JPS61500586A

JPS61500586A - インタ−ロイキン−２産生のための方法及び組成物

Info

Publication number: JPS61500586A
Application number: JP50418084A
Authority: JP
Inventors: バー，フイリツプ　ジエイ; メリーウエザー，ジエイムズ　ピー
Original assignee: チロン　コ−ポレイシヨン
Priority date: 1983-11-14
Filing date: 1984-11-09
Publication date: 1986-04-03
Also published as: WO1985002200A1; EP0162898A1; EP0162898A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】インターロイキン−２産生のだめの方法及び組成物リンフ才力イン類は、天然に存在するポリペプチド類であシ、抗原チャレンジに対する宿主の免疫反応を介在する通常のリンパ球類によって産生される。

特定のリンフ才力イン、すなわちインターロイキン−２は、宿主の免疫反応を促進し、そして腫瘍、免疫不全病及び他のいくつかの臨床状態の治療において潜在的な価値を示し、並びにワクチン投与についてのアジュバントのように思われている。インターロイキン−２は、１９７２球のための有力なマイトジン（分裂促進剤）として作用していると思われている。現在、限られた量のインターロイキン−２だけが、ヒト血清又はあるヒト細胞組織培養培地から分離によって得られる。従って、多量のインターロイキン−２を十分に産生できることは、科学的及び臨床的に非常に重要である。従って成熟したヒトインターロイキン−２の性質を持つ生成物を製造するための経済的、効果的方法が１重要な目標になる。

２、従来の技術の記載前験体を記載し、その配列を記載し、そしてプロセシングメカニズムを仮定する。１９８１年、酵母の分子生物学についてのコールトスプリングツ・−パー会議で発表された論文の要約中の、２４２ページに、のα−因子先駆物質”と題名された要約において、カージャン及びハースコウィツは、α−因子のためのコード配列及びそのような２つの配列間のスペーサーについて記載している。

ターロイキン−２のｅＤＮＡのクローニング及び組織培養におけるサルの細胞中でのその発現を報告し、オリゴヌクレオチド配列を記載し、そして推定上の前駆体及び仮定上の熟成型の両者のための推測上のア５９９０〜５９９４は、ＪＵＲＫＡＴ細胞組織培養培地から単離された熟成ヒトインターロイキン−２のＮ−ターミネータ−領域からの部分アミノ酸配列を記載新方法及びＤＮＡ構成物が、インターロイキン−２（ＩＬ２　）に類似する生物的活性を有するポリペプチド類の製造のために提供されている。ポリペプチド類の産生の増強された効率は、酵母、すなわち意図された宿主によシ優先的に利用されるコドンを使用する構造遺伝子の完全な合成によって部分的に達成される。

構造遺伝子のコドンのほとんどが酵母によって選択的に利肩されるコドンであるように、好ましくは、少なくとも約ｓｏｎ、普通少なくとも約６０チのコドンが変形される。前記構成物は、酵母のための複製系及び酵母によって認識される分泌及びプロセシングシグナルと読み枠内に連結した構造遺伝子を含んでいる。酵母宿主形質転換体は、インターロイキン−２として有用な生成物の効果的且つ経済的産生をもたらす。

図面の簡単な説明第１図は合成ＩＬ２遺伝子の５′−半分の製造において用いられる合成−末鎖ＤＮＡセグメントの組み立ての順序を例示する。

第２図は、第１図の合成りＮＡフラグメントをクローン化するために利用される設計を例示する。

第３図は、合成ＩＬ２遺伝子の３′−半分の製造において用いられる一末鎖ＤＮＡセグメントの組み立ての順序を例示する。

第４図は、第３図の合成遺伝子フラグメントをクローン化するために利用される設計を例示する。

第５図は、合成ＩＬ２遺伝子の半分２つを連結するために利用される設計を例示する。

特定の態様の記載真核微生物宿主において、哺乳類、特にヒトインターロイキン−２（ＩＬ２　）を発現することができるＤＮＡ　＃ｌ構成物与えられている。（他に示唆さ−れなく、インターロイキン−２（ＩＬ２　）のポリ４プチドに関する場合、天然に存在する哺乳類因子だけでなく、また類似した生物学的活性を示すそれらのフラグメント又は類似物も含むことが意図されている。）これらのＤＮＡフラグメントは、ベクターに組み込まれそして得られるプラスミドは、感受性の宿主を形質転換するために使用され得る。そのような組換体グラスミドによる感受性の宿主の形質転換は、ＩＬ２の発現及びＩＬ２の生理的及び免疫的活性を持つ熟成ポリペグテド生成物の産生をもたらす。すなわち、それは、認識の生物学的測定においてラット又はヒト宿主のいずれかから単離されたＩＬ２と同じ態様で作用する。

染色体外構成物は、熟成ポリペブチＰの発現のための必要因子として酵母によって認識される複製系酵母によって選択的に利用される複数のコドンを持つ合成構造遺伝子（この構造遺伝子は、酵母宿主中においてポリ４プチドの効果的分泌とプロセシングをもたらすために効果的な分泌リーダー及びプロセシングシグナルと読み枠が整合して存在する）、及びヒトインターロイキン−２に相応した生物的特に免疫及び生理的活性を持り高収率の生成物の産生を持つことを与えている。この構造物は１ｆし”−ＩＬ２の初期形成をもたらす。

