JP2003528616A

JP2003528616A - 組換えタンパク質産物の発現のための改善された方法および細胞

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Publication number: JP2003528616A
Application number: JP2001570798A
Authority: JP
Inventors: マークディー．ベター，
Original assignee: ゾーマテクノロジーリミテッド
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2001-03-19
Publication date: 2003-09-30
Also published as: US6803210B2; CA2404046C; DK1268823T3; PT1268823E; ATE377649T1; DE60131261D1; DE60131261T2; AU2001249265B2; US20050260705A1; WO2001073082A2; ES2295151T3; AU4926501A; EP1268823A2; US20020037552A1; CA2404046A1; CY1107173T1; EP1268823B1; WO2001073082A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般的に、誘導物質のための活性な輸送系の１つ以上を欠く細菌宿主細胞において、誘導性プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）の転写制御下での組換えタンパク質産物の発現のための、改善された方法に関する。ａｒａＢプロモーターの場合、この誘導物質は、Ｌ−アラビノースである。本発明はまた、誘導物質（例えば、Ｌ−アラビノース）のための活性な輸送系の１つ以上を欠き、かつ誘導性プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）の転写制御下での組換えタンパク質産物をコードするベクターの発現を含む、改善された細菌宿主細胞に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、一般的に、誘導物質のための活性な輸送系の１つ以上を欠く細菌宿
主細胞において、誘導性プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）の転写
制御下での組換えタンパク質産物の発現のための、改善された方法に関する。ａ
ｒａＢプロモーターの場合、この誘導物質は、Ｌ−アラビノースである。本発明
はまた、誘導物質（例えば、Ｌ−アラビノース）のための活性な輸送系の１つ以
上を欠き、かつ誘導性プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）の転写制
御下での組換えタンパク質産物をコードするベクターの発現を含む、改善された
細菌宿主細胞に関する。

【０００２】（発明の背景）細菌性の宿主における組換えタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む
）の発現については、多くの系が記載されてきたが、グラム陰性菌（例えば、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）におけるほとんどの遺伝子の発現系は、細菌
プロモーターの限定されたセットに排他的に依存した。最も広く使用される細菌
プロモーターとしては、ラクトース［ｌａｃ］プロモーター（Ｙａｎｉｓｃｈ−
Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５、Ｇｅｎｅ３３：１０３−１０９）、およびトリプ
トファン［ｔｒｐ］プロモーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９８０、Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄｏｎ）２８７：４１１−４１６）、ならびにこれら２つ［ｌａｃおよ
びｔｙｐ］に由来するハイブリッドプロモーター（Ｂｒｏｓｉｕｓ、１９８４、
Ｇｎｅｎｅ２７：１６１−１７２；およびＡｍａｎｎａおよびＢｒｏｓｉｕｓ
、１９８５、Ｇｎｅｎ４０：１８３−１９０）が挙げられた。他の一般に使用
される細菌プロモーターとしては、ファージλプロモーターＰ_ＬおよびＰ_Ｒ（Ｅ
ｌｖｉｓら、１９９０、Ｇｅｎｅ３７：１２３−１２６）、ファージＴ７プロ
モーター（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：１０７４−１０７８）、ならびに
アルカリホスファターゼプロモーター［ｐｈｏ］（Ｃｈａｎｇら、１９８６、Ｇ
ｅｎｅ４４：１２１−１２５）が挙げられる。これらのプロモーターの各々は
、所望の特徴を有する。しかし、広範な種々の組換えタンパク質の発現のための
理想的なプロモーターは、これら一般に使用される系に見出されない特定の特徴
を提供する。例えば、多くの組換え産物は、発現宿主にとって毒性であり得る。
従って、遺伝子が所望でない場合に、培養物増殖の間の遺伝子の発現を厳重に調
節することが、プロモーターにとってしばしば好ましい。対照的に、遺伝子の発
現が所望される場合、このプロモーターは、容易に制御されなければならず、そ
して高い発現レベルがしばしば好まれる。この遺伝子発現を開始する因子または
環境条件は、容易に使用されかつ理想的には低コストであるべきである。一般に
、厳重に制御された系が、最も好ましい。最も好ましいプロモーターおよび一般
的発現系の特徴としては、誘導物質の非存在下で厳重に抑圧された遺伝子発現、
および誘導物質の存在下で非常に活性化された遺伝子発現が挙げられる。組換え
産物の発現レベルが細胞培養物に添加された誘導剤に比例させる系がまた、所望
される。

【０００３】誘導物質の非存在下で厳重に抑圧された遺伝子発現、および誘導物質の存在下
で非常に活性化された遺伝子発現を提供するために特に有利であることが証明さ
れた細菌プロモーター系の１つは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の
ａｒａＢプロモーターである。目的のものは、米国特許第５，０２８，５３０号
（本明細書中で参考として援用される）であり、これは、微生物学的技術による
ポリペプチド（セクロピンを含む）の産生のためのａｒａＢ発現系の使用を記載
する。ａｒａ発現系の２つの特徴が、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌における組換え
産物の発現にとって、この発現系を特に非常に適したものにした。第一に、ａｒ
ａＢプロモーターの制御要素が、約３００塩基対の調節領域内に含まれ、そして
ａｒａＣ遺伝子をコードする１つの機能的コード配列のみがさらに必要であるこ
とから、利用が容易である。第二に、この系の調節が非常に厳密であることが証
明されている。すなわち、マルチコピーの発現プラスミド上のａｒａＢプロモー
ターから誘導された状態（アラビノースを含む）における産物の量に対する抑圧
された状態（アラビノースを含まない）における産物の量の比は、比較的高く、
最も頻繁には、＞２００〜７５，０００の範囲である（Ｂｅｔｔｅｒら、１９９
９、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ：ＵｓｉｎｇＮａｔｕｒ
ｅｆｏｒｔｈｅＡｒｔｏｆＥｘｐｒｉｓｓｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、９５−１０７頁）。従って、ａｒａ系からの
タンパク質発現のレベルは、非常に低い。この特徴は、宿主にとって毒性のタン
パク質産物（組換えペプチドおよびポリペプチドを含む）が発現される場合に、
特に重要かつ有用である。

【０００４】Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌は、細胞内へのアラビノースの活性な輸送のための
２つの既知の系を有する。これらの系のうち、第一のものは、誘導性であり、ａ
ｒａＥ遺伝子の産物によって触媒される蓄積プロセスにエネルギー依存的である
。このａｒａＥ遺伝子産物は、約５２，０００Ｄａの、低親和性のアラビノース
輸送系を構成する膜結合タンパク質である（Ｍａｉｄｅｎら、１９８８、Ｊｏｕ
ｒｎａｌｏｆＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：８００３−８１０１）。第二の
Ｌ−アラビノース輸送系は、Ｌ−アラビノースに対するより高い親和性を有し、
そしてＬ−アラビノース結合タンパク質、ＡｒａＦの活性に依存する。このアラ
ビノース結合タンパク質ＡｒａＦをコードする遺伝子座は、ａｒａＧおよびａｒ
ａＨと共にオペロンの一部である。これら３つの遺伝子ａｒａＦＧＨ由来のタン
パク質産物は、高親和性のＬ−アラビノース輸送系を形成する（Ｈｏｒａｚｄｏ
ｖｓｋｙおよびＨｏｇｇ、１９８９、Ｊｏｕｒ．ｏｆＢａｃｔｅｒ．１７１：
３０５３−３０５９）。アラビノース輸送系欠失変異体のＥ．ｃｏｌｉ株が、調
製されている（例えば、Ｍａｉｄｅｎら、上出；Ｈｏｒａｚｄｏｖｓｋｙおよび
Ｈｏｇｇ、上出を参照のこと）。

【０００５】細菌におけるポリペプチドの発現のためのａｒａＢプロモーターの使用に関連
する以下の参照の開示が、興味深い。

【０００６】Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、１９８５，Ｇｅｎｅ３４：１３７〜１４５は、ａｒａ
調節領域（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来の完全ａｒａＣ遺伝子およびａｒａ
Ｂ遺伝子の一部）を含むベクターｐＩＮＧ１を記載した。制限部位は、遺伝子融
合物または多重遺伝子転写単位が、アラビノース制御下で発現し得るように、ａ
ｒａＢ遺伝子のコード領域に導入した。この系は、特定の環境下でＥ．ｃｏｌｉ
において通常発現される相同性の（細菌の）タンパク質（すなわち、Ｍ１３遺伝
子１１（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９８５）および遺伝子８タンパク質（Ｋｕｈｎお
よびＷｉｃｋｎｅｒ，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１５９０７
〜１５９１８）を発現するために使用され、そして同様のベクターを使用して、
Ｅ．ｃｏｌｉＦプラスミドからＲｅｐＥタンパク質を発現した（Ｍａｓｓｏｎ
ら，１９８６，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１４：５５６９３〜５７
１１）。これらのタンパク質のそれぞれは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の細胞質に産生さ
れ、そして発現されたタンパク質の少なくともいくつかは、可溶性であり、そし
て、インビボかまたは細胞抽出物のいずれかで活性形態で検出され得た。

