DK172716B1 - Rekombinant DNA-kloningsvektor, restriktionsfragment som udgangsmateriale ved fremstilling heraf, og eukaryote og prokaryot - Google Patents

Description

i DK 172716 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte rekombi-nante DNA-kloningsvektorer, som overfører hygromycin B- og G418-resistens til såvel eukaryote som prokaryote celler, restriktionsfragmenter som udgangsmateriale ved fremstil-5 ling heraf og værtsceller transformeret hermed.

Opfindelsen er specielt af betydning, fordi den løser problemet i forbindelse med identifikation, manipulation og stabilisering af klonede DNA-sekvenser, som mangler en se-10 lekterbar funktion, i eukaryote og prokaryote celler. Indtil nu har udviklingen og anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi i eukaryote celler været forsinket og besværlig-gjort på grund af (1) den generelle mangel på egnede kloningsvektorer, som indeholder markører, der er selekterba-15 re i eukaryote celler, (2) den manglende evne til hurtig amplification i ønskede DNA-sekvenser i eukaryote celler og (3) den langsomme generationstid af eukaryote celler i kultur.

20 Inden for den kendte teknik beskriver Davies og O’Connor (Antimicrobial Agents and Chemotherapy 14, 69-72 (1978)) selektion og isolering af flere ampramycinresistente stammer. Der blev i forbindelse hermed ikke isoleret plasmider med resistens overfor antibiotiket G418.

25

Jiminez og Davies, Nature 287, 869-871 (1980) omtaler indførslen af et antibiotisk G418 resistensgen i gær, der imidlertid frembringer phosphotransferaseaktivitet. I modsætning hertil bibringes acetyltransferaseaktivitet ifølge 30 nærværende opfindelse af et gen, der både med hensyn til struktur af fysiologisk funktion er helt forskelligt fra ovennævnte phosphotransferasegen.

DK 172716 B1 2

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en rekombinant DNA kloningsvektor, der omfatter en eukaryot promotor, plasmid pBR222 replikonen og 5 a) ~7,5 kb Bgll restriktionsfragmentet af plasmid pKC203, der giver resistens mod antibiotiket hygromycin B og G418, eller b) ~2,75 kb Sall/BgIII restriktionsfragmentet af plasmid 10 pKC203 eller plasmid pKC222, der giver resistens mod antibiotiket hygromycin B og G418, eller c) ~1,51 kb Bglll/SacI restriktionsfragmentet af plasmid pKC222, der giver resistens mod antibiotiket hygromycin 15 B, eller d) ~1,65 kb EcoRI/Sall restriktionsfragmentet af plasmid pKC222, der giver resistens mod antibiotiket G418, eller 20 e) en DNA sekvens afledt af ~7,5 kb restriktionsfragmentet, der giver resistens mod det ene eller begge antibiotika hygromycin B og G418; 25 idet resistensen overfor antibiotika hygromycin B og/eller G418 opnås, når vektoren transformeres i en værtscelle, der er følsom for det ene eller begge antibiotika, idet værtscellen er modtagelig for transformation, celledeling og dyrkning; med de begrænsninger at promotor virker i mu- 30 se- eller gærceller, at de antibiotikaresistensfremkalden-de restriktionsfragmenter støder op til og, i en eukaryot værtscelle, transkriberes fra promotoren, og at DNA-se- DK 172716 B1 3 kvenserne, der giver resistens mod antibiotikum G418, ikke koder for enzymet phosphotransferase.

Følgelig kan DNA sekvenser, der er klonet på de omhandlede 5 meget anvendelige vektorer, manipuleres og opformeres konventionelt i prokaryote celler, hvorved man undgår besvær og problemer ved at foretage disse manøvrer i eukaryote celler. Da vektorerne ifølge opfindelsen yderligere både er funktionelle og selekterbare i eukaryote celler, kan 10 vektorerne transformeres, efter manipulation og opformering, direkte i eukaryote værter uden yderligere modifikation. Dette er ikke alene en fordel, men udgør en signifikant fordel inden for fagområdet.

15 Opfindelsen tilvejebringer også plasmid pKC222, der indeholder -2,75 kb Sall/Bgll restriktionsfragmentet af pKC203, som fås fra E. coli JR225 ATCC 31912 ligeret til Sall/Bgll restriktionsfragmentet af plasmid pKC7, og som giver resistens mod antibiotika ampicillin, hygromycin B 20 og G418, når det transformeres i en E. coli celle.

Endelig tilvejebringer opfindelsen E. coli, muse- og gærværtsceller, som er ejendommelige ved det i krav 16, henholdsvis 18 og 20 angivne, samt plasmider og restriktions-25 fragmenter, som er ejendommelige ved det i krav 22-31 angivne.

Evnen til at klone DNA i eukaryote værtsceller og til let at selektere transformanterne er væsentlig for den videre 30 og mere avancerede udvikling af rekombinant-DNA-teknologi.

Eftersom transformation og dermed tilegnelsen af plasmidet DNA er en begivenhed, der indtræffer med lav frekvens, er en sådan funktionel test en praktisk nødvendighed til bestemmelse af, hvilken celle eller hvilke celler blandt DK 172716 B1 4 millioner af celler, der har tilegnet sig det plasmide DNA. Dette er væsentligt, eftersom DNA-sekvenser, der er ikke-selekterbare, kan indføres i vektorerne og derved frembringe en inaktivering af et bestemt antibiotisk re-5 sistensgen. Ved transformation kan de celler, som indeholder vektoren og den særlige pågældende DNA-sekvens, derfor isoleres ved passende antibiotisk udvælgelse. De omhandlede vektorer er specielt nyttige, fordi de er særdeles alsidige, og fordi de kan transformeres og selekteres i en 10 hvilken som helst hygromycin B- eller G48-sensitiv eller prokaryot celle, der kan dele og optage DNA. Dette er væsentligt, eftersom de fleste fremskridt inden for rekombi-nant-DNA-teknikken til dato har involveret produktion af eukaryote polypeptider, såsom proinsulin. A-kæde-insulin, 15 B-kæde-insulin, humant væksthormon, bovint væksthormon, interferon, somatostatin, thymosin al og lignende, i prokaryote værtsceller. Prokaryote celler er ude af stand til på korrekt måde at knytte sukkergrupper til eukaryote polypeptider. Derfor er en produktion af eukaryote polypep-20 tider, der er modificeret efter translation, eksempelvis glycosylerede polypeptider, ved rekombinant-DNA-teknik ikke mulig uden en eukaryot vært og passende eukaryote re-kombinante DNA-kloningsvektorer.

25 De omhandlede vektorer opfylder dette behov og udvider rammerne for og anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi-en. Muligheden for at indføre og stabilisere DNA sekvenser i eukaryote og prokaryote celler er af betydning, fordi fremstillingen, under anvendelse af rekombinant DNA-meto-30 dologi, af visse antibiotika og post-translationelt modificerede proteiner kræver en eukaryot vært. Vektorerne ifølge opfindelsen har den evne, at de kan virke i prokaryote celler som f.eks. E. coli, hvilket muliggør, at de let kan manipuleres og opformeres, hvorved man undgår pro- DK 172716 B1 5 blemer i forbindelse med eukaryote celler, i hvilke sådanne procedurer er vanskelige for ikke at sige umulige at udføre.

5 Af hensyn til forståelsen af den foreliggende opfindelse skal følgende begreber defineres:

Strukturgen: En DNA-sekvens, som koder et polypeptid.

10 Kontrolelement: En DNA-sekvens, som dirigerer og regulerer transskriptionen og udtrykkeisen af et strukturgen.

Eukaryotisk promotor: En DNA-sekvens, som delvis fremskyn-der og regulerer udtrykkeisen af et strukturgen i en euka-15 ryot celle.

Prokaryot replikon: En DNA-sekvens, som kontrollerer og regulerer replikationen af DNA i en prokaryot celle.

20 Rekombinant DNA-kloningsvektor: Vilkårligt middel, omfattende (men ikke begrænset til) plasmider, bakteriophager og vira, bestående af et DNA-molekyle, hvortil et eller flere yderligere DNA-segmenter kan knyttes eller har værter knyttet.

25

Transformation: Indføring af DNA i en modtagende værtscelle, som ændrer genotypen og som følge deraf resulterer i en stabil og arvelig ændring af den modtagende celle.

30 Insertionsisomer: Et af de to eller flere mulige rekombi-nante DNA-molekyler, der dannes, når et DNA-fragment indføres i et af to eller flere forligelige bindingssteder på det recipiente DNA.

DK 172716 B1 6

De omhandlede vektorer konstrueres ved, at man fremstiller en DNA-sekvens med et eller to forskellige strukturgener og tilknyttet kontrolsekvens, som overfører resistens over for antibiotika hygromycin B eller G418 eller begge ved en 5 proces, der består i, at man behandler plasmidet pKC203 med a) Bglll restriktionsenzym og isolerer 7,5 kb Bglll restriktionsfragmentet, som overfører resistens overfor 10 begge antibiotika, eller b) Bglll og Sall restriktionsenzym og isolerer 2,75 kb Sa-11/BglII restriktionsfragment, som overfører resistens overfor begge antibiotika, eller 15 c) Bglll og SacI restriktionsenzym og isolerer 1,51 kb Sa-cI/Bglll restriktionsfragment, som overfører resistans overfor antibiotiket hygromycin B, eller 20 d) Sall og EcoRI restriktionsenzym og isolerer 1,65 kb E-coRI/Sall restriktionsfragmentet, som overfører resistans overfor antibiotiket G418.

Den således opnåede DNA-sekvens ligeres til en anden DNA- 25 sekvens omfattende en eukaryot promotor, og om nødvendigt, en prokaryot replikon. DNA-sekvensen, som opnås ved denne ligation, lukkes til dannelse af et plasmid, som kan stabiliseres og opretholdes ved, at man transformerer plasmidet i en værtscelle, dyrker den transformerede værtscelle 30 i nærværelse af antibiotikum hygromycin B eller antibiotikum G418 og selekterer de overlevende celler.

Som det fremgår af eksemplerne i nærværende beskrivelse gør den foreliggende opfindelse brug af bakterielt plasmid DK 172716 B1 7 DNA, som overfører resistens overfor de to aminoglycocid-antibiotika hygromycin B og G418 til dannelse af hidtil ukendte plasmider, som indeholder og udtrykker resistensen i eukaryote og prokaryote værtsceller, der er sensitive 5 over for hygromycin B eller G418. Den foreliggende opfindelse er således nyttig til kloning af DNA i praktisk talt en hvilken som helst celletype. De omhandlede vektorers evne til at overføre resistens overfor antibiotika, som er toxiske i både eukaryote og prokaryote celler, tilveje-10 bringer endvidere en funktionel test til selektion og stabilisering af celler, som har optaget disse vektorer.

Den særlige bakterielle plasmid-DNA-sekvens, som anvendes i de illustrative konstruktioner, er 7,5 kb Bglll restrik-15 tionsfragmentet af plasmidet pKC203 eller derivater af dette fragment. Plasmidet pKC203 har en størrelse på omkring 15 kb og kan let isoleres fra E. coli JR225 ved konventionelle procedurer. Stammen E. coli JR225 optræder i den kendte teknik (Davies og O'Connor, 1978, Antimicrobial 20 Agents and Chemotherapy 14(1):69), og den er også deponeret som en del af samlingen af stamkulturer hos the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hvorfra den er tilgængelig for offentligheden uden begrænsninger under nummeret ATCC 31912. Et restriktions- og funktions-25 diagram for plasmidet pKC203 er vist på den medfølgende fig. 1. Hverken fig. 1 eller de efterfølgende figurer er tegnet i de korrekte målestoksforhold.

7,5 kb Bglll-restriktionsfragmentet af pKC203 omfatter 30 strukturgener og kontrolelementer til udtrykkelse af re sistensen overfor de to antibiotika hygromycin B og G418.

