE60 (manufactured by QIAGEN) was cleaved with restriction enzymes HI and ⁇ lHI and then purified using QIA quick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN). Ligation was performed using the DNA fragment containing mi and the DNA fragment of pQE60 using DNA 1 igation kit ver.2 (manufactured by Takarabio) according to the attached instructions.
  • the plasmid pDrive-xylE was cleaved with the restriction enzymes ⁇ ⁇ and ⁇ , and then the DNA fragment containing E was separated by agarose electrophoresis, followed by gelation using the QIA quick Gel Extraction Kit. Recovered and purified.
  • the plasmid pQE60 XYL1 was cleaved with the restriction enzyme ⁇ lHI and purified using the QIA quick PCR Purification Kit.
  • the DNA fragment containing xvlE and the DNA fragment of pQE60 XYL1 were ligated using the DNA ligation kit ver.2 according to the attached instructions. Thereafter, a plasmid PQE60-XYL1-xylE containing both and dE was obtained by the same method as in (0).
  • the plasmid pDrive-tet was cleaved with the restriction enzyme Ml, then the DNA fragment containing M was separated by agarose electrophoresis, and recovered from the gel using the QIA quick Gel Extraction Kit. Purified.
  • the above plasmid pQE60-XYLl-xylE was cleaved with restriction enzyme Mml and purified using QIA quick PCR Purification Kit.
  • the DNA fragment containing PQE60-XYL1-xylE was ligated using the DNA ligation kit ver.2 according to the attached instructions. Thereafter, a plasmid PQE60-XYL1-xylE-tet containing all m ⁇ ⁇ , was obtained in the same manner as in (0).
  • DNA [xylose isomerase (xvlA) gene 5 ′ terminal DNA] having a nucleotide sequence ability represented by SEQ ID NO: 12 at both ends and DNA [xylose isomerase (SEQ ID NO: 13) xvlA) DNA fragment having 3 ′ terminal DNA of gene] was amplified.
  • LA-Taq was used to prepare 25 1 reaction solution containing 10 ng of plasmid DNA and 20 pmol each of primer DNA according to the instructions attached to LA-Taq, and incubated at 94 ° C for 2 minutes. 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 5 minutes, then 10 cycles at 72 ° C It was performed under the condition of keeping warm for one minute.
  • E. coH W3110red strain was transformed with 1 ⁇ g of the DNA.
  • the transformation was performed under the same conditions as in (1) above-mentioned electoral position.
  • Transformed cells were cultured for 3 hours at 30 ° C in 1 ml of SOC liquid medium containing 2 mmol / l of isopropyl- ⁇ -D-thiogalatatoside and then containing 50 g / ml of chloramfecol. It was applied onto an LB agar plate (LB liquid medium containing 1.5% agar, hereinafter abbreviated as LBcm agar medium plate) and cultured overnight at 37 ° C.
  • LB agar plate LB liquid medium containing 1.5% agar, hereinafter abbreviated as LBcm agar medium plate
  • PI phage was prepared from E. coH W3110red A QdA: :) YLiilE strain in the same manner as in Example 1.
  • E. coH BW25113 strain and E. coH BW25113 Avhb strain were transformed with the obtained phage.
  • E. coli BW25113 AxvlA :: XYLl xvlE tet and E. coli BW25113 AvhbC :: km ⁇ xvlA :: XYLl xvlE tet strains were inoculated into test tubes containing 5 ml of LB liquid medium at 30 ° C. The culture was obtained by shaking culture for 20 hours.
  • MX liquid medium 3% glucose, 6% xylose, 0.0024% isopropyl-j8-D-thiogalatatoside, 0.6% disodium hydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.05 Inoculate in a 2000 ml jar mentorer containing 0.1% ammonium chloride, 0.1% ammonium chloride, 0.012% magnesium sulfate, 0.0015% calcium chloride, 0.0011% iron sulfate, and incubate at 30 ° C did.
  • MX liquid medium 3% glucose, 6% xylose, 0.0024% isopropyl-j8-D-thiogalatatoside, 0.6% disodium hydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.05 Inoculate in a 2000 ml jar mentorer containing 0.1% ammonium chloride, 0.1% ammonium chloride, 0.012% magnesium sulfate, 0.0015% calcium chloride, 0.0011% iron sulf
  • E.codi W3110 AyhbC strain was transformed with PI phage prepared from E. coli W3110red AxidA: :) YLl YIE strain in the same manner as in Example 3, and E. coH W3110 ⁇ bC :: km AxvlA :: XYLl xvlE strain was obtained. Further, E. coH W 3110 was transformed using the same PI phage to obtain E. coli W3110 AxvlA :: XYLl xvlE strain.
  • E. coli W3110 AxvlA :: XYLl xvlE tet strain and E. coli W3110 AvhbC :: km AxvlA :: X YL1 xvlE strain each containing 5 ml of LB liquid medium containing lOg / 1 glucose The tube was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C for 16 hours to obtain a culture.
