JPS60227682A - 細菌の外来蛋白質の改良された生産のための発現プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の利用分野 本発明は細菌において外米蛋白質を発現せしめるための
組換えＤＮＡ技術Ｑこ関する。より詳しくは、大腸菌（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）においてプロキモ
シン及び哺乳類の成長ホルモンの有効な直接的発現方法
及びそのための手段に関する。

（７） 従来の技術 子牛レンニン（キモシン）、すなわちチーズ製造に使用
するための好適な牛乳凝固プロテアーゼは供給が不足し
ている。他の牛乳凝固剤、すなわちカビの蛋白分解酵素
が開発研究されてきた。しかし、これらの蛋白分解活性
が犬ぎいのでチーズの収量を低下させ、しばしば苦味を
与える。

牛乳凝固プロテアーゼの安定且つ光分な供給は経済的に
有利なので何人かの研究者がこの問題に糺換えＤ　Ｎ−
Ａ技術を適用してきた。Ｂｅｐｐｕ　ｅｔ　ａｌ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、９０　：　９０１−９０４（１９
８１）は大腸閑（Ｅ、　ｃｏｌｉ）のプロレンニン（フ
ロキモシン）の構造遺伝子のクローニングを報告してい
る。続く文献として、Ｂｅｐｐｕ　ｅ　ｔ　ａｔ　、　
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９１　：１０８５−１０８８
（１９８２）は大腸菌（Ｅ。

ｃ、ｏ　ｌ　ｉ　）の中でクローンされた子牛プロレン
ニンｃＤＮＡのヌクレオチド配列を報告している。

１ａｃＵＶ５プロモーターを有する発現プラスミドの構
成及びその大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダー
ゼの短いＮ−末端ペプチドＯこ結合されたプロ（８） キモシンペプチドのほとんどすべてを含有する融合蛋白
質を産生ずる能力はＢｅｐｐｕ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎ
ｅｌ　９　：　３３７−３４４　（１９８２）によって
記載されている。

１９８３年３月２日に公開されたヨーロッパ特許出願第
７３，０２９号は子牛プロレンニンＤＮＡ含有プラスミ
ド、該プラスミドで形質転換された微生物（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）及びそれらによるプロレンニンの発現を記載してい
る。

１９８２年７月２８日に公開された英国特許出願第２．
ｏ　９１，２７　ｌ　Ａ号は種々のプロモーター（Ｄ±
、ｐ更−グμ３１等）を使用して発現させることからな
るレンニン、プロレンニン及びプレプロレンニンを製造
する方法及び薬剤を開示している。プレプロレンニンを
コードしている開示されたＤＮＡ配列の１つには５′−
末端に転写プロモーターとりポゾーム結合部位が付加し
ている。プレプロレンニンをコードしているＤＮＡの開
始部位と転写プロモーターとリポゾーム結合部位を有す
るＤＮＡ断片との間の距離は変化する。

（９） １９８３年１月６日に公開された英国特許出願第２，１
００，７３７　Ａ号はキモシン、メチオニンキモシン、
プロキモシン、メチオニンプロキモシン、プレプロキモ
シンを製造する組換えＤＮＡ技術を記載している。大腸
菌＜Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ｔｒｐ　プロモーター−オペレ
ーター断片及び転写ターミネータ−１開始コドン、及び
リポゾーム結合部位として働くシンーダルガルノ（Ｓｈ
ｉｎｅ　−Ｄａｌｇａｒｎｏ　）　（ＳＤ）配列を有す
るベクターが開示されている。ＳＤ配列とＡＴＧ配列と
の間隔の効果についての研究も示されている。

１９８３年４月２０日゛に公開されたヨーロッパ特許出
願第７７．１０９号は、プレプロキモシンのための遺伝
子及び二重１ａｃＵＶ５または修飾されたｔｒｐ系のよ
うな特異的ＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子、すなわちプ
ラスミド、及びそれらを使用して微生物（ラクトバチリ
（１ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、　ストレプトコツキ（
５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　）、バチルス（ｂａｃｉ　
ｌ　ｌｕｓ　）または酵母）を形質転換させてその対立
形質又は成熟形としてプレプロキモシンを生（１０） 成する形質転換体を形成することを記載している。

ヨーロッパ特許出願筒３６，７７６号（，１９８１年９
月３０日公開）は、減衰領域が削除された一つプロモー
ターーオペレーターを有する発現ベクター、及びその製
造方法を記載している。このベクターを有する形質転換
体はトリプトファンに富んだ培地で生育し得、菌体の生
育は、ｔｒｐプロモーター−オペレーター系の制御の下
で他の挿入物によってコード化された外米ペプチドの早
熟発現によって阻害されることなく進行する。

Ｂ）ｍｔａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｃｌ、　Ｓｃｉ。

８０：３６７１−３６７５．１９８３および日本特願昭
５８−３８，４３９号（１９８３年３月９日出願）はプ
ロキモシンｃＤＮＡ及び大腸菌ＣＥ。

ｃｏｌｉ）　ｔｒｐオペロンを有するハイブリッドプラ
スミドの構成、及び前記研究者ζこよる報告例より多く
プロレンニンを発現させるための用法を開示している。

さらに上記日本出願の１９８３年１１月１５日付手続補
正書によるとＳＤ配列とプロキモシンの開始コドンとの
間隔を変化させることによる効果及びプロキモシンのＮ
−末端アミノ酸を長さの異なるペプチドに換えることに
よる効果０こ部分的に言及している。

Ｈａｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１０：２１７７−２１８７（１９
８２）はプレプロキモシンのためのｃＤＮＡコードのク
ローニング及びヌクレオチド配列を報告している。Ｇｏ
ｆｆｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　２７．３５−４−６（１
９８４）は酵母であるザツカロマイセス・セレビシアエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）　ｊこおける子牛プロキモシンの発現を記載している
。プレプロキモシンｃＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ
開裂地図及びＤＮＡ配列は出版されて２すＣＢｅｐｐｕ
　ｅｔａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９１　：　１
０８５−１０８８（１９８２）：）、不明、ｖｌｌ書に
も参考のため図面として添付している。

呻乳類の成長ホルモン（ヒト上皮生長因子Ｃｈ、−ＥＧ
Ｆ）を含む）は動物の代謝を改善する効力があるのでか
なり重要である。それらの一般的々使用は、非常に入手
源が限られているため制限されてきた。上記ホルモンを
適当に供給すれば経済上の利益があるので数人の研究者
が組換えＤ　Ｈ’　Ａ技術をこの問題に適用してきた。

ヒト上皮成長因子ＣＥＧＦ）すなわちウロガストロンは
上皮組織成長の促進剤であるだけでなく胃酸分泌の有効
な阻害剤でもある。ＥＧＦの効力全体については主とし
て充分な材料がないので研究されていなかった。

ウロガストロンの構造遺伝子及びそのポリペプチド同族
体の遺伝子の製造、クローニング及び発現のために組換
えＤ　Ｎ’　Ａ技術を使用することは国際特許出願／ｌ
ｆｉ　８３　／　０４０３０　（１９８３年１１月２４
日公開）に肖己載されている。

ウシ生長ホルモンｍ　ＲＮ　Ａに相補性のＩＪ）ＮＡの
クローニング、そのヌクレオチド配列及び該配列から予
測される相当するアミノ酸配列がＭｉｌｌｅｒらのヨー
ロッパ特許出願筒４７，６００号（１９８３年３月１７
日公開）およびＪ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２５５．７５
２１−７５２４（１９８０）、及びＷｏ　ｙ　ｃ　ｈ　
ｉ　ｋらのＮｗｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ、ｓ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　１０．７１９７−（１３） ７２１０（１９８２）ｉこ報告されている。英国特許出
願箱２，０７３，２４５　Ａ号（１９８１年１０月１４
日公開）及びＫｅｓｋｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉ
ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　９．１９−３０（１９８１）ｌ
こはウシ生長ホルモンのクローニング及び大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）ＢＢｌｏｌの中で融合したベーターラクタマ
ーゼーウシ成長ホルモン蛋白質として発現させることを
述べている。

ウシ生長ホルモン遺伝子を発現させる方法、プラスミド
及びそれを使用するためのプラスミド宿主がヨーロッパ
特許出願筒６７，０２６号及び第６８．６４６号（各々
１９８２年１２月１５日、１９８３年１月５日に公開）
に記載されている。

各々の出願には宿主微生物として大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ
）が開示されている。後者の出願、すなわち米国特許第
４，４４３．５３９号（１９８４年４月１７日発行）ノ
ヨーロッハ特許出願はサツカロミセス・セレビシＩｘ　
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）を宿主微生物として開示している。

Ｓｅ　ｅ　ｂｕｒｇら、ＤＮＡ、２　’３７〜４５（１
９８３）ｔ］７ＬＡ はウシまたはブタ脳下垂体からのボＩＪ　（Ａ）つＲＮ
Ａを使用して製造されたｃＤＮＡの細菌におけるクロー
ニング及び成熟動物（ウシまたはブタ）の生長ホルモン
の有効な細菌での産生を達成する発現ベクターの構成を
報告している。採用される技術は、Ｇｏｅｄ、ｄｅｌ　
ら、Ｎａｔｗｒｅ　、　２８１．５４４−５４８（１９
７９）において大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）においてヒト成
長ホルモンの直接発現０こついて記載された方法と類似
のものである。各々の場合、使用される細菌の発現ベク
ターは大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）　ｔｒｐプロモーターの
制御下に使用された。ヨーロッパ特許出願第１０３，３
９５及び１０４，９２０号（１９８４年３月２１日及び
４月４日公開）にはウシ成長ホルモン様ポリペプチド及
びブタ成長ホルモン様ポリペプチドを各々組換えＤＮＡ
技術で生産したことを記載している。

ウシ成長ホルモンを酪農用の十に投与すると乳の量が増
加し、飼料摂取対乳量の比を改善するＣＭａｃｋｌｉｎ
、　Ｊ、　Ｄａｉｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　５６１５７５
−５８０（１９７３）〕。１１９８３８８３３日こ公開
されたヨーロッパ特許出願第８５，０３６　Ａ号は生合
成されたＣｒＤＮＡによる）ウシ成長ホルモンおよび／
またはその断片もウシの乳量ヲ増し、ブタや他の畜産用
動物の肉、毛、卵、毛皮の生産を増加することを開示し
ている。

１ｂ８０年４月１６日に公開された英国特許明細書簡１
，５６５，１９０号は微生物を形質転換できる組換えプ
ラスミドベクターであってそのヌクレオチド配列の中に
ある動物種の成長ホルモンをコードしているサブ配列を
有するものを開示している。米国特許第４，２３７，２
２４号は外米Ｄ　Ｈ’　Ａを単細胞微生物に導入するた
めのプラスミドベクターを記載している。

選択された真核生物のＤＮＡ断片のためのＨｉｎｃ１ｍ
挿入部位を有し、該部位がｔｒｐプロモーターのような
細菌のプロモーターに隣接しており、該ＤＮＡ断片の転
写及び翻訳が上記プロモーターによって制御されるプラ
スミドが米国特許第４．３４９，６２９号に記載されて
いる。

クローン化された遺伝子の発現のレベルは遺伝子複写の
数及び転写と翻訳の効率のような因子の数によって影響
される。挿入された遺伝子の効率的な転写を行うには強
力なプロモーターを必要とし、効率的な翻訳を行うには
ｍＲＮＡの中の適当々リポゾーム結合部位及びｒｂｓと
翻訳開始コドンとの間の適当な間隔を必要とする。プロ
モーターは蛋白質をコードしているＤＮＡ（構造遺伝子
）のその部分より先に位置する。リボゾーム結合部位（
γｂｓ）、すなわちリポゾーム確認配列は少くとも３〜
９ｂｐの長さのシンーダルガルノ（５ｈｉ−ｎｅ　−Ｄ
ａｌｇａｒｎｏ）　（ＳＤ　）配列として知られる配列
からなると信じられている。蛋白質のアミン末端メチオ
ニンをコード化しているＡＵＧより３〜１１ｂｐ上流か
ら始まり、１６８ＲＮＡの３′−末端配列に対して相補
性である。１つの遺伝子に対する翻訳開始信号（ＡＵＧ
　）からプロモーターが分離すると産生される蛋白質の
量に影響する（、　Ｇｉａｒａｎｔ　ｅら、上記文献、
および本明細書中で引用の文献）。この文献及び１９８
２年６月１日に発行のＰｔａｓｈｎｅらの米国特許第４
，３３２，８９２（１７） 号には、発現に際して遺伝子の５７−末端からの種々の
距離に“移動性プロモーター″′断片を置く効果を記載
している。

ヌクレオチド配列の明確な変形、特にＳＤ領領域間開始
コドン間の変化についての効果ζこ関する他の参考文献
は以下の如くである： ５ｃｈｅｒｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ’ｒｉ、ｃｌ　、
　Ａｃ１ｔｌｓ　Ｒｅｓ’、人：３８９５−３９０７（
１９８０）　：’５ｈｅｐａｒｄ　ｅｔ　ａｌ’、。

