JPH0272892A - 蛋白質の製造方法 - Google Patents
蛋白質の製造方法Info
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- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の利用分野
本発明は細菌において外来蛋白質を発現せしめるための
組換えＤＮＡ技術に関する。よシ詳しくは、大腸菌（Ｅ
ａｃｈａｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてプロキモシ
ン及び哨乳類の成長ホルモンの有効な直接的発現方法及
びそのための手段に関する。
組換えＤＮＡ技術に関する。よシ詳しくは、大腸菌（Ｅ
ａｃｈａｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてプロキモシ
ン及び哨乳類の成長ホルモンの有効な直接的発現方法及
びそのための手段に関する。
従来の技術
子牛レンニン（キモシン）、すなわちチーズ製造に使用
するだめの好適な牛乳凝固プロテアーゼは供給が不足し
ている。他の牛乳凝固剤、すなわちカビの蛋白分解酵素
が開発研究されてきた。しかし、これらの蛋白分解活性
が大きいのでチーズの収量を低下させ、しばしば苦味を
与える。
するだめの好適な牛乳凝固プロテアーゼは供給が不足し
ている。他の牛乳凝固剤、すなわちカビの蛋白分解酵素
が開発研究されてきた。しかし、これらの蛋白分解活性
が大きいのでチーズの収量を低下させ、しばしば苦味を
与える。
牛乳凝固プロテアーゼの安定且つ充分な供給は経済的に
有利なので何人かの研究者がこの問題に組換えＤＮＡ技
術を適用してきた。Ｂａｐｐｘεｔａｒ。
有利なので何人かの研究者がこの問題に組換えＤＮＡ技
術を適用してきた。Ｂａｐｐｘεｔａｒ。
Ｊ、Ｂｉｏｃｈａｍ、 ９０ ： ９０１−９０４（１
９８１）は大腸ｍ （Ｅ、ｃｏＬｉ）のプロレンニン（
フロキモシン）の構造遺伝子のクローニングを報告して
いる。続く文献として、Ｂｅｐｐｕ ａｔ ａｌ、Ｊ、
Ｂｉｏｃｈａｍ、 ９１：１０８５−１０８８（１９８
２）は大腸菌（Ｅ。
９８１）は大腸ｍ （Ｅ、ｃｏＬｉ）のプロレンニン（
フロキモシン）の構造遺伝子のクローニングを報告して
いる。続く文献として、Ｂｅｐｐｕ ａｔ ａｌ、Ｊ、
Ｂｉｏｃｈａｍ、 ９１：１０８５−１０８８（１９８
２）は大腸菌（Ｅ。
ｃｏｌｉ）の中でクローンされた子牛プロレンニンｃ
Ｄ ＃ Ａのヌクレオチド配列を報告している。
Ｄ ＃ Ａのヌクレオチド配列を報告している。
１ａｃＵＶ５ プロモーターを有する発現プラスミド
の構成及びその大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ＞β−ガラクトシ
ダーゼの短いＮ−床端ペプチドに結合されたプロキモシ
ンペプチドのほとんどすべてを含有する融合蛋白質を産
生ずる能力はＢｅｐｐｕ ａｔ ａｌ、、Ｇｏｎｅ１９
：３３７−３４４（１９８２）によって記載されている
。
の構成及びその大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ＞β−ガラクトシ
ダーゼの短いＮ−床端ペプチドに結合されたプロキモシ
ンペプチドのほとんどすべてを含有する融合蛋白質を産
生ずる能力はＢｅｐｐｕ ａｔ ａｌ、、Ｇｏｎｅ１９
：３３７−３４４（１９８２）によって記載されている
。
１９８３年３月２日に公開されたヨーロッパ特許出願筒
７３，０２９号は子牛プロレンニンＤＮＡ含有プラスミ
ド、該プラスミドで形質転換された微生物（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）及びそれらによるプロレンニンの発現を記載してい
る。
７３，０２９号は子牛プロレンニンＤＮＡ含有プラスミ
ド、該プラスミドで形質転換された微生物（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）及びそれらによるプロレンニンの発現を記載してい
る。
１９８２年７月２８日に公開された英国特許出願第２，
０９１，２７１Ａ号は種々のプロモーター（シ狂＋！＋
ｕｌ”（Ｌ ３ ＋等）を使用して発現させることか
らなるレンニン、プロレンニン及びブレ７゜ロレ／ニン
を製造する方法及び薬剤を開示している。プレプロレン
ニンをコードしている開示されたＤＮＡ配列の１つには
５′−床端に転写プロモーターとリボゾーム結合部位が
付加している。プレプロレンニンをコードしているＤＮ
Ａの開始部位ト転写プロモーターとりボゾーム結合部位
を有するＤＮＡ断片との間の距離は変化する。
０９１，２７１Ａ号は種々のプロモーター（シ狂＋！＋
ｕｌ”（Ｌ ３ ＋等）を使用して発現させることか
らなるレンニン、プロレンニン及びブレ７゜ロレ／ニン
を製造する方法及び薬剤を開示している。プレプロレン
ニンをコードしている開示されたＤＮＡ配列の１つには
５′−床端に転写プロモーターとリボゾーム結合部位が
付加している。プレプロレンニンをコードしているＤＮ
Ａの開始部位ト転写プロモーターとりボゾーム結合部位
を有するＤＮＡ断片との間の距離は変化する。
１９８３年１月６日に公開された英国特許出願第２，１
００，７３７Ａ号はキモシン、メチオニンキモシン、フ
ロキモシン、メチオニンプロキモシン、プレプロキモシ
ンを製造する組換えＤＮＡ技術を記載している。大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ）ｔｒｐプロモーター−オペレーター断
片及び転写ターミネータ−開始コドン、及びリボゾーム
結合部位として働くシンーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄ
ａｌｇａｒｎｏ） Ｃ３Ｄ）配列を有するベクターが開
示されている。ＳＤ配列とＡＴＧ配列との間隔の効果に
ついての研究も示されている。
００，７３７Ａ号はキモシン、メチオニンキモシン、フ
ロキモシン、メチオニンプロキモシン、プレプロキモシ
ンを製造する組換えＤＮＡ技術を記載している。大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ）ｔｒｐプロモーター−オペレーター断
片及び転写ターミネータ−開始コドン、及びリボゾーム
結合部位として働くシンーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄ
ａｌｇａｒｎｏ） Ｃ３Ｄ）配列を有するベクターが開
示されている。ＳＤ配列とＡＴＧ配列との間隔の効果に
ついての研究も示されている。
１９８３年４月２０日に公開されたヨーロッパ特許出願
筒７７．１０９号は、プレプロキモシンのための遺伝子
及び二重１ａｃＵＶ５ または修飾されたｔｒｐ系のよ
うな特異的ＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子、すなわちプ
ラスミド、及びそれらを使用して微生物（ラクトバチリ
（１ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、ストレプトコッキ（ｓ
ｔｒｇｐｔｏｃｏｃｃｉ ） 、バチルス（ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ） ”Ｊたは酵母）を形質転換させてその対立
形質又は成熟形としてプレプロキモシンを生成する形質
転換体を形成することを記載している。
筒７７．１０９号は、プレプロキモシンのための遺伝子
及び二重１ａｃＵＶ５ または修飾されたｔｒｐ系のよ
うな特異的ＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子、すなわちプ
ラスミド、及びそれらを使用して微生物（ラクトバチリ
（１ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、ストレプトコッキ（ｓ
ｔｒｇｐｔｏｃｏｃｃｉ ） 、バチルス（ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ） ”Ｊたは酵母）を形質転換させてその対立
形質又は成熟形としてプレプロキモシンを生成する形質
転換体を形成することを記載している。
ヨーロッパ特許出願筒３６，７７６号（１９８１年９月
３０日公開）は、減衰領域が削除されたｔｒｐフロモー
ター−オペレーターを有スる発現ベクター、及びその製
造方法を記載している。このベクターを有する形質転換
体はトリプトファンに冨んだ培地で生育し得、菌体の生
育は、ｔｃｐプロモーター−オペレーター系の制御の下
で他の挿入物によってコード化された外来ペプチドの早
熟発現によって阻害されることな（進行する。
３０日公開）は、減衰領域が削除されたｔｒｐフロモー
ター−オペレーターを有スる発現ベクター、及びその製
造方法を記載している。このベクターを有する形質転換
体はトリプトファンに冨んだ培地で生育し得、菌体の生
育は、ｔｃｐプロモーター−オペレーター系の制御の下
で他の挿入物によってコード化された外来ペプチドの早
熟発現によって阻害されることな（進行する。
Ｅｍｔａｇａ ａｔ ａＬ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、８０：３６７１−３６７５．１９８３
および日本特願昭５８−３８，４３９号（１９８３年３
月９日出頗）はプロキモシン、ＤＮＡ及び大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ ）ｔｒｐオペロンを有するハイブリッドプラ
スミドの構成、及び前記研究者による報告例より多（プ
ロレンニンを発現させるための用法を開示している。
ｃａｄ、Ｓｃｉ、８０：３６７１−３６７５．１９８３
および日本特願昭５８−３８，４３９号（１９８３年３
月９日出頗）はプロキモシン、ＤＮＡ及び大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ ）ｔｒｐオペロンを有するハイブリッドプラ
スミドの構成、及び前記研究者による報告例より多（プ
ロレンニンを発現させるための用法を開示している。
さらに上記日本出願の１９８３年１１月１５日付手続補
正畜によるとＳＤ配列とプロキモシンの開始コドンとの
間隔を変化させることによる効果及びプロキモシンのＮ
−末端アミノ酸を長さの異なるペプチドに換えることに
よる効果に部分的に言及している。
正畜によるとＳＤ配列とプロキモシンの開始コドンとの
間隔を変化させることによる効果及びプロキモシンのＮ
−末端アミノ酸を長さの異なるペプチドに換えることに
よる効果に部分的に言及している。
Ｈａｒｒｉｓ ａｔ ａｌ、Ｎｘｃｌａｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｍｓｅａｒｃん１０：２１７７−２１８
７（１９８２）はプレプロキモシンのためのｃＤＮＡコ
ードのクローニング及びヌクレオチド配列を報告してい
る。ＧＯｆｆａｔ ａｌ、Ｇａｎｇ ２７ Ｈ３５〜４
６ （１９８４）は酵母で６るサツカロマイセス・セレ
ビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ ｃｇｒｇｖｉ
ｓｉａａ ）における子牛プロキモシンの発現を記載し
ている。プレプロキモシンｃ Ｄ Ｎ Ａの制限エンド
ヌクレアーゼ開裂地図及びＤＮＡ配列は出版されており
ＣＢｅｐｐ１４ａｔａ１．、Ｊ、Ｂｉｏｃｈａｍ、９
１ ： １０８５−１０８８（１９８２））、本明ａ簀
にも参考のため図面として添付している。
ｃ１ｄｓ Ｒｍｓｅａｒｃん１０：２１７７−２１８
７（１９８２）はプレプロキモシンのためのｃＤＮＡコ
ードのクローニング及びヌクレオチド配列を報告してい
る。ＧＯｆｆａｔ ａｌ、Ｇａｎｇ ２７ Ｈ３５〜４
６ （１９８４）は酵母で６るサツカロマイセス・セレ
ビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ ｃｇｒｇｖｉ
ｓｉａａ ）における子牛プロキモシンの発現を記載し
ている。プレプロキモシンｃ Ｄ Ｎ Ａの制限エンド
ヌクレアーゼ開裂地図及びＤＮＡ配列は出版されており
ＣＢｅｐｐ１４ａｔａ１．、Ｊ、Ｂｉｏｃｈａｍ、９
１ ： １０８５−１０８８（１９８２））、本明ａ簀
にも参考のため図面として添付している。
哨乳類の成長ホルモン（ヒト上皮生長因子（１，−ＥＧ
Ｆ）を含む）は動物の代謝を改善する効力があるのでか
なり重要である。それらの−収約な使用は、非常に入手
源が限られているため制限されてきた。上記ホルモンを
適当に供給すれば経済上の利益があるので数人の研究者
が組換えＤＮＡ技術をこの問題に適用してきた。
Ｆ）を含む）は動物の代謝を改善する効力があるのでか
なり重要である。それらの−収約な使用は、非常に入手
源が限られているため制限されてきた。上記ホルモンを
適当に供給すれば経済上の利益があるので数人の研究者
が組換えＤＮＡ技術をこの問題に適用してきた。
ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）すなわちウロガストロンは
上皮組織成長の促進剤であるだけでなく胃酸分泌の有効
な阻害剤でもある。ＥＧＦの効力全体については主とし
て充分な材料がないので研究されていなかった。
上皮組織成長の促進剤であるだけでなく胃酸分泌の有効
な阻害剤でもある。ＥＧＦの効力全体については主とし
て充分な材料がないので研究されていなかった。
ウロガストロンの構造遺伝子及びそのポリペプチド同族
体の遺伝子の製造、クローニング及び発現のために組換
えＤＮＡ技術を使用することは国際特許出願／１６８３
１０４０３０（１９８３年１１月２４日公開）に記載さ
れている。
体の遺伝子の製造、クローニング及び発現のために組換
えＤＮＡ技術を使用することは国際特許出願／１６８３
１０４０３０（１９８３年１１月２４日公開）に記載さ
れている。
クシ生長ホルモンｍ ＲＡ’ Ａに相補性のＤＮＡのク
ローニング、そのヌクレオチド配列及び該配列から予測
される相当するアミノ酸配列がＭｉｌｌｅｒらのヨーロ
ッパ特許出願第４７，６００号（１９８３年３月１７日
公開）およびＪ、Ｂｉｏｃｈａｍ、 ２５５ ＊７５２
１−７５２４（１９８０）、及びＷｏｙｃｈｉｋらのＮ
ｘｃｌｇｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １０
＊ ７１９７−７２１０（１９８２）に報告されてい
る。英国特許出願第２，０７３，２４５Ａ号（１９８１
年１０月１４日公開）及びＫａｓｋａｔら、Ｎｘｃｌｇ
ｉｃ ａｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ９ 、１９−３
０（１９８１） にはウシ生長ホルモンのクローニン
グ及び大腸菌（Ｅ 、 ｃｏｌｉ）Ｈ７Ｊ１０１の中で
融合したペーターラクタマーゼーウシ成長ホルモン蛋白
質として発現させることを述べている。
ローニング、そのヌクレオチド配列及び該配列から予測
される相当するアミノ酸配列がＭｉｌｌｅｒらのヨーロ
ッパ特許出願第４７，６００号（１９８３年３月１７日
公開）およびＪ、Ｂｉｏｃｈａｍ、 ２５５ ＊７５２
１−７５２４（１９８０）、及びＷｏｙｃｈｉｋらのＮ
ｘｃｌｇｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １０
＊ ７１９７−７２１０（１９８２）に報告されてい
る。英国特許出願第２，０７３，２４５Ａ号（１９８１
年１０月１４日公開）及びＫａｓｋａｔら、Ｎｘｃｌｇ
ｉｃ ａｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ９ 、１９−３
０（１９８１） にはウシ生長ホルモンのクローニン
グ及び大腸菌（Ｅ 、 ｃｏｌｉ）Ｈ７Ｊ１０１の中で
融合したペーターラクタマーゼーウシ成長ホルモン蛋白
質として発現させることを述べている。
ウシ生長ホルモン遺伝子を発現させる方法、プラスミド
及びそれを使用するためのプラスミド宿主がヨーロッパ
特許出願第６７．０２６号及び第６８．６４６号（各々
１９８２年１２月１５日、１９８３年１月５日に公開）
に記載されている。
及びそれを使用するためのプラスミド宿主がヨーロッパ
特許出願第６７．０２６号及び第６８．６４６号（各々
１９８２年１２月１５日、１９８３年１月５日に公開）
に記載されている。
各々の出願には宿主微生物として大腸菌（Ｅ 、 ｃｏ
ｌｉ）が開示されている。後者の出願、すなわち米国特
許第４，４４３，５３９号（１９８４年４月１７日発行
）のヨーロッパ特許出願はサツカロミセス・セレビシア
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｇｓ ｃｇｒｅｖｉａｉａ
ａ ）を宿主微生物として開示している。
ｌｉ）が開示されている。後者の出願、すなわち米国特
許第４，４４３，５３９号（１９８４年４月１７日発行
）のヨーロッパ特許出願はサツカロミセス・セレビシア
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｇｓ ｃｇｒｅｖｉａｉａ
ａ ）を宿主微生物として開示している。
Ｓｇｅｂｖｒｇ ら、 ＤＮＡ、２ ３７〜４５（１
９８３）はウシまたはブタ脳下垂体からのポリ（、、ｆ
）、、／？ Ｎ Ａを使用して製造されたＣＤＮＡの細
菌におけるクローニング及び成熟動物（ウシまたはブタ
）の生長ホルモンの有効な細菌での産生を達成する発現
ベクターの構成を報告して〜・る。
９８３）はウシまたはブタ脳下垂体からのポリ（、、ｆ
）、、／？ Ｎ Ａを使用して製造されたＣＤＮＡの細
菌におけるクローニング及び成熟動物（ウシまたはブタ
）の生長ホルモンの有効な細菌での産生を達成する発現
ベクターの構成を報告して〜・る。
採用される技術は、Ｇｏａｄｄａｌら、Ｎａｔ１４ｖｅ
ｒ２８１．５４４−５４８（１９７９）にお（・て大腸
菌（Ｅ、 ｃｏＥｉ）においてヒト成長ホルモンの直接
発現について記載された方法と類似のものである。各々
の場合、使用される細菌の発現ベクターは大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ ） ｔｒｙ’プロモーターの制御下に使用さ
れた。 ヨーロツ／′！？特許出願第１０３．３９５及
び１０４．９２０号（１９８４年３月２１日及び４月４
日公開）にはラフ成長ホルモン様ポリペプチド及びブタ
成長ホルモン様ざリペプチドを各々組換えＤＮＡ技術で
生産したことを記載している。
ｒ２８１．５４４−５４８（１９７９）にお（・て大腸
菌（Ｅ、 ｃｏＥｉ）においてヒト成長ホルモンの直接
発現について記載された方法と類似のものである。各々
の場合、使用される細菌の発現ベクターは大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ ） ｔｒｙ’プロモーターの制御下に使用さ
れた。 ヨーロツ／′！？特許出願第１０３．３９５及
び１０４．９２０号（１９８４年３月２１日及び４月４
日公開）にはラフ成長ホルモン様ポリペプチド及びブタ
成長ホルモン様ざリペプチドを各々組換えＤＮＡ技術で
生産したことを記載している。
ウシ成長ホルモンを酪農用の牛に投与すると乳の量が増
加し、飼料摂取対乳量の比を改善する［：Ｍａｃｋｌｉ
ｎ、Ｊ、Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｇｎｃｓ ５６ ｒ ５
７５−５８０（１９７３）：ｉ。 １９８３年８月３日
に公開されたヨーロッパ特許出願第８５，０３６，４号
は生合成された（デＤＮＡによる）ウシ成長ホルモンお
よび／またはその断片もウシの乳量を増し、ブタや他の
畜産用動物の肉、毛、卵、毛皮の生産を増加することを
開示している。
加し、飼料摂取対乳量の比を改善する［：Ｍａｃｋｌｉ
ｎ、Ｊ、Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｇｎｃｓ ５６ ｒ ５
７５−５８０（１９７３）：ｉ。 １９８３年８月３日
に公開されたヨーロッパ特許出願第８５，０３６，４号
は生合成された（デＤＮＡによる）ウシ成長ホルモンお
よび／またはその断片もウシの乳量を増し、ブタや他の
畜産用動物の肉、毛、卵、毛皮の生産を増加することを
開示している。
１９８０年４月１６日に公開された英国特許明細書簡１
，５６５，１９０号は微生物を形質転換できる組換えプ
ラスミドベクターであってそのヌクレオチド配列の中に
ある動物種の成長ホルモンをコードしているサブ配列を
有するものを開示している。米国特許第４，２３７，２
２４号は外来ＤＮＡを単細胞微生物に導入するためのプ
ラスミドベクターを記載している。
，５６５，１９０号は微生物を形質転換できる組換えプ
ラスミドベクターであってそのヌクレオチド配列の中に
ある動物種の成長ホルモンをコードしているサブ配列を
有するものを開示している。米国特許第４，２３７，２
２４号は外来ＤＮＡを単細胞微生物に導入するためのプ
ラスミドベクターを記載している。
選択された真核生物のＤＮＡ断片のためのＨｉｎｄｍ挿
入部位を有し、該部位がｔｒｐプロモーターのような細
菌のプロモーターに隣接しており、該ＤＮＡ断片の転写
及び翻訳が上記プロモーターによって制御されるプラス
ミドが米国特許第４．３４９，６２９号に記載されてい
る。
入部位を有し、該部位がｔｒｐプロモーターのような細
菌のプロモーターに隣接しており、該ＤＮＡ断片の転写
及び翻訳が上記プロモーターによって制御されるプラス
ミドが米国特許第４．３４９，６２９号に記載されてい
る。
クローン化された遺伝子の発現のレベルは遺伝子複写の
数及び転写と翻訳の効率のような因子の数によって影響
される。挿入された遺伝子の効率的な転写を行５には強
力なプロモーターを必要とし、効率的な翻訳を行うには
ｍＲＮＡの中の適当なりボゾーム結合部位及びｒｂｓと
翻訳開始コドンとの間の適当な間隔を必要とする。プロ
モーターは蛋白質をコードして℃・るＤＮＡ （構造遺
伝子）のその部分より先に位置する。リボゾーム結合部
位（ｒｂｇ）、すなわちリボゾーム確認配列は少（とも
３〜９ ｂｐの長さの７フーダルガルノ（５ｈｉ−ｎｅ
−Ｄａ ｌ ｇａｒｎｏ ） （ＳＤ）配列として知
られる配列からなると信じられている。蛋白質のアミノ
末端メチオニンをコード化しているＡＵＧより３〜１１
ｂｐ上流から始まり、１６ＳＲＮＡの３′−末端配列に
対して相補性である。１つの遺伝子に対する翻訳開始信
号（ＡＵＧ）からプロモーターが分離すると産生される
蛋白質の量に影響する（Ｇｕａデａｎｔｅら、上記文献
、および本明細曹中で引用の文献）。
数及び転写と翻訳の効率のような因子の数によって影響
される。挿入された遺伝子の効率的な転写を行５には強
