HU195248B - Process for producing recombinant deoxy-ribonucleinic acidcloning vectors determining resistance against hygromycin b and 6418 antibiotica and their eucariote and procariote transformants - Google Patents

Description

-1195248

I 1

I A találmány tárgya eljárás eukariota és

I prokariota sejtekben kifejeződő higromicin BI vei és G418 antibiotikummal szembeni reziszI tenciát biztosító, új rekombináns dezoxi-ribo| nukleinsav klónozó vektorok előállítására. A ι találmány tárgya továbbá a fenti vektorok ! transzformánsainak előállítása.

i A találmány szerinti eljárás különösen f fontos, mivel alkalmazásával megoldhatjuk | a klónozott dezoxi-ribonukleinsav-szekvencíák j azonosítását, az azokkal való tevékenységet

I és stabilizálást, abban az esetben is, ha eukaj riota és prokariota sejtekben nem rendelkezJ nek szelektálható funkcióval. Ezideig az euj kariota sejtekben kivitelezett rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológia fejlődése és lehetőségeinek kihasználása lassú volt és nehéz, a következő okok miatt:

1) Olyan megfelelő klónozó vektorok hiánya, amelyek eukariota sejtekben szelektálható markereket tartalmaznak;

2) az adott dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat eukariota sejtekben nem voltunk képesek gyorsan sokszorosítani; végül

I 3) az eukariota sejttenyészetekben lévő sejl tek lassú generációs ideje, í Ügy találtuk, hogy a fenti nehézségeket egy olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav <^! klónozó vektorral megoldhatjuk, amely tarI talmaz:

| a) egy eukariota promotert, j b) egy vagy két különböző strukturgént, és az ezzel összefüggő szabályozó szekveni ciát, ezek biztosítják a higromicin B és a

G418 antibiotikumok egyikével vagy mind1 kettővel szembeni rezisztenciát olyan gazfi dasejtbe transzformálva, amely az egyik » vagy mindkét antibiotikummal szemben f érzékeny; ez a gazdasejt képes transzI formálódni, osztódni és tenyésztődni;

! c) egy prokariota replikont, amely funkcionális az adott prokariota gazdasejtben, azzal | a feltétellel, hogy az egyik vagy mind| két strukturgén és a hozzá kapcsolódó kontroll (szabályozó) szekvencia szomszé; dós egymással, továbbá, amely eukariota ' gazdasejtben az eukariota promoterről í íródik át, és egy egyedülálló gén és a hozzákapcsolódó szabályozó szekvencia a higromicin B és a G418 antibiotikumok ^! közül az egyikkel, de nem mindkettővel szembeni rezisztenciát biztosít, és a G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó szakaszt hordozó gén nem határozza meg a foszfo-transzferáz enzimet;

i az adott vektor funkcionál és szelektálható ΐ mind eukariota, mind pedig prokariota sejj tekben. Ebből következik, hogy a fent ismertetett, sokoldalú vektorokba klónozott dezoxiI -ribonukleinsav-szekvenciák hagyományos móSdon kezelhetők és sokszorosíthatók prokariota sejtekben, ezzel elkerüljük az eukariota sejtekkel való kényelmetlen és nehézségekkel teli munkát. Ezenfelül, mivel a találmány 1 szerinti vektorok funkcionálnak és szelektálI 2 hatók eukariota sejtekben is, ezek a velük kivitelezett kísérletek és sokszorosításuk után közvetlenül eukariota gazdasejtekbe transzformálhatok, anélkül, hogy tovább modósí5 tanánk azokat. Ez nem csupán előnyös, de jelentős előrehaladást jelent a génsebészeti technikában.

A dezoxi-ribonukleinsav klónozása eukariota gazdasejtekbe és a tarnszformánsok ¹⁰ könnyű szelektálhatósága fontos feltétele a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológia további fejlődéséhez. Mivel a transzformáció, és ennek következményeképpen a plazmid dezoxi-ribonukleinsav létrejötte igen ala15 csony frekvenciával végbemenő esemény, gyakorlatilag szükséges egy olyan funkcionális vizsgálat, amely lehetővé teszi a sejtek milliói közül annak a sejtnek (sejteknek) a kiválasztását, amely félvette a plazmid dezoxi-ribo²θ nukleinsavat. Ez fontos, mivel a nem szelektálható dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák beépülhetnek a vektorokba, és így egy adott antibiotikum rezisztencia gént anaktiválhatnak. így transzformációkor azok a sejtek, amelyek tartalmazzák a vektort, és az adott, számunkra érdekes dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, a megfelelő antibiotikumon izolálhatunk. A találmány szerinti vektorok különösen előnyösek, mivel igen nagymértékben változékonyak, és ezenkívül transzformálhatok és szelektálhatok higromicin B-re és G418 antibiotikumra érzékeny eukariota és prokariota sejtekben, ha azok képesek osztódni és felvenni a dezoxi-ribonukleinsavat. Ez azért fontos, mivel napjainkban a legtöbb rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikában eukariota polipeptideket állítunk elő, például proinzulint, inzulin A láncot, inzulin B láncot, humán növekedési hormont, marha növekedési hormont, interferont, szomatosztatint, thimozin alfa 1-et és hasonló vegyületeket, mégpedig prokariota gazdasejtekben. A prokariota sejtek nem képesek cukormolekulákat hozzáépíteni az eukariota eredetű polipeptidekhez.

így ^a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikákkal transzlációt követően módosult eukariota polipeptideket, mint például a glikolizált polipeptideket, eukariota gazdasejt és megfelelő eukariota rekombináns dezoxi-ri50 bonukleinsav kiónozó vektorok nélkül nem tudunk előállítani.

A találmány szerinti vektorok megfelelnek a fenti igényeknek, és szélesítik a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiá55 ból adódó lehetőségek körét. így fokozódik a lehetősége mind a nem módosított, mind pedig a transzlációs események után módosult proteinek eukariota sejtekben való előállításának lehetősége.

θθ Az alábbiakban a következő kifejezéseket használjuk:

strukturgén: polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav -szekvencia θ₅ szabályozóelem: olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia, amely irá-2195248 nyitja és szabályozza egy sírukturgén átírását (transzkripció) és kifejeződését eukariota promoter: olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia, amely részben elősegíti és szabályozza egy strukturgén kijeződését egy eukariota sejtben prokariota replikon: olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia, amely szabályozza és kontrollálja a dezoxi-ribonukleinsav replikalódását egy prokariota sejtben rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor: bármilyen anyag, közte, de nem csupán, plazmidok, bakteriofágok és vírusok, amelyek dezoxi-ribonukleinsav molekulákból állnak, amihez viszont egy vagy több további dezoxi-ribonukleinsav szegmens kapcsolható vagy kapcsolódott transzformáció: dezoxi-ribonukleinsav bejuttatása egy érzékeny gazdasejtbe, ez a molekula megváltoztatja a genotípust, és így stabil és öröklődő változást okoz a felvevő sejtben inszerciós izomer: annak a két vagy több lehetséges rekombináns dezoxi-ribonukleinsav molekulának az egyike, amely akkor keletkezik, ha egy dezoxi-ribonukleinsav fragmenst beépítünk a recipiens dezoxi-ribonukleinsav két vagy több, erre alkalmas helyének egyikébe.

A találmány szerinti vektorok előállítására úgy járunk el, hogy egy vagy két, különböző strukturgént és az ehhez kapcsolódó szabályozó szekvenciát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-molekulát állítunk elő; a gén és a szabályozó szakasz a higromicin B és a G418 antibiotikumok egyikével vagy mindkettővel szembeni rezisztenciát határoz meg. Az eljárás során a pKC203 jelű plazmidot

BglII restrikciós enzimmel kezeljük, és izoláljuk a két fenti antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó 7,5 kb nagyságú, BglII restrikciós fragmenst, vagy a pKC203 vagy pKC222-jelü plazmidot BglII és Sáli restrikciós enzimmel kezeljük, és izoláljuk a két antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó 2,75 kb. nagyságú Sall/BglII restrikciós fragmenst, vagy a pKC222-jelű plazmidot BglII és SacI restrikciós enzimmel kezeljük, és izoláljuk a higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát hordozó 1,51 kb SacI/ /BglII restrikciós fragmenst, vagy a pKC222-jelű plazmidot Sáli és EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük, és izoláljuk a G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát hordozó 1,65 kb nagyságú EcoRI/Sall restrikciós fragmenst.

A fenti módon kapott dezoxi-ribönukleinsav-szekvenciát eukariota promotert és adott esetben prokariota replikont tartalmazó második dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciához ligáljuk (kapcsoljuk). A ligációt követően kapott dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát plazmid előállítására zárjuk, ez egy gazdasejlbe transzformálva, és a transzformált sejtet higromicin B vagy G418 antibiotikum jelenlétében tenyésztve és a túlélő sejteket szelektálva stabilizálható és fenntartható.

A találmány szerinti eljárás során, ahogy azt példákkal bemutatjuk, higromicin B és G418 amino-glükozid antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát biztosító bakteriális plazmid dezoxi-ribonukleinsavat használunk fel olyan új plazmidok előállítására, amelyek higromicin B vagy G4I8 antibiotikumokra szenzitív (érzékeny) eukariota és prokariota gazdasejtekben kifejezik a rezisztenciát. így a találmány szerinti eljárás felhasználható gyakorlatilag bármilyen sejt dezoxi-ribonuklelnsavval való klónozására. Ezenfelül, a találmány szerinti vektorok azon képessége, hogy mind eukariota, mind pedig prokariota sejtekre toxikus antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát fejeznek ki, lehetővé teszi számunkra, olyan funkcionális vizsgálatok elvégzését, amelyek során szelektáljuk és stabilizáljuk a fenti vektorokat hordozó sejteket.

Az alábbi, szemléltető jellegű kísérlet során olyan bakteriális plazmid dezoxi ribonukleinsavat használunk, amely 7,5 kb nagyságú, és a BglII restrikciós enzimmel való kezeléssel kapjuk a pKC203 plazmidból. A pKC203 plazmid körülbelül 15 kb nagyságú, és ismert módon könnyen izolálható az E. coli JR225 sejtekből. Az E. coli JR225 törzs ismert az irodalomból (Davies és O’Connor, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 14, 69,

1978), a törzset megtaláljuk az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland törzsgyűjteményében. A törzsgyűjteményből a törzs ATCC 31912 sorszámon megrendelhető. A pKC203 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 1. ábrán mutatjuk be. Az E, és a következő ábrák sem mértékarányosak.

A pKC203 7,5 kb nagyságú BglII restrikciós íragmense tartalmazza a higromicin B és a G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztencia kifejezésére szükséges strukturgéneket és szabályozó elemeket. Ezt a fragmenst a pSV5 gpt plazmidba ligáljuk (ez a plazmid és előállítása ismert, lásd MuIIigan és Berg, Science, 209, 1422, 1980). A pSV5 gpt plaz3

-3195248 mid 9,3 kb nagyságú, és tartalmazza a replikációs origint, és a pBR322 plazmid ampicillin-rezisztencia markerét; tartalmazza továbbá a funkcionális SV40 korai promotert, amely a xantin-guanin-foszfo-ribozil-transz- 5 feráz (gpt) meghatározó gén tarnszkripcióját kontrollálja. A pSV5 gpt plazmid restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt

2. ábrán mutatjuk be. Ahogy az a szakember számára világos, a pSV5 gpt plazmid mind E. coliban, mind pedig eukariota sejtekben, például emlős sejtekben képes replikálódni.

A pSV5 gpt plazmid BglII restrikciós helye lehetővé teszi a pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú BglII restrikciós íragmenssel való köz- 15 vetlen ligációt. így a higromicin B és G418 rezisztenciát meghatározó 7,5 kb nagyságú fragmens beépíthető a pSV5 gpt plazmidba, ha azt BglII enzimmel kezeljük. A 7,5 kb nagyságú fragmens mindkét lehetséges őrien- 20 tációja azonos valószínűséggel következik be, így,· ha a 7,5 kb nagyságú fragmenst beépítjük a pSV5 gpt-be, kétféle píazmidot kapunk, ezeket pKC2l4 és pKC2l5 jellel jelöljük. A pKC2l4 és a pKC215 plazmidok restrik- 25 ciós és funkcionális - térképét sorrendben a

3. és 4. mellékelt ábrán mutatjuk be.