【０００７】Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８，Ｓｃｉｎｅｃｅ２４０：１０４１〜１０４３は
、非相同性の（非細菌の）組換えタンパク質の発現を制御するように続いて操作
されたｐＩＮＧ１由来のａｒａＢ発現系を記載した。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるａｒ
ａＢ発現系を用いて首尾よく生成された非相同的なタンパク質は、免疫グロブリ
ンＦａｂドメインを含む。この場合、ａｒａＢ発現系は、細菌の細胞質膜を介し
て疎水性シグナル配列に直接的に結合されるポリペプチドの生成を指向するため
に使用された。ここでＦａｂは、正確に折りたたまれた、完全な活性立体配置で
蓄積し、そして培養上清から直接的に回収され得た。ａｒａＢプロモーターの転
写制御下におけるＦａｂドメインの発現は、ヘテロダイマーの、非相同的なタン
パク質が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成され得ることを最初に実証した。最初に報
告された発現レベルは、約１〜２μｇ／ｍＬであったが、後の研究において、タ
ンパク質発現のレベルは、発酵槽中で高細胞密度まで細菌を増殖することによっ
て約１０００倍近くに増大した（Ｂｅｔｔｅｒら、１９９０，ＩＣＳＵＳｈｏ
ｒｔＲｅｐ．１０：１０５）。対照的な、Ｃｌａｒｋら，１９９７，Ｉｍｍｎ
ｕｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：２１７〜２２６はｌａｃ制御下でＦａｂ遺伝子
が、細菌の増殖を阻害し得、そしてまた、Ｐ_ＢＡＤからのＦａｂ発現は、Ｐ_ｌａ _ｃからの発現よりもよりしっかりと抑制されたことを見出した。

【０００８】Ｂｅｔｔｅｒら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６７１２〜
１６７１８；Ｎｏｌａｎら、１９９３，Ｇｅｎｅ１３４：２２３〜２２７；お
よびＢｅｒｎｈａｒｄら、１９９４．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．５
：１２６〜１３２は、ａｒａＢ発現系が、他のタンパク質の生成に首尾よく使用
され得ることを示した。いくつかの植物および真菌のリボソーム不活化タンパク
質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアラビノースの直接制御下において発現された。こ
のようなタンパク質の１つ、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）は、Ｅ．ｃｏｌｉにお
いて分泌されたタンパク質として発現し、そして無細胞培養上清における完全な
活性タンパク質として１ｇ／Ｌよりも多く蓄積した。ヒト細胞および細胞毒性分
子（例えば、ゲロニン）に対する抗原を標的とし得る抗体ドメイン間の融合タン
パク質はまた、アラビノースの転写制御下において発現した（Ｂｅｔｔｅｒら，
１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２７０：１４９５１〜１４９５７）。これ
ら免疫融合タンパク質は、４００ｍｇ／Ｌより多いアラビノース誘導細胞からの
無細胞培養上清中に蓄積した。ａｒａＢプロモーターの転写制御下でＥ．ｃｏｌ
ｉにおいて発現された。免疫融合タンパク質のファミリーのメンバーは、動物細
胞が産生した全抗体および植物から直接的に精製されたリボソーム不活化タンパ
ク質から作製された、化学的に調製された免疫結合体の免疫融合タンパク質に匹
敵する生物学的活性を、インビトロとインビボの両方において保持した。

【０００９】Ｊａｃｏｂｓら、１９８９，Ｇｅｎｅ８３：９５〜１０３およびＲｏｍｅｙ
ｅｒら、１９９０，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：２
７４８〜２７５４はまた、細菌の細胞膜の外側に位置し得る哺乳動物タンパク質
をコードするｐＩＮＧ１由来のプラスミドを使用した。１つの例において、ヒト
メタロチオネインＩＩ遺伝子は、リーダーおよびＥ．ｃｏｌｉのリポタンパク質
Ｌｐｐの膜関連フラグメントに結合した（Ｊａｃｏｂｓら，１９８９）。アラビ
ノースを用いて誘導した場合、この発現ベクターを有する細菌は、外側の細胞膜
に活性メタロチオネインタンパク質を指向する。この組換えタンパク質は、非誘
導レベルより約７５，０００倍生成された。この系を使用して、以前Ｅ．ｃｏｌ
ｉにおいていくらか毒性かつ不安定であった活性非相同的を使用してタンパク質
を発現した。

【００１０】Ｃａｇｎｏｎら、１９９１、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．４：８４３〜８４７は
、多くの他の任意の特徴と一緒にベクターｐＫＫ２３３．２においてｐＩＮＧｌ
由来のａｒａ発現系を含む、一連の発現ベクターを記載した。このＣａｇｎｏｎ
シリーズの発現ベクターにおいて、ａｒａＢのプロモーター／オペレーター領域
の後に、都合の良い遺伝子クローニングのためのポリリンカー領域が続いた。さ
らに、いくつかのベクターは、合成シグナル配列、ｆｌファージの複製起点、お
よび変異ａｒａＢプロモーター配列を含んだ。この変異ａｒａＢプロモーターは
、−１０領域において変化を組み込んでおり、それによりこのプロモーターは、
コンセンサスＥ．ｃｏｌｉプロモーターにより密接に一致した。このプロモータ
ー変異は、マーカー遺伝子についてより高いレベルの誘導性発現（２倍）を生じ
たが、非誘導性発現レベルも同様に増加した。いくつかの組換えタンパク質（Ｈ
ＩＶウイルス由来の全長Ｔａｔタンパク質（Ａｒｍｅｎｇａｕｄら、１９９１、
ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２８２：１５７〜１６０）、および細菌性タンパク質：β
−ガラクトシダーゼ（Ｃａｇｎｏｎら、１９９１）、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔ
ｅｉｃｈｕｓｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（Ｃａｇ
ｎｏｎら、１９９１）およびコレラ毒素サブユニットＢ（Ｓｌｏｓら、１９９４
、ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．５：５１８〜５２６）を含む
）が、このファミリーのａｒａ発現ベクターから発現された。このコレラ毒素サ
ブユニットＢ（ＣＴ−Ｂ）は、ｏｍｐＡシグナル配列に連結され、そして分泌タ
ンパク質として発現された。ＣＴ−Ｂは、ペリプラズムタンパク質のおよそ６０
％に蓄積し、そしてＣＴ−Ｂは、パイロットスケールで約１ｇ／リットルで産生
された。ＣＴ−Ｂの大部分は、培養培地中に放出され、そして細胞を含まない培
養培地から８０％より高い収率で回収され得た。

【００１１】Ｐｅｒｅｚ−ＰｅｒｅｚおよびＧｕｔｉｅｒｒｅｚ、１９９５、Ｇｅｎｅ１
５８：１４１〜１４２は、発現宿主におけるＣｏｌＥ１誘導体プラスミドとの適
合性を保持する、ｐＡＣＹＣ１８４におけるａｒａ発現系を記載した。

【００１２】Ｇｕｚｍａｎら、１９９５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：４１２１〜４
１３０は、種々の選択マーカーおよびマルチクローニングサイトを組み込む一連
のａｒａＢ発現ベクターを記載した。この一連のベクターは、ネイティブなＥ．
ｃｏｌｉタンパク質の発現について広範に研究された。Ｇｕｚｍａｎら、（１９
９５）はまた、ａｒａＢ系を使用して、「非常に低いレベル非の誘導発現を達成
し得、誘導物質の存在下で中程度に高いレベルの発現を得て、そして広い範囲の
誘導物質濃度にわたって発現を調節し得る」という証拠を提示した。アラビノー
ス誘導の程度が、培養に添加される誘導物質の量によって調節され得る、という
可能性が生じた。

【００１３】他の人たちは、ａｒａＢプロモーターの制御下での遺伝子発現が、培養培地中
に導入されるアラビノースの濃度によって直接的に調節されるようであることを
報告した（ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ、１９９７、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓＲｅｓｅａｃｈ２５：１２０３〜１２１０；およびＣａｒｒｉｅｒら、１
９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ５９：６６６
〜６７２）。しかし、対照的に、ＳｉｅｇｅｌｅおよびＨｕ、１９９７、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：８１６８〜８１７２は、亜飽
和のアラビノース濃度でａｒａＢプロモーターを含むプラスミドからの遺伝子発
現が、実際に、誘導細胞と非誘導細胞との混合集団の集団平均を表すということ
を実証した。従って、培養における中間発現レベルは、集団における誘導細胞と
非誘導細胞との平均を単に反映し、直接の調節を反映しなかった。Ｓｉｅｇｅｌ
ｅおよびＨｕ（前出）は、変異緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）についてのレポー
ター遺伝子を含むプラスミドを構築し、そしてこれらのプラスミドは、ａｒａＢ
プロモーターの転写制御下でＡｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タン
パク質の速い折り畳み（ｆａｓｔ−ｆｏｌｄｉｎｇ）変異体を発現した。低いア
ラビノース濃度で増殖した細胞の顕微鏡検査は、明るい蛍光の細胞および暗色の
細胞の混合物を示し、このことは培養における中間発現レベルは、集団平均の反
映であることを示唆した。誘導物質アラビノースが細胞中に能動輸送されるので
、任意の所定の細胞における誘導の量は、この細胞中に能動輸送されるアラビノ
ースの量によって変化することが予期された。従って、細胞の集団における誘導
の平均量は、今度は、その細胞の集団中に能動輸送されるアラビノースの平均の
量を示す。しかし、高濃度のアラビノースを含む細胞は、十分に誘導されること
に注目することは、重要である。同様の現象がまた、ラクトース輸送およびｌａ
ｃオペロンの誘導で報告された（ＮｏｖｉｃｋおよびＷｅｉｎｅｒ、１９５７、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４３：５５３、ならびにＭａ
ｌｏｎｅｙおよびＲｏｔａｎ，１９７３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ７３：７１〜
９１）。従って、これらの参考文献（ＳｉｅｇｅｌｅおよびＨｕ（前出）を含む
）は、ａｒａＢベクターが、ｌａｃリプレッサーによって調節されるプラスミド
と比較して、速い調節および低い基礎レベル発現の平均を有すると言えども、ａ
ｒａＢプロモーターは、細胞間のアラビノースの取り込みにおける変動に起因し
て、クローン化された遺伝子の発現を調節することによく適しているわけではな
いと結論付けている。

