WO2012117963A1 - 有用タンパク質の発現を厳密に制御できる微生物 - Google Patents

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WO2012117963A1
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zntr
nucleic acid
protein
gene
zinc
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PCT/JP2012/054571
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由梨 崎濱
英郎 森
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協和発酵キリン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism capable of strictly controlling inducible expression of a nucleic acid encoding a protein in a host cell.
  • a method in which a vector in which a nucleic acid encoding a protein is operatively linked downstream of an inducible promoter is introduced into a host cell such as Escherichia coli is used.
  • Typical inducible promoters include lactose promoter (Plac, Non-Patent Document 1), hybrid promoter using a part of the sequence (Ptac and Ptrc, Non-Patent Document 2), T7 RNA polymerase (Non-Patent Document 3) and the like. It's being used.
  • Non-patent Document 4 shows a certain amount of protein expression even when not induced, and strict expression control is not required.
  • Non-Patent Document 5 As a promoter capable of strict expression control, there is a low temperature inducible promoter (Patent Document 1), but useful compounds such as fermentation production are suitable for the expression of functional proteins because of low temperature expression. It is not suitable for control of production processes.
  • Patent Document 6 when a combination of a PL or PR promoter of ⁇ phage and a temperature-sensitive repressor CI857 is used, a certain amount of protein expression can be seen even at non-induction (30 ° C.) (Non-patent Document 6).
  • Inexpensive inducers include inorganic metal salts added to the fermentation production medium of microorganisms.
  • genes whose expression is induced by addition of an inorganic metal salt include a zntA gene encoding a zinc ion excretion protein induced by zinc (Non-patent Document 10), a copA gene induced by divalent copper ions, or The cueO gene (Non-patent Document 11) and the like are known.
  • the ZntR protein acts as a transcription promoting factor (Non-patent Document 12), and the ZntR protein that is not bound to zinc is degraded relatively quickly and the transcription of the zntA promoter is reduced (Non-patented) It has been reported that the zntA gene is expressed at the transcriptional level even in the case of no addition of zinc (reference 13) and non-patent reference 14), and it is considered that the expression of the zntA gene is not strictly suppressed.
  • An object of the present invention is to provide a microorganism capable of controlling protein expression by adding zinc as an inducer and a method for producing a useful substance using the microorganism.
  • the present invention relates to the following (1) to (10).
  • a vector in which a promoter region containing a ZntR protein binding site and a nucleic acid encoding a desired protein are operably linked is introduced into a host cell that has reduced or lost zinc excretion activity and has a zntR gene.
  • the microorganism according to (1) is described in which a promoter region containing a ZntR protein binding site and a nucleic acid encoding a desired protein are operably linked.
  • the microorganism according to (2) wherein the vector is a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, or a virus vector.
  • a nucleic acid operably linked to a promoter region containing a ZntR protein binding site and a nucleic acid encoding a desired protein is reduced or lost in the zinc excretion activity and on the chromosome of a host cell having a zntR gene.
  • a promoter region containing a ZntR protein binding site is operably linked to a nucleic acid encoding a desired protein on the chromosome of a host cell having reduced or lost zinc excretion activity and having a zntR gene.
  • (6) The microorganism according to any one of (1) to (5), wherein the ZntR protein binding site is a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the promoter region containing a ZntR protein binding site is a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • any one of (1) to (7), wherein the host cell whose zinc excretion activity is reduced or lost is a mutant strain in which a part or all of the zntA gene or its homologue gene on the chromosome is deleted.
  • the microorganism described in 1. The microorganism according to any one of (1) to (8), wherein the host cell is a microorganism belonging to the genus Escherichia, Bacillus, Corynebauterium or Saccharomyces. (10) A method for producing a useful substance using the microorganism according to any one of (1) to (9).
  • the present invention it is possible to provide a microorganism capable of controlling inducible expression of a nucleic acid encoding a protein with zinc, and a method for producing a useful substance using the microorganism.
  • FIG. 1 shows the change over time in the amount of cells in culture using a jar fermenter as an OD (optical density) value of 660 nm.
  • ( ⁇ ) is a culture of ⁇ zntA-PzntA strain without addition of zinc (Zn)
  • ( ⁇ ) is a culture of ⁇ zntA-PzntA strain with zinc added at a final concentration of 400 mM ⁇ ⁇ at 12 hours
  • ( ⁇ ) is The WT-PzntA strain was cultured without adding zinc
  • ( ⁇ ) shows the results of culturing with the WT-PzntA strain added to zinc at 12 hours to a final concentration of 400 mM.
  • FIG. 1 shows the change over time in the amount of cells in culture using a jar fermenter as an OD (optical density) value of 660 nm.
  • ( ⁇ ) is a culture of ⁇ zntA-PzntA strain without addition of zinc (Zn)
  • ( ⁇ ) is
  • FIG. 2 shows the time course of the LacZ activity of bacterial cells in culture using a jar fermenter.
  • ( ⁇ ) shows the result of culturing with the WT-PzntA strain added with zinc at 12 hours so that the final concentration is 400 mM.
  • FIG. 3 represents the change over time in the amount of cells in culture using an Erlenmeyer flask as an OD value of 600 nm.
  • ( ⁇ ) is the ⁇ zntA-PzntA strain cultured without addition of zinc
  • ( ⁇ ) is the culture of ⁇ zntA-PzntA strain added with zinc at 8 hours to a final concentration of 400 mM
  • ( ⁇ ) is WT-PzntA The strain is cultured without adding zinc
  • ( ⁇ ) shows the result of culturing with the WT-PzntA strain added with zinc at 8 hours to a final concentration of 400 mM.
  • FIG. 4 shows the time course of the LacZ activity of the bacterial cells in culture using an Erlenmeyer flask.
  • the open bar graph shows the LacZ activity of the ⁇ zntA-PzntA strain
  • the black bar graph shows the LacZ activity of the WT-PzntA strain.
  • Zinc is added 8 hours after the start of the culture and shows activity 5 hours after the addition.
  • the microorganism of the present invention has a nucleic acid in which a promoter region containing a ZntR protein binding site and a nucleic acid encoding a desired protein are operably linked, has reduced or lost zinc excretion activity, and has a zntR gene If it is a microorganism, (1) a host in which a promoter region containing a ZntR protein binding site and a nucleic acid encoding a desired protein are operatively linked, a zinc excretion activity is reduced or lost, and a host having a zntR gene A microorganism introduced into a cell, (2) a nucleic acid in which a promoter region containing a ZntR protein binding site and a nucleic acid encoding a desired protein are operably linked, and the zinc excretion activity is reduced or lost, and the zntR gene (3) a promoter region containing a ZntR protein binding site, which is integrated on the chromosome of
  • the promoter region containing the ZntR protein binding site and the nucleic acid encoding the desired protein are operably linked means that the expression of the desired protein is controlled by the promoter region containing the ZntR protein binding site. It means that a nucleic acid encoding the protein is linked downstream of the promoter region.
  • the promoter region containing the ZntR protein binding site includes a nucleic acid consisting of a consensus sequence (-35 region) and a -35 region containing a ZntR protein binding site and RNA polymerase binding to initiate gene transcription.