A példa szerinti pKC214 és a pKC215 plazmidokban az eukariota promoter szomszédos az asszociált kontrollelemeket tártál- 30 mazó és a higromicin B és G418 rezisztenciát meghatározó génekkel, és az SV40 korai promoterrel. Az eukariota promoter szabályozza a transzkripciót, és részben regulálja a rezisztencia gének kifejeződését eukariota gaz- 35 dasejtekbe transzformálva. Ezenfelül a fenti plazmidok kromoszómális integrációt szenvednek eukariota sejtekben, és ezért a normális eukariota sejtosztódás során a kromoszóma részeként replikáidnak. 40

Bár az eukariota promotert jelen leírásban a pKC2l4 és a pKC215 szemléltető jellegű plazmidokban SV40 korai promoterként adjuk meg (O’Hare és munkatársai, Proc. ₄₅ Nat. Acad. Sci., USA, 78, 1527, 1981; Mulligan és Berg, Science, 209, 1422, 1980), használhatunk több, más eukariota promotert is. Ilyen eukariota promoter például, de nem korlátozó jelleggel, az SV40 késői pro- 50 moter. (Hamer és Leder, Natúré, 281, 35,

1979), a HSV1TK promoter (Pellicer és munkatársai, Cell, 14, 133, 1978), az adenovírus promoter (Thummel és Tjian, Cell, 23, 825, 1981), az adenovírus 2 (Ad 2) késői promoter 55 (Solnick, Cell, 24, 135, 1981), a potyoma promoter (Collantuoni és munkatársai, Proc.

Nat. Acad. Sci., USA, 77, 3850, 1980), az egér szarkóma vírus promoter (Van Beveren és munkatársai, Natúré, 289, 258 (1981)), θθ az élesztő trp-1 promoter (Stinchcomb és munkatársai, Natúré, 282, 39, 1979), az élesztő leu 2 promoter (Ratzkin és Carbon, Proc.

Nat. Acad. Sci., USA, 74, 487, 1977), az élesztő kis 3 promoter (Broach és munkatársai, Geme, 8, 121, 1979), az élesztő al- ° 4 kohol-dehidrogenáz promoter és az élesztő citokróm C promoter (Guarente és Ptashne, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 78, 2199, 1981).

A pKC214 és a pKC215 szemléltető jellegű plazmidok előállításakor egy BglII fragmenst építünk be a pSV5 gpt génbe, lefelé haladva a korai SV40 promotertől, ennek ellenére más, analóg előállításokat is végezhetünk; ezekbe egy vagy több, fentiekben felsorolt eukariota promotert használhatunk, fgy például a pKC203 plazmidból vagy ennek egy származékából higromicin B és G418 rezisztencia gént tartalmazó BglII lineáris dezoxi-ribonukleinsav fragmens állítható elő oly módon, hogy a píazmidot ismert módon BglII restrikciós enzimmel kezeljük. Ezt a fragmenst közvetlenül vagy szintetikus dezoxi-ribonukleinsav linkerekkel (ezek az irodalomból ismertek) rezisztenciát meghatározó fragmenshez köthetjük, és az így előállított dezoxi-ribonukleinsav szakaszt megfelelő eukariota prometertől (például az Ad 2.vagy az élesztő citokróm C promotertől) lefelé haladva klónozhatjuk. Egy prokariota replikonnal való ligáció során ezek a készítmények (a leírásban pGDL, pGD2, pGD3 és pGD4 plazmidokként jelöljük) funkcionálnak eukariota és prokariota gazdasejtekben, és így a találmány oltalmi köréhez tartoznak. A szakember számára érthető, hogy különböző eukariota promotereket felhasználva előállíthatunk további termékeket is, egyes eukariota promoterek és készítmények előnyösebbek bizonyos gazdasejtek használatakor.

A pKC214, pKC215, pGDl, pGD2, pGD3 és pGD4 szemléltető jellegű plazmidokkal jellemzett termékekben lévő higromicin B és G4I8 rezisztencia gének és szabályozó elemek tartalmazzák a pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú BglII fragmensét. Ezen BglII fragmensen belül a dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia meghatározza a rezisztenciát, ez a hely pedig egy további, 2,5 kb nagyságú, SalI/BglII fragmensen belül lokalizálódik. A fenti 2,5 kb nagyságú SalI/BglII fragmens restrikciós és funkcionális térképét a pKC222 plazmid részeként adjuk meg a mellékelt 5. ábrán. A pKC222 plazmid felhasználható az egyes gének izolálására, a kontroll elemek elkülönítésére, amelyek együttesen az egyes antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát határozzák meg. így például az 1,51 kb nagyságú BglII/ /Sacl fragmens a pKC222 plazmidban tartalmazza a higromicin B rezisztencia gént és a szabályozó elemet, ugyanakkor az 1,65 kb nagyságú EcoRI/Sall fragmens. a G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát biztosító gént és szabályozó elemet hordozza. Ügy hisszük, hogy a G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó gén, és a génhez kapcsolódó szabályozó elem az apramicinre és a tobramicinre is rezisztenciát biztosít érzékeny sejtekben, például E. coliban. Ily módon olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok állíthatók elő, ame·

-4195248 lyek rezisztenciát biztosítanak egy, több mint egy. vagy az összes antibiotikummal szemben.oly módon, hogy a pKC203 vagy a pKC222 plazmid megfelelő dezoxi-ribonukleinsav-frag mensét egy megfelelő eukarióta promoterhez képest lefelé haladva klónozunk. Prokariota replikont tartalmazva, a vektorok, a jelen leírásban a pGDIO, pGDll, pGD12, pGD13, pGD14 és pGD15 plazmidok mind eukarióta, mind pedig prokariota gazdasejtekben funkcionálnak, és ily módon a találmány oltalmi köréhez tartoznak. Érthető módon, a találmány szerinti eljárás nemcsak a G418 rezisztencia gén aktivitása által a fentiekben ismertetett antibiotikumokkal szembeni rezisztenciákra vonatkozik.

A pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú BglII fragmense egy prokariota replikont is tartalmaz, és így önmagához köthető plazmid előállítására. A kapott plazmidot pSC701 jellel jelöljük, ez funkcionális E. coli-ban, és olyan plazmid-származékok előállítására használható, amelyek kiindulási molekulaként előnyösek. így, a pSC701 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Haell enzimmel emésztjük, majd a pKC257 és pKC259 plazmidok előállítására ligáljuk. A pKC257 plazmid egy körülbelül

4,2 kb nagyságú molekula, és higromicín B-vel szembeni rezisztenciát határoz meg. A pK.C259 plazmid körülbelül 5,0 kb nagyságú, és mind higromicín B, mind pedig apramicinnel szembeni rezisztenciát hordoz. A pKC257 plazmid dezoxi-ribonukleinsavának Sau3AI enzimmel való kezelését követő ligáció után még kisebb plazmidot kapunk, ezt pKC261 jellel jelöljük. Ez a plazmid szintén higromicín B antibiotikummal szembeni rezisztenciát határoz meg.

A fenti plazmid-származékok E. coli sejtben funkcionálisak, és kiindulási molekulaként használjuk fel a találmány szerinti vektorok előállításakor. így például, ha a pKC259 plazmidot pSV5 gpt-be építjük, megkapjuk a pLO314 és pLO3l5 plazmidokat; ha a pKC257 plazmidot pSV5 gpt plazmidba építjük, úgy a pLO316 és pLO317 jelű plazmidokhoz jutunk; a pKC261 plazmidnak a pSV5 gpt-be való építésekor a pLO318 és pLO319 plazmidokat kapjuk. Az összes, fentiekben ismertetett pLO sorozatú plazmid funkcionál mind prokariota, mind eukarióta gazdasejtekben, és így a találmány oltalmi köréhez tartoznak.

Előállíthatunk más kiindulási plazmidokat is. fgy például, ha a pUR222 plazmid plac-tartalmú Haell restrikciós fragmensét (az előállításra vonatkozóan lásd Rüther, Nucleic Acids. Research, 9, 4087, 1981) beépítjük a pKC261 plazmidba, úgy megkapjuk a pKC275 jelű plazmidot. Az utóbbi plazmid körülbelül

3,6 kb nagyságú, és a higromicín'B antibiotikummal szembeni rezisztenciát határozza meg. Ezt a pLO320 és pLO321 szemléltető jellegű plazmidok előállítására beépíthetjük a pSV5 gpt plazmidba. Ezenfelül, ha egy, az YEp24 plazmid restrikciós fragmensét tartalmazó, 2 mikron nagyságú dezoxi-ribonukleinsavat építünk be a pKC259-be, úgy megkapjuk a pKC264 plazmidot, ugyanakkor, ha a pKC259 körülbelül 2,5 kb nagyságú BglII/ /Sáli fragmensét építjük be a megfelelően hasított YEp24 fragmensbe, úgy megkapjuk a pKC273 plazmidot, továbbmenve pedig, a pKC264 plazmid körülbelül 3,2 kb nagyságú Pstl fragmensét beépítve a pBR322-be, a pLO378 plazmidhoz jutunk. Mind a pLO378, mind pedig a pKC273 plazmid funkcionál élesztőben és E. coli ban, így a találmány oltalmi köréhez tartoznak. Az előzőekben ismertetett plazmid kiindulási anyagok felhasználásával előállított, fentiekben ismertetett és más vektorok ismertetésre kerülnek a 25. és 42. példákban.

A témában jártas szakember előtt nyilvánvaló, hogy szakember más, olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat is képes előállítani vagy izolálni, amelyek szintén meghatároznak higromicín B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát, vagy külön-külön, vagy kombinációban; és érthető, hogy ezeket a szekvenciákat felhasználhatjuk a leírásban szereplő rezisztencia gének és szabályozó elemek helyett. Ezenfelül előállíthatók a 7,5 kb nagyságú BglII fragmens vagy a

2,5 kb nagyságú Sall/BglII szubfragmensek funkcionális származékai oly módon, hogy hozzákötünk, eliminálunk vagy helyettesítünk bizonyos, a genetikai kódnak megfelelő nukleotidokat. Szakember előtt nyilvánvaló, hogy ilyen származékok és más, higromicín B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szegmensek a találmány oltalmi köréhez tartoznak.

Bár a jelen leírásban szemléltető példaként a pBR322 replikont adjuk meg prokariota replikonként, hasonló kísérletekhez több, más replikont is felhasználhatunk. Ilyen prokariota replikon például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, a következők lehetnek: pMBl replikon (Betlach és munkatársai. Fed. Proc., 35, 2037, 1976), NR1 replikon (Rownd és Mickel, Natúré, 234, 40, 1971), RK2 replikon (Beringer, J. Gén. Microbiol., 84, 188, 1974), RK6 replikon (Kontomichalou és munkatársai. J. Bacteriol., 104, 34, 1970), pSCIOl replikon (Cohen és Chang, J. Bacteriol., 132, 734, 1977), RPI replikon (Grinsted és munkatársai, J. Bacteriol., 110, 529, 1972), RP4 replikon (Nagahari és munkatársai, Gene.,

I, 141, 1977), RSF1010 replikon (Guerry és munkatársai, J. Bacteriol., 117, 619, 1974), PUB110 replikon (Gryczan és munkatársai,

J. Bacteriol., 134, 318, 1978) és az SLP1.2 replikon (Bibb és munkatársai, Natúré, 284, 526). A szakember számára érthető, hogy az irodalomban leírt több más prokariota replikont is felhasználhatjuk a találmány szerinti eljárás során, és általában egyes prokariota replikonok előnyösek másokkal szemben, bizonyos gazdasejtek esetén. így pél5

-5195248 dául az RSF1010, a PUB11O és az SLP1.2 replikonok előnyösek sorrendben a Pseudomonas, Bacillus és Streptomyces esetén, míg a többi fent megadott replikon az E. coli sejtek esetén előnyös. 5

A találmány szerinti vektorok igen változatosak, és funkcionálnak gyakorlatilag bármely prokariota vagy eukariota gazdasejtben. A feltételek a következők:

1) a gazdasejt osztódjon és tenyészthető le- 10 gyen;

2) a gazdasejt alkalmas legyen transzformációra;

3) a nem transzformált gazdasejt érzékeny legyen és így elpusztuljon a higromicin B 15 és a G418 antibiotikumok közül az egyikre, vagy mindkettőre.

Ily módon a találmány szerinti vektorokat használhatjuk baktériumok, gombák, élesztők, 20 növényi sejtek, állati sejtek és szabadon élő egysejtű eukarioták esetén.