【００１４】上記に列挙した参考文献は、ａｒａＢ発現系が、細菌系における組換えタンパ
ク質の制御された発現に有用であることを示す。これらの参考文献は、ａｒａＢ
系が、他の細菌発現系において見出されない利点を提供することをさらに示す。
しかし、当該分野でなお直面している問題は、細胞におけるタンパク質発現の量
がインデューサ（例えば、アラビノース）の培養培地中に存在する量に実際比例
するという、直接的に調節された細胞培養物を生成することである。細菌細胞中
の組換え産物の誘導は、続く細胞増殖をしばしば阻害し得るので、遺伝子の発現
が、存在する誘導物質の量によって直接的かつ比例的に調節され得る細胞培養物
を生成することが所望される。

【００１５】（発明の要旨）本発明は、誘導プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）の転写制御下
での、ペプチドおよびポリペプチドを含む組換えタンパク質産物の発現のための
改善された方法、に関する。本発明に従って、細菌宿主細胞は、誘導プロモータ
ーの転写制御下での組換えタンパク質産物の発現のためのベクターを含み、プロ
モーターの誘導物質についての能動輸送系の欠損を用いて遺伝的に操作される。
本発明は、新規の遺伝的に操作された細菌宿主細胞を特に提供し、この細胞は、
Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅファミリーの関連細
菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＰｒｏｔｅｕｓおよびＥ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒの種を含む）における２つの公知のＬ−アラビノース輸
送系の１つまたは両方を遺伝的に欠損しており、そして組換えタンパク質産物を
発現し得る。このような輸送欠損細菌宿主細胞（アラビノース輸送欠損細菌宿主
細胞を含む）の使用は、誘導プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）の
転写制御下での組換えタンパク質産物の発現について、組換えタンパク質産物の
発現を増加させるために、誘導後の宿主細胞の増殖阻害を弱め、ならびに／また
は輸送熟練（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ−ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）細胞における発現と
比較して直接的かつ同期的な発現誘導をこのような宿主細胞に提供する。従って
、組換えタンパク質産物（治療用薬剤、予防用薬剤および／または診断用薬剤と
して有用なタンパク質産物を含む）は、本発明の方法に従って、効率的かつ経済
的に産生される。

【００１６】本発明は、誘導プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）の誘導制御下
で組換えタンパク質産物を産生するための方法を提供し、この方法は、以下：（
ａ）誘導（例えば、ａｒａＢ）プロモーターの制御下で、組換えタンパク質産物
をコードする組換え発現ベクターを、細菌宿主細胞中に導入する工程であって、
この宿主細胞は、この宿主細胞中における誘導物質（例えば、アラビノース）の
能動輸送についての少なくとも１つの系を遺伝的に欠損している、工程；および
（ｂ）誘導物質（例えば、アラビノース）を用いて組換えタンパク質産物の発現
を誘導する工程、を包含する。

【００１７】本発明に従って、改善された方法は、細菌細胞の培養物の直接調節（同期誘導
を含む）を提供し、ここで、組換えタンパク質産物の発現は、誘導物質（例えば
、アラビノース）の培養濃度に比例する。本発明に従って遺伝的に操作された宿
主細胞（誘導（例えば、ａｒａＢ）プロモーターの転写制御下でのタンパク質産
物の発現のためのベクターを含み、誘導物質（例えば、アラビノース）輸送を欠
損する）において、誘導物質（例えば、アラビノース）の細胞内濃度が培養培地
中の誘導物質（例えば、アラビノース）の濃度に比例する。なぜなら、受動拡散
が、細菌の膜を横切る誘導物質（例えば、アラビノース）の細胞内集積のための
唯一の機構であるからである。これが、発現の直接調節であり、そして宿主細胞
における組換えタンパク質産物の発現の同期誘導を引き起こす。従って、本発明
の方法は、誘導プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）から輸送熟練細
菌宿主における発現では見出されない利点を提供し、ここで、誘導された細胞お
よび誘導されていない細胞が混合した集団が存在し、そしてここで、組換え産物
の量と誘導物質（例えば、アラビノース）の飽和下（ｓｕｂｓａｔｕｒａｔｉｎ
ｇ）量での誘導物質の濃度との間の明確な関係は、誘導された細胞および誘導さ
れていない細胞の両方における発現の集団平均を反映する。

【００１８】本発明はまた、誘導物質（例えば、Ｌ−アラビノース）についての能動輸送系
の１つ以上を欠損し、かつ誘導プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）
の転写制御下で組換えタンパク質産物をコードする発現ベクターを含む細菌宿主
細胞を提供する。このような細胞は、種々のタンパク質産物の産生に有用である
。本発明に従って、組換えタンパク質産物は、治療用薬剤、予防用薬剤および／
または診断用薬剤であり得る。このような組換え産物としては、タンパク質産物
、好ましくは動物および植物由来の産物（レポーター遺伝子産物でもマーカー遺
伝子産物でもない）が挙げられ得る。この組換え産物は、哺乳動物遺伝子産物（
例えば、ヒトまたはヒト様タンパク質産物）を含む。

【００１９】（発明の詳細な説明）本発明の方法は、誘導性プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）の転
写制御下で発現される組換えタンパク質産物の発現レベルが、プロモーターの誘
導物質のための少なくとも１つの活性な輸送システム（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの
アラビノース輸送システムの一方かまたは両方）を欠失している細菌細胞におい
て、より高くあり得るという驚くべき発見に基づく。また、驚くべきことに、こ
のような輸送の欠失している宿主細胞の細菌細胞における実質的な増殖抑制の低
下が、輸送の有能な細胞におけるものと比較して達成される。例えば、アラビノ
ースを用いると、アラビノースに起因するこのような増殖抑制の低下は、このよ
うな輸送の欠失している細胞を伴って、約１０〜１００倍高いアラビノース濃度
を用いて観察され得、おおよそ同じかまたはより高いレベルまでの組換えタンパ
ク質発現を伴う。さらに、誘導物質（例えば、アラビノース）を有する組換えタ
ンパク質発現の直接的な調節および同調的な誘導が、驚くべきことに、このよう
な宿主細胞において実証された。本発明は、一般的に、誘導性プロモーター（例
えばａｒａＢプロモーター）の転写制御下で、誘導物質（例えば、Ｌ−アラビノ
ース）のための１つ以上の活性な輸送システムを欠失している細菌宿主細胞にお
ける、組換えタンパク質産物の発現のための改良された方法を示し、これによっ
て誘導性プロモーターの制御下における遺伝子発現は、培養培地中に存在する誘
導物質（例えば、アラビノース）の濃度によって直接的に調節され得る。宿主細
胞を誘導するのに有用なアラビノースの濃度は、約０．００００１％〜約１０％
（ｖ／ｖ）を含む。本発明はまた、一般的に、誘導性プロモーター（例えばａｒ
ａＢプロモーター）の転写制御下で、組換えタンパク質産物をコードする発現ベ
クターを含むプロモーターの誘導物質（例えば、Ｌ−アラビノース）のための１
つ以上の活性な輸送システムを欠失している細菌宿主細胞に関する。組換えタン
パク質産物の減少した発現は、本発明に従って、このような細菌宿主細胞によっ
て提供される。

【００２０】従って、本発明は、誘導性プロモーター（例えばａｒａＢプロモーター）の転
写制御下で、誘導物質（例えば、Ｌ−アラビノース）のための１つ以上の活性な
輸送システムを欠失している細菌宿主細胞における、組換えタンパク質産物の発
現のための改良された方法を提供する。このような誘導性プロモーター（例えば
、ａｒａＢ）の制御下における遺伝子発現は、培養培地中に存在する誘導物質（
例えば、アラビノース）の濃度によって直接的に制御され得る。詳細には、本方
法は、組換えタンパク質産物をコードする発現ベクターを含む細菌宿主細胞の開
発および使用を特に提供し、ここで、これらの細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける２
つの公知のＬ−アラビノース輸送システムの一方もしくは両方か、またはＥｎｔ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅファミリーの関連細菌のいずれかにおける類似
のアラビノース輸送システムを遺伝学的に欠失している。ａｒａＢプロモーター
の転写制御下における組換えタンパク質産物の発現のためのアラビノース輸送の
欠失している株の使用は、アラビノース輸送の有能な細胞における発現レベルと
比較して、誘導の後に、組換え産物の減少した発現および／または宿主細胞のよ
り低い増殖抑制を提供した。従って、本発明の方法は、細胞の産生および／また
は誘導された細菌宿主細胞由来の組換えタンパク質産物を増加させるのに有用で
ある。この改良された方法はまた、細菌培地中に導入される誘導物質（例えば、
Ｌ−アラビノース）の量を制御することによって、宿主細胞における組換えタン
パク質産物の量を直接的に調節するための手法を提供する。

【００２１】「ベクター」は、組換えタンパク質産物をコードし、そして細菌内で自律複製
し得る、組換え遺伝物質を含む、プラスミドまたはウイルスＤＮＡをいう。ベク
ターはまた、本明細書では、「組換え発現ベクター」または「発現ベクター」と
もいわれる。

【００２２】「形質転換」または「形質転換された」は、当該分野で公知の任意の形質転換
方法による組換え遺伝物質（例えば、ベクター（例えば、プラスミド））の細菌
細胞への導入をいう。このような組換え遺伝物質を受け入れた、細菌細胞または
細菌細胞由来のコロニーは、「形質転換体」といわれる。

【００２３】「形質導入」または「形質導入された」は、当該分野で公知の任意の形質導入
方法によるバクテリオファージの遺伝物質から細菌宿主への遺伝物質の導入をい
う。このような遺伝物質のセグメントをバクテリオファージから受け入れた細菌
細胞または細菌細胞由来のコロニーは、「形質導入体」といわれる。