力なプロモーターを必要とし、効率的な翻訳を行うには
ｍＲＮＡの中の適当なりボゾーム結合部位及びｒｂｓと
翻訳開始コドンとの間の適当な間隔を必要とする。プロ
モーターは蛋白質をコードして℃・るＤＮＡ （構造遺
伝子）のその部分より先に位置する。リボゾーム結合部
位（ｒｂｇ）、すなわちリボゾーム確認配列は少（とも
３〜９ ｂｐの長さの７フーダルガルノ（５ｈｉ−ｎｅ
−Ｄａ ｌ ｇａｒｎｏ ） （ＳＤ）配列として知
られる配列からなると信じられている。蛋白質のアミノ
末端メチオニンをコード化しているＡＵＧより３〜１１
ｂｐ上流から始まり、１６ＳＲＮＡの３′−末端配列に
対して相補性である。１つの遺伝子に対する翻訳開始信
号（ＡＵＧ）からプロモーターが分離すると産生される
蛋白質の量に影響する（Ｇｕａデａｎｔｅら、上記文献
、および本明細曹中で引用の文献）。
この文献及び１９８２年６月１日に発行のＰｔａｓｈｌ
ｕらの米国特許第４，３３２，８９２号には、発現に際
して遺伝子の５′−末端からの種々の距離に″移動性プ
ロモーター”断片を置（効果を記載している。
ｕらの米国特許第４，３３２，８９２号には、発現に際
して遺伝子の５′−末端からの種々の距離に″移動性プ
ロモーター”断片を置（効果を記載している。
ヌクレオチド配列の明確な変形、特にＳＤ領領域開始コ
ドンの間の変化についての効果に関する他の参考文献は
以下の如くである： Ｓｃｈｇｒａｒ ａｔ ａｌ、、Ｎ１Ｌｃ１．Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｇｓ、 ８ ：３８９５ ３９０７ （１９８０
） ； Ｓｈｇｐａｒｄ ｇｔａｌ、、ＤＨＡ Ｉ＝
１２５−１３１（１９８２）；Ｗｉｎｄａｓｓ ａｔ
ａｌ、、Ｉ’ｂｂｃ１．Ａｃ１ｄｓ Ｒｇｓ、 １０
：６６３９ ６６５７Ｃ１９８２）：ＤｅＢｏｅｒ ｇ
ｔａｌ、、ＤＮＡ ２：２３１−２３５（１９８３）
；Ｔａｃｏｎ ａｔ ａｌ、、Ｍｏ１ｒｃ、ｇｇｎ、Ｇ
ｇｎａｔ、 １７７ 。
ドンの間の変化についての効果に関する他の参考文献は
以下の如くである： Ｓｃｈｇｒａｒ ａｔ ａｌ、、Ｎ１Ｌｃ１．Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｇｓ、 ８ ：３８９５ ３９０７ （１９８０
） ； Ｓｈｇｐａｒｄ ｇｔａｌ、、ＤＨＡ Ｉ＝
１２５−１３１（１９８２）；Ｗｉｎｄａｓｓ ａｔ
ａｌ、、Ｉ’ｂｂｃ１．Ａｃ１ｄｓ Ｒｇｓ、 １０
：６６３９ ６６５７Ｃ１９８２）：ＤｅＢｏｅｒ ｇ
ｔａｌ、、ＤＮＡ ２：２３１−２３５（１９８３）
；Ｔａｃｏｎ ａｔ ａｌ、、Ｍｏ１ｒｃ、ｇｇｎ、Ｇ
ｇｎａｔ、 １７７ 。
４２７−４３８（１９８０）；およびＩｔｏｈ ｇｔａ
ｌ、、ＤＮＡ ３，１５７−１６５（１９８４）。
ｌ、、ＤＮＡ ３，１５７−１６５（１９８４）。
問題を解決するための手段
本発明は、高レベル外来遺伝子発現のために一般的に有
用なブロモ−タープｂｓ発現要素；外来蛋白質（原核ま
たは真核）の直接発現のための発現要素を有する発現プ
ラスミドを含む組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換
体を使用して外来蛋白質な産生ずる方法に関する。より
詳細には、本発明は、プロキモシンのよ５な蛋白質およ
びウシとブタの成長ホルモン及びヒト上皮成長因子のよ
っな唱乳類ノ成長ホルモンをコード化している外来遺伝
子の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）による高度のレベルの発現
のために有用な発現プラスミドを大腸菌に組込んで外来
蛋白質を産生させる方法に関する。上記プラスミドは、
選択できるマーカー；レプリコン、すなわち宿主細胞に
おける自律的な被写をコントロールする領域からなるＤ
ＮＡ配列；および合成りＮＡ＋）ンカーによって上記外
来蛋白質ｃ Ｄ Ｎ Ａ配列（遺伝子）に結合されてい
る大腸菌（Ｅ。
用なブロモ−タープｂｓ発現要素；外来蛋白質（原核ま
たは真核）の直接発現のための発現要素を有する発現プ
ラスミドを含む組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換
体を使用して外来蛋白質な産生ずる方法に関する。より
詳細には、本発明は、プロキモシンのよ５な蛋白質およ
びウシとブタの成長ホルモン及びヒト上皮成長因子のよ
っな唱乳類ノ成長ホルモンをコード化している外来遺伝
子の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）による高度のレベルの発現
のために有用な発現プラスミドを大腸菌に組込んで外来
蛋白質を産生させる方法に関する。上記プラスミドは、
選択できるマーカー；レプリコン、すなわち宿主細胞に
おける自律的な被写をコントロールする領域からなるＤ
ＮＡ配列；および合成りＮＡ＋）ンカーによって上記外
来蛋白質ｃ Ｄ Ｎ Ａ配列（遺伝子）に結合されてい
る大腸菌（Ｅ。
ｃｏｌｉ） ｔｒｐプロモーターがらなり、長さを変化
させることができる新規なりボゾーム結合領域からなる
。本発明のプラスミドの特徴はＡＴＧ開始コドンより上
流にあろりポゾーム結合領域にヌクレオチド配列５／
ＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧ３′または５′
ＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧ３
’ が存在することである。−好適発現プラスミドはシ
ンーダルガルノ配列の直前の蛋白質をコードしている配
列として同じ読み取り枠内に翻訳停止コドン（ＴＡＡ）
をさらに有意な特徴として有している。
させることができる新規なりボゾーム結合領域からなる
。本発明のプラスミドの特徴はＡＴＧ開始コドンより上
流にあろりポゾーム結合領域にヌクレオチド配列５／
ＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧ３′または５′
ＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧ３
’ が存在することである。−好適発現プラスミドはシ
ンーダルガルノ配列の直前の蛋白質をコードしている配
列として同じ読み取り枠内に翻訳停止コドン（ＴＡＡ）
をさらに有意な特徴として有している。
分子生物学の技術の状態では、充分に開発されたレベル
である蛋白質またはポリペプチドを発現すべきハイブリ
ッドプラスミドのインビトロでの形成は、上記ポリペプ
チドをコード化しているｃＤＮＡ配列および該配列の制
限エンドヌクレアーゼ開裂地図の知識から可能である。
である蛋白質またはポリペプチドを発現すべきハイブリ
ッドプラスミドのインビトロでの形成は、上記ポリペプ
チドをコード化しているｃＤＮＡ配列および該配列の制
限エンドヌクレアーゼ開裂地図の知識から可能である。
しかし、これにもかかわらず、プラスミド内に特定の臨
界的でさえある配置で上記ＤＮＡ配列を適当に微生物に
導入すると、ポリペプチドを有意且つ予期し得ない程高
度に発現させるであろうとい５ことを示唆する根拠は当
分野において何ら存在しない。
界的でさえある配置で上記ＤＮＡ配列を適当に微生物に
導入すると、ポリペプチドを有意且つ予期し得ない程高
度に発現させるであろうとい５ことを示唆する根拠は当
分野において何ら存在しない。
ここに記載の組換え微生物は、以前に報告されている微
生物が産生じ、初期に組換えＤＮＡ技術によって経済的
規模で産生じたよりも有意に大きな収量で外来蛋白質を
発現する。
生物が産生じ、初期に組換えＤＮＡ技術によって経済的
規模で産生じたよりも有意に大きな収量で外来蛋白質を
発現する。
当業者は知っているとおり、組換え微生物は多くの方法
、たとえば形質転換、形質導入、接合、トランスフェク
ションによって製造によって製造できる。したがって、
１組換え微生物”という用語には、上記いずれの方法に
よって製造されようが外来蛋白質を産生じ得る微生物を
含める。別法として、本明細書で使用する組換え微生物
の定義にはその微生物が組換え技術により製造された場
合外来または外因性配列の外来蛋白質を発現せしめるこ
とができる微生物を含める。
、たとえば形質転換、形質導入、接合、トランスフェク
ションによって製造によって製造できる。したがって、
１組換え微生物”という用語には、上記いずれの方法に
よって製造されようが外来蛋白質を産生じ得る微生物を
含める。別法として、本明細書で使用する組換え微生物
の定義にはその微生物が組換え技術により製造された場
合外来または外因性配列の外来蛋白質を発現せしめるこ
とができる微生物を含める。
転写プロモーター配列より下流に細菌のプラスミドに挿
入した場合大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）において効率のよい
発現を行なわせる原核生物または真核生物の蛋白質をコ
ード化している遺伝子のりボゾーム結合部位について本
明細書で記載したヌクレオチド配列を得ることが重要で
ある。記載されたリボゾーム結合部位領域はＡＴＧ開始
コドンのすぐ上流の都合の良いＥｃｏ ＲＩ制限エンド
ヌクレアーゼ開裂部位を含み、これによって、蛋白質翻
訳開始コドンを含むＤＮＡ断片を発現ベクターのＳＤ配
列の後に挿入する方法を提供する。換言すれば、ここで
述べる発現プラスミドの遺伝子は原核生物の蛋白質か真
核生物の蛋白質をコード化している遺伝子ならよい。た
とえば、ここで記載する、リボゾーム結合部位とＡＴＧ
開始コドンとの間のヌクレオチド配列は、フロキモシン
（フロレンニン）、ウシ成長ホルモン、ブタ生長ホルモ
ン、ヒト上皮成長因子（ウロガストロン）のよ５なｃ
Ｄ ＃ Ａ配列の高度の発現を可能にする。これらの蛋
白質、すなわちウシおよびブタ成長ホルモン及びヒト上
皮成長因子は一括して補乳類成長因子と称されている。
入した場合大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）において効率のよい
発現を行なわせる原核生物または真核生物の蛋白質をコ
ード化している遺伝子のりボゾーム結合部位について本
明細書で記載したヌクレオチド配列を得ることが重要で
ある。記載されたリボゾーム結合部位領域はＡＴＧ開始
コドンのすぐ上流の都合の良いＥｃｏ ＲＩ制限エンド
ヌクレアーゼ開裂部位を含み、これによって、蛋白質翻
訳開始コドンを含むＤＮＡ断片を発現ベクターのＳＤ配
列の後に挿入する方法を提供する。換言すれば、ここで
述べる発現プラスミドの遺伝子は原核生物の蛋白質か真
核生物の蛋白質をコード化している遺伝子ならよい。た
とえば、ここで記載する、リボゾーム結合部位とＡＴＧ
開始コドンとの間のヌクレオチド配列は、フロキモシン
（フロレンニン）、ウシ成長ホルモン、ブタ生長ホルモ
ン、ヒト上皮成長因子（ウロガストロン）のよ５なｃ
Ｄ ＃ Ａ配列の高度の発現を可能にする。これらの蛋
白質、すなわちウシおよびブタ成長ホルモン及びヒト上
皮成長因子は一括して補乳類成長因子と称されている。
特定の外来遺伝子を細菌によって生産するとアミノ末端
にメチオニン残基を有するかあるいは有しないポリペプ
チドを産生できる。したがって、０７０ロキモシン′（
フロレンニン）ナル用語はメテオニンフ０ロキモシン（
プロレンニン）及ヒブロキモシン（プロレンニン）を含
むものとする。同じことは本明細書で述べる他のポリペ
プチドについてもいえる。さらに、“キモシン’（レン
ニン）というときは、その既知の対立形質（たとえば、
Ａ、Ｂ、など）も含めるものとする。
にメチオニン残基を有するかあるいは有しないポリペプ
チドを産生できる。したがって、０７０ロキモシン′（
フロレンニン）ナル用語はメテオニンフ０ロキモシン（
プロレンニン）及ヒブロキモシン（プロレンニン）を含
むものとする。同じことは本明細書で述べる他のポリペ
プチドについてもいえる。さらに、“キモシン’（レン
ニン）というときは、その既知の対立形質（たとえば、
Ａ、Ｂ、など）も含めるものとする。
本発明は下記例及び添付図面によりさらに詳しく説明さ
れるが本発明の範囲？限定するものではない。
れるが本発明の範囲？限定するものではない。
第１図はプラスミドｐＰＦＺ−Ｒ２およびＲ４（ｐＰＦ
Ｚ−Ｒ）の構成を示すｐＰＦＺ−Ｒ２およびＲ４の各々
に共通の制限地図を含む概略図である。
Ｚ−Ｒ）の構成を示すｐＰＦＺ−Ｒ２およびＲ４の各々
に共通の制限地図を含む概略図である。
図中矢印はｔｃｐプロモーター配列からプロキモシン（
プロレンニン）遺伝子（太い断片として表わした）へと
発現する方向を示している。合成挿入物は空白の箱状の
形で表わした。
プロレンニン）遺伝子（太い断片として表わした）へと
発現する方向を示している。合成挿入物は空白の箱状の
形で表わした。
第２図はプラスミドｐ ｔ ｒｐＬＩ −Ｒ２およびＲ
４の構成のための手順を示す概略図である。
４の構成のための手順を示す概略図である。
第３図はプラスミドｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２−Ｒ４８及びｐ
ｔｒｐＬＩ−Ｒ４−／？４８の構成のための手順を示す
概略図である。
ｔｒｐＬＩ−Ｒ４−／？４８の構成のための手順を示す
概略図である。
第４図はプラスミドｐＰＦＺ−Ｒ２およびｐＰＦＺ−Ｒ
４の各々についてのプロキモシン（フロレンニン）遺伝
子のりボゾーム結合部位と開始コドン（ＡＴＧ）との間
のヌクレオチド配列と間隔を示す概略図である。これは
上記プラスミドがヌクレオチド配列において異なる領域
のみを示す。
４の各々についてのプロキモシン（フロレンニン）遺伝
子のりボゾーム結合部位と開始コドン（ＡＴＧ）との間
のヌクレオチド配列と間隔を示す概略図である。これは
上記プラスミドがヌクレオチド配列において異なる領域
のみを示す。
第５−１及び５−２図は、全長のｂＧＨ遺伝子及び発現
配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略図
である。プラスミドｐＢＧＨ−１０２はｐＢＲ３２２の
アンピシリン耐性遺伝子にクローンされたｂＧＨｃＤＮ
Ａ配列（黒く塗った箱形）を含む。ｂＧＨの新しいアミ
ン末端をコードしている合成りＮＡなりＢＲ３２２ｃ点
線の箱形）のＥＣｏＲｌ部位とＨｉｎｄ ■部位に挿入
した。種々のインビトロでの複製を行って完全な修飾さ
れたｂＧＨ遺伝子を担持するプラスミドｐＢＧＨ−２１
２を構成した。プラスミドｐＢＧＨ−２１２はＥｃ。
配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略図
である。プラスミドｐＢＧＨ−１０２はｐＢＲ３２２の
アンピシリン耐性遺伝子にクローンされたｂＧＨｃＤＮ
Ａ配列（黒く塗った箱形）を含む。ｂＧＨの新しいアミ
ン末端をコードしている合成りＮＡなりＢＲ３２２ｃ点
線の箱形）のＥＣｏＲｌ部位とＨｉｎｄ ■部位に挿入
した。種々のインビトロでの複製を行って完全な修飾さ
れたｂＧＨ遺伝子を担持するプラスミドｐＢＧＨ−２１
２を構成した。プラスミドｐＢＧＨ−２１２はＥｃ。
Ｒ（によって開裂され、ｔｒｙ）プロモーター−オペレ
ーター配列の異なる変化したものを有するＤＮＡ断片を
挿入した。矢印は配列解読の５′→３′方向、すなわち
転写の方向を示す。
ーター配列の異なる変化したものを有するＤＮＡ断片を
挿入した。矢印は配列解読の５′→３′方向、すなわち
転写の方向を示す。
第６−１及び６−２図はｂＧＨ産生のための細菌の発現
プラスミドの構成を示す概略図である。
プラスミドの構成を示す概略図である。
プラスミドｂＢにＨ−２１２−Ｒはｔｃｐプロモーター
配列（第５図参照）によって成熟ｂＧＨを完全に直接発
現させる遺伝子を担持している。これらのプラスミドは
１ｌｉｎｄ ＩＩＩによって開裂され、ｐｖｓ■によっ
て部分的に切断され、２つの約９２０ ｂｐＨｉｎｄ
ｉｌｌ −Ｐｖｘ■断片を単離した。ｂＧＩＩのＣ−末
端をコードする合成りＮＡ断片がｐＢＲ３２２（空白の
箱形）のＥｃｏＲ１部位およびＨｉｎｄ １１部位に挿
入された。このサブクローンはＰｖｓ ＵおよびＢａｎ
ＨＩで開裂され、３６５ ｂｐＤＮＡ 断片を単離
した。Ｈｉｎｄ Ｉ［［とＢａ−Ｒ７で開裂後大きいベ
クター断片（３，ｃａ ９ ｓ ｂｐ）をｐＢＲ３２２
がら単離した。これら２つのプロモーターｂＧＨ遺伝子
含有断片（９２０ｂｐ）を別々に合成りＮＡ含有断片（
３６５ｂｐ）およびベクター断片（３９９５ｂｐ）と混
合した。この混合物をＴ Ａ ＩＪガーゼでつなげて適
当な大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ）ＨＥ １０１の形質転換
に使用された。異なるｂＧＨ発現プラスミドはｂ ＢＧ
ＩＩ−３０１およびｐＢＧＨ−３７５と称される。
配列（第５図参照）によって成熟ｂＧＨを完全に直接発
現させる遺伝子を担持している。これらのプラスミドは
１ｌｉｎｄ ＩＩＩによって開裂され、ｐｖｓ■によっ
て部分的に切断され、２つの約９２０ ｂｐＨｉｎｄ
ｉｌｌ −Ｐｖｘ■断片を単離した。ｂＧＩＩのＣ−末
端をコードする合成りＮＡ断片がｐＢＲ３２２（空白の
箱形）のＥｃｏＲ１部位およびＨｉｎｄ １１部位に挿
入された。このサブクローンはＰｖｓ ＵおよびＢａｎ
ＨＩで開裂され、３６５ ｂｐＤＮＡ 断片を単離
した。Ｈｉｎｄ Ｉ［［とＢａ−Ｒ７で開裂後大きいベ
クター断片（３，ｃａ ９ ｓ ｂｐ）をｐＢＲ３２２
がら単離した。これら２つのプロモーターｂＧＨ遺伝子
含有断片（９２０ｂｐ）を別々に合成りＮＡ含有断片（
３６５ｂｐ）およびベクター断片（３９９５ｂｐ）と混
合した。この混合物をＴ Ａ ＩＪガーゼでつなげて適
当な大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ）ＨＥ １０１の形質転換
に使用された。異なるｂＧＨ発現プラスミドはｂ ＢＧ
ＩＩ−３０１およびｐＢＧＨ−３７５と称される。
矢印は”ＪＬプロモーター配列からの転写の方向及び配
列解読における５′→３′の方向を示している。
列解読における５′→３′の方向を示している。
第７−１および７−２図はｐＧＨ遺伝子と発現配列の全
長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミドｐＧＨ−２４はｐＥＲ３２２のアンピシ
リン耐性遺伝子の中にクローンされたｐＧＨｃＤＮＡ配
列（黒（塗った箱形）を有する。ｐＧＨの新しいアミン
末端をコードしている合成りＮＡはｐＢＲ３２２（点綴
の箱形）のＥ６ｏＲ■部位とＨｉｎｄ Ｉ［［部位に挿
入された。インビトロで種々の複製を行い完成した修飾
されたｐＧＥ！遺伝子を担持するプラスミドを構成した
。
長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミドｐＧＨ−２４はｐＥＲ３２２のアンピシ
リン耐性遺伝子の中にクローンされたｐＧＨｃＤＮＡ配
列（黒（塗った箱形）を有する。ｐＧＨの新しいアミン
末端をコードしている合成りＮＡはｐＢＲ３２２（点綴
の箱形）のＥ６ｏＲ■部位とＨｉｎｄ Ｉ［［部位に挿
入された。インビトロで種々の複製を行い完成した修飾
されたｐＧＥ！遺伝子を担持するプラスミドを構成した
。
このプラスミドはＥｃｏＲ■によって開裂され、いろい
ろに変化させたｔｒｐプロモーター−オペレーター配列
を含むＤＮＡ断片を挿入した。矢印は配列解読の５′→
３′の方向、すなわち転写の方向を示す。
ろに変化させたｔｒｐプロモーター−オペレーター配列
を含むＤＮＡ断片を挿入した。矢印は配列解読の５′→
３′の方向、すなわち転写の方向を示す。
実施例
微生物
本発明において使用されまたは製造された微生物及び組
換え微生物ならびにそれらが入手された寄託機関は下記
のとおりである： 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｃ６００，ＣＲ３４としても公
知、ＡＴＣＣ２３７２４ 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＮＲＲＬＢ −１１３７Ｌ Ａ
Ｔ ＣＣ大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）ＭＭ２９４ ＡＴＣ
Ｃ３３６２５大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０ Ａ
ＴＣＣ２７３２５ｐＰＦＺ−Ｒ２を有する大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）ＨＢｌｏｌ ＡＴＣＣ３９５４４ ｐＰＦＺ−Ｒ４を有する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＨＢｌ
ｏｌ ＡＴＣＣ３９５４３ 当業者は知るとおり、上記宿主の代りにいかなる形質転
換可能な大腸菌ＣＥ、ｃｏＬｉ）Ｋ−１２株も本発明に
おいて使用できる。さらに、プロテアーゼを有しない大
腸菌株は当業者も認めるとおり上記大腸菌株と同等ある
いはそれより良好な結果をもたらす。
換え微生物ならびにそれらが入手された寄託機関は下記
のとおりである： 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｃ６００，ＣＲ３４としても公
知、ＡＴＣＣ２３７２４ 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＮＲＲＬＢ −１１３７Ｌ Ａ
Ｔ ＣＣ大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）ＭＭ２９４ ＡＴＣ
Ｃ３３６２５大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０ Ａ
ＴＣＣ２７３２５ｐＰＦＺ−Ｒ２を有する大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）ＨＢｌｏｌ ＡＴＣＣ３９５４４ ｐＰＦＺ−Ｒ４を有する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＨＢｌ
ｏｌ ＡＴＣＣ３９５４３ 当業者は知るとおり、上記宿主の代りにいかなる形質転
換可能な大腸菌ＣＥ、ｃｏＬｉ）Ｋ−１２株も本発明に
おいて使用できる。さらに、プロテアーゼを有しない大
腸菌株は当業者も認めるとおり上記大腸菌株と同等ある
いはそれより良好な結果をもたらす。
上記組換え微生物ＡＴＣＣ３９５４３及び３９５４４は
１９８３年１２月１４日にブタペスト条約の下でアメリ
カ合衆国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション、すなわち寄託を永久的
に維持し特許出願が特許になったら一般公衆に分譲する
公認の寄託機関に寄託された。これらの菌株には上記受