  • nucleic acid contains a nucleic acid (-10 region) consisting of a consensus sequence existing in 10 regions, it may be any nucleic acid consisting of any sequence, but from the upstream -35 region, ZntR protein binding site, -10 region It is preferable to arrange in this order.
  • the promoter region including the ZntR protein binding site the promoter region of the zntA gene is preferably used, and a region having a palindromic structure present in the region is more preferably used.
  • the nucleic acid represented by SEQ ID NO: 2 is suitably used as the promoter region of the zntA gene, and the nucleic acid represented by SEQ ID NO: 1 is suitably used as the region having a palindromic structure.
  • the -35 region any nucleic acid comprising a consensus sequence (TTGACA, TTGACT, etc.) that functions in the host cell may be used.
  • TTGACT the difference from the -35 region (TTGACT) of the zntA gene of E. coli is 2
  • the sequence of the -35 region may or may not overlap with a part or all of the sequence of the ZntR protein binding site.
  • the sequence of the -35 region and the sequence of the ZntR protein binding site overlap, it is preferable that the sequence of the 3 'end of the -35 region overlaps with the sequence of the 5' end of the ZntR protein binding site.
  • the overlapping sequence is preferably 6 bases or less, more preferably 4 bases or less, and even more preferably 3 bases or less.
  • any nucleic acid comprising a consensus sequence (TATAAT, TATCCT, etc.) that functions in the host cell may be used.
  • TATCCT -10 region
  • the sequence of the -10 region may or may not partially overlap with the sequence on the ZntR protein binding site side, but it may be one or two bases downstream from the 3 'end of the ZntR protein binding site. It is preferable to place the base at the 5 ′ end of the ⁇ 10 region at the position.
  • the promoter region containing the ZntR protein binding site may have a translation initiation region such as a ribosome binding site (Shine-Dalgarno sequence).
  • the ZntR protein binds to the promoter region and the desired protein is expressed, for example, by placing a nucleic acid encoding LacZ protein downstream of the promoter containing the ZntR protein binding site, and in the presence of ZntR protein and zinc, LacZ It can be confirmed by expressing a protein and measuring the transcriptional activity using the expression intensity as ⁇ -galactosidase activity (LacZ activity). LacZ activity can be measured according to Miller's experimental method (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972, pp.349-376).
  • the protein itself may be a useful substance, such as an enzyme, a physiologically active protein, a receptor, an antibody, or an antibody fragment, or a structural protein, a functional protein, etc. for indirectly enhancing the useful substance
  • a useful substance such as an enzyme, a physiologically active protein, a receptor, an antibody, or an antibody fragment, or a structural protein, a functional protein, etc. for indirectly enhancing the useful substance
  • it is preferably a protein other than the ZntA protein.
  • DNA is usually used, but any nucleic acid such as RNA or modified nucleic acid may be used.
  • any prokaryotic or eukaryotic cell may be used as the host cell as long as the zinc excretion activity is reduced or lost and the ZntR gene is contained.
  • host cells with reduced zinc excretion activity include, for example, a part or all of the base sequences of one or more, preferably 1 to 2 types of genes among zinc excretion transporter genes present on the chromosome of the host cell. In which the transporter activity is reduced to 20% or less, preferably 40% or less, more preferably 60% or less, and even more preferably 80% or less compared to the zinc-extracting transporter activity of wild-type cells. Is used.
  • the zinc excretion type transporter activity of the host cell can be determined by, for example, a method of quantifying zinc uptake using the following inverted membrane vesicle (Rensing et. Al. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14326 -14330) can be used for measurement.
  • the host cells are disrupted with a French press or the like, centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant is further centrifuged at 100,000 ⁇ g for 60 minutes.
  • the pellet obtained is buffer A (10 mM Tris-HCl, pH 7.5).
  • Zinc excretion transporters that operate when prokaryotes are used as host cells include cation transporters classified as P-type ATPases such as E. coli ZntA, and cation diffusion facilitators as represented by E. coli ZitB. , CDF) type transporters, double transmembrane type (RND type) exporters operating with Gram-negative bacteria, etc. [BioMetals, 14, 239 (2001)].
  • Examples of zinc excretory transporters that operate when eukaryotes are used as host cells include ZIP (Zrt-, Irt-like Proteins) transporters and CDF transporters [BioMetals, 14 , 251 (2001). )].
  • Examples of the zinc excretion transporter used when the host cell is a microorganism belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, or a microorganism belonging to the genus Erwinia or Vibrio, which are enteric bacteria, include a ZntA protein or a homologous protein thereof.
  • Examples of the ZntA protein include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (a protein encoded by a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3).
  • the homologous protein of the ZntA protein is, for example, an amino acid sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • a protein having zinc excretion activity is determined by the program BLASTX [J. Mol. Biol., 215 , developed based on the algorithm BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci.
  • a host cell having reduced or lost zinc excretion activity has a deletion, substitution or addition of one or more bases in the base sequence of the zinc excretion transporter gene on the chromosome.
  • Transcriptional control such as the promoter or operator of the gene to be encoded does not function, mutants in which the expression of the transporter is reduced or lost, (2) because part or all of the zinc excretion transporter gene is missing, A mutant strain in which the expression of an active protein is reduced or lost is used.
  • Escherichia (Escherichia) genus is a microorganism having ZntA protein as zinc emptying transporter, Erwinia (Erwinia) genus Vibrio (Vibrio) genus Sinorhizobium (Sinorhizobium) genus, Rhodobacter (Rhodobacter) a microorganism belonging to the genus belonging to, such as Bacillus (Bacillus) the genus is a microorganism having a CadA protein, Pseudomonas (Pseudomonas) genus Corynebacterium (Corynebacterium) genus Brevibacterium (Brevibacterium) species, Staphylococcus (Staphylococcus For example, a mutant belonging to the genus or the like, a microorganism belonging to the genus Saccharomyces, which is a microorganism having ZntA protein as zinc emptying transport
  • Zinc host cell discharge activity is reduced or lost, for example a microorganism having ZntA protein or its homologue protein Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli
  • W1485 Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.
  • Escherichia coli W3110 Escherichia coli TB1
  • Erwinia carotovora Vibrio fischeri
  • Sinorhizobium meliloti Rhodobacter capsulatus, etc.
  • the base in the sequence is deleted, substituted or added, and zinc excretion activity is reduced or lost.
  • a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by linking a mutant gene of the excretory transporter to a plasmid having a drug resistance gene that cannot replicate autonomously in the host cell into which the mutant gene is to be introduced can be mentioned.
  • a transformant in which the plasmid for homologous recombination is integrated on the chromosome by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.
  • the obtained transformant is cultured in a medium not containing the drug for several hours to 1 day, and then applied to the drug-containing agar medium and the drug-free agar medium.
  • a strain that can grow in the medium By selecting a strain that can grow in the medium, a strain in which the second homologous recombination has occurred on the chromosome can be obtained. It can be confirmed that the mutation has been incorporated into the target gene on the chromosome by determining the base sequence of the region where the mutant gene introduced on the chromosome is present.