ＤＮＡ　１　：１２５−１３１（１９８２）：Ｗｉ＝ｄ
ａｓｓｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃｉ’ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、　１０　：　６６３９−６６５７（１９８２）　
：Ｄｅ　Ｂｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ　２　：　２
３１−２３５　（１９８３）　：　Ｔａｃｏｎ　ｅｔ　
ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃ、ｇｅｎ”＝Ｇｅｎｅｔ　、　１７
７．４２７−４３８（１９８０）；およびＩｔｏｈ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　ＤＮＡ３．１５７−１６’５　（１９８
４）。

本発明は、高レベル外米遺伝子発現のために一般的に有
用なプロモーターｒｂｓ発現要素；外米蛋白質（原核ま
たは真核）の直接発現のための発現要素を有する発現プ
ラスミドであって、適当な細菌に導入されれば予期せぬ
程且つ驚く程高レベル（１８） の蛋白質を発現し得る組換え微生物を形成するもの；そ
の構成方法；該プラスミドを菩む組換え大腸菌（Ａ”４
復１）形質転換体：および上記外米蛋白質を産生ずる組
換え微生物の用途に関する。よりＰ細には、本発明はプ
ロキモシンのような蛋白質およびウシとブタの成長ホル
モン及びヒト上皮成長因子のような哺乳類の成長ホルモ
ンをコード化している外米遺伝子の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）による高度のレベルの発現、特Ｏこそのために有用
な発現プラスミドに関する。上記プラスミドは、選択で
きるマーカー；レプリコン、すなわち宿主細胞０こおけ
る自律的表複写をコントロールする領域からなるＤＮＡ
配列、および合成りＨＡＩ）ンカーによって上記外米蛋
白質ｃＤＮＡ配列（遺伝子）に結合さ扛ている大腸菌Ｃ
Ｅ、ｃｏｌｉ）　ｔｒｐプロモーターから々す、長さを
変化させることができる新規なりポゾーム結合領域から
なる。本発明のプラスミドの特徴はＡＴＧ開始コドンよ
り上流にあるリポゾーム結合領域にヌクレオチド配列５
’ＴＡＡＡＡＡ−ＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧ　３　’ま
たは５　’　ＴＡＡＡＡＡＧＧＧ−ＴＡＴＣＧＡＧＡＡ
Ｔ’／’ＣＡＴＧ３’　が存在することである。本発明
の一好適発現ブラスミドはシンーダルガルノ配列の直前
の蛋白質をコードしている配列として同じ読み取り枠内
に翻訳停止コドンＣＴＡ、Ａ）をさらに有意な特徴とし
て有している。

分子生物学の技術の状態では、光分Ｏこ開発されたレベ
ルである蛋白質またはポリペプチドを発現すべきハイブ
リッドプラスミドのインビトロでの形成は、上記ポリペ
プチドをコード化しているｃＤＮＡ配列および該配列の
制限エンドヌクレアーゼ開裂地図の知識から可能である
。しかし、こ扛にもかかわらず、プラスミド内Ｏこ特定
の臨界的でさえある配置で上記Ｄ　Ｎ’　Ａ配列を適当
に微生物に導入すると、ポリペプチドを有意且つ予期し
得ない程０度に発現させるであろうということを示唆す
る根拠は当分野において何ら存在しない。

ここに記載の組換え微生物は、以前に報告されている微
生物が産生じ、初期に６組換えＤＮＡ技術Ｏこよって経
済的規模で産生じたよりも有意Ｑこ太ぎな収量で外米蛋
白質を発現する。

当業者は知っているとおり、組換え微生物は多くの方法
、たとえば形質転換、形質導入、接合、トランスフェク
ションによって製造によって製造できる。したがって、
“組換え微生物″′という用語には、上記いずれの方法
によって製造されようが外米蛋白質を産生じ得る微生物
を含める。別法として、本明細書で使用する組換え微生
物の定義にはその微生物が組換え技術により製造された
場合外米または外因性配列の外米蛋白質を発現せしめる
ことができる微生物を含める。

゛本発明のもう１つの目的は、転写プロモーター配列よ
り下流に細菌のプラスミドに挿入した場合大腸菌ＣＥ、
ｃｏｌｉ）において効率のよい発現を行なわせる原核生
物または真核生物の蛋白質をコード化している遺伝子の
りホゾーム結合部位について本明細書で記載したヌクレ
オチド配列を得ることである。記載されたりポゾーム結
合部位領域はＡＴＧ開始コドンのすぐ上流の都合の艮い
Ｅｃ。

ＲＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含み、これによ
って、蛋白質翻訳開始コドンを含むＤＮＡ（２１） 断片を発現ベクタ〜のＳＤ配列の後に挿入する方法を提
供する。換言す扛ば、ここで述べる発現プラスミドの遺
伝子は原核生物の蛋白質か真核生物の蛋白質をコード化
している遺伝子ならよい。たとえば、ここで記載する、
リポゾーム結合部位とＡＴＧ開始コドンとの間のヌクレ
オチド配列は、プロキモシン（プロレンニンン）、ウシ
成長ホルモン、ブタ生長ホルモン、ヒト上皮成長因子（
ウロガストロン）のようなｃＤＮＡ配列の高度の発現を
可能にする。これらの蛋白質、すなわちウシおよびブタ
成長ホルモン及びヒト上皮成長因子は一括して哺乳類成
長因子と称さ扛ている。

特定の外米遺伝子を細歯ζこよって生産するとアミノ末
端にメチオニン残基を有するがあるいは有しないポリペ
プチドを産生できる。したがって、”フ、ロキモシン″
′（フロレンニン１．６用ｆｆｍはメチオニンプロキモ
シン（プロレンニン）及びプロキモシン（プロレンニン
）を含むものとする。同じことは本明細書で述べる他の
ポリペプチドについてもいえる。さらに、”キモシン″
（レンニン）ｔつＱ） というときは、その既知の対立形質（たとえば、Ａ、Ｂ
、など）も含めるものとする。

本発明は下記例及び添付図面によりさらＯこ詳しく説明
されるが本発明の範囲を限定するものではない。

第１図はプラスミドｐＰＦＺ＃２およびＲ４ＣｐＰＦ’
Ｚ−Ｒ）の構成を示すｐ　ｐＦｚ　−ｈ　２およびＲ４
の各々に共通の制限地図を含む概、略図である。

図中矢印はｔｒｐプロモーター配列からプロキモシン（
プロレンニン）遺伝子（太い断片として表わした）へと
発現する方向を示している。合成挿入物は空白の箱状の
形で表わした。

第２図はプラスミドｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２およびＲ４の構
成のための手順を示す概略図である。

第３図はプラスミドｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２−Ｒ４８及びｐ
ｔｒｐＬＩ−Ｒ４−Ｒ４Ｂの構成のための手順を示す概
略図である。

第４図はプラスミドｐＰＦ’Ｚ−ｉン２およびｐＰＦＺ
−Ｒ４の各々についてのプロキモシン（プロレンニン）
遺伝子のりボゾーム結合部位と開始コドンＣＡ、ＴＧ）
との間のヌクレオチド配列と間隔を示す概略図である。

こ扛は上記プラスミドがヌクレオチド配列において異な
る鎖酸のみを示す。

第５−１及び５−２図は、全長のｂＧＩｉ遺伝子及び発
現配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略
図である。プラスミドｐＢＧＨ−１０２はｐＢＲ，３２
２のアンピシリン耐性遺伝子ｌこクローンされたｂＧＨ
ｃＤＮＡ配列（黒く塗った箱形）を含む。ｂＧＨの新し
いアミン末端をコードしている合成り　Ｈ’　ＡをｂＢ
Ｒ３２２（点線の箱形）のＥｃｏＲ１部位とＨｉｎｄＴ
１１部位に挿入した。種々のインビトロでの複製を行っ
て完全な修飾されたｂＧＨ遺伝子を担持するプラスミド
ｐＢＧＨ’−２１２を構成した。プラスミドｐＢＧＨ−
２１２はＥｃ、　ｏ　ＲＩによって開裂され、ｔｒｐプ
ロモーター−オペレーター配列の異なる変化したものを
有するＤＮＡ断片を挿入した。矢印は配列解読の５′→
３′方向、すなわち転写の方向を示す。

第６−１及び６−２図はｂＧＨ産生のための細菌の発現
プラスミドの構成を示す概略図である。

プラスミドｂＢＧＩｉ−２１２−Ｒはｔｒｐプロモータ
ー配列（第５図参照）ｉこよって成熟ｂＧＨを完全に直
接発現させる遺伝子を担持している。これらのプラスミ
ドはＨｉｎｔｉｍによって開裂され、Ｐ−ｖπ■によっ
て部分的に切断され、２つの約９２０ｂｐＨｉｎｄ　Ｉ
Ｉ　−Ｐｖｒｂ　ＩＩ断片を単離した。ｂＧＨのＣ−末
端をコードする合成りＮＡ断片がｐＢＲ３２２（空白の
箱形）のＥｃｏＲ１部位およびＨｉｎｔ１ｍ部位に挿入
された。このサブクローンはｐｖｒｂ　Ｉｆおよびｆｌ
　ａ　ｍＨＩで開裂され、３６５ｂｐＤＮＡ断片を単離
した。ＨｉｎｔｉｍとＢａｍＨＩで開裂後大きいベクタ
ー断片（３９９５ｂｐ）をｐＢＲ３２２から単離した。

これら２つのプロモーターｂＧＨ遺伝子含有断片（９２
０ｂｐ）を別々に合成り　Ｈ’　Ａ含有断片Ｃ３６５ｂ
ｐ）およびベクター断片（３９９５ｂｐ）と混合した。

この混合物をＴＡＩＪガーゼでつなげて適当な大腸菌Ｃ
Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１の形質転換に使用された
。異なるｂＧＨ発現プラスミドはｐＢＧＨ−３０１およ
びｐＢＧＨ−３７５と称される。

矢印はｔｒｐプロモーター配列からの転写の方向及び配
列解読における５′→３′の方向を示している。

第７−１および７−２図はｐＧＨ遺伝子と発現配列の全
長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミド７）ＧＨ−２４はｐＢＲ３２２のアンピ
シリン耐性遺伝子の中にクローンされたｐＧＨｃＤＮＡ
配列（黒く塗った箱形）を有する。ｐＧＨの新しいアミ
ン末端をコードしている合成りＮＡはｐＢＲ３２２（点
線の箱形）のＥｃｏＲ１部位とＨｉｎｄ■部位Ｏこ挿入
された。インビトロで種々の複製を行い完成した修飾さ
れたｐＧＨ遺伝子を担持するプラスミドを構成した。

このプラスミドはＥｃｏＲｌによって開裂され、いろい
ろに変化させたｔｒｐプロモーター−オペレーター配列
を含むＤ　Ｈ’　Ａ断片を挿入した。矢印は配列解読の
５′→３′の方向、すなわち転写の方向を示す。

実施例 微生物 本発明において使用されまたは製造された微生物及び組
換え微生物ならびにそれらが入手された寄託機関は下記
のとおりである： 大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）　Ｃ６００、ＣＲ３４としても
公知、ＡＴＣＣ２３７２４ 大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）ＮＲＥＬＢ−１１３７１、Ａ、
Ｔ　ＣＣ３６９４ 大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）ＭＭ２９４．ＡＴＣＣ３３６２
５大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）Ｗ３１．１０　ＡＴＣＣ２７
３２５ｐ　ＰＦＺ　−Ｒ２を有する大腸菌ＣＥ、ｃｏｌ
ｉ）ＨＢ　１０１ＡＴＣＣ３９５４４ ｐＰＦＺ−１１４を有する大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）ＨＢ
ｌｏ　１ＡＴＣＣ３９５４３ 当業者は知るとおり、上記宿主の代りにいかなる形質転
換可能な大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）　Ｋ　−１２株も本発
明において使用できる。さらに、プロテアーゼを有しな
い大腸菌株は当業者も認めるとおり上記大腸菌株と同等
あるいはそれより艮好な結果をもたらす。　− 上記組換え微生物ＡＴＣＣ３９５４３及び３９５４４は
１９８３年１２月１４日にフ゛り：ペスト条約の下でア
メリカ合衆国メリーランド州ロックビルのアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション、すなわち寄託を永
久的ζこ維持し特許出願が特許ζこ橙ったら一般公衆る
こ分譲する公認の寄託機関Ｑこ寄託された。これらの菌
株には上記受託番号が与えられた。これらの寄託物は本
願が３７ＣＥＩ１１１４および３５ＵＳＣ１２２の下に
適格性ありと合衆国特許商標庁の長官によって決定され
るものとして係属している間本願の相当する出願捷たは
その関連出願が出願された国の外国特許法により入手で
きる。寄託された微生物の公衆への分譲に対するすべて
の制限は特許の許可と同時Ｏこ不可逆的に取り除かれる
。

ＲＮＡの製造及びｃＤＮＡのクロー二くｌ地方の畜殺場
から動物の脳下垂体を得、そこからＨ，ＲＮＡをＵｌ　
ｌｒ　ｉ　ｃ　ｈら、５ｃｉｅｎｃｅ　１９６．１３１
３−１３１９（１９７７）の方法により単離した。ポリ
アデニル化ＲＮＡ’ｉオリゴＣｄＴ）セルロース上のク
ロマトグラフィーにより総ＩＩ　Ｎ　Ａから得た。二本
鎖ｃＤＮＡをこのＲＮＡから製造し、ｃＤＮＡＯサイズ
フラクションをプラスミドｐＢＩｔ３２２を使用して大
腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）中で標準的方法及び従来のホモポ
リマー方法でクローン化した。