【００２４】「遺伝的不全」は、ＤＮＡ変異（置換、欠失、および／または付加を含む）に
よる遺伝子産物の欠損または不全をいう。

【００２５】「組換えタンパク質産物」は、アミノ酸をコードする組換え遺伝物質から発現
されるレポーター遺伝子産物でもマーカー遺伝子産物（例えば、グリーン蛍光タ
ンパク質）でもない任意のタンパク質産物（ペプチド、ポリペプチド、タンパク
質、オリゴタンパク質、および／または融合タンパク質を含む）をいう。組換え
タンパク質産物は、好ましくは、レポーター遺伝子産物でもマーカー遺伝子産物
（例えば、グリーン蛍光タンパク質）でもない、動物または植物由来の産物であ
る。組換えタンパク質産物はまた、好ましくは、ヒトまたはヒト様αタンパク質
産物である。組換えタンパク質産物は好ましくは、哺乳動物または植物由来の組
換え産物である。組換えタンパク質産物は、好ましくは、治療的、予防的、また
は診断的産物である。「レポーター遺伝子産物」または「マーカー遺伝子産物」
は、遺伝子発現が生じているか否かを研究するために通常使用されている、容易
に検出可能な（すなわち、これらの発現のレポーターまたはマーカーとして働く
）タンパク質産物である、研究用手段をいう。例示的レポーター遺伝子産物また
はマーカー遺伝子産物は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）、Ｂ−ラクタマーゼ（
Ｂ−ｌａｃ）、Ｂ−ガラクトシダーゼ（Ｂ−ｇｅｌ）、およびグリーン蛍光タン
パク質（ｇｆｐ）の種々の形態を含む。

【００２６】タンパク質「ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）」は、本明細書は、ａｒａＢプロモ
ーターの転写制御下で組換え産物として発現されたリボソーム不活化タンパク質
ゲロニンをいう。組換えタンパク質ゲロニンは、植物Ｇｅｌｏｎｉｕｍｍｕｌ
ｔｉｆｌｏｒｕｍの種子からクローニングされた（本明細書において参考として
援用される、Ｎｏｌａｎら、１９９３、Ｇｅｎｅ１３４：２２３〜２２７、な
らびに共有に係る米国特許第５，３７６，５４６号および同第５，８３７，４９
１号に記載された通り）。ゲロニンは、ｐｅｌＢリーダー配列を用いて、Ｅ．ｃ
ｏｌｉにおいて分泌タンパク質として発現され、このリーダー配列は、共有に係
る米国特許第５，５７６，１９５号および同第５，８４６，８１８号に記載され
これらは、本明細書において参考として援用される。

【００２７】本発明に従って発現された組換えゲロニンタンパク質産物は、例示的な細菌宿
主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、例示的な誘導性のプロモーター（ａｒａＢプ
ロモーター）の転写制御下で発現される例示的な組換えタンパク質産物である。
本発明の発現された組換えタンパク質産物は、誘導性のプロモーター（好ましく
は、ａｒａＢプロモーター）の転写制御下で、レポーター遺伝子産物でもマーカ
ー遺伝子産物（例えば、グリーン蛍光タンパク質）でもないこのような組換えタ
ンパク質産物に関して、当該分野で公知の任意のアミノ酸配列を含み得る。本発
明は、誘導性（例えば、ａｒａＢ）プロモーターの誘導後に、任意の細菌区画に
蓄積するか、または無細胞の培養上清に分泌される、組換えタンパク質産物を提
供する。従って、本発明は、ペリプラズムまたは細胞質のいずれかにおいての誘
導後に、細菌宿主細胞に会合したままであるか、培養培地中に分泌される、組換
えタンパク質産物に関するが、これらに限定されない。

【００２８】本発明に従う有用なａｒａＢプロモーターは、例示的な誘導性プロモーターで
ある。この誘導性プロモーターの誘導物質は、アラビノース（天然に広く見出さ
れる五炭糖（ｆｉｖｅｃａｒｂｏｎｓｕｇａｒ）であり、多くの細菌におい
て増殖のための唯一の炭素源として役立ち得る）である。この誘導性のプロモー
ター系は、Ｂｅｔｔｅｒら（１９９９年、前出）において論評される。３つの遺
伝子（ａｒａＢ、ａｒａＡ、およびａｒａＤ）由来のタンパク質産物は、Ｅｎｔ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ）のメンバーにおけるアラビノース分解に必要であり、これらの
遺伝子は、ａｒａＢＡＤと略記されるクラスターを形成する。これらの遺伝子は
、１つのオペロン内に配置され、以下の酵素をコードする：リブロキナーゼ（Ａ
ｒａＢ）、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（ＡｒａＡ）およびＬ−リブロース−
５−リン酸−４エピメラーゼ（ＡｒａＤ）。ａｒａＢＡＤオペロンに隣接するの
は、複合プロモーター領域および調節遺伝子ａｒａＣである。ａｒａＢＡＤ遺伝
子とａｒａＣ遺伝子とは、反対の方向に転写される。ａｒａＢＡＤに対するプロ
モーター（Ｐ_ＢＡＤ）およびａｒａＣに対するプロモーター（Ｐ_Ｃ）の中および
周りに、ＡｒａＣタンパク質、サイクリックＡＭＰレセプタータンパク質（ＣＲ
Ｐ）、およびＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位がある。誘導物質（Ｌ−アラ
ビノース）の存在下または非存在下の両方で、単独または組み合せにおいて、こ
れらの領域に対して結合するタンパク質は、両方のプロモーターからの発現を強
く調節する。図４は、この複合体ａｒａＢＡＤおよびａｒａＣのプロモーター領
域内の調節部位の空間的な配置を例示する。

【００２９】Ｐ_ＢＡＤからの転写は、Ｌ−アラビノースで誘導し得る。アラビノースの存在
下で、Ｐ_ＢＡＤプロモーターのＲＮＡポリメラーゼ結合部位にすぐに隣接するａ
ｒａＩ部位で結合したＡｒａＣタンパク質は、ａｒａＢＡＤオペロンの転写を刺
激する。しかし、アラビノースの非存在下で、ＡｒａＣタンパク質は、ＤＮＡル
ープの形成に関与する機構によって、Ｐ_ＢＡＤからのｍＲＮＡ合成を抑制する。
アラビノースなしでは、ａｒａ調節領域のほとんどのコピーは、ａｒａＯ_２部位
およびａｒａＩ部位の両方に結合したＡｒａＣタンパク質によって媒介される、
ａｒａＯ_２部位とａｒａＩ部位との間のＤＮＡループを含む。このループは、ａ
ｒａＩで結合したＡｒａＣタンパク質が誘導状態に入ることを制限し、誘導され
ていないＰ_ＢＡＤ発現のレベルを低く保持する。アラビノースの添加の際に、ａ
ｒａＯ_２−ａｒａＩループが開き、そしてａｒａＩ部位のＡｒａＣタンパク質に
結合したアラビノースは、ＡｒａＣを誘導コンホメーションへと駆動し、これに
よってＰ_ＢＡＤを誘導する。このオペロンの調節はまた、カタボライト抑制に供
され、そのためアラビノースの存在下でさえ、細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡ
ＭＰ）レベルが低い場合（例えば、細胞がグルコースの存在下で増殖する場合）
に、有意に低い誘導が生じる。

【００３０】Ｐ_ｃからの転写もまた、アラビノースによって調節される。アラビノースの非
存在下で、ＲＮＡポリメラーゼのＰ_ｃへの接近は、ＡｒａＣ媒介ａｒａＩ−ａｒ
ａＯ_２ループの形成によって制限され、そしてａｒａＣの発現は低いままである
。アラビノースの存在下で、その誘導コンホメーションでａｒａＩに結合したＡ
ｒａＣは、立体的制限を解除し、そしてＲＮＡポリメラーゼのＰ_ｃへの接近が増
加する。しかし、Ｐ_ｃの転写活性は一過性である。なぜなら、ＡｒａＣは、ａｒ
ａＯ_１に結合し得、そしてＡｒａＣ媒介ＤＮＡループが、ａｒａＯ_１とａｒａＯ_２との間に形成し、これが最終的にＰ_ｃからの転写を制限するからである。さら
に、Ｐ_ｃもまた、カタボライト抑制に供される。

【００３１】外見上は複雑であるが、これらの調節配置は、細菌が必要な場合にのみアラビ
ノース代謝のための酵素を生成することを可能にする。この系は、２つのポジテ
ィブ調節タンパク質（ＡｒａＣ＋アラビノース；ＣＲＰ）、１つのネガティブ調
節エレメント（ＡｒａＣ−アラビノース）、ＤＮＡのループ化を介して遺伝子発
現を制御する機構、およびＲＮＡポリメラーゼとの相互作用を防止または増大し
得る系を含むように追加された。この調節領域全体の特徴の全ては、図４に示さ
れるＤＮＡの約３００塩基対に都合よく含まれる。

【００３２】従って、「ａｒａＢプロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼについての少な
くとも１つの結合部位およびＡｒａＣタンパク質についての付随した結合部位ま
たはその機能的等価体を含む、ＤＮＡの制御領域をいう。Ｅ．ｃｏｌｉの制御エ
レメントによって例示される町内細菌科のａｒａＢプロモーターの必須の制御エ
レメントは、図４に概略的に示されるようなプロモーターのおよそ＋１〜−１０
０の領域に対応するＤＮＡにおいて見出される。更なる好ましい制御エレメント
（例えば、ａｒａＣについてのさらなる結合部位またはその機能的等価体（例え
ば、ＡｒａＯ_２））は、図４にまた概略的に示されるプロモーターのおよそ−１
００〜−３００の領域に対応するＤＮＡにおいて見出される。最も好ましくは、
ａｒａＢプロモーターは、図４に概略的に示されるプロモーターのおよそ＋１〜
−３００の領域に対応するＤＮＡの制御領域をいう。