熟成ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列は、効果的に認識されるプロセシングシグナルを含むリーダー配列と連結しそして読み枠に整合していることが″ ″グレ−ＩＬ２によって意味される。従うて、１ゾレ”とは酵母によって認識される分泌リーダー及びプロセシングシグナル配列（前駆体ポリ４プチド上の）を包含することを意味し、ナして、天然のヒ）ＩＬ２遺伝子に関するどのプロセシングシグナルにも関係しない。

この発明のＩＬ２構造遺伝子は、酵母の解糖系酵素をコードしている構造遺伝子のコドン頻度によシ明確なように、酵母によって好まれるコドンを用いて製造される合成りＮＡである。分泌リーダー及びプロセシングシグナルは一酵母中の天然に存在するＤＮＡ配列に由来するのが好都合でアシ、そしてこの配列は、ポリ４プチドの分泌及びプロセシングをもたらす。酵母によって自然に分泌されるそのようなペプチドは、α−因子、ａ−因子酸性フォス７アターゼ、等を包含する。複数系、プロモーター、及びターミネータ−を含む構成物中のその他の配列は、良く知られておシ、そして文献において、十分に記載されている。

この発明のＤＮＡ構成物の製造において、構造遺伝子、分泌リーダー及びプロセシングシグナル、複製系、プロモーター、及びターミネータ−を具体化するおのおののＤＮＡ配列をあらかじめ定められた順序におくことによって、得られるｆ２スミドにおいてそれらが正確に機能することができることを保証することが必要である。この発明のＤＮＡ構成物を形成するために連結される種々のＤＮＡ配列が多種多様な分離源に由来するであろうから、この発明において合成遺伝子中に組み込まれる連結分子又はアダプター分子によって配列を連結することが、ある場合において便利であシ又は必要であろう。

この発明の開発において、マルティコピイ数の酵母複製系、細菌複製系、選択のための適切なマーカー、並びにプロモーター、転写ターミネータ−１及びα−因子の分泌に関係する変形されたリーダー配列を含む先存のベクターが利用される。１９８３年８月１２日に提出された同時係属出願（番号５２２．９０９）を参照のこと。

ＩＬ２をコードしている構造遺伝子は、約ｌＯ〜４０、好ましくは１４〜３４の塩基の数の範囲の一末鎖フラグメント（これは他の７ラグメントの重複及びオーバーハングをもたらす）？：、まず与えることによって製造されその結果、連結条件下で前記フラグメントの集合に基づいて、適切な付着端を持つ二本鎖ＤＮＡが調製される。大きなサイズのＩＬ２構造遺伝子を考慮して、及び将来の可能性ちる操作において柔軟性を与えるために、５′−及び３′−フラグメントが製造されそして次に組み合され、　ＩＬ２の完全なアミノ酸配列全コードしておシそしてベクター（これは、分泌腺リーダー配列と読み枠が適合する構造遺伝子をもたらす）中の制限部位に連結のための適切な末端を与える構造遺伝子をもたらす。

前記遺伝子をコードする各７ラグメント（適切な周縁部分をもつ５′−７ラグメ／ト及び３′−７２グメント）は、フラグメントの量を増幅し、そしてその結合性を確実にする適切なベクターにクローン化されそして拡大される１１５’−７ラグメントは、転写開始のための転写調節シグナル及び分泌リーダー配列（これはプロセシングシグナルで又はまわシで都合の良い制限部位を包含する５から下流に組み込まれる。

合成フラグメントを使用することによシ前記フラグメントの末端は、次のプロセシング段階のために必要な要求を満たすため、整えることができる。５′−７ラグメントについて、その５′−末端は、読み枠を合せて分泌リーダー配列及びプロセシングシグナルに連結するために、及び分泌腺リーダー及びプロセシングシグナルをコードしているヌクレオチド配列の制限酵素処理又は他のプロセシングによって失ったすべてのヌクレオチドを償うために設計される。

従って、ベクターの制限酵素処理において、分泌リーダー及びプロセシングシグナルのためのコード領域内に存在する制限部位を選択することができる。

加えて、５′−７ラグメント及び３′−フラグメントが連結される予定である部位を越えて３′一方向に５′−７ラグメントを延長することが有用である。この方法において、５′−フラグメントの便宜上の３′−末端がベクターの５′−末端に連結するために存在する。

次に前記延長部は、制限酵素によシ除去され、３′−フラグメントの５′−末端に相補的な５′−フラグメントの３′−末端が与えられる。

同様の操作が、３′−フラグメントによシ行なわれ、ベクター及び５′−７ラグメントに連結するための、並びに転写及び翻訳の終結に関する３′−非コード部分中のヌクレオチドを供給するための適切な制限部位及び末端が与えられる。

分泌腺リーダー配列を含むベクター中に合成５／、−フラグメントをクローニングした後、新しく延長されｆｃ５′−フラグメントが切シ出される。新５′−７ラグメントは、分泌リーダー配列及びプロセシングシグナルの転写を支配する転写調節シグナルで始まる５′−末端を有し次に分泌腺リーダー配列と読み枠が整合する合成５′−７ラグメントを持っている。従って、この新７２グメントは、今や、プロモーター及び他の開運転写調節配列、たとえばＴＡＴＡボックス及びキャプイング配列、並びにα−因子の効果的転写に関与する他の配列を含んでいる。必要な転写調節機能、分泌リーダー及びプロセシングシグナル、ＩＬ２構造遺伝子の５′−末端及び３′−フラグメントの５７−末端に連結するための付着端又は平滑末端のすべてを持つ７ラグメントが適切な制限酵素を使用して得られる。