ＣＭ’１ｌｌｅｒ＋　Ｗ、ｌ　ｅｔ　ａｌ、　１９８０
ｓ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋２５５．７５２１、Ｇｏ
ｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９７９　：Ｎａｔｕｒｅ
　２８１．５４４−５４８　；　Ｓｅｅｂｕｒｇ　ｅｔ
　ａ、１．。

１９８３、ＤＮＡ　２．３７−４５） プラスミドを有する、ｃＤＮＡで形質転換されたコロニ
ーをニトロセルロースフィルター上にレプリカ平板法に
より移植した。形質転換体コロニーを有するフィルター
をＧｒｒｂｎｓ　ｔ　ｅ　ｉｎおよびＪ−１’ｏｇ−ｎ
ｅｓｓの方法（１９７５、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、、Ｓｃｉ。

７２、ｊ９６１−３９６５）によってハイブリダイゼー
ションのために処理した。公開されたｃＤＮ’Ａ配列か
ら誘導された配列を有する放射性同位元素標ｉ合成オリ
ゴヌクレオチドをプローブとして使用してクローン化ｃ
ＤＮＡを検出した。ノ・イブリッド化しているコロニー
を５ｍ１ＬＢ中で生育させ、製造されたプラスミドＤＮ
Ａおよびクローン化された配列は制限エンドヌクレアー
ゼによる開裂に続いてＤＮＡ断片のゲル中での電気泳動
によって（２９） 特性をしらべた。

出発プラスミド プラスミドｐｃＲ１０１はＮｉ　ｓ　ｈ　ｉｍｏ　ｒ　
ｉら、Ｇｅｎｅ、。

１９：３３７−３４４（１９８２）によって記載されて
いる。このプラスミドはプロキモシンの全長ｃＤＮＡ、
すなわちアンピシリン耐性のための遺伝子を有し、５６
．７８ｂ７）からなる。このプラスミドはＨｉｎｄｍの
開裂部位といくつかのＢａｍＨ１部位を有する。

プラスミドｐｔｒｐＬＩはＥｄｍｔｖｎら、１Ｖａｔｓ
ｂｒｅ２９１；５０３−５０６（１９８１）に記載され
、プラスミドｐＢＲ，３２２はＢｏ　ｌ　１ｖａｒら、
Ｇｅｎｅ　２　：９５＝、１１３（１９７７）によって
報告されている。

材料１ 制限エンドヌクレアーゼ（Ａｓｕｌ、ＢａｍＨＩ。

Ｅｃｏ　Ｒ１１Ｈｉｎｔｉ　ＩＩＩ、Ｃ１ａ　Ｉ、　Ｈ
ｉｎｆ　Ｉ　、　Ｋｐｎ　Ｉ。

Ｐｓ　ｔ　Ｉ、−ＰｖｕＨ１Ｅｓａ■、５ａＩＩ）、Ｔ
４リガーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼＩ（大きい断片
）をニューイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇ　１７Ｂｉｏｌａｂｓ）から購入し、Ｉ“４ポリヌク
レオチドキ（Ｑ凸１ ナーゼはＰＬバイオケミカルズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）より得、細菌のアルカリ性ホスファターゼはベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲ
ｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　ＣＢＲ
Ｌ）より入手、子牛小腸アルカリ性ホスファターゼはベ
ーリンガー・コープＣＢｏｅ）ｒｓｉｎｇｅｒ　Ｃａｒ
ｐ）より入手した。

すべての酵素は上記製造元が推める条件下に使用した。

放射性化学物質はニューイングランド・ヌクレアー（Ｎ
ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ、　Ｍｂｃ　１ｅａｒ　）　（＃
ＥＮ）から購入した。蛋白質分子量の標準物はＢ′ＲＬ
より入手し、精製された子牛キモシンはシグマ・ケミカ
ル−カンパ＝　−Ｃ８ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏｒｒｖｐａｎｙ）より入手し、精製ｂＧＨはマイルス
ＣＭ’１ｌｅｓ）より入手した。

細菌はアンピシリン（２５μｇ／７）”！、たはテトラ
サイクリン（１０μ９／−）を含有するＬブロスＣＢｒ
ｏｔｈ）中またはＬ寒天プレート上ＣＡｌ１　ｌｌ　ｅ
ｒ　。

Ｊ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂａｒｂｏｒ　Ｌａｂｒａｔ
ｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ｐ４３３．１９７２）で３７℃で常法どおり生育させた
。大規模Ｏこプラスミドを製造するため０こは、対数期
の培養物をクロラムフェニコール（１７０μｇ／ｍｌ）
の添加によって増大させた［Ｃｌｅｗｅｌｌａｒｂｔｌ
　Ｈｅ１ｓｉｎｌｃｉ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
　１１０　：　１１３５（１９７２））。

プラスミド７）ＢＧＨ’−７は、Ｐｓｔ１部位にクロー
ンさせたｂＧＨの全長ｃＤＮＡを含むｐＢＲ−３２２か
らなり、Ｍ’ｉ　ｌ　ｌ　ｅｒ　＋　Ｗ、ら、Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　２５５．７５２１（１９８０）によっ
て記載されたようにして製造された。クローン化された
ｃＤＮＡは３１ｂｐの５′未翻訳配列、全プレホルモン
構造配列（６５１ｂｐ）、全３′未翻訳領域（１０ｉｐ
）、短いポＩＪ　（Ａ）、およびｄＣ−ｄＧ尾部を有す
る約８３０　ｐｂの長さである。プラスミドｐＧ１１’
−２４はそのＰｓｔ１部位Ｏこクローン化された全長ｃ
ＤＮＡを含むｐＢＲ３２２からなり、Ｓｅｅｂｕｒｇら
、ＤＮＡ　２．３７−４５（１９８３）によって記載さ
れた方法と類似の方法で製造された。ｐＧＩｉ−２４プ
ラスミドＤＮＡはテニス・ペレイラＣＤｅｎｎｉｓｐｅ
ｒｅｉｒα）によって構成され提供さ扛た。プラスミド
ｐＢＲ−３２２はすでにＢｏｌｉｖ（ｔｒら、Ｇｅｎｅ
ム９５−１１３（１９７７）によって報告されている。

オリゴヌクレオチド類の合成 合成オリゴヌクレオチド５’、ＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧ
。

３′（■〕および５’、ＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＴ、３’
（”）をホスファイト法［ＣａｒｌＬｔｈｅｒｓ　、　
Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ　。

１０３．１３８５（１９８１））によって化学合成し、
６Ｍ尿素−２０％ポリアクリルアミドゲルから精製した
。

１８−ｂｐおよび２２ｂｐ一本領オリゴマーを本明細書
記載の方法で合成し、本明細書記載の方法で４０−　ｍ
ａｒアダプターに形質転換した。二本鎖４０−　ｍｅｒ
は一本鎖１８−および２２−　ｔｎｅｒを公知方法によ
りアニーリングし、結合（ｌｉｇａｔｅ）することによ
って生成した。

ｐＧＨ’およびｂＧＨのために使用されたジゴヌクレオ
チドはＣａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｔｅ　ｔｒａｈｅｒｌｒ
ｏｎＬｅｔｔ、２４．２４５　（１９８３）のホスホラ
ミダイト法により合成され、断片は１１〜１６塩基の長
さく３３） の一本領オリゴマーから合成した。

大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）　ＤＮＡポリメラーゼ■のフレ
ナラ（Ｋｌ　ｅｎｏｖ　）断片を使用して二本鎖ＤＮＡ
の隠扛た３′末端の空白を満たす反応は本質的にＭａｎ
ｉａｔｉｓ　ら、Ｍｏｌｅｗｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋
　Ａ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨＣＬｒｂｏｒ　Ｌａｂ−ｏｒ
ａｔｏｒｙ’ｐ、１１３（１９８２）の方法に依った。

ＡＴＰのガンマホスフェートをＴ　４　ホＩＪヌクレオ
チドキナーゼによって合成リンカ−ＤＮＡの５′−ＯＨ
末端へ転移させることは上記Ｍａｎｉａｔｉｓ　の文献
に示されている。約２０μｇの二本鎖リンカ−ＤＮＡを
、７０　ｍＷ　トリス（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　Ｍ’
ｇＣ１３２，５ｍ、＆ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、
２０μＣ４〔ガンマ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（５０００Ｃｉミ
リモルー’：ＮＥＮ）を含有する２０μｅの反応混合物
中でホスホリル化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
１０単位）を加えて、反応を３７℃で１５分間行い、１
　μ１．の１０ｍＭ’ＡＴＰおよびＩＯ年単位１４キナ
ーゼを加え、反応をさらに３０分（３４） 間３７℃で行なった。キナーゼ処理したリンカ−は−２
０℃で貯蔵した。

必要ならば、末端の５′ホスフエートヲ細菌のアルカリ
性ホスファターゼ（ＢＡＰ）あるいは子牛腸アルカリ性
ホスファターゼＣＣＩＰ）のいずれかにより処理してＤ
ＮＡから除去した。［：　Ｃｈａｃｏｎａｓら、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５　：　７５　（１９
８０）　〕。

簡単に言えば、ＣＩＰによる処理においては、プラスミ
ドＤＮＡは適当な制限酵素によって切断を完了させエタ
ノニル中に沈殿させた。ＤＮＡのペレットをＣＩＰ反応
緩衝液（０，１Ｍグリシン、１　ｍＭ　ｈｆｇ　Ｃ４，
０，１ｍＭ　ＺｎＣｌ２、ｐｌＩ　１０．４　）中に最
終濃度１μｇ／１０μｌ緩衝液で再懸濁した。試料を６
５℃に１０分間加熱し、氷上で５分間？や却した。子牛
腸アルカリ性ホスファターゼを最終濃度０．５単位／Ｄ
ＮＡ１μｇとなるまで加えた。この混合物を３７℃で３
０分間インキュベートし、続いてフェノール−クロロホ
ルムにより抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させ
た。これらのＤＮＡペレットを蒸留水に再懸濁し、最終
濃度１００μＶｍｌとした。

Ｂ　Ａ、　Ｐ処理の場合は、プラスミドＤＮＡを選択し
た制限エンドヌクレアーゼで開裂し、エタノール中で沈
殿させた。ＤＮＡペレットヲ緩衝液（５０ｍＭ　Ｎａ　
Ｃ１１，１０ｍＭ’Ｍ’ｇＣ１２，１０ｍＭ　）リス、
１０ｍＭＤＴＴ）中に再懸濁した（最終濃度１μｇ／１
０μｌの緩衝液）。この反応混合物を６５℃に１０分間
加熱し氷−ヒで反応停止した。細菌のアルカリ性ホスフ
ァターゼを最終濃度５０単位／ＤＮＡ１μｇ丑で添加し
た。この反応混合物を６５℃で２時間インキュベートし
フェノール−クロロホルムで抽出し、Ｄ　Ｎ　Ａ　ｌａ
’ｆ＋片をエタノール中に沈殿させた。

細胞の発現プラスミドの構成は種々のプラスミドからの
ＤＮＡ断片を結合する操作からなる。すべての段階は添
付図面Ｏこ示されている。一般に、ＤＮＡ断片はゲルか
ら単離後精製され、２０〜５０ｔｔ（４の６６　ｍＡＯ
リス−ＨＣＩＣｐｌｉ　７．６　）、　５ｍＭ　Ａ／　
ｇ　Ｃ１３２，１ｍＭＡＴＰ、２０ｔｎＭＤＴＴ　＞よ
び１μｌのＴ　４１Ｊガーゼ（４００単位）中で他の断
片またはプラスミドＤＮＡに結合した。大腸菌ＣＥ、ｃ
ｏｌｉ）の能力細胞を標準的方法ＣＭａｎｔｌｅ　ｌら
、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５３．１．５４３（１９
７０））で調製し、上記配位結合混合物の半分で形質転
換した。

ＤＮＡ配列は化学的減成方法Ｃ，ＭＣＬｘａｍ　Ａ　ａ
ｎｄ。

Ｇ１１ｂｅｒｔ　、　Ｗ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ　、　６５．　：　４９９−５６０（１９８０）
］により末端標識ＤＮＡ断片を使用することによって決
定した。各リポゾーム結合部位領域は各々独立して二本
鎖の両方Ｏこ数回配列されていた。

プラスミドＤＮＡの大規模な製造は先行文献に記載のア
ルカリ性−８ＤＳ法し１３ｉｒｒＬｂｏｉｍら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓ、７：１５１３ｃ１−９７９
）」、続いてエチジウムフロミド−ＣｓＣ１１浮遊密度
遠心分離あるいは分画をバイオゲルＣＢｉｏｇｅｌ　）
Ａ−５０（バイオラド（Ｂｉ　ｏ　Ｒａｄ　Ｍ）カラム
を使用してＥｌ−Ｇｅｗｅｌｙら、Ａｎａｌ　、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　１０２　：　４２３−４２８（１９８０
）の方法により行った。小標品（３７） としてのＤ　Ｎ　Ａ、　ｉアルカリ性ＳＤＳ法（Ｅｉｒ
ｎｂｏｉｍら上記文献）の迅速にできる変法によって調
製した。