  • SEQ ID NO: 4 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 11 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 12 Description of artificial sequence

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Abstract

　本発明によれば、染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物を用いた有用物質の製造法が提供される。

Description

有用物質の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、微生物を用いた有用物質の製造法に関する。
背景技術
[0002] 微生物を用いたアミノ酸等の有用物質の製造法はこれまで数多く報告されて 、るが 、そのほとんどは（1)有用物質の生合成酵素遺伝子の発現が強化された微生物、（2 )該遺伝子の脱感作型変異遺伝子を有する微生物、または（3)有用物質の分解酵 素遺伝子が破壊された微生物等を用いた製造法である (非特許文献 1〜3)。
上記（1)〜（3)以外の微生物を用いた有用物質の製造法としては、増殖速度を低 下させる活性を有する蛋白質をコードする E 遺伝子を破壊した E. soliを用いたリジン の製造法 (特許文献 1)が知られている。しかしながら、一般的には間接的に有用物 質の生合成の促進や分解の抑制に関与している遺伝子を特定することは困難である
[0003] 多くの微生物では、その染色体 DNAの全塩基配列が明らかになつている（非特許 文献 4)。また、相同組換え手法を用いて、微生物の染色体 DNA上にある特定の遺 伝子または染色体 DNA上の領域を意図した通りに欠損させる方法は知られて 、る ( 非特許文献 5)。また染色体 DNAの全塩基配列情報、および相同組換え手法を利 用して微生物の染色体 DNA上の各遺伝子を網羅的に破壊した変異株ライブラリ一 、および 20kbp程度の削除可能な染色体 DNA上の領域のそれぞれを網羅的に欠 損させた変異株ライブラリーなども作製されて ヽる (非特許文献 6および 7)。
[0004] E. soliが持つ機能未知遺伝子の一つ YhhC遺伝子の塩基配列は既に知られている
(非特許文献 8)。また、 YhhC遺伝子産物が大腸菌の生育にとって必須であるという 報告もある（特許文献 2、および 3)。一方で大腸菌の染色体上 DNA上の YhhC遺伝 子を破壊した変異株が作製されており、奈良先端科学技術大学院大学より入手する ことが可能である (非特許文献 9、 10)。
[0005] しかしながら、染色体 DNA上の x hC遺伝子の一部または全部が欠損した E. £diの 有用物質の生産性が向上することは知られて 、な 、。
特許文献 1：特開 2002-306191号公報
特許文献 2：特表 2002-541819号公報
特許文献 3：特表 2002-541820号公報
非特許文献 1： Microbial Production of L- Amino Acids, ADVANCES IN BIOCHEMI
CAL ENGINEERING BIOTECHNOLOGY, vol.79 (2003), Springer
非特許文献 2 :核酸発酵、講談社サイェンティフイク社、 1976年発行
非特許文献 3 :J. Biosci. Bioeng. (ジャーナル ォブ バイオサイエンス アンド バイ ォエンジニアリング）， 90, 522 (2000)
特干文献 4： http://www.tigr.org/ tdb/ mdb/ mdbcomplete.html
非特許文献 5 :J. Bacteriol. (ジャーナル ォブ バタテリォロジ一）， 180, 2063 (1998) 非特許文献 6 :蛋白質 核酸 酵素、第 46卷、 2386ページ、 2001年
非特許文献 7 : Nature Biotechnol. (ネイチヤー バイオテクノロジー）， 20, 1018 (2002) 非特許文献 8 : Science (サイエンス）， 277, 1453 (1997)
特干文献 9： http:// ecoli.aist-nara.ac.jp/ uB5/ search, jsp
特干文献 10： http:/ノ www.shigen.nig.ac.jp/ ecoli/ strain/ deletionQueryAction.do 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、有用物質の生産性が向上した微生物を用いた有用物質の製造 法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は、以下の（1)〜（6)に関する。
(1)染色体 DNA上の配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードす る遺伝子、または配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有する 蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物を培地に培養し 、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取すること を特徴とする有用物質の製造法。
(2)配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番 号 2で表される塩基配列を有する遺伝子である、上記（1)の製造法。
(3)微生物が以下の [ 1]〜 [5]から選ばれる方法によって有用物質を生産する能力 が強化された微生物である、上記（1)または (2)の製造法。
[1]有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法 [2]有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法
[3]有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増加さ せる方法
[4]有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路 の少なくとも 1つを弱化または遮断する方法
[5]野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択 する方法
,4)微牛.物:^ Escherichia腐、 Erwinia属、 Pseudomonas属、 Rhodobacter腐、 aalmonell 属、 Serratia厲、 Vibrio属、 Xanthomonas属、または gila属に属する微生物である、 上記（1)〜（3)の!、ずれか 1つの製造法。
(5)微牛.物:^ Escherichia coli、 Erwinia carotovora. Pseudomonas putida. Pseudomon as fluorescens. Pseudomonas aeruginosa. Rhodobacter capsulatus. Salmonella typhi murium. Serratia marcescens. Vibriofischeri、 Xanthomonas capestrisまたは Xylella fe stidiosaである、上記（1)〜（4)のいずれか 1つの製造法。
(6)有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、 アルコール、有機酸および脂質力もなる群より選ばれる有用物質である、上記（1)〜 (5)のいずれか 1つの製造法。
発明の効果
[0008] 本発明により、有用物質を効率よく製造することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 1.本発明の製造法に用いられる微生物
本発明の製造法に用いられる微生物としては、染色体 DNA上の配列番号 1で表さ れるアミノ酸配列を有する蛋白質 (以下、 YhbC蛋白質と称することもある）をコードす る遺伝子、または配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 90%以 上、より好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 97%以上、特に好ましくは 98%以上、 最も好ましくは 99%以上の相同性を有する蛋白質 (以下、 YhbC蛋白質ホモログと称 することもある）をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物をあげる ことができる。なお、本明細書中での遺伝子とは、構造遺伝子およびプロモーター、 オペレーターなどの特定の制御機能を有する領域を含んでいる。
[0010] アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAS T[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods EnzymoL, 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLAST Nや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol, 215, 403(1990)]。 BLASTに基づ 、て BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例 えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによって アミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えば score=50、 wordlength=3と する。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフオル トパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http：〃 www. ncbi.nlm.nih.gov.)。