託番号が与えられた。これらの寄託物は本願が３７ＣＥ
Ｒ１１４および３５ＵＳＣ１２２の下に適格性ありと合
衆国特許商標庁の長官によって決定されるものとして係
属している間本願の相当する出願またはその関連出願が
出願された国の外国特許法により入手できる。寄託され
た微生物の公衆への分譲に対するすべての制限は特許の
許可と同時に不可逆的に取り除かれる。
１９８３年１２月１４日にブタペスト条約の下でアメリ
カ合衆国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション、すなわち寄託を永久的
に維持し特許出願が特許になったら一般公衆に分譲する
公認の寄託機関に寄託された。これらの菌株には上記受
託番号が与えられた。これらの寄託物は本願が３７ＣＥ
Ｒ１１４および３５ＵＳＣ１２２の下に適格性ありと合
衆国特許商標庁の長官によって決定されるものとして係
属している間本願の相当する出願またはその関連出願が
出願された国の外国特許法により入手できる。寄託され
た微生物の公衆への分譲に対するすべての制限は特許の
許可と同時に不可逆的に取り除かれる。
ＲＮＡの製造及びｃ Ｄ Ａ’ Ａのクローニング地方
の畜殺場から動物の脳下垂体を得、そこから総ＲＮＡを
ＵＥｌｒｉｃｈ ら、５ｃｉｅｎｃｅ １９６．１
３１３−１３１９（１９７７）の方法により単離した。
の畜殺場から動物の脳下垂体を得、そこから総ＲＮＡを
ＵＥｌｒｉｃｈ ら、５ｃｉｅｎｃｅ １９６．１
３１３−１３１９（１９７７）の方法により単離した。
ポリアデニル化ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース上の
クロマトグラフィーによｐ総ＲＮＡから得た。二本鎖ｃ
ＤＮＡをこのＲＮＡから製造し、ｃ Ｄ Ｎ Ａのサイ
ズフラクションをプラスミドｐＢＲ３２２を使用して大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で標準的方法及び従来のホモポ
リマ一方法でクローン化した。
クロマトグラフィーによｐ総ＲＮＡから得た。二本鎖ｃ
ＤＮＡをこのＲＮＡから製造し、ｃ Ｄ Ｎ Ａのサイ
ズフラクションをプラスミドｐＢＲ３２２を使用して大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で標準的方法及び従来のホモポ
リマ一方法でクローン化した。
（Ｍｉｌｌｅｒ、ＩＦ’、、ｅｔ ａｔ、 １９８０
、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。
、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。
２５５ ｒ ７５２１ ＋ （ｙｏｇｄｃｌＮ ａｔ
ａｌ−＋ １９７９ ；ＮａｔｌＬｒｅ ２８１ ＋
５４４ ５４８ ：５ｅａｂｘｒｙ ａｔ ａｌ、＋
１９８３ 、ＤＮＡ ２ 、３７−４５ ）プラスミ
ドを有する、ｃＤＮＡで形質転換されたコロニーをニト
ロセルロースフィルター上にレプリカ平板法によシ移植
した。形質転換体コロニーを有するフィルターをＧデｗ
ｒｂｓｔｅｉｎおよびＨｏｔ）−ｎａｓｓの方法（１９
７５、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ ｌ 、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ
。
ａｌ−＋ １９７９ ；ＮａｔｌＬｒｅ ２８１ ＋
５４４ ５４８ ：５ｅａｂｘｒｙ ａｔ ａｌ、＋
１９８３ 、ＤＮＡ ２ 、３７−４５ ）プラスミ
ドを有する、ｃＤＮＡで形質転換されたコロニーをニト
ロセルロースフィルター上にレプリカ平板法によシ移植
した。形質転換体コロニーを有するフィルターをＧデｗ
ｒｂｓｔｅｉｎおよびＨｏｔ）−ｎａｓｓの方法（１９
７５、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ ｌ 、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ
。
７２．３９６１−３９６５）によってハイブリダイゼシ
ョンのために処理した。公開されたｃ Ｄ Ｎ Ａ配列
から誘導された配列を有する放射性同位元素標識合成オ
リゴヌクレオチドをプローブとして使用してクローン化
ｃＤＮＡを検出した。ハイブリッド化しているコロニー
を５ ｍｌ Ｌ Ｂ中で生育させ、製造されたプラスミ
ドＤＮＡおよびクローン化された配列は制限エンドヌク
レアーゼによる開裂に続いてＤＮＡ断片のゲル中での電
気泳動によって特性をしらべた。
ョンのために処理した。公開されたｃ Ｄ Ｎ Ａ配列
から誘導された配列を有する放射性同位元素標識合成オ
リゴヌクレオチドをプローブとして使用してクローン化
ｃＤＮＡを検出した。ハイブリッド化しているコロニー
を５ ｍｌ Ｌ Ｂ中で生育させ、製造されたプラスミ
ドＤＮＡおよびクローン化された配列は制限エンドヌク
レアーゼによる開裂に続いてＤＮＡ断片のゲル中での電
気泳動によって特性をしらべた。
ＪＬＬ△ム乙エヱ
プラスミドｐｃＲＩＯ１はＮｉ ｓ ｈ ｉｍｏ ｒ
ｉら、Ｇａ ｎ ｅ ＋１９：３３７−３４４（１９８
２）によって記載されている。このプラスミドはプロキ
モシンの全長ｃ Ｄ Ｎ Ａ、すなわちアンピシリン耐
性のための遺伝子を有し、５６７８ｂｐからなる。この
プラスミドはＨ６ｎｄｍの開裂部位といくつかのＢａｍ
Ｈ（部位を有する。
ｉら、Ｇａ ｎ ｅ ＋１９：３３７−３４４（１９８
２）によって記載されている。このプラスミドはプロキ
モシンの全長ｃ Ｄ Ｎ Ａ、すなわちアンピシリン耐
性のための遺伝子を有し、５６７８ｂｐからなる。この
プラスミドはＨ６ｎｄｍの開裂部位といくつかのＢａｍ
Ｈ（部位を有する。
プラスミドｐｔｒｐＬＩはＥｄｍａｎら、Ｎａｔｓｒｅ
２９１；５０３−５０６（１９８１）に記載され、プラ
スミドｐＢＲ３２２はＥｏ ｌ ｉ ｖａｒら、Ｇａｎ
ｇ ２ ：９５−１１３（１９７７）によって報告さ
れている。
２９１；５０３−５０６（１９８１）に記載され、プラ
スミドｐＢＲ３２２はＥｏ ｌ ｉ ｖａｒら、Ｇａｎ
ｇ ２ ：９５−１１３（１９７７）によって報告さ
れている。
材料
制限エンドヌクレアーゼ（Ａｓ笛■、ＢａｒｎＨＩ ５
Ｅｃｏ Ｒ１％Ｈｉｎｄ ｌ［、Ｃｔａ Ｌ Ｈｉｎｆ
ｌ、Ｋｐｎ ｌ、ｐａｔ（、Ｐ ｖ ｕ １１、Ｒｓ
ａＩ、Ｓｃｉｉ ）、Ｔ４リガーゼ、およびＤＮＡポリ
メラーゼＩ（大きい断片）をニューイングランド・バイ
オラブズ（Ｎ ｇ ｗ Ｅ ｎｇｔａｎｄＢｉｏｌａｂ
ｓ）から購入し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼはＰＬ
バイオケミカルズ（Ｂｉｏｃｈｍｍｉｃａｔｓ）より得
、細菌のアルカリ性ホスファターゼはベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ（ＢａｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＢＲＬ）より入手、
子牛小腸アルカリ性ホスファターゼはペーリンガー・コ
ープ（Ｅｏａｈｒｉｎｇｍｒ Ｃｏｒｐ ）よシ入手し
た。
Ｅｃｏ Ｒ１％Ｈｉｎｄ ｌ［、Ｃｔａ Ｌ Ｈｉｎｆ
ｌ、Ｋｐｎ ｌ、ｐａｔ（、Ｐ ｖ ｕ １１、Ｒｓ
ａＩ、Ｓｃｉｉ ）、Ｔ４リガーゼ、およびＤＮＡポリ
メラーゼＩ（大きい断片）をニューイングランド・バイ
オラブズ（Ｎ ｇ ｗ Ｅ ｎｇｔａｎｄＢｉｏｌａｂ
ｓ）から購入し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼはＰＬ
バイオケミカルズ（Ｂｉｏｃｈｍｍｉｃａｔｓ）より得
、細菌のアルカリ性ホスファターゼはベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ（ＢａｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＢＲＬ）より入手、
子牛小腸アルカリ性ホスファターゼはペーリンガー・コ
ープ（Ｅｏａｈｒｉｎｇｍｒ Ｃｏｒｐ ）よシ入手し
た。
すべての酵素は上記製造元が推める粂件下に使用した。
放射性化学物質はニューイングランド・ヌクレアー（Ｎ
ｍ５ｏ Ｅｎｇｌａｎｄ ＮｘｃＬｇａ→（ＮＥＮ）か
ら購入した。蛋白質分子量の標準物はＥＲＬより入手し
、精製された子牛キモシンはシグマ・ケミカＡ／−カン
パニー （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ ）より入手し、精製ｂＧＨはマイルス（Ｍｉｌｅ
ｓ ）より入手した。
ｍ５ｏ Ｅｎｇｌａｎｄ ＮｘｃＬｇａ→（ＮＥＮ）か
ら購入した。蛋白質分子量の標準物はＥＲＬより入手し
、精製された子牛キモシンはシグマ・ケミカＡ／−カン
パニー （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ ）より入手し、精製ｂＧＨはマイルス（Ｍｉｌｅ
ｓ ）より入手した。
細菌はエンドシリ／（２５μ２／プ）またはテトラサイ
クリン（１０μ２／α）を含有するＬグロス（Ｂｒａｔ
ル）中またはＬ寒天プレート上（Ｍｉｌｌｓデ。
クリン（１０μ２／α）を含有するＬグロス（Ｂｒａｔ
ル）中またはＬ寒天プレート上（Ｍｉｌｌｓデ。
Ｊ、Ｅｙｅｐｉｒｉｍｇｎｔｇ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ ＣｒｇｎａｔｉｃｓｒＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｒａｔｏｒＩＢＮｅｗ Ｙｏｒｋ
＋ｐ４３３．１９７２）で３７℃で常法どおり生育させ
た。大規模にプラスミドを製造するためには、対数期の
培養物をクロラムフェニコール（１７０μｙ／ｒｕｇ）
の添加によって増大させた（ ＣｌａｗａＬＬａｎｄ
Ｈａｌｓｉｎｋｉ、Ｊ、Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、 １
１０ ： １１３５（１９７２））。
ａｒ ＣｒｇｎａｔｉｃｓｒＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｒａｔｏｒＩＢＮｅｗ Ｙｏｒｋ
＋ｐ４３３．１９７２）で３７℃で常法どおり生育させ
た。大規模にプラスミドを製造するためには、対数期の
培養物をクロラムフェニコール（１７０μｙ／ｒｕｇ）
の添加によって増大させた（ ＣｌａｗａＬＬａｎｄ
Ｈａｌｓｉｎｋｉ、Ｊ、Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、 １
１０ ： １１３５（１９７２））。
プラスミドｐＢＣ，Ｈ−７は、Ｐａｔ（部位にクローン
させたｂＧＨの全長ｃＤＮＡを含むｐＢＲ−３２２から
なり、Ｍｉ ｌ ｌ ６ ｙ 、ｊＪ７．ら、Ｂｉｏｃ
ｈｍｍ、 ２５５ ＋７５２１（１９８０）によって記
載されたようにして製造された。クローン化された。Ｄ
ＮＡは３１ｂｐの５′未翻訳配列、全プレホルモン構造
配列（６５１ｂｐ）、全３′未翻訳領域（１０４ｂｐ）
、短いボ！Ｊ （、（）、およびｄＣ−ｄＧ 尾部を有
する約８３０９ｂの長さである。プラスミドｐＧＨ−２
４はそのＰｓｔ１部位にクローン化された全長ｃＤＮＡ
を含むｐＢＲ３２２からなり、Ｓａａｂｕｒｇ ら、
ＤＮＡ ２．３７−４５（１９８３）によって記載され
た方法と類似の方法で製造された。ｐＧＨ−２５プラス
ミドＤＮＡはデニス・ペレイラ（ＤｔｒｎｎｉａＰａｒ
ｅｉｒα）によって構成され提供された。プラスミドｐ
Ｂ Ｒ−３２２はすでにＢｏ ｌ ｉ ｖａｔら、Ｇ
ａｎｇ２．９５−１１３（１９７７）によって報告され
ている。
させたｂＧＨの全長ｃＤＮＡを含むｐＢＲ−３２２から
なり、Ｍｉ ｌ ｌ ６ ｙ 、ｊＪ７．ら、Ｂｉｏｃ
ｈｍｍ、 ２５５ ＋７５２１（１９８０）によって記
載されたようにして製造された。クローン化された。Ｄ
ＮＡは３１ｂｐの５′未翻訳配列、全プレホルモン構造
配列（６５１ｂｐ）、全３′未翻訳領域（１０４ｂｐ）
、短いボ！Ｊ （、（）、およびｄＣ−ｄＧ 尾部を有
する約８３０９ｂの長さである。プラスミドｐＧＨ−２
４はそのＰｓｔ１部位にクローン化された全長ｃＤＮＡ
を含むｐＢＲ３２２からなり、Ｓａａｂｕｒｇ ら、
ＤＮＡ ２．３７−４５（１９８３）によって記載され
た方法と類似の方法で製造された。ｐＧＨ−２５プラス
ミドＤＮＡはデニス・ペレイラ（ＤｔｒｎｎｉａＰａｒ
ｅｉｒα）によって構成され提供された。プラスミドｐ
Ｂ Ｒ−３２２はすでにＢｏ ｌ ｉ ｖａｔら、Ｇ
ａｎｇ２．９５−１１３（１９７７）によって報告され
ている。
オリゴヌクレオチド類の合成
合成オリゴヌクレオチド５’、ＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧ
。
。
３、ｔｒ）および５’ 、ＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＴ、３
””をホスファイト法（Ｃａｒｕｔｈａｒｓ 、 Ｊ、
Ａｍ、 Ｃｈｇｒｎ 、 Ｓａｃ 。
””をホスファイト法（Ｃａｒｕｔｈａｒｓ 、 Ｊ、
Ａｍ、 Ｃｈｇｒｎ 、 Ｓａｃ 。
１０３．１３８５（１９８１））によって化学合成し、
６Ｍ尿素−２０チポリアクリルアミドゲルから精製した
。
６Ｍ尿素−２０チポリアクリルアミドゲルから精製した
。
１８−ｂｐおよび２２ｂｐ−本領オリゴマーを本明細曹
記載の方法で合成し、本明細誉記載の方法で４０ｍａｒ
アダプターに形質転換した。二本鎖４０−ｍげは一本鎖
１８−および２２−惧ｓｒを公知方法によりアニーリン
グし、結合（ｌｉｇａｔｇ）することによって生成した
。
記載の方法で合成し、本明細誉記載の方法で４０ｍａｒ
アダプターに形質転換した。二本鎖４０−ｍげは一本鎖
１８−および２２−惧ｓｒを公知方法によりアニーリン
グし、結合（ｌｉｇａｔｇ）することによって生成した
。
ｐＧＨ’およびｂＧＨのために使用されたジゴヌクレオ
チドはＣ（Ｌｒｘｔｈｔｒｒｓら、Ｔｅｔｒａｈｓｄｒ
ｏｎＬｇｔｔ、２４，２４５（１９８３） のホスホラ
ミダイト法により合成され、断片は１１〜１６塩基の長
さの一本鎖オリゴマーから合成した。
チドはＣ（Ｌｒｘｔｈｔｒｒｓら、Ｔｅｔｒａｈｓｄｒ
ｏｎＬｇｔｔ、２４，２４５（１９８３） のホスホラ
ミダイト法により合成され、断片は１１〜１６塩基の長
さの一本鎖オリゴマーから合成した。
分子クローニング反応
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼ■の
フレナラ（Ｋｌ ｇｎａｗ ）断片を使用して二本鎖Ｄ
ＮＡの隠れた３′末端の空白を満たす反応は本質的にＭ
ａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｍｗ１ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
、 Ａ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ ＭａｎｌＬａｌ
、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−
ｒａｔｏｒｙ ｐ、 １１３（１９８２） の方法に
依った。
フレナラ（Ｋｌ ｇｎａｗ ）断片を使用して二本鎖Ｄ
ＮＡの隠れた３′末端の空白を満たす反応は本質的にＭ
ａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｍｗ１ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
、 Ａ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ ＭａｎｌＬａｌ
、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−
ｒａｔｏｒｙ ｐ、 １１３（１９８２） の方法に
依った。
ＡＴＰのガンマホスフェートをＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼによって合成リンカ−ＤＮＡの５′−ＯＨ末端へ
転移させることは上記Ｍａｎｉａｔｉｓの文献に示され
ている。約２０μｍの二本鎖リンカ−ＤＮＡを、７０溝
Ｍトリス（ｐＨ７，６）、１０ｍＡｆ ＭｇＣ１ｔ 、
５ ｍＡ／ジテオスレイトール（ＤＴＴ）、２０μＣｉ
〔ガンマ−３２Ｐ ）ＡＴ／’（５０００Ｃｉミリモル
″″１：ＮＥＮ）を含有する２０μｌの反応混合物中で
ホスホリル化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０
単位）を加えて、反応を３７℃で１５分間行い、１μｌ
の１０ ｍｕ ＡＴ Ｐおよび１０単位のＴ４キナーゼ
を加え、反応をさらに３０分間３７℃で行なった。キナ
ーゼ処理したリンカ−は−２０℃で貯蔵した。
ナーゼによって合成リンカ−ＤＮＡの５′−ＯＨ末端へ
転移させることは上記Ｍａｎｉａｔｉｓの文献に示され
ている。約２０μｍの二本鎖リンカ−ＤＮＡを、７０溝
Ｍトリス（ｐＨ７，６）、１０ｍＡｆ ＭｇＣ１ｔ 、
５ ｍＡ／ジテオスレイトール（ＤＴＴ）、２０μＣｉ
〔ガンマ−３２Ｐ ）ＡＴ／’（５０００Ｃｉミリモル
″″１：ＮＥＮ）を含有する２０μｌの反応混合物中で
ホスホリル化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０
単位）を加えて、反応を３７℃で１５分間行い、１μｌ
の１０ ｍｕ ＡＴ Ｐおよび１０単位のＴ４キナーゼ
を加え、反応をさらに３０分間３７℃で行なった。キナ
ーゼ処理したリンカ−は−２０℃で貯蔵した。
必要ならば、末端の５′ホスフエートを細菌のアルカリ
性ホスファターゼ（ＢＡＰ）＄るいは子牛ｉアルカリ性
ホスファターゼ（ＣＩＰ）のいずれかにより処理してＤ
ＮＡから除去した。［：Ｃｈａｃｏｎα８ら、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｔｎｏｌ、６５ ： ７５ （１９８
０） ：］。
性ホスファターゼ（ＢＡＰ）＄るいは子牛ｉアルカリ性
ホスファターゼ（ＣＩＰ）のいずれかにより処理してＤ
ＮＡから除去した。［：Ｃｈａｃｏｎα８ら、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｔｎｏｌ、６５ ： ７５ （１９８
０） ：］。
簡単に言えば、ＣＩＦによる処理においては、プラスミ
ドＤＮＡは適当な制限酵素によって切断を完了させエタ
ノール中に沈殿させた。ＤＮＡのペレットをＣＩＰ反応
緩衝液（Ｏ，Ｘ＆グリシン、１ｍｕ ＭｇＣｌ、 、０
．１ ｍｕ ＺｎＣ１！２ 、ｐＨ１０，４）中に最終
濃度１μｙ／１０／’ｌ緩衝液で再懸濁した。試料を６
５℃に１０分間加熱し、氷上で５分間冷却した。子牛腸
アルカリ性ホスファターゼを最終濃度０．５単位／ＤＮ
Ａ Ｉｐｙとなるまで加えた。この混合物を３７℃で
３０分間インキュベートし、続いてフェノール−クロロ
ホルムにより抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿さ
せた。これらのＤＮＡペレットを蒸留水に再懸濁し、最
終濃度１００ ｐｙ／ｍｌとした。
ドＤＮＡは適当な制限酵素によって切断を完了させエタ
ノール中に沈殿させた。ＤＮＡのペレットをＣＩＰ反応
緩衝液（Ｏ，Ｘ＆グリシン、１ｍｕ ＭｇＣｌ、 、０
．１ ｍｕ ＺｎＣ１！２ 、ｐＨ１０，４）中に最終
濃度１μｙ／１０／’ｌ緩衝液で再懸濁した。試料を６
５℃に１０分間加熱し、氷上で５分間冷却した。子牛腸
アルカリ性ホスファターゼを最終濃度０．５単位／ＤＮ
Ａ Ｉｐｙとなるまで加えた。この混合物を３７℃で
３０分間インキュベートし、続いてフェノール−クロロ
ホルムにより抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿さ
せた。これらのＤＮＡペレットを蒸留水に再懸濁し、最
終濃度１００ ｐｙ／ｍｌとした。
ＥＡＰ処理の場合は、プラスミドＤＮＡを選択した制限
エンドヌクレアーゼで開裂し、エタノール中で沈殿させ
た。ＤＮＡペレットを緩衝液（５０ｍｕ ＮａＣ６，
１０ｒｎＭ ＭｇＣｌ２．１０ｍＪ／）！Ｊス、１０
ｍＭ ＤＴ Ｔ ）中に再懸濁した（最終濃度１μ？
／ｌＯμｌ の緩衝液）。この反応混合物を６５℃に１
０分間加熱し氷上で反応停止した。細菌のアルカリ性ホ
スファターゼを最終濃度５０単位／ＤＮＡ １μｍま
で添加した。この反応混合物を６５℃で２時間インキュ
ベートしフェノール−クロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断
片をエタノール中に沈殿させた。
エンドヌクレアーゼで開裂し、エタノール中で沈殿させ
た。ＤＮＡペレットを緩衝液（５０ｍｕ ＮａＣ６，
１０ｒｎＭ ＭｇＣｌ２．１０ｍＪ／）！Ｊス、１０
ｍＭ ＤＴ Ｔ ）中に再懸濁した（最終濃度１μ？
／ｌＯμｌ の緩衝液）。この反応混合物を６５℃に１
０分間加熱し氷上で反応停止した。細菌のアルカリ性ホ
スファターゼを最終濃度５０単位／ＤＮＡ １μｍま
で添加した。この反応混合物を６５℃で２時間インキュ
ベートしフェノール−クロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断
片をエタノール中に沈殿させた。
細胞の発現プラスミドの構成は種々のプラスミドからの
ＤＮＡ断片を結合する操作からなる。すべての段階は添
付図面に示されている。一般に、ＤＮＡ断片はゲルから
単離後精製され、２０〜５０ ｐｇ の６６ ｍＭ
トリス−１１Ｃ１（７＋Ｈ７，５）、５ ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２、Ｉ ｍｕ Ａ Ｔ Ｐ、 ２０ ｍｕ ＤＴ
Ｔおよび１μｅの７４ ＋）ガーゼ（４００単位）中で
他の断片またはプラスミドＤ ｉＶ Ａに結合した。大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の能力細胞を標準的方法〔Ｍａｎ
ｄｇｒら、Ｊ、、Ｗｏｌ、Ｂｉｏｌ、５３．１５４３（
１９７０））で調製し、上記配位結合混合物の半分で形
質転換した。
ＤＮＡ断片を結合する操作からなる。すべての段階は添
付図面に示されている。一般に、ＤＮＡ断片はゲルから
単離後精製され、２０〜５０ ｐｇ の６６ ｍＭ
トリス−１１Ｃ１（７＋Ｈ７，５）、５ ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２、Ｉ ｍｕ Ａ Ｔ Ｐ、 ２０ ｍｕ ＤＴ
Ｔおよび１μｅの７４ ＋）ガーゼ（４００単位）中で