ル２の３′−半分は、クローニングのために適切なベクターに挿入される。この得られるプラスミドは、切断した場合に、３′−フラグメントの５′−末端に付着末端を生じさせるユニーク制限部位を持ち、そして下記に適切な転写ターミネーシッン配列、たとえばターミネータ−及びポリアデニル化シグナルを持っている。便利に挿入されるフラグメントＬ同じ付着末端を持っている。ＩＬ２の５７ −末端の挿入を伴わないでプラスミドが環状化するのを防ぐために、前記シラスミドは、ホスフェイターゼで処理される。

次に、工Ｌ２構造遺伝子の転写調節シグナル及び５′−末端を含むフラグメントは、細菌の形質転換のためにホスフェイターゼー処理したプラスミド中に組み込まれそして次に切断され、そして連結され、酵母宿主を効果的に形質転換し、マルティコビイし、及びＩＬ２遺伝子によってコードされたポリペプチドの効果的分泌を与え得るプラスミドをもたらす。

分泌リーダー配列に関する相同プロモーターを用いることができるが、それは、また、他のプロモーターと交換することができ、又は他のプロモーターと共にタンデムに用いることができる。

多種類のゾロモーターが利用可能であシ又は酵母遺伝子から得ることができる。

特に興味ちるプロモーターは、酸ホスフェイターゼ及び解糖経路における酵素に関するプロモーター、たとえばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロダナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、リリオーゼリン酸イソメラーゼ、ホスフォグルコイソメラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼ、等のためのゾロモーターである。調節配列、たとえばエンハンサ−。

オペレーター等と共にこれらのゾロモーターを使用しそして損われていない調節系を持つ宿主を用いる事によって、”ゾレ”−ＩＬ２の発現を調節することができ、そして種々の小有機分子、たとえばグルコースが、所望のポリペプチドの産生の調節のために使用され得る。

また温度制御系、たとえば感温感受性調節変異（これは温度を変化することによって転写の調節を可能にする）を使用できる。従りてＩＬ２のための１プレ”− ポリペプチドの発現をもたらすために温度を変える前に、非許容温度又は適当な場合には許容温度のいづれかで細胞を増殖せしめることによって、細胞を高濃度に増殖せしめることができる。

他の能力も、また、構成物に挿入することができる。たとえば、宿主に対するストレスの際に、そのストレスに応答する遺伝子のみならず周縁領域も、増幅される場合には、幾つかの遺伝子が増幅される。

プロモーター、コード部分、及び１プレ”−ポリ４プチドの転写制御をもたらす他の制御シグナルから上流にそのような遺伝子を設けそして酵母宿主をストレスすることによって、その調節配列と共に１プレ”−ポリペプチドを含む多数の反復配列を持つプラスミドを得ることができる。例示的な遺伝子にはメタロチオネイン及びジヒドロフォレイト還元酵素が含まれる。

構成物は、分泌リーダー及びプロセシングシグナル配列に加えて宿主ゲノムに相同の他のＤＮＡを含むことができる。ＩＬ２遺伝子の染色体中への組み込みが望まれるなら、宿主染色体ＤＮＡ　Ｋ相同の配列をＩＬ２遺伝子構成物の周縁に与えることによって、組み込みを高めることができる。

使用される複製系は、酵母宿主によって認識、されるだろう。従って、複製系が、酵母宿主にとって生来でちるということが望しい。メスティン、など、。

ジーン（Ｇｅｎｅ　）　（１９７９）　８　：　１７〜２４によって、多くの酵母ベクターが報告されている。２μｍプラスミド複製系を含むＹＥｐグ２スミドが特に興味のある。これらのグラスミドは、マルティコピイ数で安定して維持される。他方、又は加えて、安定した維持を与えるためにＡＲＳ　１及びＣＥＮ４の組み合せを用いることができる。

酵母宿主細胞又はスフェロプラストを使用してそして形質転換のためにＤＮＡもしくはり一ゾーム、又はカルシウム沈殿ＤＮＡもしくは他の通常の技法を用いて、便利な手段によってプラスミドを酵母宿主中に挿入することができる。変性された宿主は、発現シラスミドを構成するために使用されたベクター中に、普通もたらされ冬遺伝的マーカーに従って選択され得る。栄養要求性宿主を使用することができ、この場合、プラスミドは、宿主を補完し、そして原栄養性をもたらす遺伝子を持つ。他方、適切な殺生物剤たとえば抗生物質、重金属、毒素又は同様の物に対する抵抗を、プラスミド中にマーカーとして含まれ得る。次に、親細胞をストレスしその結果プラスミドを含む細胞を選択するような栄養培地を使用することによって選択を達成することができる。次に、シラスミド含有性細胞は、適切な栄養培地中で増殖せしめ、そして所望の分泌ポリペプチドを通常の技法によって単離することができる。このポリペプチドは、クロマトグラフィ、−過、抽出、等によって精製され得る。このポリペプチドは、栄養培地中で熟成した形態で存在するであろうから、連続して所望のポリペプチドを取シ出しながら、栄養培地を循環することができる。