Az.E. coli K12 sejtekről sok genetikai és biokémiai információ áll rendelkezésünkre, így ezeket előnyösen használhatjuk fel 25 a találmány szerinti-eljárás prokariota gazdasejtjeként, Más, előnyös prokariota gazdasejtként baktériumokat, köztük, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, a kővetkezőket használhatjuk: E. coli, E. coli K12 BE 827, ₃θ Bacillus, Bacillus subtilis, Pseudomonas, Agrobacterium, Streptomyces, Staphylococcus, Streptococcus, Actínomycetes és Serratia; használhatunk továbbá zöld algákat is. Eukariota gazdasejtként előnyösen gombát, köz- ₃₅ tűk, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, Neurosporá-t.Cephalosporium-ot.Aspergillus-t, Penícillium-ot és élesztőt használunk;használhatunk továbbá tenyészthető, többsejtű organizmusból származó szövetből kapott sej- 49 teket, például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, emlős sejtet, egérsejtet, Mouse Ltk^- sejtet, emberi sejtet, madár sejtet, kétéltű állatból származó sejtet, hüllősejtet, a Chordata törzsből származó sejtet, állati sejtet, növényi sejtet, gymnospermous sejtet, angiospermous sejtet; felhasználhatunk továbbá szabadon élő, egysejtű organizmust, például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, algát és protozoát. ₅₀

Ahogy azt az előzőekben megadtuk, a találmány szerinti vektorok gyakorlatilag bármely prokariota vagy eukariota gazdasejtben funkcionálnak, és hordozzák a hígromicin B és a G418 antibiotikumokkal szembe- 55 ni rezisztenciát, például az alábbi sejtekben:

E. coli K12 BE827, E. coli K12 BE783, E. coli K12 BEI041, Mouse Ltk^- sejtek és Saccharomyces cerevisiae sejtek. így a találmány szerinti transzformánsok, például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, az E. coli K12 ⁶⁰

BE827/pKC214, az E. coli Κ12 BE827/pKC215, a Mouse Ltk /pKC214, a Mouse Ltk^-/ /pKC215, az E. coli KI2 BE783/pKC273 és a Saccharomyces cerevisiae/pKC273 rezisztens a fenti két antibiotikum egyikével vagy mind- 65 6 kettővel szemben, és így megfelelő szelekciós körülmények között alkalmasak a találmány szerinti vektorok szaporítására és fenntartására. A témában jártas szakember előtt nyilvánvaló, hogy nem szelektálható strukturgének klónozhatok a vektorokba, és így, transzformációt és higromicin B vagy G4I8 antibiotikumokkal való szelekciós tenyésztést követően emlős vagy más gazdasejtekben a klónozott gének stabilizálhatok, fenntarthatok és kifejezhetők. Csak azok a transzformált gazdasejtek képesek élni, higromicin B vagy G418 jelenlétében, így a találmány szerinti vektorokkal könnyen izolálhatok és azonosíthatók a transzformánsok.

Igen jelentős az a tény, hogy a találmány szerinti vektorokkal nagyszámú gazdasejt transzformálható, mivel így lehetővé válik eukariota vektorok könnyű sokszorosítása és az ezekkel való tevékenység prokariota gazdasejtekben. Ez azért előnyös különösen, mivel a prokariotát, például az E. coli és.más, hasonló sejtek genetikai háttere jól ismert, és a hagyományos rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiák ezekben a rendszerekben könnyen kivitelezhetők. A találmány szerinti rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok, köztük a szelektálható vagy nem szelektálható strukturgéneket tartalmazók, először prokariota sejtekben kezelhetők és sokszorosíthatók, majd ezt követően kifejezésre eukariota gazdasejtbe transzformálhatok, ezzel elkerüljük az eukariota rendszerekkel együttjáró nehézségeket.

Bár a találmány szerinti eljárás összes kivitelezési változatát használhatjuk, egyes rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és transzformánsok előnyösebbek. Előnyös vektorok a következők: pKC214 plazmidok, pKC215 és pKC273 plazmidok; az előnyös prokariota transzformánsok a következők: E. coli K12 BE827/pKC214, E. coli K12 BE827/pKC215, és E. coli K12 BE783/ /pKC273; az előnyös eukariota transzformánsok a következők: Mouse Ltk^-/pKC215, Mouse Ltk~/pKC214 és a Saccharomyces cerevisiae/pKC273.

A találmány szerinti vektorok és transzformánsok széles körben használhatók fel, és lehetővé teszik a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológia eukariota rendszerekben való gyorsabb és szélesebb körű kivitelezését. Például a találmány szerinti vektorok, köztük: plazmidok, bakteriofágok és vírusok, olyan antibiotikumokkal szemben hordoznak rezisztenciát, amelyek mind eukariota, mind prokariota sejtekre nézve toxikusak, és így lehetővé válik a transzformánsok szelekciója. Ez azért fontos, mivel ilyen vizsgálattal képesek vagyunk meghatározni és kiválasztani azokat az egyes sejteket, amelyek tartalmazzák a vektor dezoxi-ribonukleinsavat. A találmány szerinti vektorokba további, funkcionális kimutatásra alkalmatlan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat is beépíthetünk,

-6195248 majd ezeket tarnszformálva elkülöníthetjük a nem szelektálható dezoxi-ribonukleinsavat oly módon, hogy higromicin B vagy G418 antibiotikumokkal szemben szelektálunk.

Ilyen nem szelektálható dezoxi-ribonukleinsav- 5 -szekvencia lehet például, de nem az oltalmi kórt szűkítő jelleggel, olyan gének, amelyek poszt-transzlácionálisan módosult proteint határoznak meg, például a fibronectint vagy a hepatitis B antigént, mindjét termék transz- 10 lációt követően glükozileződik az eukariota sejtekben.

Például úgy járunk el, hogy egy nem szelektálható génszekvenciát építünk be például a plazmidok Pvul helyére, például a 15 pGD14 vagy a pGD15 plazmidba, amelyek tartalmazzák a pKC203 plazmid 2,75 kb nagyságú Sall/Bglll restrikciós fragmensét. A beépítés következményeként inaktiválódik a higromicin B rezisztencia gén, és így könnyen el- 20 különíthetők azok a transzformánsok, amelyek tartalmazzák a rekombináns plazmidot. Ezt úgy végezzük, hogy először G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciára szelektálunk, majd ezután azonosítjuk azokat a G418 rezisz- 25 tens transzformánsokat, amelyek higromicin B-re nem rezisztensek. Hasonló módon, ha egy génszekvenciát beépítünk az Xhol helyre, úgy inaktiválódik a G418 rezisztencia gén. A transzformánsok, amelyek hordozzák a rekombináns 30 plazmidot, könnyen elkülöníthetők oly módon, hogy először higromicin B rezisztenciára szelektálunk, majd ezután azonosítjuk azokat a higromicin B transzformánsokat, amelyek G418 antibiotikumra érzékenyek. Az eukariota 35 vagy prokariota transzformánsok antibiotikum rezisztenciára való szelektálhatósága lehetővé teszi azoknak a rendkívül ritkán jelentkező sejteknek a hatékony izolálását, amelyek tartalmazzák a kiválasztott, nem szelek- 40 tálható, számunkra érdekes dezoxi-ribonukleinsavat.

Az antibiotikum rezisztencia funkcionális vizsgálata — ahogy azt az előzőekben le- 45 írtuk — felhasználható arra is, hogy szabályozó elemként és egyes antibiotikum rezisztencia gének kifejeződését meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat azonosítsunk. Ilyen szekvenciák például, de nem az 50 oltalmi kört szűkítő jelleggel, a promoterek, az attenuatorok, represszorok, inducerek, riboszómális kötőhelyek és hasonlóak, amelyek felhasználhatók eukariota és prokariota sejtekben más strukturgének kifejezésének sza- 55 bályozására.

A találmány szerinti, higromicin B és G418 rezisztenciát meghatározó vektorok felhasználhatók különböző hosszúságú, kapcsolt dez- θθ oxi-ribonukleinsav-szekvenciák stabilizálására is. Ezeket a géneket vagy fragmenseket, amelyeket kovalensen kötünk a higromicin B vagy G418 rezisztenciát meghatározó génhez és eukariota vagy prokariota sejtekben szaporítunk, fenntarthatok oly módon, hogy a transzformánsokat higromicin vagy G4I8 antibiotikum hatásának tesszük ki, mégpedig olyan mennyiségű antibiotikum jelenlétében, amely toxikus a nem transzformálódott sejtekre. Ily módon a vektort elvesztett trartszformánsok, vagyis a bármely kovalensen kötött dezoxi-ribonukleinsavakat nem tartalmazó sejtek elpusztulnak és eliminálódnak a tenyészetből. Ily módon, a találmány szerinti vektorokkal számunkra érdekes dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát stabilizálhatunk és tarthatunk fenn.

A találmány szerinti klónozó vektorok és transzformánsok nemcsak nem módosított és transzlációt követően módosított polipeptidek közönséges előállítását teszi lehetővé eukariota sejtekben, de a jelenleg prokariota és eukariota sejtekben előállított különböző termékek jobb kihozatalát is lehetővé teszi. Ilyen termék, például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, a sztreptomicin, a tylozin, a cefalosporinok, az aktaplamin, a bioszintetikus inzulin, a bioszintetikus humán inzulin, a bioszintetikus humán proinzulin, a bioszintetikus interferon és a bioszintetikus humán interferon. A találmány szerinti eljárással előállíthatunk továbbá olyan szelektálható vektorokat, amelyeket felhasználhatunk az alábbi termékek azonosítására, jellemzésére és az azokat meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák rekonstruálására:

1) a gyakorlatban fontos fehérjék;

2) a metabolizmusban szerepet játszó és gyakorlatilag fontos eljárások és termékek előállításához vezető enzimek; vagy

3) szabályozó elemek és előnyösebb gén-kifejeződés.

Ilyen dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, a következők: szénhidrogének biodegradációját meghatározó dezoxi-ribonukleinsav, antibiotikum-származékok előállítása, például az alábbi antibiotikumoké, cefalosporin, tylozin és Actaplanin, antibiotikumok vagy más termékek bioszintézisét szabályozó és fokozó enzimek. Annak lehetősége, hogy ilyen dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat eukariota és prokariota sejtekbe építsünk és stabilizáljunk, igen fontos, mivel a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiával való bizonyos antibiotikumok és poszt-transzlációsan módosított proteinek előállítása eukariota gazdasejt jelenlétét igényli. Ezenfelül, mivel a találmány szerinti vektorok funkcionálnak prokariota sejtekben, például E. coli-ban, a velük való manipuláció és sokszorosításuk lehetségessé válik, így elkerüljük az eukariota sejtek használatakor jelentkező nehézségeket, ugyanis ezekben a technológiai lépések nehezen, vagy egyáltalán nem kivitelezhetők.

A találmány szerinti eljárással új, többsejtű organizmus-változatokat vagy törzseket állíthatunk elő, amelyek jobban képesek tolerálni olyan antibiotikumok hatását, amelyek kiküszöbölik a belső paraziták, patogén 7

-7195248 baktériumok vagy más, fertőző tényezők hatását. Például a higromicin B vagy a G418 rezisztencia géneket különvkülön vagy kombinálva beépíthetjük egy sejtvonalba vagy korai, embrionális sejtbe, amikor olyan több- ! sejtü organizmushoz jutunk,· amely ezekre az. antibiotikumokra rendkívül rezisztens. fgy a rezisztens többsejtű varietász, például a sertés, marha vagy juh tolerálni képes annak a nagykoncentrációjú antibiotikumnak a je- 1 lenlétét, amely alkalmas lassú növekedést és csökkent életképességet okozó paraziták és fertőző betegséget okozó ágensek kontrollálására.

Az alábbiakban részletes példákkal szem- 1 teltetjük a találmány szerinti eljárást.

I. példa

A pKC203 plazmid

A) A plazmid dezoxi-ribonukleinsav izolálása az E. coii JR225 sejtből Az E. coli JR225 (ATCC 31912) baktériumot TY táptalajban tenyésztjük. A táptalaj összetétele a következő: 1% tripton, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% nátrium-klorid, pH-ja — 7,4. A táptalajt ml-enként 100 pg higromicin B antibiotikummal egészítjük ki.

A tenyésztést a hagyományos mikrobiológiai módszerek szerint végezzük. 18 órán át inkubáljuk a tenyészetet, majd 0,5 ml tenyészetet 1,5 ml térfogatú Eppendorf-csőbe helyezünk és 15 másodpercen át centrifugáljuk. Az összes tevékenységet — kivéve, ha másként nem adjuk meg — szobahőmérsékleten végezzük. A felülúszót óvatosan eltávolítjuk, és a sejtüledéket 100 pl frissen előállított lizozimes oldatban szuszpendáljuk.