他の断片またはプラスミドＤ ｉＶ Ａに結合した。大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の能力細胞を標準的方法〔Ｍａｎ
ｄｇｒら、Ｊ、、Ｗｏｌ、Ｂｉｏｌ、５３．１５４３（
１９７０））で調製し、上記配位結合混合物の半分で形
質転換した。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は化学的減成方法［Ａｆａｚａｍ Ａ ａｎ
ｄＧｉＬｂｅｒｔ、ｉｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ
ｏＬ、６５ ： ４９９−５６０（１９８０）］により
末端標識ＤＮＡ断片を使用することによって決定した。
ｄＧｉＬｂｅｒｔ、ｉｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ
ｏＬ、６５ ： ４９９−５６０（１９８０）］により
末端標識ＤＮＡ断片を使用することによって決定した。
各リボゾーム結合部位領域は各々独立して二本鎖の両方
に数回配列されていた。
に数回配列されていた。
プラスミドＤＮＡの製造
プラスミドＤＮＡの大規模な製造は先行文献に記載のア
ルカリ性−５ＤＳ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｒｎ ら、Ｎｘ
ｃＬｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒａａ、７ ： １５１３（１
９７９） ）、続いてエチジウムプロミド−〇 ｓ Ｃ
ｌ浮遊密度遠心分離あるいは分゛画をバイオゲル（Ｂｉ
ｏｇｅｔ）Ａ−５０（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ製）カ
ラムを使用してＥｌ−Ｇｅｗｅｌｙら、Ａｎａｌ、Ｂｉ
ｏｃｈｇｍ、１０２二４２３−４２８（１９８０）の方
法により行った。小標品としてのＤＮＡを７Ａ／カリ性
ＳＤＳ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍら上記文献）の迅速にでき
る変法によって調製した。
ルカリ性−５ＤＳ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｒｎ ら、Ｎｘ
ｃＬｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒａａ、７ ： １５１３（１
９７９） ）、続いてエチジウムプロミド−〇 ｓ Ｃ
ｌ浮遊密度遠心分離あるいは分゛画をバイオゲル（Ｂｉ
ｏｇｅｔ）Ａ−５０（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ製）カ
ラムを使用してＥｌ−Ｇｅｗｅｌｙら、Ａｎａｌ、Ｂｉ
ｏｃｈｇｍ、１０２二４２３−４２８（１９８０）の方
法により行った。小標品としてのＤＮＡを７Ａ／カリ性
ＳＤＳ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍら上記文献）の迅速にでき
る変法によって調製した。
アガロース平板ゲル０．７〜１％をＭａｎｉａｔｉｓら
、上記文献ｐ１５０〜１６４の条件下に使用した。ゲル
を１５分間１μｙ ／ｍｌのエチジウムプロミドで染色
し、ポラロイドフィルム（タイプ５７、ＡＳＡ３０００
）をコダック・ラッテｙ （Ｋｏｄａｋ ＩＶｒａ−ｔ
ｃａｎ ）フィルタとともに使用して２６６ ｎｍの紫
外線の照明で写真をとった。
、上記文献ｐ１５０〜１６４の条件下に使用した。ゲル
を１５分間１μｙ ／ｍｌのエチジウムプロミドで染色
し、ポラロイドフィルム（タイプ５７、ＡＳＡ３０００
）をコダック・ラッテｙ （Ｋｏｄａｋ ＩＶｒａ−ｔ
ｃａｎ ）フィルタとともに使用して２６６ ｎｍの紫
外線の照明で写真をとった。
５〜１２．５％のアクリルアミドゲル（２０Ｘｉ ５
ｘ Ｏ，１５ｃＩｒＬ）を使用してＭａｎｉａｔｉｓら
、Ｅｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４：３７８７−３
７９４（１９７５）の方法により小さな（１゜５ｋｂ未
満）制限断片を同定した。アガロースゲルと同様にゲル
を染色し、写真をとった。
ｘ Ｏ，１５ｃＩｒＬ）を使用してＭａｎｉａｔｉｓら
、Ｅｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４：３７８７−３
７９４（１９７５）の方法により小さな（１゜５ｋｂ未
満）制限断片を同定した。アガロースゲルと同様にゲル
を染色し、写真をとった。
ＤＮＡ断片を、ケル切片がら０．ＩＸＴＢＥ１８．９ｍ
Ｍトリス−ホウ酸塩、８．９ｍＪ／ホウ酸、０．２ｍｕ
ＥＤＴＡ）を含有する透析バッグ中で電気的に溶出
することによって精製した。
Ｍトリス−ホウ酸塩、８．９ｍＪ／ホウ酸、０．２ｍｕ
ＥＤＴＡ）を含有する透析バッグ中で電気的に溶出
することによって精製した。
ｐＢＲ３２２または発現プラスミド（ｐＰＦＺ−８２ま
たはｐｐＦＺ−Ｒ４）を含有する細菌培養物を４μ２７
４１チアミン、２５μｙ ７ｍｌアンピシリンおよび１
００μｙ／ｍｌ ）リプトファ／を含有するＬＢプロス
またはＭ９ＣＡ培地（Ｍα罰αバ３も、上記文献）中で
一晩生育させた。これらの培養物をＭ９ＣＡ培地中に１
：２５に希釈しくＭａｎｉａｔｉｓらの上記文献、トリ
プトファンなしでｔｒｐプロモーターの完全導入を行な
わせる）、またはＭ９ＣＡ培地＋１００μ／ ｍｌのト
リプトファンに１＝２５に希釈しくごプロモーターの導
入を阻害し）、あるいはＬＢ培地（ネガチプコントロー
ルとして）に１：２５に希釈し、損と５フラスコ中で細
胞密度’ａ６ｏ ＝ １−０となるまで生育させた。全
細胞蛋白質抽出のために、２００ ｉｌｌ培養物に等し
い細胞ペレットを２チドデシル硫酸ナトリウム、１％β
−メルカプトエタノール中で溶解させ、蛋白質をＩＯ容
量部の冷アセトン中に沈殿させた。沈殿させた蛋白質を
ＳＤＳ試料緩衝液中に再溶解し、了りコツトを１０％ま
たは１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルＣＬａ
ｇｍｔｎｌｉ、ＮａｔｌＬｒｅ ２２７ ：６８０−
６８５（１９７０））上で電気泳動にかけた。
たはｐｐＦＺ−Ｒ４）を含有する細菌培養物を４μ２７
４１チアミン、２５μｙ ７ｍｌアンピシリンおよび１
００μｙ／ｍｌ ）リプトファ／を含有するＬＢプロス
またはＭ９ＣＡ培地（Ｍα罰αバ３も、上記文献）中で
一晩生育させた。これらの培養物をＭ９ＣＡ培地中に１
：２５に希釈しくＭａｎｉａｔｉｓらの上記文献、トリ
プトファンなしでｔｒｐプロモーターの完全導入を行な
わせる）、またはＭ９ＣＡ培地＋１００μ／ ｍｌのト
リプトファンに１＝２５に希釈しくごプロモーターの導
入を阻害し）、あるいはＬＢ培地（ネガチプコントロー
ルとして）に１：２５に希釈し、損と５フラスコ中で細
胞密度’ａ６ｏ ＝ １−０となるまで生育させた。全
細胞蛋白質抽出のために、２００ ｉｌｌ培養物に等し
い細胞ペレットを２チドデシル硫酸ナトリウム、１％β
−メルカプトエタノール中で溶解させ、蛋白質をＩＯ容
量部の冷アセトン中に沈殿させた。沈殿させた蛋白質を
ＳＤＳ試料緩衝液中に再溶解し、了りコツトを１０％ま
たは１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルＣＬａ
ｇｍｔｎｌｉ、ＮａｔｌＬｒｅ ２２７ ：６８０−
６８５（１９７０））上で電気泳動にかけた。
標識された蛋白質の製造のためには発現培養物の１ｍｌ
アリコツトからの細胞ペレットヲｌ ｍｌのＭ９ＣＡ添
加培地（Ｍ９ＣＡ塩、０．２％クル：ｒ −ス、４μｙ
／ｍｌチアミン、２ｏｐ１メＵ標準アミノ酸（メチオニ
ンとトリプトファンを除＜））＋２５μｙ／ｍｌアンピ
シリンおよび７５Ｃｉ”Ｓメチオニン（ＮＥＮ； ９７
０Ｃｉ／ミリモル）中に懸濁した。１時間３７℃でイン
キュベートした後、細胞をペレット化し、２００ ｐｇ
の１０ ｍＪ／ ） ＬＸ （ｐＨ８，０）、Ｉ ｍ
Ｊ／ １ＶａＥ Ｄ Ｔ Ａに再懸濁し、氷上Ｋ １
０ 分Ｍｆｔき、最＃！濃度としてリゾチームをＩ ｍ
ｙ ／ ｍｔ：まで、ＮＰ４０を０．２％まで、ＮａＣ
ｌを０．３５＆まで添加した。溶解物を１０ ｍｒＷ
ＭｇＣ１ｚ に調節し、氷上で３０分間５０ ｐｙ／
ｍｌのＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｇ）■（シグマ（Ｓｉ
ｇｍａ ）裂）とインキュベートした。
アリコツトからの細胞ペレットヲｌ ｍｌのＭ９ＣＡ添
加培地（Ｍ９ＣＡ塩、０．２％クル：ｒ −ス、４μｙ
／ｍｌチアミン、２ｏｐ１メＵ標準アミノ酸（メチオニ
ンとトリプトファンを除＜））＋２５μｙ／ｍｌアンピ
シリンおよび７５Ｃｉ”Ｓメチオニン（ＮＥＮ； ９７
０Ｃｉ／ミリモル）中に懸濁した。１時間３７℃でイン
キュベートした後、細胞をペレット化し、２００ ｐｇ
の１０ ｍＪ／ ） ＬＸ （ｐＨ８，０）、Ｉ ｍ
Ｊ／ １ＶａＥ Ｄ Ｔ Ａに再懸濁し、氷上Ｋ １
０ 分Ｍｆｔき、最＃！濃度としてリゾチームをＩ ｍ
ｙ ／ ｍｔ：まで、ＮＰ４０を０．２％まで、ＮａＣ
ｌを０．３５＆まで添加した。溶解物を１０ ｍｒＷ
ＭｇＣ１ｚ に調節し、氷上で３０分間５０ ｐｙ／
ｍｌのＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｇ）■（シグマ（Ｓｉ
ｇｍａ ）裂）とインキュベートした。
不溶物を緩やかな遠心分離で除き、このペレットフラク
ションをＳＤＳ試料緩衝液中に溶解した。
ションをＳＤＳ試料緩衝液中に溶解した。
上清試料をウサギ抗プロレンニン抗体（Ｂａｐｐｓ。
Ｇａｎｇ Ｉ ９ 、３３７−３３４ ）およびフ下つ
原菌吸着剤（Ｐａｎ５ｏｒｂｉｎ、Ｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｍｍ）でＫｓｓｓＬｇｒ、Ｊ。
原菌吸着剤（Ｐａｎ５ｏｒｂｉｎ、Ｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｍｍ）でＫｓｓｓＬｇｒ、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１７：１４８２ １４９０の
方法により免疫沈殿させた。試料をＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉの上記文献）し、
−７５℃でコダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘ Ａ Ｒ−２フイ
／Ｉ／ムと１ルネツクス（ＣＯｒｎｇｚ ）ライトニン
グプラス（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｆｉｌｔｓ ）強化ス
クリーンテ螢光写真法を行５前に強化した（エンドライ
トニング（Ｅｎｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ： ＨＥＮ ）
）。
方法により免疫沈殿させた。試料をＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉの上記文献）し、
−７５℃でコダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘ Ａ Ｒ−２フイ
／Ｉ／ムと１ルネツクス（ＣＯｒｎｇｚ ）ライトニン
グプラス（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｆｉｌｔｓ ）強化ス
クリーンテ螢光写真法を行５前に強化した（エンドライ
トニング（Ｅｎｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ： ＨＥＮ ）
）。
現レベルの定量化
発現培養物によって産生された外来蛋白質の量の測定は
細菌培養物からの全蛋白質抽出物を含有する蛋白質ゲル
をデンシトメーターによって走査することにより測定し
た。総細胞蛋白質抽出物の５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルの個々のレーンをベックマン（Ｂｇｃｋ頼謂） Ｄ
Ｕ−１３Ｂｆンシトメターを使用して分析した。乾燥し
たコーマシー青染色５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを
各レーンにおいて走査して外来蛋白質帯における総細胞
蛋白質のパーセントを測定した。対照培養物（ｐＢＲ３
２２ベクター含有）からの総細胞蛋白質の走査図を使用
して組換生成物のサイズに一致するゲルの領域における
生来の蛋白質含量を測定した。対照培養物中の見かけ上
のバックグラウンドピークな補正後、発現レベルを総細
胞蛋白質のパーセントとして測定した。蛋白質ゲルは５
７９ ｎｍで走査した。
細菌培養物からの全蛋白質抽出物を含有する蛋白質ゲル
をデンシトメーターによって走査することにより測定し
た。総細胞蛋白質抽出物の５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルの個々のレーンをベックマン（Ｂｇｃｋ頼謂） Ｄ
Ｕ−１３Ｂｆンシトメターを使用して分析した。乾燥し
たコーマシー青染色５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを
各レーンにおいて走査して外来蛋白質帯における総細胞
蛋白質のパーセントを測定した。対照培養物（ｐＢＲ３
２２ベクター含有）からの総細胞蛋白質の走査図を使用
して組換生成物のサイズに一致するゲルの領域における
生来の蛋白質含量を測定した。対照培養物中の見かけ上
のバックグラウンドピークな補正後、発現レベルを総細
胞蛋白質のパーセントとして測定した。蛋白質ゲルは５
７９ ｎｍで走査した。
結果
ｔｒｐＬＩ−Ｒ２およびｐｔｒｐＬｌ−Ｒ４の構成プラ
スミドｐｔｒｐＬＩはＨｉｎｄ Ｉｌｌ −Ｃ１ａ Ｔ
断片（３６０ｂｐ以下）上に大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
ｔｒｐプ０％−ター−オペレーターの一部およびｔｒｐ
Ｌのシンーダルガルノ（，５Ｚ））配列を含んでいるｐ
ＢＲ３２２誘導体である。（Ｅｄｍａｎら、ＮａｔｌＬ
ｒｅ ２９１ ：５０３−ｓｏｓ（ｘ９ｓ１））した
がって、このベクターはｔｒｐｐ４節領域に隣接して特
有のＣｔα■クローニング部位を有する発現プラスミド
である。挿入されるＤＮＡは、その配列内に、ｐｔｒｐ
ＬＩに挿入された場合ｔｒｐＬ’）ボゾーム結合部位配
列に対して適当に間隔を空けられるであろ５遺伝子コ一
ド配列の前にＡＴＧ翻訳開始コドンをきまなければなら
ない。この発現ベクターは適当な合成りＮＡリンカ−を
第２図に図示されたようにＣ１ａ■部位に挿入すること
によって修飾された。
スミドｐｔｒｐＬＩはＨｉｎｄ Ｉｌｌ −Ｃ１ａ Ｔ
断片（３６０ｂｐ以下）上に大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
ｔｒｐプ０％−ター−オペレーターの一部およびｔｒｐ
Ｌのシンーダルガルノ（，５Ｚ））配列を含んでいるｐ
ＢＲ３２２誘導体である。（Ｅｄｍａｎら、ＮａｔｌＬ
ｒｅ ２９１ ：５０３−ｓｏｓ（ｘ９ｓ１））した
がって、このベクターはｔｒｐｐ４節領域に隣接して特
有のＣｔα■クローニング部位を有する発現プラスミド
である。挿入されるＤＮＡは、その配列内に、ｐｔｒｐ
ＬＩに挿入された場合ｔｒｐＬ’）ボゾーム結合部位配
列に対して適当に間隔を空けられるであろ５遺伝子コ一
ド配列の前にＡＴＧ翻訳開始コドンをきまなければなら
ない。この発現ベクターは適当な合成りＮＡリンカ−を
第２図に図示されたようにＣ１ａ■部位に挿入すること
によって修飾された。
特異的二本鎖合成りＮ、４＋）ンカーを使用してｐｔｒ
ｐＬＩのＣＪｃＬ［ｉｌｌ限部位の周囲のヌクレオチド
含量を変えた。約１０μｍのｐｔｒｐＬＩＤＮＡを１６
単位の制限エンドヌクレアーゼＣＬｃＬ■で９０分間３
７℃で切断した。Ｃｌａ Ｉによる開裂によって生じた
接着末端を５０ ｍＭ ） リス−ＨＣ１（ｐＨ７，２
）、１０ｍＭ ＭＱＳＯ，，０，１惧Ｍジチオスレイ
トール、０．２ ｍＭ ｄＧＴ Ｐ、 ０，２慣Ｍ
ｄｃＴＰを含有する１００μｇの反応混合物中で鈍化し
た。
ｐＬＩのＣＪｃＬ［ｉｌｌ限部位の周囲のヌクレオチド
含量を変えた。約１０μｍのｐｔｒｐＬＩＤＮＡを１６
単位の制限エンドヌクレアーゼＣＬｃＬ■で９０分間３
７℃で切断した。Ｃｌａ Ｉによる開裂によって生じた
接着末端を５０ ｍＭ ） リス−ＨＣ１（ｐＨ７，２
）、１０ｍＭ ＭＱＳＯ，，０，１惧Ｍジチオスレイ
トール、０．２ ｍＭ ｄＧＴ Ｐ、 ０，２慣Ｍ
ｄｃＴＰを含有する１００μｇの反応混合物中で鈍化し
た。
Ｄ、■Ａポリメラーゼ（３０単位）のフレナラ断片を加
え、反応を２０℃で４５分間行なわせた。フエ、ノール
とクロロホルムで抽出後、示されたホスホリル化された
デオキシオリゴヌクレオチドリンカー（６０ｐモル以下
） （５’ＡＧＩＡＴＴＣＡＴＧＧ３’＞（３’ＴＣＴ
ＴＡＡＧＴＡＣＣ５”）を１μ７以下（０，６ｐモル以
下）の挿入ベクター断片といっしょにしてエタノールで
沈殿させた。これらの断片を４℃で１８時間３０ ｔｔ
ｌｌの６６ ｒｎＭ ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，６）、
５０ ｍｕ ＭｇＣ１ｚ、１ｍＭＡＴｐ、２０ｍＭジチ
オスレイトールおよび８００単位のＴＡＤＮＡリガーゼ
中で結合させた。この混合物を９０分間３単位のＥｃＯ
Ｒ■で９０分間切断した。ＥｃｏＲＩで開裂したプラス
ミドＤＮＡを４℃で４時間１１００ｐ の６６ｍ＆）
すｙ、 −ＭＣＩＩ （ｐＨ７，６）、５ｍＭＭＱＣ
Ｉ２．１ｒｎＭＡＴＰ、２０ ｍＪｆ Ｄ Ｔ Ｔ、お
よび４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの中で再び結合さ
せた。大腸菌（Ｅ、ｃｏｘｉ）菌株ＨＢＩＯＩの能力細
胞を２０μｌの上記結合混合物で形質転換した。
え、反応を２０℃で４５分間行なわせた。フエ、ノール
とクロロホルムで抽出後、示されたホスホリル化された
デオキシオリゴヌクレオチドリンカー（６０ｐモル以下
） （５’ＡＧＩＡＴＴＣＡＴＧＧ３’＞（３’ＴＣＴ
ＴＡＡＧＴＡＣＣ５”）を１μ７以下（０，６ｐモル以
下）の挿入ベクター断片といっしょにしてエタノールで
沈殿させた。これらの断片を４℃で１８時間３０ ｔｔ
ｌｌの６６ ｒｎＭ ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，６）、
５０ ｍｕ ＭｇＣ１ｚ、１ｍＭＡＴｐ、２０ｍＭジチ
オスレイトールおよび８００単位のＴＡＤＮＡリガーゼ
中で結合させた。この混合物を９０分間３単位のＥｃＯ
Ｒ■で９０分間切断した。ＥｃｏＲＩで開裂したプラス
ミドＤＮＡを４℃で４時間１１００ｐ の６６ｍ＆）
すｙ、 −ＭＣＩＩ （ｐＨ７，６）、５ｍＭＭＱＣ
Ｉ２．１ｒｎＭＡＴＰ、２０ ｍＪｆ Ｄ Ｔ Ｔ、お
よび４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの中で再び結合さ
せた。大腸菌（Ｅ、ｃｏｘｉ）菌株ＨＢＩＯＩの能力細
胞を２０μｌの上記結合混合物で形質転換した。
（Ｍａｎｄｅｌ ｇｔ ａｌ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、 ５ ３ 二 １ ５ ４（１９７０））プ
ラスミドＤＮＡを上記形質転換体のうちの１２のものか
ら調製し、Ｅ、ｏＲ■とＨｉ ｎｄ■で切断した。これ
らのプラスミドのうち１０のものが所望の３６０− ｂ
’ｌ）以下のＥｃｏ Ｒｌ−Ｈ１ｎｒＬ■断片を含有し
て（・た。ＤＮＡ配列を分析したところ、これらのプラ
スミドのうち１つＣｐｔｒｐＬｌ−Ｒ４）は合成リンカ
−の所望の配向およびｔｒｐプロモーターと合成りＮＡ
との間の接合部に所望の配列を有していた。
ｏｌ、 ５ ３ 二 １ ５ ４（１９７０））プ
ラスミドＤＮＡを上記形質転換体のうちの１２のものか
ら調製し、Ｅ、ｏＲ■とＨｉ ｎｄ■で切断した。これ
らのプラスミドのうち１０のものが所望の３６０− ｂ
’ｌ）以下のＥｃｏ Ｒｌ−Ｈ１ｎｒＬ■断片を含有し
て（・た。ＤＮＡ配列を分析したところ、これらのプラ
スミドのうち１つＣｐｔｒｐＬｌ−Ｒ４）は合成リンカ
−の所望の配向およびｔｒｐプロモーターと合成りＮＡ
との間の接合部に所望の配列を有していた。
謹々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列
を分析している間に、上記プラスミドのうちの１つ（ｐ
ｔｒｐＬＩ−Ｒ２）がリボゾーム結合部位の領域におい
て６ ｂｐ削除されて（・ることか発見された。この削
除は、リンカ−配列がすべて存在するのでＤＮＡポリメ
ラービ■のフレナラ断片の３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性から生じたものとされている。この誘導体はｐｔ
、ｐＬＩ−Ｒ４に含まれている生来のｔｒｐＳＤ配列に
比較して変化したりボゾーム結合部位を有する。
を分析している間に、上記プラスミドのうちの１つ（ｐ
ｔｒｐＬＩ−Ｒ２）がリボゾーム結合部位の領域におい
て６ ｂｐ削除されて（・ることか発見された。この削
除は、リンカ−配列がすべて存在するのでＤＮＡポリメ
ラービ■のフレナラ断片の３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性から生じたものとされている。この誘導体はｐｔ
、ｐＬＩ−Ｒ４に含まれている生来のｔｒｐＳＤ配列に
比較して変化したりボゾーム結合部位を有する。
合成プロレンニンアダプターのクローニングプロレンニ
ンのアミノ末端を修飾するのに使用される合成二本鎖Ｄ
ＮＡの配列は下記のとおりである。
ンのアミノ末端を修飾するのに使用される合成二本鎖Ｄ
ＮＡの配列は下記のとおりである。
この断片は２本の一重鎖オリゴマー（１８−ｂｐと２２
− ｂｐの長さ）から組み立てられた。この合成りＮＡ
は蛋白質合成のだめの人工的なＡＴＧ開始コドン及ヒフ
ロレンニン配列ＣＣＮ１５ｈｉ。ｒｉう、Ｊ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｒｎ、９１：１０８５−１０８８（１９８２） 〕
の最終のいくつかのコドンをＢａｎ Ｈ１部位の周囲に
変化して繰り返された形でコードしている。この合成り
ＮＡは、すでにＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラ断片で