次の例は限定的でなく例示的に提供される。

実験優先的に利用される酵母コドンを含有するインターロイキン−２のためのヌクレオチド配列を、工夫した。この配列は、その５′−末端に、修飾された五−因子分泌リーダー及びプロセシングシグナルの部分を含んでいた。３つのｇｌｕ−ｇｌｕ対を欠失しそして塩基対を、分泌線リーダー配列の内部で変化させ、Ｋｐｎ　［部位を生じさせそしてｍａｒからｇｉｎにコドンを変えた。５′から３′を示すコード鎖の配列は次のようであった：この配列は５′−末端ＫＫｐｎＩ付着端及び３′−末端ＫＳａｌｌ付着端を付与されている。熟成の？リペプチドのためのコード配列は、ゾロ七シング部位の後始まる。

上記の配列を持つインターロイキン−２のための合成りＮＡフラグメントを、別々に２つの半フラグメントを合成し及びクローニングすることによって製造した。ビシケイノそしてカーウサー。

Ｔｅｔｒａｈａｄｒｏｎ　Ｌａｔｔ、　（１９８１）　２２　：　１８５９〜１８６２によって記載されてｈるように、ホスホラミジテ法を用い、部分的に重なる一末鎖ＤＮＡセグメントを合成することによって、おのおのの半フラグメントを製造した。この−末鎖ＤＮＡセグメントは次のようでちった：特表昭６１−５００５８６　（６）名称　配列（５′から３′）リンカ−ＡＧＣＴＧＧＡＴ　ＡＡＡＡＧＡＩＩ、２−Ｉ　ＧＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＩＬ２−４　ＡＧＡＡＣＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＣＣＡＣＡＡＴＧＴＴＧＡＣＣＴＴＣＩＬ２−５　ＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＴＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＴＡＣＣＧＡＡＴＴＩＬ２−６　ＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＴＴＧＩＬ２−７　ＡＡＧＣＣＡＴＴＧＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＧＧＣＴＣＡＡＴＩＬ２− ８　ＣＴＡＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＣＴＴＩＬ２ −９　ＧＡＴＣＴＣＴＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＴＡＴＣＧＴＴＴＴＧＧＡＡＴＩＬ２−１０　ＴＧＡＡＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＴＧＴＧＡＡＩＬ２−１１　ＴＡＣＣ，ＣＴＧＡＣＧＡＡＡＣＣＣ；ＣＴＡＣＣＡＴＣＧＴＴＧＡＡＴＩＬ２−１２　ＴＣＴＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＴＣＡＡＴＣＩＬ２−１３　ＴＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＴＧＡＣＣＴＧＡＴＡＧＧＣＧＴＣＧＩＬ２−１４　ＧＡＡＧＡＧＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＩｎ、２−１５　ＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＡＧＡＧＩＬ２−１６　ＧＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＩＬ２−１７　ＧＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＧＴＴＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＩＬ２−１８　ＴＴＧＧＣＡＴＧＴＡＧＡＡＣＴＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＣＡＴＴＣＴＧＩＬ２−１９　ＡＣＡＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＣＧＧＴＡＧＣＣＴＴＣＴ［，２−２０ＴＴＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣ；ＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＧＩＬ２−２０ ’　ＴＣＧＡＣＡＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＧ！Ｌ２−２１　ＡＧＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＴＡＧＡＴＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＧＧＡＣＩＬ２−２２　ＧＴＴＧＡＴＧＴＴＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＡＩＬ２−２３　ＧＴＴＴＣＡＱＡＡＣＣＣＴＴＣＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＣＩＬ２− ２４　ＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＡＣＡＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＩＬ２−２５　ＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＣＧＡＴＧＧＴＡＧＣＩＬ２−２６　ＡＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＣ；ＡＴＡＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＩＬ２−２７　ＴＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＴＡＴＣＡＧＧＴにの配列の５′ −半分は、第１図に例示されているように組み立てられた。おのおのの−末鎖ＤＮＡセグルを、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、５′−リン酸化した。次に、このセグメントを、混合しそして９５℃から２５℃に１．５時間にわたって冷却することによって一段階でアニーリングした。１ｍＭのＡＴＰ’、１０ｍＭのＤＴＴ、１００ｍＭのｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　、　ｐＨ７，８，１０ｍＭの塩化マグネシウム、１μφｌのスイルミノン及びＴ４リグーゼを含む３０μｊの反応体積中で、その連結を実施した。得られる二本鎖７ラグメントを７％の天然Ｉリアクリルアミド電気泳動グル上で精製した。この二本鎖ＤＮＡフラグメントは、端を含んだ。

集成の後、前記配列の５′−半分を、ｐαＥＧＦ　−２４中に、修飾されたα− 因子分泌リーダー及びプロセシングシグナルと相が合うようにその下流に挿入した。シラスミドｐαＥＧＦ　−２４は、１９８３年８月１２日に提出された出願番号５２２，９０９に記載されておシ、適切な部分は、引用によシこの明細書中に組み入れそして適切な部分において、次の通りに再生される。