Az oldat 2 mg/ml lizozimot, 50 mmól glükózt, mmól ciklohexán-diamino-tetraacetátot és 25 ml trisz-hidrogén-kloridot tartalmaz (pH= =8,0). 30 percen át 0°C hőmérsékleten inkubáljuk a szuszpenziót, majd 200 pl alkalikus nátrium-dodecil-szulfát-oldatot adunk (0,2 n nátrium-hidroxid, 1% nátrium-dodecil-szulfát). A csövet enyhén vortexeljük, majd 15 percen át 0°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután 150 pl 3 mólos nátrium-acetát-oldatot adagolunk. Az oldatot úgy állítjuk elő, hogy a lehető legkisebb mennyiségű vízben 3 mól nátrium-acetátot oldunk, az oldat pH-ját jégecettel 4,8-ra állítjuk be, majd térfogatát 1 1-re egészítjük ki. Ezután enyhén rázogatjuk a csőben lévő oldatot, ezalatt létrejön a dezoxi-ri bonukleinsav-csapadék.

percen át 0°C hőmérsékleten tartjuk az oldatot, majd 5 percen át centrifugáljuk, amiután majdnem teljesen átlátszó felülúszót kapunk. 0,4 ml felülúszót egy másik centrifuga csőbe teszünk, az oldatot 1 ml hideg etanollal egészítjük ki. 30 percen át —20°C hőmérsékleten tartjuk a készítményt, amiután centrifugálással (2 perc) elkülönítjük a csapadékot. A felülúszót leszívatjuk.

Az így kapott üledéket 100 pl, 0,1 mólos nátrium-acetát/0,05 mól trisz-hidrogén-klorid (pH = 8) elegyben oldjuk, és két téríogat8 nyi etanollal újra kicsapjuk’ 10 percen át 20°C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, a csapadékot centrifugálással az előbbiek szerint elkülönítjük. Ez a csapadék tartalmazza az

E. coli JR225 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat.

B) Az E. coli JR225 plazmid dezoxi-ribonukleinsav transzformálása és a pKC203 plaz0 mid izolálása

Az E. coli JR225 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl 0,1 mólos nátrium-acetát/ /0,5 mól trisz-hidrogén-klorid (pH = 8) elegyben oldjuk, majd ezt követően két térfogat₅ nyi hidegetanollal kicsapjuk. A kapott plazmid dezoxi-ribonukleinsavat összegyűjtjük és 40 pl vízben oldjuk, az oldatot pufferral hígítjuk, oldjuk Wensink módszere szerint (Ceil, 3, 315, 1974) E. coli KI2 BE827 sejteket transzq formálunk. Az E. coli K12 BE827 sejteket az American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) törzsgyüjteményében letétbe helyeztük; innen ATCC 31911 számon elkérhető. A transzformánsokat TY-agaron szelek5 táljuk. Az agar 1% triptont, 0,5% élesztőkivonatot, 0,5% nátrium-kloridot, 1,5% agart és ml-enként 200 pg higromicin B antibiotikumot tartalmaz, pH-ja = 7,4. A gélelektroforézises vizsgálat (Rao és Rogers, 1978) θ és más vizsgálatok szerint egyes transzformánsok nagy és kisebb (!5 kb) plazmidokat tartalmaznak, és rezisztensek ampicillinre és higromicin B-re. Más transzformánsok csak a kisebb, 15 kb nagyságú plazmidot tartal₅ mázzák, és a higromicin B és a G418 antibiotikumokra rezisztensek, szenzitivek azonban ampicillinre.

Az utóbbi típusú transzformánsokat ml-enként 1 mg higromicin B-t tartalmazó TY-aga0 ron szélesztjük, és a hagyományos mikrobiológiai techn.ka szerint tenyésztjük. A sejteket az 1A. példa szerint eljárva felhasználjuk a fenti 15 kb nagyságú higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisz5 tenciát meghatározó plazmid izolálására. Ezt a plazmidot a továbbiakban pKC203 jellel jelöljük. A pKC203 plazmidon jelenlévő, higromicin B és G4I8 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó gének jelenlétét a továbbiakban transzformációs és szelekciós analízissel bizonyítjuk.

2. példa

A higromicin B és a G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó gének és szabályozó elemek izolálása pg pKC203 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat a gyártó cég által megadott körülmények között Bglll restrikciós enzimmel keze) lünk (a restrikciós enzimeket és használatuk módját az alábbi cégektől kaphatjuk meg: Bethesda Reserarch Laboratories Inc.. Box 6010, Rockville, Maryland 20850.; Boehringer Mannhein Biochemicals 7941 Castleway Drive, ₅ P.O. Box 50816, Indianapolis, Indiana, 46250.: New England Bio Labs., Inc., 283 Cabot,

-8195248

Beverly, Massachusetts 01915.; Research Products, Mi les Laboratories Inc., Elkhart, Indiana 46515.). A 7,5 kb, 5,8 kb és 0,5 kb nagyságú fragmensek közül a 7,5 kb nagyságú Bglll fragmens tartalmazza a higromicin 5 B és G4I8 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó géneket és szabályozó elemeket. Ezt transzformációs és szelekciós analízissel bizonyítjuk, a kísérletek azt mutatják, hogy a közönséges körülmények 10 között a higromicin B-re és a G418-ra érzékeny sejtek a 7,5 kb nagyságú Bglll fragmenssel való transzformációt követően rezisztensekké válnak.

3. példa

A pKC2l4 és a pKC215 plazmidok előállítása és az E. coli K12 BE827/pKC214 és az E. coli K12 BE827/pKC215 tarnszformánsok

A pSV5 gpt plazmid előállítását Mulligan 20 és Berg írja le (Science, 209, 1422, 1980), a plazmid a gpt génen belül egyetlen Bglll hellyel rendelkezik. Az alábbiak szerint klónozva kifejezzük a higromicin B és G418 rezisztencia géneket. 25 pg pSV5 gpt plazmid dezoxi-ribonukleinsavat az előállító cég ajánlását követve Bglll restrikciós enzimmel kezelünk (lásd előbb). Az enzim inaktiválására 5 percen át 70°C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd 30 1:1 arányban 1 pg dezoxi-ribonukleinsavat keverünk a pKC203 7,5 kb nagyságú Bglll fragmensével. A fragmenseket T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsoljuk össze, a kísérletet az előállító ajánlása szerint végezzük 35 (Bethesda Research Laboratories, Box 6010, Rockville, Maryland 20850.).

A ligációs eleggyel E. coli K12 BE827 sejteket transzformálunk TY lemezeken, ame- 40 lyek 100 pg/ml ampicillint és apramícint tartalmaznak. A transzformációt Wensink szerint végezzük (Cell, 3, 315, 1974). A rekombináns kiónokat 100 pg/ml ampicillint és 200 pg/ml higromicin B-t tartalmazó TY-lemezeken szélesztjük. A higromicin B rezisztens ⁵ rekombináns kiónok körülbelül fele tartalmazza a pKC214 plazmidot (lásd. 3. ábra), míg a többi sejt a pKC215 plazmidot hordozza (lásd 4. ábra). 50

A fenti klónokból.származó különböző plazmid dezoxi-ribonukleinsavat az 1A. példa szerint eljárva izoláljuk, és restrikciós enzim-analizissel ismert módon vizsgáljuk. Ilyen 55 módon a pKC214 és pKC215 plazmidokat és az előállított E. coli K12 BE827/pKC214 és E. coli KI2 BE827/pKC215 transzformánsokat azonosítjuk és további felhasználásra izoláljuk. θθ

4. példa

A Mouse Ltk~/pKC214 előállítása

A Mouse Ltk~ sejteket ismert módon tenyésztjük olyan táptalajon, amely minimál esszenciális táptalajt tartalmaz Earle-sókkal és nem esszenciális aminosavakkal együtt (Eagle, Science, 130, 432, 1959). A táptalaj 10% újszülött borjúszérumot és ml-enként 292 pg glutamint is tartalmaz. A tenyésztett Mouse Ltk^- sejteket transzformáljuk a pKC214 plazmiddal Wigler és munkatársai szerint eljárva (Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 76, 1373, 1979). A transzformációt a fentiek szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy mindegyik lemezhez 1 ml kalcium-foszfát-csapadékban 100-300 mg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat adunk, továbbá a tenyésztő táptalaj a fentiekben megadottal azonos. Négy órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészetet, majd a táptalajt friss táptalajjal cseréljük ki, és további 20 órán át folytatjuk az inkubálást. Ekkor higromicin B antibiotikum szelekciós nyomást biztosítunk. Ezt úgy végezzük, hogy a táptalajt olyan szelekciós táptalajjal cseréljük ki, amely a fenti összetételű, de ezenkívül ml-enként 75-1000 pg higromicin B-t tartalmaz. A szelekciós táptalaj előnyös antibiotikum-koncentrációja 200 pg/ml. Az első nap után cseréljük a szelektív táptalajt, majd a második napon ismét, végül az elkövetkező 2-3 hétig minden harmadik napon. Ezalatt megjelennek a transzformáns kiónok. összegyűjtjük a telepeket, és nagytömegű tenyész-sejtet állítunk elő, miközben fenntartjuk a szelekciós nyomást. Az így kapott higromicin B antibiotikumra rezisztens sejtek a Mouse Ltk~/ /pKC214 transzformánsok.

5. példa

A Mouse Ltk~/pKC215 előállítása

A 4. példában megadottak szerint eljárva állítjuk elő a Mouse Ltk~/pKC215 sejteket, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett pKC215 plazmidot használunk a transzformációs eljárás során. Az előállított Mouse Ltk^-/pKC215 transzformánsokat szaporítjuk.

6. példa

A transzformánsok rezisztenciája a higromicin B és G418 antibiotikumokkal szemben

Annak bizonyítására, hogy a pKC203, pKC2I4 és pKC125 plazmidok meghatározzák a higromicin B és a G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát, a transzformált és nem transzformált E. coli és Mouse Ltk~ sejteket különböző mennyiségű antibiotikumokat tartalmazó táptalajon növesztjük. Az E. coli és Mouse Ltk sejtek tenyésztéséhez használt táptalajok gyakorlatilag azonosak az 1A. és 4. példában megadott táptalajokkal. A kísérletek eredményeit az 1. és 2. táblázatban adjuk meg, a táblázatban:

a + növekedést jelez;

a — jel a növekedés hiányát jelzi;

az N/T betűjelek pedig a vizsgálat hiányát mutatják.

-9195248

I. Táblázat

A higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztencia

Sej ttípus	A táptalaj antibiotikum koncentrációja 0 jig/ml 200 jag/ml 400* jug/ml
E. coli K12 E. coli K12 BE827/	+ -	-
/pKC203	+ +	+
E. coli K12 BE827	+	-
E. coli K12 BE827/ /pKC214 E. coli K12	N/T +	N/T
BE827/pKC215	N/T +	N/T
Mouse Ltk	+	N/T
Mouse Ltk“/pKC214	+ +	+
Mouse Ltk“/pKC215	+ +	+
x = A Mouse Ltk’	/pKC214 és a Mouse Ltk“/pKC215 sej-
tek nemcsak	400 jug/ml antibiotikum j	elenlétében
replikálódtak, de túlélték az 1000 jug/ml-nél nagyobb koncentrációjú antibiotikum hatását is.
II.	Táblázat
A G418 antibiotikummal szembeni rezisztencia
Sej ttípus	A táptalaj antibiotikum	koncentrá-
	ciój a
	0 jug/ml 75 jug/ml 75 jug/ml 500 jug/ml
E. coli Kl2/pKC203	+ + +	N/T
Mouse Ltk-	+ + -	-
Mouse Ltk-/pKC214	+ + +	+
Mouse Ltk~/pKC215	+ + +	-

7. példa

A pGDI és pGD2 plazmidok és az E. coli K12 BE827/pGDl és az E. coli K12 BE827/ /pGD2 transzformánsok előállítása

A pLG669 plazmid előállítását Guarente és Ptashne írja le (Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 78, 2199, 1981), a plazmid a citokróm C génben egyetlen BamHI restrikciós helyet tartalmaz. A pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú Bglll fragmensét az alábbiak szerint ebbe a helybe klónozzuk, amikor lehetővé válik a higromicin B rezisztenciát meghatározó gén kifejeződése. A beépítést könnyen véghezvihetjük, mivel a Bglll fragmensek az 5’-végen GATC-szekvenciát tartalmaznak, és ez azonos a BamHI fragmensek 5’-végein lévő szekvenciával. így a Bglll és a BamHI fragmensek összekapcsolhatók, és közvetlen ligációt követően rekombinánsokat kapunk.

A pGDI és a pGD2 plazmidokat, továbbá az E. coli K12 BE827/pGDl és az E. coli K12 BE827/pGD2 transzformánsokat lényegében a 3. példában megadottak szerint el10 járva állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy . a pSV5 gpt plazmid helyett az egyetlen BamHI restrikciós hellyel rendelkező pLG669 plazmidot használjuk fel. A Bglll fragmens orientációjától függően kétorientációjú plazmidokat kapunk. A pGDI plazmid olyan rekombináns plazmid termék, amelyben az Sáli restrikciós hely közelebb esik az ura génhez. A pGD2 olyan plazmid, amelynek orientációja fordított.