  • mutants in which the expression of active protein is reduced or lost include one base in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 on the chromosome. It may be deleted, substituted or added, preferably 5 to 10 bases, more preferably 10 to 50 bases, still more preferably 50 to 100 bases are deleted, substituted or added, and part or all of the gene is Due to the deletion, a mutant strain in which the zinc excretion activity of the ZntA protein is reduced or lost is preferably used.
  • any host cell that expresses the ZntR protein any host cell that carries the zntR gene on its chromosome, such as Escherichia coli, may be used.
  • the zntR gene may be cloned on a plasmid in the host cell and the ZntR protein expressed from the episome.
  • a microorganism other than E. coli is used as the host cell and the host cell does not have the zntR gene, it is described in MolecularMCloning, 2nd edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • ZntR protein can be expressed in the host cell using genetic recombination techniques such as By coexisting the zntR gene on an expression plasmid having a promoter region containing a ZntR protein binding site and increasing the supply of the ZntR protein, which is a transcription promoting factor, the inducible expression of the promoter used in the present invention is enhanced. Also good.
  • ZntR protein examples include a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • a protein containing an amino acid sequence having 95% or more identity is used. Amino acid sequence identity can be determined according to the algorithm described above.
  • Examples of the zntR gene include, for example, a nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, or 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid containing a base sequence having 95% or more identity is used. The identity of the base sequence can be determined according to the algorithm described above.
  • a promoter region containing a ZntR protein binding site and a nucleic acid encoding a desired protein are functionally linked.
  • Any vector such as a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, or a viral vector can be used as long as it is a vector that has been prepared.
  • Microorganism obtained by introducing a vector in which a promoter region containing a ZntR protein binding site and a nucleic acid encoding a desired protein are operably linked into a host cell having reduced or lost zinc excretion activity and having a zntR gene For example, (1) after introducing the vector into a host cell having a zntR gene, a part or all of the gene encoding the zntA gene present on the chromosome or the homologous protein of the ZntA protein is deleted, and zinc is excreted.
  • a method for reducing or losing the activity (2) a host cell having a zntR gene, wherein a part or all of the gene encoding the ZntA protein on the chromosome or a homologous protein thereof is deleted and the zinc excretion activity is reduced or lost; It can be prepared using a method for introducing the vector.
  • a nucleic acid operably linked to a promoter region containing a ZntR protein binding site and a nucleic acid encoding a desired protein is incorporated into the chromosome of a host cell that has reduced or lost zinc excretion activity and has a zntR gene. Is a part of a zinc effluxing transporter gene on the chromosome except that a promoter region containing a ZntR protein binding site and a nucleic acid encoding the desired protein are used instead of the mutant gene of the zinc effluxing transporter. Alternatively, it can be prepared using a homologous recombination method similar to the method of deleting all.
  • the microorganism has homology to the nucleic acid encoding the drug resistance gene, the nucleic acid of the promoter region containing the ZntR protein binding site, and the nucleic acid encoding the desired protein at both ends of the nucleic acid of the introduction site on the chromosome.
  • a linear nucleic acid having a nucleic acid is synthesized by PCR, and the linear nucleic acid is reduced or lost by a conventional method in a zinc excretion activity and introduced into a host cell having a zntR gene. It can also be prepared by selecting a transformant in which a nucleic acid of a chain is integrated into a chromosome using drug resistance as an index.
  • a microorganism comprising a promoter region containing a ZntR protein binding site, wherein zinc excretion activity is reduced or lost and operably linked to a nucleic acid encoding a desired protein on the chromosome of a host cell having a zntR gene ''
  • the above homologous recombination method for example, a nucleic acid in which a nucleic acid having homology with the 5 ′ upstream region of a nucleic acid encoding a desired protein on a chromosome is arranged at both ends of a promoter region containing a ZntR protein binding site in a host cell.
  • the microorganism comprises a host cell having reduced or lost zinc excretion activity and a zntR gene at both ends of a nucleic acid containing a nucleic acid of a promoter region containing a ZntR protein binding site and a drug resistance gene that cannot replicate autonomously in the host cell.
  • a linear nucleic acid in which a nucleic acid having homology with a nucleic acid encoding a desired protein on a chromosome to be introduced is synthesized by PCR, and the linear nucleic acid is introduced into the host cell by a conventional method, and then homologous. It can also be produced by selecting a transformant in which the linear nucleic acid is integrated into the chromosome by recombination using drug resistance as an indicator.
  • the nucleic acid having homology with the nucleic acid at the introduction site on the chromosome present at both ends of the linear nucleic acid is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% with the nucleic acid at the introduction site on the chromosome.
  • a nucleic acid having 95% or more identity has the same direction as the base sequence of DNA on the chromosome Those arranged in the direction are used.
  • a promoter region containing a ZntR protein binding site, or a position on a chromosome that incorporates a nucleic acid in which the promoter region and a nucleic acid encoding a desired protein are operably linked can be any position as long as it does not affect the growth of microorganisms. It may be.
  • Nucleic acid in which a promoter region containing a ZntR protein binding site and a nucleic acid encoding a desired protein are operably linked is incorporated into the chromosome.
  • the nucleotide sequence of the region where the incorporated nucleic acid is present on the chromosome It can be confirmed by determining.
  • the useful substance that can be produced using the microorganism of the present invention may be any industrially useful substance that can be produced by a microorganism, and is preferably a protein, peptide, amino acid, nucleic acid, vitamin, sugar, sugar. Alcohol, alcohol, organic acid, lipid, etc. can be mention
  • Examples include enzymes, physiologically active proteins such as human granulocyte colony-stimulating factor, receptors, antibodies, antibody fragments, and the like.
  • Examples of peptides include glutathione.
  • Amino acids include L-alanine, glycine, L-glutamine, L-glutamic acid, L-asparagine, L-aspartic acid, L-lysine, L-methionine, L-threonine, L-leucine, L-valine, L-isoleucine , L-proline, L-histidine, L-arginine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-serine, L-cysteine, L-3-hydroxyproline, L-4-hydroxyproline, etc.
  • nucleic acids include inosine, guanosine, inosinic acid, guanylic acid and the like.
  • vitamins include riboflavin, thiamine, and ascorbic acid.
  • sugar include xylose, and examples of the sugar alcohol include xylitol.
  • alcohol include ethanol, and examples of the organic acid include lactic acid and succinic acid.
  • lipids include EPA (eicosapentaenoic acid) and DHA (docosahexaenoic acid).
  • the above-mentioned useful substance can be produced by culturing the microorganism of the present invention in a medium, producing and accumulating the useful substance in the culture, and collecting the useful substance from the culture.
  • the culture method used in the production of the useful substance of the present invention can be a normal method used for culturing microorganisms. That is, both a natural medium and a synthetic medium can be used as long as they contain a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the microorganism and can efficiently culture the microorganism.
  • Any carbon source may be used as long as the microorganism can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, ethanol, Alcohols such as propanol and the like, and glycerol can be used, but it is particularly preferable to use glucose as a carbon source.
  • the nitrogen source ammonia, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, and other nitrogen-containing compounds can be used.
  • Natural sources of nitrogen sources include peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, and digested products thereof, such as zinc. Can be used as long as the content of is not a level that affects the expression control.