シ、ナルジャーナルオブベデチドアンドプロテインリサーチ（Ｉｎｔａｒｎａｔｔｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａ　ｔｉｄｅａｎｄ　Ｅ’ｒｏｔｅｔｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　］によって報告され九ＥＧＦのアミノ酸配列を基礎にしてヒト表皮成長因子（ＥＧＦ　）のだめの合成配列を製造した。この配列を、ｐＢＲ３２８のＥｅｏ　Ｒ１部位に挿入し、プラスミドｐ３２８ＥＧＦ−１を生成せしめそしてクローン化を行なったＯる消化を行った。次に２つの合成オリゴヌクレオチ前記Ｈｇａ　Ｉ　−Ｋｉｎ　ｄＩＩＩリンカ−は次の配列を持った：ＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＧＡＴＴＧＡＧこのリンカ−は、Ｈｉｎ　ｄＩＩＩによって中断されたα−因子プロセシングシグナルを修復しそしてＥＧＦ遺伝子の５′−末端のＨｇａ　ｌ末端をｐＡＢ　１１２のＨｉｎ　ｄ　Ｉ［末端に連結する。

Ｈｇａ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉリンカ−は、次の配列を持りた：ＴＧＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧＡＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴこのリンカ−は、２つの終止コドンを持ちそしてＥＧＦ遺伝子の３′−末端の四 μＩ末端をｐＡＢ　１１２のシ±Ｉ末端に肋μ■末端を連結する。

得られる１８１塩基対フラグメントを、調製用ｒルミ気泳動によって精製し、そして酵素Ｈ４ｎ　ｄＩエエ及びＳａｔ　Ｉによシ前もって完全に消化された１００μｙのｐＡＢ　１１２に連結した。驚いたことには、１１：：ＧＦの３番目及び４番目のアミン配列のためのコドン、　ａｓｐ及びｍａｒが欠失し、残りのＥＧＦのコドンは保持されているような欠失が生じた。

Ｒ１部位にクローンした酵母α−因子遺伝子を持つ１、７５　ｋｂのＥｅｏＲＩフラグメントを含むシラスミドて酵母α−因子遺伝子を含むプラスミドｐＡＢ　１０１から由来した。（１９８１年、酵母の分子生物学についてのコールドスプリングハーバ−会合で、カアージャン及びハースコウィッによって要約の２４２ページに公表された）α−因子コード部分に相同の合成の２０−ｍａｒオリゴヌクレオチドグローブ（３’−ＧＧＣＣＧＧＴＴＧＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴＯ−５ ’）を用いて、ＹＥｐ２４中の酵母ゲノムライブラリィをスクリーンすることによりてｐＡＢ　１０１を得た。

得られる混合物を使用し、Ｅ、コライ（Ｅ、ｃｏｌｉ　）ＨＢＩＯｌを形質転換しそしてプラスミドｐＡＢ　２０１を得た。シラスミドｐＡＢ　２０１　（５μ ｇ）を、酵素ＥｅｏＲＩによシ完全消化しそして、得られる７ラグメントを二ａ）　ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントを用いて満たし；ｂ）過剰のＢａｍＨＩリンカ−に連結し；そしてｃ）　ＢａｍＨＩによシ消化した。１．７５　ＫｂｐのＥｅｏＲＩフラグメントを、調製用グル電気泳動によって単離し、そしてこのフラグメントの約１００　ｎ９を、１００　ｎ、９のｐｃ１７／１　（制限酵素シ、ｍ　Ｈｌにょシあらかじめ完全消化されそしてアルカリ性ホスフェターゼで処理されている）に連結した。

シラスミドｐｃｔ／１はｐＪＤＢ２１９の誘導体であり〔ペッグ、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ　）（１９７８）　２７５　：１０４）、この場合ｐＪＤＢ２１９における細菌性グラスミドｐＭＢ　９に対応する部分が、ｐｃｔ／１においては、ｐＢＲ３２２によって取シ換えられている。この混合物を用い、Ｌ−二重Δ ＨＢ　１０１細胞を形質転換した。形質転換体を、アンピシリン耐性によって選択しそしてそれらのプラスミドを、制限エンドヌクレオチドによって分析した。

１つの選択されたクローン（ＰＹＥＧＦ　−８）からのＤＮＡを調製し、そして酵母ＡＢ１０３細胞を形質転換するために用いた。形質転換体を、それらのｌｅｕ＋表現型によって選択した。

上記の構成物は、構造遺伝子を且−因子分泌リーダー配列に連結するための異なった配列及び／又は部位特異の変異誘発を用いて修飾され、従って異なっタプロセシングシグナルを与えた。

次の表において、ａ、からｅ、は、構造遺伝子ｈＥＧＦ（例示として、配列がいくつかの構成法の間で異なる）のＮ−末端領域での融合配列を示している。

ｆ、は、すべての構成物について同じであるｈＥＧＦのＣ−末端領域での配列を示している。これらの構成物に用いられる合成オリゴヌクレオチドリンカーは箱に図まれている。

これらの融合を、次のようにして行なった。構成物（、）を上記のようにして製造した。リンカ−２を、リンカ−１０代りに用いた他は、同様の方法で構成物（ｂ）を製造した。リンカ−２は、ｈＥＧＦ遺伝子のすぐ前に追加のプロセシング部位（ａ＠ｒ−Ｌｅｕ−ａｓｐ−１ｙｓ−ａｒｙ　）を挿入することによって圧 −因子プロセシングシグナルを修飾する。得られる酵母プラスミドはｐｙαＥＧＦ−２２と命名される。構成物（Ｃ）（この場合、）６．６チドアミノベプチダ一ゼ熟成部位（ｇｌｕ−ａｌａ　）１３にクーロン化しそして一本鎖型で単離した。