【００３３】本発明の細菌宿主細胞は、当該分野で公知の任意の方法（培養管、振盪フラス
コ、または細菌発酵槽での増殖が挙げられるがこれらに限定されない）によって
増殖され得る。本発明の１つの好ましい実施形態は、共有に係る米国特許第５，
８５１，８０２号および米国特許出願番号０９／２７１，９７０に記載されるよ
うな発酵槽中での、または当該分野で公知の他の手段による、組換え発現ベクタ
ーを含む宿主細胞の増殖である。

【００３４】本発明の他の局面および利点は、以下の例示的実施例を考慮して理解され、こ
こで実施例１は、新規な同遺伝子系アラビノース輸送欠損菌株の構築に焦点をあ
て、これは、実施例２において組換えタンパク質産物をコードするベクターで形
質転換される。実施例２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡによる、アラビ
ノース誘導後のＷ３１１０、Ｅ２２０、Ｅ２２４およびＥ２２６中での例示的組
換えタンパク質産物（ゲロニン）の発現の分析に焦点をあてる。実施例３は、ア
ラビノース誘導後の、Ｅ１０４、Ｅ２２１、Ｅ２２５およびＥ２２７での細胞増
殖およびゲロニンタンパク質産物の発現の分析に焦点をあてる。

【００３５】（実施例１）（アラビノース輸送欠損株の構築）同遺伝子系ΔａｒａＦＧＨ：：ｋａｎおよびａｒａＥ２０１株を、Ｅ．ｃｏｌ
ｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）およびＥ．ｃｏｌｉＥ１０４（ＡＴ
ＣＣ６９００９；ＡＴＣＣ６９００８；ＡＴＣＣ６９１０１；ＡＴＣＣ
６９１０２；ＡＴＣＣ６９１０３；ＡＴＣＣ６９１０４；ＡＴＣＣ６９３
３１；ＡＴＣＣ６９３３２；ＡＴＣＣ６９３３３として寄託、この各々は、
ゲロニンをコードするプラスミドを含む）から構築した。得られた株および中間
体株を表１に示す。表１．アラビノースの有能な株および不完全な株

【００３６】

【表１】 ^Ａ２０００年３月２１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ
）に寄託された。

【００３７】（Ｅ２２０およびＥ２２１の構築）Ｅ２２０およびＥ２２１を、Ｅ．ｃｏｌｉＣＷ２５５３で増殖したバクテリ
オファージＰ１ｖｉｒ（ＨｏｒａｚｄｏｖｓｋｙおよびＨｏｇｇ、前出）を用
いて、それぞれ、Ｗ３１Ｉ０およびＥ１０４のＰ１形質導入によって構築した。
Ｅ．ｃｏｌｉＣＷ２５５３上でのＰ１ファージストックの調製のために、細菌
細胞をＴＹＥ培地（トチプトン１５ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ＬおよびＮａＣ
ｌ５ｇ／Ｌ）中に接種し、そして６時間増殖した。５ｍＭＣａＣｌ_２を補充し
たＴＹＥ中に１：５０に細胞を希釈し、そしてさらに９０分間増殖させた。最小
塩溶液（１リットルあたり：２１．４ｇＫ_２ＨＰＯ_４、１０．４ｇＫＨ_２Ｐ
Ｏ_４、１３．６ｇ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４および０．３ｇＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）
中で、Ｐ１ｖｉｒファージストックを１：１０００に希釈し、そして０．１ｍ
Ｌのファージを０．２ｍＬの細胞と混合した。このファージおよび細胞を振盪せ
ずに、３７℃で２０分間インキュベートし、次いで３ｍＬのＲ軟寒天（Ｍｉｌｌ
ｅｒ、ＡＳｈｏｒｔＣｏｕｒｓｅｉｎＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔ
ｉｃｓ、ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ、１９９２）を添加し、そしてこの混合物をＲ寒
天上にプレートして一晩増殖した。３ｍＬのＴＹＥをこのプレートの上に添加し
、そしてＴＹＥと軟寒天の混合物をプレート表面からかきとった。３滴のクロロ
ホルムを添加し、この混合物をボルテックスして、このファージストックを遠心
分離によって寒天から分離した。得られたファージストックの力価は、約４×１
０^９ファージ／ｍＬであった。

【００３８】Ｗ３１Ｉ０およびＥ１０４の形質導入のために、各株を、ＴＹＥ＋５ｍＭＣ
ａＣｌ_２中で一晩増殖した。各培養物の２ｍＬ中の細胞を遠心分離によって回収
し、２ｍＬの０．１ＭＭｇＳＯ_４、０．００５ｍＭＣａＣｌ_２に懸濁し、そ
して３７℃で１５分間インキュベートした。細胞（０．３ｍＬ）および０．２ｍ
ＬのＴＹＥ＋５ｍＭＣａＣｌ_２を、０．１ｍＬの希釈していないファージ、１
：１０もしくは１：１００に希釈したファージ、または希釈緩衝液のみと混合し
た。細胞およびファージを３７℃で２０分間インキュベートし、次いで０．６ｍ
Ｌの１Ｍクエン酸ナトリウムを添加し、続いて６ｍＬのＴＹＥを添加した。形質
導入株を３７℃で４時間増殖し、その後、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を補充
したＴＹＥプレート上にプレートした。１：１０希釈および１：１００希釈した
ファージで、プレート上にコロニーが出現した。コントロールのプレートではコ
ロニーは出現しなかった。Ｗ３１１０のカナマイシン耐性形質導入株の１つをＥ
２２０として選択し、そしてＥ１０４のカナマイシン耐性形質導入株の１つをＥ
２２１として選択した。

【００３９】（Ｅ２２２、Ｅ２２３、Ｅ２２８およびＥ２２９の構築）ａｒａＥ２０１対立遺伝子は、ｔｈｙＡ遺伝子で同時形質導入され得るので、
Ｗ３１１０、Ｅ１０４、Ｅ２２０およびＥ２２１のｔｈｙＡ誘導体を、トリメト
プリムプレート（Ｍｉｌｌｅｒ、前出）での選択によって同定した。最小グルコ
ーストリメトプリムプレートを１０ｍｇ／Ｌのトリメトプリムで調製し、そして
各株をプレートした。約４日間後に生じる小さいコロニーを、トリメトプリムプ
レート上に再ストリーク（線付け）し、そして単独のコロニーを選択した。つい
でこれらの単独コロニーを、最小プレート上に再ストリークし、最小プレートを
、チミジンおよびトリメトプリムプレートで補充した。各株のｔｈｙＡ誘導体は
、それによって、表１に示されるように同定された。

【００４０】（Ｅ２２４の構築）Ｅ．ｃｏｌｉＥ２２２を、ＣＷ２５５３で増殖したＰ１ｖｉｒとともにＴ
ｈｙＡ＋に形質導入した。細胞を、ＴＹＥ＋５ｍＭＣａＣｌ_２中で一晩増殖し
、０．１ＭＭｇＳＯ_４、０．００５ＭＣａＣｌ_２に懸濁し、そして０．６ｍ
Ｌのファージの階段希釈でインキュベートした。細胞およびファージを、３７℃
で２０分間、インキュベートし、続いて、０．６ｍＬの１Ｍクエン酸ナトリウム
および６ｍＬのＴＹＥの添加を行った。形質導入株を３７℃で１時間増殖し、次
いで遠心分離によって回収し、そして１ｍＬの塩溶液（１リットルあたり：２１
．４ｇＫ_２ＨＰＯ_４、１０．４ｇＫＨ_２ＰＯ_４、１３．６ｇ（ＮＨ_４）_２Ｓ
Ｏ_４および０．３ｇＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）中に懸濁した。細胞をグルコース
最小プレート上にプレートし、そして３７℃で増殖した。１０の候補である形質
導入株を最小プレート上に再ストリークした。再ストリークから生じるコロニー
を、アラビノーステトラゾリウムプレートのそれらの表現型について試験した。
Ｅ２２２は、アラビノーステトラゾリウムプレート（Ａｒａ^＋）上で白色であっ
たが、１０の形質導入株のうち７つがピンクであった。Ａｒａ⁻株は、テトラゾ
リウムプレート上で赤色である。ピンクのコロニーのうちの１つをＥ２２４とし
て選択した。これらのデータは、ａｒａＥ２０１株が、部分的にＡｒａ⁻表現型
を示すことを実証する。この表現型の区別はまた、０．２５％アラビノースを補
充したＭａｃＣｏｎｋｅｙプレート上でもみることができた。ＭａｃＣｏｎｋｅ
ｙプレート上でＥ２２４は薄いピンクのコロニーとして増殖した。

【００４１】（Ｅ２２６の構築）ａｒａＥ２０１およびΔａｒａＦＧＨである細菌株を、Ｅ２２４およびＥ２２
８の各々から構築して、同一の遺伝子型を有する株を得た。Ｅ２２４を、ＣＷ２
５５３由来のＰ１ｖｉｒ溶解産物を用いて形質導入してカナマイシン耐性にし、
そして単一の形質導入体をＥ２２６として選択した。同様に、Ｅ２２８を、ＣＷ
２５５３由来のＰ１ｖｉｒ溶解産物を用いて形質導入して、ＴｈｙＡ^＋にした。
Ｅ２２８の２つのＴｈｙＡ^＋形質導入体から、１つの候補クローンが、アラビノ
ーステトラゾリウムプレート上で部分的Ａｒａ⁻表現型（すなわち、ピンク色の
コロニー）を有した。この候補もまた、Ｅ２２６として選択した。Ｅ２２４株ま
たはＥ２２８株のいずれかから調製したＥ２２６株は、同一の遺伝子型を有し、
そしてテトラゾリウムアラビノースプレート上で同じ表現型を示した。