ゲル電気泳動 アガロース平板ゲル０．７〜１％をＭａｎｉａｔｉｓら
、上記文献ｐ１５０〜１６４の条件下に使用した。ゲル
を１５分間１μｇ／ｍｌのエチジウムプロミドで染色し
、ポラロイドフィルム（タイプ５．７、ＡＳＡ３０００
）をコダック・ラッテ７　ＣＫｏｔｌａｋ　Ｗｒａ−ｉ
　ｔ　ｅｎ）フィルタとともに使用して２６６ｎｍの紫
外線の照明で写真をとった。

５〜１２．５Ｘのアクリルアミドゲル（２０Ｘ１５　ｘ
　Ｏ，１５ｃＩｒＬ）を使用して１（Ｈｌｉ（ＬｔｉＢ
ら、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４：３７８７−３
７９４（１９７５）の方法により小さな（１，５ｋｂ未
満〕制限断片を同定した。アガロースゲルと同様にゲル
を染色し、写真をとった。

ＤＮＡ断片を、グル切片から０．１．　ＸＴＢＥ　１８
．９ｍＭトリス−ホウ酸塩、８．９ｍＭホウ酸、０．２
ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）を含有する透析バッグ中で電
気的に（３Ｂ） 溶出することによって精製した。

ｐＢＲ３２２’ｔ、たは発現プラスミド（ｐＰＦＺ　−
Ｒ２−１，たはｐＰＦＺ−Ｒ４）を含有する細菌培養物
を４μｊｊ／ｍｅチアミン、２５μｇ／ｍｌアンピシリ
ンおよび１００μｇ／ｒｄトリプトファンを含有するＬ
Ｂフロス捷たはＭ９ＣＡ培地ＣＭｎｎｉａｔｉｓら、上
記文献）中で一晩生育させた。これらの培養物をＭ９Ｃ
Ａ培地中にｌ：２５に希釈しＣＭａｎｉａｔｉｓらの上
記文献、トリプトファンなしでｔｒｐプロモーターの完
全導入を行なわせる）、また＆慴’９ＣＡ培地＋１００
μ／ｍｅのトリプトファンに１＝２５に希釈しく　ｔｒ
ｐプロモーターの導入を阻害し〕、あるいはＬＢ培地（
ネガテブコントロールとして〕にｌ：２５に希釈し、振
とうフラスコ中で細胞密度Ａ３６０＝１．０となるまで
生育させた。全細胞蛋白質抽出のために、２００μｌ培
養物に等しい細胞ペレットを２％ドデシル硫酸ナトリウ
ム、ＩＸβ−メルカプトエタノール中で溶解させ、蛋白
質を１０容量部の冷アセトン中に沈殿させた。沈殿させ
た蛋白質をＳＤＳ試料緩衝液中に再溶解し、アリコツト
を１０％または１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルＣＬａｅｗｎｌ　ｉ　＋　Ｎａｔｒｂｒｅ　２２７
゜６８０−６８５（１９７０）、１上で電気泳動にかけ
た。

標識された蛋白質の製造のためには発現培養物の１−ア
リコツトからの細胞ペレットを１ｍｌのＭ９ＣＡ添加培
地ＣＭ９ＣＡ塩、０．２％グルコース、４μｇ／づチア
ミン、２０μｇ／−標準アミノ酸（メチオニンとトリプ
トファン；２除＜））＋２５μｇ／−アンピシリンおよ
び７５　Ｃｉ　”Ｓメチオニン（ＮＥＮ　；　９７０　
Ｃｉ／ミリモル）中に懸濁した。１時間３７℃でインキ
ュベートした後、細胞をペレット化し、２００　Ｒ１４
の１０　ｍＭ　）リス（ｐＨ８，０）、１ｍＭＨａＥＤ
ＴＡｉこ再懸濁し、氷上に１０分間置き、最終濃度とし
てリゾチームを１ｍ９／ｎｄ！、まで、ＮＰ４０を０．
２％まで、ＮａＣ１）を０．３５　Ｍまで添加した。溶
解物を１０　ｍＭＭｇｃ１１２に調節し、氷上で３０分
間５０μ、！ｉ’／　ｍｌのＤＮＡ分解酵素ＣＤＮａ５
υＩ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）製）とインキュベートした
。

不溶物を緩やかな遠心分離で除き、このペレットフラク
ションをＳＤＳ試料緩衝液中Ｏこ溶解した。

上清試料をウサギ抗プロレンニン抗体（Ｂｅｐｐｕ　。

Ｇｅｎｅ１９．３３７−３４４）およびブドウ球菌吸着
剤（Ｐａｎ５ｏｒｂｉｎＩＣａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ）で
Ｋｅｓｓｌｅｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎ　ｏ　ｌ　ｏ　ｇｕ±１７　：１４８２−１
４９０の方法により免疫沈殿させた。試料をＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（Ｌａ　ｅｍｍｌ　ｉの上
記文献）し、−７５℃でコダック（Ｋｏｔｌａｋ　）　
ＸＡＲ２フィルムとコルネツクスＣＣｏｒｎｅｘ）ライ
トニングプラスＣＬｉｇｈｔｎｉｇ　Ｐｌｕｓ）強化ス
クリーンで螢光写真法を行う前に強化した（エンライト
ニング（Ｅｎｌｉ−ｇｈｔｎｉｎｇ　：　ＮＥＮ　）　
）。

発現レベルの定量化 発現培養物によって産生された外米蛋白質の量の測定は
細菌培養物からの全蛋白質抽出物を含有する蛋白質ゲル
をデンシトメーターによって走査することにより測定し
た。総細胞蛋白質抽出物の５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルの個々のレーンをベック７　：ｙ　（Ｂｅｃｋｍｃ
ｖｎ）ＤＵ−８Ｂデンシトメーターを使用して分析した
。乾燥したコーマシー青（４１） 染色５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを各レーンζこお
いて走査して外米蛋白質帯における総細胞蛋白質のパー
セントを測定した。対照培養物（ｐＢＲ３２２ベクター
含有）からの総細胞蛋白質の疋査図を使用して組換生成
物のサイズに一部するゲルの領域における生米の蛋白質
含量を測定した。対照培養物中の児かけ上のバックグラ
ウンドピークを補正後、発現レベルを総細胞蛋白質のパ
ーセントとして測定した。蛋白質ゲルは５７９ｎｍで走
査した。

結果 プラスミドｐｔｒｐＬＩはＨｉｎｃｌ　ＩＩＩ　−Ｃ１
ａＩ断片（３６０ｂｐ以下）上に大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ
）　ｔｒｐプロモーター−オペレーターの一部おヨヒｔ
ｒｐＬのシンーダルガルノＣ３Ｄ）配列を含んでいるｐ
ＢＲ３２２誘導体である。［Ｅｄ、ｍａｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ　２９１：５０３−、−５０６（１９８１）Ｉした
がって、このベクターはｔｒｐ調節領域に隣接して％有
のＣ１ａ　Ｉクローニング部位を有する発現プラスミド
である。挿（４２） 入されるＤＮＡは、その配列内に、ｐｔｒｐＬＩに挿入
された場合ｔｒｐ’Ｌｌ）ボソーム結合部位配列に対し
て適当に間隔を突けられるであろう遺伝子コード配列の
前にＡＴＧ翻訳開始コドンを含まなければならない。こ
の発現ベクターは適当な合成りＮＡ’）ンカーを第２図
に図示されたようにＣｌａｌ部位に挿入することによっ
て修飾された。

特異的二本鎖合成りＮ’Ａ’Ｊンカーを使用してｐｔｒ
ｐＬＩのＣ１ａ　Ｉ制限部位の周囲のヌクレオチド含量
を変えた。約１０μＩのｐ　ｔ　ｒ　ｐＬＩ　ＤＮＡを
１６単位の制限エンドヌクレアーゼＣ１ａ　Ｉで９０分
間３７℃で切断した。Ｃ１ａ　Ｉによる開裂によって生
じた接着末端ｉ５０ＱＭｌスーＨ’Ｃｌ５（ｐＨ７，２
）、１０　ｍＭ　Ｍ’ｇ　Ｓ　Ｏ４，０，１ｍＭジチオ
スレイトール、０．２ｍＭｔｉＧＴＰ、０．２ｍＭ’ｄ
ＣＴＰを含有する１００μｌの反応混合物中で鈍化した
。

ＤＮＡポリメラーゼ（３０Ｍｐ−位〕のフレナラ断片を
加え、反応を２０℃で４５分間行なわせた。フェノール
とクロロホルムで抽出後、示されたホスホリル化された
デオキシオリゴヌクレオチドリンカー（６０ｐモル以下
）（５’ＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧ３’）（３’ＴＣＴＴ
ＡＡＧＴＡＣＣ５’）を１μｇ以下（０，６ｐモル以下
）の挿入ベクター断片といっしょにしてエタノールで沈
殿させた。これらの断片を４℃で１８時間３（Ｊμｌｌ
の６６ｍＭ）リス−ＨＣｌ３　（ｐＨ７，６）、５０　
ｍＭＭ’ｇｃ（４２，１ｍＭ　ＡＴＰ　、　２０　ｍ　
Ｍジチオスレイトールおよび８００単位のＴＡＤＮＡリ
ガーゼ中で結合させた。この混合物を９０分間３単位の
ＥｃｏＲＩで９０分間切断した。ＥｃｏＲ（で開裂した
グラスミドＤＮＡを４℃で４時間１００μ１３の６６　
ｍＭ　）リス−ＨＣｌ３　（ｐＨ７，６）、　５　ｍＭ
Ａ４ｇＣＩ３２．１　ｍＭ　ＡＴＰ、　２０　ｍＭ　Ｄ
ＴＴ　、および４００単位のＴ４ＤＮＡ、ｌ）ガーゼの
中で再び結合させた。大腸菌ＣＥ、ｃｏｔｉ）菌体ＨＢ
１０１の能力細胞を２０μＢの上記結合混合物で形質転
換した。

しルｒａｎｄｅｌ　ｅｔ　ａｔ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、５３　：　１５４（１９７０）ＪプラスミドＤＮＡを
上記形質転換体の′）ちの１２のものからｇｉし、Ｅｃ
ｏＲＩとＨｉｎｄＩｌｌで（ＩＴした。これらのプラス
ミドのうちＩＯのものが所望の３６０−ｂｐ以下のＥｃ
ｏ　ＲＩ　−Ｂｉｎｄ■断片を含有していた。ＤＮＡ配
列を分併したところ、これらのプラスミドのうち１つ＜
ｐｔｒｐＬＩ−Ｒ４）は合成リンカ−の所望の配回およ
びｔｒｐプロモーターと合成りＮＡとの間の接合部に所
望の配列を有していた。

種々の形質転換体からのツーラスミドＤＮＡのＤＮＡ配
列を分析している間に、上記プラスミドのうちの１つ（
ｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２）がリボゾーム結合部位の領域ζこ
おいて６ｂｐ削除されていることが発見さ扛た。この削
除は、リンカ−配列がすべて存在するのでＤＮＡポリメ
ラーゼ■のフレナラ断片の３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活惟から生じたものとされている。この誘導体はｐｔ
ｒｐＬＩ−Ｒ４に含まれている生米のｔｒｐＳｉＪ配列
に比較して変化したりボゾーム結合部値を有する。

合成プロレンニンアタ゛ブタ−のクローニングプロレン
ニンのアミン末端を修飾するのに使用さ扛る会成二本領
ＤＮＡの配夕１］はＦ記のとおりである。

（４５） １８　ＢａｍＭＩ　２２ 、＞　□−−→ この断片は２本の一本領オリゴマー（１８−ｂｐと２２
−ｂｐの長さ〕から組み立てら扛た。この会成りＮＡは
蛋白質合成のための人工的なＡＴＧ開始ｊ）”７及びプ
ロレンニン配列しＮｉｓｈＮ１５ｈｉ　ラ、Ｊ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、９１：１０８５−１０８８（１９８２，）Ｊ
の最終のいくつかのコドンをＢａｍＨ１部位の周囲に変
化して繰り返さ扛た形でコードしている。この合成りＮ
Ａは、すでにＤＮＡポリメラーゼ■のフレナラ断片で処
理して接着末端に挿入されているｐＢＲ３２２のＥＣ０
ＲＩ制限部位にサブクローンされた。サブクローンは放
射性同位元素で標識さ扛た２２−ｍｅｒをプローブとし
て使用する組換え微生物のその場でのコロニーノ・イブ
リダイゼーションによって同定さ扛た。（Ｇｒｕｎｓ　
ｔ　ｅ　ｉｎ　＋Ｍａｎｄ、　１１’ｏｇｎｅｓｓ＋　
Ｄ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ’ａｔｌ　、　Ａｃａｄ、、
　Ｓｃｉ。