処理して接着末端に挿入されているｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲ）制限部位にサブクローンされた。サブクローンは
放射性同位元素で標識された２２−ｍａｒをプローブと
して使用する組換え微生物のその場でのコロニーハイブ
リダイゼーショ７Ｋ ヨッテ同定すレタ。［Ｇｒｓｎｓ
ｃａｉｎ＋ＭａｎｄＨｏｇｎｅｓｓ、Ｄ、 ｒＰｒｏｃ
、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ７２ ：３９６１
（１９７５））。プラスミドＤＮＡは２０個のハイブリ
ダイゼーション陽性コロニーから調製され、ＢａｍＨＩ
またはＥｃｏ ＲＩで開裂されて所望のプラスミドを含
有するサブクローンを同定した。組換え微生物＃エフか
らの約１００μりのプラスミドＤＮＡをＥｃｏ ＲＩで
開裂して４０ ｂｐ断片を１２．５％ポリアクリルアミ
ドゲル上で単離した。精製された４ ０ ｂｐ Ｅｃｏ
ＩＮ断片を、すてにＥｃｏＲｌで開裂し子牛腸アルカ
リ性ホスファターゼで処理して脱ホスホリル化しである
２発現プラスミド誘導体（ｐｔｒｐＬＩ−Ｂ２およびｐ
ｔｒｐＬｌ−／？４ ）のＥｃｏＲ）部位に挿入した。
− ｂｐの長さ）から組み立てられた。この合成りＮＡ
は蛋白質合成のだめの人工的なＡＴＧ開始コドン及ヒフ
ロレンニン配列ＣＣＮ１５ｈｉ。ｒｉう、Ｊ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｒｎ、９１：１０８５−１０８８（１９８２） 〕
の最終のいくつかのコドンをＢａｎ Ｈ１部位の周囲に
変化して繰り返された形でコードしている。この合成り
ＮＡは、すでにＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラ断片で
処理して接着末端に挿入されているｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲ）制限部位にサブクローンされた。サブクローンは
放射性同位元素で標識された２２−ｍａｒをプローブと
して使用する組換え微生物のその場でのコロニーハイブ
リダイゼーショ７Ｋ ヨッテ同定すレタ。［Ｇｒｓｎｓ
ｃａｉｎ＋ＭａｎｄＨｏｇｎｅｓｓ、Ｄ、 ｒＰｒｏｃ
、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ７２ ：３９６１
（１９７５））。プラスミドＤＮＡは２０個のハイブリ
ダイゼーション陽性コロニーから調製され、ＢａｍＨＩ
またはＥｃｏ ＲＩで開裂されて所望のプラスミドを含
有するサブクローンを同定した。組換え微生物＃エフか
らの約１００μりのプラスミドＤＮＡをＥｃｏ ＲＩで
開裂して４０ ｂｐ断片を１２．５％ポリアクリルアミ
ドゲル上で単離した。精製された４ ０ ｂｐ Ｅｃｏ
ＩＮ断片を、すてにＥｃｏＲｌで開裂し子牛腸アルカ
リ性ホスファターゼで処理して脱ホスホリル化しである
２発現プラスミド誘導体（ｐｔｒｐＬＩ−Ｂ２およびｐ
ｔｒｐＬｌ−／？４ ）のＥｃｏＲ）部位に挿入した。
各結合物のい（つかの組換え微生物からのプラスミドＤ
ＮＡを調製し、ＢａｍＨ■制限エンドヌクレアーゼで切
断した。ｔｒｐ発現配列より下流に挿入された４゜ｈｐ
プロレンニンアダプターを有するプラスミドを約７０
０ ｂｐ離れた２つのＢａｍ Ｈ１部位の存在により同
定した。この構成は第３図に示されている。これらの発
現プラスミドはｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２−Ｂ４８およびｐｔ
ｒｐＬＩ−Ｒ４−Ｂ４８と称された。
ＮＡを調製し、ＢａｍＨ■制限エンドヌクレアーゼで切
断した。ｔｒｐ発現配列より下流に挿入された４゜ｈｐ
プロレンニンアダプターを有するプラスミドを約７０
０ ｂｐ離れた２つのＢａｍ Ｈ１部位の存在により同
定した。この構成は第３図に示されている。これらの発
現プラスミドはｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２−Ｂ４８およびｐｔ
ｒｐＬＩ−Ｒ４−Ｂ４８と称された。
これらの組換え微生物は、ｔｒｐプロモーター−オペレ
ーター配列、リボゾーム結合部位、人工ＡＴＧ開始コド
ン、及びプロレンニンの最初の５つのアミノ酸残基をコ
ードしている化学的に得られた配列を含む約３７０ ｂ
ｐのＨｉｎｄ ｌｌ−Ｂａｍ ＨｌＤＮＡ断片のための
源として使用した。プロモーターより下流のヌクレオチ
ド配列は、上述のプラスミドベクターｐｔｒｐＬＩのＣ
ｌα■制限部位に異なる化学合成されたデオキシオリゴ
ヌクレオチドリンカーがすでに挿入されていたのでリボ
ゾーム結合部位の領域が異なっている。リボゾーム結合
部位（ｒｂａ）配列と、プロレンニン遺伝子のＡＴＧお
よび、他の蛋白質についてはコードしている遺伝子との
間のヌクレオチドの内容および間隔をＤＮＡ配列分析に
より下記の如（各発現の構成について示した： ｐｐｐＺ（Ｒ） ５’→３′ 間
隔（、ｂｐ）Ｒ２ＡＡＧＧＡＧ、４ＡＴＴＣエ
５Ｒ４Ａ＆にＧＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧ
１１Ｇ’Ｊボゾ一ム結合部位の変化を使用してプロレ
ンニン発現プラスミドをつくって、ｒｂｓヌクレオチド
配列の内容及び間隔が蛋白質発現レベルに対して有して
いる可能性ある効果を後でしろべだ。
ーター配列、リボゾーム結合部位、人工ＡＴＧ開始コド
ン、及びプロレンニンの最初の５つのアミノ酸残基をコ
ードしている化学的に得られた配列を含む約３７０ ｂ
ｐのＨｉｎｄ ｌｌ−Ｂａｍ ＨｌＤＮＡ断片のための
源として使用した。プロモーターより下流のヌクレオチ
ド配列は、上述のプラスミドベクターｐｔｒｐＬＩのＣ
ｌα■制限部位に異なる化学合成されたデオキシオリゴ
ヌクレオチドリンカーがすでに挿入されていたのでリボ
ゾーム結合部位の領域が異なっている。リボゾーム結合
部位（ｒｂａ）配列と、プロレンニン遺伝子のＡＴＧお
よび、他の蛋白質についてはコードしている遺伝子との
間のヌクレオチドの内容および間隔をＤＮＡ配列分析に
より下記の如（各発現の構成について示した： ｐｐｐＺ（Ｒ） ５’→３′ 間
隔（、ｂｐ）Ｒ２ＡＡＧＧＡＧ、４ＡＴＴＣエ
５Ｒ４Ａ＆にＧＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧ
１１Ｇ’Ｊボゾ一ム結合部位の変化を使用してプロレ
ンニン発現プラスミドをつくって、ｒｂｓヌクレオチド
配列の内容及び間隔が蛋白質発現レベルに対して有して
いる可能性ある効果を後でしろべだ。
プロレンニン発現プラスミドを構成するために使用され
る実験段階は第１図に示されている。第一に、プラスミ
ドレプリコン、アンピシリン耐性マーカー、及び所望の
プロレンニンをコードしている配列（アミノ酸コドン８
３から停止コドン（Ｔに、４）まで）を含む４７７２
ｂｐ ベクター断片を、３０μ７のｐｃ’Ｒ１０１プラ
スミドＤＮＡを１１ｉｎｄ ＩＩ［およびＫｐ７ＬＩ％
ｉｌＪ限エンドヌクレアーゼで切断することにより製造
した。この制限反応物を１％アガロースゲル上で電気泳
動にかけ、両方のＤＮＡ断片を電気溶出によりゲルから
切片から単離した。プロレンニンｃ Ｄ Ｎ Ａ配列の
アミノ末端部分を含む９０６− ｂｐ Ｈｉｎｄ ［［
−Ｋｐｎ （断片をさらにＢａ−ＩＩＩで切断し５％ポ
リアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。２３５−
ｂｐ ８０ｍ Ｈ（−Ｋｐｎ■断片（アミノ酸コドン
６ないし８３をコードしている）をゲルの切片から電気
溶出した。
る実験段階は第１図に示されている。第一に、プラスミ
ドレプリコン、アンピシリン耐性マーカー、及び所望の
プロレンニンをコードしている配列（アミノ酸コドン８
３から停止コドン（Ｔに、４）まで）を含む４７７２
ｂｐ ベクター断片を、３０μ７のｐｃ’Ｒ１０１プラ
スミドＤＮＡを１１ｉｎｄ ＩＩ［およびＫｐ７ＬＩ％
ｉｌＪ限エンドヌクレアーゼで切断することにより製造
した。この制限反応物を１％アガロースゲル上で電気泳
動にかけ、両方のＤＮＡ断片を電気溶出によりゲルから
切片から単離した。プロレンニンｃ Ｄ Ｎ Ａ配列の
アミノ末端部分を含む９０６− ｂｐ Ｈｉｎｄ ［［
−Ｋｐｎ （断片をさらにＢａ−ＩＩＩで切断し５％ポ
リアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。２３５−
ｂｐ ８０ｍ Ｈ（−Ｋｐｎ■断片（アミノ酸コドン
６ないし８３をコードしている）をゲルの切片から電気
溶出した。
異なるｐｔｒｐＬＩ−Ｒ−Ｂ４８誘導体からの発現配列
を含むＨｉｎｄ ｌｌｌ−Ｂａｎ Ｈｉ Ｄ Ｎ Ａ断
片をｐＣＲｌｏｌから２つの制限断片（４７７２ｂｐお
よび２３５ ｂｐ）と約等モル比で別々に混合した。こ
の混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼの添加により結合させ、
各結合混合物の１部をＨＢ１０１能力細胞に導入するの
に使用した。細胞をアンピシリン（２５μｙ／ｒｎｌ）
を含有するＬＢ寒天プレート上で細胞を選択した各場合
についてコロニーが得られた。上述のコロニーかもい（
つかの薬物耐性コロニーを５ｍｇのＬＢ培養物に採取し
て、プラスミドＤＮＡを制限酵素によって分析した。各
場合について、はとんどの組換え微生物はｉｒｐプロモ
ーター−ｒｂｓ配列に隣接して組換えられた完全なプロ
レンニン遺伝子を含んでいることがわかった。
を含むＨｉｎｄ ｌｌｌ−Ｂａｎ Ｈｉ Ｄ Ｎ Ａ断
片をｐＣＲｌｏｌから２つの制限断片（４７７２ｂｐお
よび２３５ ｂｐ）と約等モル比で別々に混合した。こ
の混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼの添加により結合させ、
各結合混合物の１部をＨＢ１０１能力細胞に導入するの
に使用した。細胞をアンピシリン（２５μｙ／ｒｎｌ）
を含有するＬＢ寒天プレート上で細胞を選択した各場合
についてコロニーが得られた。上述のコロニーかもい（
つかの薬物耐性コロニーを５ｍｇのＬＢ培養物に採取し
て、プラスミドＤＮＡを制限酵素によって分析した。各
場合について、はとんどの組換え微生物はｉｒｐプロモ
ーター−ｒｂｓ配列に隣接して組換えられた完全なプロ
レンニン遺伝子を含んでいることがわかった。
これらの発現プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで分
析することにより、プロレンニンの直接的発現に適合し
た全プロレンニンコード化配列を含んでいることがわか
った。上記プロレンニン遺伝子、インビトロ接合領域お
よびｔｆｐプロモーター−オペレーターのほとんどをＡ
ｆａ ｚ ａｍおよびＧＬｌｂｇｆｔの上記文献の化学
的減成方法によってＤＮＡ配列を分析したところ、上記
人工の開始コドンおよびプロキモシンをコードしている
配列が大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ユプロモーターーオペレ
ーターの直後に位置し、ヌクレオチドレベルで２つの発
現プラスミドの別々の特性を゛確豆する役割をしている
ことが確認された。ここで構成されたこれらの２つのプ
ロレンニンプラスミドはｐＰＦＺ−Ｒ２およびｐＰＦＺ
−Ｒ４と称される。さらに、発現プラスミドｐＰＦＺ−
Ｒ２およびｐＰＦＺ −Ｒ４においては、ｔｒｐリーダ
ーペプチドの大腸菌リボゾーム結合部位の各々５および
１１ヌクレオチド後にＡＴＧ開始コドンが存在している
。
析することにより、プロレンニンの直接的発現に適合し
た全プロレンニンコード化配列を含んでいることがわか
った。上記プロレンニン遺伝子、インビトロ接合領域お
よびｔｆｐプロモーター−オペレーターのほとんどをＡ
ｆａ ｚ ａｍおよびＧＬｌｂｇｆｔの上記文献の化学
的減成方法によってＤＮＡ配列を分析したところ、上記
人工の開始コドンおよびプロキモシンをコードしている
配列が大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ユプロモーターーオペレ
ーターの直後に位置し、ヌクレオチドレベルで２つの発
現プラスミドの別々の特性を゛確豆する役割をしている
ことが確認された。ここで構成されたこれらの２つのプ
ロレンニンプラスミドはｐＰＦＺ−Ｒ２およびｐＰＦＺ
−Ｒ４と称される。さらに、発現プラスミドｐＰＦＺ−
Ｒ２およびｐＰＦＺ −Ｒ４においては、ｔｒｐリーダ
ーペプチドの大腸菌リボゾーム結合部位の各々５および
１１ヌクレオチド後にＡＴＧ開始コドンが存在している
。
これらの発現プラスミドのＤＮＡ配列を翻訳すると３６
６個のアミノ酸で構成されたプロレンニン蛋白質を予測
する。そのようなポリペプチドの測定された分子量は約
４１．０００である。発現プラスミドを有する大腸菌を
トリプトファンを欠く最小限の培地中で生育させると、
これらの細胞は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動において成熟キモシン（約３６，０００ダルトン）よ
りわずかに太きいところに位置する蛋白質を産生ずる（
Ｌａｇｔｎｍｌｉ、Ｕ、に、Ｎａｔｘｒｇ ２２７
： ６８０（１９７０）〕。そのような蛋白質は同一
条件下に生育させたベクタープラスミドｐＢＲ３２２を
含む大腸菌によっては産生されない。トリプトファン（
１００ｆｔ？／ｍｅ）を欠（Ｍ ９ ＣＡ 培地中テ生
１ｊｌされた同一の発現組換え体によってはプロレンニ
ン蛋白質はほとんど産生されず、このことは推定される
プロキモシン蛋白質の大腸菌による産生は意図されたよ
５にｔｒｐプロモーター−オペレーターの制御下にある
ことを示す。
６個のアミノ酸で構成されたプロレンニン蛋白質を予測
する。そのようなポリペプチドの測定された分子量は約
４１．０００である。発現プラスミドを有する大腸菌を
トリプトファンを欠く最小限の培地中で生育させると、
これらの細胞は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動において成熟キモシン（約３６，０００ダルトン）よ
りわずかに太きいところに位置する蛋白質を産生ずる（
Ｌａｇｔｎｍｌｉ、Ｕ、に、Ｎａｔｘｒｇ ２２７
： ６８０（１９７０）〕。そのような蛋白質は同一
条件下に生育させたベクタープラスミドｐＢＲ３２２を
含む大腸菌によっては産生されない。トリプトファン（
１００ｆｔ？／ｍｅ）を欠（Ｍ ９ ＣＡ 培地中テ生
１ｊｌされた同一の発現組換え体によってはプロレンニ
ン蛋白質はほとんど産生されず、このことは推定される
プロキモシン蛋白質の大腸菌による産生は意図されたよ
５にｔｒｐプロモーター−オペレーターの制御下にある
ことを示す。
プロレンニン発現プラスミドｐ ＰＦＺ −Ｒ２および
ｐＰＦＺ−Ｒ４を有する大腸菌形質転換体はセ２プロモ
ーターの誘導のためにトリプトファンを欠（Ｍ９ Ｃ，
４培地中で生育させた。細胞を振と５フラスコ中で５５
０ ｎｍにおける光学密度１．０となるまで生育させた
。これらの培養物からの細胞ペレットを２％ＳＤＳ、１
％ベーターメルカプトエタノール中で分解させて、蛋白
質をアセトンで沈殿させた。沈殿した蛋白質をＳＤＳ試
料緩衝液中で再溶解し、アリコツトを１０％５Ｄｓ−ポ
リアクリルアミドゲル上で電気泳動させたＣ Ｌ（Ｌｅ
ｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ ２２７二６８０（１９７０
））。フ０ロレンニンレベルはコーマシー青で染色シタ
ケルを５７９ ｎｍでデンシトメーターによってゲルを
走査することによって測定した。
ｐＰＦＺ−Ｒ４を有する大腸菌形質転換体はセ２プロモ
ーターの誘導のためにトリプトファンを欠（Ｍ９ Ｃ，
４培地中で生育させた。細胞を振と５フラスコ中で５５
０ ｎｍにおける光学密度１．０となるまで生育させた
。これらの培養物からの細胞ペレットを２％ＳＤＳ、１
％ベーターメルカプトエタノール中で分解させて、蛋白
質をアセトンで沈殿させた。沈殿した蛋白質をＳＤＳ試
料緩衝液中で再溶解し、アリコツトを１０％５Ｄｓ−ポ
リアクリルアミドゲル上で電気泳動させたＣ Ｌ（Ｌｅ
ｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ ２２７二６８０（１９７０
））。フ０ロレンニンレベルはコーマシー青で染色シタ
ケルを５７９ ｎｍでデンシトメーターによってゲルを
走査することによって測定した。
プロキモシン発現プラスミドを含む大腸菌の菌体中に屈
折性の包摂物体が存在することが位相差顕微鏡によって
観察された。プラスミドベクタｐＢＲ３２２を含む対照
菌体を同一の榮件下に生育せしめても何らそのような屈
折性包摂物体は現われない。同様の観察はインシュリン
やテモシンのような外来遺伝子の産物を産生ずる遺伝子
操作された微生物に関して報告されている（ Ｃａｒｒ
ｉｅｒａｔ ａｌ、、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉ、ｏＴ
ｒｃｈｎｏｌｏｇｙ １ ： １０９（１９８３））。
折性の包摂物体が存在することが位相差顕微鏡によって
観察された。プラスミドベクタｐＢＲ３２２を含む対照
菌体を同一の榮件下に生育せしめても何らそのような屈
折性包摂物体は現われない。同様の観察はインシュリン
やテモシンのような外来遺伝子の産物を産生ずる遺伝子
操作された微生物に関して報告されている（ Ｃａｒｒ
ｉｅｒａｔ ａｌ、、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉ、ｏＴ
ｒｃｈｎｏｌｏｇｙ １ ： １０９（１９８３））。
屈折性物体は発現された外来蛋白質がたまったものであ
ると考えられる。
ると考えられる。
屈折性包摂物の存在は高レベルでプロレンニンが産生さ
れたことと直接相関関係があるものと見られる。
れたことと直接相関関係があるものと見られる。
上記の細菌によって合成されたプロキモシンはプロレン
ニン抗体と特異的に反応する。
ニン抗体と特異的に反応する。
同一の振と５フラスコでの生育条件下に、プラスミドｐ
ＰＦＺ−Ｒ２およびｐＰＦＺ−Ｒ４を有する大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）ＨＢ １０１の組換体の生育を評価したと
ころ、プラスミドｐＰＦＺ−Ｒ２はプロレンニンな１０
〜１５％のレベル範囲で再現性を以って産生じ、ｐＰＦ
Ｚ−Ｒ４はプロレンニンを５〜７チのレベル範囲で産生
じた： 総細胞蛋白質 培養物 ＨＩＪｌｏｌ ｐＰＦＺ−Ｒ２ ｐＰＦＺ−Ｒ４ １１１３１０１ｐＰＦＺ−Ｒ２ ７＃Ｊ１０１ ｐＰＦＺ−Ｒ２ ｐＰＦＺ−Ｒ２ １３，１ ７、■ １１．６ １０．２ １５．４ １１．７ ７．０ ＊ ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのデンシトメー
ターによる走査にもとづいている。
ＰＦＺ−Ｒ２およびｐＰＦＺ−Ｒ４を有する大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）ＨＢ １０１の組換体の生育を評価したと
ころ、プラスミドｐＰＦＺ−Ｒ２はプロレンニンな１０
〜１５％のレベル範囲で再現性を以って産生じ、ｐＰＦ
Ｚ−Ｒ４はプロレンニンを５〜７チのレベル範囲で産生
じた： 総細胞蛋白質 培養物 ＨＩＪｌｏｌ ｐＰＦＺ−Ｒ２ ｐＰＦＺ−Ｒ４ １１１３１０１ｐＰＦＺ−Ｒ２ ７＃Ｊ１０１ ｐＰＦＺ−Ｒ２ ｐＰＦＺ−Ｒ２ １３，１ ７、■ １１．６ １０．２ １５．４ １１．７ ７．０ ＊ ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのデンシトメー
ターによる走査にもとづいている。
ヌクレオチドの組成に関してこれら２つのプロレンニン
発現構造物（ｐＰＦＺ−Ｒ２およびｐＰＦＺ−Ｒ４）の
間の相違点はプロレンニン遺伝子のりボゾーム紹合部位
と開始コドンの周囲の配列のみである。異なるプラスミ
ドを含有する培養物の間にはプロレンニン発現のレベル
に有意の差もある。
発現構造物（ｐＰＦＺ−Ｒ２およびｐＰＦＺ−Ｒ４）の
間の相違点はプロレンニン遺伝子のりボゾーム紹合部位
と開始コドンの周囲の配列のみである。異なるプラスミ
ドを含有する培養物の間にはプロレンニン発現のレベル
に有意の差もある。
プロレンニン発現において観察される相違は、リボゾー
ム結合部位の周囲の一次ＤＮＡ配列の差異に帰因すると
いえる。５ｈｉｎεおよびＤａｌｇａｒｎｏによって最
初に注目されたようにＣ１９７４，ＰＮＡＳ７１ ：１
３４２−１３４２）、１６５リボゾームＲＮＡの３′−
末端配列に対して相補性の開始コドンより約ＩＯヌクレ
オチド上流を中心とするプリンに富んだ配列がある。は
とんどの証拠は大腸菌のりボゾームによる蛋白質合成開
始部位の選択における、ＲＮＡ塩基対形成に対するｍ
ＲＡ’ Ａの役割を証明している。多（の細菌およびフ
ァージのｍＲＮＡからのりボゾーム結合部位の配列がし
もべもれ、合致するシンーダルガルノ配列はＴＡＡＧＧ
ＡＧＧＴであることがわかった。これらの３つのパラメ
ーターはシンーダルガルノ相互作用＝１）相補性の長さ
；２）シンーダルガルノ配列と開始コドンとの間の距離
；および３）シンーダルガルノ配列が二次構造によって
遮へいされる程度に影響を与える。
ム結合部位の周囲の一次ＤＮＡ配列の差異に帰因すると
いえる。５ｈｉｎεおよびＤａｌｇａｒｎｏによって最
初に注目されたようにＣ１９７４，ＰＮＡＳ７１ ：１
３４２−１３４２）、１６５リボゾームＲＮＡの３′−
末端配列に対して相補性の開始コドンより約ＩＯヌクレ
オチド上流を中心とするプリンに富んだ配列がある。は
とんどの証拠は大腸菌のりボゾームによる蛋白質合成開
始部位の選択における、ＲＮＡ塩基対形成に対するｍ
ＲＡ’ Ａの役割を証明している。多（の細菌およびフ
ァージのｍＲＮＡからのりボゾーム結合部位の配列がし
もべもれ、合致するシンーダルガルノ配列はＴＡＡＧＧ
ＡＧＧＴであることがわかった。これらの３つのパラメ
ーターはシンーダルガルノ相互作用＝１）相補性の長さ
；２）シンーダルガルノ配列と開始コドンとの間の距離
；および３）シンーダルガルノ配列が二次構造によって
遮へいされる程度に影響を与える。
上記２つの発現プラスミドの各々のＳＤ配列の周囲の部
分をしらべるとｐ ＰＦＺ −Ｒ２における相補性の長
さは６つの隣接するヌクレオチドであり、他は３つの隣
接するヌクレオチドを有するのみであることがわかる： 又、リボゾーム結合部位と開始コド／との間の間隔はｐ
ＰＦＺ−Ｒ２において５つのヌクレオチドであり、これ
は７つのヌクレオチドが介在する天然のｔデ、Ｌ遺伝子
開始領域の間隔に非常に近似している。一方、ＰＦＺ−
Ｒ４はリボゾーム結合部位と開始コドンとの間に１１個
のヌクレオチドを有している。、ＰＦＺ−Ｒ２に見られ