３１−ｍａｒの合成配列、５′−τテ℃λ　−３′を合成し、そしてＤＮＡポリマラーゼのクレノーフラグメントによって上の鋳型の１ｐモルからの第２鎖合成するために、プライマーとして７０Ｐモルを用いた。フィルイン及び連結が１４ ℃で１８時間行なわれた後、この混合物を、Ｓ、ヌクレアーゼで処理し細胞をトランスフェクトするために用いた。（ｇｌｕ−ａｌｍ　）のためのコード領域が除かれたＤＮＡ配列を含むバクテリオファージをプロープトシて３２Ｐ−、ベルされたプライマーを用いるフィルターシラ＝クハイプリダイゼーション法により位置決定した。陽性グラークからのＲＦ　ＤＮＡを単離し、Ｐｓｔ　■及びシｔｌ　Ｉによシ消化しそして事前にＳａｌ　Ｉ及び一部Ｐｓｔ　Ｉにより完全消化し、そしてアルカリ性フォスファターゼにより処理したｐＡＢ　１１４に、得られるフラグメントを挿入した。

シラスミドｐＡＢ　１１４を、次のようにして誘導したニブラスミドｐＡＢ　１１２をＨｉｎ　ｄ、ｉによシ完全消化しそして次に低ＤＮＡ濃度（４μＶｍｌ　 ’）で再連結しそしてプラスミドｐＡＢ　１１３を得た。このグラスミドにおいては熟成１−因子コード部分の１つのコピーだけを残して、五−因子構造遺伝子から３つの６３ｂｐ　ｆ）　Ｈｉｎ　ｄＩＨ７ラグメンが欠失している。Ｅｅｏ　Ｒ１によシ切断し、ＤＮＡ／リマラーゼのクレノーフラグメントによってオーパハンギング末端をフィル−インし、ＢａｍＨｌす／カーを連結し、シ、ｍ）ＩＳにより切断することによｊ）　Ｂａｍ　ＨＩをＰＡＢ　ｉ　１に付加し、そして再連結することによってｐＡＢ　１２を得た。プラスミドｐＡＢ　１３を、Ｅｃｏ　ＲＩにより消化し、オーＨＩリンカ−に連結した。シ二ＨＩによる消化の後、１５００　ｂｐの７ラグメントをグルー精製しそしてＢａｍ　ＨＩにより消化し、そしてアルカリ性フォスファターゼによシ処理されているｐＡＢ　１２に連結した。

五−因子遺伝子を担持する１　５００　ｂｐのシュＨＩ７ラグメントを含むプラスミドｐＡＢ　１１４を得た。次にこの得られるプラスミド（上記の構成物を含むｐＡＢ　１１４　）をシニＨＩによシ消化しそしてプラスミドｐｃ１／’１中に連結する。

この得られる酵母プラスミドをｐＹαＥＧＦ−２３と命名する。構成物（ｄ）（この場合、新Ｋｐｎ　Ｉ部位が生じた）は、構成物（ｃ）のために記載されたようにして製造されたが、但し、３６−ｍａｒのオリゴヌクレオチドプライマーの配列５′−一３′を用いた。この得られる酵母プラスミドをｐｙαＥＧＦ　−２４と命名する。リンカ−１及び２の代シにＫｐｎ　Ｉ及びシＬＩ　Ｉによる構成物（ｄ）を含むシラスミドの消化によって、構成物（、）を誘導した。

ＩＬ２配列の５′半分を、第２図に例示されている設置及び且１工の混合物によシブラスミドｐαＥＧＦ　−２４を制限処理し、Ｋｐｎ　Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉフラグメントを取り除いた。ＩＬ２０５′−合成フラグメントを、前記で得られる切断されたベクターに挿入し、グラスミドｐαＩＬ２−５’を調製し次にこれをにコライＨＢＩＯＩにクローン化した。

この配列の３′−半分を、第３図に例示されているように組み立てた。おのおのの−重鎖ＤＮＡの５０Ｐモル（ＩＬ２−６及びＩＬ２−２７を除く）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５′−リン酸化した。次にこのセグメントを混合しそして１．５時間にわたって９５℃から２５℃に冷却することによって一段階でアニーリングした。１ｍＭのＡＴＰ　、　１０　ｒｎＭのＤ’ｒＴ　。

１００ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｔ、　ｐＨ７，８、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１μｇ／ｍｌのスペルミシン及びＴ４リグーゼを含む３０μｌの反応体積中で連結を実施した。得られる二本鎖フラグメントを、７チの天然ポリアクリルアミド電気泳動グル上で精製した。この二本鎖フラグメントは、５′−末端にＸｂａ　Ｉ付着末端及び３′−末端にＳａｌ　Ｉ付着末端を含んだ。