Dette fragment blev ved ligation bundet til plasmidet pSV5 gpt, et kendt plasmid, hvis konstruktion er beskrevet af Mulligan og Berg, 1980, Science 209 (4463):1422. Plasmidet DK 172716 B1 8 pSV5 gpt har en størrelse på omkring 9,3 kb og indeholder såvel et origin for replikation som ampicillin-resistens-markøren af plasmid pBR322 samt en funktionel tidlig SV40-promotor, som kontrollerer transskriptionen af et gen, der 5 koder xanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (gpt). Et diagram, der viser restriktionsstederne og funktionerne af plasmidet pSV5 gpt, er vist på den medfølgende fig. 2. Som det vil være velkendt for fagmanden, kan plasmidet pSV5 gpt replikere både i E. coli og i eukaryote celler såsom 10 pattedyrceller. Desuden gør det unikke Bglll restriktionssted i plasmidet pSV5 gpt det muligt at gennemføre en direkte ligation med 7,5 kb Bglll restriktionsfragmentet fra plasmidet pKC203. Det resistens-tildelende 7,5 kb fragment (for hygromycin B og G418) kan således ved ligation bindes 15 til et Bglll-behandlet plasmid pSV5 gpt. Eftersom de to mulige orienteringer af 7,5 kb fragmentet er lige sandsynlige, resulterer ligationen af 7,5 kb fragmentet på plasmidet pSV5 gpt i plasmider af to typer, som i denne beskrivelse benævnes plasmid pKC214 og plasmid pKC215. Re-20 striktions- og funktionsdiagrammer for plasmiderne pKC214 og pKC215 er vist på fig. 3 og 4.

I de illustrative plasmider pKC214 og pKC215 ligger den eukaryote promotor opad generne, herunder de tilknyttede 25 kontrolelementer, for resistens overfor hygromycin B og G418, og denne promotor er eksemplificeret ved den tidlige SV4O-promotor. Den eukaryote promotor kontrollerer transskriptionen, ligesom den delvist regulerer udtrykkeisen af resistensgenerne, når disse er transformeret over i euka-30 ryote værtsceller. Desuden undergår de nævnte plasmider en chromosomal integration i eukaryote værtsceller og repli-kerer derfor sammen med og som en del af chromosomerne under normal eukaryote celledeling.

DK 172716 B1 9

Selv om den eukaryote promotor, som er eksemplificeret i de illustrative plasmider pKC214 og pKC215, er den tidlige SV40-promotor (O’Hare et al., 1981, Proc. Nat. Acad. Sci.

USA 78 (3) 1527 og Mulligan og Berg, 1980, Sci. 209:1422), 5 kan mange andre eukaryote promotorer anvendes. Andre illu strative eukaryote promotorer omfatter (men er ikke begrænset til) den sene SV40-promotor (Hamer og Leder, 1979,

Nature 281:35), HSVITK-promotor (Pellicer et al., 1978,

Cell 14:133), adenovirus-promotor (Thummel og Tjian, 1981, 10 Cell 23:825), adenovirus 2 (Ad 2) sen promotor (Solnick, 1981, Cell 24:135), polyoma-promotor (Colantuoni et al., 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77 (7):3850), musesarcoma-virus-promotor (VanBeveren et al., 1981, Nature 289:258), gær-trp-l-promotor (Stinchcomb et al., 1979, Nature 15 282:39), gær-leu 2-promotor (Ratzkin og Carbon, 1977,

Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74(2):487, gær-his 3-promotor (Broach et al., 1979, Gene 8:121), cytochrom-c-promotor (Guarente og Ptaschne, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78(4):2199).

20

Medens konstruktionen af de illustrative plasmider pKC214 og pKC215 involverer en indføring af Bglll fragmentet fra pKC203 i pSV5 gpt plasmidet, kan man fremstille andre analoge konstruktioner, som involverer en eller flere af de 25 ovennævnte eukaryote promotorer. F.eks. kan man opnå et lineært BglII-DNA-fragment indeholdende resistensgenerne for hygromycin B og G418 ud fra plasmidet pKC203 eller et derivat deraf ved at behandle plasmidet med et Bglll restriktionsenzym ifølge konventionelle procedurer. Dette 30 fragment kan anvendes direkte, eller man kan ved ligation binde syntetiske DNA-linkere, som kendes af fagfolk, til det resistensoverførende fragment, hvorefter man kan klone det således fremstillede fragment nedenfor en passende eukaryot promotor såsom en Ad 2- eller gær-cytochrom-c- DK 172716 B1 10 promotoren. Efter ligation med en prokaryot replikon er disse konstruktioner, som er eksemplificeret ved plasmi-derne pGDl, pGD2, pGD3 og pGD4, funktionelle i eukaryote og prokaryote værtsceller, og de falder således inden for 5 rammerne af den foreliggende opfindelse. Det skal desuden forstås (og det vil være velkendt for fagmanden), at det er muligt at fremstille yderligere konstruktioner under anvendelse af forskellige eukaryote promotorer, og at visse eukaryote promotorer og konstruktioner foretrækkes frem 10 for andre til anvendelse i bestemte værtsceller.

De særlige hygromycin B og G418 resistensgener og kontrolelementer, som er eksemplificeret i de illustrative plas-mider pKC214, pKC215, pGDl, pGD2, pGD3 og pGD4, omfatter 15 7,5 kb Bglll fragmentet af plasmidet pKC203. Inden for dette Bglll fragment, er den DNA-sekvens, som koder for resistensen, yderligere lokaliseret til 2,5 kb Sall/BgIII fragmentet. Et restriktions- og funktionsdiagram for dette 2,5 kb Sall/BgIII-fragment er vist som en del af plasmidet 20 pKC222 på den medfølgende fig. 5. Plasmidet pKC222 er nyttigt til isolation af de enkelte gener og kontrolelementer, som overfører resistens overfor særlige antibiotika.

F.eks. omfatter 1,51 kb Bglll/SacI fragmentet af plasmidet pKC222 hygromycin B-resistensgenet og kontrolelementet, 25 mens 1,65 kb EcoRI/Sall fragmentet omfatter genet og kontrolelementet, som giver resistens overfor G418. Det formodes yderligere, at genet og det tilknyttede kontrolelement, som giver resistens overfor G418, samtidigt giver resistens overfor antibiotika apramycin og tobramycin i 30 sensitive værtsceller såsom E. coli. Derfor kan rekombi-nante DNA-klonende vektorer, som giver resistens overfor et, flere eller alle antibiotika, konstrueres ved at klone et passende plasmid pKC203 eller pKC222 DNA-fragment nedenfor en passende eukaryot promotor. Efter at være blevet DK 172716 B1 11 forsynet med en prokaryot replikon er vektorerne, som er eksemplificeret ved plasmiderne pGDIO, pGD12, pGD13, pGD14 og pGD15, funktionelle i både eukaryote og prokaryote værtsceller og falder således inden for rammerne af den 5 foreliggende opfindelse. Det skal forstås, at opfindelsen på ingen måde er begrænset af den ovennævnte postulerede yderligere resistens-tildelende aktivitet af G418-re-sistensgenet.

10 7,5 kb Bglll fragmentet af plasmidet pKC203 indeholder og så et prokaryot replikon og kan derfor undergå en selv-ligation til dannelse af et plasmid. Det resulterende plasmid, som benævnes pSC701, er funktionelt i E. coli og er nyttigt til fremstilling af plasmid-derivater, som er 15 nyttige som udgangsmaterialer. Således kan plasmid pSC701 DNA fordøjes med Haell og derefter underkastes ligation til dannelse af plasmiderne pKC257 og pKC259. Plasmidet pKC257 har en størrelse på omkring 4,2 kb og overfører resistens overfor hygromycin B, mens plasmidet pKC259 har en 20 størrelse på omkring 5,0 kb og overfører resistens overfor både hygromycin B og apramycin. En Sau3AI-digestion af plasmidet pKC257 DNA efterfulgt af en ligation resulterer i et endnu mindre plasmid, som benævnes pKC261. Dette plasmid overfører også resistens overfor hygromycin B.

25

De ovennævnte afledte plasmider er funktionelle i E. coli og er nyttige som udgangsmaterialer til konstruktion af vektorer ifølge opfindelsen. Således resulterer en indføring af plasmid pKC259 og pSV5 gpt i plasmiderne pL0314 og 30 pL0315; en indføring af plasmid pKC257 og pSV5 gpt resul terer i plasmiderne pL0316 og pL0317, og en indføring af plasmid pKC261 i pSV5 gpt resulterer i plasmiderne pL0318 og pL0319. Alle de oven for nævnte pLO-plasmider er funktionelle i både prokaryote og eukaryote værtsceller og DK 172716 B1 12 falder således inden for rammerne af den foreliggende opfindelse.

Også andre plasmid-udgangsmaterialer kan konstrueres.

5 F.eks. resulterer en indføring af det plac-holdige Haell restriktionsfragment af plasmid pUR222, hvis konstruktion er beskrevet af RUther, 1981, Nucleic Acids Research 9:4087 i plasmid pKC261 i dannelsen af plasmid pKC275. Det sidstnævnte plasmid har en størrelse på omkring 3,6 kb, 10 det giver resistens overfor hygromycin B, og det kan indføres i plasmid pSV5 gpt til dannelse af de illustrative plasmider pL0320 og pL0321. Ydermere resulterer indføring af et 2 μ DNA-holdigt restriktionsfragment af plasmid Y-ep24 i pKC259 i dannelsen af plasmid pKC264, en indføring 15 af 2,5 kb Bglll/Sall fragmentet af pKC259 i en passende skåret Yep24 resulterer i plasmid pKC273, og en indføring af 3,2 kb PstI fragmentet af plasmid pKC264 i pBR322 resulterer i plasmid pL0378. Både plasmid pL0378 og pKC273 er funktionelle i gær og i E. coli, og de falder således 20 inden for rammerne af den foreliggende opfindelse. Konstruktionen af de ovenfor nævnte vektorer og andre vektorer under anvendelse af de i det foregående nævnte plasmid-udgangsmaterialer er beskrevet yderligere i de efterfølgende eksempler 25-42.

25

Det vil kunne forstås, at fagfolk kan konstruere eller isolere yderligere andre DNA-sekvenser som også giver resistens overfor hygromycin B og G418, enten individuelt eller i kombination, og at disse sekvenser kan anvendes i 30 stedet for de eksemplificerede resistensgener og kontrolelementer. Desuden kan funktionelle derivater af 7,5 kb Bglll fragmentet eller 2,5 kb Sall/BgIII subfragmentet konstrueres ved, at man tilsætter, eliminerer eller sub- DK 172716 B1 13 stituerer visse nucleotider i overensstemmelse med den genetiske kode.

Selv om det prokaryote replikon, som er eksemplificeret i 5 de illustrative plasmider, er et replikon af plasmidet pBR322, kan man anvende en lang række andre replikon'er til fremstilling af tilsvarende konstruktioner. Andre illustrative prokaryote replikon'er omfatter (men er ikke begrænset til): pMBl replikon (Betlach et al., 1976, Fed.

10 Proc. 35:2037), NRI replikon (Rownd og Mickel, 1971 Nature 234:40), RK2 replikon (Beringer, 1974, J. Gen. Microbiol.

84:188), RK6 replikon (Kontomichalou et al., 1970, J. Bac-teriol. 104:34), pSCIOl replikon Cohen og Chang, 1977, J. Bacteriol. 132:734), RP1 replikon (Grinsted et al., 1972, 15 J. Bacteriol. 110:529), RP4 replikon (1977, Nagahari et al., Gene 1:141)), RSF1010 replikon (Guerry et al., 1974, J. Bacteriol. 117:619), PUB110 replikon (Gryczan et al., 1978, J. Bacteriol. 134:318) og SLP1.2 replikon (Bibb et al., Nature 284:526). Det skal forstås (og vil være klart 20 for fagmanden), at mange andre prokaryote replikon'er kan konstrueres, og at man generelt vil foretrække visse prokaryote replikon'er frem for andre og udvælge sådanne foretrukne replikon'er til anvendelse i bestemte værtsceller. F.eks. foretrækker man RSF1010, PUB110 og SLP.2 re-25 plikon'erne til anvendelse i henholdsvis Pseudomonas, Bacillus og Streptomyces, mens de øvrige replikon'er nævnt oven for foretrækkes til anvendelse i E. coli.

Vektorerne ifølge opfindelsen er særdeles alsidige, og de 30 er funktionelle i praktisk talt enhver type prokaryot eller eukaryot værtscelle. De eneste krav er, at (1) værtscellen skal kunne deles og kunne dyrkes, at (2) værtscellen skal være kompetent for transformation, og at (3) den ikke-transformerede værtscelle skal være sensitiv over DK 172716 B1 14 for, og således kunne dræbes af enten hygromycin B eller G418 eller begge antibiotika. Derfor er de omhandlede vektorer nyttige i bakterier, svampe, gær, planteceller, dyreceller og frit levende encellede eukaryoter.