  • the inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is usually 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH is usually maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • antibiotics such as an ampicillin and a tetracycline, to a culture medium as needed during culture
  • the concentration of zinc in the medium when suppressing expression of a desired protein by a promoter containing a ZntR protein binding site is preferably less than 20 ⁇ M, more preferably 10 ⁇ M or less, and even more preferably 5 ⁇ M or less.
  • the concentration of zinc in the medium when inducing desired protein expression by a promoter containing a ZntR protein binding site is preferably 20 to 2000 ⁇ M, more preferably 20 to 800 ⁇ M, further preferably 40 to 400 ⁇ M, and particularly preferably 100 to 400 ⁇ M. preferable.
  • zinc is preferably added as zinc sulfate or zinc chloride so that the final concentration of zinc in the medium is the above concentration.
  • OD600 is preferably 0.5 to 1.5, more preferably 0.6 to 1.4, still more preferably 0.7 to 1.3, and particularly preferably 0.8 to 1.2. .
  • the target useful substance can be isolated and purified from the culture.
  • the useful substance is produced and accumulated in the microbial cells, after culturing, the microbial cells are recovered from the culture and then crushed by an appropriate method such as a mechanical or chemical method.
  • an ion exchange treatment method, a concentration method, a salting-out method, or the like in combination from the cell disruption solution a target useful substance can be isolated and purified from the cell disruption solution. Examples of the present invention are shown below.
  • Example 1 Expression of nucleic acid encoding LacZ protein under the control of zntA promoter region
  • Plasmid construction Using the region comprising the promoter region of the zntA gene of Escherichia coli to the start codon (ATG) of the downstream zntA open reading frame, use the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 7 and 8 as a set.
  • SEQ ID NOs: 7 and 8 was amplified using the chromosomal DNA of E. coli strain W3110 as a template.
  • the amplified DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis and purified by Qiagen's QIA quick Gel Extraction Kit.
  • pRWPzntA The purified DNA fragment was digested with Eco RI and Hind III, the plasmid was cleaved with Eco RI and Hind III pRW50 (FEMS Microbial Letter, 1992,95,271-276) was prepared pRWPzntA in conjunction with.
  • the above promoter region of pRWPzntA was confirmed by sequencing.
  • pRWPzntA a nucleic acid encoding a LacZ protein (lacZ gene) is arranged downstream of the zntA promoter region, and the zntA promoter activity can be quantified using ⁇ -galactosidase activity (LacZ activity) as an index.
  • M9 minimal medium was added with 5 mg / L FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2 mM MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.1 mM CaCl 2 .
  • Main culture was carried out in 1 L medium supplemented with 4% glucose and 0.1% casamino acid and with 10-20 mg / ml tetracycline.
  • the main culture was performed at 37 ° C. for 20 hours using a 2 L glass jar fermenter.
  • the culture solution was maintained at pH 7 using ammonia.
  • ZnSO 4 .7H 2 O was added to the medium so that the final concentration was 400 mM 12 to 12.5 hours after the start of the main culture.
  • LacZ activity was diluted so that the OD660 value of the sampled culture broth was less than 1.0, and Miller's experimental method (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972, pp.349-376). ). LacZ activity was measured using a plate reader measuring device (Perkin Elmer). The results are shown in FIG. When no zinc was added, both the LacZ activity of the WT-PzntA strain and ⁇ zntA-PzntA strain were suppressed to 15 Miller units or less.
  • Induction of zntA promoter activity by addition of zinc WT-PzntA strain and ⁇ zntA-PzntA strain were each pre-cultured in LB medium at 37 ° C for 10 hours, and then 5 mg / L FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2 in M9 minimal medium
  • Main culture in 25 mL of medium supplemented with 10-20 mg / ml tetracycline with addition of mM MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.1 mM CaCl 2 , 4% glucose, 20 g / L CaCO 3 and 0.1% casamino acid Carried out.
  • stirring culture was performed at 37 ° C.
  • the final concentration should be 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400 mM 8 hours after the start of main culture.
  • ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O was added to the solution. Changes in the amount of cells were measured using a spectrophotometer (BD Bioscience). The results are shown in FIG. 3 (only the results when the zinc concentration is 0 and 400 mM are shown).
  • the results of measuring LacZ activity by the same method as in Example 1 (2) are shown in FIG. As shown in FIG. 4, the expression level of LacZ protein increased according to the zinc concentration to be added.