７２：３９６１（１９７５）］。プラスミドＤＮＡは２
０個のハイブリダイゼーション１１コロニーか（Ｒ６） ら調製さ汎、７３　ａ　ｍ、ＨＩまたはＥｃｏｌｌＩで
開裂されて所望のプラスミドを含有するサブクローンを
同定した。組換え微生物≠１７からの約１００μＩのプ
ラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで開裂して４０　ｂｐ断片
ｉ１２．５％ポリアクリルアミドゲル上で単離した。精
製された４０　ｂｐＥｃｏＲ，Ｉ断片を、すでにＥｃｏ
Ｒ，Ｉで開裂し子牛腸アルカリ性ホスファターゼで処理
して脱ホスホリル化しである２発現プラスミド誘導体Ｃ
ｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２およびｐｔｒｐＬＩ−Ｒ４）のＥｃ
ｏＲ１部位に挿入した。各結合物のいくつかの組換え微
生物からのプラスミドＤＮＡを調製し、Ｂａｍ１−１１
制限エンドヌクレアーゼで切断した。ｔｒｐ発現配列よ
り下流に挿入された４０ｂｐプロレンニンアダプターを
有するプラスミドを約７００　ｂｐ離れた２つのＢ　ａ
　ｍ、ＨＩ部位の存在により同定した。この構成は第３
図に示されている。

これらの発現プラスミドはｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２−Ｂ４Ｂ
およびｐｔｒｐＬＩ−Ｒ４−Ｒ４８と称された。

これらの組換え微生物は、ｔｒｐプロモーター−オペレ
ーター配列、リポゾーム結合部位、人工Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｐ
始コドン、及びプロレンニンの最初の５つのアミノ酸残
基をコードしている化学的に得られた配列を含む約３７
０　ｂｐ　（７）Ｈｉｎｄｍ　−ＢａｍｌｉＩＤＮＡ断
片のための源として使用した。プロモーターより下流の
ヌクレオチド配列は、上述のプラスミドベクターｐｔｒ
ｐＬＩのＣ１ａＩ制限部位に異なる化学合成されたデオ
キシオリゴヌクレオチドリンカーがすでに挿入されてい
たのでリポゾーム結合部位の領域が異なっている。リポ
ゾーム結合部位（ｒｂｓ）配列と、プロレンニン遺伝子
のＡＴＧおよび、他の蛋白質についてはコードしている
遺伝子どの間のヌクレオチドの内容および間隔をＤＮＡ
配列分析により下記の如く各発現の構成ζこついて示し
た： ｐＰＦＺｃＲ）　５’→３′　間隔（ｂｐ）Ｒ’；ｌ　
ＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧ　５１１４　ＡＡ（ＸＥ
ＧＩ■”ＣＧん竹ＴＣＡＴＧ　１１各リボゾ一ム結合部
位の変化を使用してプロレンニン発現プラスミドをつく
って、ｒｂｓヌクレオチド配列の内容及び間隔が蛋白質
発現レベルに対して有している可能性ある効果を後でし
らべた。

プロレンニン発現プラスミドの構成 プロレンニン発現プラスミドを構成するために使用され
る実験段階は第１図に示されている。第一に、プラスミ
ドレプリコン、アンピシリン耐性マーカー、及び所望の
プロレンニンをコードしている配列（アミノ酸コドン８
３から停止コドンＣＴＧＡ）まで）を含む４７７２　ｂ
ｐベクター断片を、３０μｌのｐＣＲ１０１プラスミド
ＤＮＡをｆｆ１ｎｄ、■およびＫｐｎＩ制限エンドヌク
レアーゼで切断することζζより製造した。この制限反
応物を１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、両方の
ＤＮＡ断片を電気溶出によりゲル切片から単離した。プ
ロレンニンｃＤＮＡ配列のアミノ末端部分を含む９０６
−ｂｐＨｉｎｄｍ−ＫｐｎＩ断片をさらにＢａｍＨＩで
切断し５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ
た。２３５−ｂｐＢａｍＨＩ　−ＫｐｎＩ断片（アミノ
酸コドン６ないし８３をコードしている）をゲルの切片
から電気溶出した。

異なるｐｔｒｐＬＩ＝Ｒ−Ｂ４Ｂ誘導体からの発現（４
９） 配列を含むＨｉｎｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片を
７）ＣＲ１０１から２つの制限断片Ｃ，４７，７２ｂｐ
および２３５ｂｐ）と約等モル比で別々に混合した。こ
の混合物を１４ＤＩＪＡ’）ガーゼの添加により結合さ
せ、各結合混合物の１部をＲＢ１０１能力細胞に導入す
るのに使用した。細胞をアンピシリン（２５μｇ／−）
を含有するＬＢ寒寒天フッ−トモ細胞を選侭した各場合
についてコロニーが得られた。上述のコロニーからいく
つかの薬物耐性コロニーを５ｄのＬＢＢ養物に採取して
、プラスミドＤＮＡ）ｉ制限酵素ζこよって分析した。

各場合ζこつぃて、はとんどの組換え微生物はｔｒｐプ
ロモーター−ｒｂｓ配列に隣接して糾換えられた完全な
プロレンニン遺伝子を含んでいることがわかった。

これらの発現プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで分
析することにより、プロレンニンの直接的発現に適合し
た全プロレンニンコード化配列ｉ含んでいることがわか
った。上記プロレンニン遺伝子、インビトロ接合領域お
よびｔｒｐプロモーター−オペレーターのほとんどｆ、
Ｍαｘａｍおよび（５０〕 Ｇ１１ｂｅｒｔの上記文献の化学的減成方法Ｏこよって
ＤＮＡ配列を分析したところ、上記人工の開始コドンお
よびプロキモシンをコードしている配列が大腸菌ＣＥ、
ｃｏｌｉ）　ｔｒ７＞ブｏ　モー　ター−ｙ）ｒ　ヘＶ
−ターの直後ζこ位置し、ヌクレオチドレベルで２つの
発現プラスミドの別々の特性を確立する役割をしている
ことが確認された。ここで構成されたこれらの２つのプ
ロレンニンプラスミドはｐＰＦＺ−Ｒ２およびｐＰＦＺ
−Ｒ４と称される。さらに、発現プラスミドｐＰＦＺ−
Ｒ２およびｐＰＦ’Ｚ−Ｒ４においては、ｔｒｐ’）−
ダーペプチドの大腸菌リポゾーム結合部位の各々５およ
び１１ヌクレオチド後０こＡ、　Ｔ　Ｇ開始コドンが存
在している。

これらの発現プラスミドのＤＮＡ配列を翻訳すると３６
６個のアミノ酸で構成されたプロレンニン蛋白質を予測
する。そのよう々ポリペプチドの測定された分子量は約
４１，０００である。発現プラスミドを有する大腸菌を
トリプトファンを欠く最小限の培地中で生育させると、
これらの細胞は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動において成熟キモシン（約３６，０００ダルトン）よ
りわずかに犬ぎいところに位置する蛋白質を産生ずる［
　Ｌａｅｒｒｖｎｌｉ、　Ｕ、に、Ｎａｔｒｂｒｅ　２
２７　：　６８０（１９７０）’：ｌ。そのよう々蛋白
質は同一条件下に生育させたベクタープラスミド７ｒＢ
Ｒ３２２を含む大腸菌ζこよっては産生されない。トリ
プトファン（１００μｇ／−）を欠くＭ９ＣＡ培地中で
生育された同一の発現組換え体によってはプロレンニン
蛋白質はほとんど産生されず、このことは推定されるプ
ロキモシン蛋白質の大腸菌Ｏこよる産生は意図されたよ
うにｔｒｐプロモーターーオペレーターの制御下にある
ことを示す。

発現培養物ζこよるプロレンニン合成の評価プロレンニ
ン発現プラスミドｐＰＦＺ−Ｒ２およびｐｐｐｚ−Ｒ４
を有する大腸菌形質転換体はｔｒｐプロモーターの誘導
のためにトリプトファンを欠（Ｍ９ＣＡ培地中で生育さ
せた。細胞を振どうフラスコ中で５５０μｍにおける光
学密度１．０となるまで生育させた。これらの培養物か
らの細胞ペレットを２％ＳＤＳ、１％ベーターメルカプ
トエタノール中で分解させて、蛋白質をアセトンで沈殿
させた。沈殿した蛋白質をＳＤＳ試料緩衝液中で再溶解
し、アリコツトを１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上で電気泳動させたＣ　Ｊ、ａ　ｅｍｍ−１ｉ、Ｎａ
ｔｒｂｒｅ　２２７：６８０（１９７０）：］。ププロ
レンニン抗体はコーマシー青テ染色シタケルヲ５７９ｎ
ｍでデンシトメーターによってゲルを走査することによ
って測定した。

プロキモシン発現プラスミドを含む大腸菌の菌体中に屈
折性の包摂物体が存在することが位相差顕微鏡によって
観察された。プラスミドベクターｐＢＲ３２２を含む対
照菌体を同一の条件下に生育せしめても何らそのような
屈折性包摂物体は現われない。同様の観察はインシュリ
ンやチモシンのよう々外来遺伝子の産物を産生ずる遺伝
子操作された微生物に関して報告されているＣ　Ｃａｒ
ｒｉ　ｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉ
ｏＴｅ６ｈｎｏｌｏｇｙ　１　：　１０９（１９８３）
）。屈折性物体は発現された外米蛋白質がたまったもの
であると考えられる。

屈折性包摂物の存在は高レベルでプロレンニン（５３） が産生されたことと直接相関関係があるものと見られろ
。

上記の細菌によって合成されたプロキモシンはプロレン
ニン抗体と特異的に反応する。

同一の振どうフラスコでの生育条件下に、プラスミドｐ
ＰＦ’Ｚ−Ｒ２およびｐＰＦ’Ｚ−Ｒ４を有する大腸菌
ＣＥ、　ｃ、ｏ　ｌ　ｉ）　ＨＢ　１０１の組換体の生
育を評価したところ、プラスミドｐｐｐｚ−Ｒ２はプロ
レンニンを１０〜１５％のレベル範囲で再現性を以って
産生じ、ｐＰＦ’Ｚ−Ｒ４はプロレンニンを５〜７％の
レベル範囲で産生じた： ＨＢ　１０１　ｐＰＦＺ−Ｒ２１３，１０，５ｐＰＦＺ
−Ｒ４７，１０，５ ＨＢ１０’ｌ　ｐＰＦＺ−Ｒ２１１，６０，１１０，２
０，６ ＨＢ　！　０１　ｐＰＦＺ−Ｒ２１５，４０，３１１゜
７０．５ ｐＰＦＺ−Ｒ４７，０１，０ （５４） ＝）　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのデンシトメー
ターＱこよる走査にもとづいている。

ヌクレオチドの組成に関してこれら２つのプロレンニン
発現構造物（ｐＰＦＺ−Ｒ２＄−よびｐＰＦＺ−Ｒ４）
の間の相違点はプロレンニン遺伝子のりボゾーム結合部
位と開始コドンの周囲の配列のみである。異なるプラス
ミドを含有する培養物の間Ｏこはプロレンニン発現のレ
ベルに有意の差もある。

プロレンニン発現において観察される相違は、リポゾー
ム結合部位の周囲の一次ＤＮＡ配列の差異に帰因すると
いえる。５ｈｉｎａおよびＤａｌｇａｒｎｏｉこよって
最初に注目されたように（１９７４、ＰＮＡＳ７１　：
１３４２−１３４２）、１６ＳリボゾームＲＮＡの３′
−末端配列に対して相補性の開始コドンより約１０ヌク
レオチド上流を中心とするプリンＯこ富んだ配列がある
。はとんどの証拠は大腸菌のりポゾームによる蛋白質合
成開始部位の選択におけるｒＲＮＡ塩基対形成に対する
ｍ　ＲＮ　Ａの役割を証明している。多くの細菌および
ファージのｍＲＮＡからのりボゾーム結合部位の配列が
しらべられ、合致するシンーダルガルノ配列はＴＡＡＧ
ＧＡＧＧＴであることがわかった。これらの３つのパラ
メーターはシンーダルガルノ相互作用：１）相補性の長
さ；２）シンーダルガルノ配列と開始コドンとの間の距
離；２よび３）シンーダルガルノ配列カニ次構造によっ
て遮へいされる程度ｌこ影響を与える。

上記２つの発現プラスミドの各々のＳＤ配列の周囲の部
分をしらべるとｐＰＦＺ−Ｒ２における相補性の長さは
６つの隣接するヌクレオチドであり、他は３つの隣接す
るヌクレオチドを有するのみであることがわかる： 又、リポゾーム結合部位と開始コドンとの間の間隔はｐ
ＰＦＺ−Ｒ２１こおいて５つのヌクレオチドであり、こ
れは７つのヌクレオチドが介在する天然のｔｒｐ　Ｌ遺
伝子開始領域の間隔に非常に近似している。一方ｐＰＦ
Ｚ−Ｒ４はりポゾーム結合部位と開始コドンとの間に１
１・個のヌクレオチドを有している。ｐＰＦＺ−Ｒ２に
見られる効果的にリポゾーム結合部位のもう１つの重要
な特徴は、シンーダルガルノ配列の直前のプロレンニン
コード化配列と同じ読み取り枠における翻訳停止コドン
（ＴＡＡ）である。ｐＰＦＺ−Ｒ２ＤＮＡ配列のこれら
すべての特徴はその高度に効果的なプロレンニン発現に
おいである役割を演じている。