5

Den omfattende mængde af genetisk og biokemisk information om E. coli K12 gør denne til en bekvem og foretrukken pro-karyot værtscelle til opfindelsens formål. Andre foretrukne prokaryote værtsceller er bakterier, hvoriblandt kan 10 nævnes E. coli, E. coli K12 BE827, Bacillus, Bacillus subtilis, Pseudomonas, Agrobacterium, Streptomyces, Staphylococcus, Streptococcus, Actinomyces og Serratia samt blågrønalger. Foretrukne eukaryote værtsceller er svampe, hvoriblandt kan nævnes Neurospora, Cephalosporium, Asper-15 gillus, Penicillium og gær. Desuden kan nævnes celler, der kan dyrkes, og som er afledt af væv fra multicellulære organismer, herunder pattedyrceller, museceller, muse-Ltk--celler, humane celler, fugleceller, amfibieceller, krybdyrceller, celler afledt af phylum Chordata, animalske 20 celler, planteceller, nøgenfrøceller, dækfrøceller og frit levende unicellulære organismer, herunder alger og protozoer.

Som beskrevet i det foregående er vektorerne ifølge opfin-25 delsen funktionelle i praktisk talt alle typer af prokaryote eller eukaryote værtsceller, og tildeler den ønskede antibiotiske resistens over for hygromycin B og G418 til celler, der er sensitive, f.eks. E. coli K12 BE827, E. coli K12 BE783, E. coli K12 BE1041, muse-Lkt“-celler og Sac-30 charomyces cerevisiae. Således giver transformanterne ifølge opfindelsen, herunder de ' illustrative trans- formanter E. coli K12 BE827/pKC214, E. coli K12 BE827/pKC215, muse-Lkt“/pKC214, muse-Lkt"/pKC215, E. coli DK 172716 B1 15 K12 BE7 83/pKC273 og Saccharomyces cerevisiae/pKC273, resistens overfor det ene af de ovennævnte to antibiotika eller dem begge, og de er derfor nyttige, under passende selektionsbetingelser, til opformering og opretholdelse af 5 de omhandlede vektorer. Det vil endvidere være klart for fagmanden, at ikke selekterbare strukturgener kan klones ind i disse vektorer, og at de klonede gener efter transformation og efterfølgende dyrkning under hygromycin B eller G418-selektionstryk i pattedyrceller eller andre 10 værtsceller, kan stabiliseres, opretholdes og udtrykkes.

Kun sådanne transformerede værtsceller kan overleve i nærværelse af hygromycin B eller G418, og derfor gør vektorerne ifølge opfindelsen det muligt at foretage en bekvem isolation og begyndende identifikation af transformanter.

15

Den store mængde værtsceller, som kan transformeres med vektorerne ifølge opfindelsen, er væsentlig, eftersom den muliggør en bekvem amplificering og manipulation af eukaryote vektorer i prokaryote værtsceller. Dette er en sær-20 lig fordel, eftersom den genetiske baggrund for prokaryo-ter, såsom E. coli og lignende, er velkendt og eftersom man bekvemt kan anvende rekombinant DNA-procedurer i sådanne systemer. Som en konsekvens heraf kan man i de prokaryote celler først manipulere og amplificere de rekombi-25 nante DNA-kloningsvektorer, herunder de vektorer, som indeholder selekterbare eller ikke-selekterbare strukturgener og derefter transformeret i eukaryote værtsceller til udtrykkelse, hvorved man undgår de alvorlige problemer, som er forbundet med at være begrænset til udelukkende at 30 anvende eukaryote systemer.

Mens alle udførelsesformerne for den foreliggende opfindelse er nyttige, er visse af de rekombinante DNA-klo-ningsvektorer og transformanter ifølge opfindelsen særligt DK 172716 B1 16 foretrukne. De foretrukne vektorer er således plasmiderne pKC214, pKC215 og pKC273 og de foretrukne prokaryote transformanter er E. coli K12 BE827/pKC214, E. coli K12 BE827/pKC215 og E. coli K12 BE783/pKC273, mens de fore- 5 trukne eukaryote transformanter er muse-Lkt“/pKC214, muse-Lkt-/pKC215 og Saccharomyces cerevisiae/pKC273.

Anvendeligheden af vektorerne og transformanterne ifølge opfindelsen er bred og muliggør en større og væsentligt 10 hurtigere anvendelse af rekombinant-DNA-teknologien på eukaryote systemer. F.eks. frembyder evnen af de omhandlede vektorer, herunder plasmider, bakteriophager og vira, til at give resistens overfor antibiotika, som er toxiske overfor både eukaryote og prokaryote celler, en funktionel 15 test til selektering af transformanter. Dette er væsentligt, eftersom en sådan test er en praktisk nødvendighed til bestemmelse og selektering af de særlige celler, som har tilegnet sig vektor-DNA. Yderligere DNA-sekvenser, som mangler en funktionel test for deres tilstedeværelse, kan 20 indføres i de omhandlede vektorer, hvorefter transformanter, som indeholder den ikke-selekterbare DNA, kan isoleres ved hygromycin B- eller G418-selektion. Sådanne ikke-selekterbare DNA-sekvenser omfatter (men er ikke begrænset til) gener, som specificerer et post-translationelt modi-25 ficeret protein, såsom fibronectin- eller hepatitis B-antigen, som begge er post-translationelt glycolyseret af eukaryote celler.

Nærmere bestemt kan man eksempelvis indføre en ikke-selek-30 terbar gensekvens i Pvul-stedet af plasmider, såsom de eksempelvise plasmider pGD14 og pGD15, som indeholder 2,75 kb Sall/BgIII restriktionsfragmentet af plasmidet pKC203.

En sådan indføring inaktiverer hygromycin B-resistensgenet og gør det således muligt at foretage en let identifikati- DK 172716 B1 17 on af transformanter, der indeholder det rekombinante plasmid. Dette gøres ved, at man først selekterer for G418-resistens, hvorefter man identificerer de G418-re-sistente transformanter, som ikke er resistente over for 5 hygromycin B. På lignende måde vil en indføring af en særlig gensekvens på eksempelvis Xhol-stedet inaktivere G418-resistensgenet. Transformanter, som bærer dette rekombinante plasmid, kan således også let identificeres ved, at man først at selektere for hygromycin B-resistens, hvoref-10 ter man identificerer de hygromycin B-transformanter, som ikke er resistente over for G418. Evnen til at selektere for antibiotisk resistens i eukaryote eller prokaryote transformanter gør det derfor muligt at foretage en effektiv isolation af de ekstremt sjældne celler, som indehol-15 der det pågældende ikke-selekterbare særlige DNA.

Den funktionelle test for antibiotisk resistens, som er beskrevet i det foregående, kan også anvendes til at identificere DNA-sekvenser, som virker som kontrolelementer og 20 dirigerer udtrykkeisen af et individuelt antibiotisk resistensgen. Sådanne sekvenser omfatter, men er ikke begrænset til promotorer, attenuatorer, repressorer, inducere, ribosomale bindingssteder og lignende, og de kan anvendes til at kontrollere udtrykkeisen af andre strukturgener i 25 både eukaryote og prokaryote celler.

De hygromycin B- og G418-resistens-tildelende vektorer ifølge opfindelsen er også nyttige til stabilisering af linkede DNA-sekvenser af forskellig art. Disse gener eller 30 fragmenter, som er kovalent bundet til hygromycin B- eller G418-resistensgenet og opformeret i enten eukaryoter eller prokaryoter, kan opretholdes ved, at man udsætter transformanterne for niveauer af hygromycin B eller G418, som er toxiske over for ikke-transformerede celler. Derfor vil DK 172716 B1 18 de transformanter, som mangler vektoren, og dermed enhver form for kovalent linket DNA, dø og fjernes fra kulturen.

Således kan vektorerne ifølge opfindelsen stabilisere og opretholde enhver speciel DNA-sekvens.

5

De klonede vektorer og transformanter ifølge opfindelsen gør det ikke kun muligt at foretage en kommercielt gennemførlig produktion af polypeptider, såvel umodificerede po-lypeptider som polypeptider, der er modificeret post-10 translationelt, i eukaryote celler, men gør det også muligt at opnå forbedrede udbytter af forskellige produkter, som løbende produceres i prokaryote og eukaryote celler.

Evnen til at kunne indføre og stabilisere sådanne DNA-se-15 kvenser i eukaryote og prokaryote celler er væsentlig, eftersom produktionen af visse antibiotika og proteiner, som er modificeret efter translationen, ved anvendelse af re-kombinant-DNA-teknik kræver en eukaryotisk vært. Desuden muliggør de omhandlede vektorers evne til at være funktio-20 nelle i prokaryote celler såsom E. coli en bekvem manipulation og amplifikation, således at man kan undgå de problemer, der er forbundet med eukaryote celler, hvori sådanne procedurer er vanskelige eller endog umulige at gennemføre.

25

Opfindelsen illustreres nærmere ved følgende eksempler.

EKSEMPEL 1 30 Plasmid pKC203 A. Isolation af plasmid DNA fra E. coli JR225 DK 172716 B1 19

Bakterien E. coli JR225 (ATCC nr. 31912) blev dyrket i TY-dyrkningsbouillon (1% trypton, 0,5% gærekstrakt, 0,5% na-triumchlorid, pH 7,4) med 100 pg/ml antibiotikum hygromy-cin B ved konventionelle mikrobiologiske procedurer. Efter 5 18 timers inkubering blev omkring 0,5 ml af kulturen over ført til et Eppendorf-rør på 1,5 ml og centrifugeret i omkring 15 sekunder. Med mindre andet er angivet, er alle manipulationer udført ved omgivelsestemperatur. Den resulterende supernatant blev forsigtigt fjernet ved hjælp af 10 en aspirator med fin spids, og celletabletten blev suspenderet i omkring 100 μΐ af en frisk fremstillet lysozym-op-løsning, som indeholdt 2 mg/ml lysozym, 50 mM glucose, 10 mM CDTA (cyclohexandiamintetraacetat) og 25 mM tris-HCl (pH 8,0). Efter inkubering ved 0 °C i 30 minutter tilsattes 15 omkring 200 μΐ af en basisk SDS-opløsning (natriumdecyl-sulfonat) (0,2 N NaOH, 1% SDS), og røret blev forsigtigt underkastet en hvirvelbevægelse og derefter holdt ved 0 °C i 15 minutter. Derpå tilsattes omkring 150 μΐ 3 M natriumacetat (fremstillet ved at opløse 3 mol natriumacetat i en 20 minimal mængde vand, justere pH til 4,8 med iseddikesyre og derefter justere volumenet til 1 liter), og rørets indhold blev derefter forsigtigt blandet, idet man vendte røret i nogle få sekunder, hvorunder der dannedes en klump af DNA.

25 Røret blev holdt ved 0 °C i 60 minutter og derefter centrifugeret i 5 minutter til dannelse af en næsten klar supernatant. Omkring 0,4 m laf denne supernatant blev overført til et andet centrifugeringsrør, hvortil der forinden var 30 sat 1 ml koldt ethanol. Efter at røret var blevet holdt ved -20 °C i 30 minutter, blev det resulterende bundfald opsamlet ved centrifugering (2 minutter) , og supernatanten blev fjernet ved frasugning. Den således opnåede tablet DK 172716 B1 20 blev opløst i 100 μΐ i 0,1 M natriumacetat/O,05 M Tris-HCl (pH 8) og derefter genudfældet ved tilsætning af 2 voluminer koldt ethanol. Efter 10 minutters forløb ved 20 °C blev bundfaldet opsamlet ved centrifugering som beskrevet oven-5 for, og dette bundfald bestod af det ønskede E. coli JR226 plasmid DNA.

B. Transformation af E. coli JR225 plasmid DNA og isolation af plasmid pKC203 10

Tabletten af E. coli JR225 plasmid DNA blev opløst i omkring 100 μΐ 0,1 M natriumacetat/O,05 M Tris-HCl (pH 8) og udfældet med 2 voluminer koldt ethanol. Det resulterende plasmid-DNA blev opsamlet og derefter opløst i omkring 40 15 μΐ vand eller fortyndet pufferopløsning og endelig anvendt til at transformere E. coli K12 BE827 i det væsentlige i overensstemmelse med transformationsmetoden beskrevet af Wensink, 1974, Cell 3:315. E. coli K12 BE827 er deponeret som en del af samlingen af stamkulturer hos the American 20 Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hvorfra den er tilgængelig for offentligheden uden begrænsninger under nummeret ATCC 31911. De resulterende transformanter blev udvalgt på TY-agar (1% trypton, 0,5% gærekstrakt, 0,5% na-triumchlorid, 1,5% agar, pH 7,4) indeholdende 200 μg/ml 25 antibiotikum hygromycin B. Det blev vist ved gelelek-trophorese (Rao og Rogers, 1978) og ved andre forsøg, at nogle af transformanterne indeholdt både større og mindre (15 kb) plasmider og var resistente over for bade antibio-tiket ampicillin og antibiotiket hygromycin B. Andre 30 transformanter indeholdt kun det mindre 15 kb plasmid og var resistente over for de to antibiotika hygromycin B og G418, men sensitive over for ampicillin.