[0011] YhbC蛋白質をコードする遺伝子、または YhbC蛋白質ホモログをコードする遺伝子（ 以下、 i h£遺伝子またはそのホモログ遺伝子と称することもある）の一部または全部 が欠損して 、るとは、染色体 DNA上の該遺伝子の塩基配列中に塩基の欠失がある ため、（i)i h£遺伝子またはそのホモログ遺伝子プロモーターまたはオペレーター などの転写制御が機能せず、 YhbC蛋白質またはそのホモログ蛋白質を発現しない 微生物、（2)y h£遺伝子またはそのホモログ遺伝子中の構造遺伝子にフレームシフ トが生じ、 YhbC蛋白質またはそのホモログ蛋白質が活性ある蛋白質として発現しな い微生物、（3)y h£遺伝子またはそのホモログ遺伝子中の構造遺伝子の一部また は全部が欠損しているため活性ある蛋白質を発現しない微生物、などをあげることが でき、好ましくは（3)の微生物をあげることができる。
[0012] 上記（3)の微生物として、より具体的には、配列番号 2で表される塩基配列におい て、構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため活性ある蛋白質を発現しない 微生物をあげることができる。一部が欠損しているとは、配列番号 1で表されるァミノ 酸配列を有する蛋白質がその活性を喪失する欠損であれば、配列番号 2で表される 塩基配列中の構造遺伝子部分の 1塩基の欠失でもよぐ好ましくは構造遺伝子中の 5〜100塩基、より好ましくは該遺伝子中の 10〜100塩基、さらに好ましくは該遺伝 子中の 50〜： LOO塩基の欠失などをあげることができる。
[0013] 本発明の製造法で用いられる微生物が生産する有用物質は、微生物が生産するこ とができる工業上有用とされて 、る物質であれば 、ずれでもよく、好ましくはタンパク 質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸およ び脂質などをあげることができ、より好ましくはタンパク質としては、イノシンキナーゼ、 lutamate 5— kinase (EC 2.7.2.丄丄)、（jlutamate— 5— semialdehyde dehydrogenase (ti, C 1.2.1.41)、 Pyrroline- 5- carboxylate reductase (EC 1.5.1.2)、 Xylose reductase^ P4 50、ヒト顆粒球コロニー刺激因子などをあげることができ、ペプチドとしてはダルタチ オンなどをあげることができ、アミノ酸としては、 L—ァラニン、グリシン、 L—グルタミン 、 L—グルタミン酸、 L—ァスパラギン、 L—ァスパラギン酸、 L—リジン、 L—メチォ- ン、 L—スレオニン、 L—ロイシン、 L—パリン、 L—イソロイシン、 L—プロリン、 L—ヒス チジン、 L—アルギニン、 L—チロシン、 L—トリプトファン、 L—フエ二ルァラニン、 L— セリン、 L—システィン、 L— 3—ヒドロキシプロリン、 L— 4ーヒドロキシプロリンなどをあ げることができ、核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グァニル酸などをあ げることができ、ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、ァスコルビン酸などをあげる ことができ、糖としては、キシロースなどをあげることができ、糖アルコールとしては、キ シリトールなどをあげることができ、アルコールとしては、エタノールなどをあげることが でき、有機酸としては乳酸、コハク酸などをあげることができ、脂質としては、 EPA (エイ コサペンタエン酸)や DHA (ドコサへキサェン酸）などをあげることができる。
[0014] また、本発明の製造法で用いられる微生物は、上記したように染色体 DNA上の y k£遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損している微生物であ れば、いずれの属に属する微生物であってもよぐ好ましくは原核生物、より好ましく は細菌をあげることができる。
糸田菌として Escherichia Erwinia鹿、 Pseudomonas鹿、 Rhodobacterfe、 Salmonel 属、 Serratia属、 Vibrio属、 Xanthomonas属、または^ ylella属に属する微生物、より好 ましくは Escherichia coli、 Erwinia carotovom、 Pseudomonas putida. Pseudomonasfluo rescens. Pseudomonas aeruginosa. Rhodobacter capsulatus、 Salmonella typhimurium ゝ Serratia marcescens. Vibrio fischeri. Xanthomonas capestris.および Xylella fastidi などをあげることができ、さらに好ましくは E. をあげることができる。
2.本発明の製造法に用いられる微生物の調製
本発明の製造法に用いられる微生物は、（1)有用物質を生産する能力を有する微 生物の染色体 DNA上に存在する y h£遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部ま たは全部を欠損させる方法、または（2)染色体 DNA上の y h£遺伝子またはそのホ モログ遺伝子の一部または全部が欠損した微生物に、有用物質の生産性を付与す る方法により調製することができる。
[0015] 有用物質を生産する能力を有する微生物は、 1種以上の有用物質を生産する能力 を有する微生物であればいずれの微生物であってもよぐ該微生物としては自然界 から分離された株自身が該能力を有する場合は該株そのもの、および公知の方法に より所望の有用物質を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることが できる。
当該公知の方法としては、
(a)有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法、
(b)有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法、
(c)有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増加さ せる方法、
(d)有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の 少なくとも 1つを弱化または遮断する方法、および
(e)野生型株に比べ、有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する 方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることがで きる。
[0016] 上記 (a)〜（e)の具体的な方法は、例えば有用物質がアミノ酸である場合について は、上記（a)の方法に関しては Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、 J. BacterioL, 110, 761- 763(1972)および Appl. Microbiol. BiotechnoL, 39, 318- 323(1993)などに 記載されている。上記（b)の方法に関しては、 Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979) および J. BacterioL, 110, 761-763(1972)などに記載されている。上記（c)の方法に関 しては、 Appl. Microbiol. BiotechnoL, 39, 318- 323(1993)および Agric. Biol. Chem., 3 9, 371-377(1987)などに記載されている。上記（d)の方法に関しては、 Appl. Environ.
MicribioL, 38, 181- 190(1979)および Agric. Biol. Chem., 42, 1773- 1778(1978)など に記載されている。上記（e)の方法に関しては、 Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684( 1972)、 Agric. Biol. Chem., 41, 109—116(1977)、 Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1 973)および Agric. Biol. Chem., 51, 2089- 2094(1987)などに記載されている。上記文 献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することがで きる。
[0017] さらに上記 (a)〜（e)のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄 積する能力を有する微生物の調製方法については、 Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (Vし H Verlagsgesellschaft mbH, Weinneim, 1996) s ection 14a, 14bや Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1—35 (20 03)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（1986)に多くの例が記載されてお り、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製 方法は、特開 2003- 164297、 Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、 Agric. Biol. C hem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭 58- 13599、 J. Gen. Appl. Microbiol, 4, 272-283 (1958)、特開昭 63- 94985、 Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、 W097/15673, 特開昭 56-18596、特開昭 56-144092および特表 2003-511086など数多くの報告があ り、上記文献等を参照することにより 1種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生 物を調製することができる。