  • the microorganisms which can control protein expression can be provided by adding zinc as an inducer.
  • proteins that are harmful to host cells, enzymes that cause interference with basal metabolism, etc. can be expressed in the growth arrest phase, so a wide range of useful substances are produced. be able to.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2011-043209 (filing date: February 28, 2011) filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

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Abstract

本発明は、ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結された核酸を有し、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造方法を提供する。

Description

有用タンパク質の発現を厳密に制御できる微生物
　本発明は、宿主細胞において、タンパク質をコードする核酸の誘導発現を厳密に制御できる微生物に関する。
　微生物を用いた有用タンパク質や有用化合物の生産プロセスを制御するために、誘導型プロモーターの下流にタンパク質をコードする核酸を機能的に連結したベクターを大腸菌などの宿主細胞に導入する方法が用いられている。代表的な誘導型プロモーターとして、ラクトースプロモーター（Plac、非特許文献１）、その配列の一部を用いたハイブリッドプロモーター（PtacならびにPtrc、非特許文献２）およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（非特許文献３）等が利用されている。
　しかしながら、これらの誘導型プロモーターでは非誘導時にもある程度のタンパク質発現が見られ、厳密な発現制御がかからないため（非特許文献４）、幾つかの毒性を持つタンパク質の発現は困難であることが知られている（非特許文献５）。厳密な発現制御が可能なプロモーターとしては、低温誘導型プロモーター（特許文献１）があるが、低温での発現のため、機能性タンパク質の発現には好適であっても、発酵生産などの有用化合物生産プロセスの制御には不向きである。
　また、λファージのＰＬあるいはＰＲプロモーターと温度感受性のレプレッサーＣＩ８５７の組合せを利用した場合、非誘導時（３０℃）でもある程度のタンパク質発現が見られる（非特許文献６）。また高温誘導時の温度は４２℃であるため、大腸菌の代謝の至適温度ではなく、この点も発酵制御などには不向きである。
　さらに、tetAプロモーター・オペレーター（非特許文献７）、アラビノースプロモーター（非特許文献８）あるいはラムノースプロモーター（非特許文献９）では、誘導時にそれぞれ高価な化合物である、アンヒドロテトラサイクリン、アラビノース、ラムノースを必要とするため、より安価な化合物で誘導可能なプロモーターが望まれている。
　安価な誘導物質としては、微生物の発酵生産培地に添加する無機金属塩があげられる。無機金属塩の添加により、発現が誘導される遺伝子としては、亜鉛により誘導発現する亜鉛イオンの排出系タンパク質をコードするzntA遺伝子（非特許文献１０）、二価銅イオンにより誘導発現するcopA遺伝子あるいはcueO遺伝子（非特許文献１１）等が知られている。
　zntA遺伝子の発現制御に関しては、ZntRタンパク質が転写促進因子として働き（非特許文献１２）、亜鉛と結合していないZntRタンパク質は比較的速やかに分解されてzntAプロモーターの転写が低下すること（非特許文献１３）や、亜鉛無添加の場合でもzntA遺伝子は転写レベルで発現すること（非特許文献１４）などが報告されており、zntA遺伝子は厳密な発現抑制がかからないと考えられている。
国際公開第1999/27117号
Mol. Gen. Genet. 1976. 148:243-250 J. Biol. Chem. 1985. 260:3539-3541 J. Mol. Biol. 1986. 189:113-130 Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. 72:211-222 J. Mol. Biol. 1991. 219:37-44 Gene 1990. 87:123-126 Gene 1994. 151:131-135 J. Bacteriol. 1995. 177:4121-4130 J. Bacteriol. 1998. 180:1277-1286 FEBS Lett. 2000. 473:67-70 J. Biol. Chem. 2000. 275:31024-31029 J. Bacteriol. 2001. 183:4664-4667 J. Biol. Chem. 1999. 274:37517-37524 J. Bacteriol. 2005. 187:6333-6340
　本発明の目的は、亜鉛を誘導物質として添加することでタンパク質の発現を制御できる微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造方法を提供することにある。
　本発明は以下の（１）～（１０）に関する。
（１）ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結された核酸を有し、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する微生物。
（２）ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結されたベクターを、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞に導入してなる、（１）に記載の微生物。
（３）ベクターがプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターまたはウイルスベクターである、（２）に記載の微生物。
（４）ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結された核酸を、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞の染色体上に組み込んでなる、（１）に記載の微生物。
（５）ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域を、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞の染色体上の所望のタンパク質をコードする核酸と機能的に連結してなる、（１）に記載の微生物。
（６）ZntRタンパク質結合部位が配列番号１で表される塩基配列からなる核酸である、（１）～（５）のいずれか１つに記載の微生物。
（７）ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域が、配列番号２で表される塩基配列からなる核酸である、（１）～（６）のいずれか１つに記載の微生物。
（８）亜鉛排出活性が低下または喪失した宿主細胞が、染色体上のzntA遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損している変異株である（１）～（７）のいずれか１つに記載の微生物。
（９）宿主細胞が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバウテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である、（１）～（８）のいずれか１つに記載の微生物。
（１０）（１）～（９）のいずれか１つに記載の微生物を用いる有用物質の製造方法。
　本発明によれば、タンパク質をコードする核酸の誘導発現を亜鉛で制御できる微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造方法を提供できる。
図１は、ジャーファーメンターを用いた培養における菌体量の経時変化を660nmのOD（optical density）値で表す。（△）はΔzntA-PzntA株を亜鉛（Zn）無添加で培養、（▲）はΔzntA-PzntA株を終濃度400 mM となるように亜鉛を12時間目に添加して培養、（○）はWT-PzntA株を亜鉛無添加で培養、（●）はWT-PzntA株を終濃度400 mM となるように亜鉛を12時間目に添加して培養した結果を示す。 図２は、ジャーファーメンターを用いた培養における菌体のLacZ活性の経時変化を表す。（△）はΔzntA-PzntA株を亜鉛無添加で培養、（▲）はΔzntA-PzntA株を終濃度400 mM となるように亜鉛を12時間目に添加して培養、（○）はWT-PzntA株を亜鉛無添加で培養、（●）はWT-PzntA株を終濃度400 mM となるように亜鉛を12時間目に添加して培養した結果を示す。 図３は、三角フラスコを用いた培養における菌体量の経時変化を600nmのOD値で表す。（△）はΔzntA-PzntA株を亜鉛無添加で培養、（▲）はΔzntA-PzntA株を終濃度400 mM となるように亜鉛を8時間目に添加して培養、（○）はWT-PzntA株を亜鉛無添加で培養、（●）はWT-PzntA株を終濃度400 mM となるように亜鉛を8時間目に添加して培養した結果を示す。 図４は、三角フラスコを用いた培養における菌体のLacZ活性の経時変化を表す。白抜きの棒グラフはΔzntA-PzntA株のLacZ活性、黒塗りの棒グラフはWT-PzntA株のLacZ活性を示す。亜鉛は培養開始8時間で添加し、添加後5時間目の活性を示す。
　本発明の微生物としては、ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結された核酸を有し、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する微生物であれば、（１）ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結されたベクターを、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞に導入してなる微生物、（２）ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結された核酸を、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞の染色体上に組み込んでなる微生物、（３）ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域を、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞の染色体上の所望のタンパク質をコードする核酸と機能的に連結してなる微生物など、いずれの微生物であってもよい。