る効果的にリボゾーム結合部位のも５１つの重要な特徴
は、シンーダルガルノ配列の直前のプロレンニンコート
化配列と同じ読み取り枠における翻訳停止コド°ン（Ｔ
ＡＡ）である。ｐＰＦＺ−Ｒ２ＤＮＡ配列のこれらすべ
ての特徴はその高度に効果的なプロレンニン発現におい
である役割を演じている。
分をしらべるとｐ ＰＦＺ −Ｒ２における相補性の長
さは６つの隣接するヌクレオチドであり、他は３つの隣
接するヌクレオチドを有するのみであることがわかる： 又、リボゾーム結合部位と開始コド／との間の間隔はｐ
ＰＦＺ−Ｒ２において５つのヌクレオチドであり、これ
は７つのヌクレオチドが介在する天然のｔデ、Ｌ遺伝子
開始領域の間隔に非常に近似している。一方、ＰＦＺ−
Ｒ４はリボゾーム結合部位と開始コドンとの間に１１個
のヌクレオチドを有している。、ＰＦＺ−Ｒ２に見られ
る効果的にリボゾーム結合部位のも５１つの重要な特徴
は、シンーダルガルノ配列の直前のプロレンニンコート
化配列と同じ読み取り枠における翻訳停止コド°ン（Ｔ
ＡＡ）である。ｐＰＦＺ−Ｒ２ＤＮＡ配列のこれらすべ
ての特徴はその高度に効果的なプロレンニン発現におい
である役割を演じている。
もちろん遺伝学的コードが退化すると、上記配列によっ
てコードされた蛋白質のアミノ酸配列を変えることなし
に特定のヌクレオチド配列の組成をある程度変化させる
。このようにして、２つ以上の異なる塩基配列（同意義
のコドン）を、それによって特定化されるアミノ酸の同
一性を変化させることなく特定のヌクレオチド配列にお
いて置換することができる。さらに、コドンを除去し、
あるいは１つ以上のコドンを退化しているコドン以外の
コドンで置換して構造的に修飾されたポリペプチドであ
るが修飾されていないＤＮＡ分子によって生成されるポ
リペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するも
のを産生ずることは可能である。たとえ上記ＤＮＡ分子
の相異が上記遺伝学的コードの退化に無関係だとしても
、上記ポリペプチドを生産する２つのＤＮＡ分子として
見た場合、上記２つのポリペプチド類は機能的に均等で
ある。
てコードされた蛋白質のアミノ酸配列を変えることなし
に特定のヌクレオチド配列の組成をある程度変化させる
。このようにして、２つ以上の異なる塩基配列（同意義
のコドン）を、それによって特定化されるアミノ酸の同
一性を変化させることなく特定のヌクレオチド配列にお
いて置換することができる。さらに、コドンを除去し、
あるいは１つ以上のコドンを退化しているコドン以外の
コドンで置換して構造的に修飾されたポリペプチドであ
るが修飾されていないＤＮＡ分子によって生成されるポ
リペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するも
のを産生ずることは可能である。たとえ上記ＤＮＡ分子
の相異が上記遺伝学的コードの退化に無関係だとしても
、上記ポリペプチドを生産する２つのＤＮＡ分子として
見た場合、上記２つのポリペプチド類は機能的に均等で
ある。
＃４アミノ酸、すなわちスレオニンのコドンはＡＣＣの
代りにＡＣＴである。遺伝学的コードの過剰によって、
このコードはこの位置のアミノ酸を変化しない。この工
程では、上記ホルモンのＮ−末端部分をコードしている
部分が合成的にっ（られているハイブリッド遺伝子の構
成物を使用するので、合成りＮＡによってプロレンニン
のその部分のための新しいコード化配列の設計を行うこ
とができる。プロレンニンのアミノ酸配列は実際には遺
伝学的コードの退化によって維持されるので、これらの
種類の配列の変化は無意味であって、この遺伝子は天然
で生産されるものと均等のポリペプチド（Ｎ末端ｍｅｔ
を除（）を生成する。
代りにＡＣＴである。遺伝学的コードの過剰によって、
このコードはこの位置のアミノ酸を変化しない。この工
程では、上記ホルモンのＮ−末端部分をコードしている
部分が合成的にっ（られているハイブリッド遺伝子の構
成物を使用するので、合成りＮＡによってプロレンニン
のその部分のための新しいコード化配列の設計を行うこ
とができる。プロレンニンのアミノ酸配列は実際には遺
伝学的コードの退化によって維持されるので、これらの
種類の配列の変化は無意味であって、この遺伝子は天然
で生産されるものと均等のポリペプチド（Ｎ末端ｍｅｔ
を除（）を生成する。
本発明の細菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ ）形質転換体によって
発現すれたメチオニンプロレンニンの単離、そのレニン
への転化および該レニンの牛乳凝固活性は英国特許出願
２，１００，７３７ ＡおよびＥｍｔａｇａら、Ｐｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ８０ ：
３６７１−３６７５（１９８３）に記載の方法によって
示された。
発現すれたメチオニンプロレンニンの単離、そのレニン
への転化および該レニンの牛乳凝固活性は英国特許出願
２，１００，７３７ ＡおよびＥｍｔａｇａら、Ｐｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ８０ ：
３６７１−３６７５（１９８３）に記載の方法によって
示された。
犬１］％ 菌ｔ ｃｐプロモーター−オペレーター断片
ＡＴＯ開始コドン、Ｒ２またはＲ４からなるリボゾーム
結合部位、およびウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン
またはヒト上皮成長因子をコード化しているｃＤＮＡｉ
Ｉｔ伝子配列を有才子配列スミドも構成され、大腸菌に
導入されると、上述の各外来蛋白質を高度に効率よく発
現する。ＡＴＧ開始コドン迄のベクター、プロモーター
およびリボゾーム結合部位のヌクレオチド配列は本質的
にプロレンニン発現プラスミドについて上述したものと
同一である。これらの種々の構成物により産生される外
来蛋白質の発現レベルは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、続いてデンシトメーターで走査する
ことによって測定された。これらの培養物によって得ら
れた発現の相対的レベルはプロレンニンの発現について
観察されるものと類似していた。すなわち、リボゾーム
結合部位の８２翻訳を含む動物の成長ホルモン発現プラ
スミドの発現レベルはＲ４翻訳の発現レベルの約４〜５
倍である。最終的には、大腸菌細胞における発現レベル
は全細胞蛋白質の約２５〜３０％であった。
ＡＴＯ開始コドン、Ｒ２またはＲ４からなるリボゾーム
結合部位、およびウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン
またはヒト上皮成長因子をコード化しているｃＤＮＡｉ
Ｉｔ伝子配列を有才子配列スミドも構成され、大腸菌に
導入されると、上述の各外来蛋白質を高度に効率よく発
現する。ＡＴＧ開始コドン迄のベクター、プロモーター
およびリボゾーム結合部位のヌクレオチド配列は本質的
にプロレンニン発現プラスミドについて上述したものと
同一である。これらの種々の構成物により産生される外
来蛋白質の発現レベルは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、続いてデンシトメーターで走査する
ことによって測定された。これらの培養物によって得ら
れた発現の相対的レベルはプロレンニンの発現について
観察されるものと類似していた。すなわち、リボゾーム
結合部位の８２翻訳を含む動物の成長ホルモン発現プラ
スミドの発現レベルはＲ４翻訳の発現レベルの約４〜５
倍である。最終的には、大腸菌細胞における発現レベル
は全細胞蛋白質の約２５〜３０％であった。
ｂＧＥおよびｐＧ１１遺伝子の発現を達成させるのに使
用される方法は動物の成長ホルモンの発現についてＰ、
Ｓｇａｂｕｒｇら（１９８３、ＤＮＡ２１３７−４５
）によって報告されている方法と本質的に同じである。
用される方法は動物の成長ホルモンの発現についてＰ、
Ｓｇａｂｕｒｇら（１９８３、ＤＮＡ２１３７−４５
）によって報告されている方法と本質的に同じである。
この方法によりクローンされた合成りＮＡとクローンさ
れたｃ Ｄ Ａ’ Ａ配列からなる混成遺伝子の構成を
確認した。この構成設計により、成熟ホルモンの最初の
アミノ酸についての翻訳開始コドンを導入することによ
り信号配列のないｂＧＨおよびｐＧＨを大腸菌において
直接発現させることができた。合成りＮＡの使用によっ
てｂＧＨおよびｐＧＲ遺伝子のアミン末端領域のための
新しいコード化配列を設計することもできた。成長ホル
モン遺伝子の合成領域によってコード化されているアミ
ノ酸配列は実際には遺伝学的コードの過剰によって維持
された。
れたｃ Ｄ Ａ’ Ａ配列からなる混成遺伝子の構成を
確認した。この構成設計により、成熟ホルモンの最初の
アミノ酸についての翻訳開始コドンを導入することによ
り信号配列のないｂＧＨおよびｐＧＨを大腸菌において
直接発現させることができた。合成りＮＡの使用によっ
てｂＧＨおよびｐＧＲ遺伝子のアミン末端領域のための
新しいコード化配列を設計することもできた。成長ホル
モン遺伝子の合成領域によってコード化されているアミ
ノ酸配列は実際には遺伝学的コードの過剰によって維持
された。
ｂＧＨｃＤＮＡを有するプラスミドをＭ ｉ ｌ ｊ
ｇ ｒら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｇｍ、７５２１Ｃ１９８０）
によって報告されたようにして得られｐＢＧＥ−１０２
と称された。これはＭ ｉ ｌ Ｌ ａ ｒらのプラス
ミドＢＰ３４Ｂと均等である。ｂＧＨ，、ＲＮＡのヌク
レオチド配列とその相当するアミノ酸配列（該ヌクレオ
チド配列により予測される）はすでに公開されている（
ＭｉＬＬａｒ、Ｗら、上記文献）。トリプトファンプロ
モーター−オペレーターおよびリボゾーム結合部位配列
を有する制限断片をｐｔｒｐＬｌ−Ｒ２および−Ｒ４か
ら得た。成長ホルモン遺伝子のアミノおよびカルボキシ
末端を修飾するのに使用される合成二本鎖ＤＮＡの配列
はＳａｇｂｓｒｇら（１９８３、ＤＮＡ２”、３７−４
５）による報告から取り出した。ホスホラミダイト化学
（Ｃａｒｕｔｈｔｒｒｓら）を使用して上述の如くオリ
ゴヌクレオチドを合成し、断片を一本領オリゴマー（１
１−１６塩基）から組立てた。Ｎ−末端合成りＮＡは蛋
白質合成のための人工ＡＴＧ開始コドンおよびｂＧＨの
最初の２３個のアミノ酸のコドンをコード化している。
ｇ ｒら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｇｍ、７５２１Ｃ１９８０）
によって報告されたようにして得られｐＢＧＥ−１０２
と称された。これはＭ ｉ ｌ Ｌ ａ ｒらのプラス
ミドＢＰ３４Ｂと均等である。ｂＧＨ，、ＲＮＡのヌク
レオチド配列とその相当するアミノ酸配列（該ヌクレオ
チド配列により予測される）はすでに公開されている（
ＭｉＬＬａｒ、Ｗら、上記文献）。トリプトファンプロ
モーター−オペレーターおよびリボゾーム結合部位配列
を有する制限断片をｐｔｒｐＬｌ−Ｒ２および−Ｒ４か
ら得た。成長ホルモン遺伝子のアミノおよびカルボキシ
末端を修飾するのに使用される合成二本鎖ＤＮＡの配列
はＳａｇｂｓｒｇら（１９８３、ＤＮＡ２”、３７−４
５）による報告から取り出した。ホスホラミダイト化学
（Ｃａｒｕｔｈｔｒｒｓら）を使用して上述の如くオリ
ゴヌクレオチドを合成し、断片を一本領オリゴマー（１
１−１６塩基）から組立てた。Ｎ−末端合成りＮＡは蛋
白質合成のための人工ＡＴＧ開始コドンおよびｂＧＨの
最初の２３個のアミノ酸のコドンをコード化している。
’Ｉ）ＢＲ３２２ＤＮＡへの挿入を促進するために、こ
の合成断片は、制限エンドヌクレアーゼＥａｏＲ■とＥ
ｉｓｄ ＩＩＩ Ｋよって生じた接着末端に連続的に
一致する５′末端上に４塩基−本領接着末端をも有して
いた。所望の配位結合生成物を５％ポリアクリルアミド
ゲルから約５ｏｂｐの帯状物として単離した。次いで精
製されたＤＮＡを、すでに制限エンドヌクレアーゼＥｃ
ｏＲＩおよびＥｉｔｃｄＴｎで切断されたｐＢＲ３２２
ＤＮＡと配位結合して大腸菌能力細胞の中に形質転換し
た。クローンされた合成りＮＡを化学減成方法（Ｍα■
扁およびＧＮｂａデｔ＃１９８０、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ＥｎｔｙｍｏＬ ６５ ： ４ ９９ ）を使用
してＤＮＡ配列を分析して修飾されたｂＧＨ配列の完全
な配列を確認した。
の合成断片は、制限エンドヌクレアーゼＥａｏＲ■とＥ
ｉｓｄ ＩＩＩ Ｋよって生じた接着末端に連続的に
一致する５′末端上に４塩基−本領接着末端をも有して
いた。所望の配位結合生成物を５％ポリアクリルアミド
ゲルから約５ｏｂｐの帯状物として単離した。次いで精
製されたＤＮＡを、すでに制限エンドヌクレアーゼＥｃ
ｏＲＩおよびＥｉｔｃｄＴｎで切断されたｐＢＲ３２２
ＤＮＡと配位結合して大腸菌能力細胞の中に形質転換し
た。クローンされた合成りＮＡを化学減成方法（Ｍα■
扁およびＧＮｂａデｔ＃１９８０、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ＥｎｔｙｍｏＬ ６５ ： ４ ９９ ）を使用
してＤＮＡ配列を分析して修飾されたｂＧＨ配列の完全
な配列を確認した。
Ｓａａｂｓｒｇ らによって記載されたプラスミドに
類似の発現ベクターなりＧＨとｐＧＥの両者について構
成して、リポゾーム結合部位を変えた場合のプロレンニ
ン以外の哺乳類の遺伝子の発現を比較した。ｂＧＨ発現
プラスミドを構成するのに使用される実験工程は第５図
と第６図に示した。
類似の発現ベクターなりＧＨとｐＧＥの両者について構
成して、リポゾーム結合部位を変えた場合のプロレンニ
ン以外の哺乳類の遺伝子の発現を比較した。ｂＧＨ発現
プラスミドを構成するのに使用される実験工程は第５図
と第６図に示した。
まず、ｃ Ｄ Ａ’ Ａりｏ −ｙ ｐ Ｂ ＧＨ−１
０２からの領域、すなわちアミノ酸２３〜８６をコード
化している配列を５％ポリアクリルアミドゲル上で単離
し、ＡＴＧ開始コドンとｂＧＨの最初の２２個のアミノ
酸のための配列をコード化しているｐＢＲ３２２サブク
ローンが単離されたクローン化合成７５ ｂｐ Ｅｃｏ
ＲＩ −Ｐｖｕ ＩＩＡ断片配位結合した。この配位結
合混合物を制限エンドヌクレアーゼＥ ｃ ｏ ＲＩお
よびＰｓｔＩで開裂し、２７０ｂｐ断片を５％ポリアク
リルアミドゲルから単離し、適当に開裂されたｐＢＲ３
２２ＤＮＡに挿入した。これら０２つの部位を使用して
、修飾されたｂＧ１１遺伝子配列のＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ
Ｉ ＤＮＡ断片を、ＢＲ３２２プラスミドに挿入して
挿入の単一の配向のみを可能にした。この結合において
得られた形質転換体から得られたプラスミドＤＮＡをＥ
ｃｏ ＲＩとＰｓｔＩで開裂して２７０ｂｐｂＧＨ遺
伝子断片のベクターへの挿入を証明した。次に、ｂＧ１
１アミノ酸９１−１９１のコード化配列（およびｂ Ｇ
Ｉｆ ｃ ＤＮ Ａの３′未翻訳領域）を有するｂＢ
ＧＨ−１０２からの４４０ ｈｐ Ｐｓｔ Ｉ ＤＮＡ
１１１′ｒ片をこのプラスミドＤＮＡのＰａｔ１部位に
挿入して全長ｂＧＨ遺伝子の再構成を完了した。このＰ
ｓｔ■断片はｂＧＩｌ遺伝子の残部に対して２つの可能
な方向で挿入された。制限地図によると、挿入物を所望
の方向に挿入すると約４９０ ｂｐ Ｐｖｓ■断片（上
記ｂＧＨ遺伝子に対して完全に内部）を生成するが、挿
入する方向が悪いと３５０１１７）ＰｖｌＬＩ［Ｄ Ｎ
Ａ断片となる。制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＵでテ
トラサイクリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡ
を開裂後側方の方向の多重単離物を同定した。この方法
で同定されたプラスミドの１つはｐＢＧＥ−２１２と称
され、この全長ｂＧＨ遺伝子をさらに制限エンドヌクレ
アーゼで開裂して制限地図を作成しＤＮＡ配列をしらべ
ることによって分析して該プラスミドの構成を正確なも
のにした。
０２からの領域、すなわちアミノ酸２３〜８６をコード
化している配列を５％ポリアクリルアミドゲル上で単離
し、ＡＴＧ開始コドンとｂＧＨの最初の２２個のアミノ
酸のための配列をコード化しているｐＢＲ３２２サブク
ローンが単離されたクローン化合成７５ ｂｐ Ｅｃｏ
ＲＩ −Ｐｖｕ ＩＩＡ断片配位結合した。この配位結
合混合物を制限エンドヌクレアーゼＥ ｃ ｏ ＲＩお
よびＰｓｔＩで開裂し、２７０ｂｐ断片を５％ポリアク
リルアミドゲルから単離し、適当に開裂されたｐＢＲ３
２２ＤＮＡに挿入した。これら０２つの部位を使用して
、修飾されたｂＧ１１遺伝子配列のＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ
Ｉ ＤＮＡ断片を、ＢＲ３２２プラスミドに挿入して
挿入の単一の配向のみを可能にした。この結合において
得られた形質転換体から得られたプラスミドＤＮＡをＥ
ｃｏ ＲＩとＰｓｔＩで開裂して２７０ｂｐｂＧＨ遺
伝子断片のベクターへの挿入を証明した。次に、ｂＧ１
１アミノ酸９１−１９１のコード化配列（およびｂ Ｇ
Ｉｆ ｃ ＤＮ Ａの３′未翻訳領域）を有するｂＢ
ＧＨ−１０２からの４４０ ｈｐ Ｐｓｔ Ｉ ＤＮＡ
１１１′ｒ片をこのプラスミドＤＮＡのＰａｔ１部位に
挿入して全長ｂＧＨ遺伝子の再構成を完了した。このＰ
ｓｔ■断片はｂＧＩｌ遺伝子の残部に対して２つの可能
な方向で挿入された。制限地図によると、挿入物を所望
の方向に挿入すると約４９０ ｂｐ Ｐｖｓ■断片（上
記ｂＧＨ遺伝子に対して完全に内部）を生成するが、挿
入する方向が悪いと３５０１１７）ＰｖｌＬＩ［Ｄ Ｎ
Ａ断片となる。制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＵでテ
トラサイクリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡ
を開裂後側方の方向の多重単離物を同定した。この方法
で同定されたプラスミドの１つはｐＢＧＥ−２１２と称
され、この全長ｂＧＨ遺伝子をさらに制限エンドヌクレ
アーゼで開裂して制限地図を作成しＤＮＡ配列をしらべ
ることによって分析して該プラスミドの構成を正確なも
のにした。
ｂＧＨ発現プラスミドを組立てるための次の段階は、大
腸菌ｔｒｐプロモーターとりボゾーム結合部位配列を有
するＥ ｃ ｏ ＲＩ Ｄ ＃ Ａ断片の挿入である。
腸菌ｔｒｐプロモーターとりボゾーム結合部位配列を有
するＥ ｃ ｏ ＲＩ Ｄ ＃ Ａ断片の挿入である。
全長ｂＧＥクローン１．ＢＧＢ２１２を制限エンドヌク
レアーゼＥｃｏ ＲＩで開裂し、細菌のアルカリ性ホス
ファターゼで処理して、２つの異なる約３９０ｂｐのＥ
ｃｏＲＩ断片（ｂＧＨの細菌による発現に要する配列を
有する）と結合させた。２つの異なる配位結合を行って
、遺伝子開始領域のヌクレオチド配列がわずかに異なる
ｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ断片をｐＢＧＥ−２１２に
挿入した。菌株ＢＢ１０１の能力細胞を各配位結合反応
混合物で形質転換した。各形質転換物からいくつかのテ
トラサイクリン耐性コロニーをとり出し、単離されたプ
ラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼによる切断に
よって分析した。ｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ含有断片
を、該プロモーターからの転写の方向に対して可能な２
つの方向でｐＢＧＨ−２１２ＤＮＡに挿入できた。プロ
モーター−ｒｂａ挿入物の方向をｂＧＨ遺伝子の転写を
生じる方向にすると６０ ｂｐＨｉｎｄｍ ＤＮＡ断片
を生成し、望マシ（ない方向にすると４００６ｐ断片を
生成する。
レアーゼＥｃｏ ＲＩで開裂し、細菌のアルカリ性ホス
ファターゼで処理して、２つの異なる約３９０ｂｐのＥ
ｃｏＲＩ断片（ｂＧＨの細菌による発現に要する配列を
有する）と結合させた。２つの異なる配位結合を行って
、遺伝子開始領域のヌクレオチド配列がわずかに異なる
ｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ断片をｐＢＧＥ−２１２に
挿入した。菌株ＢＢ１０１の能力細胞を各配位結合反応
混合物で形質転換した。各形質転換物からいくつかのテ
トラサイクリン耐性コロニーをとり出し、単離されたプ
ラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼによる切断に
よって分析した。ｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ含有断片
を、該プロモーターからの転写の方向に対して可能な２
つの方向でｐＢＧＨ−２１２ＤＮＡに挿入できた。プロ
モーター−ｒｂａ挿入物の方向をｂＧＨ遺伝子の転写を
生じる方向にすると６０ ｂｐＨｉｎｄｍ ＤＮＡ断片
を生成し、望マシ（ない方向にすると４００６ｐ断片を
生成する。
各結合混合物からの倍数の組換え微生物を、直接の発現
に必要とされる配置でｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ配列
に隣接する完全なりＧＥ遺伝子を担持するプラスミドで
同定した。
に必要とされる配置でｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ配列
に隣接する完全なりＧＥ遺伝子を担持するプラスミドで
同定した。
発現プラスミドの構成は、プラスミドｐＢＧＨ−２１２
−／＜２および、ＢＧＭ−２１２−Ｒ４からの約９２０
ｂｐＨｉ九ｄ ＩＩＩ −Ｐ ｔ−藝■（パーシャル）
ＤＮＡ断片を単離することによって開始された。
−／＜２および、ＢＧＭ−２１２−Ｒ４からの約９２０
ｂｐＨｉ九ｄ ＩＩＩ −Ｐ ｔ−藝■（パーシャル）
ＤＮＡ断片を単離することによって開始された。
このＤＮＡ断片はｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ配列およ
びｂＧＥコード化配列配列とんど全体（最後の４個のア
ミノ酸残基および停止コドン以外のすべて）を含む。ホ
ルモン全体を発現するために、ｂＧＩＩのＣ末端をコー
ド化している合成りＮＡの断片をｐＢＲ−３２２にクロ
ーンした。この２０ｂ ｐ ＤＮＡ１Ｍ片を２つの独立
したオリゴマーとして合成し、アニール化して二本鎖断
片を形成し、制限エンドヌクレアーゼＥ ｃ ｏ ＲＩ
およびＩＩ ｉ ｎ ｄ ＩＩＩで切断されたｐＢＲ３