[0018] アミノ酸以外の有用物質を生産する能力を微生物に付与する方法もまた、多くの報 告があり、従来知られているすべての方法は、本発明の製造法に用いられる微生物 の調製に用いることができる。
染色体 DNA上の y h£遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損 した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが 、例えば下記した微生物の染色体 DNA上の配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有 する蛋白質をコードする遺伝子、または y kC遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列情 報を利用して、微生物の染色体 DNA上にある y h£遺伝子またはそのホモログ遺伝 子に塩基の欠失を導入する方法により取得することができる。
[0019] y kC遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列は、配列番号 2で表される塩基配列と相 補的な塩基配列を有する DNAの全部または一部をプローブに用いた、各種微生物 の染色体 DNAに対するサザンハイブリダィゼーシヨンにより y £遺伝子のホモログ 遺伝子を同定、取得し、または配列番号 2で表される塩基配列に基づき設計したブラ イマ一 DNAを用い、各種微生物の染色体 DNAを铸型とした PCRにより y ^遺伝 子のホモログ遺伝子を同定、取得した後、常法により該遺伝子の塩基配列を解析す ること〖こより決定することができる。
[0020] サザンハイブリダィゼーシヨンおよび PCRに供する染色体 DNAは、いずれの微生 物の染色体 DNAであってもよく、好ましくは、 Escherichia属、 Erwinia属、 Pseudomona S属、 Rhodobacter属、 Salmonella属、 serratia属、 Vibrio腐、 Xanthomonasfe. 3;た ί Χ ylellafe〖こ する 1激牛 より奸 3:しくは Escherichia coli、 Erwinia carotovora. Pseudo monas putida. Pseudomonas fluorescens. Pseudomonas aeruginosa. Rhodobacter cap sulatus、 Salmonella tvphimurium. Serratia marcescens. Vibrio fischeri. Xanthomonas caDestrisおよび Xylella fastidiosaなどの ¾色体 DNAをあげるこ ができる。
[0021] 上記で!/、う「ノヽイブリダィゼーシヨン」とは、特定の塩基配列を有する DNAまたは該 DNAの一部に DNAがハイブリダィズすることである。したがって、該特定の塩基配 列を有する DNAまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブと して用いることができ、また PCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる DNAである。プローブとして用いられる DNAとしては、少なくとも 100塩基以上、好 ましくは 200塩基以上、より好ましくは 500塩基以上の DNAをあげることができ、プラ イマ一として用いられる DNAとしては、少なくとも 10塩基以上、好ましくは 15塩基以 上の DNAをあげることができる。
[0022] DNAのハイブリダィゼーシヨン実験の方法はよく知られており、例えば当業者であ れば本願明細書に従い、ハイブリダィゼーシヨンの条件を決定することができる。該 ハイブリダィゼーシヨンの条件は、モレキュラー 'クローユング第 2版、第 3版（2001年 )、 Methods for General ana Molecular Bacteriolgy, ASM Press (1994)、 Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科 書に従っておこなうことができる。
[0023] ハイブリダィゼーシヨンはストリンジェントな条件下で行うことが好まし!/、。ストリンジェ ントな条件とは、 DNAを固定化したフィルターとプローブ DNAとを 50%ホルムアミド、 5 X SSC (750mMの塩化ナトリウム、 75mMのクェン酸ナトリウム）、 50mMのリン酸ナトリ ゥム（pH7.6)、 5 Xデンハルト溶液、 10%の硫酸デキストラン、および 20 g/1の変性さ せたサケ精子 DNAを含む溶液中で 42°Cでー晚、インキュベートした後、例えば約 65 °Cの 0.2 X SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリン ジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃 度調整 (ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジヱントになる）、塩濃度および温 度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば 6 X SSCE (20 X SSCEは、 3mol/lの塩化ナトリウム、 0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、 0.02mol/lの EDTA、 pH7.4)、 0.5%の SDS、 30%のホルムアミド、 100 μ g/1の変性させたサケ精子 DNAを含む溶液中で、 37°Cでー晚インキュベートした後、 50°Cの 1 X SSC、 0.1%SDS 溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな 条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度 (例えば 5 X SSC) の溶液を用いてハイブリダィゼーシヨンを行った後、洗浄する条件をあげることができ る。
[0024] 上記した様々な条件は、ノ、イブリダィゼーシヨン実験のバックグラウンドを抑えるた めに用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。 上記したブロッキング試薬の添カ卩は、条件を適合させるために、ハイブリダィゼーショ ン条件の変更を伴ってもょ 、。
上記したストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズ可能な DNAとしては、例えば上 記した BLASTや FASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づ 、て計算したときに、 配列番号 2で表される塩基配列と少なくとも 90%以上、好ましくは 95%以上、より好 ましくは 97%以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以上の相同性を 有する DNAをあげることができる。
[0025] 具体的な y h£遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列としては、 Erwinia carotovora由 来の vhbC遣伝子の塩某配歹 IJ (Genbank accession no. BX950851)、 Pseudomonas flu orescens由来の vhbC遣伝子の塩某配列（Genbank accession no. AAAT00000000)、 Xanthomonas capestns由来の vhbし遣 fe+の塩 酉列 (uenbank accession no. AE0 08922)などをあげることができる。
[0026] 微生物の染色体 DNA上の遺伝子に塩基の欠失を導入する方法としては、相同組 換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法とし ては、塩基の欠失が導入された変異遺伝子を、該欠失の導入対象である宿主細胞 内では自立複製できな!/ヽ薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド DNAと連結して作製で きる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。
[0027] 該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標に して相同組換えによって染色体 DNA上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形 質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しな!ヽ培地で数時間〜 1 日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、 前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体 DN A上において 2回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体 DNA 上の塩基の欠失を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染 色体 DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失が導入されたことを確認することができる。