【００４２】（Ｅ２２７の構築）Ｅ２２２またはＥ２２８のａｒａＥ２０１誘導体は、指示プレート上での表現
型選択によってＴｈｙＡ^＋形質導入体から選択され得るが、このアプローチは、
Ｅ１０４から誘導された株のａｒａＥ２０１誘導体の選択のためには使用できな
い。なぜなら、ａｒａＢＣ領域の欠失（Δ（ａｒａＢＣ）７６８）によってこの
株はすでにＡｒａ⁻であるからである。それゆえ、アラビノースマイナスのバッ
クグラウンドにおいてこのアラビノース輸送体変異体を選択するために、異なる
アプローチが必要であった。このために、Ｅ２２９を、プラスミドｐＩＮＧ３８
２５（これは、ａｒａＢプロモーターの誘導性制御下でゲロニンタンパク質をコ
ードする）で形質転換し、そしてテトラサイクリン耐性コロニーを選択した。次
いで、Ｅ２２９（ｐＩＮＧ３８２５）を、ＣＷ２５５３上で増殖させたＰ１ｖｉ
ｒで形質導入してＴｈｙＡ^＋にし、そして形質導入体を、テトラサイクリンを補
充した最少グルコースプレート上で選択した。Ｅ２２０（ｐＩＮＧ３８２５）お
よびＥ２２６（ｐＩＮＧ３８２５）とともにＴｈｙＡ^＋形質導入体を、ＴＹＥ＋
テトラサイクリンに接種し、そして一晩増殖させた。次いで、形質転換体および
コントロールを、１０ｍＬの培地に希釈し、そして約０．４のＯＤ_６００になる
まで約２時間増殖させた。３ｍＬの各培養物を、０．１５ｍＬの０．２％アラビ
ノースまたは０．１５ｍＬの２０％アラビノースのいずれかを含むチューブに取
り出し、最終的なアラビノース濃度をそれぞれ０．０１％または０．１％にした
。各培養物を４．５時間増殖させ、そして細胞を遠心分離によって除去した。５
つの形質導入体ならびにＥ２２０コントロールおよびＥ２２６コントロール由来
の１５マイクロリットルの無細胞培養上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し
た。ゲルをクーマシーコロイド青で染色し、写真撮影し、次いで銀で染色した（
図１）。形質導入体のうちの２つは、Ｅ２２６コントロールと同様に、０．０１
％アラビノースを用いた４時間の誘導後に非常にわずかな組換えゲロニンを産生
し、一方、他の３つは、Ｅ２２０コントロールが産生したのとほぼ同じの多くの
ゲロニンを産生した。１．０％アラビノースを用いて誘導された培養物において
は、形質導入体の発現レベルの間に差は検出されなかった。図１のレーン３にお
けるサンプルを生成するために用いられた細胞を、Ｅ．ｃｏｌｉＥ２２７（ｐ
ＩＮＧ３８２５）として選択した。このプラスミドを失った株を選択するために
、Ｅ２２７（ｐＩＮＧ３８２５）の培養物を３７℃にてＴＹＥ中で３日間増殖さ
せ、次いでＴＹＥプレートにプレーティングして単一コロニーを単離した。コロ
ニーを、テトラサイクリンを含むプレートまたは含まないプレート上に拾い上げ
、そしてこのプラスミドを失ったコロニーを同定した。この株をＥ２２７と命名
した。

【００４３】（Ｅ２２５の構築）Ｅ．ｃｏｌｉＥ２２３を、プラスミドｐＩＮＧ３８２５で形質転換し、そし
てこのプラスミドを含むコロニーを、テトラサイクリン含有プレート上で選択し
た。Ｅ２２３（ｐＩＮＧ３８２５）を、ＣＷ２５５３上で増殖させたＰ１ｖｉｒ
を用いて形質導入し、そして最少プレート上で増殖し得る形質導入体を選択した
。個々のコロニーを、Ｅ２２７の選択に関して上記で概説した通りに、０．０１
％アラビノースを用いた誘導後にゲロニン産生についてスクリーニングした。Ｅ
２２０（ｐＩＮＧ３８２５）およびＥ１０４（ｐＩＮＧ３８２５）と比較してご
く少量で、かつＥ２２７（ｐＩＮＧ３８２５）と類似の量のゲロニンを産生する
細胞株をＥ２２５（ｐＩＮＧ３８２５）として選択した。ｐＩＮＧ３８２５プラ
スミドを失った細胞株を同定するために、Ｅ２２７（ｐＩＮＧ３８２５）を、３
７℃にて２４時間増殖させ、次いで室温にて３日間設定した。次いで、培養物中
の生存可能な細胞をＴＹＥ培地上にプレーティングし、次いで得られたコロニー
を、テトラサイクリンを含むプレートまたはテトラサイクリンを含まないプレー
ト上に拾い上げ、そしてこのプラスミドを失ったコロニーを同定した。この株を
Ｅ２２５と命名した。

【００４４】（実施例２）（アラビノース誘導後のＷ３１１０、Ｅ２２０、Ｅ２２４およびＥ２２６にお
けるジェロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡ分
析）４つの同遺伝子系統（Ｗ３１１０、Ｅ２２０、Ｅ２２４およびＥ２２６）を、
ｐＩＮＧ３８２５で形質転換した。各細胞株を、約０．４のＯＤ_６００まで増殖
し、次いで、２ｍＬの各培養物のアリコートを、０％、０．０１％、０．１％ま
たは１％までアラビノースを補充したチューブに移した。２８本のチューブをセ
ットし、そうして０％、０．０１％、０．１％または１％のアラビノースで誘導
された細胞を、誘導から４時間後に収集し得、そして０．０１％、０．１％およ
び１％のアラビノースで誘導された細胞を、誘導から１８時間後に収集し得る。
４時間または１８時間のいずれかの適切な誘導期間の後、細胞を、遠心分離によ
って培養上清から取り出し、そして各上清を０．２μｍフィルターを通して濾過
し、その後４℃で保存した。１０μｌの各上清を、ドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価した。各上清か
らのサンプルを、コロイド状クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅｃｏｌｌｏ
ｉｄａｌｂｌｕｅ）で染色した（図２）。いくつかのサンプルをまた、ＰＶＤ
Ｆ膜に転写し、そしてジェロニンに対するウサギ抗体と、次いでヤギ抗ウサギペ
ルオキシダーゼ結合体とを用いて検出した（図３）。０．０１％アラビノースと
の４時間のインキュベーション後、ジェロニン発現は、Ｗ３１１０およびＥ２２
０においてコロイド状クマシーブルーにより検出可能（かすかなバンド）であり
（図２Ａ、レーン１および２）、そしてジェロニンは、Ｅ２２０においてウエス
タンブロット分析により容易に検出可能であったが、いずれの技術によっても、
４時間でのＥ２２４サンプルまたはＥ２２６サンプルにおいては検出され得なか
った。０．１％アラビノースでの誘導から４時間後に、いずれのサンプルにおい
てもジェロニンの発現量に差異は検出され得なかった。これらのサンプルでは、
ジェロニンについて予期されるサイズのバンドは、明らかに存在した（図２Ａの
レーン５〜８および図３のレーン７〜９）。しかし、１％アラビノースでの誘導
から４時間後に、Ｅ２２４系統およびＥ２２６系統には、Ｗ３１１０系統または
Ｅ２２０系統のいずれかのサンプルにおいてよりも明らかに多い発現の痕跡が存
在した（図２Ａのレーン９〜１２および図３のレーン１０〜１２）。

【００４５】１８時間のインキュベーションのサンプルでは、０．０１％アラビノースで誘
導された４つのサンプルのいずれにも、ジェロニン量における明らかな差異の存
在はなかった（図２Ｂのレーン１〜４）。直接的な対比において、０．１％また
は１．０％のアラビノースのいずれかで誘導されたＥ２２４およびＥ２２６のサ
ンプルには、Ｗ３１１０またはＥ２２０のサンプル中よりもはるかに多いジェロ
ニンが存在した。Ｅ２２４およびＥ２２６における、４時間での１．０％アラビ
ノースにおけるジェロニンの発現増強、および１８時間での０．１％アラビノー
ス（図２Ｂのレーン５〜８（レーン７，８を、レーン５，６と比較））または１
．０％アラビノース（図２Ｂのレーン９〜１２（レーン１１，１２を、レーン９
，１０と比較））におけるジェロニンの発現増強は、輸送欠損性の細菌宿主細胞
における組換え遺伝子発現の利点を実証する。アラビノース誘導後の細菌増殖阻
害の減少は、Ｅ２２４およびＥ２２６培養物において明らかであり、そしてこれ
は、組換えタンパク質のより高い細胞蓄積を生じた可能性がある。これにより得
られたサンプルにおけるより多い細胞は、培養物におけるより多いジェロニン発
現を生じた。これらのデータは、インタクトなＡｒａＥ輸送系が、４時間以内の
０．０１％アラビノースによる、中程度のコピーのプラスミドからの組換えタン
パク質の低レベル誘導のために必要とされるが、１８時間での発現は、ａｒａＥ⁻ 系統およびａｒａＥ^＋系統の両方において同一であるということを示す。これ
らのデータはまた、ＡｒａＦを欠損した細胞が、試験されたすべての実験条件下
で、野生型系統と同様に組換え産物を誘導するということを示す。

【００４６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価された同一サンプルをまた、ＥＬＩＳＡによっ
て評価した。誘導されたサンプルを添加する前に、ウェルを、ジェロニンに対す
るウサギ抗体でコーティングした。各ウェルに結合したジェロニンを、ジェロニ
ンに対するビオチン化ウサギ抗体で検出し、そして各ウェルにおけるビオチンを
、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体で検出した。表２は
、この最初のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。