₅₅ 8. példa

A Saccharomyces cerevisiae/pGDI előállítása A Saccharomyces cerevisiae élesztőt a hagyományos módon növesztjük 1% élesztőkivonatot és 2% bakto-peptont tartalmazó tápθ_ talajon, ismert mikrobiológiai módszerrel. A pGDI plazmid transzformációját az élesztőbe Hinnen és munkatársai szerint végezzük (Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 75, 1929, 1978). A transzformánsok szelektálására letális mennyiségű higromicin B antibiotikumot adunk a tenyésztő táptalajhoz.

-10195248

9. példa

A Saccharomyces cerevisiae/pGD2 előállítása

A 8. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pGDl plazmid helyett a pGD2 plazmidot használjuk.

10. példa

A pGD3 és a pGD4 plazmidok, és az E. coli K12 BE827/pGD3 és az E. coli K12 BE827/ /pGD4 transzformánsok előállítása

A p04 plazmid előállítását Solnick írja le (Cell, 24, 135, 1981), a plazmid tartalmazza az Adenovírus 2 (Ad 2) késői promoterét a 15,4 (EcoRI) és 16,6 (Hindii!) térképszakaszok között. A 7,5 kb nagyságú pKC203 BglII plazmid fragmenst beépítve a p04 plazmid Hindii! helyébe, kifejeződik a higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó gén.

A kísérletet úgy végezzük el, hogy Ullrich· és munkatársai szerint (Science, 196, 1313, 1977) a 7,5 kb nagyságú BglII fragmenshez HindlII linkereket ((d(CCAAGCTTGG) ], Cotlaborative Research Inc., 1365 Main Street, Waltham, MA 02154.) adunk, majd az így módosított fragmenst T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal hozzákapcsoljuk a HindlII enzimmel kezelt p04 plazmidhoz. A HindlII restrikciós enzimet és a T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt a 2. és 3. példában ismertetett cégektől vásároltuk, használatukkor az eladó tanácsait követtük. A 7,5 kb nagyságú BglII fragmens HindlII linkerekkel való ellátását követően a fragmenst a p04 plazmidhoz kötjük, amikor megkapjuk a pgD3és a pGD4 plazmidokat. A kísérletet lényegében a 3. példában megadottak szerint végezzük. Az E. coli K12 BE827 sejteket transzformálva megkapjuk az E. coli K12 BE827/pGD3 és az E. coli K12 BE827/ /pGD4 transzformánsokat. A transzformációt a 3. példában megadottak szerint végezzük.

Mint ahogy azt a 3. és 7. példában ismertettük, a beépített, rezisztenciát meghatározó fragmens orientációjától függően kétféle orientációjú plazmidot kapunk. A pGD3 jelű rekombináns plazmidban a Sáli restrikciós hely a higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát hordozó fragmensben az Ad2 promoter EcoRI helyéhez közelebb esik. A pGD4 jelű plazmidokban az orientáció fordított.

11. példa

A Mouse Ltk~/pGD3 előállítása

A Mouse Ltk^T/pGD3 előállítására a 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett a pGD3 plazmidot használjuk.

12. példa

A Mouse Ltk~/pGD4 előállítása

A Mouse Ltk~/pGD4 előállítására a 4. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pKC215 plazmid helyett a pGD4 plazmidot használjuk.

13. példa

A pKC222 plazmid és az E. coli KI2 BE827/ /pKC222 transzformáns előállítása

A) A pKC203 plazmid 2,75 kb nagyságú Sáli/ /BglII fragmensének izolálása pg pKC203 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Sáli és BglII restrikciós enzimmel kezelünk, az előállító intsrukciói szecint eljárva (lásd a 2. példát). A higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát biztosító géneket és szabályozó elemeket tartalmazó 2,75 kb nagyságú fragmenst ismert módon különítjük el.

B) Ligái ás és végső előállítás

5pg, Rao és Rogers szerint kapott pKC7 plazmidot (Gene, 7, 79, 1979) Sáli és BglII restrikciós enzimekkel kezelünk. Az enzimeket 70°C hőmérsékleten 5 percen át tartva a reakcióelegyet inaktiváljuk, majd ezt követően 1:1 arányban 1 pg dezoxi-ribonukleinsavat keverünk a pKC203 2,75 kb nagyságú SalII/BglII fragmensével. T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal összekapcsoljuk a fragmenseket, a reakciót az enzimet előállító tanácsai alapján végezzük (lásd a 3. példát). A kapott pKC222 plazmiddal E. coli K12 sejteket transzformálunk, a 3. példában megadottak szerint eljárva. A sejtek az ampicillin, higromicin B és G418 antibiotikumokkal szemben rezisztensekké válnak,

14. példa

A pKC222 plazmid higromicin B rezisztenciát meghatározó, 1,51 kb nagyságú Sac 1/ /BglII fragmensének izolálása

A 13A. példában megadottak szerint izoláljuk a kívánt dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst, azzal a különbséggel, hogy az Sáli enzim helyett Sacf és BglII restrikciós enzimeket használunk.

15. példa

A pKC222 plazmid G418 rezisztenciát meghatározó, 1,65 kb nagyságú EcoRI/Sall fragmensének izolálása

A 13A. példában megadottak szerint izoláljuk a kívánt dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst, azzal a különbséggel, hogy a BglII enzim helyett EcoRI és Sáli restrikciós enzimekkel végezzük az emésztést.

16. példa

A pGDIO és pGDll plazmidok és az E. coli K12 BE827/pGD10 és E. coli K12 BE827/ /pGDll transzformánsok előállítása

A 3. és 10. példában megadottak szerint eljárva állítjuk elő a kívánt plazmidot, azzal a különbséggel, hogy a pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú BglII fragmense helyett a pKC222 plazmid 1,51 kb nagyságú SacI/BglII fragmensét és a HindlII helyett BglII linkereket kötünk az antibiotikum rezisztenciát meghatározó fragmenshez. Az 11

-11195248

1,51 kb nagyságú, BglII linkereket hordozó fragmenst a pSV5 gpt plazmidba építjük be,a beépítést a 3. példában megadottak szerint végezzük.

Ahogy azt a 3. és 7. példában megadott eljárás során ismertettük, a plazmidok két orientációban léteznek, attól függően, hogy a beépített antibiotikum rezisztenciát hordozó fragmens hogyan helyezkedik el. A pGDIO jelű rekombináns plazmidokban a beépített higromicin B rezisztenciát meghatározó fragmens Aval restrikciós helye közelebb esik a gpt gén HindlII helyéhez. A pGDll plazmidban a fragmens orientációja fordított.

Ezután a 3. példában megadottak szerint eljárva a pGDIO és a pGDll plazmidokat E. coli K12 BE827 sejtekbe transzformáljuk, amikor sorrendben megkapjuk az E. coli K12 BE827/pGD10 és az E. coli KI2 BE827/pGDll transzformánsokat.

17. példa

A Mouse Ltk~/pGD10 előállítása

A 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett pGDIO plazmidot használunk a transzformáció során. A kapott Mouse Ltk“/pGD10 sejteket tömegesen tenyésztjük.

18. példa

A Mouse Ltk/pGDll előállítása

A 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett a pGDll plazmidot használjuk a transzformáció során. A kapott Mouse Ltk^-/pGDl 1 sejteket tömeges tenyésztéssel szaporítjuk.

19. példa

A pGDI2 és a pGD13 plazmidok, és az E. coli K12 BE827/pGDI2 és az E. coli K12 BE827/ /pGD13 transzformánsok előállítása

Lényegében a 3. és 10. példában megadottak szerint járunk el a fenti plazmidok előállítására, azzal a különbséggel, hogy a pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú BglII fragmense helyett a pKC222 plazmid 1,65 kb nagyságú EcoRI/Sall fragmensét használjuk, és a Hindii! linkerek helyett BglII linkereket kötünk a fragmenshez, amely fragmens az antibiotikum rezisztenciát határozza meg. Az 1,65 kb nagyságú BglII linkereket hordozó fragmenst a pSV5 gpt plazmidba építjük be, a 3. példában megadottak szerint eljárva.

Ahogy azt a 16. példában megadtuk, a plazmidok két orientációban léteznek. A pGDI2 jelű rekombináns plazmidokban a beépített G418 antibiotikum rezisztenciát hordozó fragmens PstI restrikciós helye közelebb van a gpt gén HindlII helyéhez. A pGD13 jelű plazmidokban az orientáció fordított.

A kapott pGD12 és a pGD13 plazmidokkal E. coli KI2 BE827 sejteket transzformálunk, a 3. példában megadottak szerint eljárva, az E. coli KI2 BE827/pGD12 és az E. coli K12 BE827/pGD13 előállítására. Az eljárás során a higromicin B-vel való transzformáns szelekció helyett G418 antibiotikumra szelektálunk.

20. példa

A Mouse Ltk~/pGD12 előállítása

A 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett pGD12 plazmidot használunk a transzformáció során, továbbá a transzformánsok szelektálását nem higromicin B-vel, hanem G418 antibiotikummal végezzük

A kapott Mouse Ltk“/pGD12 sejteket tömeges tenyészetben növesztjük.

21. példa ²⁰ A Mouse Ltk~/pGDI3 előállítása

Az előállítást a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett a pGD13 plazmidot használjuk a transzformáció során, a transzformánsok szelektálását pedig nem higromicin B-vel, hanem G418 antibiotikummal végezzük. A kapott Mouse Ltk“/pGD13 sejteket tömeges tenyészetben növesztjük.

22. példa

A pGD14 és a pGD15 plazmidok, és az E. coli K12 BE827/pGD14 és az E. coli K12 BE827/ /pGD15 transzformánsok előállítása

A pKC203 plazmid 2,75 kb nagyságú Sáli/ /BglII fragmensét a 13. példában megadottak szerint eljárva izoláljuk. Ezután a 10. példában megadottak szerint, molekuláris linkereket kapcsolunk hozzá, azzal a különbség40 gél, hogy nem HindlII, hanem BglII linkereket használunk. A fragmenst ezután a pSV5 gpt plazmidba építjük be, a beépítést a

3. példában megadottak szerint végezzük.

Ahogy azt a 16. példában megadtuk, két orientációjú plazmidot kapunk. A pGD14 jelű rekombináns plazmidokban az antibiotikum rezisztenciát meghatározó fragmens Aval restrikciós helye közelebb esik a gpt gén HindlII helyéhez. A pGD15 plazmidok for50 dított orientációjúak.

Ezután a 3. példában megadottak szerint eljárva, a pGD14 és a pGD15 plazmidokkal E. coli K12 BE827 sejteket transzformálunk, amikor megkapjuk az E. coli K12

BE827/pGD14 és az E. coli K12 BE827/ /pGD15 transzformánsokat.

23. példa

A Mouse Ltk~/pGD14 előállítása

A 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett a pGD14 plazmidot használjuk a transzformáció során. A kapott Mouse Ltk“/pGD14 sejteket tenyészetben növeszt65 jük.

-12195248

24. példa

A Mouse Ltk~/pGDI5 előállítása

A 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a transzformáció során a pKC2I4 plazmid helyett a pGD15 plazmidot használjuk. Az így előállít tott Mouse Ltk~/pGD14 sejteket tenyészetben növesztjük.

25. példa

A pSC70l plazmid és az E. coli KI2 BE827/ /pSC701 transzformáns előállítása pl (5 pg), az 1. példában megadottak szerint előállított pKC203 plazmidot TE-pufíerban (10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = = 8,0, I mmól etilén-diamino-tetraecetsav), 5 pl DTT (100 mmól ditio-treitol), 5 pl (1000 mg/ml) borjúszérum albumin, 25 pl víz, 5 pl (5 egység) BglII restrikciós enzim és 5 pl 1 OX reakcióelegy (a reakcióelegy a következő összetételű: 600 mmól nátrium-klorid, 100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 100 mmól magnézium-klorid) jelenlétében 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubálunk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet 5 percen át 70°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután jeges fürdőben lehűtjük az elegyet, fenollal, majd kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyével extraháljuk, és ezt követően etanollal kicsapjuk. A kapott BglII restrikciós fragmenseket 5 pl, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk, majd ligáljuk. A ligációs reakciót 1 pl BglII restrikciós enzimmel kezelt dezoxi-ribonukleinsav, 38 pl víz és 5 pl, 10 mmólos ATT oldat, továbbá 5 pl ligációs elegy (összetétele a következő: 500 mmól trisz-hidrogért-klorid, pH=7,8, 200 mmól ditio-treitol, 100 mmól magnézium-klorid), továbbá 1 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz (körülbelül 10⁵ New England Bio Láb egység) jelenlétében végezzük, 16°C hőmérsékleten, 16 órán át. A reakciót úgy állítjuk le, hogy 5 percen át 70°C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet. Jeges vízfürdőben ezután lehűtjük, a kapott ligációs eleggyel pedig E. coli K12 BE827 sejteket transzformálunk gyakorlatilag Wensink módszere (1974) szerint, TY lemezeken, amelyek 200 mg/ml higromicin B antibiotikumot tartalmaznak. A gélelektroforézises (Rao és Rogers, 19.78) és más vizsgálatok szerint egyes transzformánsok tartalmazzák a 7,3 kb nagyságú, előállítandó plazmidot. Egy ilyen transzformánst E. coli K12 BE827/ /pSC701 jellel jelöltünk. A szelektált, 200 pg/ /ml higromicin B antibiotikumot tartalmazó TY agaron szélesztett, majd hagyományos mikrobiológiai módszerekkel tenyésztett transzformánsból az 1A. példában megadottak szerint eljárva izoláljuk a pS€701 plazmidot. A higromicin B és G418 rezisztenciát meghatározó gének jelenlétét a pSC701 plazmidban transzformációval, szelekcióval és restrikciós enzim-analízissel bizonyítjuk. A mellékelt 6. ábrán megadjuk a pSC701 plaz24 mid restrikciós helyét és funkcionális térképét.