[0028] 上記方法により、染色体 DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失を導入することができ る微生物としては、例えばェシエリヒア属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失を導入する相同組換えを利用した方法 としては、直鎖 DNAを用いた方法をあげることができる。
具体的には、塩基の欠失の導入対象である染色体 DNA上の領域の両外側に存 在する領域を含有する直鎖 DNAを細胞内に取り込ませ、染色体 DNAと導入した直 鎖 DNAとの間で相同組換えが起こさせる方法である。本方法は、直鎖 DNAを効率 よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物として はェシエリヒア属、より好ましくはェシエリヒア'コリ、さらに好ましくはえファージ由来の 組換えタンパク質群 (Red組換え系）を発現しているェシエリヒア'コリをあげることがで きる。
[0029] λ Red組換え系を発現しているェシエリヒア'コリとしては、 λ Red組換え系遺伝子 を有するプラスミド DNAである pKD46 [ェシエリヒア'コリジェネティックストックセンタ 一（米国エール大学)より入手可能]を保有するェシエリヒア'コリ JM101株等をあげる ことができる。
相同組換えに用いられる DNAとしては、
(a)塩基の欠失の導入対象である染色体 DNA上の領域の両外側に存在する DNA または該 DNAと相同性を有する DNAを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖 DN A、
(b)塩基の欠失の導入対象である染色体 DNA上の領域の両外側に存在する DNA または該 DNAと相同性を有する DNAを直接連結した直鎖 DNA、
(c)塩基の欠失の導入対象である染色体 DNA上の領域の両外側に存在する DNA または該 DNAと相同性を有する DNAを、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレク シヨンに用いることができる遺伝子を有する DNAの両端に有する直鎖 DNA、および
(d)上記 (a)の直鎖 DNAにお 、て、薬剤耐性遺伝子と塩基の欠失の導入対象であ る染色体 DNA上の領域の両外側に存在する DNAまたは該 DNAと相同性を有する DNAの間に、さらに酵母由来の Flp recombinase [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 5 875 (1985)〕が認識する塩基配列を有する DNA、
などをあげることができる。
[0030] 薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付 与する薬剤耐性遺伝子であれば、 ヽずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる 。宿主微生物にェシエリヒア'コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば 、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフエ-コール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺 伝子、スぺクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリ ン耐性遺伝子等をあげることができる。
[0031] ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を 発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のこ とをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来の^遺伝子〔
Appl. Environ. Microbiol, 59, 1361- 1366 (1993)〕、およびェシエリヒア属に属する微 生物由来の 遺伝子 [Genomics, 72, 99-104(2001)〕等をあげることができる。
[0032] 上記の直鎖 DNAの両末端に存在する、染色体 DNA上の塩基の欠失の導入対象 となる領域の両端の外側に位置する DN Aまたは該 DNAと相同性を有する DNAは 、直鎖 DNAにおいて、染色体 DNA上の方向と同じ方向に配置され、その長さは 10b p〜100bp程度が好ましぐ 20bp〜50bp程度がより好ましぐ 30〜40bp程度がさらに好 ましい。
酵母由来の Flp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組 換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号 3で表 される塩基配列を有する DNA、および該 DNAにおいて 1個〜数個の塩基が欠損、 置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来の Hp recombinaseが認識し、 相同組換えを触媒する塩基配列を有する DNAをあげることができる。
[0033] 相同性を有するとは、上記直鎖 DNAが、染色体 DNA上の目的とする領域におい て、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては 、 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 100% の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記した BLASTや FASTA等のプログラムを用いて決定 することができる。
[0034] 上記直鎖 DNAは、 PCRにより作製することができる。また上記直鎖 DNAを含む D NAをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖 DNAを得ることも できる。
微生物の染色体 DNAに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、 以下の方法 1〜4があげられる。
方法 1：上記 (a)または (d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に 該直鎖 DNAが染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択す る方法。
方法 2：上記方法 1により取得された形質転換株に、上記 (b)の直鎖 DNAを導入し、 該方法により染色体 DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物 の染色体 DNA上の領域を置換または欠失させる方法。
方法 3 :
[ 1 ]上記 (c)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]染色体 DNA上の塩基の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置する
DNAと相同性を有する DN Aを、染色体 DNA上における方向と同一の方向で連結 した DNAを合成し、上記 [ 1 ]で得られた形質転換株に導入する、
[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、 上記 [2]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬 剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体 D
NA上から削除された株として選択する方法。
方法 4 :
[ 1 ]上記 (d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]上記 [ 1 ]で得られた形質転^ に Hp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入 し、該遺伝子を発現させた後、上記 [1]で用いた薬剤に感受性である株を取得する 方法。
[0035] 上記方法で用いられる、直鎖 DNAを宿主微生物に導入する方法としては、該微生 物へ DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムィ オンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（ 特開昭 63- 2483942)、エレクト口ポレーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988) 〕等をあげることができる。
[0036] 方法 2または方法 3 [2]で用いられる直鎖 DNAにおいて、該 DNAの中央部付近に 、染色体 DNA上に挿入した 、任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖 DNAを用いること により、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体 DNA上 に挿入することができる。
上記方法 2〜4では、最終的に得られる形質転換株の染色体 DNA上には薬剤耐 性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子 を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およ びネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り 返すことにより、容易に染色体 DNA上の位置の異なる 2以上の領域に塩基の欠失等 を有する微生物を製造することができる。
3.本発明の有用物質の製造法
上記 2の本発明の製造法に用いられる微生物を培地に培養し、培養物中に有用物 質を生成、蓄積させ、該培養物から有用物質を採取することにより、該有用物質を製 造することができる。