【００４７】（表２．４時間の誘導後にＥＬＩＳＡにより検出されたゲロニン（ｎｇ／ｍｌ
）

【００４８】

【表２】Ｅ２２０およびＷ３３１０は、アラビノース誘導に対して同様に応答するが、ａ
ｒａＥ２０１株Ｅ２２４およびａｒａＥ２０１ ΔａｒａＦＧＨである株Ｅ２２
６は、それぞれ、０．０１％アラビノースでかなり少ないゲロニンを生成するが
、０．１％アラビノースおよび１．０％アラビノースでほぼ等しいかまたはそれ
以上のゲロニンを生成する。このＥＬＩＳＡデータはまた、このａｒａＦ’株Ｅ
２２０が、Ｗ２１１０が生成するよりもわずかに少ない組換えタンパク質を生成
することも示す。

【００４９】別の実験において、Ｅ．ｃｏｌｉＥ２２０およびＥ２２６を、０．０１％ア
ラビノースおよび１．０％アラビノースによる誘導の後のゲロニンの発現につい
て、時間的に評価した。０．１％または１．０％のいずれかのアラビノース濃度
での誘導の後、誘導後１．２５時間、３時間および４．５時間でサンプルを取り
出し、そしてその無細胞培養上清中に存在するゲロニンの量を、ＥＬＩＳＡによ
り評価した。この実験からのデータを、表３に示す。

【００５０】（表３．アラビノースによる誘導の後のＥＬＩＳＡによって検出された、ゲロ
ニン（ｎｇ／ｍＬ））

【００５１】

【表３】これらのデータは、低アラビノース濃度（０．０１％）で、Ｅ２２６が、Ｅ２
２０よりも誘導可能でないことをさらに示す。しかし、より高いアラビノース濃
度での誘導後、Ｅ２２６は、Ｅ２２０よりも多くの生成物を蓄積する。これらの
データはまた、Ｅ２２６が、Ｅ２２０が蓄積するよりも迅速にゲロニンを蓄積す
ることも、示す。表３に記載されるサンプルをまた、ウェスタンブロッティング
によっても評価した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてＰＶ
ＤＥメンブレンにトランスファーした。各レーンにおけるゲロニンの量を、ゲロ
ニンに対するウサギ抗体を用い、その後、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ結合体
を用いて、検出した。このウェスタンのデータにより、０．０１％アラビノース
でのＥＬＩＳＡデータが、Ｅ２２６においてゲロニンの誘導が全く生じないかま
たはほとんど生じないことを示すことが、確認された。１．０％アラビノース誘
導にて、３時間および４．５時間の時点で、Ｅ２２０においてよりも多くの生成
物がＥ２２６株において出現し、そして少量のゲロニンさえ、１．２５時間後の
１．０％アラビノースサンプルにて出現した。

【００５２】（実施例３）（アラビノース誘導の後のＥ１０４，Ｅ２２１、Ｅ２２５およびＥ２２７にお
ける細胞増殖およびゲロニン発現の分析）各々ｐＩＮＧ３８２５を含む４つのΔ（ａｒａＢＤ）７６８細菌株（Ｅ１０４
、Ｅ２２１、Ｅ２２５およびＥ２２７）を、ＴＹＥ培地中でＯＤ約０．４まで増
殖させ、そして２．１５ｍＬアリコート中にて、アラビノースを０ｍＭ、０．１
ｍＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭ（１０ｍＭ０．１５％；１ｍＭ０．０１５％；
０．１ｍＭ０．００１５％）まで用いて誘導した。誘導の４時間後、各培養物
の１：５希釈物のＯＤ_６００を決定し、その後、その培養物を遠心分離して細胞
を除去し、そして濾過した上清を、ＥＬＩＳＡによるその後の評価のために−２
０℃に配置した。同様に、誘導の１７時間後、各培養物の１：１０希釈物のＯＤ_６００を決定し、その後、その培養物を遠心分離して細胞を除去し、そして濾過
した上清を、ＥＬＩＳＡによるその後の評価のために−２０℃に配置した。表４
は、各サンプルについての培養物のＯＤ_６００を示す。

【００５３】（表４．アラビノースを用いて誘導されたＥ１０４、Ｅ２２１、Ｅ２２５およ
びＥ２２７培養物の光学密度）

【００５４】

【表４】ＮＤ＝決定されず各サンプルを、ＥＬＩＳＡによって評価して、アラビノースとのインキュベーシ
ョン後に培養上清に蓄積したゲロニンの量を決定した。このＥＬＩＳＡからの結
果を表５に示す。

【００５５】（表５．アラビノースを用いて誘導した後にＥＬＩＳＡによって検出されたゲ
ロニン（ｎｇ／ｍｌ））

【００５６】

【表５】ＮＤ−決定されず表４および表５のデータは、アラビノース輸送欠損株が、Ｅ１０４よりも、誘導
の後のアラビノースによってあまり増殖阻害されず、なおも４時間および１７時
間後に１０ｍＭのアラビノースを有するＥ１０４とほぼ同じかまたはより高いレ
ベルへのゲロニン発現を可能にする。宿主細胞へのアラビノースの受動的な拡散
は、Ｅ２２７におけるアラビノースの細胞内蓄積のための単なる残りの機構であ
るので、この株は、明らかに低いアラビノース濃度で、Ｅ１０４よりもあまり増
殖阻害されず、そしてまた、低いアラビノース濃度で、あまりゲロニンを生成し
ない。ＡｒａＦＧＨ欠失およびＡｒａＥ変異の表現型効果が、誘導された細菌宿
主株のこの組において独立して見られ得る。Ｅ２２５（ａｒａＥ２０１）は、Ｅ
２２１またはＥ２２７（両方は、ΔａｒａＦＧＨである）よりも、０．１ｍＭ
アラビノースで、４時間または１８時間のいずれかで、より多くのゲロニンを生
成し、それによって、ＡｒａＦＧＨ輸送システムが、非常に低いアラビノース濃
度において、最も応答することを実証する。同様に、Ｅ２２５およびＥ２２７は
、１．０ｍＭアラビノースで、４時間目には、あまりゲロニンを生成せず、こ
のことは、このより高いアラビノース濃度でのＡｒａＥ輸送システムの重要性を
実証する。さらに、ＡｒａＦＧＨおよびＡｒａＥトランスポーターにおけるアラ
ビノース輸送欠損の効果が、付加されるようである。この二重変異は、単一の変
異体のいずれかよりも、高いアラビノース濃度では、細胞の増殖をあまり阻害し
ないが、ＡｒａＥ⁻およびＡｒａＥＦＧＨ⁻株は、１〜１０ｍＭアラビノース
で、ほぼ等しい量のゲロニンを生成する。しかし、低いアラビノース濃度（０．
１ｍＭ）において、この二重変異体は、ａｒａＦ単一変異体よりわずかに少ない
ゲロニンのみを生成する。全ての株は、１０ｍＭアラビノースで、類似した、
完全かつ迅速な誘導を示し、ここで、おそらく、この輸送システムは、細胞内ア
ラビノースの蓄積には本質的ではない。しかし、培地中のより低いアラビノース
の濃度において、野生型と変異体株との間には、差異が現れる。野生型またはＡ
ｒａＦＧＨ株が４時間で完全に誘導されるが、ＡｒａＥ株は、４時間では完全に
誘導されない。

【００５７】これらの実施例のデータは、アラビノース輸送欠損株（組換えタンパク質産物
をコードするベクターを含む）が、ａｒａＢプロモーターの誘導的制御下の組換
えタンパク質産物の発現のための宿主として特に有用であることを実証する。よ
り低い細菌細胞増殖阻害（例えば、より高い細胞数）、より高い組換えタンパク
質産物発現、および組換えタンパク質産物の直接的に調節可能な発現（アラビノ
ースによる同時発現の誘導を含む）は、異なる局面であり、そして本発明の驚く
べき利点である。組換え発現ベクターを含む輸送欠損宿主細胞の発酵槽における
増殖の間に、培養物を誘導するための誘導物質（例えば、アラビノース）のボー
ラス添加が、輸送能力を有する宿主細胞の他の等価な培養物または匹敵する培養
物においてよりも細胞増殖をあまり阻害しないことが期待される。従って、改善
された組換えタンパク質産物産生（細胞および／または産物のより高い収量を含
む）が、本発明の方法および細菌宿主細胞を使用して、期待される。

【００５８】先の実施例は、例示の目的で提供され、そして添付の特許請求の範囲に記載さ
れるような本発明の範囲を制限することは意図しない。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、０．０１％および１．０％のアラビノースで４．５時間誘導した後、
Ｅ２２０（ｐＩＮＧ３８２５）、Ｅ２２６（ｐＩＮＧ３８２５）およびＥ２２９
（ｐＩＮＧ３８２５）形質転換株を誘導した後のタンパク質パターンを比較する
銀染色したポルアクリルアミドゲルを示す。

【図２】図２は、アラビノースで誘導された細菌宿主細胞からの無細胞培養上清を比較
するクーマシーコロイドブルー染色したポルアクリルアミドゲルを示す。図２Ａ
は、４時間の誘導後を示し；図２Ｂは、１８時間の誘導後を示す。