26. példa

A pKC257 és a pKC259 plazmidok és az E. coli K12 BE783/pKC257 és az E. coli K12 BE783/pKC259 transzformánsok előállítása

A 25. példában megadottak szerint eljárva állítjuk elő a plazmidot, azzal a különbséggel, hogy a pKC203 plazmid, a BglII restrikciós enzim és az ott megadott reakcióelegy helyett a pSC70l és a Haell restrikciós enzimet, valamint az alábbi összetételű reakcióelegyet használjuk: 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 60 mmól magnézium-klorid. A pSC701 plazmid több mint egy Haell restrikciós helyet tartalmaz, így Haell enzimmel emésztve, és ezután ligációt végezve különböző plazmidok elegyét kapjuk.

A kapott ligációs elegy tartalmazza a körülbelül 4,2 kb nagyságú pKC257, a higromicin B rezisztenciát meghatározó plazmidot, továbbá a körülbelül 5,0 kb nagyságú, higromicin B, G418 és apramicin rezisztenciát meghatározó pKC259 plazmidot. Ezzel az eleggyel E. coli K12 BE783 sejteket a (Northern Regionál Research Laboratory, Peoria, Illinois törzsgyűjteményében B-15020 számon található) transzformálunk, a 25. példában megadottak szerint eljárva. A transzformánsokat 200 pg/ /ml higromicin B antibiotikumot tartalmazó TY agaron szélesztve szelektáljuk, majd külön-külön tenyésztjük, hagyományos mikrobiológiai módszerekkel. A pKC257-et tartalmazó transzformánsokat könnyen azonosítjuk oly módon, hogy keressük a higromícin B antibiotikum rezisztens sejteket. A pKC259 plazmidot tartalmazó transzformánsok azonosítását apramicin és higromicin B rezisztencia alapján végezzük. Az E. coli K12 BE783/pKC257 és az E. coli KI 2 BE783/ /pKC259 jelű transzformánsokat az adott sorrendben felhasználjuk a pKC257 és a pKC259 plazmidok izolálására. A plazmidok izolálását az 1A. példában megadottak szerint végezzük. Az antibiotikum rezisztencia gének jelenlétét az'egyes plazmidokban ezután transzformációval, szelekcióval és restrikciós enzimmel végzett analízissel bizonyítjuk. A pKC257 és a pKC259 plazmidok restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 6. és 7. ábrán mutatjuk be.

27. példa

A pKC261 plazmid és az E. coli K12 BE783/ /pKC261 transzformáns előállítása

A 25. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pSC701 plazmid, a BglII restrikciós enzim és az ott megadott reakcióelegy helyett a pKC257 plazmidot, a Sau3 Al restrikciós enzimet és az alábbi összetételű reakcióelegyet használjuk: 500 mmól nátrium-klorid, 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5 és 50 mmól magné13

-13195248 zium-klorid. A pKC261 plazmid körülbelül

3,2 kb nagyságú, és meghatározza a higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát.

A kapott ligációs eleggyel a 25. példában megadottak szerint eljárva E. coli K12 BE783 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat, a leírásban E. coli K12 BE783/pKC261 jellel jelöljük, szelektáljuk, és felhasználjuk őket a pKC261 plazmid izolálására. A plazmid izolálását az 1A. példa szerint végezzük. A higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát. biztosító gén jelenlétét a pKC261 plazmidban transzformálással, szelekcióval és dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia-analízissel tovább bizonyítjuk. A pKC261 plazmid restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 7. ábrán adjuk meg.

28. példa

A pKC275 plazmid és az E. coli K12 BE104I/ /pKC275 transzformánsok előállítása

A) A pKC271 plazmid részleges emésztése

Haell enzimmel μΙ (5 pg), a 27. példában megadottak szerint izolált pKC261 plazmidot TE-puffer, 5 μΙ ditio-treitol, 5 μΙ (1000 mg/ml) borjúszérum albumin, 25 μΐ víz, 5 μΐ (5 egység) Haell restrikciós enzim és 5 μΙ reakeíóelegy (600 mmól nátrium-klorid, 100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,4, 100 mmól magnézium-klorid) jelenlétében, 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubálunk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet 5 percen át 70°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután jeges vízfürdőben lehűtjük, fenollal, majd ezután kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyével extrahaljuk, végül etanollal kicsapjuk. A kapott Haell restrikciós fragmenseket 5 μΐ, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk.

B) A Haell véget tartalmazó, körülbelül 394 nt piac fragmens izolálása

Az 1. példában megadottak szerint eljárva E. coli K12 BEI 166/pUR222 sejtből izoláljuk a pUR222 plazmidot, majd 5 μΐ (5 pg) plazmidot TE-pufferban oldunk, és Haell enzimmel emésztünk, a 28A. példában megadottak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy a restrikciós elegyet 2 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten, azaz nem részleges, hanem teljes emésztést végzünk. A kapott Haell restrikciós fragmenseket 5 μΙ, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk.

Az E. coli K12 BEI 166/pUR222 törzs a Northern Régiónál Research Laboratory, Peoria, Illinois törzsgyűjteményében található meg. A törzs a kutatók számára hozzáférhető a B-15023 számon, és felhasználható a pUR222 plazmid forrásaként.

C) Ligálás és transzformálás pl pKC261 és pUR222 plazmidból a 28A., illetve a B) példában megadottak szerint előállított Haell restrikciós fragmenst, 14 ²⁶ pl vizet, 5 pl (10 mmól) ATP-t, 5 pl ligációs keveréket (lásd: előző példa) és 1 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt (körülbelül 10⁵ New England Bio Láb Units) elegyítünk, a reakcióelegyet 16 órán át 16°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután 5 percen át 70°C hőmérsékleten hagyjuk állni a reakcióelegyet, és ezzel leállítjuk a reakciót. Az így kapott ligációs elegyet jégfürdőben lehűtjük. Ezután

E. coli K12 BE1041 törzset transzformálunk az eleggyel (a törzs a Northern Régiónál Research Laboratory, Peoria, Illinois törzsgyűjteményében található meg B-15021 sorszámon). A transzformációt a 25. példában megadottak szerint végezzük. A 3,6 kb nagyságú pKC275 plazmidot tartalmazó transzformánsokat E. coli K12 BE1041/pKC275 jellel jelöljük. Az egyik ilyen transzformánst szelektáljuk, szélesztjük, tenyésztjük és fel20 használjuk további plazmid-izolálásokhoz. A 3,94 nt piac-tartalmú fragmenst és a pKC275 plazmid részletes szerkezetét gél-elektroforézissel és restrikciós enzim-analízissel vizsgáljuk.

Mivel a pKC261 plazmid három helyen hasítható Haell restrikciós enzimmel, a Haell emésztést követően különböző Haell fragmenseket kapunk. így a fentiek szerint eljárva, különbözőképpen orientált plazmid izomereket kapunk, és a transzformánsok izolálhatok és ismert módszerekkel azonosíthatók. ApKC275 plazmid restrikciós helyét és funkcionális térképét mutatjuk be a mellékelt 8. ábrán.

29. példa

A pKC264 plazmid és az E. coli K12 BE783/ /pKC264 transzformáns előállítása

A) A pKC259 plazmid EcoRI enzimmel való emésztése

Az emésztést a 28. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC259 plazmidot és az EcoRI restrikciós enzimet használjuk, reakcióelegyként az alábbi összetételű elegyet adagoljuk: 500mmól . nátrium-klorid, 1000 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, 50 mmól magnézium-klorid. A

28. példában a pUR222 plazmidot és Haell restrikciós enzimet, és az ezeknek megfelelő reakcióelegyet használtuk. A kapott EcoRI restrikciós fragmenseket 5 μΙ, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk.

B) Az YEp24 plazmid emésztése EcoRI enzimmel a 2 μ méretű dezoxi-ribonuklein55 sav izolálására

Az YEp24 plazmidot az E. coli KI2

BE1139/YEp24 törzsből izoláljuk, az 1. példában megadottak szerint eljárva. Az E. coli KI2 BE1139/YEp24 törzs a Northern Regio00 nal Research Laboratory, Peoria, Illinois törzsgyűjteményében található meg B-15022 sorszámon. Az YEp24 plazmid EcoRI enzimmel való emésztését a 29A. példa szerint végezzük, a kapott EcoRI restrikciós fragmenseket pedig 5 μ|, 5 mmólos nátrium-klorid-ol⁶⁵ datban oldjuk.

-14195248

C) Ligálás és transzformálás

A pKC259 és az YEp24 plazmidok EcoRI enzimmel emésztett fragmenseit (a fragménseket a 29A. példa és a 29B. példa szerint állítottuk elő) ligáljuk, a ligációs eleggyel 5 pedig E. coli K12 BE783 sejteket transzformálunk. A ligálást és a transzformálást a 28C. példa szerint végezzük. A kizárólag a

7,2 kb nagyságú, higromicin B, apramicin és G418 antibiotikumokkal szembeni reziszten- 10 ciát meghatározó plazmidot tartalmazó transzformánsokat E. coli KI2 BE783/pKC264 jellel jelöljük. Egy ilyen transzformánst szelektálunk, szélesztünk, tenyésztünk és felhasználunk további plazmid-izolálásokhoz. A té- 15 mában jártas szakember előtt világos, hogy a 2 μ nagyságú dezoxi-ribonukleinsavat mindkét irányban kapcsolhatjuk, és így a pKC264 plazmid és ugyanakkor a fordított orientációjú plazmidok is létrejönnek a fenti eljárás· 20 során. A különböző plazmidok és a kapott transzformánsok könnyen izolálhatok és azonosíthatók, ismert módszerekkel. A pKC264 plazmid restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 8. ábrán mutatjuk be. 25

30. példa

A pLO314 és a pLO315 plazmidok és az E. coli KI2 BE783/pL0314 és az E. coli K12 BE783/pLO315 transzformánsok elő- 30 állítása

A) A pKC259 plazmid emésztése BglII enzimmel

A 28B. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pÚR222 plazmid, a ³⁵ Haell restrikciós enzim és az enzimhez tartozó reakcióelegy helyett a pKC259 plazmidot, a BglII restrikciós enzimet és az enzimhez tartozó reakcióelegyet használjuk. A kapott BglII enzimmel hasadó fragmenseket ⁴⁰ 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk.

B) A pSV5 gpt plazmid emésztése a BglII enzimmel

Az emésztést a 28B. példában megadottak 45 szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pUR222 plazmid, a Haell restrikciós enzim és az enzimhez tartozó reakcióelegy helyett a pSV5 gpt plazmidot, a BglII restrikciós enzimet és az ehhez az enzimhez tar- 50 tozó reakcióelegyet használjuk. A BglII fragmenseket 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk.

C) Ligálás és transzformálás 55

A ligálást a 28C. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC26l és pUR222 emésztett plazmidok helyett a pKC259 és a pSV5 gpt plazmidok BglII enzimmel kapott fragmenseit használ- go juk. A ligációs eleggyel E. coli K12 BE783 sejteket transzformálunk Wensink módszere szerint (1974) olyan TY lemezeken, amelyek ml-enként 20C μg higromicin B antibiotikumot tartalmaznak. Egyes transzformánsok _g5 a gél-elektroforézises (Rao és Rogers, 1978) és más vizsgálatok szerint kizárólag a pLO314 vagy a pLO315 plazmidot tartalmazzák. Ezeket a transzformánsokat szelektáljuk, szélesztjük és tenyésztjük, két törzset E. coli K12 BE783/pLO314 és az E. coli K12 BE783/ /pLO315 transzformánsoknak nevezünk. A transzformánsokat felhasználjuk a pLO314 és a pLO315 plazmidok további izolálására.