もちろん遺伝学的コードが退化すると、上記配列Ｏこよ
ってコードされた蛋白質のアミノ酸配列を変えること表
しに特定のヌクレオチド配列の組成をある程度変化させ
る。このようにして、２つ以上の異々る塩基配列（同意
義のコドン）を、それによって特定化されるアミノ酸の
同一性を変化させることなく特定のヌクレオチド配列に
おいて置（５８） 換することができる。さらに、コドンを除去し、あるい
は１つ以上のコドンを退化しているコドン以外のコドン
で置換して構造的に修飾されたポリペプチドであるが修
飾されていないＤＮＡ分子によって生成されるポリペプ
チドと実質的に同じ有用性または活性を有するものを産
生ずることは可能である。たとえ上記ＤＮＡ分子の相異
が上記遺伝学的コードの退化に無関係だとしても、上記
ポリペプチドを生産する２つのＤＮＡ分子として見た場
合、上記２つのポリペプチド類は機能的に均等である。

≠４アミノ酸、すなわちスレオニンのコドンはＡＣＣＯ
代りにＡＣＴである。遺伝学的コードの過剰によって、
このコードはこの位置のアミノ酸を変化しない。この工
程では、上記ホルモンのＮ−末端部分をコードしている
部分が合成的につくられているノ・イブリッド遺伝子の
構成物を使用するので、合成り　ＮＡ　ｌこよってプロ
レンニンのその部分のための新しいコード化配列の設計
を行うことができる。プロレンニンのアミノ酸配列は実
際には遺伝学的コードの退化によって維持されるので、
これらの種類の配列の変化は無意味であって、この遺伝
子は天然で生産されるものと均等のポリペプチド（Ｎ末
端ｍｅｔを除く）を生成する。

本発明の細菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）形質転換体によって発現
されたメチオニンプロレンニンの単離、そのレニンへの
転化および該レニンの牛乳凝固活性は英国特許出願２，
１００，７３７　ＡおよびＥｍｔａｇｅら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｒｌ、　Ｓｃｉ、　８０　：　３６
７１−３６７５（１９８３）に記載の方法によって示さ
れた。

大腸菌ｔ　ｒ　ｐ　プロモーター−オペレーター断片Ａ
ＴＧ開始コドン、１１２またはＲ４からなるリポゾーム
結合部位、およびウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン
捷たはヒト上皮成長因子をコード化しているｃＤＮＡ遺
伝子配列を有するプラスミドも構成され、大腸菌に導入
されると、上述の各外米蛋白質を高度に効率よく発現す
る。ＡＴＧ開始コドン迄のベクター、プロモーターおよ
びリポゾーム結合部位のヌクレオチド配列は本質的Ｏこ
プロレンニン発現プラスミドについて上述したものと同
一である。これらの種々の構成物により産生される外米
蛋白質の発現レベルは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行い、続いてテンシトメーターで走査するこ
とによって測定された。これらの培養物によって得られ
た発現の相対的レベルはプロレンニンの発現について観
察されるものと類似していた。すなわち、リポゾーム結
合部位のＲ２翻訳を含む動物の成長ホルモン発現プラス
ミドの発現レベルはＲ４翻訳の発現レベルの約４〜５倍
である。最終的には、大腸菌細胞における発現レベルは
全細胞蛋白質の約２５〜３０％であった。

ｂＧ＃＝−よびｐＧＨ遺伝子の発現を達成させるのに使
用される方法は動物の成長ホルモンの発現についてＰ、
　Ｓｅｅｂｕｒｇら（１９８３、ＤＮＡ２１３７−４５
）によって報告されている方法と本質的に同じである。

この方法によりクローンされた合成りＮＡとクローンさ
れたｃＤＮ、Ａ配列からなる混成遺伝子の構成を確認し
た。この構成設計により、成熟ホルモンの最初のアミノ
酸についての翻訳開（６１） 始コドンを導入することにより信号配列のないｂＧＨお
よびｐＧＩＩを大腸菌において直接発現させることがで
きた。合成りＮＡの使用によってｂＧＩｉおよびｐＧＨ
遺伝子のアミン末端領域のための新しいコード化配列を
設計することもできた。

成長ホルモン遺伝子の合成領域によってコード化されて
いるアミノ酸配列は実際Ｏこは遺伝学的コードの過剰に
よって維持された。

ｂＧＨｃＤＮＡを有するプラスミドをＭｉ　ｌ　ｌ　ｅ
　ｒら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７５２１（１９８０）
によって報告されたようにして得られｐＢＧＨ−１０２
と称された。

これはＭｉｌｌｅｒらのプラスミドＢＰ３４８と均等で
ある。ｂＧＨｍＲＮＡのヌクレオチド配列とその相当す
るアミノ酸配列（該ヌクレオチド配列により予測される
）はすでに公開されているＣＭｉｌｌｅｒ。

Ｗら、上記文献）。トリプトファンプロモーター−オペ
１／−夕−２よびリポゾーム結合部位配列を有する制限
断片をｐ　ｔ　ｒｐＬ　１−Ｒ２および−Ｒ４から得た
。成長ホルモン遺伝子のアミノおよびカル（６２） ポキン末端を修飾するのに使用される合成二本鎖ＤＮＡ
の配列はＳｅｅｂｕｒｇら（１９８３、ＤＮＡ２；３７
−４．５）による報告から取り出した。ホスホラミダイ
ト化学（Ｃａｒｗｔｈｅｒｓら）を使用して上述の如く
オリゴヌクレオチドを合成し、断片を一本領オリゴマー
（１１−１６塩基）から組立てた。

Ｎ−末端合成りＮＡは蛋白質合成のための人工ＡＴＧ開
始コドンおよびｂＧＨの最初の２３個のアミノ酸のコド
ンをコード化している。ｐＢＲ３２２ＤＮＡへの挿入を
促進するために、この合成断片は、制限エンドヌクレア
ーゼＥｃｏＲＩとＨｉｎｔｌ■によって生じた接着末端
に連続的に一致する５′末端上に４塩基一本領接着末端
をも有していた。

所望の配位結合生成物を５％ポリアクリルアミドゲルか
ら約ｓ　ｏ　ｂｐの帯状物として単離した。次いで積設
されたＤＮＡを、すでに制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄ■で切断されたｐＢＲ３２２ＤＮＡ
と配位結合して大腸菌能力細胞の中に形質転換した。ク
ローンされた合成りＮＡを化学減成方法（Ｍ’ａｚａｍ
およびＧ１１ｂｅｒｔ、　１９８０、Ｍ’ｅｔｈｏｄｓ
　Ｅｎｚｙｍｏｌ　６５　；　４９９　）ｆ使用してＤ
ＮＡ配列を分析して修飾されたｂＧＨ配列の完全な配列
を確認した。

３ｅｅｂｕｒｇらによって記載されたプラスミドＯこ類
似の発現ベクターｒ、ｒｂＧＨとｐＧＨの両者について
構成して、リボゾーム結合部位を変えた場合のプロレン
ニン以外の哺乳類の遺伝子の発現を比較した。ｂＧＨ発
現プラスミドを構成するのに使用される実験工程は第５
図と第６図に示した。

まず、ｃＤＮＡりＣ１−ンｐＢＧＢ’−１０２からの領
域、すなわちアミノ酸２３〜８６をコード化シている配
列を５％ポリアクリルアミドゲル上で単離し、ＡＴＧ開
始コドンとｂＧＨの最初の２２個のアミノ酸のための配
列をコード化しているｐＢＲ３２２サブクローンが単離
されたクローン化合成７５　ｂｐＥｃｏｌｌｌ−Ｐｖｕ
Ｔｌ断片に配位結合した。この配位結合混合物を制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで開裂し、
２７０　ｂｐ断片を５％ポリアクリルアミドゲルから単
離し、適当に開裂されたｐＢＲ３２２ＤＮＡに挿入した
。これら０２つの部位を使用して、修飾されたｂＧＨ遺
伝子配列のＥｃ　ｏＲＩ　−Ｐｓ　ｔ　Ｉ　ＤＮＡ断片
をｐＢＲ３２２プラスミドに挿入して挿入の単一の配向
のみを可能にした。この結合Ｏこおいて得られた形質転
換体から得られたプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　ｆ　Ｅｃ　ｏ
ＲＩとＰｓ　ｔ　Ｉで開裂して２７０ｂｐｂＧＨ遺伝子
断片のベクターへの挿入を証明した。次に、ｂＧＩｉア
ミノ酸９１〜１９１のコード化配列（２よびｂＧＲｃＤ
ＮＡの３′未翻訳領域）を有するｂＢＧＨ−１０２から
の４４０ｂｐＰｓｔＩＤＮＡ断片をこのプラスミドＤＮ
ＡのＰｓｔＡ部位に挿入して全長ｂＧＨ遺伝子の再構成
を完了した。このＰｓｔＩ断片はｂＧＨ遺伝子の残部に
対して２つの可能な方向で挿入された。制限地図による
と、挿入物を所望の方向に挿入すると約４９０　ｂｐ　
ＰｖｕＵ断片（上記ｂＧＨ遺伝子に対して完全に内部）
を生成するが、挿入する方向が悪いと３５０ｂｐＰτｕ
’Ａ　ＤＮＡ断片となる。制限エンドヌクレアーゼＰτ
ｕｎでテトラサ（６５） イクリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを開裂
後両方の方向の多重単離物を同定した。この方法で同定
されたプラスミドの１つはｐＢＧＨ−２１２と称され、
この全長ｂＧＨ遺伝子をさらに制限エンドヌクレアーゼ
で開裂して制限地図を作成しＤＮＡ配列をしらべること
によって分析して該プラスミドの構成を正確なものζこ
した。

ｂＧＨ’発現プラスミドを組立てるための次の段階は、
大腸菌ｔｒｐプロモーターとリポゾーム結合部位配列を
有するＥｃｏＲＩＤＮＡ断片の挿入である。全長ｂＧＨ
クローン、ｐＢＧＨ２１２を制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃ　ｏＲＩで開裂し、細菌のアルカリ性ホスファターゼ
で処理して、２つの異なる約３９０　ｂｐのＥｃｏＲＩ
断片ＣｂＧＨの細菌による発現に要する配列を有する）
と結合させた。２つの異なる配位結合を行って、遺伝子
開始領域のヌクレオチド配列がわずかに異なるｔｒｐプ
ロモー（６６） ターーγｂｓ断片をｐＢＧＨ−２１２に挿入した。菌株
ＨＢ１０１の能力細胞を各配位結合反応混合物で形質転
換した。各形質転換物からいくつかのテトラサイクリン
耐性コロニーをとり出し、単離されたプラスミドＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼによる切断Ｏこよって分析し
た。ｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ含有断片を、該プロモ
ーターからの転写の方向に対して可能な２つの方向でｐ
ＢＧＨ−２１２ＤＮＡに挿入できた。プロモーター−ｒ
ｂｓ挿入物の方向をｂＧＨ遺伝子の転写を生じる方向に
すると６０　ｂ　ｐＨ１ｎｔｌ　ＴＨＤＮ　Ａ断片を生
成し、望捷しくない方向Ｏこすると４００　ｂｐ断片を
生成する。各結合混合物からの倍数の組換え微生物を、
直接の発現に必要とされる配置でｔｒｐプロモーター−
ｒｂｓ配列に隣接する完全なりＧＨ遺伝子を担持するプ
ラスミドで同定した。

発現プラスミドの構成は、プラスミドｐＢＧＨ−２１２
−Ｒ２およびｐＢＧＨ−２１２−Ｒ４がらの約９２０　
ｂ　ｐＨｉ　ｎｄｍ　−ＰｒｕＴｌ　（パーシャル）Ｄ
ＮＡ断片を単離することによって開始された。このＤＮ
Ａ断片はｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ配列およびｂＧＨ
コード化配列配列とんど全体（最後の４個のアミノ酸残
基および停止コドン以外のすべて）を含む。ホルモン全
体を発現するために、ｂＧＨのＣ末端をコード化してい
る合成りＮＡの断片をｐＢＲ−’１３２２にクローンし
た。この２０ｂｐＤＮＡ断片を２つの独立したオリゴマ
ーとして合成し、アニール化して二本鎖断片を形成し、
制限エンドスフレアーゼＥｃｏＲ）およびＨｉｎｄ、Ｔ
Ｈで切断されたｐＢｙｚ３２２　ＤｙＡに挿入した。こ
のサブクローンヲ制限エンドヌクレアーゼｐｖｒｔｆｌ
おヨヒＢ（ＬｍＨＴで切断後、３６５　ｂｐＰｖｕ■−
ＢａｍＨＩＤＮＡ断片をゲルで単離し、電気溶出により
精製した。最終的な発現プラスミドは、クローンされた
合成Ｃ末端を有する断片（３６５ｂｐ）を第６図に示す
とおりに、各々、ｔｒｐ　プロモーター−ｒ　ｂ　ｓ　
−ｂ　ＧＨＤＮＡ断片（９２０ｂｐ）とＰＢＲ：ｄ２２
誘導ベクター断片（３９９５ｂｐ）と結合することによ
って組み立てられた。全長ｂＧＨ発現プラスミドをＰｖ
ｕ■による制限エンドヌクレアーゼ開裂によって同定さ
れた。これらのｂＧＨ発現プラスミドはさらに制限酵素
開裂地図のもつと正確な艇庫により特徴付けられた。Ｄ
ＮＡの配列をしらべることによりこれらの発現プラスミ
ドをさらにしらべることにより、上記修飾されたｂＧＨ
遺伝子配列を証明し、ｐＢＧＨ−３０１とｐＢＧＨ−３
７５と称される２つの異なるベクターが別個のものであ
ることを確証した。