【図３】図３は、アラビノースで誘導された細菌宿主細胞由来の無細胞培養上清を比較
する誘導されたサンプルおよび非誘導のサンプルのウエスタンブロットを示す。

【図４】図４は、ａｒａＢプロモーターシステム（Ｂｅｔｔｅｒら、１９９９、前出も
また参照のこと）の概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 CA01 DA06 EA04 FA02 GA11 HA20 4B064 AG01 CA02 CA31 CC24 CD09 DA01 DA10 4B065 AA26X AB01 AC14 BA02 BB15 CA24 CA41 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】誘導性プロモーターの制御下で組換えタンパク質産物を産生
するための方法であって、以下：（ａ）細菌宿主細胞へ、誘導性プロモーターの
制御下で組換えタンパク質産物をコードする発現ベクターを導入する工程であっ
て、該宿主細胞が、該宿主細胞への該プロモーターの誘導物質の活性な輸送のた
めの少なくとも１つの系において遺伝的に欠損がある、工程；および（ｂ）該誘
導物質を有する該産物の発現を誘導する工程、を包含する、方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、前記誘導性プロモーターが
、ａｒａＢプロモーターである、方法。
【請求項３】請求項２に記載の方法であって、前記誘導物質がアラビノー
スである、方法。
【請求項４】請求項３に記載の方法であって、前記宿主細胞が、アラビノ
ース上で増殖し得ない、方法。
【請求項５】請求項１、２、３または４に記載の方法であって、前記宿主
細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、方法。
【請求項６】請求項５に記載の方法であって、前記宿主が、ａｒａＥ遺伝
子によってコードされる低親和性アラビノース輸送系において欠損がある、方法
。
【請求項７】請求項５に記載の方法であって、前記宿主細胞が、ａｒａＦ
ＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系において欠損があ
る、方法。
【請求項８】請求項５に記載の方法であって、前記宿主細胞が、ａｒａＦ
ＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系とａｒａＥ遺伝子
によってコードされる低親和性アラビノース輸送系との両方において欠損がある
、方法。
【請求項９】請求項１に記載の方法であって、さらに、前記誘導された宿
主細胞由来の前記産物を回収する工程を包含する、方法。
【請求項１０】誘導性プロモーターの誘導物質についての活性な輸送系の
１つ以上において欠損がある細菌宿主細胞であって、該宿主細胞が、該誘導性プ
ロモーターの制御下で組換えタンパク質産物をコードする組換え発現ベクターを
含む、細菌宿主細胞。
【請求項１１】請求項１０に記載の宿主細胞であって、前記誘導性プロモ
ーターが、ａｒａＢプロモーターである、宿主細胞。
【請求項１２】前記誘導物質がアラビノースである、請求項１１に記載の
宿主細胞。
【請求項１３】前記宿主細胞が、アラビノース上で増殖し得ない、請求項
１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１０、１１
、１２、または１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】請求項１４に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞が、
ａｒａＥ遺伝子によってコードされる低親和性アラビノース輸送系において欠損
がある、宿主細胞。
【請求項１６】請求項１４に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞が、
ａｒａＦＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系において
欠損がある、宿主細胞。
【請求項１７】請求項１４に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞が、
ａｒａＦＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系とａｒａ
Ｅ遺伝子によってコードされる低親和性アラビノース輸送系との両方において欠
損がある、宿主細胞。
【請求項１８】組換えタンパク質産物を誘導性プロモーターの制御下で産
生し、そして該産物の発現を同時に誘導する方法であって、以下：（ａ）該宿主
細胞への誘導性プロモーターの誘導物質の活性な輸送のための少なくとも１つの
系において遺伝的に欠損がある細菌宿主細胞を培養する工程であって、該宿主細
胞が、該誘導性プロモーターの制御下で組換えタンパク質産物をコードする発現
ベクターを含む、工程；および（ｂ）該宿主細胞による該産物の発現を同時に誘
導するのに有効な誘導物質の濃度で該産物の発現を誘導する工程、を包含する、
方法。
【請求項１９】請求項１８に記載に方法であって、前記誘導性プロモータ
ーが、ａｒａＢプロモーターである、方法。
【請求項２０】請求項１９に記載に方法であって、前記誘導物質がアラビ
ノースである、方法。
【請求項２１】請求項２０に記載の方法であって、前記宿主細胞が、アラ
ビノース上で増殖し得ない、方法。
【請求項２２】請求項１８、１９、２０または２１に記載の方法であって
、前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、方法。
【請求項２３】請求項２２に記載の方法であって、前記宿主が、ａｒａＥ
遺伝子によってコードされる低親和性アラビノース輸送系において欠損がある、
方法。
【請求項２４】請求項２２に記載の方法であって、前記宿主細胞が、ａｒ
ａＦＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系において欠損
がある、方法。
【請求項２５】請求項２２に記載の方法であって、前記宿主細胞が、ａｒ
ａＦＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系とａｒａＥ遺
伝子によってコードされる低親和性アラビノース輸送系との両方において欠損が
ある、方法。
【請求項２６】誘導性プロモーターの誘導物質により誘導される細菌細胞
増殖阻害を減少させるための方法であって、以下：（ａ）該宿主細胞への該誘導
物質の活性な輸送のための少なくとも１つの系において遺伝的に欠損がある細菌
宿主細胞を培養する工程であって、該宿主細胞が、該誘導性プロモーターの制御
下で組換えタンパク質産物をコードする発現ベクターを含む、工程；および（ｂ
）輸送成熟細胞と比較して、該宿主細胞において該産物の発現を誘導するのに有
効であるが、細胞の増殖を阻害するのに有効でない、誘導物質の濃度で該産物の
発現を誘導する工程、を包含する、方法。
【請求項２７】請求項２６に記載に方法であって、前記誘導性プロモータ
ーが、ａｒａＢプロモーターである、方法。
【請求項２８】請求項２７に記載に方法であって、前記誘導物質がアラビ
ノースである、方法。
【請求項２９】請求項２８に記載の方法であって、前記宿主細胞が、アラ
ビノース上で増殖し得ない、方法。
【請求項３０】請求項２６、２７、２８または２９に記載の方法であって
、前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、方法。
【請求項３１】請求項３０に記載の方法であって、前記宿主が、ａｒａＥ
遺伝子によってコードされる低親和性アラビノース輸送系において欠損がある、
方法。
【請求項３２】請求項３０に記載の方法であって、前記宿主細胞が、ａｒ
ａＦＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系において欠損
がある、方法。
【請求項３３】請求項３０に記載の方法であって、前記宿主細胞が、ａｒ
ａＦＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系とａｒａＥ遺
伝子によってコードされる低親和性アラビノース輸送系との両方において欠損が
ある、方法。
【請求項３４】組換えタンパク質産物の収量を増加させる方法であって、
以下：宿主細胞への誘導性プロモーターの誘導物質の活性な輸送のための少なく
とも１つの系において遺伝的に欠損がある細菌宿主細胞を培養する工程であって
、該宿主細胞が、該誘導性プロモーターの制御下で組換えタンパク質産物をコー
ドする発現ベクターを含む、工程；および（ｂ）該宿主細胞または該産物の収量
を増加させるのに有効な誘導物質の濃度で該産物の発現を誘導する工程、を包含
する、方法。
【請求項３５】請求項３４に記載の方法であって、前記宿主細胞および前
記産物の収量が増加する、方法。
【請求項３６】請求項３４に記載に方法であって、前記誘導性プロモータ
ーが、ａｒａＢプロモーターである、方法。
【請求項３７】請求項３６に記載に方法であって、前記誘導物質がアラビ
ノースである、方法。
【請求項３８】請求項３７に記載の方法であって、前記宿主細胞が、アラ
ビノース上で増殖し得ない、方法。
【請求項３９】請求項３４、３５、３６、３７または３８に記載の方法で
あって、前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、方法。
【請求項４０】請求項３９に記載の方法であって、前記宿主が、ａｒａＥ
遺伝子によってコードされる低親和性アラビノース輸送系において欠損がある、
方法。
【請求項４１】請求項３９に記載の方法であって、前記宿主細胞が、ａｒ
ａＦＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系において欠損
がある、方法。
【請求項４２】請求項３９に記載の方法であって、前記宿主細胞が、ａｒ
ａＦＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系とａｒａＥ遺
伝子によってコードされる低親和性アラビノース輸送系との両方において欠損が
ある、方法。
【請求項４３】誘導性プロモーターの制御下で組換えタンパク質産物を産
生するための方法であって、以下：（ａ）宿主細胞への誘導性プロモーターの誘
導物質の活性な輸送のための少なくとも１つの系において遺伝的に欠損がある細
菌宿主細胞を培養する工程であって、該宿主細胞が、該プロモーターの制御下で
組換えタンパク質産物をコードする発現ベクターを含む、工程；および（ｂ）該
誘導物質で該産物の発現を誘導する工程、を包含する、方法。
【請求項４４】請求項４３に記載に方法であって、前記誘導性プロモータ
ーが、ａｒａＢプロモーターである、方法。
【請求項４５】請求項４４に記載に方法であって、前記誘導物質がアラビ
ノースである、方法。
【請求項４６】請求項４５に記載の方法であって、前記宿主細胞が、アラ
ビノース上で増殖し得ない、方法。
【請求項４７】請求項４３、４４、４５または４６に記載の方法であって
、前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、方法。
【請求項４８】請求項４７に記載の方法であって、前記宿主が、ａｒａＥ
遺伝子によってコードされる低親和性アラビノース輸送系において欠損がある、
方法。
【請求項４９】請求項４７に記載の方法であって、前記宿主細胞が、ａｒ
ａＦＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系において欠損
がある、方法。
【請求項５０】請求項４７に記載の方法であって、前記宿主細胞が、ａｒ
ａＦＧＨ遺伝子によってコードされる高親和性アラビノース輸送系とａｒａＥ遺
伝子によってコードされる低親和性アラビノース輸送系との両方において欠損が
ある、方法。
【請求項５１】請求項１８、２６、３４または４３に記載の方法であって
、さらに、前記誘導された宿主細胞から前記産物を回収する工程を包含する、方
法。