集成の後、この配列の３′−半分をＸｂａ　Ｉ　／　Ｓａ上Ｉ消化ｐＡＢ　１１４に挿入した。シラスミドｐＡＢ　１１４（上で一部再現された）は出願番号５２２，９０９に記載されている。

この配列の３′−半分を、第４図に例示された図に従ってクローン化した。制限エンドヌクレアーゼＸｂａ　Ｉ及びＳａｌ　Ｉの混合物により、プラスミドｐＡＢ□　−〒１１４を、制限処理し、五二Ｉ／シｔｌ　Ｉを取り除いた。３′−合成フラグメントを、この得られる切断されたベクターに挿入し、ｐαＩＬ２−３’を調製し次に、こｔＬｔ−Ｅ、＝ｆｆ！ＡＨＢ１０１にクローン化した。

増幅の後、酵母分泌及びｆ″′′ロセシングシグナルが合うように、並びに酵母転写調節シグナルに５′−末端で連結するように、合成ＩＬ２配列の半分２つを、第５図に例示されている設計に従ってｐαＩＬ２−３′シラスミドに連結した。プラスミドｐαＩＬ２−５’を、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩによシ制限処理し、α−因子転写調節配列及びグラスミドｐαＥＧＦ　−２４及びＩＬ２配列の５′−半分から由来した変性分泌リーダー及びプロセシングシグナルを担持するＸｂａ　Ｉ　／Ｘｂａ　Ｉフラグメントを生成せしめた。５′−セグメントにおいて、３′に最りとも近いＸｂａ　Ｉ部位は、合成配列の内部に位置し、その結果３′−末端と１５ｂｐのセグメントが取り出される。グラスミドｐαＩＬ２−３’をまたＸｂａ　Ｉにより制限処理しそしてアルカリ性ホスファターゼによシ処理し、再環状化を妨いだ。次にｐαＩＬ２−５’からのと止エフラグメントを、ｐαＩＬ２−３’上のＸｂａ　Ｉ部位に挿入し、正しい方向性に適合した２つの７ラグメントを持つグラスミドＰαＩＬ２を形成した。後者は、グラスミドｐαＩＬ２がＥ、コライＨＢＩＯＩ中にクローンされた後、制限分析によって決定された。

次に、シラスミドｐαＩＬ２をＲａｍ　ＨＩにより完全消化しそしてＩＬ２構成物を担持する得られたフラグメントを調製用グル電気泳動によって単離した。前もって、ＢａｍＨＩによシ完全消化されそしてアルカリ性フォスファターゼにより処理されたｐｃｔ／１のＢａｍＨＩ部位に、前記フラグメント約１０　Ｏｎ、ｊ９を挿入した。この得られるプラスミドは、ｐＹαＩＬ−２／’３．６及びｐｙαＩＬ−２／１８．７と命名され、挿入された配列の逆の方向を代表する。プラスミドｐｃｔ７’ｔは上で記載された。

酵母菌株ＡＢ１０３（遺伝子型：　ＭＡＴαａ　ｐｅｐ４−３　＋　ｌｅｕ　２ −３　ｒ　ｌｅｕ　２−１１２　ｒ　ｕｒａ　３−５２　＊　ｈｉｓと１凹）の１１培養菌を、プラスミドｐｙαＩＩ、−２／’３．６かｐｙαＩＬ−２／１８．７のいづれかにより形質転換した。この培養菌を１ｅｕ−培地中に一晩、３０ ℃で増殖し飽和させ（６００ｒｒｎで５の光学濃度）そして３０℃でさらに１２時間振盪しながら維持した。次に、細胞を遠心分離により除きそして上清培地をｐＨ７，３の１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳに対して５℃で一晩、透析した。

１０％子牛の胞子血清により補充されたＬ−グルタミン（３００μｇ／ｍｌ　’ ）　、　２−メルカプトエタノール及び抗生物質（５０Ｕｌｗｒｌのペニシリン、５０μｇ、Ａｔのストレプトマイシン）を含むＲＰＭＩ−１６４０哺乳類細胞増殖培地ウェル当シ１００μｌ中に２　Ｘ　１０’ＨＴ−２細胞を有するミクロタイターティッシュ（９６−ウェル）を用意した。ＨＴ−２細胞は、ネズミＴリンノぐ球のＨＴＬ　−１系のサブクローンであり〔ワトソン。

Ｌ旦０：８４９及び１５１０に記載された〕、生存性及び／又は増殖性について、インターロイキン−２の存在に依存する。これらのネズミ細胞はヒト物質に反応するので、それらの使用は、ヒトインターロイキン−２のだめの生物学的測定を提供する。顕微鏡を使用し細胞の生存性及び増殖性を視覚的に測定しセしてＩＬ２の既知量を用いる標準とテスト結果を比較することによって半定量測定を行なった。

次に、上の酵母培地透析物を哨乳類細胞の増殖培地（上記のように補足物を含むＲＰＭＩ−１６４０）中で、逐次的に２倍に希釈しそしてＨＴ−２細胞を含む個々のウェルにおのおのの希釈したサンプルの１００μｌを添加した。