Mivel a dezoxi-ribonukleinsav-frágmensek mindkét irányban kötődnek, két orientációjú rekombináns plazmidot kapunk. Szakember számára érthető, hogy az előállítani kívánt plazmidokat könnyen megkülönböztethetjük és ismert módszerekkel, restrikciós enzimes analízissel és elektroforézissel azonosíthatjuk. A pLO314 és a pLO315 plazmidok restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 9. ábrán mutatjuk be.

31. példa

A Mouse Ltk'/pLO314 előállítása

A kísérletet a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett a pLO314 plazmidot használjuk. Az így kapott Mouse Ltk”/ /pLO3I4 transzformánsokat tömegesen tenyésztjük.

32. példa

A Mouse Ltk^_/pLO315 előállítása

A 4. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 helyett a pLO315 plazmidot használjuk. Az így előállított Mouse Ltk^_/pLO315 transzformánsokat tömegtenyészetben növesztjük.

33. példa

A pLO316 és a pLO317, valamint az E. coli K12 BE783/pLO316 és az E. coli KI2 BE783/ /pLO317 transzformánsok előállítása

A) A pKC257 plazmid emésztése SacI enzimmel, és a BglII linkerek hozzákapcsolása Az emésztést a 28B. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pUR222 plazmid, a Haell restrikciós enzim és a hozzá tartozó reakcióelegy helyett a pKC257 plazmidot, az SacI restrikciós enzimet és az ehhez az enzimhez tartozó reak·· cióelegyet (600 mmól nátrium - klorid, 100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,4, 100 mmól magnézium-kiorid) használjuk.

A BglII linkereket [(dCAGATCTG), Collaborative Research Inc., 1365 Main Street, Waltham, MA, 02154] a SacI enzimmel emésztett pKC257 plazmid-végekhez St. John és munkatársai szerint kötjük (J. Mól. Bioi., 152, 317, 1981).

B) Ligálás és transzformálás

A BglII végekkel rendelkező lineáris pKC257 plazmidot hozzákötjük a 30B. példa szerint előállított BglII enzimmel emésztett pSV5 gpt plazmidhoz. A reakciót a 30C. példában megadottak szerint végezzük. A ligációs eleggyel E. coli KI2 BE783 sejteket transzformálunk, a transzformálást a 30C. példá15

-15195248 bán megadottak szerint végezzük. A kapott E. coli KI2 BE783/pLO316 és az E. coli K12 BE783/pLO317 transzformánsokat felhasználjuk a pLO316 és a pLO317 plazmídok izolálására. Mint ahogy a 30C. példában megadtuk, két orientációjú plazmidot kaI púnk, attól függően, hogy milyen a beépíI tett rezisztenciát hordozó fragmens orientá! ciója. A plazmidokat és a kapott transzformánsokat ismert módszerekkel könnyen megkülönböztethetjük és azonosíthatjuk. A pLO316 és pLO317 plazmidok egy restrikI ciós helyét és funkcionális térképét mutatI juk be a mellékelt 9. ábrán.

K 34. példa

A Mouse Ltk^_/pLO316 és a Mouse Ltk^-/ β /pLO3!7 előállítása

Ι A 4. példában megadottak szerint járunk | el, a fenti két termék előállítására, azzal | a különbséggel, hogy a pKC2I4 plazmid heI lyett vagy a pLO316, vagy a pLO317 plazi midot használjuk. Az így kapott Mouse Ltk^-/ (Ι /pLO316 és a Mouse Ltk~/pLO317 transz{ formánsokat külön-külön tömegtenyészetben

I növesztjük.

35. példa

A pLO318 és a pLO319 plazmidok, továbbá az E. coli K12 BE783/pLO318 és az E. coli K12 BE783/pLO319 transzformánsok βίοι állítása

I A kísérleteket a 33. példában megadottak

I szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy f a pKC257 plazmid helyett a pKC261 plazmii dót használjuk. A kapott E. coli K12 BE783/ íj /pLO318 és az E. coli K12 BE783/pLO319 / transzformánsokat felhasználjuk a pLO318 / és a pLO319 plazmidok izolálására. Ahogy íj azt a 30C. példában ismertettük, attól füg'! gően, hogy a beépített rezisztenciát hordo| zó fragmens milyen orientációjú, két orientáI ciójú plazmidot kapunk. A plazmidokat és íjj a kapott transzformánsokat könnyen megküíj lönböztethetjük és ismert módszerekkel azonosíthatjuk. A pLO318 és a pLO319 plazmidok restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 9. ábrán adjuk meg.

36. példa

A Mouse Ltk~/pLO318 és a Mouse Ltk^-/ /pLO319 előállítása

A kísérleteket külön-külön a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy pKC214 plazmid helyett a ! pLO318 vagy a pLO319 plazmidokat haszí náljuk. Az így előállított Mouse Ltk^-/pLO318 í és a Mouse Ltk~/pLO319 transzformánsokat | külön-külön tömeges tenyészetben növesztjük, j 37. példa

A pLO321 és a pLO320 plazmidok, továbbá az E. coli K12 Bel041/pL0320 és az E. coli KI2 BE1041/pLO321 transzformánsok előállítása

A kísérleteket a 33. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC257 plazmid helyett a pKC275 jelű plazmidot használjuk. A kapott E. coli K12

BE1041/pL0320 és az E. coli K12 BE1041/ /pLO321 transzformánsokat felhasználjuk a pLO320 és a pLO321 plazmidok izolálására; Ahogy azt a 30C. példában kifejtettük, a beépített rezisztenciát hordozó fragmens ¹θ orientációjától függően két orientációjú plazmídot kapunk. A plazmidokat és a kapott transzformánsokat ismert módszerekkel könynyen megkülönböztethetjük és azonosíthatjuk. A pLO320 és a pLO32I plazmidok restrik15 ciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 9. ábrán adjuk meg.

38. példa

A Mouse Ltk^-/pLO320 és a Mouse Ltk^-/ ²⁰ /pLO321 előállítása

A 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pK214 plazmid helyett vagy a pLO320, vagy a pLO321 plazmidokat használjuk. Az előállított Mouse ²^ Ltk~/pLO320és a Mouse Ltk~/pLO321 transzformánsokat tömeges tenyészetben, külön-külön növesztjük.

39. példa

A pKC273 plazmid és az E. coli K12 BE783/ /pKC273 transzformánsok előállítása A) A 2 μ és ura⁺ gént tartalmazó, BamHI és a Sáli végekkel rendelkező, lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása

TE-pufferban lévő, 5 μΙ (5 μg) pYEp24 plazmidot, 5 μΙ ditio-treitolt, 5 μΐ (1000 mg/ /ml) borjúszérum albumint, 25 μΐ vizet, 5 μΙ (5 egység) BamHI restrikciós enzimet és 5 μΙ alábbi összetételű reakcióelegyet inku40 bálunk 37°C hőmérsékleten, 1 órán át: 1500 mmól nátrium-klorid, 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,9, 60 mmól magnézium-klorid. Ezután 70°C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, 5 percen át. A BamHI en45 zimmel emésztett dezoxi-ribonukleinsavat jeges fürdőben lehűtjük, etanollal kicsapjuk, 30 μΙ vízben oldjuk, az oldathoz 5 μΙ Sáli puffért adunk (1500 mmól nátrium-klorid, 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,9,

60 mmól magnézium-klorid), a reakcióelegyet μΐ ditio-treitollal, 5 μΙ (1000 mg/ml) borjúszérum albuminnal és 5 μΐ (5 egység) Sáli restrikciós enzimmel egészítjük ki. A kapott reakcióelegyet 1 órán át 37°C hőmérsékle55 ten inkubáljuk, majd 5 percen át 70°C hőmérsékleten tartjuk, végül 4°C hőmérsékletre hűtjük. Ezután fenollal, és kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyével extraháljuk, végül etanollal kicsapjuk. A kapott csapadék tartalmazza a lineáris dezoxi-ribonukleinsavat, ezt 5 μΙ, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk, és további felhasználásra 4°C hőmérsékleten tároljuk.

₆₅ B) A BamHI és az Sáli végekkel rendelkező, higromicin B rezisztencia gént tartal-

-16195248 mazó lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása

A lineáris dezoxi-ribonukleinsavat a 39A. példában megadottak szerint állítjuk elő. azzal a különbséggel, hogy YEp24 plazmid helyett a pKC259 plazmidot használjuk. A kapott csapadék tartalmazza a lineáris dezoxi-ribonukleinsavat, ezt 5 μΐ, 5 mmótos nátrium-klorid-oldatban oldjuk, és további felhasználásra 4°C hőmérsékleten tároljuk.

C) Ligálás és transzformálás

Az E. coli KI2 BE783 sejtek transzformálását és a ligálást a 28C. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 39A. és B. példák szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket használjuk a pUR222 és a pKC261 plazmidok Haell fragmensei helyett. A jigációt követően transzformációt végzünk. A kapott transzformánsok szelekciós, gél-elektroforézises (Rao és Rogers, 1978) és más vizsgálatok szerint tartalmazzák az adott plazmidot. Egy ilyen transzformánst E. coli K12 BE783/pKC273 jellel jelöltünk, szelektáltunk, szélesztettünk, tenyésztettünk, és a pKC273 plazmid izolálására használtunk. A pKC273 plazmid egy restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 10. ábrán adjuk meg.

40. példa

A Saccharomyces cerevi$iae/pKC273 előállítása

Élesztőt (Saccharomyces cerevisiae) növesztünk 1% élesztőkivonatot, 2% bakto-peptont és 1% glükózt tartalmazó táptalajon, ismert mikrobiológiai módszerekkel. Az élesztő pKC273 plazmiddal való transzformálását Hinnen és munkatársai szerint végezzük (Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 75, 1929, 1978). A transzformánsokat uracilmentes táptalajon való növekedési képességük alapján szelektáljuk (Ura⁺ fenotípus). Az Ura⁺ transzformánsokat megvizsgáljuk 200 mg/ml higromicin B-t tartalmazó komplett táptalajon való növekedésük szempontjából. Ez az antibiotikum-mennyiség letális nem-transzform'ált sejtekre. A Saccharomyces cerevisiae/pKC273 transzformáns sejtek növekednek ezen a táptalajon, míg a nem transzformálódott Saccharomyces cerevisiae sejtek elpusztulnak.

41. példa

A pLO378 plazmid és az E. coli K12 BE783/ /pLO378 transzformánsok előállítása

A) A pBR322 plazmid emésztése PstI enzimmel

A 28B. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pUR222 plazmid, a Haell restrikciós enzim és az ott megadott reakcióelegy helyett a pBR322 plazmidot, a PstI restrikciós enzimet és az alábbi összetételű reakcióelegyet használjuk; 500 mmól nátrium-klorid, 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,4, 60 mmól magnézium32

-klorid. A kapott PstI fragmenseket 5 μΙ, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk.

B) A pKC264 plazmid Psti enzimmel való emésztése

Az emésztést a 41A. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pBR322 plazmid helyett a pKC264 jelű plazmidot használjuk. A kapott Psti fragmenseket 5 μΙ térfogatú, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk.

C) Ligálás és transzformálás

Az E. coli K12 BE783 sejtek transzformálását ( és a ligálást) a 28C. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pUR222 és a pKC261 plazmidok Haell fragmensei helyett a 41A. és B. példákban megadottak szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket használjuk. A ligációt követően transzformációt végzünk. Egyes transzformánsok, ahogy azt az antibiotikum szelekciós, gél-elektroforézises (Rao és Rogers, 1978), és más vizsgálatok mutatják, tartalmazzák az adott plazmidot. Egy ilyen transzformánst E. coli KI2 BE783/ /pLO378 jellel jelölünk, szelektáljuk, szélesztjük, tenyésztjük és felhasználjuk a pLO378 plazmid izolálásához.

Ahogy azt a 30C. példában ismertettük, attól függően, hogy a beépített rezisztenciát hordozó fragmens milyen orientációjú, két orientációjú plazmidot kapunk. Ezért, a pLO378 plazmidon túlmenően, a fenti eljáás során fordított orientációjú plazmidok is keletkeznek. A témában jártas szakemberek könnyen megkülönböztethetik és azonosíthatják ezeket a plazmidokat, és ismert módszerekkel elkülöníthetik a kapott transzformánsokat. A pLO378 egy restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 10. ábrán mutatjuk be.