これらの発現プラスミドのＤＮＡ配列を翻訳することに
より１９１個のアミノ酸残渣のホルモンポリペプチドを
予測できる。そのような蛋白質の測定された分子量は約
２２，０００である。ｂＧＨ発現プラスミド７）ＢＧＭ
−８０１とｐＢＧＨ−８７５を有する細胞をｔｒｐプロ
モーターで司令される発現を誘導するのに公知の条件下
に生育させると、細胞は、総蛋白抽出物を５ＤＳ−ポリ
アクリルアミトゲ／ｌ／　（ＬａｅｒＭＬｌｉ、　Ｕ、
　１９７０　＋　Ｎａｔｕｒｅ２７７゜６８０）上でし
らべたところ精製されたｂＧＨ蛋白（マイルス（Ｍｉ　
ｌ　ｅ　ｓ　）より得た）のサイズに似た蛋白質を生産
した。この帯状物は同一条件下に生育させたベクタープ
ラスミドｐＢＲ８２２を有する細胞からの蛋白質抽出物
中で可視ではなかった。

ｂＧＨレベルを５７９Ｂ、ｍにおけるデンシトメーター
ゲル走査によりしらべた。γｂｓのＲ２を変えた発現プ
ラスミド責ｐＢａＨ−ａｏ　１）を含む培養物は総細胞
蛋白質の約２０〜２５係のレベルでｂＧＨを生成した。

一方、ｒｂｒのＲ４が変化した７）　ＢＧＡ−３７５発
現プラスミドを有する細胞は総細胞蛋白質の約５〜７ヂ
のレベルでｂＧＨを生成した。

ｐＧＨ発現の鴨合、ｂＧＩＩ発現に使用されるものと類
似の方法が使用された。７）ＧＨ遺伝子のアミン末端を
修飾するのに使用される二本鎖ＤＮＡの配列は本質的に
Ｓｅｅｂｕｒｇらの上記文献に記載のとおりである。ｐ
ＧＨ発現プラスミドを構成するのに使用される実験の工
程は第７図のとおりである。まず、ＣＤＮＡクローン（
ｐＧＨ２４）からの領域をｐＧＨ遺伝子の合成領域で置
換した。ｐＧＨのアミノ酸残基２２と２３をコードして
いる領域ばＰｖｕＪ１部位を欠いているので、７）ＧＨ
ハイブリッド遺伝子の合成５′部分を上記クローンされ
たｃＤＮＡから誘導されたコード化配列にＡｓｕ■部位
（ｐＧＨ−２４のアミノ酸コドン１６および１７で生じ
る）において結合した。Ａｓｕ：［部位もｐＧ、ＩＩの
アミン末端をコードしている合成りＮＡの同じ位置に挿
入した。クローンされたＣＤＮＡにさらにＡｓｕｉ部位
が存在することにより、このｐＧＩＩ遺伝子は３つの異
なるＤＮＡ断片から再構成された。

７）ＧＨ−２４から単離された６　８５　ｂｐ　ｐｓｔ
■−Ｐυｕ■断片はＲｓａ■によって切断され、得られ
た２　００　ｂｐ　Ｐｓｔ■−Ｒｓａｉ断片をさらにＡ
　ｓ　ｎ　■で・開裂した。修飾された遺伝子はクロー
ンされた合成ＥｃｏＲ■−Ａｓｕ■５：ｄｂｐ断片、７
５　ｂ’１）Ａｓｕ■−Ｒｓα■断片および４８０　ｂ
ｐＲｓａ■−Ｐｖｕ■断片をいっしょに結合することに
より構成した。この結合の生成物をＥｃｏＲＩおよびＲ
ｖｒｂＪｌで切断し、５７０　ｂｐの大きさのＤＮＡ断
片を５％ポリアクリルアミドゲルから単離した。この断
片をｂＧＨ発現プラスミドｐＢＧＨ−８７５がらのＥｃ
ｏＲＩ−Ｐｖｕ■（パーシャル）ベクター断片と結合し
て大腸菌菌株ＭＭ２９４　（ＡＴＣＣ８３６２５）の能
力細胞内に形質転換し、アンピシリンを含有するプレー
ト上で選択された。このプレー発現プラスミド（９１０
ｂ　ｐ　Ｅｃ　ｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ断片の存在によっ
て同定された）は全長ｐＧＨ遺伝子を有する。というの
は、ｐＧＨおよびｂ　ＧＨＫ白質は同じＣ末端アミノ酸
配列を有するからである。

７）Ｇ、Ｈ発現プラスミドの構成における次の工程は、
大腸菌ｔｒｐオペロンプロモーター配列と修飾されたり
ボゾーム結合部位を有する約３９０　ｂｐＥｃｏＲＴＤ
ＮＡ断片の挿入である。全長ｐＧＨプラスミドを制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲ■で開裂し、ｐＧＨの細筒に
よる発現に必要な配列を有するＥｃｏＲＩ断片の別個の
もの（ｓｅｐａｒａｔｅ　ｖｅｒｓｉ−ｏｎ）と結合し
た。発現断片をリボゾーム結合部位の周囲の領域がわず
かに異なるヌクレオチド配列とともに使用することによ
り２つの異なる結合反応物をつくった。菌株Ｃ６００の
能力細胞を各結合反応物で形質転換した。プラスミドＤ
ＮＡを各形質転換体からのいくつかの薬剤耐性コロニー
から単離し、制限エンドヌクレアーゼによって切断して
分析した。ｔｃｐプロモーターを含む断片をｔｒｐプロ
モーターからの転写方向に対して可能な２つの方向でプ
レ発現プラスミド中に挿入できた。

上記ｐＧＨ遺伝子の転写を生じるプロモーター挿入断片
を所望の方向に挿入すると９２０　ｂ　ｐＨｉｎｄｍＤ
ＮＡ断片を産生じ、一方望ましくない方向にすると６０
０　ｂｐＤＮＡ断片を生成する。各結合反応物からの多
重単離物を直接発現に必要とされる配置にあるｔｒｐプ
ロモーターとｒｂｓ配列に隣接する完全なｐＧＨ遺伝子
を有するプラスミドで同定した。

さらに、これらの発現構成物の特性は他の制限エンドヌ
クレアーゼによる制限地図をつ（ることによりしらべら
れた。これらの７３．ＧＨ発現プラスミドの特徴をＤＮ
Ａ配列をしらべることによってしらべてヌクレオチドの
レベルでそれらが別個のものであることを確証した。こ
れら２つのｐＧＨ発現プラスミドは７）ＧＨ−１０１と
ｐＧＨ−１０７と称された。

これらの７）ＧＨ発現プラスミドのＤＮＡ配列を翻訳す
れば１９１個のアミノ酸のホルモンポリペプチドを予測
し得る。そのような蛋白質の測定された分子量は約２２
，０００となる。プラスミドｐＧＨ−１０１またはｐＧ
Ｈ−１０７からなる組換え微生物をｔｒｐプロモーター
が司令する発現を誘導させるに公知の条件下で生育させ
ると、これらの細胞は約２２，０００ダルトンのサイズ
の蛋白質を生成した。この帯状物は同一の条件下に生育
されたベクタープラスミドｐＢＲ３２２を有する細胞か
らつくられた蛋白質抽出物からは得られなかった。ｐＧ
Ｈ産生のレベルば５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの個
々のレーンをデンシトメーターで走査することによって
決定された。いくつかの大腸菌蛋白質は２２，０００ダ
ルトンの大きさにあてはまり対照細胞抽出物中の総蛋白
質の約２〜５チを占める。これらの生来の蛋白質の割合
を補正すると、上記発現培養物の蛋白質抽出物中に見ら
れる７）ＧＨ帯状物はｐＧＨ−１０１と７）Ｇｌｉ−１
０７の各々について総細胞蛋白質の約５係および１５チ
である。トリプトファン（１００μｊｊ／ｍｌ）の存在
下に生育させた培養物中のｐＧＨレベルを定量するとｐ
ＧＨ発現のレベルが低下した。この事実は、ｐＧＨ蛋白
質の大腸菌内での産生が意図されたｔｒｐプロモーター
−オペレーターの制御下で本当に行なわれていることを
意味する。ｐＧＨの場合の発現レベルの相違は同じリボ
ゾーム結合部位配列を使用してプロレンニンとｂＧＨを
発現させるときに見られる相違と類似していた。

”Ｒ２”ｔｒｐプロモーター−ｒｂｓを使用した外来遺
伝子の効率的発現のもう１つの例は、合成りＮＡ配列か
らのヒトウロガストロンすなわちヒト上皮成長因子（ｈ
ＥＧＦ）の産生である。ｈＥＧＦの効率的な細菌による
生産を達成するのに工夫された計画においては成熟ｈＥ
ＧＦのコード化配列を含むＤＮＡ断片を化学的に合成し
た。この方法によって、成熟ＥＧＦポリペプチドの最初
のアミノ酸残基をコードしているコドンの前に蛋白質合
成のためのＡＴＧ開始コドンを導入することによってこ
の成熟ホルモンの直接発現が可能となった。この合成遺
伝子は１５個のオリゴヌクレオチドからなり、長さは１
２〜４５個の塩基である。３つの別個の結合を行い、結
合中間生成物をポリアクリルアミドゲル上で単離した。

精製された結合中間生成物を次いでｈＥＧＦ遺伝子の最
終的組立てとして配位結合した。ｈＥＧＦ遺伝子をプラ
スミドｐＢＲ８２２ＤＮＡに挿入するのを促進するため
、合成り、ＥＧＦ遺伝子がその末端にＥｃｏＲＩおよび
Ｈｉｎｄ■制限エンドヌクレアーゼ接着末幽を有するよ
うにした。

ｈＥＧＦ合成りＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ■開裂
した７）ＢＲ８２２ＤＮＡと結合させ、このプラスミド
の合成的に誘導された領域をＤＮＡ配列により分析（Ｍ
ａ　ｘ　ａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの上記文献）して正
確なものとした。

大腸菌のｈＥＧＦの発現のためのベクターは、プロレン
ニン、ｂＧＨおよびｐＧＨの高レベルノ発現に使用され
たことのあるｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ断片を使用し
て構成された。ＥＧＦ発現プラスミドの構成はｐＢＲ８
２２−ＥＧＦサフソローンを制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲ■で開”Ｉし、続いて細菌のアルカリ性ホスファ
ターゼで脱ボスホリル化することにより開始された。こ
れらの発現プラスミドはｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ配
列を有するＥｃｏＲＩＴｒｒ片を使用して構成された。

リボゾーム結合部位の周囲の領域のヌクレオチド配列が
わずかに異なるｔｃｐプロモーター−ｒｐｓ断片を使用
して２つの異なる結合を行なった。大腸菌菌株ＨＢ１０
１の能力細胞を各結合反応物で形質転換した。各形質転
換物から得られたいくつかの薬物耐性コロニーをとり出
して単離したプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアー
ゼによって開裂して分析した。ｔｒｐプロモーター−ｒ
ｂｓを有する断片をプロモーターからの転写の方向に対
して可能な２つの方向でＥ　Ｇ　Ｆサブクローンの中に
挿入できた。合成ＥＧＦ遺伝子の発現を生じるプロモー
ター挿入断片の方向を望ましい方向にすると５１０ｂｐ
のＨｉ　ｎ　ｄＴｍＤＮＡ断片を生成するが、望ましく
ない方向にすると２００　ｂｐのＨｉ　ｎ　ｄ、ＩＩＩ
　ＤＮＡ断片を生成する。各結合反応物がらの多重単離
物は、直接発現に必要な配置で細菌のプロモーター−ｒ
ｂｓ配列に隣接してＥＧＦ遺伝子を有するプラスミドで
同定された。

発現プラスミドのＤＮＡ配列を分析することによりＥＧ
Ｆコード化配列配列述の如く大腸菌ｔ７−ｐプロモータ
ー−ｒｂｓの直後にあることが確認された。ｐＥＧＦ−
Ｒ２およびｐＥＧＦ−Ｒ４と称されるＥＧＦ発現プラス
ミドにおいてはＡＴＧ開始コドンはリボゾーム結合部位
配列の各々５および１１個のヌクレオチドの後に存在す
る。

ＥＧＦ発現プラスミドのＤＮＡ配列の翻訳をすると、銀
白に３つのジスルフィド結合を形成すると考えられる６
つのシスティン残基な有する５４個のアミノ酸ポリペプ
チドを予測できる。そのようなホルモンの測定された分
子量は約６，３５８となろう。ｌｏ？Ｚと称される大腸
菌の変異菌株（Ｇ（ｌ　ｔ　ｔ　−ｅｓｍａｎら、Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｌ、　１４８＋　２６５．１９８１
）はコネチカット州ニューヘブンのエール大学の大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｌｉ）遺伝子ストック・センターから菌株
＆、ＥＣＧＳＣ−６４３６として入手し得、ＥＧＦ発現
プラスミドで形質転換され、ｔｒｐプロモーターによっ
て司令された発現を誘導するのに公知の条件下で生育さ
れる。野性型細胞に存するいくつかのプロテアーゼの１
つを欠くこの変異菌株を使用して細菌によって生成した
ｈＥＧＦの蛋白質分解を最小限にした。