インターロイキン−２を含んでいると知られている対照標準（コンカナバリンＡ −不含の調整されたラット牌細胞培地）は、商業的に（モノクローン。

コラボラティプリサーチ、　Ｉｎｃ　）又は７％ＣＯ□／空気中で３７℃で４８時間コンカナバリンＡ（１μＶ１０６細胞）によりラット牌臓細胞培養（上記のように補足物を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中において）の刺激により、次に培地の回収、コンカナバリンＡを除くために５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５による吸収、及びｆ紙殺菌によるいづれかによって提供された。おのおのの対照標準の２倍希釈系列は酵母培地透析物のために・　記載されているようにして製造された。

ＨＴ−２細胞ミクログレート培養物を、７チｃｏ２／空気中において３７℃で４８時間培養し、生存性及び／又は増殖性について評価し、そして酵母の調製物のおおよそのインターロイキン−２含有を、標準と対照することによって定量した。この比較は、市販物質と同等か又は大きな活性を印した、すなわち２０〜１００　ｎｇ／ｍｌの範囲、たぶん約５０　ｎｊｉｌｍｌであることを測定した。

この発明に従って、“プレ″−インターロイキン−２の発現をもたらすためにベクター中に挿入でき得る新ＤＮＡを与えそして熟成ポリペプチドの細胞内プロセシング及び分泌をもたらし、ネズミの細胞増殖に基づく認知の生物学的検定において高いＩＬ２の生物的活性を持つポリペプチド生成物を高収率で増進できる。

従って、天然に存在するヒトインターロイキン−２の生理的活性を持つポリペプチドを得ることが可能である。分泌を与えることによって、ひじょうに高収量を得ることができそして、次にこのポリペプチドの単離及び精製を簡単にし得る。

この発明は、明確に理解するために例示及び例で詳細に記載されているけれども、ある変更及び修飾が、付属フレイムの範囲内で実施され得ることは、明確である。

浄書（内容に変更なし）手続補正＠（方式）昭和６１年１月２ノ日特許庁長官　宇　實　道　部　殿１　事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ　８４１０　ｌ　８５３２　発明の名称インターロイキン−２産生のための方法及び組成物３　補正をする者事件との関係　特許出願人名称　チロン　コーポレイション４代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５　補正命令の日付昭和６０年１２月２４日（発送日）６　補正の対象・＜１１　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「発明の名称」の欄（２）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」の欄（３）願書の翻訳文のｒ（０発明の名称」の樹（４）明細書の翻訳文第１頁の「発明の名称」の（資）（５）図面の翻訳文（６）委任状７　補正の内容（１１＋２１　ｆ３＋　＋４１　＋６１　別紙の通り（５）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８　添付書類の目録（２１ＶＪＭ　ＩＦ　（７）翻訳文　１ｉ［！１（３）　明細書の翻訳文第１頁　１ｉＮｌ（４）図面の翻訳文　１通（５）委任状及びその翻訳文　各１通国際調査報告１＋＋ｗｍ−引−−＾８ｄｅ＆１ｍｎ　Ｎａ、　？（ｐｐ　／（Ｉ　ＳＲ４１０１８へ１に＋ｔａｎｍｍ＠ＩＡ＠＠６−４　ＰＣＴ／ＩＪＳ８４１０１８５３

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトＩＬ２の生物的活性を有し、生物学的に活性のポリペプチドを高収率で産生するための方法であって、転写の方向に、酵母に認識される転写調節配列及び分泌リーダー及びプロセシングシグナル，前記分泌リーダー及びプロセシングシグナルと相が合うようなヒトＩＬ２ポリペプチド配列について少なくとも実質的にコードしている合成遺伝子，終止コドン，及びターミネーターを含有するＤＮＡ構成物を含むマルティコピイの染色体外要素を有する酵母形質転換体を増殖させ、それによって、ヒトＩＬ２と少なくとも実質的に同じアミノ酸配列の熟成ポリペプチドが分泌され；そしてヒトＩＬ２の生物的活性を有する培地から前記熟成ポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
２．前記合成配列のコード鎖が次のヌクレオチド配列：【配列があります】を持つことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
３．前記分泌腺リーダー及びプロセシングシグナルがα−因子から由来することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
４．前記α−因子の分泌腺リーダー及びプロセシングシグナルを少なくともｇｌｕ−ａｌａジペプチドコドンの除去によって修飾することを特徴とする請求の範囲第３項に記載の方法。
５．前記ＤＮＡ配列が、他の配列に連結するために周縁部分を有する複数の二本鎖ＤＮＡフラグメント（これは完全な配列を形成するために共に連結されている）を調製することによって合成されることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の方法。
６．転写の方向に、酵母に認識される転写調節シグナル及び分泌リーダー配列及びプロセシングシグナル；前記分泌リーダー及びプロセシングシグナルと読み枠に整合していて、酵母によって優先的に利用される少なくとも複数のコドンを持つヒトＩＬ２遺伝子のためにコードしている合成ＤＮＡ配列；終止コドン；及び転写ターミネーターを含有するＤＮＡ構成物。
７．前記ＤＮＡ配列が次のような配列：【配列があります】であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ構成物。
８．前記分泌リーダー及びプロセシングシグナルがα−因子の分泌リーダー及びプロセシングシグナルから由来することを特徴とする請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ構成物。
９．前記α−因子の分泌リーダー及びプロセシングシグナルを少なくともｇｌｕ −ａｌａジペプチドコドンの除去によって修飾することを特徴とする請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ構成物。