２２ＤＮＡに挿入した。このサブクローンを制限エンド
ヌクレアーゼＪ’ｖｗ■およびＢａｍ１ｌ（で切断後、
３６５ ｂ ｐ Ｐｖｕ■−ＨａｍｌｌｌＩ）ＨＡ断片
をゲルで単離し、電気溶出により精製した。最終的な発
現プラスミドは、クローンされた合成Ｃ末端を有する断
片（３６５ｂｐ）を第６図に示すとおりに、各々、ｔｒ
ｐプロモーター−ｒｂｓ −ｂ Ｇｌｌ ＤＮ Ａ断片
（９２０ｂｐ）とｐＢＲ３２２誘導ベクター断片（３９
９５６ｐ）と結合することによって組み立てられた。全
長ｂＧＩＩ発現プラスミドをＰｖｘ■による制限エンド
ヌクレアーゼ開裂によって同定された。これらのｂＧＩ
１発現プラスミドはさらに制限酵素開裂地図のもつと正
確な決定により特徴付けられた。ＤＮＡの配列をしらべ
ることによりこれらの発現プラスミドをさらにしらべる
ことにより、上記修飾されたｂＧＥ遺伝子配列を証明し
１．ＢＧＨ−３０１とｐＢＧＨ−３７５と称される２つ
の異なるベクターが別個のものであることを確証した。
びｂＧＥコード化配列配列とんど全体（最後の４個のア
ミノ酸残基および停止コドン以外のすべて）を含む。ホ
ルモン全体を発現するために、ｂＧＩＩのＣ末端をコー
ド化している合成りＮＡの断片をｐＢＲ−３２２にクロ
ーンした。この２０ｂ ｐ ＤＮＡ１Ｍ片を２つの独立
したオリゴマーとして合成し、アニール化して二本鎖断
片を形成し、制限エンドヌクレアーゼＥ ｃ ｏ ＲＩ
およびＩＩ ｉ ｎ ｄ ＩＩＩで切断されたｐＢＲ３
２２ＤＮＡに挿入した。このサブクローンを制限エンド
ヌクレアーゼＪ’ｖｗ■およびＢａｍ１ｌ（で切断後、
３６５ ｂ ｐ Ｐｖｕ■−ＨａｍｌｌｌＩ）ＨＡ断片
をゲルで単離し、電気溶出により精製した。最終的な発
現プラスミドは、クローンされた合成Ｃ末端を有する断
片（３６５ｂｐ）を第６図に示すとおりに、各々、ｔｒ
ｐプロモーター−ｒｂｓ −ｂ Ｇｌｌ ＤＮ Ａ断片
（９２０ｂｐ）とｐＢＲ３２２誘導ベクター断片（３９
９５６ｐ）と結合することによって組み立てられた。全
長ｂＧＩＩ発現プラスミドをＰｖｘ■による制限エンド
ヌクレアーゼ開裂によって同定された。これらのｂＧＩ
１発現プラスミドはさらに制限酵素開裂地図のもつと正
確な決定により特徴付けられた。ＤＮＡの配列をしらべ
ることによりこれらの発現プラスミドをさらにしらべる
ことにより、上記修飾されたｂＧＥ遺伝子配列を証明し
１．ＢＧＨ−３０１とｐＢＧＨ−３７５と称される２つ
の異なるベクターが別個のものであることを確証した。
これらの発現プラスミドのＤＮＡ配列を翻訳することに
より１９１個のアミノ酸残渣のホルモンポリペプチドを
予測できる。そのような蛋白質の測定された分子量は約
２２，０００である。ｂＧＨ発現プラスミドｐＢ０１１
−３０１とｐＢＧＥ−３７５を有する細胞をｔｒｐプロ
モーターで司令される発現を誘導するのに公知の条件下
に生育させると、細胞は、総蛋白抽出物を５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル（Ｌａｇｒｎｍｌｉ、 Ｕ、 １９
７０ 、 Ｎａｔｕｒｅ２７７．６８０）上でしらべた
ところ精製されたｂＧＨｉ白（マイルス（Ａ（ｊｊｇｇ
）より得た）のサイズに似た蛋白質を生産した。この帯
状物は同一条件下に生育させたベクタープラスミドｐＢ
Ｒ３２２を有する細胞からの蛋白質抽出物中で可視では
なかった。ｂＧＩｉレベルを５７９７Ｌｍにおけるデン
シトメーターゲル走査によりしらべた。
より１９１個のアミノ酸残渣のホルモンポリペプチドを
予測できる。そのような蛋白質の測定された分子量は約
２２，０００である。ｂＧＨ発現プラスミドｐＢ０１１
−３０１とｐＢＧＥ−３７５を有する細胞をｔｒｐプロ
モーターで司令される発現を誘導するのに公知の条件下
に生育させると、細胞は、総蛋白抽出物を５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル（Ｌａｇｒｎｍｌｉ、 Ｕ、 １９
７０ 、 Ｎａｔｕｒｅ２７７．６８０）上でしらべた
ところ精製されたｂＧＨｉ白（マイルス（Ａ（ｊｊｇｇ
）より得た）のサイズに似た蛋白質を生産した。この帯
状物は同一条件下に生育させたベクタープラスミドｐＢ
Ｒ３２２を有する細胞からの蛋白質抽出物中で可視では
なかった。ｂＧＩｉレベルを５７９７Ｌｍにおけるデン
シトメーターゲル走査によりしらべた。
ｒｂｓのＲ２を変えた発現プラスミド（ｐＢＧＩＩ−３
０１）を含む培養物は総細胞蛋白質の約２０〜２５％の
レベルでｂＧｌｌを生成した。一方、ｒｂｒのＲ４が変
化したｐＢＧＡ−３７５発現プラスミドを有する細胞は
総細胞蛋白質の約５〜７％のレベルでｂＧｌｌを生成し
た。
０１）を含む培養物は総細胞蛋白質の約２０〜２５％の
レベルでｂＧｌｌを生成した。一方、ｒｂｒのＲ４が変
化したｐＢＧＡ−３７５発現プラスミドを有する細胞は
総細胞蛋白質の約５〜７％のレベルでｂＧｌｌを生成し
た。
ｐＧＨ発現の場合、ｂＧＥ発現に使用されるものと類似
の方法が使用された。ｐＧＨ遺伝子のアミン末端を修飾
するのに使用される二本鎖ＤＮＡの配列は本質的にＳｅ
ｅｂｗτｇらの上記文献に記載のとおりである。ｐＧＨ
発現プラスミドを構成するのに使用される実験の工程は
第７図のとおりである。まず、ｃ Ｄ Ａ’ Ａクロー
ン＜ｐＧＨ２４）からの領域をｐＧＥ遺伝子の合成領域
で置換した。ｐＧＥのアミノ酸残基２２と２３をコード
している領域はＰｖＳ■部位を欠いているので、ｐＧｆ
ｉ／・イブリッド遺伝子の合成５′部分を上記クローン
されたｃ Ｄ Ａ’ Ａから誘導されたコード化配列に
Ａｓｓ■部位（、ＧＨ−２４のアミノ酸コドン１６およ
び１７で生じる）において結合した。ＡｓｕＩ部位もｐ
ＧＩＩのアミン末端をコードしている合成りＮＡの同じ
位置に挿入した。クローンされたｃＤ ＃ Ａにさらに
Ａｓｕ Ｉ部位が存在することにより、このｐＧＩＩ遺
伝子は３つの異なるＤＮＡ断片から再構成された。
の方法が使用された。ｐＧＨ遺伝子のアミン末端を修飾
するのに使用される二本鎖ＤＮＡの配列は本質的にＳｅ
ｅｂｗτｇらの上記文献に記載のとおりである。ｐＧＨ
発現プラスミドを構成するのに使用される実験の工程は
第７図のとおりである。まず、ｃ Ｄ Ａ’ Ａクロー
ン＜ｐＧＨ２４）からの領域をｐＧＥ遺伝子の合成領域
で置換した。ｐＧＥのアミノ酸残基２２と２３をコード
している領域はＰｖＳ■部位を欠いているので、ｐＧｆ
ｉ／・イブリッド遺伝子の合成５′部分を上記クローン
されたｃ Ｄ Ａ’ Ａから誘導されたコード化配列に
Ａｓｓ■部位（、ＧＨ−２４のアミノ酸コドン１６およ
び１７で生じる）において結合した。ＡｓｕＩ部位もｐ
ＧＩＩのアミン末端をコードしている合成りＮＡの同じ
位置に挿入した。クローンされたｃＤ ＃ Ａにさらに
Ａｓｕ Ｉ部位が存在することにより、このｐＧＩＩ遺
伝子は３つの異なるＤＮＡ断片から再構成された。
ｐＧｌｉ−２４から単離された６ ３５ ｂｐ Ｐｓｔ
ｌ−ＰｖｗＵ断片はＲｓα■によって切断され、得られ
た２ ００ ｂｐＰｓｔＩ−Ｒｓａ Ｉ断片をさらにＡ
ｓｎ■で開裂した。修飾された遺伝子はクローンされた
合成ＥｃｏＲＩ−Ａｓｕ■５３ ｂｐ断片、７５ｂｐＡ
ｓｓＩ −ＲｓａＩ断片および４８０ ｈｐ ＲｓｃＬ
■−Ｐ ｖ ｕ ＩＩ断片をいっしょに結合することに
より構成した。この結合の生成物をＥｇｏＲＩおよびＲ
ｖｕ■で切断し、５７０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を５
％ポリアクリルアミドゲルから単離した。この断片をｂ
ＧＨ発現プラスミドｐＢＧＨ−３７５がらのＥｃａＲＩ
−Ｐｖ舊■ （パーシャル）ベクター断片と結合して大
腸菌菌株ＭＭ２９４ＣＡＴＣＣ３３６２５）の能力細胞
内に形質転換し、アンピシリンを含有するプレート上で
選択された。このプレー発現プラスミド（９１０ｂｐＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片の存在によって同定された）
は全長ｐＧＨ遺伝子を有する。というのは、ｐＧＨおよ
びｂＧＥ蛋白質は同じＣ末端アミノ酸配列を有するから
である。
ｌ−ＰｖｗＵ断片はＲｓα■によって切断され、得られ
た２ ００ ｂｐＰｓｔＩ−Ｒｓａ Ｉ断片をさらにＡ
ｓｎ■で開裂した。修飾された遺伝子はクローンされた
合成ＥｃｏＲＩ−Ａｓｕ■５３ ｂｐ断片、７５ｂｐＡ
ｓｓＩ −ＲｓａＩ断片および４８０ ｈｐ ＲｓｃＬ
■−Ｐ ｖ ｕ ＩＩ断片をいっしょに結合することに
より構成した。この結合の生成物をＥｇｏＲＩおよびＲ
ｖｕ■で切断し、５７０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を５
％ポリアクリルアミドゲルから単離した。この断片をｂ
ＧＨ発現プラスミドｐＢＧＨ−３７５がらのＥｃａＲＩ
−Ｐｖ舊■ （パーシャル）ベクター断片と結合して大
腸菌菌株ＭＭ２９４ＣＡＴＣＣ３３６２５）の能力細胞
内に形質転換し、アンピシリンを含有するプレート上で
選択された。このプレー発現プラスミド（９１０ｂｐＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片の存在によって同定された）
は全長ｐＧＨ遺伝子を有する。というのは、ｐＧＨおよ
びｂＧＥ蛋白質は同じＣ末端アミノ酸配列を有するから
である。
ｐＧＢ発現プラスミドの構成における次の工程は、大腸
菌ｔｒｐオペロンプロモーター配列と修飾されたりボゾ
ーム結合部位を有する約３９０ｂｐＥＣＯＲＩ ＤＮＡ
断片の挿入である。全長、ＧＥプラスミドを制限エンド
ヌクレアーゼＥｃｏＲＩで開裂し、ｐＧＥの細菌による
発現に必要な配列を有するＥ ｃ ｏ ＲＩ断片の別個
のもの（ｓｅｐａｒａｔｅｕｇｒ８ｉ０ｎ）と結合した
。発現断片をリボゾーム結合部位の周囲の領域かわずか
に異なるヌクレオチド配列とともに使用することにより
２つの異なる結合反応物をつくった。菌株Ｃ６００の能
力細胞を各結合反応物で形質転換した。プラスミドＤＮ
Ａを各形質転換体からのい（つかの薬剤耐性コロニーか
ら単離し、制限エンドヌクレアーゼによって切断して分
析した。ｔｒｐプロモーターを含む断片をｔｒｐプロモ
ーターからの転写方向に対して可能な２つの方向でプレ
発現プラスミド中に挿入できた。上記ｐＧＩＩ遺伝子の
転写を生じるプロモーター挿入断片を所望の方向に挿入
すると９２０ｂｐ１１ｉｎｄ ＵＩＤＮ Ａ断片を産生
じ、一方望ましくない方向にすると６００ｂｐＤＮＡ断
片を生成する。
菌ｔｒｐオペロンプロモーター配列と修飾されたりボゾ
ーム結合部位を有する約３９０ｂｐＥＣＯＲＩ ＤＮＡ
断片の挿入である。全長、ＧＥプラスミドを制限エンド
ヌクレアーゼＥｃｏＲＩで開裂し、ｐＧＥの細菌による
発現に必要な配列を有するＥ ｃ ｏ ＲＩ断片の別個
のもの（ｓｅｐａｒａｔｅｕｇｒ８ｉ０ｎ）と結合した
。発現断片をリボゾーム結合部位の周囲の領域かわずか
に異なるヌクレオチド配列とともに使用することにより
２つの異なる結合反応物をつくった。菌株Ｃ６００の能
力細胞を各結合反応物で形質転換した。プラスミドＤＮ
Ａを各形質転換体からのい（つかの薬剤耐性コロニーか
ら単離し、制限エンドヌクレアーゼによって切断して分
析した。ｔｒｐプロモーターを含む断片をｔｒｐプロモ
ーターからの転写方向に対して可能な２つの方向でプレ
発現プラスミド中に挿入できた。上記ｐＧＩＩ遺伝子の
転写を生じるプロモーター挿入断片を所望の方向に挿入
すると９２０ｂｐ１１ｉｎｄ ＵＩＤＮ Ａ断片を産生
じ、一方望ましくない方向にすると６００ｂｐＤＮＡ断
片を生成する。
各結合反応物からの多重単離物を直接発現に必要とされ
る配置にあるｔｒｐプロモーターとｒｂｓ配列に隣接す
る完全なｐＧＥ遺伝子を有するプラスミドで同定、した
。さらに、これらの発現構成物の特性は他の制限エンド
ヌクレアーゼによる制限地図をつくることによりしらべ
られた。これらのｐＧＥ発現プラスミドの特徴をＤＮＡ
配列をしらべることによってしらべてヌクレオチドのレ
ベルでそれらが別個のものであることを確証した。これ
ら２つのｐＧＨ発現プラスミドはｐＧＨ−１０１とｐＧ
Ｉｌ−１０７と称された。
る配置にあるｔｒｐプロモーターとｒｂｓ配列に隣接す
る完全なｐＧＥ遺伝子を有するプラスミドで同定、した
。さらに、これらの発現構成物の特性は他の制限エンド
ヌクレアーゼによる制限地図をつくることによりしらべ
られた。これらのｐＧＥ発現プラスミドの特徴をＤＮＡ
配列をしらべることによってしらべてヌクレオチドのレ
ベルでそれらが別個のものであることを確証した。これ
ら２つのｐＧＨ発現プラスミドはｐＧＨ−１０１とｐＧ
Ｉｌ−１０７と称された。
これらのｐＧＨ発現プラスミドのＤＮＡ配列を翻訳すれ
ば１９１個のアミノ酸のホルモンポリペプチドを予測し
得る。そのような蛋白質の測定された分子量は約２２，
０００となる。プラスミドｐＧＨ−１０１まタハｐ Ｇ
Ｅ −１０７からなる組換え微生物をｔｒｐプロモータ
ーが司令する発現を誘導させるに公知の条件下で生育さ
せると、これらの細胞は約２２，０００ダルトンのサイ
ズの蛋白質を生成した。この帯状物は同一の条件下に生
育されたベクタープラスミドｐＢＲ３２２を有する細胞
からり（もれた蛋白質抽出物からは得られなかった。、
ＧＥ産生のレベルは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの
個々のレーンをデンシトメーターで走査することによっ
て決定された。いくつかの大腸菌蛋白質は２２．０００
ダルトンの大きさにあてはまり対照細胞抽出物中の総蛋
白質の約２〜５％を占める。これらの生来の蛋白質の割
合を補正すると、上記発現培養物の蛋白質抽出物中に見
られるｐＧＨ帯状物はｐＧＨ−１０１とｐＧＥ−１０７
の各々について総細胞蛋白質の約５％および１５％であ
る。トリプト７ア／（１００μｒ、／＋７りの存在下に
生育させた培養物中のｐＧＨレベルを定量するとｐＧＥ
発現のレベルが低下した。この事実は１．ＧＥ蛋白質の
大腸菌内での産生が意図されたｔｒｐプロモーター−オ
ペレーターの制御下で本当に行なわれていることを意味
する。ｐＧＨの場合の発現レベルの相違は同じリポゾー
ム結合部位配列を使用してプロレンニンとｂＧＨを発現
させるときに見られる相違と類似していた。
ば１９１個のアミノ酸のホルモンポリペプチドを予測し
得る。そのような蛋白質の測定された分子量は約２２，
０００となる。プラスミドｐＧＨ−１０１まタハｐ Ｇ
Ｅ −１０７からなる組換え微生物をｔｒｐプロモータ
ーが司令する発現を誘導させるに公知の条件下で生育さ
せると、これらの細胞は約２２，０００ダルトンのサイ
ズの蛋白質を生成した。この帯状物は同一の条件下に生
育されたベクタープラスミドｐＢＲ３２２を有する細胞
からり（もれた蛋白質抽出物からは得られなかった。、
ＧＥ産生のレベルは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの
個々のレーンをデンシトメーターで走査することによっ
て決定された。いくつかの大腸菌蛋白質は２２．０００
ダルトンの大きさにあてはまり対照細胞抽出物中の総蛋
白質の約２〜５％を占める。これらの生来の蛋白質の割
合を補正すると、上記発現培養物の蛋白質抽出物中に見
られるｐＧＨ帯状物はｐＧＨ−１０１とｐＧＥ−１０７
の各々について総細胞蛋白質の約５％および１５％であ
る。トリプト７ア／（１００μｒ、／＋７りの存在下に
生育させた培養物中のｐＧＨレベルを定量するとｐＧＥ
発現のレベルが低下した。この事実は１．ＧＥ蛋白質の
大腸菌内での産生が意図されたｔｒｐプロモーター−オ
ペレーターの制御下で本当に行なわれていることを意味
する。ｐＧＨの場合の発現レベルの相違は同じリポゾー
ム結合部位配列を使用してプロレンニンとｂＧＨを発現
させるときに見られる相違と類似していた。
Ｒ２”ｔｒｐプロモーター−ｒｂｓを使用した外来遺伝
子の効率的発現のもう１つの例は、合成りＮＡ配列から
のヒトウロガストロンすなワチヒト上皮成長因子（ｈＥ
ＧＦ）の産生である。ｈＥＧＦの効率的な細菌による生
産を達成するのに工夫された計画においては成熟ｈＥＧ
Ｆのコード化配列を含むＤＮＡ断片を化学的に合成した
。この方法によって、成熟Ｅ、ＧＦポリペプチドの最初
のアミノ酸残基をコードしているコドンの前に蛋白質合
成のためのＡＴＧ開始コドンを導入することによってこ
の成熟ホルモンの直接発現が可能となった。
子の効率的発現のもう１つの例は、合成りＮＡ配列から
のヒトウロガストロンすなワチヒト上皮成長因子（ｈＥ
ＧＦ）の産生である。ｈＥＧＦの効率的な細菌による生
産を達成するのに工夫された計画においては成熟ｈＥＧ
Ｆのコード化配列を含むＤＮＡ断片を化学的に合成した
。この方法によって、成熟Ｅ、ＧＦポリペプチドの最初
のアミノ酸残基をコードしているコドンの前に蛋白質合
成のためのＡＴＧ開始コドンを導入することによってこ
の成熟ホルモンの直接発現が可能となった。
この合成遺伝子は１５個のオリゴヌクレオチドからなり
、長さは１２〜４５個の塩基である。３つの別個の結合
を行い、結合中間生成物をポリアクリルアミドゲル上で
単離した。精製された結合中間生成物を次いでｈＥＧＦ
遺伝子の最終的組立てとして配位結合した。ｈＥＧＦ遺
伝子をプラスミドｐＥＲ３２２ＤＮＡに挿入するのを促
進するため、合成／ＬＥＧＦ遺伝子がその末端にＥｃｏ
ＲＩおよび１１ｉｎｄ■制限工ンドヌクレアーゼ接着末
端を有するようにした。ｈＥＧＦ合成りＮＡをＥｃｏＲ
Ｉおよび１１ｉｎｄＴＪｌ開裂したｐＢＲ３２２ＤＮＡ
と結合させ、このプラスミドの合成的に誘導された領域
をＤＮＡ配列により分析（ＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅ
−ｒｔの上記文献）して正確なものとした。
、長さは１２〜４５個の塩基である。３つの別個の結合
を行い、結合中間生成物をポリアクリルアミドゲル上で
単離した。精製された結合中間生成物を次いでｈＥＧＦ
遺伝子の最終的組立てとして配位結合した。ｈＥＧＦ遺
伝子をプラスミドｐＥＲ３２２ＤＮＡに挿入するのを促
進するため、合成／ＬＥＧＦ遺伝子がその末端にＥｃｏ
ＲＩおよび１１ｉｎｄ■制限工ンドヌクレアーゼ接着末
端を有するようにした。ｈＥＧＦ合成りＮＡをＥｃｏＲ
Ｉおよび１１ｉｎｄＴＪｌ開裂したｐＢＲ３２２ＤＮＡ
と結合させ、このプラスミドの合成的に誘導された領域
をＤＮＡ配列により分析（ＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅ
−ｒｔの上記文献）して正確なものとした。
大腸菌のｈＥＧＦの発現のためのベクターは、プロレン
ニン、ｂｃｎｙよりｐＧｎの高レベルの発現に使用され
たことのあるｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ断片を使用し
て構成された。ＥＧＦ発現プラスミドの構成はｐＢＲ３
２２−ＥＧＦサブクローンを制限エンドヌクレアーゼＥ
６ｏＲ■で開裂し、続いて細菌のアルカリ性ホスファタ
ーゼで脱ホスホリル化することにより開始された。これ
らの発現プラスミドはｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ配列
を有するＥ ｃ ｏ ＲＩ断片を使用して構成された。
ニン、ｂｃｎｙよりｐＧｎの高レベルの発現に使用され
たことのあるｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ断片を使用し
て構成された。ＥＧＦ発現プラスミドの構成はｐＢＲ３
２２−ＥＧＦサブクローンを制限エンドヌクレアーゼＥ
６ｏＲ■で開裂し、続いて細菌のアルカリ性ホスファタ
ーゼで脱ホスホリル化することにより開始された。これ
らの発現プラスミドはｔｒｐプロモーター−ｒｂｓ配列
を有するＥ ｃ ｏ ＲＩ断片を使用して構成された。
リボゾーム結合部位の周囲の領域のヌクレオチド配列が
わずかに異なるｔｒｐプロモーター−ｒｐｓ断片を使用
して２つの異なる結合を行なった。大腸菌菌株ＨＢ１０
１の能力細胞を各結合反応物で形質転換した。各形質転
換物から得られたいくつかの薬物耐性コロニーをとり出
して単離したプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアー
ゼによって開裂して分析した。ｔｒｐプロモーター−ｒ
ｂｓを有する断片をプロモーターからの転写の方向に対
して可能な２つの方向でＥＧＦサブクローンの中に挿入
できた。合成ＥＧＦ遺伝子の発現を生じるプロモーター
挿入断片の方向を望ましい方向にすると５１０ｈｐのＩ
ｌｉｎｄｍＤ Ｎ Ａ断片を生成するが、望ましくない
方向にすると２００ｂｐのｌ１ｉｎｄＩＩＩＤ Ａ’
Ａ断片を生成する。各結合反応物からの多重単離物は、
直接発現に必要な配置で細菌のプロモーター−ｒｂｔｔ
配列に隣接してＥＧＦ遺伝子を有するプラスミドで同定
された。
わずかに異なるｔｒｐプロモーター−ｒｐｓ断片を使用
して２つの異なる結合を行なった。大腸菌菌株ＨＢ１０
１の能力細胞を各結合反応物で形質転換した。各形質転
換物から得られたいくつかの薬物耐性コロニーをとり出
して単離したプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアー
ゼによって開裂して分析した。ｔｒｐプロモーター−ｒ
ｂｓを有する断片をプロモーターからの転写の方向に対
して可能な２つの方向でＥＧＦサブクローンの中に挿入
できた。合成ＥＧＦ遺伝子の発現を生じるプロモーター
挿入断片の方向を望ましい方向にすると５１０ｈｐのＩ
ｌｉｎｄｍＤ Ｎ Ａ断片を生成するが、望ましくない
方向にすると２００ｂｐのｌ１ｉｎｄＩＩＩＤ Ａ’
Ａ断片を生成する。各結合反応物からの多重単離物は、
直接発現に必要な配置で細菌のプロモーター−ｒｂｔｔ
配列に隣接してＥＧＦ遺伝子を有するプラスミドで同定
された。
発現プラスミドのＤＮＡ配列を分析することによりＥＧ
Ｆコード化配列配列述の如（大腸菌ｔｒｐプロモーター
−ｒｂｓの直後にあることが確認された。ｐＥＧＦ−Ｒ
２およびｐＥＧＦ−Ｒ４と称されるＥＧＦ発現プラスミ
ドにおいてはＡＴＧ開始コドンはリポゾーム結合部位配
列の各々５および１１個のヌクレオチドの後に存在する
。
Ｆコード化配列配列述の如（大腸菌ｔｒｐプロモーター
−ｒｂｓの直後にあることが確認された。ｐＥＧＦ−Ｒ
２およびｐＥＧＦ−Ｒ４と称されるＥＧＦ発現プラスミ
ドにおいてはＡＴＧ開始コドンはリポゾーム結合部位配
列の各々５および１１個のヌクレオチドの後に存在する
。
ＥＧＦ発現プラスミドのＤＮＡ配列の翻訳をすると、領
内に３つのジスルフィド結合を形成すると考えられる６
つのシスティン残基を有する５４個のアミノ酸ポリペプ
チドを予測できる。そのようなホルモンの測定された分
子量は約６，３５３となろう。ｉｏｎと称される大腸菌
