KR100342448B1

KR100342448B1 - 돌연변이체aox2프로모터,이를보유한벡터,형질전환체,및이종단백질의제조방법

Info

Publication number: KR100342448B1
Application number: KR1019940018340A
Authority: KR
Inventors: 오오이히데유끼; 미우라마사미; 히라마쓰류지; 오오무라다까오
Original assignee: 미츠비시 파마 코포레이션
Priority date: 1993-07-27
Filing date: 1994-07-27
Publication date: 2002-11-18
Also published as: DE69433222D1; EP0639643B1; ES2206462T3; KR950003446A; JP3505743B2; CA2128794A1; DK0639643T3; US5707827A; EP0639643A3; EP0639643A2; DE69433222T2; CA2128794C; JPH0731481A

Abstract

야생형 AOX2 프로모터의 부분 DNA 단편의 5' 말단에 1 내지 3 개의 올리고뉴클레오티드(들) GATAGGCTATTTTTGTCGCATAAAT 가 정방향, 역방향, 또는 정방향 및 역방향으로 첨가된 돌연변이체 AOX2 프로모터, 이 프로모터를 보유한 벡터, 이 벡터가 도입된 형질 전환체 및 이 형질 전환체를 배양하는 것으로 구성된 이종단백질의 제조방법이 개시되어있다. 본 발명의 돌연변이체 AOX2 프로모터는 야생형 AOX2 프로모터에 비해 현저히 향상된 프로모터 활성을 가지고 있다. 따라서 본 발명의 프로모터는 이종 단백질을 발현할 수 있는 벡터의 의해 보유되는 프로모터로서 매우 유용하다. 본 발명의 백터는 숙주내에서 각종 유용한 이종 단백질을 효율적으로 발현하고 생산할 수 있다.

Description

돌연변이체 AOX2 프로모터, 이를 보유한 벡터, 형질 전환체, 및 이종 단백질의 제조방법

본 발명은, 이종 단백질 유전자를 발현시키기 위해 바람직하게 사용되는 돌연변이체 AOX2 프로모터, 상기 프로모터를 보유한 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환체, 및 상기 형질 전환체의 배양으로 이루어진 이종 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

유전자 공학 분야에서, 유전자의 발현을 중가시키고 목적하는 단백질의 수율을 중가시키기 위한 노력으로 유전자 발현 체계의 다양한 개량 및 발전을 시도해 왔다. 숙주로서 메틸로트로픽 효모를 사용하는 발현 체계가 이종 단백질 유전자의 발현 체계로서 많은 관심을 끌어왔다.

메틸로트로픽 효모는 메탄올을 유일한 탄소 및 에너지 원으로서 이용하여 생육할 수 있다. 그 메카니즘은, 이 효모가 메탄올의 대사에서의 첫 번째 반응, 즉 메탄올의 포름알데히드로의 산화 반응에 촉매작용을 하는 효소인 알콜 산화효소 (EC 1. 1. 3, B, 이하 AOX 라고도 한다) 를 코딩하는 유전자를 갖고 있다는 사실에 기인한다.

피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 는 메틸로트로픽 효모의 하나이며, 2 종류의 AOX 유전자, 즉 AOX1 유전자 및 AOX2 유전자를 가지고 있다. 이들 유전자는 각각 5' 말단 비 - 번역 영역에 특유한 프로모터 (AOXI 프로모터 및 AOX2 프로모터) 를 가지고 있음이 알려져 있다. AOX2 프로모터의 전사 활성은 강한 전사활성을 갖는 AOX1 프로모터에 비해 극히 빈약하며, 실제로 발현되고 생산되는 AOX 는 대부분 AOX1 유전자에서 유래된다[Molecular and Cellular Biology, Vol. 9, 1316 (1989)].