DK 172716 B1 21

Transformanter af den sidstnævnte type blev udsået på TY-agar indeholdende 1 mg/ml af antibiotiket hygromycin B og dyrket ved anvendelse af mikrobiologiske standardteknikker. De resulterende celler blev anvendt som beskrevet 5 ovenfor i eksempel 1 A for at isolere det ovenfor beskrevne 15 kb plasmid, der overfører hygromycin B- og G148-re-sistent, i det følgende betegnet plasmid pKC203. Tilstedeværelse af hygromycin B- og G418-resistensgenerne på plasmid pKC203 blev bekræftet ved efterfølgende transformation 10 og selektionsanalyse.

EKSEMPEL 2

Isolation af antibiotika hygromycin B- og G418-resistens-15 generne og kontrolelementerne

Omkring 5 μg plasmid pKC203 DNA blev behandlet med Bglll restriktionsenzym ifølge instruktionerne og under de betingelser, som er specificeret af fabrikanten*. Af de ud-20 vundne 7,5 kb, 5,8 kb og 0,5 kb fragmenter indeholdt 7,5 kb Bglll fragmentet de ønskede antibiotika hygromycin B-og G418-resistensgener og kontrolelementer. Dette blev bekræftet ved efterfølgende transformation og selektionsanalyse, som viste, at celler, som normalt er sensitive over 25 for antibiotika hygromycin B og G418, er resistente over for disse antibiotika efter transformation med 7,5 kb Bglll fragmentet.

* Restriktionsenzymer og instruktion kan let erhverves fra 30 følgende leverandører:

Bethesda Research Laboratories Inc.

Box 6010

Rockville, Maryland 20850; DK 172716 B1 22

Boehringer Mannheim Biochemicals 7941 Castleway Drive P.0. Box 50816 5 Indianapolis, Indiana 46250;

New England Bio Labs., Inc.

283 Cabot

Beverly, Massachusetts 01915; 10

Research Products Miles Laboratories Inc.

Elkhart, Indiana 46515.

15 EKSEMPEL 3

Konstruktion af plasmiderne pKC214 oq pKC215 og transfor-manterne E. coli K12 BE827/pKC214 og E. coli K12 BE827/pKC215 20

Plasmidet pSV5 gpt, hvis konstruktion er beskrevet af Mulligan og Berg 1980, Science 209(4462):1422 har et enkelt Bglll-sted inden for gpt-genet. En kloning som beskrevet i det følgende muliggør en udtrykkelse af antibiotika hygro-25 mycin B- og G418-resistensgenerne.

Omkring 5 μς plasmid pSV5 gpt DNA blev behandlet med Bglll restriktionsenzym ifølge instruktioner og betingelser specificeret af fabrikanten. Efter at have inaktiveret enzy-30 met ved opvarmning til 70 °C i 5 minutter blandede man omkring 1 μ0 DNA i et forhold på 1:1 med 7,5 kb Bglll fragmentet af pKC203. Fragmenterne blev sammenknyttet ved anvendelse af T4 DNA ligase i overensstemmelse med instruktioner og betingelser specificeret af fabrikanten*.

* T4 DNA Ligase og instruktioner kan fås fra: DK 172716 B1 23

Bethesda Research Laboratories 5 Box 6010

Rockville, Maryland 20850.

Den således ligerede blanding blev anvendt til at transformere E. coli K12 BE827 i det væsentlige i overensstem-10 melse med transformationsmetoden beskrevet af Wensink, 1974, Cell 3:315 på TY-plader indeholdende 100 pg/ml af hvert af de to antibiotika ampicillin og apramycin. De re-kombinante kloner blev udsået på TY-plader indeholdende 100 μg/πιl ampicillin og 200 pg/ml af antibiotiket hygromy-15 cin B. Omkring halvdelen af de hygromycin B-resistente re-kombinante kloner indeholdt plasmidet pKC214 (fig. 3), mens resten indeholdt plasmidet pKC215 (fig. 4).

Plasmid-DNA fra forskellige kloner beskrevet ovenfor blev 20 isoleret ifølge proceduren beskrevet i eksempel 1A og konventionelt skelnet fra hinanden ved restriktionsenzymanalyse. På denne måde blev de konstruerede plasmider pKC214 og pKC215 og de konstruerede transformater E. coli K12 BE827/pKC214 og E. coli K12 BE827/pKC215 identificeret og 25 derefter isoleret til senere brug.

Konstruktion af muse-Ltk~/pKC214 DK 172716 B1 EKSEMPEL 4 24 5 Muse-Ltk“-celler blev dyrket konventionelt til normal opretholdelse af celler i et medium omfattende et minimalt essentielt medium med Earle's salte og ikke-essentielle aminosyrer (Eagle, 1959, Science 130:435), 10% v/v kalve serum fra nyfødte kalve og 292 μg/ml glutamin. De således 10 dyrkede muse-Ltk“-celler blev derefter transformeret med plasmid pKC214 i det væsentlige i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet af Wigler et al., 1979, Proc.

Nat. Acad. Sci. USA 76 (3):1373 med den undtagelse, at (1) der sattes 100-300 ng plasmid-DNA til hver plade i 1 ml 15 calciumphosphatbundfald, og at (2) dyrkningsmediet var som beskrevet ovenfor. Efter inkubering i 4 timer ved 37 °C blev mediet erstattet med et frisk medium, og cellerne fik lov til at inkubere i yderligere 20 timer. Derefter påfør-tes udvælgelsestrykket for antibiotiket hygromycin B. Det-20 te blev gjort ved at ændre mediet til et selektionsmedium, som indeholdt det oven for beskrevne medium samt omkring 75-100 pg/ml antibiotikum hygromycin B. Den koncentration af antibiotiket, som foretrækkes til selektionsmediet, er 200 pg/ml. Selektionsmediet blev udskiftet efter den før-25 ste dag, derpå efter yderligere 2 dages forløb og endelig hver tredje dag i løbet af de næste to eller tre uger, hvorunder de transformante kloner opstod. Kolonierne blev indhøstet ved håndkraft med pipette og blev dyrket i en massekultur under fortsat selektionstryk. De således dyr-30 kede hygromycin B-resistente celler udgør de ønskede muse-

Ltk~/pKC214-transformanter.

Konstruktion af muse-Ltk~/pKC215 DK 172716 B1 EKSEMPEL 5 25 5 Man konstruerede muse-Ltk”/pKC215-celler i det væsentlige i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 4, idet man dog anvendte plasmid pKC215 i stedet for plasmid pKC214 ved transformationsproceduren. De således konstruerede muse-Lkt_/pKC215-transformanter blev derefter dyrket 10 i massekultur.

EKSEMPEL 6

Resistens af transformanter over for antibiotika hyqromy-15 cin B og G418

Evnen hos plasmiderne pKC203, pKC214 og pKC215 til at tilvejebringe resistens over for antibiotika hygromycin B og G418 blev bestemt ved at teste transformerede og ikke- 20 transformerede E. coli- og muse-Ltk“-celler for vækst på medier indeholdende forskellige mængder af ovennævnte antibiotika. Medierne og dyrkningsbetingelserne for E. co li- og muse-Ltk"-celler var i det væsentlige som beskrevet oven for i henholdsvis eksempel 1A og eksempel 4. Resulta-25 terne af denne test fremgår af de efterfølgende tabeller 1 og 2, hvori symbolet "+" angiver vækst, symboler angiver ingen vækst, og symbolet "N/T" angiver, at der ikke gennemførtes nogen test.

TABEL 1 DK 172716 B1 26

Resistens overfor antibiotiket hygromycin B

Antibiotisk koncen-

Celletype tration af dyrknings medium 0 200 400 μθ/ml μ9/πι1 μς/πιΐ1 E. coli K12 + E. coli K12 BE827/pKC203 + + + E. coli K12 BE827 +

E. coli K12 BE827/pKC214 N/T + N/T

E. coli K12 BE827/pKC215 N/T + N/T

Muse-Ltk- + - ^/T

Muse-Ltk”/pKC214 + + +

Muse-Ltk"/pKC215 + + +

Muse-Ltk-/pKC214 og muse-Ltk“/pKC215-cellerne replikere-5 de ikke alene ved 400 μg/ml, men overlevede også højere koncentrationer, der oversteg 100 pg/ml.

TABEL 2 DK 172716 B1 27

Resistens overfor antibiotiket G418

Celletype Antiobiotisk koncentration af dyrk ningsmedium

0 pg/ml <75 pg/ml 75 pg/ml 500 μg/ml E. coli K12/pKC203 + + + N/T

Muse-Ltk- + +

Muse-Ltk“PKC214 + + + +

Muse-Ltk“/pKC215 + + + EKSEMPEL 7 5

Konstruktion af plasmiderne pGDl og pGD2 og transformanterne E. coli K12 BE827/pGDl og E. coli K12 BE827/pGD2

Plasmidet pLG669, hvis konstruktion er beskrevet af Gua-10 rente og Ptashne, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA

78(4):2199, indeholder et enkelt BamHI-restriktionssted i cytochrom-c-genet. Ved at klone 7,5 kb Bglll fragmentet af plasmid pKC203 ind på dette sted, som beskrevet i det følgende, opnås muligheden for at udtrykke det antibiotiske 15 hygromycin B-resistensgen. Den ønskede indføring kan let gennemføres, eftersom Bglll-fragmenter indeholder 5’-eks-tensioner med sekvensen GATC, som er identiske med 5'-ekstensionerne i BamHI-fragmenterne. Derfor er Bgl11-fragmenterne og BamHI-fragmenterne forligelige og kan underkastes 20 direkte ligation til dannelse af rekombinationer.

Plasmiderne pGDl og pGD2 og transformanterne E. coli K12 BE827/pGDl og E. coli K12 BE827/pGD2 konstrueres i det væ- DK 172716 B1 28 sentlige og i overensstemmelse med teknikken beskrevet i eksempel 3 med den undtagelse, at plasmidet pLG669 med det enlige BamHI-sted anvendes i stedet for plasmidet pSV5 gpt. Afhængig af orienteringen af BglII-fragmentet opnås 5 plasmider med to orienteringer. Plasmidet pGDl betegner rekombinante plasmider, hvori Sall-restriktionsstedet er tættest på ura-genet. Plasmidet pGD2 betegner plasmider med den omvendte orientering.

10 EKSEMPEL 8

Konstruktion af Saccharomyces cerevisiae/pGDl Gær (Saccharomyces cerevisiae) dyrkes typisk i 1% gæreks-15 trakt/2% bacto-pepton under anvendelse af konventionelle mikrobiologiske procedurer, der er velkendte for fagmanden. Transformationen af plasmid pGDl i gær gennemføres i det væsentlige i overensstemmelse med teknikken beskrevet af Hinnen et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:1929.

20 Transformanterne udvælges ved at sætte dødelige doser af antibiotiket hygromycin B til dyrkningsmediet.

EKSEMPEL 9 25 Konstruktion af Saccharomyces cerevisiae/pGD2

De ønskede transformanter konstrueres i det væsentlige i overensstemmelse med det i eksempel 8 beskrevne, idet der dog anvendes plasmid pGD2 i stedet for plasmid pGDl.

30 DK 172716 B1 EKSEMPEL 10 29

Konstruktion af plasmiderne pGD3 og pGD4 og transforman-terne E. coli K12 BE827/pGD3 og E. coli K12 BE827/pGD4 5

Plasmidet p04, hvis konstruktion er beskrevet af Solnick, 1981, Cell 24:135, indeholder den vigtigste sene Adenovirus 2 (Ad2) promotor med plankoordinaterne 15,4 (EcoRI) til 16,6 (Hindlll). Ved at klone Bglll-fragmentet (7,5 kb) 10 af plasmidet pKC203 ind på Hindlll-stedet i plasmidet p04 bliver det muligt at udtrykke det antibiotiske hygromycin B-resistensgen.