これらの発現培養物の総蛋白抽出物を１５％５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル上でしらべてＥＧＦ産生のレベル
を決定しようとした。低分子量のポリペプチド責市販の
ものから得られた精製マウス−ＥＧＦを含む）は比較的
分割しないが、対照の抽出物に比べて発現培養物からの
抽出物にはＥＧＦ分子量範囲の蛋白質がもつと多いよう
である。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの個々のレー
ンをデンシトメーターで走査した。大きさが１０．００
０ダルトン未満の細胞蛋白質は対照抽出物においては総
細胞蛋白質の約１チを占めている。

これらの生来の蛋白質の割合を補正すると、発現培養蛋
白抽出物中の推定ＥＧＦレベルは総細胞蛋白質の約３〜
５％に相当する。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＰＦＺ−Ｒ２およびＲ４（ｐＰＦ
Ｚ−Ｒ）の構成を示すｐＰＦＺ−Ｒ２およびＲ４の各々
に共通の制限地図を含む概略図である。 図中矢印はｔｒｐプロモーター配列からプロキモシン（
プロレンニン）遺伝子（太い断片として表わした）へと
発現する方向を示している。合成挿入物は空白の箱状の
形で表わした。 第２図は、プラスミドｐ　ｔ　ｒ、ｐ−ＬＩ−Ｒ２およ
びＲ４の構成のだめの手順を示す概略図である。 第３図はプラスミドｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２−Ｂ４８及びｐ
　ｔ　ｒｐ　Ｌｌ−Ｒ４−Ｒ４８の構成のための手順を
示す概略図である。 第４図はプラスミドｐ　ｐｐｚ−Ｒ２および７）　ＰＦ
Ｚ　−Ｒ４（７）各々についてのプロキモシン（プロレ
ンニン）遺伝子のりボゾームの結合部位と開始コドン（
ＡＴＧ）との間のヌクレオチド配列と間隔を示す概略図
である。 第５−１および５−２図は、全長のｂＧＨ遺伝子及び発
現配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略
図である。プラスミドｐＢＧＨ−１０２ばｐＢＲ３２２
のアンピシリン耐性遺伝子に　。 クローンされたｂ　ＧＨｃ　ＤＮＡ配列（黒く塗った箱
形）　゛を含む。ｂＧＩｉの新しいアミン末端をコード
している合成りＮＡをｐＢＲ３２２（点線の箱形）のＥ
ＣｏＲ■部位とｌｌｌｎｃｌＪｆＪ部位に挿入した。矢
印は配列解読の５′→３′方向、すなわち転写の方向を
示す。 第６−１および６−２図はｂＧＨ産生のための細菌の発
現プラスミドの構成を示す概略図である。 プラスミドｐ’ＢＧＭ−２１２−Ｒはｔｒｐプロモータ
ー　゛配列（第５図参照）によって成熟ｂＧＨを完全に
直接発現させる遺伝子を担持している。これらのプラス
ミドはＨ’ｉｎｄ■によって開裂され、Ｐｖｕ■によっ
て部分的に切断され、２つの約９２０　ｂ７）Ｈｉｎｃ
ｌ■−ＰｖａＴ１断片を単離した。ｂＧＨのＣ−末端を
コードする合成りＮＡ断片がｐＢＲ８２２（空白の箱形
）のＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄ■部位に挿入された
。矢印ばｔｒｐプロモーター配列からの転写の方向及び
配列解読における５′→３′の方向を示している。、 第７−１および７−２図はｐＧＨ遺伝子と発現配列の全
長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミドｐＧ、Ｈ７２４はｐＢＲ３２２のアンピ
シリン耐性遺伝子の曳にクローンされたｐ　ＧＨｃ　Ｄ
ＮＡ配列（゛黒く塗ちた箱形）を有する。ｐＧＨの新し
いアミン末端をコードしている合成りＮＡはｐＢＲ３・
２２（点線の′箱形）のＥｃｏＲ■部位とＨｉｎｄ■部
位゛−挿入された。矢印は配列解読のＡ′−３′の方向
、すなわ゛も転１写の方向を示す。 （外５名） 配列 プラスミドｓ。 ｐＰＦＺ−Ｒ２ＴＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＴＴ
ＣｐＰＦＺ−Ｒ４ＴＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＧ　ＴＡＴ　Ｃ
ＧＡ間隔 ＡＴＧ　５ｂｐ ＧＡＡ　ＴＴＣＡＴＧ　Ｉｌｂｐ 手続補正書（方式） 昭和６０年　１−月ユ２日 昭和Ｎ年　！／ｊ士午願第　２フリ２−／）号ｈ１１）
詰　のりＦ−末男　ｂｔ建句　こｋ　ｈ・う′・４、プ
ミ　’ｔｉｔ　内ＪミめつＺ芒１２フ０ラスこ１〜゛ ６、補正をする者 事件′との関係　出　願　人 住所 名　く−〒　７フイサ゛−・イ）コーＡプし−テ、ド４
、代理人 Ｚ補正の内容 ２・ＪＳ’への通ソ　（匁大・　ｒ勾ン’１ｔｓｒよ麦
え唸し）−ｂｎら−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（α）ＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧま
   たは（ｂ）ＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＴＴ
   ＣＡＴＧであるヌクレオチド配列。 （２）　ヌクレオチド配列ＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡｉ
   ’ＴＣＡＴＧ　′Ｔ！たはＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣ
   ＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧを含む細菌の発現プラスミド。 （３）　レプリコン、選択できるマーカー、および外米
   蛋白質をコードしている遺伝子に合成リンカ−によって
   結合している大腸菌Ｃ＄、　ｃｏｌｉ）　ｔｒｐプロモ
   ーターからなり、発現されるべき遺伝子のリボゾーム結
   合部位にＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧまたは
   ＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧで
   あるヌクレオチド配列を有する特許請求の範囲第２項の
   プラスミド。 （４）発現されるべき遺伝子のりボゾーム結合部位とＡ
   、　Ｔ　Ｇ開始コドンとの間に５ｂｐの間隔があり、該
   ５ｂｐはヌクレオチド配列−ＡＡＴＴＣ−（”ある特許
   請求の範囲第３項記載の発現プラスミド。 （５）　発現されるべき遺伝子のりポゾーム結合部位と
   ＡＴＧ開始コドンとの間に１１　ｂｐの間隔があり、該
   １１　ｂｐはヌクレオチド配列−ＡＴＣＧＡ、ＧＡＡＴ
   ＴＣ−である特許請求の範囲第３項の発現プラスミド。 （６）外米蛋白質をコードしている遺伝子がプロレンニ
   ン遺伝子または哺乳類成長ホルモン遺伝子である特許請
   求の範囲第４または５項の細菌の発現プラスミド。 （７）哺乳類成長ホルモン遺伝子がウシ成長ホルモン遺
   伝子、ブタ成長ホルモン遺伝子またはヒト上皮成長因子
   遺伝子である特許請求の範囲第５項の細菌の発現プラス
   ミド。 （８）大腸色ＣＥ、ｃｏｌｉ）において外米蛋白質を産
   生ずるための発現プラスミドであって、 （１）　大腸ＣＥ、ｃｏｌｉ）ｔγｐプロモーター：（
   １１）要素（１ｖ）の翻訳のためのりポゾーム結合部位
   をコード化しているヌクレオチド； （２） ０ｉ＋）　要素（Ｖ）の翻訳のための翻訳開始信号をコ
   ード化しているヌクレオチド； （Ｖ）　上記外米蛋白質のアミノ酸配列をコード化して
   いる構造遺伝子。 からなり、 （Ｖ）リポゾーム結合部位と翻訳開始信号との間に５ｂ
   ｐ−ｉたは１１　ｂｐの間隔があるプラスミド。 （９）外米蛋白質ＤＮＡ配列の構造遺伝子と同じ読み取
   り枠に翻訳停止コドンを有し、該コドンはンンーダルガ
   ルノ（Ｓｈｉｎｅ　−Ｄａｌ　ｇａｒｎｏ　）配列の前
   にある特許請求の範囲第８項の発現プラスミド。 ドか５゛翫・６発現プラスミド。 ０１）第１図および第４図における制限エンドヌクレア
   ーゼ地図によって示されることを特徴とするプラスミド
   ｐＰＦＺ−Ｒ２およびｐ　ＰＦＺ　−Ｒ４゜（２）プラ
   スミドｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２゜（２）プラスミドｐＢＧＨ
   −３０１゜ （３） ０◇　プラスミド７＋ＧＨ１０７゜ ０５）プラスミドＥＧＦ−Ｒ２゜ （杓特許請求の範囲第２〜７項のいずれかのプラスミド
   からなる大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）。 （１７）ｐｐｐｚ−Ｒ２を有しＡ、’ｊＣＣ３９！５４
   ４の識別特性を有する大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＨＢ
   　１０１である特許請求の範囲第１６項の大腸菌。 （卸　ｐＰＦＺ−Ｒ４を有しＡＴＣＣ３９５４３の識別
   特性を有する大腸菌＜Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１
   である特許請求の範囲第１６項の大腸菌。 （１９）同化性のＩ炭素、窒素２よび無機塩源からなる
   水性培地中で特許請求の範囲第２項ないし第７項のいず
   れかに記載のプラスミドを有する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
   ）からなる微生物を実質的量の細菌産生蛋白質が発現さ
   れる徒で培養することからなる方法。 （２０）同化性の炭素、窒素および無機塩源からなる水
   性栄養培地中でプラスミドｐＰＦＺ−Ｒ２捷たはｐＰＦ
   Ｚ−Ｒ４を含む大腸菌ＣＥ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２菌
   株からなり各々ＡＴＣＣ３９５４，４＄−よびＡＴＣＣ
   （４） ３９５４３の　ＩＪ特性を有する微生物を実質的量のプ
   ロレンニンが発現されるまで培養し該プロレンニンを単
   離することからなるプロキモシンの製造方法。 Ｑυ（ｃＬ）プラスミドｐｔｒｐＬＩ−Ｒ４−Ｂ４８を
   制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ■およびＢａｍ　ＨＩ
   で切断してｔｒｐプロモーターを有する断片を得；（ｂ
   ）　プラスミドｐＣＲ１０１を制限エンドヌクレアーゼ
   Ｈｉｎｄ■およびＫｐｎ　Ｉで切断して断片化した線状
   プラスミドＤＮＡを得： （ｃ）　段階（ｂ）から４７７２　ｂＬｐの大ぎいベク
   ター断片と９０６　ｂｐの小さな断片を単離し；（ｄ）
   　さらに上記率さな断片を制限エンドヌクレアーゼＢａ
   ｍＨＩで切断して２３５　ｂ、ｐのＢａｍＨＩ　−Ｋｐ
   ｎ　Ｉ断片を生成し： （ｇ）　段階（α）および（ｄ）の断片を段階（Ｃ）の
   大きなベクター断片と結合してプラスミドｐＰＦＺ−Ｒ
   ４を得ること からなるプラスミドｐＰＦＺ−，Ｒ４の製造方法。 （２２）　（ａ）　プラスミドｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２−Ｂ
   ４８を制（５） 限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｆｆｌおよびＢａｒｎ、
   ＨＩで切断してｔｒｐプロモーターを有する断片を得；
   （ｂ）プラスミドｐＣＲ１０１を制限エンドヌクレアー
   ゼＨｉｎｃｌ■およびＫｐｎ　Ｉ　で切断して断片化さ
   れた線状プラスミドＤＮＡを得： （ｃ）　段階（ｂ）から４７７２　ｂｐの大きなベクタ
   ー断片および９０６　ｂｐの小さな断片を単離し；（ｄ
   ）　さらに上記率さな断片を制限エンドヌクレアーゼＢ
   ａｍＨＩで切断して２３５　ｂｐのＢ　ａ　ｍＨＩ−Ｋ
   ｐｎ断片を生成し； ＜ｅ）　段階（ａ）および（ｄ）の断片を段階（ｃ）の
   大きなベクター断片と結合させてプラスミドｐＰＦＺ−
   Ｒ２を得ること からなるプラスミドｐＰＦＺ−Ｒ２の製造方法。 （２）（α）プラスミドｐｔγｐＬＩをＣ１αＩで切断
   して線状プラスミドＤＮＡを得。 （ｂ）上記線状プラスミドＤＮＡをフレナラ＜Ｋｌｅｎ
   ｏｗ）ポリメラーゼで処理して鈍い末端を有する線状プ
   ラスミドを得； （Ｃ）　ｐｔｒｐＬＩからの上記鈍い末端を有する線（
   ６） 状化されたプラスミドＤＮＡと合成二本鎖ＥｃｏＲＩリ
   ンカ− （ｉ）　５’ＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＴ３’３’ＧＧＴＡ
   ＣＴＴＡＡＧＡ３’ または （ｉ＋）　５’ＡＧＡ、Ａ、ＴＴＣＡＴＧＧ　３’３　
   ’ＴＣＴＴＡ、ＡＧＴＡＣＣ５’ を結合させてプラスミドｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２およびｐｔ
   ｒｐＬＩ−Ｒ４を得・ （ｄ）　ＩＪンカ−の接合点でＤＮＡ配列を決定するこ
   とにより上記プラスミドを同定することからなるプラス
   ミドｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２およびｐｔｒｐＬＩ−Ｒ４の製
   造方法。