の変異菌株（Ｇｏ ｔ ｔ ｇ ｓｍａｎら、Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｇｒｉｏｌ 、 １４８．２６５．１９８１）
はコネチカット州ニューヘプンのエール大学の大腸菌（
Ｅ、ｃｏＬｉ）遺伝子ストック・センターから菌株ｙｔ
ｃＥＣＧＳＣ−６４３６として入手シ得、ＥＧＦ発現プ
ラスミドで形質転換され、ｔｒｐプロモーターによって
司令された発現を誘導するのに公知の条件下で生育され
る。野性型細胞に存するいくつかのプロテアーゼの１つ
を欠くこの変異菌株を使用して細菌によって生成したｈ
ＥＧＦの蛋白質分解を最小限にした。
内に３つのジスルフィド結合を形成すると考えられる６
つのシスティン残基を有する５４個のアミノ酸ポリペプ
チドを予測できる。そのようなホルモンの測定された分
子量は約６，３５３となろう。ｉｏｎと称される大腸菌
の変異菌株（Ｇｏ ｔ ｔ ｇ ｓｍａｎら、Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｇｒｉｏｌ 、 １４８．２６５．１９８１）
はコネチカット州ニューヘプンのエール大学の大腸菌（
Ｅ、ｃｏＬｉ）遺伝子ストック・センターから菌株ｙｔ
ｃＥＣＧＳＣ−６４３６として入手シ得、ＥＧＦ発現プ
ラスミドで形質転換され、ｔｒｐプロモーターによって
司令された発現を誘導するのに公知の条件下で生育され
る。野性型細胞に存するいくつかのプロテアーゼの１つ
を欠くこの変異菌株を使用して細菌によって生成したｈ
ＥＧＦの蛋白質分解を最小限にした。
これらの発現培養物の総蛋白抽出物を１５％５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル上でしらべてＥＧＦ産生のレベル
を決定しようとした。低分子量のポリペプチド（市販の
ものから得られた精製マウス−ＥＧＦを含む）は比較的
分割しないが、対照の抽出物に比べて発現培養物からの
抽出物にはＥＧＦ分子量範囲の蛋白質がもつと多いよう
である。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの個々のレー
ンをデンシトメーターで走査した。大きさが１０．００
０ダルトン未満の細胞蛋白質は対照抽出物においては総
細胞蛋白質の約１％を占めている。
リアクリルアミドゲル上でしらべてＥＧＦ産生のレベル
を決定しようとした。低分子量のポリペプチド（市販の
ものから得られた精製マウス−ＥＧＦを含む）は比較的
分割しないが、対照の抽出物に比べて発現培養物からの
抽出物にはＥＧＦ分子量範囲の蛋白質がもつと多いよう
である。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの個々のレー
ンをデンシトメーターで走査した。大きさが１０．００
０ダルトン未満の細胞蛋白質は対照抽出物においては総
細胞蛋白質の約１％を占めている。
これらの生来の蛋白質の割合を補正すると、発現培養蛋
白抽出物中の推定ＥＧＦレベルは総細胞蛋白質の約３〜
５％に相当する。
白抽出物中の推定ＥＧＦレベルは総細胞蛋白質の約３〜
５％に相当する。
第１図はプラスミド、ＰＦＺ−Ｒ２およびＲ４（ｐＰＦ
Ｚ−Ｒ）の構成を示す、ＰＦＺ−Ｒ２およびＲ４の各々
に共通の制限地図を含む概略図である。 図中矢印はｔｒｐプロモーター配列からプロキモシン（
プロレンニン）遺伝子（太い断片として表わした）へと
発現する方向を示している。合成挿入物は空白の箱状の
形で表わした。 第２図は、プラスミドｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２およびＲ４の
構成のための手順を示す概略図である。 第３図はプラスミドｐｔτｐＬＩ−Ｊイ２−Ｂ４８ 及
びｐｔｒｐＬＩ−Ｒ４−Ｒ４８の構成ツタメツ手１１ｊ
Ｉヲ示す概略図である。 第４図はプラスミドｐ ／’ Ｆ Ｚ −／＜ ２およ
びｐＰＦＺ−Ｒ４の各々についてのプロキモシン（プロ
レンニン）遺伝子のりボゾームの結合部位と開始コドン
（Ａ Ｔ Ｇ ）との間のヌクレオチド配列と間隔を示
す概略図である。 第５−１および５−２図は、全長のｂＧ１１遺伝子及び
発現配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概
略図である。プラスミドｐＢＧＩＩ−１０２はｐＢＲ３
２２のアンピシリン耐性遺伝子にクローンされたｂＧＩ
ｉｃＤＮＡ配列（黒（塗った箱形）を含む。ｂＧＩｉの
新しいアミン末端をコードしている合成りＮＡをｐＢＲ
３２２＜点線の箱形）のＥ ｃ ｏ ＲＩ部位とＪＩｉ
ｎｄＴ１１部位に挿入した。矢印は配列解読の５′→３
′方向、すなわち転写の方向を示す。 第６−１および６−２図はｂＧ１１産生のための細菌の
発現プラスミドの構成を示す概略図である。 プラスミドｐＢＧＥ−２１２−Ｒはｔｒｐプロモーター
配列（第５図参照）によって成熟ｂＧＨを完全に直接発
現させる遺伝子を担持している。これらのプラスミドは
ｌ１ｉｎｄ■によって開裂され、ＰｖｗＵによって部分
的に切断され、２つの約９２０ｂ ｐ Ｈｉｎｄ■−Ｐ
ｖｕＴｌ断片を単離した。ｂＧＩｌのＣ−末端をコード
する合成りＮＡ断片がｐ Ｂ Ｒ３２２（空白の箱形）
のＥｃｏＲＩ部位およびｌ１ｉｎｄ■部位に挿入された
。矢印はｔｒｐプロモーター配列からの転写の方向及び
配列解読における５′→３′の方向を示している。 第７−１および７−２図はｐＧＩｉ遺伝子と発現配列の
全長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図で
ある。プラスミドｐＧｌｌ−２４はｐＢＲ３２２のアン
ピシリン耐性遺伝子の中にクローンされたｐ （ｄｉ
ｃ ＤＮ Ａ配列（黒く塗った箱形）を有する。ｐＧＩ
ｌの新しいアミン末端をコードしてし・る合成りＮＡは
ｐＢＲ３２２（点線の箱形）のＥｃｏＲ１部位とＢｉｎ
ｄ’ｆＨ部位に挿入された。矢印は配列解読の５′→３
′の方向、すなわち転写の方向を示す。
Ｚ−Ｒ）の構成を示す、ＰＦＺ−Ｒ２およびＲ４の各々
に共通の制限地図を含む概略図である。 図中矢印はｔｒｐプロモーター配列からプロキモシン（
プロレンニン）遺伝子（太い断片として表わした）へと
発現する方向を示している。合成挿入物は空白の箱状の
形で表わした。 第２図は、プラスミドｐｔｒｐＬＩ−Ｒ２およびＲ４の
構成のための手順を示す概略図である。 第３図はプラスミドｐｔτｐＬＩ−Ｊイ２−Ｂ４８ 及
びｐｔｒｐＬＩ−Ｒ４−Ｒ４８の構成ツタメツ手１１ｊ
Ｉヲ示す概略図である。 第４図はプラスミドｐ ／’ Ｆ Ｚ −／＜ ２およ
びｐＰＦＺ−Ｒ４の各々についてのプロキモシン（プロ
レンニン）遺伝子のりボゾームの結合部位と開始コドン
（Ａ Ｔ Ｇ ）との間のヌクレオチド配列と間隔を示
す概略図である。 第５−１および５−２図は、全長のｂＧ１１遺伝子及び
発現配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概
略図である。プラスミドｐＢＧＩＩ−１０２はｐＢＲ３
２２のアンピシリン耐性遺伝子にクローンされたｂＧＩ
ｉｃＤＮＡ配列（黒（塗った箱形）を含む。ｂＧＩｉの
新しいアミン末端をコードしている合成りＮＡをｐＢＲ
３２２＜点線の箱形）のＥ ｃ ｏ ＲＩ部位とＪＩｉ
ｎｄＴ１１部位に挿入した。矢印は配列解読の５′→３
′方向、すなわち転写の方向を示す。 第６−１および６−２図はｂＧ１１産生のための細菌の
発現プラスミドの構成を示す概略図である。 プラスミドｐＢＧＥ−２１２−Ｒはｔｒｐプロモーター
配列（第５図参照）によって成熟ｂＧＨを完全に直接発
現させる遺伝子を担持している。これらのプラスミドは
ｌ１ｉｎｄ■によって開裂され、ＰｖｗＵによって部分
的に切断され、２つの約９２０ｂ ｐ Ｈｉｎｄ■−Ｐ
ｖｕＴｌ断片を単離した。ｂＧＩｌのＣ−末端をコード
する合成りＮＡ断片がｐ Ｂ Ｒ３２２（空白の箱形）
のＥｃｏＲＩ部位およびｌ１ｉｎｄ■部位に挿入された
。矢印はｔｒｐプロモーター配列からの転写の方向及び
配列解読における５′→３′の方向を示している。 第７−１および７−２図はｐＧＩｉ遺伝子と発現配列の
全長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図で
ある。プラスミドｐＧｌｌ−２４はｐＢＲ３２２のアン
ピシリン耐性遺伝子の中にクローンされたｐ （ｄｉ
ｃ ＤＮ Ａ配列（黒く塗った箱形）を有する。ｐＧＩ
ｌの新しいアミン末端をコードしてし・る合成りＮＡは
ｐＢＲ３２２（点線の箱形）のＥｃｏＲ１部位とＢｉｎ
ｄ’ｆＨ部位に挿入された。矢印は配列解読の５′→３
′の方向、すなわち転写の方向を示す。
Claims (3)
- （１）同化性の炭素、窒素および無機塩源からなる水性
培地で、ヌクレオチド配列ＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴ
ＴＣＡＴＧまたはＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＧＡ
ＡＴＴＣＡＴＧを含む細菌の発現プラスミドを有する大
腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）からなる微生物を実質的量の細菌
産生蛋白質が発現されるまで培養することからなる蛋白
質の製造方法。 - （２）大腸菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌株ＡＴ
ＣＣ３９５４４またはＡＴＣＣ３９５４３であり、蛋白
質がプロレンニンである特許請求の範囲第１項の方法。 - （３）さらに該プロレンニンを単離することからなる特
許請求の範囲第２項の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US56496283A | 1983-12-23 | 1983-12-23 | |
| US564962 | 1983-12-23 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59272726A Division JP2532365B2 (ja) | 1983-12-23 | 1984-12-24 | 細菌の外来蛋白質の改良された生産のための発現プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0272892A true JPH0272892A (ja) | 1990-03-13 |
| JPH0630612B2 JPH0630612B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=24256628
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59272726A Expired - Lifetime JP2532365B2 (ja) | 1983-12-23 | 1984-12-24 | 細菌の外来蛋白質の改良された生産のための発現プラスミド |
| JP1166479A Expired - Lifetime JPH0630612B2 (ja) | 1983-12-23 | 1989-06-28 | 蛋白質の製造方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59272726A Expired - Lifetime JP2532365B2 (ja) | 1983-12-23 | 1984-12-24 | 細菌の外来蛋白質の改良された生産のための発現プラスミド |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0147178B1 (ja) |
| JP (2) | JP2532365B2 (ja) |
| AT (1) | ATE66251T1 (ja) |
| BR (1) | BR8406680A (ja) |
| CA (1) | CA1340867C (ja) |
| DE (1) | DE3484926D1 (ja) |
| DK (1) | DK173028B1 (ja) |
| IE (1) | IE57651B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5659357A (en) * | 1995-04-13 | 1997-08-19 | Eastman Kodak Company | Auto white adjusting device |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
| US4743679A (en) * | 1986-02-24 | 1988-05-10 | Creative Biomolecules, Inc. | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof |
| GB8701848D0 (en) * | 1987-01-28 | 1987-03-04 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US5366081A (en) | 1987-08-26 | 1994-11-22 | United States Surgical Corporation | Packaged synthetic absorbable surgical elements |
| US5222978A (en) | 1987-08-26 | 1993-06-29 | United States Surgical Corporation | Packaged synthetic absorbable surgical elements |
| US5472702A (en) * | 1987-08-26 | 1995-12-05 | United States Surgical Corporation | Sterilization of growth factors |
| EP0335400B1 (en) * | 1988-03-30 | 1994-06-08 | Hitachi, Ltd. | Processes for production of human epidermal growth factor by genetic engineering |
| US5359831A (en) | 1989-08-01 | 1994-11-01 | United States Surgical Corporation | Molded suture retainer |
| CA2059245C (en) * | 1991-02-08 | 2004-07-06 | Michael P. Chesterfield | Method and apparatus for calendering and coating/filling sutures |
| US5904716A (en) * | 1995-04-26 | 1999-05-18 | Gendler; El | Method for reconstituting cartilage tissue using demineralized bone and product thereof |
| US20090192554A1 (en) | 2008-01-29 | 2009-07-30 | Confluent Surgical, Inc. | Bioabsorbable block copolymer |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
| IE52755B1 (en) * | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
| DK489481A (da) * | 1980-11-10 | 1982-05-11 | Searle & Co | Plasmidvektor og frmgangsmaade til fremstilling deraf |
| EP0054330B1 (en) * | 1980-12-12 | 1986-09-17 | Unilever N.V. | Dna sequences encoding various allelic forms of mature thaumatin, recombinant plasmids comprising said dna's and a process for their preparation, bacterial cultures comprising said recombinant plasmids, and method for producing mature thaumatin |
| IE53517B1 (en) * | 1981-06-17 | 1988-12-07 | Celltech Ltd | Process for the production of a polypeptide |
| JPS589687A (ja) * | 1981-06-17 | 1983-01-20 | セルテク リミテッド | ポリペプチドの生産方法 |
| NZ201918A (en) * | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
| BR8205954A (pt) * | 1981-10-14 | 1983-09-13 | Unilever Nv | Sequencia de dna,plasmidio recombinante,cultura bacteriana e microorganismos |
| IL68100A0 (en) * | 1982-03-24 | 1983-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel dna and use thereof |
| JPS58189197A (ja) * | 1982-03-24 | 1983-11-04 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａおよびその用途 |
| WO1983004030A1 (en) * | 1982-05-06 | 1983-11-24 | Applied Molecular Genetics, Inc. | The manufacture and expression of genes for urogastrone and polypeptide analogs thereof |
| US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
| EP0121569B1 (en) * | 1982-10-08 | 1990-08-22 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Novel vector |
| IE56372B1 (en) * | 1982-12-22 | 1991-07-03 | Genentech Inc | Microbially produced rennet methods for its production and plasmids used for its production |
-
1984
- 1984-12-19 AT AT84308928T patent/ATE66251T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-12-19 EP EP84308928A patent/EP0147178B1/en not_active Expired
- 1984-12-19 DE DE8484308928T patent/DE3484926D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-12-20 IE IE3270/84A patent/IE57651B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-12-21 BR BR8406680A patent/BR8406680A/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-12-21 DK DK198406192A patent/DK173028B1/da active IP Right Grant
- 1984-12-21 CA CA000470825A patent/CA1340867C/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-12-24 JP JP59272726A patent/JP2532365B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-06-28 JP JP1166479A patent/JPH0630612B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5659357A (en) * | 1995-04-13 | 1997-08-19 | Eastman Kodak Company | Auto white adjusting device |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0630612B2 (ja) | 1994-04-27 |
| JP2532365B2 (ja) | 1996-09-11 |
| EP0147178A3 (en) | 1987-06-03 |
| DK619284A (da) | 1985-06-24 |
| BR8406680A (pt) | 1985-10-22 |
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| IE843270L (en) | 1985-06-23 |
| EP0147178A2 (en) | 1985-07-03 |
| DE3484926D1 (de) | 1991-09-19 |
| ATE66251T1 (de) | 1991-08-15 |
| CA1340867C (en) | 2000-01-04 |
| DK173028B1 (da) | 1999-11-22 |
| DK619284D0 (da) | 1984-12-21 |
| EP0147178B1 (en) | 1991-08-14 |
| JPS60227682A (ja) | 1985-11-12 |
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