Den ønskede konstruktion foretages bekvemt ved, at man i 15 det væsentlige i overensstemmelse med teknikken beskrevet af Ullrich et al., 1977, Science 196:1313 sætter Hindlll-linkere* til 7,5 kb Bglll-fragmentet, hvorefter man ved ligation binder det således modificerede fragment til Hin-dlll-behandlet plasmid p04 ved brug af T4 DNA ligase. Hin-20 dill restriktion og T4 DNA ligaseenzym kan fås med instruktioner fra de firmaer, der er omtalt i henholdsvis eksempel 2 og eksempel 3. Efter at 7,5 kb Bglll fragmentet er forsynet med Hindlll-linkere, gennemføres ligationen af fragmentet til plasmidet p04 til dannelse af plasmiderne 25 pGD3 og pGD4 i det væsentlige i overensstemmelse med teknikken beskrevet i eksempel 3. Den efterfølgende transformation over i E. coli K12 BE827 til dannelse af E. coli K12 BE827/pGD3 og E. coli K12 BE827/pGD4 gennemføres ligeledes i overensstemmelse med teknikken beskrevet i eksem-30 pel 3.

Som forklaret i eksemplerne 3 og 7 opnår man plasmider med to orienteringer i afhængighed af orienteringen af det indførte resistens-overførende fragment. Plasmidet pGD3 DK 172716 B1 30 betegner rekombinante plasmider, hvori Sall-restriktions-stedet af det indførte antibiotiske hygromycin B-overfø-rende fragment er tættest på EcoRI-stedet på Ad2-promoto-ren. Plasmidet gGD4 betegner plasmider med den omvendte 5 orientering.

* HindiII [(d(CCAAGCTTGG)J og andre linkere kan fås fra:

Collaborative Research Inc.

10 1365 Main Street

Waltham, MA 02154 EKSEMPEL 11 15 Konstruktion af muse-Ltk~/pGD3

Konstruktionen af muse-Ltk~/pGD3 gennemføres i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 4 beskrevne teknik med den undtagelse, at man anvender plasmid pGD3 i 20 stedet for plasmid pKC214.

EKSEMPEL 12

Konstruktion af muse-Ltk~/pGD4 25

Konstruktionen af muse-Ltk~/pGD4 gennemføres i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 4 beskrevne teknik med den undtagelse, at man anvender plasmid pGD4 i stedet for plasmid pKC215.

30 DK 172716 B1 EKSEMPEL 13 31

Konstruktion af plasmid pKC222 og transformant E. coli K12 BE827/pKC222 5 A. Isolation af 2,75 kb Sall/Bglll fragmentet af plasmid PKC203

Omkring 5 pg plasmid pKC203 DNA blev behandlet med Sall og 10 Bglll restriktionsenzymer i overensstemmelse med instruktioner og betingelser specificeret af fabrikanten*. Et 2,75 kb fragment, som indeholdt generne og kontrolelementerne for resistens overfor de to antibiotika hygromycin B og G418, blev udvundet ved konventionelle procedurer.

15 * Restriktionsenzymer og instruktioner kan fås fra de i eksempel 2 angivne leverandører.

B. Ligation og endelig konstruktion 20

Omkring 5 μg plasmid pKC7, hvis konstruktion er beskrevet af Rao og Rogers, 1979, Gene 7:79, blev behandlet med Sall og Bglll restriktionsenzymer. Efter at enzymerne var blevet inaktiveret ved opvarmning til 70 °C i 5 minutter, 25 blandedes omkring 1 pg/DNA i et forhold på 1:1 med 2,75 kb Sall/Bglll fragmentet af pKC203. Fragmenterne blev sammenknyttet ved anvendelse af T4 DNA ligase i overensstemmelse med instruktioner og betingelser specificeret af den i eksempel 3 nævnte leverandør. Det resulterende plasmid 30 pKC222 blev transformeret i E. coli K12, i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 3 beskrevne teknik, og plasmidet viste sig at overføre resistens overfor til de tre antibiotika ampicillin, hygromycin B og G418.

EKSEMPEL 14 DK 172716 B1 32

Isolation af det hyqromycin B-resistens-overførende 1,51 5 kb SacI/BgIII fragment af plasmid pKC222

Det ønskede DNA-fragment blev isoleret i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 13A beskrevne teknik med den undtagelse, at man anvendte SacI og ikke Sall sam-10 men med Bglll til restriktions-fordøjelsen.

EKSEMPEL 15

Isolation af det G418-resi5tens-overførende 1,65 kb Eco-15 RI/SalI fragment af plasmid pKC222

Det ønskede DNA-fragment blev isoleret i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 13A beskrevne teknik med den undtagelse, at man anvendte EcoRI og ikke Bglll 20 sammen med Sall til restriktionsfordøjelsen.

EKSEMPEL 16

Konstruktion af plasmiderne pGDIO og pGDll og transforman-25 terne E. coli K12 BE827/pGD10 og E. coli K12 BE827/pGDll

De ønskede plasmider konstrueres i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 3 og eksempel 10 beskrevne teknik med den undtagelse, at man anvender 1,51 kb 30 SacI/BgIII fragmentet af plasmid pKC222 i stedet for 7,5 kb Bglll fragmentet af plasmid pKC203, og at man knytter Bglll- og ikke Hindlll-linkere til det resistens-overførende fragment. Man indfører 1,51 kb fragmentet med Bglll- DK 172716 B1 33 linkere i plasmid pSV5 gpt i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 3 beskrevne procedure.

Som beskrevet i eksemplerne 3 og 7 opnår man plasmider med 5 to orienteringer i afhængighed af orienteringen af det indførte resistens-overførende fragment. Plasmid pGDIO designerer rekombinante plasmider, hvori Aval-restriktions-stedet af det indførte hygromycin B-resistens-overførende fragment ligger tættest på Hindlll-stedet i gpt-genet.

10 Plasmid pGDll betegner plasmider med den omvendte orientering.

Transformationen af plasmiderne pGDIO og pGDll i E. coli K12 BE827 til dannelse af henholdsvis E. coli K12 15 BE827/pGDll gennemføres også i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 3 beskrevne teknik.

EKSEMPEL 17 20 Konstruktion af muse-Ltk~/pGD10

Den ønskede konstruktion gennemføres i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 4 beskrevne teknik med den undtagelse, at man ved transformationen anvender plas-25 mid pGDIO i stedet for plasmid pKC214. Det således konstruerede muse-Ltk~/pGD10 kan dyrkes i massekultur.

EKSEMPEL 18 30 Konstruktion af muse-Ltk~/pGDll

Den ønskede konstruktion gennemføres i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 4 beskrevne teknik, DK 172716 B1 34 idet man anvender plasmid pGDll i stedet for plasmid pKC214 ved transformationen. Det således konstruerede mu- se-Ltk"/pGDll kan dyrkes i massekultur.

5 EKSEMPEL 19

Konstruktion af plasmiderne pGD12 og pGD13 og transformanterne E. coli Kl2 BE827/PGD12 og E. coli K12 BE827/pGDl3 10 De ønskede plasmider konstrueres i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 3 og eksempel 10 beskrevne teknik med den undtagelse, at man anvender 1,65 kb Eco-RI/SalI fragmentet af plasmid pKC222 i stedet for 7,5 kb Bglll fragmentet af plasmid pKC203, og at man knytter 15 Bglll- og ikke Hindlll-linkere til det resistens-overførende fragment. Man indfører 1,65 kb fragmentet med Bglll-bindere i plasmidet pSV5 gpt i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 3 beskrevne procedure.

20 Som forklaret i eksempel 16 opnår man plasmider med to orienteringer. Plasmid pGD12 betegner rekombinante plasmider, hvori Pstl-restriktionsstedet af det indførte G418-resistens-overførende fragment ligger tættest på Hindlll-stedet i gpt-genet. Plasmid pGD13 betegner plasmider med 25 den omvendte orientering.

Transformationen af plasmiderne pGD12 og pGD13 i E. coli K12 BE827/pGD13 gennemføres også i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 3 beskrevne teknik med den 30 undtagelse, at man anvender antibiotiket G418 i stedet for antibiotiket hygromycin B til udvælgelse af transformenter .

DK 172716 B1 EKSEMPEL 20 35

Konstruktion af muse-Ltk~/pGD12 5 Den ønskede konstruktion gennemføres i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 4 beskrevne teknik med den undtagelse, at man anvender plasmid pGD12 og ikke plasmid pKC213 ved transformationsproceduren, og med den undtagelse, at man ved udvælgelsen af transformanter an-10 vender antibiotiket G418 i stedet for antibiotiket hygro- mycin B. Det således konstruerede muse-Ltk~/pGD12 kan dyrkes i massekultur.

EKSEMPEL 21 15

Konstruktion af muse-Ltk~/pGD13

Den ønskede konstruktion gennemføres i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 4 beskrevne teknik med 20 den undtagelse, at man ved transformationsproceduren anvender plasmid pGD13 og ikke plasmid pKC214, og med den undtagelse, at man ved udvælgelsen af transformanter anvender antibiotiket G418 i stedet for antibiotiket hygro- mycin B. Det således konstruerede muse-Ltk”/pGD13 kan dyr-25 kes i massekultur.

EKSEMPEL 22

Konstruktion af plasmiderne pGD14 og pGD15 og transforman-30 terne E. coli K12 BE827/pGD14 og E. coli K12 BE827/pGD15 2,75 kb Sall/BgIII fragmentet af plasmid pKC203 blev isoleret som beskrevet i eksempel 13. Derefter tilknyttedes DK 172716 B1 36 molekylære linkere som beskrevet i eksempel 10 med den undtagelse, at man anvendte Bglll- og ikke Hindlll-linke-re. Det resulterende fragment blev derefter indført i plasmid pSV5 gpt, idet man i det væsentlige gik frem som 5 beskrevet i eksempel 3, til dannelse af de ønskede plasmi-der.

Som forklaret i eksempel 16 opnår man plasmider med to forskellige orienteringer. Plasmid pGD14 betegner rekombi-10 nante plasmider, hvori Aval-restriktionsstedet af det resistens-overførende fragment ligger tættest ved HindTII-stedet i gpt-genet. Plasmid pGD15 betegner plasmider med den omvendte orientering.

15 Transformationen af plasmiderne pGD14 og pGDl5 til E. coli K12 BE827 til dannelse af henholdsvis E. coli K12 BE827/pGDl4 og E. coli K12 BE827/pGD15 gennemføres ligeledes i det væsentlige i overensstemmelse med det i eksempel 3 beskrevne.

20 EKSEMPEL 23

Konstruktion af muse-Ltk~/pGDl4 25 Den ønskede konstruktion gennemføres i det væsentlige som beskrevet i eksempel 4 med den undtagelse, at man ved transformationen anvender plasmid pGD14 i stedet for plasmid pKC214. Det således konstruerede muse-Ltk"/pGD14 kan dyrkes i massekultur.

30 EKSEMPEL 24 DK 172716 B1 37

Konstruktion af muse-Ltk~/pGD15 5 Den ønskede konstruktion gennemføres i det væsentlige som beskrevet i eksempel 4 med den undtagelse, at man ved transformationen anvender plasmid pGD15 i stedet for plasmid pKC214. Det således konstruerede muse-Ltk“/pGD14 kan dyrkes i massekultur.

10 EKSEMPEL 25

Konstruktion af plasmid pSC701 og transformant E. coli K12 BE827/pSC701 15

Omkring 25 μΐ (5 pg) plasmid pKC203 (isoleret i eksempel 1) i TE-puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 1 mM EDTA) , 5 μΐ DTT (100 mM dithiothreitol), 5 μΐ (1000 mg/ml) BSA (bovint serumalbumin), 25 μΐ vand, 5 μΐ (5 enheder) Bglll restrik-20 tionsenzym, og 5 μΐ, 10X reaktionsblanding* blev inkuberet ved 37 °c i omkring 1 time. Reaktionen blev afbrudt ved in-kubering ved 70 °C i 5 minutter, hvorefter reaktionsblandingen blev afkølet med is, ekstraheret med phenol og chloroform/isoamylalkohol (24:1) og udfældet med ethanol.