　「ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結された」とは、ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域によって所望のタンパク質の発現が制御されるように、該プロモーター領域の下流に該タンパク質をコードする核酸が連結されていることをいう。
　ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域としては、ZntRタンパク質結合部位を含み、かつRNAポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始させる-35の領域に存在するコンセンサス配列からなる核酸（-35領域）および-10の領域に存在するコンセンサス配列からなる核酸（-10領域）を含む核酸であれば、いずれの配列からなる核酸であってもよいが、上流から-35領域、ZntRタンパク質結合部位、-10領域の順で配置されていることが好ましい。
　ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域としては、zntA遺伝子のプロモーター領域を用いることが好ましく、該領域に存在するパリンドローム構造を有する領域を用いることがさらに好ましい。例えば大腸菌の場合は、zntA遺伝子のプロモーター領域としては配列番号２で表される核酸が、パリンドローム構造を有する領域としては配列番号１で表される核酸が、それぞれ好適に用いられる。
　-35領域としては、宿主細胞中で機能するコンセンサス配列（TTGACA、TTGACTなど）からなる核酸であればいずれを用いてよいが、例えば大腸菌のzntA遺伝子の-35領域（TTGACT）との相違が2塩基以下、好ましくは1塩基以下である塩基配列からなる核酸が好適に用いられる。
　-35領域の配列は、ZntRタンパク質結合部位の配列と一部または全部の配列が重複していても重複していなくてもよい。-35領域の配列とZntRタンパク質結合部位の配列が重複する場合、-35領域の3’末端側の配列とZntRタンパク質結合部位の5’末端側の配列が重複することが好ましい。これらの配列が重複する場合は、重複する配列は6塩基以下であることが好ましく、4塩基以下であることがより好ましく、3塩基以下であることがさらに好ましい。
　-10領域としては、宿主細胞中で機能するコンセンサス配列（TATAAT、TATCCTなど）からなる核酸であればいずれを用いてもよいが、例えば大腸菌のzntA遺伝子の-10領域(TATCCT) との相違が2塩基以下、好ましくは1塩基以下である塩基配列からなる核酸が好適に用いられる。
　-10領域の配列は、ZntRタンパク質結合部位側の配列と一部または全部の配列が重複していても重複していなくてもよいが、ZntRタンパク質結合部位の3’末端から１～２塩基下流の位置に-10領域の5’末端の塩基を配することが好ましい。
　ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域には、リボソーム結合部位（シャイン・ダルガノ配列）などの翻訳開始領域を有していてもよい。
　該プロモーター領域にZntRタンパク質が結合して所望のタンパク質が発現することは、例えば、ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーターの下流にLacZタンパク質をコードする核酸を配置し、ZntRタンパク質および亜鉛の存在下、LacZタンパク質を発現させて、その発現強度をβ－ガラクトシダーゼ活性（LacZ活性）として転写活性を測定することで確認できる。LacZ活性は、Millerの実験方法(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972, pp.349-376)に準じて測定することができる。
　「所望のタンパク質」としては、酵素、生理活性タンパク質、受容体、抗体、抗体フラグメント等、タンパク質そのものが有用物質であってもよいし、有用物質を間接的に高めるための構造タンパク質、機能タンパク質等のタンパク質であってもよいが、ZntAタンパク質以外のタンパク質であることが好ましい。
　「核酸」としては、通常はＤＮＡが用いられるが、ＲＮＡや修飾核酸などいずれの核酸であってもよい。
　宿主細胞としては、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつZntR遺伝子を有するものであれば、原核生物および真核生物のいずれの細胞を宿主細胞として用いてもよい。
　亜鉛排出活性が低下した宿主細胞としては、例えば該宿主細胞の染色体上に存在する亜鉛排出型トランスポーター遺伝子のうち、１種以上、好ましくは１～２種の遺伝子の塩基配列の一部または全部が欠損し、野生型細胞の亜鉛排出型トランスポーター活性に比べて、該トランスポーター活性が２０％以下、好ましくは４０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは８０％以下に低下した細胞が用いられる。
　宿主細胞の亜鉛排出型トランスポーター活性は、例えば以下の反転膜小胞を用いた亜鉛の取り込み量を定量化する方法（Rensing et. Al.1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:14326-14330）を用いることにより、測定することができる。
　宿主細胞をフレンチプレス等で破壊し、10,000×ｇで10分間遠心分離後、上澄み液をさらに100,000×ｇで60分間遠心分離して得られるペレットをバッファーA（10 mM Tris-HCl, pH7.5, 140 mM choline chloride, 0.5 mM dithiothreitol, 0.25 M sucrose）に懸濁することによって、反転膜小胞を調製する。この反転膜小胞液を含む1ｍLの反応液(20 mM 1,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propane、pH 6.0、0.2 M KCl、0.25 M sucrose、1 mM 2-mercaptoethanol、0.8-1 mg 膜タンパク質、5mM ATP、10 μM 65ZnSO4(1.25 μCi/mL))に、終濃度5 mMとなるようにMgSO4を加えて、反転膜小胞にラベル化した硫酸亜鉛（65ZnSO4）を取り込ませる。0.1 mLずつサンプリングを行い、各サンプルをニトロセルロースフィルター（0.22μｍの穴径）に通し、反転膜小胞をフィルターに固定化する。取り込み終了後、5mLのバッファーB（20 mM 1,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propane、pH 6.0、 0.2 M KCl、0.25 M sucrose、1 mM 2-mercaptoethanol、10 mM MgSO4、20 mM ZnSO4）でニトロセルロースフィルター上の膜小胞を洗浄、乾燥させた後、液体シンチレーションカウンターで取り込まれた硫酸亜鉛の放射線量を計測することで、亜鉛の取り込み活性を定量化する。
　原核生物を宿主細胞とした場合に稼働する亜鉛排出型トランスポーターとしては、大腸菌ZntAに代表されるP型ATPase群に分類されるカチオントランスポーター、大腸菌ZitBに代表されるカチオン拡散促進（cation diffusion facilitators、CDF）型のトランスポーター、グラム陰性菌で稼働する二重膜貫通型（RND型）エクスポーターなどがあげられる［BioMetals, 14, 239(2001)］。真核生物を宿主細胞とした場合に稼働する亜鉛排出型トランスポーターとしては、ZIP型（Zrt-, Irt-like Proteins）トランスポーター、CDF型トランスポーターなどがあげられる［BioMetals, 14, 251(2001)］。
　宿主細胞が大腸菌などエシェリヒア属に属する微生物、または腸内細菌であるエルウィニア属、ビブリオ属に属する微生物である場合に用いられる亜鉛排出型トランスポーターとしては、ZntAタンパク質またはそのホモログタンパク質があげられる。
　ZntAタンパク質としては、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（配列番号３で表される塩基配列からなる核酸がコードするタンパク質）があげられる。
　ZntAタンパク質のホモログタンパク質としては、例えば配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０%以上、好ましくは８５%以上、さらに好ましくは９０%以上、特に好ましくは９５%以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、かつ亜鉛排出活性を有するタンパク質があげられる。
　アミノ酸配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]に基づいて開発されているプログラムBLASTX［J. Mol.Biol., 215, 403(1990)］を用いて決定することができる。ｎパラメータBLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
　亜鉛排出活性が低下または喪失した宿主細胞は、染色体上の亜鉛排出型トランスポーター遺伝子の塩基配列中に１以上の塩基の欠失、置換または付加があるため、（１）亜鉛排出型トランスポーターをコードする遺伝子のプロモーターまたはオペレーターなどの転写制御が機能せず、該トランスポーターの発現が低下または喪失した変異株、（２）亜鉛排出型トランスポーター遺伝子の一部または全部が欠損しているため、活性あるタンパク質の発現が低下または喪失した変異株などが用いられる。
　亜鉛排出活性が低下または喪失した変異株としては、亜鉛排出型トランスポーターとしてZntAタンパク質を有する微生物であるエシェリヒア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、ビブリオ（Vibrio）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属などに属する微生物、CadAタンパク質を有する微生物であるバシラス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属などに属する微生物、Zrc1タンパク質またはCot1タンパク質を有する微生物であるサッカロミセス（Saccharomyces）属などに属する微生物等で、亜鉛排出活性が低下または喪失した変異株などが用いられる。このうち、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバウテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物が好適に用いられる。
　亜鉛排出活性が低下または喪失した宿主細胞は、例えばZntAタンパク質またはそのホモログタンパク質を有する微生物であるEscherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli TB1、Erwinia carotovora、Vibrio fischeri、Sinorhizobium meliloti、Rhodobacter capsulatus等の他、CadAタンパク質またはそのホモログタンパク質を有する微生物であるBacillus subtilis、Pseudomonas syringae、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium efficiens、Brevibacterium linens等、Zrc1タンパク質もしくはCot1タンパク質またはそのホモログタンパク質を有する微生物であるSaccharomyces cerevisiae等がもつ、染色体上の亜鉛排出型トランスポーター遺伝子の一部または全部を、例えば相同組換えを利用した方法を用いて欠損させることにより、調製することができる。