[0037] 該微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従 つて行うことができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生 物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の!/ヽずれも用いること ができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース 、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭 水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール 類等を用いることができる。
[0038] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカ一、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化 物等を用いることができる。
[0039] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは 3.0〜9 .0に保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ ゥム、アンモニア等を用いて行う。
[0040] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添カロしてちょい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 1 ^プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル一 β—D—チォガラタトピラノシド等を、 imプロモーターを用いた発 現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地 に添カ卩してもよい。
[0041] 培養物中に生成、蓄積した有用物質の採取は、活性炭やイオン交換榭脂などを用 いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高 速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、 以下の実施例における DNA操作等に関する方法は、 Molecular Cloning, A Laborat ory Manual, Third Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press (2001)に己載の方 法を適宜用いることができる。
実施例 1
[0042] y k£遺伝子欠損株の造成
奈良先端科学技術大学院大学より入手した y k£遺伝子が欠損している E. coH BW 25113 Ay hCllkil (以下、 E. coH AyhbC株と表記する)より PIファージストックを以下 の方法により調製した。
E. coH AyhbC株を 20mg/lのカナマイシンを含む LB液体培地 [lOg/1バクトトリプト ン (ディフコ社製)、 5g/lバクトイーストエキストラタト (ディフコ社製)、 5g/l塩化ナトリウ ム、 lml/1の割合で lmol/1水酸ィ匕ナトリウムを添加]を用いて 30°Cにてー晚培養した 後、そこから 0.5mlの培養物をとり、 1.4mlの新しい LB液体培地、および 100 1の 0.1m ol/lの塩ィ匕カルシウム溶液とを加え混合した。
[0043] 該混合溶液を 30°Cで 5〜6時間振とう培養した後、 400 μ 1の該混合液を滅菌したチ ユーブに移した。そこに 2 1の PIファージストック溶液を添カ卩し、 37°Cで 10分間保温 した後、 50°Cに保温したソフトァガー溶液（lOg/1バタトトリプトン、 5g/lバクトイースト エキストラタト、 5mmol/l塩化カルシウム、 3g/l寒天、 lml/1の割合で lmol/1水酸化ナ トリウムを添加）を 3ml添加して、よく攪拌し、 Ca— LB寒天培地プレート（lOg/1ノクトト リプトン、 5g/lバクトイーストエキストラタト、 5mmol/l塩化カルシウム、 15g/l寒天、 1ml /1の割合で lmol/1水酸ィ匕ナトリウムを添加。プレートの直径は 15cm)上にまいた。
[0044] 該プレートを 37°Cで 7時間培養した後、スプレッダ一でソフトァガ一部分を細力べ砕 いて回収し、 1500 X g、 4°Cの条件下で 10分間遠心分離した。上清 1.5mlに対し 100 1 のクロ口ホルムを添カ卩し、 4°Cにてー晚保存した。翌日、溶液を 15000 X gにて 2分間遠 心分離し、上清をファージストツクとして 4°Cで保存した。
次に、取得したファージを用いて E. soli W3110株および E. SQUMG1655株を形質転 換した。 Ca—LB液体培地で 30°C、 4時間培養した E. coH W3110株および E. coliMG 1655株の培養物を 200 μ 1分取し、ファージストックを 1 μ 1添カ卩した。 37°Cで 10分間保 温した後、 5mlの LB液体培地と 200 μ 1の lmol/1のクェン酸ナトリウム溶液を添カ卩し、攪 拌した。
[0045] 1500 X g、 25°Cの条件下で 10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に 1 mlの LB液体培地と 10 μ 1の lmol/1のクェン酸ナトリウム溶液を加え 30°Cで 2時間保温 した。 100 1の該溶液を 20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム 3 寒天平板培地（0.15%肉エキス、 0.15%酵母エキス、 0.5%ペプトン、 0.1%グルコース 、 0.35%塩化ナトリウム、 0.132%リン酸水素二カリウム、 1.5%寒天、 pH7.0)に塗布し、 3 0°Cでー晚培養した。
[0046] 各々の欠損導入株毎に出現したコロニー 24個をそれぞれ、 20mg/lのカナマイシン を含むアンチバイオティックメディウム 3寒天平板培地に塗布し、その薬剤感受性を 確認し、カナマイシン耐性株を選抜することにより、 vhbC遣伝子欠損「 Δ vhbC::km1 が形質導入された E. coH W3110株および E. coH MG1655株を取得した（以下、それ ぞれ E. ^HW3110 AyhbC株、 E. coH MG1655 AyhbC株と標記する）。
実施例 2
[0047] YhhC欠損株の生育特性の解析 E. coH BW25113 AyhbC株、 E. £2liW3110 AyhbC株および E. coH MG1655 AyhbC 株、並びに対照株である E. £2liBW25113株、 E. coH W3110株および E. coH MG1655 株を、それぞれ 5mlの LB液体培地を入れた試験管に植菌し、 30°Cにて 20時間、振と う培養し培養物を得た。 50 1の該培養物を、 5mlの M9液体培地（1%グルコース、 0. 6% リン酸水素ニナトリウム、 0.3% リン酸二水素カリウム、 0.05% 塩ィ匕ナトリウム、 0.1% 塩化アンモ-ゥム、 0.012% 硫酸マグネシウム、 0.0015% 塩化カルシウム、 0 .0011% 硫酸鉄）が入った L字試験管に植菌し、 30°Cで振とう培養した。培養開始か ら 10分毎に濁度（660nmにおける吸光度。以下、 OD660nmと記載する）を測定したと ころ、 OD660nmの値が 0.3〜 1.0の範囲に納まる期間は対数増殖期であることが確認 され、その期間の比増殖速度 [= A ln(OD660nm)/ A培養時間]を算出した。
[0048] vhbC遣伝子欠損株である E. coli BW25113 AyhbC株、 E. coH W3110 AyhbC株お よび E. coH MG1655 AyhbC株の μはそれぞれ 0.34、 0.34、 0.35であったのに対して、 各菌株の親株である E. SQHBW25113株、 E. coH W3110株および E. coH MG1655株の μはそれぞれ 0.31、 0.28、 0.28であった。すなわち、全ての xhh£遺伝子欠損株は、親 株と比較して、 M9最少液体培地での生育特性が大幅に向上して 、た。
[0049] 以上の結果より、 i h£遺伝子が欠損した微生物を用いることにより、有用物質を効 率よく製造することができることが明ら力となった。
実施例 3
[0050] キシリトール生産株の造成
E. coH BW25113株にキシリトールを生産する能力を以下の方法により付与した。 (1)直鎖 DNAによる染色体 DNA上の相同組換えが可能な E. coH W3110red株の造 成
直鎖 DNAによる染色体 DNA上の相同組換えが可能な E. coH KM22株 [Gene, 24 6, 321-330 (2000)]より PIファージを実施例 1と同様の方法により調製した。
[0051] 次に、取得したファージを用いて E. coH W3110株を形質転換した。 Ca— LB液体培 地で 30°Cで 4時間培養した E. coH W3110株の培養物を 200 μ 1分取し、ファージストツ クを 1 μ 1添カ卩した。 37°Cで 10分間保温した後、 5mlの LB液体培地と 200 μ 1の lmol/1の クェン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。 1500g、 25°Cの条件下で 10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に lml の LB液体培地と 10 μ 1の lmol/1のクェン酸ナトリウム溶液をカ卩ぇ 30°Cで 2時間保温し た。 100 1の該溶液を 20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム 3 寒天平板培地に塗布し、 30°Cで一晩培養した。各々の欠損導入株毎に出現したコロ ニー 24個をそれぞれ、 20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム 3 寒天平板培地に塗布し、その薬剤感受性を確認し、カナマイシン耐性株を選抜する ことにより、直鎖 DNAによる染色体 DNA上の相同組換えを可能とする染色体 DNA 領域 [ A (recC ptr recB recD)::Plac- red kan]が形質導入された W3110red株を取得 した。