25 De resulterende BglII-restriktions-fragmenter blev opløst i 5 μΐ 5 mM NaCl og derefter bundet ved ligation. Man gennemførte ligationen ved at omsætte 1 μΐ af det BglII-be-grænsede DNA med omkring 38 μΐ vand, 5 μΐ (10 mM) ATP, 5 μΐ ligationsblanding** og 1 μΐ T4 DNA ligase (~10^ New 30 England Bio Lab enheder) ved 16 °C i omkring 16 timer. Reaktionen blev afbrudt ved inkubering ved 70 °C i 5 minut- DK 172716 B1 38 ter. Efter afkøling med is anvendes den resulterende lige-rede blanding til at transformere E. coli K12 BE827, i det væsentlige i overensstemmelse med transformationsproceduren beskrevet i Wensink, 1974 på TY-plader indeholdende 5 200 mg/ml af antibiotiket hygromycin B. Som det alminde ligt fremgår af gelelektrophorese (Rao og Rogers, 1978) og ved andre forsøg, indeholdt nogle af transformanterne kun det ønskede ~7,3 kb plasmid. En sådan transformant, der her betegnes E. coli K12 BE827/pSC701, udvælges, spredes 10 på TY-agar indeholdende 200 pg/ml af antibiotiket hygromycin B og dyrkes ved anvendelse af konventionelle mikrobiologiske teknikker. De resulterende celler anvendes til at isolere plasmidet pSC701 ifølge proceduren beskrevet i eksempel 1. Tilstedeværelsen af hygromycin B- og G418-re-15 sistensgenerne i plasmid pSC701 blev yderligere bekræftet ved efterfølgende transformation, selektion og restriktionsenzymanalyse. Et restriktions- og funktionsdiagram af plasmid pSC701 er vist på fig. 6, 20 * Reaktionsblanding (10X) til Bglll restriktionsenzym fremstilledes med følgende sammensætning: 600 mM NaCl 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 25 100 mM MgCl2 ** Ligationsblandingen fremstilledes med følgende sammensætning: 30 500 mM Tris-HCl, pH 7,8 200 mM dithiothreitol 100 mM MgCl2 EKSEMPEL 26 DK 172716 B1 39

Konstruktion af plasmiderne pKC257 og pKC259 og transformanterne E. coli K12 BE783/pKC257 og E. coli K12 5 BE783/pKC259

Det ønskede plasmid blev fremstillet i det væsentlige som beskrevet i eksempel 25 med den undtagelse, at man anvendte plasmid pSC701 sammen med Haell restriktionsenzym og 10 reaktionsblanding*, i stedet for plasmid pKC203 sammen med Bglll restriktionsenzym og reaktionblanding. Plasmid pSC701 indeholder mere end Haell-restriktionssted, således at Haell-fordøjelsen og den efterfølgende ligation resulterer i en blanding af forskellige plasmider.

15

Den resulterende ligerede blanding, som omfatter det ønskede hygromycin B-resistens-overførende ~4,2 kb plasmid pKC257 og det hygromycin B-, G418- og apramycin-resistens-overførende ~5,0 kb plasmid pKC259, blev anvendt til at 20 transformere E. coli K12 BE783 (deponeret og udgør en del af den permanente samling af stamkulturer hos the Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois under registreringsnummeret B-15020), i det væsentlige som for transformationsproceduren beskrevet i eksempel 25. De øns-25 kede transformanter blev udvalgt, spredt på TY-agar indeholdende 200 μg/ml antibiotisk hygromycin B og derefter dyrket separat ved anvendelse af konventionelle mikrobiologiske teknikker. Transformanterne indeholdende pKC257 blev let og konventionelt identificeret ved screening for 30 hygromycin B-resistens, og transformanterne indeholdende plasmid pKC259 blev identificeret ved screening for apra-mycin- og hygromycin B-resistens. Transformanterne, som her benævnes E. coli kl2 BE783/pKC257 og E. coli K12 BE783/pKC259 blev anvendt til isolation af henholdsvis DK 172716 B1 40 plasmid pKC257 og plasmid pKC259 i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1A. Tilstedeværelsen af de antibiotiske resistensgener i de respektive plasmi-der blev yderligere bekræftet ved efterfølgende transfor-5 mation, udvælgelse og restriktionsenzymanalyse. Et restriktions- og funktionsdiagram for hvert af plasmiderne PKC257 og pKC259 er vist på de medfølgende figurer 6 og 7.

* Reaktionsblanding (10X) til Haell restriktionsenzymet 10 blev fremstillet med følgende sammensætning: 60 mM Tris-HCl, pH 7,4 60 mM MgCl2 15 EKSEMPEL 27

Konstruktion af plasmid pKC261 og transformant E. coli K12 BE783/pKC261 20 Det ønskede plasmid blev fremstillet i det væsentlige som beskrevet i eksempel 25 med den undtagelse, at man anvendte plasmid pKC257 og Sau 3 AI restriktionsenzym og reaktionsblanding* i stedet for plasmid pSC701 og Bglll restriktionsenzym og reaktionsblanding. Det ønskede plasmid 25 pKC261 har en størrelse på omkring 3,21 kb og overfører resistens overfor hygromycin B.

Den resulterende ligerede blanding anvendes til at transformere E. coli K12 BE783 i det væsentlige som beskrevet i 30 eksempel 25. Transformanterne, som her benævnes E. coli K12 BE783/pKC261, udvælges og anvendes til at isolere plasmid pKC261 i overensstemmelse med proceduren beskrevet i eksempel 1A. Tilstedeværelsen af det antibiotiske hygromycin B-resistensgen i plasmidet pKC261 blev yderligere DK 172716 B1 41 bekræftet ved en efterfølgende transformation, udvælgelse og DNA-sekvensanalyse. Et restriktions- og funktionsdiagram for plasmidet pKC261 er vist på den medfølgende fig.

7.

5 * Reaktionsblanding (10X) til Sau 3AI restriktionsenzymet blev fremstillet med følgende sammensætning: 500 mM NaCl 10 60 mM Tris-HCl, pH 7,5 50 mM MgCl2 EKSEMPEL 28 15 Konstruktion af plasmid pKC275 og transformant E. coli K12 BE1041/PKC275 A. Partiel Haell-fordøjelse af plasmid pKC261 20 Omkring 5 μΐ (5 μg) plasmid pKC261 {isoleret i eksempel 27) i TE-puffer, 5 μΐ DTT, 5 μΐ (1000 mg/ml) BSA, 25 μΐ vand, 5 μΐ (5 enheder Haell restriktionsenzymer og 5 μΐ 10X reaktionsblanding blev inkuberet ved 37 °C i omkring 1 time. Efter afslutning af reaktionen ved inkubering ved 70 25 °C i 5 minutter blev reaktionsblandingen afkølet med is, ekstraheret med phenol og chloroform/isoamylalkohol (24:1) og endelig udfældet med ethanol. De resulterende HaeII-re-striktionsfragmenter blev opløst i 5 μΐ 5 mM NaCl.

DK 172716 B1 42 B. Isolation af ~394 plac fragment-holdiqe Hae II termini

Omkring 5 μΐ (5 μg) plasmid pUR222 (isoleret fra E. coli K12 BE1166/pUR222 i det væsentlige som beskrevet i eksem-5 pel 1) i TE-puffer blev Haell-fordøjet i det væsentlige som beskrevet i eksempel 28A med den undtagelse, at reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37 °C i omkring 2 timer med henblik på at sikre, at fordøjelsen var fuldstændig og ikke partiel. De resulterende Haell-restriktionsfragmenter 10 blev opløst i 5 μΐ 5 mM NaCl.

E. coli K12 BE1166/pUR222 er en stamme, der er deponeret som del af den permanente samling af stamkulturer hos Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois. Den-15 ne stamme er tilgængelig for offentligheden som en fore-trukken kilde for plasmid pUR222 under registreringsnummeret B-15023.

C. Ligation og transformation 20

Omkring 4 μΐ plasmid pKC261 og 4 μΐ plasmid pUR222 Haell restriktionsfragmenter (fremstillet i henholdsvis eksempel 28A og 28B), 31 μΐ vand, 5 μΐ ligationsblanding og 1 μΐ T4 DNA ligase (~105 New England Bio Lab Units) blev omsat ved 25 16 °C i omkring 16 timer. Efter at reaktionen var afsluttet ved inkubering ved 70 "C i 5 minutter, blev den resulterende ligerede blanding afkølet med is. Derpå blev DNA transformeret i E. coli K12 BE1041 (deponeret som del af den permanente samling af stamkulturer hos the Northern Regio-30 nal Research Laboratory, Peoria, Illinois under registreringsnummeret B-15021) i det væsentlige i overensstemmelse med transformationsproceduren beskrevet i eksempel 25. De DK 172716 B1 43 transformanter, som kun indeholdt det ønskede ~3,6 kb plasmid pKC275, blev betegnet E. coli K12 BE1041/pKC275.

En sådan transformant blev udvalgt, spredt, dyrket og anvendt til efterfølgende plasmid-isolationer. Både tilste-5 deværelsen af det ~394 nt plac-indeholdende fragment og den detaljerede struktur af plasmid pKC275 blev bestemt på konventionel måde ved gelelektrophorese og restriktionsenzymanalyse .

10 Eftersom plasmid pKC261 har tre Haell-restriktionssteder, resulterer en delvis Haell-fordøjelse i en blanding af forskellige Haell-fragmenter. Som en konsekvens heraf resulterer den ovennævnte illustrative procedure i en konstruktion af såvel plasmid pKC275 som de forskellige in-15 sertionsisomere af plasmid pKC275. Rekombinante plasmider med to orienteringer produceres ligeledes, eftersom det ~394 nt-plac-holdige fragment kan ligeres i begge retninger. Det vil være klart for fagmanden, at de forskelligt orienterede plasmid-isomere og også de resulterende trans-20 formanter let kan isoleres og identificeres på konventio nel måde. Et restriktions- og funktionsdiagram af plasmi-det pKC275 fremgår af den medfølgende fig. 8.

EKSEMPEL 29 25

Konstruktion plasmid pKC264 og transformant E. coli K12 BE783/PKC264 A. EcoRI-fordøjelse af plasmid pKC259 30

Den ønskede fordøjelse blev gennemført i det væsentlige som beskrevet i eksempel 28 med den undtagelse, at man anvendte plasmid pKC259 og EcoRI restriktionsenzym og reaktionsblanding* og ikke plasmid pUR222 og Haell restrik- DK 172716 B1 44 tionsenzym og reaktionsblanding. De resulterende EcoRI restriktionsfragmenter blev opløst i 5 μΐ 5 mM NaCl.

* Reaktionsblanding (10X) til EcoRI restriktionsenzym blev 5 fremstillet med følgende sammensætning: 500 mM NaCl 1000 mM Tris-HCl, pH 7,5 50 mM MgCl2 10

B. EcoRI-fordøjelse af plasmid Yep24 for efterfølgende at isolere 2 ug DNA

Plasmidet Yep24 blev isoleret fra E. coli K12 BE1139/YEp24 15 i det væsentlige som beskrevet i eksempel 1. E. coli K12 BE1139/YEp24 er en stamme, der er deponeret som del af den permanente samling af stamkulturer hos the Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois. Den er tilgængelig for offentligheden som en foretrukken kilde for 20 plasmidet under registreringsnummeret B-15022. Den ønskede EcoRI-fordøjelse af plasmidet Yep24 blev gennemført i det væsentlige som beskrevet i eksempel 29A, og de resulterende EcoRI-restriktionsfragmenter blev opløst i 5 μΐ 5 mM NaCl.

25 C. Ligation og transformation

De EcoRI-fordøjede plasmider pKC259 og Yep24 (fremstillet henholdsvis i eksempel 29A og eksempel 29B) blev ligeret 30 og derefter transformeret i E. coli K12 BE783, i det væsentlige som beskrevet i eksempel 28C. De transformanter, der kun indeholder det ønskede ~7,2 kb hygromycin B-, apramycin- og G418-resistens-overførende plasmid, betegnes DK 172716 B1 45 E. coli K12 BE783/pKC264. En sådan transformant blev udvalgt på konventionel måde, spredt, dyrket og anvendt til efterfølgende plasmid-isolationer.

5 Det vil være klart for fagmanden, at 2 μ DNA'et kan ligeres i begge retninger, og at der ved den ovennævnte procedure derfor dannes både plasmid pKC264 og plasmider med omvendt orientering. De forskellige plasmider og resulterende transformanter kan let isoleres og identificeres på 10 konventionel måde. Et restriktions- og funktionsdiagram af plasmidet pKC264 fremgår af fig. 8.