　相同組換えを利用して染色体上の亜鉛排出型トランスポーター遺伝子の一部または全部を欠損させる方法としては、配列中の塩基が欠失、置換または付加されて亜鉛排出活性が低下または喪失した亜鉛排出型トランスポーターの変異遺伝子を、該変異遺伝子を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドに連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、相同組換えによって染色体上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を、薬剤耐性を指標にして選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間～1日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。
　染色体上の目的遺伝子に変異が染色体上に組み込まれたことは、染色体上に導入した変異遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで確認できる。
　亜鉛排出型トランスポーター遺伝子の一部または全部が欠損しているため、活性あるタンパク質の発現が低下または喪失した変異株としては、染色体上の配列番号３で表される塩基配列中の１塩基の欠失、置換または付加でもよく、好ましくは５～１０塩基、より好ましくは１０～５０塩基、さらに好ましくは５０～１００塩基が欠失、置換または付加されており、該遺伝子の一部または全部が欠損しているため、ZntAタンパク質の亜鉛排出活性が低下または喪失した変異株が好適に用いられる。
　ZntRタンパク質を発現する宿主細胞としては、例えば大腸菌など、染色体上にzntR遺伝子を保有する宿主細胞であれば、いずれのものを用いてもよい。該宿主細胞中でプラスミド上にzntR遺伝子をクローン化し、エピソームからZntRタンパク質を発現させてもよい。該宿主細胞として大腸菌以外の微生物を用いる場合で、その宿主細胞がzntR遺伝子を保有しない場合は、Molecular Cloning, 第2版 (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などの遺伝子組換え手法を用いて、その宿主細胞にZntRタンパク質を発現させることができる。ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域を保有する発現プラスミド上にzntR遺伝子を共存させて、転写促進因子であるZntRタンパク質の供給量を高めることにより、本発明に用いられるプロモーターの誘導発現を増強してもよい。
　ZntRタンパク質としては、例えば、配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質があげられる。配列番号６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０%以上、好ましくは８５%以上、さらに好ましくは９０%以上、特に好ましくは９５%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が用いられる。アミノ酸配列の同一性は、前記のアルゴリズムに従って決定することができる。
　zntR遺伝子としては、例えば、配列番号５で表される塩基配列を含む核酸、あるいは配列番号５で表される塩基配列と８０%以上、好ましくは８５%以上、さらに好ましくは９０%以上、特に好ましくは９５%以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸が用いられる。塩基配列の同一性は、前記のアルゴリズムに従って決定することができる。
　ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結されたベクターとしては、ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結されたベクターであれば、例えばプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターまたはウイルスベクターなどいずれのベクターも使用することができる。
　「ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結されたベクターを、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞に導入してなる微生物」は、例えば（１）zntR遺伝子を有する宿主細胞に該ベクターを導入した後に、その染色体上に存在するzntA遺伝子またはそのZntAタンパク質のホモログタンパク質をコードする遺伝子の一部または全部を欠損させ亜鉛排出活性を低下または喪失させる方法、（２）染色体上のZntAタンパク質またはそのホモログタンパク質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損して亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞に該ベクターを導入する方法等を用いて調製することができる。
　「ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結された核酸を、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞の染色体上に組み込んでなる微生物」は、例えば亜鉛排出型トランスポーターの変異遺伝子に代えてZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸を用いる以外は、染色体上の亜鉛排出型トランスポーター遺伝子の一部または全部を欠損させる方法と同様の相同組換え方法を用いて、調製することができる。
　該微生物は、薬剤耐性遺伝子をコードする核酸、ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域の核酸および所望のタンパク質をコードする核酸をそれぞれ含む核酸の両末端に染色体上の導入部位の核酸と相同性を有する核酸を配した直鎖の核酸をPCRで合成し、該直鎖の核酸を常法によって亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞に導入した後、相同組換えによって該直鎖の核酸が染色体に組み込まれた形質転換体を、薬剤耐性を指標にして選択することにより、調製することもできる。
　「ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域を、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞の染色体上の所望のタンパク質をコードする核酸と機能的に連結してなる微生物」は、上記の相同組換え方法、例えばZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域の両末端に染色体上の所望のタンパク質をコードする核酸の5’上流領域と相同性を有する核酸を配した核酸を、宿主細胞中では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドと連結して作製した相同組換え用プラスミドを用いる方法等を用いて、調製することができる。
　該微生物は、ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域の核酸と宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子とを含む核酸の両末端に、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞に導入する染色体上の所望のタンパク質をコードする核酸と相同性を有する核酸を配した直鎖の核酸をPCRで合成し、該直鎖の核酸を常法によって該宿主細胞に導入した後、相同組換えによって該直鎖の核酸が染色体に組み込まれた形質転換体を、薬剤耐性を指標にして選択することにより、製造することもできる。
　直鎖の核酸の両末端に存在する、染色体上の導入部位の核酸と相同性を有する核酸としては、染色体上の導入部位の核酸と８０%以上、好ましくは８５%以上、さらに好ましくは９０%以上、特に好ましくは９５%以上の同一性を有する、通常１０～１００塩基、好ましくは２０～５０塩基、さらに好ましくは３０～４０塩基からなる核酸を、染色体上のＤＮＡの塩基配列の方向と同じ方向に配置したものが用いられる。
　ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域、または該プロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結した核酸を組み込む染色体上の位置は、微生物の生育に影響を与えなければ、いずれの位置であってもよい。
　ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結された核酸が染色体上に組み込まれていることは、染色体上で組み込まれた核酸が存在する領域の塩基配列を決定することで確認できる。
　本発明の微生物を用いて製造できる有用物質は、微生物が生産することができる工業上有用とされている物質であればいずれでもよく、好ましくはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸および脂質などをあげることができる。タンパク質としては、イノシンキナーゼ、Glutamate 5-kinase (EC 2.7.2.11)、Glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.41)、Pyrroline-5-carboxylate reductase (EC 1.5.1.2)、Xylose reductase、P450等の酵素、ヒト顆粒球コロニー刺激因子等の生理活性タンパク質、受容体、抗体、抗体フラグメントなどをあげることができる。ペプチドとしては、グルタチオンなどをあげることができる。アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、グリシン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－バリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－システイン、Ｌ－３－ヒドロキシプロリン、Ｌ－４－ヒドロキシプロリンなどをあげることができる。核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸などをあげることができる。ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸などをあげることができる。糖としては、キシロースなどをあげることができ、糖アルコールとしては、キシリトールなどをあげることができる。アルコールとしては、エタノールなどをあげることができ、有機酸としては乳酸、コハク酸などをあげることができる。脂質としては、EPA(エイコサペンタエン酸)やDHA（ドコサヘキサエン酸）などをあげることができる。