(2)キシリトール生産遺伝子群導入株の造成
(i)キシロースレダクターゼ遺伝子の単離
Kluweromvces ksikの染色体 DNAを铸型として、配列番号 4および 5で表される 塩基配列からなる DNAをプライマーセットとして用いた PCRにより、キシロースレダク ターゼ遺伝子 OmJJ)を含む lkbpの DNA断片を増幅した。 PCRは、 LA_Taq (タカラ バイオ社製）を用いて、染色体 DNA 10ng、プライマー DNA各 20pmolを含む 25 μ 1 の反応液を LA-Taqに添付の指示書に従い調製し、 94°Cで 2分間保温後、 94°Cで 30 秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間のサイクルを 30回繰り返した後、 72°Cで 10分間保 温する条件で行った。
目的とする DNA断片が増幅されて ヽることをァガロースゲル電気泳動法にて確認 した後、該 DNA断片をゲル力 切り出して精製し、 PCR Cloning Kit (QIAGEN社製） を用いて、プラスミド pDrive (QIAGEN社製）にクローン化することで、プラスミド pDrive- XYL1を取得した。
(ii)キシロース透過酵素遺伝子の導入
E. の染色体 DNAを铸型として、配列番号 6および 7で表される塩基配列からな る DNAをプライマーセットとして用いた PCRにより、シャインダルガーノ配列およびキ シロース诱渦酵素遣伝子 (XV1E)を含む 1.5kbpの DNA断片を増幅した。 PCRは、 LA - Taqを用いて、染色体 DNA 10ng、プライマー DNA各 20pmolを含む 25 μ 1の反応 液を LA-Taqに添付の指示書に従い調製し、 94°Cで 2分間保温後、 94°Cで 30秒間、 5 5°Cで 30秒間、 72°Cで 1.5分間のサイクルを 30回繰り返した後、 72°Cで 10分間保温す る条件で行った。
[0053] 目的とする DNA断片が増幅されて ヽることをァガロースゲル電気泳動法にて確認 した後、該 DNA断片をゲル力も切り出して精製し、 PCR Cloning Kitを用いて、プラス ミド pDriveにクローン化することで、プラスミド pDrive-xylEを取得した。
(iii)テトラサイクリン耐性遺伝子の単離
TnlOトランスポゾンを染色体 DNA上に持つ E. coH CGSC7465株（米国 Yale大学で 運営されている Coli Genetic Stock Centerから入手可能）の染色体 DNAを铸型とし て、配列番号 8および 9で表される塩基配列力 なる DNAをプライマーセットとして用 いた PCRにより、テトラサイクリン耐性遺伝子 ( )を含む 1.5kbpの DNA断片を増幅し た。
[0054] PCRは、 LA- Taqを用いて、染色体 DNA 10ng、プライマー DNA各 20pmolを含む 25 1の反応液を LA-Taqに添付の指示書に従い調製し、 94°Cで 2分間保温後、 94°C で 30秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 1.5分間のサイクルを 30回繰り返した後、 72°Cで 10 分間保温する条件で行った。
目的とする DNA断片が増幅されて ヽることをァガロースゲル電気泳動法にて確認 した後、該 DNA断片をゲル力も切り出して精製し、 PCR Cloning Kitを用いて、プラス ミド pDriveにクローン化することで、プラスミド pDrive-tetを取得した。
(iv) pQE60-XYLl-xylE-tetプラスミドの造成
プラスミド pDrive-XYLlを制限酵素^ I、 ^ lHIを用いて切断した後、ァガロース電 気泳動法にて miを含む DNA断片を分離し、 QIA quick Gel Extraction Kit (QIAG EN社製)を用いてゲルから回収、精製した。同様にプラスミド pQE60 (QIAGEN社製） を制限酵素 HI、 ^ lHIを用いて切断した後、 QIA quick PCR Purification Kit (QI AGEN社製）を用いて精製した。 miを含む DNA断片と pQE60の DNA断片を DNA 1 igation kit ver.2 (タカラバィォ社製)を用いて添付の指示書に従いライゲーシヨンを行 つた o
[0055] 10 μ 1のライゲーシヨン反応溶液と 100 μ 1の Ε. coH JM109コンビテントセル（タカラバ ィォ社製)を混合して 20分間氷上で保温後、 42°Cで 30秒間、氷上で 2分間保温した。 混合液に lmlの SOC液体培地をカ卩え、この内 100 μ 1を 20mg/lのアンピシリンを含む LB 寒天培地に塗布し 30°Cでー晚培養した。出現したコロニーより miを含むプラスミド PQE60-XYL1を取得した。
[0056] 次に、プラスミド pDrive-xylEを制限酵素 β ΐΗΙ、 Πを用いて切断した後、ァガロ ース電気泳動法にて Eを含む DNA断片を分離し、 QIA quick Gel Extraction Kit を用いてゲルから回収、精製した。同様に上記のプラスミド pQE60 XYL1を制限酵素 ^ lHIを用いて切断した後、 QIA quick PCR Purification Kitを用いて精製した。 xvlE を含む DNA断片と pQE60 XYL1の DNA断片を DNA ligation kit ver.2を用いて添付 の指示書に従いライゲーシヨンを行った。以後 (0と同様の手法により と dEを共 に含むプラスミド PQE60- XYL1- xylEを取得した。
[0057] 次に、プラスミド pDrive-tetを制限酵素 M lを用いて切断した後、ァガロース電気泳 動法にて Mを含む DNA断片を分離し、 QIA quick Gel Extraction Kitを用いてゲル から回収、精製した。同様に上記のプラスミド pQE60-XYLl-xylEを制限酵素 Mmlを 用いて切断した後、 QIA quick PCR Purification Kitを用いて精製した。 を含む DN A断片と PQE60- XYL1- xylEの DNA断片を DNA ligation kit ver.2を用いて添付の指 示書に従いライゲーシヨンを行った。以後 (0と同様の手法によりm丄 γΙΕ, を全 て含むプラスミド PQE60- XYL1- xylE- tetを取得した。
(v) E. coli W3110red AxvlA::XYLl xvlE tet株の诰成
上記 pQE60-XYLl-xylE-tetプラスミドを铸型として、配列番号 10および 11で表さ れる塩基配列からなる DNAをプライマーセットとして用いた PCRにより、キシロースレ ダクターゼ遺伝子、キシロース透過酵素遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子を 中央部に持ち、両端に配列番号 12であらわされる塩基配列力もなる DNA [キシロー スイソメラーゼ (xvlA)遺伝子の 5 '末端側の DNA]および配列番号 13であらわされる 塩基配列からなる DNA [キシロースイソメラーゼ (xvlA)遺伝子の 3 '末端側の DNA] を有する DNA断片を増幅した。
[0058] PCRは、 LA- Taqを用いて、プラスミド DNA 10ng、プライマー DNA各 20pmolを含 む 25 1の反応液を LA-Taqに添付の指示書に従い調製し、 94°Cで 2分間保温後、 94 °Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 5分間のサイクルを 30回繰り返した後、 72°Cで 10 分間保温する条件で行った。
次に、該 DNA 1 μ gを用いて E. coH W3110red株の形質転換を行った。形質転換 は上記（1)のエレクト口ポレーシヨンと同様の条件で行った。
[0059] 形質転換した細胞を、 2mmol/lのイソプロピル- β -D-チォガラタトシドを含む lmlの SOC液体培地を用いて 30°Cで 3時間培養した後、 50 g/mlのクロラムフエ-コール を含む LB寒天プレート (LB液体培地に寒天を 1.5%含むもの。以下、 LBcm寒天培 地プレートと略す)上に塗布し、 37°Cで一晩培養した。
生育してきた株は、 E. coH W3110red株の染色体 DNA上の xylA遺伝子がキシロー スレダクターゼ遺伝子、キシロース透過酵素遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝 子と置換された株であることを確認し、該株を E. coH W3110red A2odA::) YLi YIE te 株と命名した。
(vi) E. coH BW25113 AxvlA::XYLl xvlE tet株および E. coli BW25113 AvhbC::km AxvlA::XYLl xvlE 株の造成
E. coH W3110red A QdA::) YLi ilE 株より PIファージを実施例 1と同様の方法 により調製した。
[0060] 次に、取得したファージを用いて E. coH BW25113株および E. coH BW25113 Avhb 株を形質転換した。 Ca—LB液体培地を用いて 30°Cで 4時間培養した E. coH B W25113株および E. coH BW25113 AvhbC::km株の培着物を 200 μ 1分取し、 E. coli
W3110red A QdA::) YLi χΙΕ 株より取得した PIファージストックを 1 μ 1添カ卩した。 3 7°Cで 10分間保温した後、 5mlの LB液体培地と 200 μ 1の lmol/1のクェン酸ナトリウム 溶液を添加し、攪拌した。