EKSEMPEL 30 15 Konstruktion af plasmiderne pLQ314 og pLQ315 og transformanterne E. coli K12 BE783/pL0314 og E. coli K12 BE783/PL0315 A. Bqlll-fordøjelse af plasmid pKC259 20

Den ønskede fordøjelse gennemføres i det væsentlige som beskrevet i eksempel 28B med den undtagelse, at man anvender plasmid pKC259 og Bglll restriktionsenzym og reaktionsblanding i stedet for plasmid pUR222 og Haell re-25 striktionsenzym og reaktionsblanding. Det resulterende Bglll-fordøjelsesprodukt opløses i 5 mM NaCl.

B. Bqlll-fordøjelse af plasmid pSV5 gpt 30 Den ønskede fordøjelse blev gennemført i det væsentlige som beskrevet i eksempel 28B med den undtagelse, at man anvendte plasmid pSV5 gpt og Bglll restriktionsenzym og reaktionsblanding i stedet for plasmid pUR222 og Haell re- DK 172716 B1 46 striktionsenzym og reaktionsblanding. Det resulterende Bglll-fordøjelsesprodukt opløses i NaCl.

C. Ligation og transformation 5

Den ønskede ligation gennemføres i det væsentlige som beskrevet i eksempel 28C med den undtagelse, at man anvender Bglll-fordøjede plasmider pKC259 og pSV5 gpt i stedet for plasmiderne pKC261 og pUR222. Den resulterende ligerede 10 blanding anvendes til at transformere E. coli K12 BE783, i det væsentlige i overensstemmelse med transformationsproceduren beskrevet af Wensink, 1974, på TY-plader indeholdende 200 pg/ml antibiotiket hygromycin B. Som vist ved konventionel gelelektrophorese (Rao og Rogers, 1978) og 15 ved andre forsøg indeholder nogle af transformanterne kun det ønskede plasmid pL0314 eller det ønskede plasmid pL0315. Sådanne transformanter udvælges, udspredes og dyrkes og udgør de ønskede transformanter E. coli K12 BE783/pL0314 og E. coli K12 BE783/pL0315. Disse transfor-20 manter anvendes til efterfølgende isolation af de ønskede plasmider pL0314 og pL0315.

Der opstår rekombinante plasmider med to orienteringer, fordi DNA-fragmenterne er ligeret i begge retninger. Fag-25 manden vil forstå, at de ønskede plasmider let kan skelnes fra hinanden og identificeres ved konventionel teknik, dvs. ved restriktionsenzymanalyse og elektrophorese. Et restriktions- og funktionsdiagram af hvert af plasmiderne pL0314 og pL0315 er vist på den medfølgende fig. 9.

30

Konstruktion af muse-Ltk~/pLQ314 EKSEMPEL 31 DK 172716 B1 47 5 Den ønskede konstruktion fremstilles i det væsentlige som beskrevet i eksempel 4 med den undtagelse, at man anvender plasmid pL0314 i stedet for plasmid pKC214. De således konstruerede muse-Ltk“/pL0314-transformanter dyrkes derefter i massekultur.

10 EKSEMPEL 32

Konstruktion af muse-Ltk~/pLQ315 15 Den ønskede konstruktion fremstillet i det væsentlige som beskrevet i eksempel 4 med den undtagelse, at man anvender plasmid pL0315 i stedet for plasmid pKC214. De således konstruerede muse-Ltk'/pL0315-transformanter dyrkes derefter i massekultur.

20 EKSEMPEL 33

Konstruktion af pL0316 og pL0317 og transformanterne E. coli K12 BE783/pL0316 og E. coli K12 BE783/pLQ317 25 A. Sacl-fordøjelse af plasmid pKC257 og addition af Bglll-linkere

Den ønskede fordøjelse gennemføres i det væsentlige som 30 beskrevet i eksempel 28B med den undtagelse, at man anvender plasmid pKC257 og SacI restriktionsenzym og reaktionsblanding* i stedet for plasmid pUR222 og Haell restriktionsenzym og reaktionsblanding.

5 DK 172716 B1 48

Additionen af Bglll-linkere** til de SacI-fordøjede plasmid pKC257 termini gennemføres i det væsentlige som beskrevet af St. John et al., 1981, J. Mol. Biol. 152:317.

* Reaktionsblanding (10X) til Sad restriktionsenzym fremstilles med følgende sammensætning: 600 mM NaCl 10 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 100 mM MgCl2 ** Bglll [(d(CAGATCTG)] og andre linkere kan fås fra: 15 Collaborative Research Inc.

1365 Main Street Waltham, MA 02154 B. Ligation og tranformation 20

Det lineære plasmid pKC257 med Bglll-termini ligeres til det BglII-fordøjede plasmid pSVS gpt (fremstillet i eksempel 30B) i det væsentlige som angivet i eksempel 30C. Den ligerede blanding anvendes til at transformere E. coli K12 25 BE783 ved en metode, der ligeledes er omtalt i eksempel 30C. De resulterende E. coli K12 BE783/pL0316 og E. coli K12 BE783/pL0317 transformanter anvendes til isolation af de ønskede plasmider pL0316 og pL0317. Som forklaret i eksempel 30C dannes der plasmider med to forskellige orien-30 teringer i afhængighed af orienteringen af det indførte resistens-overførende fragment. Plasraiderne og de resulterende transformanter kan let skelnes fra hinanden og identificeres på velkendt måde. Et restriktions- og funktions- DK 172716 B1 49 diagram for hvert af plasmiderne pL0316 og pL0317 fremgår af den medfølgende fig. 9.

EKSEMPEL 34 5

Konstruktion af muse-Ltk~/pL0316 og muse-Ltk~/pL0317

De ønskede konstruktioner fremstilles hver for sig i det væsentlige som beskrevet i eksempel 4 med den undtagelse, 10 at man anvender et af plasmiderne pL0316 og pL0317 i stedet for plasmidet pKC214. De således konstruerede muse-Ltk~/pL0316 og muse-Ltk~/pL0317 transformanter dyrkes derefter hver for sig i massekultur.

15 EKSEMPEL 35

Konstruktion af plasmiderne pL0318 og pL0319 og transformanterne E. coli K12 BE783/pL0318 og E. coli K12 BE783/pL0319 20

De ønskede konstruktioner fremstilles i det væsentlige som beskrevet i eksempel 33 med den undtagelse, at man anvender plasmidet pKC261 i stedet for plasmidet pKC257. De resulterende E. coli K12 BE783/pL0318 og E. coli K12 25 BE783/pL0319 transformanter anvendes til isolation af de ønskede plasmider pL0318 og pL0319. Som forklaret i eksempel 30C dannes der plasmider med to forskellige orienteringer i afhængighed af orienteringen af det indførte resistens-overførende fragment. Plasmiderne og de resulte-30 rende transformanter kan let skelnes fra hinanden og identificeres på kendt måde. Et restriktions- og funktionsdiagram for hvert af plasmiderne pL0318 og pL0319 fremgår af den medfølgende fig. 9.

EKSEMPEL 36

Konstruktion af muse-Ltk~/pLQ318 og muse-Ltk~/pLQ319 50 DK 172716 B1 5 De ønskede konstruktioner foretages hver for sig i det væsentlige i overensstemmelse med det i eksempel 4 beskrevne med den undtagelse, at man anvender et af plasmiderne pL0318 eller pL0319 i stedet for plasmid pKC214. De således konstruerede muse-Ltk“/pL0318 og muse-Ltk*VpL0319-10 transformanter dyrkes derefter separat i massekultur.

EKSEMPEL 37

Konstruktion af plasmiderne pLQ320 og pL0321 og transfor-15 manterne E. coli K12 BE1041/pLQ320 og E. coli K12 BE104l/pL0321

De ønskede konstruktioner foretages i det væsentlige som beskrevet i eksempel 33 med den undtagelse, at man anven-20 der plasmid pKC275 i stedet for plasmid pKC257. De resulterende E. coli K12 BE1041/pL0320 og E. coli K12 BE1041/pLO321 transformanter anvendes til isolation af de ønskede plasmider pL0320 og pL0321. Som forklaret i eksempel 30C opnår man plasmider med to forskellige orienterin-25 ger i afhængighed af orienteringen af det indførte re sistens-overførende fragment. Plasmiderne og de resterende transformanter kan let skelnes fra hinanden og identificeres på kendt måde. Et restriktions- og funktionsdiagram for hvert af plasmiderne pLO320 og pL0321 fremgår af den 30 medfølgende fig. 9.

Konstruktioner af muse-Ltk~/pLQ320 og muse-Ltk~/pL0321 DK 172716 B1 EKSEMPEL 38 51 5 De ønskede konstruktioner fremstilles separat i det væsentlige som beskrevet i eksempel 4 med den undtagelse, at man anvender et af plasmiderne pLO320 og pL0321 i stedet for plasmid pKC214. De således konstruerede muse-Ltk"/pLO320 og muse-Ltk~/pL0321 transformanter dyrkes 10 derefter separat i massekultur.

EKSEMPEL 39

Konstruktion af plasmid pKC273 og transformant E. coli K12 15 BE783/PKC273 A. Konstruktion af et 2 μ og ura+ gen-indeholdende lineært DNA med BamHI og Sall termini 20 Omkring 5 μΐ (5 pg) plasmid pYEp24 i TE-puffer, 5 μΐ DTT, 5 μΐ (1000 mg/ml) BSA, 25 μΐ vand, 5 μΐ (5 enheder) BamHI restriktionsenzym og 5 μΐ 10X reaktionsblanding* blev inkuberet ved 37 °C i 1 time og derefter ved 70 °C i 5 minutter. Det BamHI-fordøjede DNA blev afkølet med is, udfældet 25 med ethanol og derefter opløst i 30 μΐ vand, hvortil der sattes 5 μΐ 10X Sall puffer (reaktionsblanding*) og 5 μΐ (5 enheder) Sall restriktionsenzym. Den resulterende blanding blev inkuberet ved 37 °C i 1 time og derefter ved 70 °C i 5 minutter, hvorefter den blev afkølet til 4 °C. Derpå 30 blev blandingen ekstraheret med phenol og chloro-form/isoamylalkohol (24:1) og endelig udfældet med ethanol. Det resulterende bundfald indeholdt det ønskede line- DK 172716 B1 52 ære DNA og blev opløst i 5 μΐ 5 mM NaCl og opbevaret ved 4 °C til senere brug.

* Reaktionsblanding (10X) for BamHI restriktionsenzymer 5 fremstilledes med følgende sammensætning: 1500 mM NaCl 60 mM Tris-HCl, pH 7,9 60 mM MgCl2 10 B. Konstruktion af et hyqromycin B-resistensgen-indehol-dende lineært DNA med BamHI og Sall termini

Det ønskede lineære DNA blev konstrueret i det væsentlige 15 som beskrevet i eksempel 39A med den undtagelse, at der anvendtes plasmid pKC259 i stedet for plasmid Yep24. Det resulterende bundfald indeholdt det ønskede lineære DNA og blev opløst i 5 μΐ 5 mM NaCl og opbevaret ved 4 °C til senere brug.

20 C. Ligation og transformation

Den ønskede ligation og transformation i E. coli K12 BE783 blev gennemført i det væsentlige som beskrevet i eksempel 25 28C med den undtagelse, at DNA-fragmenterne fremstillet i eksemplerne 39A og 39B blev ligeret og anvendt i efterfølgende transformationer i stedet for HaeII-fragmenterne af plasmiderne pUR222 og pKC261. Som det almindeligt ses ved selektion, gelelektrophorese (Rao og Rogers, 1978) og an-30 dre forsøg, indeholdt nogle af de resulterende transfor-manter det ønskede plasmid. En sådan transformant, der betegnes E. coli K12 BE783/pKC273, blev udvalgt, spredt, dyrket og anvendt til efterfølgende isolation af plasmid DK 172716 B1 53 pKC273. Et restriktions- og funktionsdiagram for plasmidet pKC273 er vist på den medfølgende fig. 10.

EKSEMPEL 40 5

Konstruktion af Saccharomyces cerevisiae/pKC273 Gær (Saccharomyces cerevisiae) blev dyrket i 1% gæreks-trakt/2% bacto-pepton/1% glucose under anvendelse af kon-10 ventionelle og velkendte mikrobiologiske procedurer. Transformationen af plasmid pKC273 i gær blev gennemført i det væsentlige som beskrevet af Hinnen et al., 1978, Proc.