　上記の有用物質は、本発明の微生物を培地に培養し、培養物中に該有用物質を生成蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することなどにより製造することができる。
　本発明の有用物質の製造において用いられる培養方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法を用いることができる。すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
　炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等、さらにはグリセロールを用いることができるが、特にグルコースを炭素源として用いることが好ましい。
　窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物を用いることができる。天然物由来の窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等の中で、亜鉛の含有量が発現コントロールに影響を与えないレベルのものであれば使用できる。
　無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
　培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常15～40℃で、培養時間は通常5時間～7日間である。培養中のpHは通常3.0～9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーターによる所望のタンパク質の発現を抑制する場合の培地中の亜鉛の濃度は、20μM未満が好ましく、10μM以下がより好ましく、5μM以下がさらに好ましい。
　ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーターによる所望のタンパク質発現を誘導する場合の培地中の亜鉛の濃度は、20～2000μMが好ましく、20～800μMがより好ましく、40～400μMがさらに好ましく、100～400μMが特に好ましい。培養期間中に該プロモーターによる所望のタンパク質発現を誘導させる場合は、亜鉛を、好適には硫酸亜鉛、塩化亜鉛として、培地中の亜鉛の終濃度が上記の濃度となるように添加すればよい。培地中に亜鉛を添加する時期は、OD600が0.5～1.5であることが好ましく、0.6～1.4であることがより好ましく、0.7～1.3であることがさらに好ましく、0.8～1.2であることが特に好ましい。
　有用物質が菌体外に生成、蓄積した場合には、培養終了後、培養物から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、培養物から目的する有用物質を単離、精製することができる。有用物質が、菌体内に生成、蓄積される場合には、培養終了後、培養物から菌体を回収した後、機械的または化学的方法等の適切な方法で破砕する。該菌体破砕液から、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、該菌体破砕液から目的とする有用物質を単離、精製することができる。
　以下に、本発明の実施例を示す。
（実施例１）
zntAプロモーター領域制御下でのLacZタンパク質をコードする核酸の発現　
（１）プラスミドの構築
　大腸菌のzntA遺伝子のプロモーター領域から下流のzntAオープンリーディングフレームの開始コドン（ATG）までを含む領域を、配列番号7および8で表される塩基配列から成るDNAをセットとして用いたPCRにより、大腸菌W3110株の染色体DNAを鋳型として増幅した。増幅したDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、Qiagen社のQIA quick Gel Extraction Kitにより精製した。精製したDNA断片をEco RIおよびHind IIIで切断し、EcoRIとHind IIIで切断したプラスミドpRW50（FEMS Microbial Letter, 1992,95,271-276）と連結してpRWPzntAを調製した。pRWPzntAの上記プロモーター領域は、シーケンシングによって確認した。pRWPzntAは、zntAプロモーター領域の下流にLacZタンパク質をコードする核酸（lacZ遺伝子）を配置しており、zntAプロモーター活性をβ－ガラクトシダーゼ活性（LacZ活性）を指標として定量化することができる。
（２） zntA遺伝子欠失株でのzntAプロモーター領域によるLacZタンパク質の発現
　大腸菌BW25113株(国立遺伝研究所が保有するMEコレクションのME9062株)および大腸菌BW25113株からzntA遺伝子を欠失したΔzntA株（国立遺伝研究所が保有するKeioコレクションのJW3434株）に先に作製したpRWPzntAをそれぞれ形質転換して、WT-PzntA株およびΔzntA-PzntA株を得た。
　これら形質転換株をそれぞれLB培地中で、37℃、10時間前培養した後、M9最小培地に5 mg/L FeSO4・7H2O、2 mM MgSO4・7H2O、0.1 mM CaCl2、4%グルコースおよび0.1%カザミノ酸を添加し、テトラサイクリンを10～20 mg/ml添加した１Lの培地中でそれぞれ本培養を実施した。本培養は、2 L容量ガラス製ジャーファーメンターを用いて、37℃、20時間行った。培養液はアンモニアを用いてpH7に維持した。zntAプロモーター領域を誘導発現させる場合には、本培養開始12～12.5時間後に、終濃度が400 mMとなるようにZnSO4・7H2Oを培地に添加した。菌体量の変化を分光光度計（BDバイオサイエンス社製）を用いて測定した。結果を図１に示す。
　LacZ活性は、サンプリングした培養液のOD660値が1.0未満になるように希釈し、Millerの実験方法 (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972, pp.349-376) に準じて測定した。プレートリーダー測定装置（パーキンエルマー社製）を用いてLacZ活性を測定した。結果を図２に示す。
　亜鉛を無添加しない場合は、WT-PzntA株、ΔzntA-PzntA株のLacZ活性はともに15 Miller unit 以下に抑えられた。亜鉛を添加した場合は、WT-PzntA株のLacZ活性100 Miller unit 程度であったのに対して、ΔzntA-PzntA株のLacZ活性約500 Miller unit を示した。
　結果に示されるとおり、zntAプロモーター領域を含有するベクターとzntA遺伝子欠損株との組み合わせによって、LacZタンパク質の発現を亜鉛無添加時には厳密に抑制し、亜鉛添加時には誘導することができた。
（実施例２）
亜鉛の添加によるzntAプロモーター活性の誘導
　WT-PzntA株およびΔzntA-PzntA株をそれぞれLB培地で、37℃、10時間前培養した後、M9最小培地に5 mg/L FeSO4・7H2O、2 mM MgSO4・7H2O、0.1 mM CaCl2、4%グルコース、20g/L CaCO3および0.1%カザミノ酸を添加し、テトラサイクリンを10～20 mg/ml添加した25 mLの培地中でそれぞれ本培養を実施した。本培養は、300 mL容量三角フラスコを用いて、37℃、250 rpmで撹拌培養を実施した。zntAプロモーター活性を誘導させる際には、本培養を開始して8時間後に終濃度がそれぞれ0、2.5、5.0、7.5、10、20、30、40、50、100、200、400 mMとなるようにZnSO4・7H2Oを添加した。菌体量の変化を分光光度計（BDバイオサイエンス社製）を用いて測定した。結果を図３に示す（亜鉛濃度が0、400 mMの結果のみを示す）。LacZ活性は、実施例１（２）と同様な方法で測定した結果を図４に示す。
　図４に示されるとおり、添加する亜鉛濃度に応じて、LacZタンパク質の発現量が増大した。
　本発明によれば、亜鉛を誘導物質として添加することでタンパク質の発現の制御できる微生物を提供できる。該微生物を用いることで、宿主細胞にとって有害なタンパク質、基礎代謝への干渉が問題となるような酵素等であっても、生育停止期に発現させることができるため、広範な有用物質を製造することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１１－０４３２０９（出願日：平成２３年２月２８日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (10)

  1. ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結された核酸を有し、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する微生物。
  2. ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結されたベクターを、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞に導入してなる、請求項１記載の微生物。
  3. ベクターがプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターまたはウイルスベクターである、請求項２記載の微生物。
  4. ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域と所望のタンパク質をコードする核酸とが機能的に連結された核酸を、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞の染色体上に組み込んでなる、請求項１記載の微生物。
  5. ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域を、亜鉛排出活性が低下または喪失し、かつzntR遺伝子を有する宿主細胞の染色体上の所望のタンパク質をコードする核酸と機能的に連結してなる、請求項１記載の微生物。
  6. ZntRタンパク質結合部位が配列番号１で表される塩基配列からなる核酸である、請求項１～５のいずれか１項に記載の微生物。
  7. ZntRタンパク質結合部位を含むプロモーター領域が、配列番号２で表される塩基配列からなる核酸である、請求項１～６のいずれか１項に記載の微生物。
  8. 亜鉛排出活性が低下または喪失した宿主細胞が、染色体上のzntA遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損している変異株である、請求項１～７のいずれか１項に記載の微生物。
  9. 宿主細胞が、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバウテリウム属またはサッカロマイセス属に属する微生物である、請求項１～８のいずれか１項に記載の微生物。
  10. 請求項１～９のいずれか１項に記載の微生物を用いる有用物質の製造方法。
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