[0061] 1500g、 25°Cの条件下で 10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に lml の LB液体培地と 10 μ 1の lmol/1のクェン酸ナトリウム溶液をカ卩ぇ 30°Cで 2時間保温し た。 100 1の該溶液を 20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム 3 寒天平板培地に塗布し、 30°Cで一晩培養した。各々の欠損導入株毎に出現したコロ ニー 24個をそれぞれ、 10mg/lのテトラサイクリンを含むアンチバイオティックメディウム 3寒天平板培地に塗布し、その薬剤感受性を確認し、テトラサイクリン耐性株を選抜 することにより、染色体 DNA上の xylA遺伝子力 キシロースレダクターゼ遺伝子、キ シロース透過酵素遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含む DNA領域と置換 した开質導入株、 E. coH BW25113 AxvlA::XYLl xvlE ^株および E. coH BW25113 AvhbC::km AxvlA::XYLl xvlE tet株を取得した
実施例 4
[0062] YhhC遺伝子欠損株を用いた有用物質の製造（1)
E. coli BW25113 AxvlA::XYLl xvlE tet株および E. coli BW25113 AvhbC::km Δ xvlA::XYLl xvlE tet株を、それぞれ 5mlの LB液体培地を入れた試験管に植菌し、 30 °Cで 20時間、振とう培養し培養物を得た。 30mlの該培養物を、 1000mlの MX液体培 地（3%グルコース、 6% キシロース、 0.0024% イソプロピル- j8 -D-チォガラタトシ ド、 0.6% リン酸水素ニナトリウム、 0.3% リン酸二水素カリウム、 0.05% 塩化ナトリ ゥム、 0.1% 塩化アンモ-ゥム、 0.012% 硫酸マグネシウム、 0.0015% 塩化カルシ ゥム、 0.0011% 硫酸鉄）が入った 2000ml容のジャーフアーメンターに植菌し、 30°Cで 培養した。上記培養において、添加したキシロースは化学量論的にキシリトールへと 変換された。
[0063] 培養開始から 23時間目、 28.5時間目および 32.5時間目に培養物の一部をサンプリ ングして遠心分離し、その上清を 1000倍に希釈してダイオネタス社製のイオンクロマト グラフシステム DXa— 500を用いて培養液中のキシリトール蓄積量を測定した。また 分光光度計を用いて、培養物の濁度（OD660nm)を測定して生育を定量化した。結 果を表 1に示す。
[0064] [表 1] 表 1 培養時間 （時間） 菌株 定量項目
23 28.5 32.5
B 25113 Δ xylA::XYLl キシリ ト一ル (g八） 2.7 6.0 9.2 xylE tet株 OD660nm 3.9 7.8 11.3
BW25113 AyhbC: :km Δ キシリ トール（g/1) 5.1 11.4 16.0 xylA: :XYL1 xylE tet株 OD660nm 6.6 10.7 12.2 実施例 5
[0065] y k£遺伝子欠損株を用いた有用物質の製造（2)
実施例 3と同様の方法により E. coli W3110red AxidA::) YLl YIE 株より調製さ れた PIファージを用いて E. £di W3110 AyhbC株を形質転換し、 E. coH W3110 Δχΐι bC::km AxvlA::XYLl xvlE 株を取得した。また同じ PIファージを用いて E. coH W 3110を形質転換し、 E. coli W3110 AxvlA::XYLl xvlE 株を取得した。
[0066] E. coli W3110 AxvlA::XYLl xvlE tet株および E. coli W3110 AvhbC::km AxvlA::X YL1 xvlE 株を、それぞれ 5mlの lOg/1のグルコースを含む LB液体培地を入れた試 験管に植菌し、 30°Cで 16時間、振とう培養し培養物を得た。 3.75mlの該培養物を、 12 5mlの液体培地（60g/lグルコース、 lOg/1イーストエキストラタト、 6.8g/l リン酸水素二 ナトリウム、 3g/lリン酸二水素カリウム、 0.5g/l塩ィ匕ナトリウム、 lg/1 塩ィ匕アンモ-ゥム 、 0.247g/l 硫酸マグネシウム、 0.015g/l 塩化カルシウム、 0.028g/l 硫酸鉄）が入つ た 250ml容のジャーフアーメンターに植菌し、 30°C、 pH7.0 (アンモニア水で調整）、通 気量 lwmで培養を開始した。撹拌は 500rpmで開始し、溶存酸素濃度が lppmを保つ ように撹拌数を変化させた。培養開始後 3.5時間目にキシロースを 80g/lになるように 添力！]して、さらに培養を継続した。
[0067] 上記培養において、添加したキシロースは化学量論的にキシリトールへと変換され た。
培養開始から 23.3時間目、 29.3時間目、 33.3時間目および 47.3時間目に培養液の 一部をサンプリングして遠心分離し、実施例 4と同様の方法で培養物中のキシリトー ル濃度および培養物の濁度を測定した。結果を表 2に示す。
[0068] [表 2] 表 2
Figure imgf000025_0001
[0069] 表 1および 2にあるとおり、 YhhC遺伝子欠損株は生育が早まると同時に、キシリトー ル生産性が向上すること、および生産性の向上率は、生育の向上率を上回ることが わかった。
以上より、 xhhC遺伝子欠損株の生育特性の改善が、有用物質、すなわち発酵過程 によって生産される各種有用物質、例えばタンパク質、核酸、ビタミン、糖、有機酸お よび脂質などの生産性の向上につながることに加え、生育特性の向上率以上の生産 性の向上も期待できることがわ力つた。
産業上の利用可能性
[0070] 本発明により、有用物質を効率よく製造することができる。
配列表フリーテキスト
[0071] 配列番号 3 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 4 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 5—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 6—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 7—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 8—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 9 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 10—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 11 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 12—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 13 人工配列の説明；合成 DNA

Claims

請求の範囲 [1] 染色体 DNA上の配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺 伝子、または配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有する蛋白 質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損して 、る微生物を培地に培養し、培 養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特 徴とする有用物質の製造法。 [2] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番号 2 で表される塩基配列を有する遺伝子である、請求項 1記載の製造法。 [3] 微生物が以下の（1)〜（5)力も選ばれる方法によって有用物質を生産する能力が強 化された微生物である、請求項 1または 2記載の製造法。
(1)有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法
(2)有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法
(3)有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増加さ せる方法
(4)有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路 の少なくとも 1つを弱化または遮断する方法
(5)野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択 する方法
[4] 微生物 ¾^ Escherichia J¾、 Erwinia属、 Pseudomonas属、 Rhodobacter鹿、 Salmonellafe
、 Serratia属、 Vibrio属、 Xanthomonas属、または d 属に属する微生物である、請 求項 1〜3のいずれか 1項に記載の製造法。
[5] 微生物 ¾^ Escherichia coli、 Erwinia carotovora, PseuQomonasputida, Pseudomonas fl uorescens. Pseudomonas aeruginosa. Rhodobacter capsulatus. Salmonella tvphimuri um、 Serratia marcescens. Vibrio fischeri. Xanthomonas capestrisまたは Xylella fastidi である、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の製造法。
[6] 有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アル コール、有機酸および脂質力もなる群より選ばれる有用物質である、請求項 1〜5の いずれか 1項に記載の製造法。
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