Nat. Acad. Sci. USA 75:1929. Transformanterne blev udvalgt på grundlag af deres evne til at vokse på minimale medier 15 uden uracil (Ura+-phenotype). Ura+-transformanterne blev derefter afprøvet for deres evne til at vokse på komplekse medier tilsat 200 pg/ml hygromycin B. En sådan dosis er dødelig for ikke-transformerede celler. Saccharomyces ce-revisiae/pKC273 transformante celler vokser på disse medi-20 er, men ikke-transformeret Saccharomyces cerevisiae dræbes .

EKSEMPEL 41 25 Konstruktion af plasmid pL0378 og transformant E. coli K12 BE783/pL0378 A. Pstl-fordøjelse af plasmid pBR322 30 Den ønskede fordøjelse gennemføres i det væsentlige som beskrevet i eksempel 28B med den undtagelse, at man anvender plasmid pBR322 og PstI restriktionsenzym og reaktionsblanding* i stedet for plasmid pUR222 og Haell restrikti- DK 172716 B1 54 tionsenzym og reaktionsblanding. Det resulterende Pstl-fordøj elsesprodukt opløses i 5 μΐ 5 mM NaCl.

* Reaktionsblanding (10X) til PstI restriktionsenzym blev 5 fremstillet med følgende sammensætning: 500 mM NaCl 60 mM Tris-HCl, pH 7,4 60 mM MgCl2 10 B. Pstl-fordøjelse af plasmid pKC264

Den ønskede fordøjelse blev gennemført i det væsentlige som beskrevet i eksempel 41 A med den undtagelse, at man 15 anvendte plasmid pKC264 i stedet for plasmid pBR322. Det resulterende Pstl-fordøjelsesprodukt blev opløst i 5 μΐ 5 mM NaCl.

C. Ligation og transformation 20

Den ønskede ligation og transformation i E. coli K12 BR783 gennemføres i det væsentlige som beskrevet i eksempel 28C, idet de i eksemplerne 41A og 41B fremstillede DNA-fragmen-ter ligeres og anvendes i efterfølgende transformationer i 25 stedet for Haell-fragmenter af plasmiderne pUR222 og pKC261. Som det almindeligt ses ved antibiotisk selektion, gelelektrophorese (Rao og Rogers, 1978) og andre forsøg, indeholder nogle af transformanterne det ønskede plasmid.

En sådan transformant, der betegnes E. coli K12 30 BE783/pL0378, udvælges, spredes, dyrkes og anvendes til efterfølgende isolation af plasmid pL0378.

Som forklaret i eksempel 30c opnås plasmider med to forskellige orienteringer i afhængighed af orienteringen af DK 172716 B1 55 det indførte resistens-overførende fragment. Foruden at danne plasmid pL0378 vil den ovenfor beskrevne procedure derfor føre til dannelse af plasmider med den omvendte orientering. Fagmanden vil let kunne skelne og identifice-5 re disse plasmider og resulterende transformanter ved kendte metoder. Et restriktions- og funktionsdiagram af plasmidet pL0378 er vist på den medfølgende fig. 10.

EKSEMPEL 42 10

Konstruktion af Saccharomyces cerevisiae/pL0378

Den ønskede transformation gennemføres i det væsentlige som beskrevet i eksempel 40 med den undtagelse, at der an-15 vendes det G418-resistensgen-holdige plasmid pL0378 i stedet for plasmid pKC273. Transformanterne identificeres ved en konventionel screening af modtager-gærcellerne for tilstedeværelse af plasmid-DNA. De ønskede Saccharomyces ce-revisiae/pL0378 transformanter kan således let identifice-20 res og isoleres.

Claims (26)

1. Plasmid pKC222, der indeholder ~2,75 kb Sall/BgIII re-5 striktionsfragmentet af plasmid pKC203 opnået fra E. coli JR225 ATCC 31912 ligeret til Sall/BgIII restriktionsfragmentet af plasmid pKC7, og som giver resistens overfor antibiotika ampicillin, hygromycin B og G418, når det transformeres i en E. coli celle. 10

2. Rekombinant DNA kloningsvektor, der omfatter en euka-ryot promotor, plasmid pBR322 replikonen og a) ~7,5 kb Bglll restriktionsfragmentet af plasmid pKC203, 15 der giver resistens overfor antibiotiket hygromycin B og G418, eller b) ~2,75 kb Sall/BgIII restriktionsfragmentet af plasmid PKC203 eller plasmid pKC222, der giver resistens over- 20 for antibiotiket hygromycin B og G418, eller c) ~1,51 kb Bglll/SacI restriktionsfragmentet af plasmid pKC222, der giver resistens overfor antibiotika hygromycin B, eller 25 d) ~1,65 kb EcoRI/Sall restriktionsfragmentet af plasmid pKC222, der giver resistens overfor antibiotika G418, eller 30 e) en DNA sekvens afledt af ~7,5 kb restriktionsfragmentet, der giver resistens overfor den ene eller begge antibiotika hygromycin B og G418; DK 172716 B1 idet resistensen overfor antibiotika hygromycin B og/eller G418 opnås, når vektoren transformeres i en værtscelle, der er følsom for den ene eller begge antibiotika, idet værtscellen er modtagelig for transformation, celledeling 5 og dyrkning; med de begrænsninger at promotoren kan virke i muse- eller gærceller, at de antibiotika-resistensfremkaldende restriktionsfragmenter støder op til, og, i en eukaryotisk værtscelle’ transskriberet fra promotoren, og at DNA-sekvenserne, der giver resistens mod antibiotiket 10 G418, ikke koder for enzymet phosphotransferase.

3. Vektor ifølge krav 2 som er et plasmid.

4. Vektor ifølge krav 3 hvori den eukaryote promotor er 15 den tidlige SV40 promotor af plasmid pSV5 gpt.

5. Vektor ifølge krav 4 der er en konstruktion af ~7,5 kb Bglll restriktionsfragmentet af plasmid pKC203 og Bglll nedbrydningen af plasmid pSV5 gpt, hvilket er plasmid 20 pKC214 med restriktionskortet vist i fig. 3 eller dets in-sertionale isomere plasmid pKC215, der har restriktionskortet vist i fig. 4.

6. Vektor ifølge krav 4 der er en konstruktion af ~1,51 kb 25 Sacl/Bglll restriktionsfragmentet af plasmid pKC222 udstyret med en Bglll linker ved SacI terminus og Bglll nedbrydningen af plasmid pSV5 gpt, hvilket er plasmid pGDIO, hvori det subterminale Aval restriktionssted af pKC222 fragmentet er nærmest Hindlll restriktionsstedet af gpt 30 genet, eller dets insertionale isomere plasmid pGDll, hvori orienteringen af pKC222 fragmentet er omvendt.

7. Vektor ifølge krav 4 der er en konstruktion af ~1,65 kb EcoRI/Sall restriktionsfragmentet af plasmid pKC222 udsty- DK 172716 B1 ret med Bglll linkere ved hver terminus og Bglll nedbrydningen af plasmid pSV5 gpt, hvilket er plasmid pGD12, hvori det subterminale PstI restriktionssted af pKC222 fragmentet er nærmest Hindlll restriktionsstedet af gpt 5 genet, eller dets insertionale isomere plasmid pGD13, hvori orienteringen af pKC222 fragmentet er omvendt.

8. Vektor ifølge krav 4 der er en konstruktion af ~2,75 kb Sall/BgIII restriktionsfragmentet af plasmid pKC203 udsty- 10 ret med Bglll linkere ved hver terminus og Bglll nedbrydningen af plasmid pSV5 gpt, hvilket er plasmid pGD14, i hvilket det subterminale Aval restriktionssted af pKC203 fragmentet er nærmest Hindlll restriktionsstedet af gpt genet, eller det insertionale isomere plasmid pGD15, hvori 15 orienteringen af pKC203 fragmentet er omvendt.

9. Vektor ifølge krav der er plasmid pL0314 med restrik tionskortet angivet i fig. 9(3) eller dets insertionale isomere plasmid pL0315 med restriktionskortet angivet i 20 fig. 9(7).

10. Vektor ifølge krav 4 der er plasmid pL0316 med re striktionskortet angivet i fig. 9(4) eller dets insertionale isomere plasmid pL0317 med restriktionskortet angivet 25. fig. 9(8).

11. Vektor ifølge krav 4 der er plasmid pL0318 med re striktionskortet angivet i fig. 9(2) eller dets insertionale isomere plasmid pL0319 med restriktionskortet angivet 30. fig. 9(6). 1 Vektor ifølge krav 4 der er plasmid pLO320 med re striktionskortet angivet i fig. 9(1) eller dets insertio- DK 172716 B1 nåle isomere plasmid pL0321 med restriktionskortet angivet i fig. 9(5).

13. Vektor ifølge krav 3 hvori den eukaryotiske promotor 5 er ura+ promotoren af plasmid Yep24.

14. Vektor ifølge krav 13 hvori plasmidet pKC273 har restriktionskortet angivet i fig. 10.

15. Vektor ifølge krav 13 hvori plasmidet pL0378 har re striktionskortet angivet i fig. 10.

16. E. coli værtscelle transformeret med den rekombinante DNA kloningsvektor ifølge et vilkårligt af kravene 1-15. 15

17. Værtscelle ifølge krav 16 der er en E. coli K12 eller E. coli Kl2 BE783, 827 eller 1041 celle.

18. Museværtscelle transformeret med den rekombinante klo-20 ningsvektor ifølge et vilkårligt af kravene 1-12.

19. Værtscelle ifølge krav 18 der er en muse-Ltk- celle.

20. Gærcelle transformeret med den rekombinant DNA vektor 25 ifølge et vilkårligt af kravene 1, 2 eller 13-15.

21. Værtscelle ifølge krav 20 der er en Saccharomyces ce-revisiae celle.

22. Plasmid pSC701 opnået ved selvligation af ~7,3 kb Bglll restriktionsfragmentet af plasmid pKC203 (ATCC 31912) og med restriktionskortet angivet i fig. 6. DK 172716 B1

23. Plasmid pKC257 opnået ved inkubation af plasmid pSC701 med Haell restriktionsenzym, selvligering af den fremstillede blanding af restriktionsfragmenter, transformering af en E. coli K12 stamme med den ligerede blanding og afsøg- 5 ning af transformanterne for hygromycin B resistens; og med molekylvægten og restriktionskortet angivet i fig. 6.

24. Plasmid pKC259 opnået ved at inkubere plasmid pSC701 med Haell restriktionsenzym, selvligering af den fremstil- 10 lede blanding af restriktionsfragmenter, transformering af en E. coli K12 stamme med den ligerede blanding og afsøgning af transformanterne for Ampicillin og hygromycin B resistens; og molekylvægten og restriktionskortet angivet i fig. 7. 15

25. Plasmid pKC261 fremstillet ved selvligering af -3,2 kb Sau3Al restriktionsfragmentet af plasmid pKC257 og med restriktionskortet angivet i fig. 7.

26. Plasmid pKC275 fremstillet ved ligering af det -396 base plac holdige Haell restriktionsfragment af plasmid pUR222, der kan fås fra E. coli K12 BE1166 NRRL B-15023 og en blanding af Haell restriktionsfragmenter af plasmid pKC261, transformering af en E. coli K12 stamme med den 25 ligerede blanding og selektering af transformanter, der indeholder et -3,6 kb plasmid; og med restriktionskortet angivet i fig. 8.

27. Plasmid pKC264 fremstillet ved ligering af 2 μ EcoRI 30 restriktionsfragmentet af plasmid Yep24 som opnåeligt E. coli K12 BE1139 NRRL B-15022 og en blanding af EcoRI restriktionsfragmenter af plasmid pKC259, transformering af en E. coli K12 stamme med den ligerede blanding og selek- DK 172716 B1 tering af transformanter indeholdende et ~7,2 kb hygromy-cin B, apramycin og G418 resistenstildelende plasmid; og med restriktionskortet angivet i fig. 8. 5 28. ~7,5 kb Bglll restriktionsfragmentet af plasmid pKC203 til brug som udgangsmateriale ved fremstilling af vektoren ifølge krav 2. 29. ~2,75 kb Sal/BgIII restriktionsfragmentet af plasmid 10 pKC203 til brug som udgangsmateriale ved fremstilling af vektoren ifølge krav 2. 30. ~1,51 kb Sacl/BgIII restriktions fragmentet af plasmid pKC222 til brug som udgangsmateriale ved fremstilling af 15 vektoren ifølge krav 2. 31. ~1,65 kb EcoRI/Sall restriktionsfragmentet af plasmid pKC222 til brug som udgangsmateriale ved fremstilling af vektoren ifølge krav 2. 20