42. példa

A Saccharomyces cerevisiae/pLO378 előállítása

A transzformációt a 40. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC273 plazmid helyett a G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó gént tartalmazó pLO378 plazmidot használjuk. A transzformánsokat ismert módon választjuk ki úgy, hogy vizsgáljuk a recipiens élesztősejteket a plazmid dezoxi-ribonukleinsav jelenlétére. Az előállítandó Saccharomyces cerevisiae/pLO378 transzformánsokat könnyen azonosítjuk és izoláljuk.

Claims (27)

1. Eljárás higromicin B és G4I8 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó két különböző strukturgént és a hozzájuk kapcsolódó szabályozó szekvenciát hordozó pKC203 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy E. coli JR225 (ATCC 31912) sej17

-17195248 teket higromicin jelenlétében tenyésztünk és a tenyészetből izoláljuk a plazmid DNS-t, az izolált plazmid DNS-sel E. coli K12 BE827 sejteket transzformálunk, a transzformált E. coli K12 BE827 sejteket higromicin B je- 5 lenlétében tenyésztjük, a higromicin B és G418 antibiotikumokra rezisztens és ampicillinre érzékeny transzformánsokat szelektáljuk, végül a 15 kb nagyságú plazmidot a sejtekből izoláljuk. (Elsőbbsége: 1981.06.22.) 10

2. Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó két különböző strukturgént és a hozzájuk kapcsolódó szabályozó szekvenciát hordozó, prokariota sejtekben funkcionáló 15 pKC222 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított plazmidot BglII és Sáli restrikciós enzimekkel kezeljük, a keletkezett 2,75 kb nagyságú Sall/BglII restrikciós fragmenst izo- 20 láljuk és Sall-el és BglII-vel kezelt pKC7 plazmiddal ligáljuk. (Elsőbbsége: 1981.06.22.)

3. Eljárás a higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát mégha- 25 tározó, két különböző strukturgént és az ehhez tartozó szabályozó szekvenciát tartalmazó DNS szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a pKC203 plazmidot

a) BglII restrikciós enzimmel kezeljük, 30 majd a 7,5 kb nagyságú BglII restrikciós fragmenst izoláljuk vagy

b) BglII és Sáli restrikciós enzimmel kezeljük és a 2,75 kb nagyságú Sall/BglII restrikciós fragmenst izoláljuk. (Elsőbbsége: 35 1981.06.22.)

4. Eljárás a higromicin B és G418 antibiotikumok egyikével vagy mindkettővel szembeni szekvenciát meghatározó, két különbö- 40 ző strukturgént és az ehhez tartozó szabályozó szekvenciát tartalmazó DNS szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a pKC222 plazmidot

a) BglII és Sáli restrikciós enzimmel kezeljük és a mindkét antibiotikummal szembeni rezisztenciát hordozó 2,75 kb nagyságú Sall/BglII restrikciós fragmenst izoláljuk vagy

b) BglII és SacI restrikciós enzimmel ke- 50 zeljük és a higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó 1,51 kb nagyságú Sacl/BglII restrikciós fragmenst izoláljuk, vagy

c) Sáli és EcoRI restrikciós enzimmel 55 kezeljük és a G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó 1,65 kb nagyságú EcoRI/Sall restrikciós fragmenst izoláljuk. (Elsőbbsége: 1981.06.22)

5. Eljárás a higromicin B és G418 anti- θθ biotikumok egyikével vagy mindkettővel szembeni rezisztenciát mutató, a 3. vagy 4. igénypontok szerint előállított restrikciós fragmensek vagy származékaik bármelyikét tartalmazó, prokariota sejtekben funkcionáló alá-bbi plazmidok:

a) pSC701,

b) pKC257,

c) pKC259,

d) pKC261,

e) pKC275és

f) pKC264, előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a 3a) igénypont szerint előállított 7,5 kb nagyságú BglII fragmenst DNS ligázzal kezeljük, majd

b) az a) eljárás során kapott pSC701 plazmidot HaelII restrikciós enzimmel kezeljük és a kapott fragmenst DNS ligázzal kezeljük, a keletkezett plazmidok elegyével E. coli K12 BE783 sejteket transzformálunk, a transzformált E. coli K12 BE783 sejteket higromicin B jelenlétében tenyésztjük, a higromicin B-re rezisztens transzformánsokat szelektáljuk és a 4,2 kb nagyságú plazmidot a sejtekből izoláljuk, majd

c) a b) eljárás során kapott pKC257 plazmidot Sau3 Al restrikciós enzimmel kezeljük és a kapott fragmenst DNS ligázzal kezeljük, majd

d) a c) eljárás során kapott pKC261 plazmidot és a pUR222 plazmidot külön-külön Haell restrikciós enzimmel kezeljük és a kapott fragmenseket egymással ligáljuk, vagy

e) az a) eljárás során kapott pSC701 plazmidot HaelII restrikciós enzimmel kezeljük, és a kapott fragmenst DNS ligázzal kezeljük, a keletkezett plazmidok elegyével E. coli K12 BE783 sejteket transzformálunk, a transzformált E. coli K12 BE783 sejteket higromicin B jelenlétében tenyésztjük, a higromicin B-re és apramicinre rezisztens transzformánsokat szelektáljuk és az 5,0 kb nagyságú plazmidot izoláljuk, majd

f) az e) eljárás során kapott pKC259 plazmidot és az YEp24 plazmidot külön-külön EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük és a kapott fragmenseket egymással ligáljuk. (Elsőbbsége: 1982.03.26)

6. Eljárás a higromicin B és G418 antibiotikumok egyikével vagy mindkettővel szembeni rezisztenciát mutató, a 3. vagy 4. igénypontok szerint előállított restrikciós fragmensek vagy származékaik bármelyikét tartalmazó, prokariota és eukariota sejtekben funkcionáló alábbi plazmidok:

a) pKC214 és pKC215,

b) pGDIO és pGDl 1,

c) pGD12 és pGD13, és

d) pGD14 és pGD15 előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a 3a) igénypont szerint előállított 7,5 kb nagyságú BglII fragmenst BglII-vel kezelt pSV5 gpt plazmiddal ligáljuk, vagy

b) a 4b) igénypont szerint előállított

1,51 kb nagyságú Sacl/BglII fragmenst BglII kapcsolókhoz kapcsoljuk és az így nyert terméket BglII restrikciós enzimmel kezelt pSV5 gpt plazmiddal ligáljuk, vagy

c) a 4c) igénypont szerint előállított

1,65 kb nagyságú EcoRI/Sall fragmenshez BglII kapcsolókat kapcsolunk és a kapott.

-18195248 terméket BglII restrikciós enzimmel kezelt pSV5 gpt plazmiddal ligáljuk, vagy

d) a 3b) igénypont szerint előállított

2,75 kb nagyságú fragmenshez BglII kapcsolókat kapcsolunk és a kapott terméket BglII restrikciós enzimmel kezelt pSV5 gpt plazmid dal ligáljuk. (Elsőbbsége: 1981.06.22J

7. Eljárás a higromicin B és G418 antibiotikumok egyikével vagy mindkettővel szembeni rezisztenciát mutató, a 3a) igénypont szerint előállított restrikciós fragmens vagy származékai bármelyikét tartalmazó, prokarióta és eukariota sejtekben funkcionáló alábbi plazmidok:

a) pLO314 és pLO315,

b) pLO316 és pLO317,

c) pEO318 és pLO319,

d) pLO321 és pLO320,

e) pKC273 és

f) pLO378 előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) az 5c) igénypont szerint előállított pKC259 píazmidot és a pSV5 gpt plazmidot külön-külön BglII restrikciós enzimmel kezeljük és a kapott fragmenseket egymással ligáljuk, vagy

b) az 5b) igénypont szerint előállított pKC257 píazmidot Sacl-el kezeljük, a lineáris termék végeihez BglII kapcsolókat kapcsolunk és a kapott terméket BglII restrikciós enzimmel kezelt pSV5 gpt plazmiddal ligáljuk, vagy

c) az 5d) igénypont szerint előállított pKC261 píazmidot Sacl restrikciós enzimmel kezeljük, a lineáris termék végeihez BglII kapcsolókat kapcsolunk és a kapott terméket BglII restrikciós enzimmel kezelt pSV5 gpt plazmiddal ligáljuk, vagy

d) az 5e) igénypont szerint előállított pKC275 píazmidot Sacl restrikciós enzimmel kezeljük, a lineáris termék végeihez BglII kapcsolókat kapcsolunk és a kapott terméket BglII restrikciós enzimmel kezelt pSV5 gpt plazmiddal ligáljuk, vagy

e) az 5c) igénypont szerint előállított pKC259 píazmidot BamHI, majd Sáli restrikciós enzimekkel kezeljük, ugyanakkor pYEp24 píazmidot BamHI, majd Sáli restrikciós enzimekkel kezelünk és a keletkezett frakciókat egymással ligáljuk, vagy

f) az 5f) igénypont szerint előállított pKC264 píazmidot és pBR322 píazmidot külön-külön PstI restrikciós enzimmel kezelünk és a kapott fragmenseket egymással ligáljuk. (Elsőbbsége: 1982.03.26J

8. Eljárás a higromicin B és G418 antibiotikumok egyikévei vagy mindkettővel szembeni rezisztenciát meghatározó, egy vagy két különböző strukturgént és az ehhez tartozó szabályozó szekvenciát tartalmazó DNS szekvenciákkal rendelkező plazmidokat'tartalmazó prokariota és eukariota sejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) valamely prokariota sejtet a 2—6. igénypontok bármelyike szerint előállított plazmiddal transzformálunk, vagy

b) valamely eukariota sejtet a 6. igénypont szerint előállított valamely plazmiddal transzformálunk. (Elsőbbsége: 198I.06.22J

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokariota sejtként E. Coli K12 sejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1981.06.22J

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokariota sejtként E. coli KI2 BE827 törzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1981.06.22J

11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy eukariota sejtként Mouse Ltk~ sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1981.06.22.)

12. Eljárás a higromicin B és G4I8 antibiotikumok egyikével vagy mindkettővel szembeni rezisztenciát meghatározó, egy vagy két különböző strukturgént és az ehhez tartozó szabályozó szekvenciát tartalmazó DNS szekvenciákkal rendelkező plazmidokat tartalmazó prokariota és eukariota előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) valamely prokariota sejtet az 5. vagy

7. igénypont szerint előállított bármely plazmiddal transzformálunk, vagy

b) valamely eukariota sejtet a 7. igénypont szerint előállított valamely plazmiddal transzformálunk. (Elsőbbsége: 1982.03.26J

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokariota sejtként E. coli K12 sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982.03.26)

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokariota sejtként E. coli K12 BE783, E. coli K12 BE827 vagy E. coli K12 BE1041 törzseket alkalmazunk. (Elsőbbsége: I982.03.26J

15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy eukariota sejtként Mouse Ltk^- sejtet vagy Saccharomyces cerevisiae sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982.03.26.)

16. Eljárás a 2. vagy 6. igénypont szerint előállított plazmidok fenntartására és stabilizálására, azzal jellemezve, hogy a píazmidot valamely gazdasejtbe transzformáljuk és a transzformált gazdasejtet higromicin B és/ /vagy G418 antibiotikum jelenlétében tenyésztjük és a túlélő sejteket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1981.06.22.)

17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. vagy 6. igénypont szerint előállított píazmidot valamely prokariota gazdasejtbe transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1981.06.22)

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokariota gazdasejtként E. coli K12 sejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1981.06.22.)

19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokariota gazdasejtként E. coli K12 BE827 törzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1981.06.22J

20. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerint előállított valamely píazmidot eukariota gazda19

-19195248 sejtbe transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1981.

06. 22.)

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy eukarióta gazdasejtként Mouse Ltk~ sejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 5 1981.06.22.)

22. Eljárás az 5. vagy 7. igénypont szerint előállított plazmidok fenntartására és stabilizálására, azzal jellemezve, hogy a plazmidot valamely gazdasejtbe transzformáljuk és 10 a transzformált gazdasejtet higromicin B és/vagy G418 antibiotikum jelenlétében tenyésztjük és a túlélő sejteket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1982.03.26)

23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal 15 jellemezve, hogy az 5. vagy 7. igénypontban előállított plazmidot prokarióta gazdasejtbe transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1982. 03.26.)

24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokarióta gazdasejtként E. coli K12 sejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége· 1982.03.26)

25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokarióta gazdasejtként E. coli K12 BE783, E. coli K12 BE827 vagy E. coli K12 BE1041 törzseket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982.03.26)

26. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerint előállított plazmidot valamely eukarióta gazdasejtbe transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1982.03.26)

27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy eukarióta gazdasejtként Mouse Ltk~ sejtet vagy Saccharomyces cerevisiae sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982.03.26)