종래, 피키아 (Pichia) 효모를 사용하여 이종 단백질을 생산하기 위해서는 강한 전사 활성을 갖는 AOX1 프로모터가 사용되어 왔다. 최근들어, AOX 유전자의조절 영역을 사용함으로써 이종 단백질을 생산하는 방법이 연구되고 있다. [Yeast, 5, 167 - 177 (1989), 유럽 특허 공개 제 344459 호 및 유럽 특허 공개 제 347928 호]. 이종 단백질의 발현을 증가시키기 위해서 강력한 전사 활성을 갖는 프로모터가 여전히 요망되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은, 이종 단백질의 대규모 생산을 위해 유용한 프로모터, 상기 프로모터를 보유한 벡터, 및 상기 벡터가 도입된 형질 전환체를 제공하는데 있다. 또한, 본 발명은 상기 형질 전환체의 배양으로 이루어진 이종 단백질의 제조 방법을 확립하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들의 집중적인 연구 결과, 야생형 AOX2 프로모터의 부분 DNA 단편의 상류쪽에 특정한 뉴클레오티드 서열을 가진 뉴클레오티드 서열 (들)을 삽입함으로써 수득되는 DNA 단편을 프로모터로 사용하면, 특정 영역의 하류에 위치한 이종 단백질 유전자를 효율적으로 형질 발현시킬 수 있음을 알아내었으며, 이를 근거로 하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따르면, 서열목록에서 뉴클레오티드 서열 번호 1을 갖는 야생형 AOX2 프로모터의 부분 DNA 단편내에 서열이 GATAGGCTATTTTTGTCGCATAAAT [서열목록, 서열번호 2, 이하 올리고뉴클레오티드 (I) 이라 한다] 인 1 내지 3 개의 올리고뉴클레오티드 서열을 그의 5' 말단에 정 및/또는 역 방향으로 첨가함으로써 수득되는 뉴클레오티드 서열을 지닌 돌연변이체 AOX2 프로모터가 제공된다.

또한, 본 발명은 상기 돌연변이체 AOX2 프로모터를 보유한 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질 전환체, 및 상기 형질 전환체를 배양시키는 것을 포함한 이종 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명이 완성되었을때, 본 발명자들은 먼저 야생형 AOX2 프로모터의 기능을 분석하였다. 그 결과, 프로모터 전사활성 향상 부위 (이하, UAS 영역이라 한다), 2개의 활성 억제 부위 (이하, URS 1 영역 및 URS 2 영역이라 한다) 및 TATA 영역의 위치를 알아내었다. 본 발명에 있어서, URS 1 영역이란 야생형 AOX2 프로모터 (서열 목록, 서열번호 1) 의 뉴클레오티드 845 - 960 을 말하고, UAS 영역이란 그의 뉴클레오티드 1192 ~ 1216 을 말하며, URS 2 영역이란 그의 뉴클레오티드 1274 - 1314 를 말하고, TATA 영역은 뉴클레오티드 1325 - 1330 을 말한다.

다른 특정한 언급이 없는 한, 뉴클레오티드 번호는 야생형 AOX2 프로모터 뉴클레오티드 (서열목록, 서열번호 1) 를 위해 사용된 것을 언급 하는 것이다.

본 발명에 있어서, 야생형 AOX2 프로모터의 부분 DNA 단편은 야생형 AOX2 프로모터의 특정영역이 결실된 DNA 단편을 말하는 것이며 다음을 포함한다.

(1) 야생형 AOX2 프로모터의 URS 1 영역 (뉴클레오티드 845 ~ 960) 으로부터 상류 영역이 결실된 DNA 단편 (이하, 부분 DNA 단편 1이라 한다. URS 1 영역, UAS 영역, URS 2 영역 및 TATA 영역 포함).

즉, 이 단편은 뉴클레오티드 845 로부터 상류쪽 영역의 전부 또는 일부가 결실되어 있다. 이로부터 결실된 영역은 URS 1 영역으로 부터 상류쪽에 위치하는 한 특별히 제한되지 않는다. 이러한 DNA 단편은 단지 뉴클레오티드 서열 845 ~ 1528 을 적어도 갖는 것이 필요하다.

(2) 야생형 AOX2 프로모터의 URS1 영역을 포함하며 UAS 영역 (뉴클레오티드1192 ~ 1216) 으로 부터 상류쪽의 영역이 결실된 DNA 단편 (이하, 부분 DNA 단편 2 라고 한다. UAS 영역, URS 2 영역 및 TATA 영역 포함). 즉, 이 단편은 뉴클레오티드 1192 로부터 상류쪽 영역의 전부 또는 일부가 결실되어 있다. 이로부터 결실된 영역은 UAS 영역으로부터 상류쪽에 위치하고 URS1 영역을 포함하는 한 특별히 제한되지 않는다. 이러한 DNA 단편은 단지 뉴클레오티드 서열 1192 ~ 1528 을 적어도 갖는 것이 필요하다.

(3) 야생형 AOX2 프로모터의 URS1 영역 및 UAS 영역을 포함하여 URS 2 영역 (뉴클레오티드 1274 ~ 1314) 으로부터 상류쪽에 위치한 영역이 결실된 DNA 단편 (이하, 부분DNA 단편 3 이라 한다. URS 2 영역 및 TATA 영역 포함)

즉, 이 단편은 뉴클레오티드 1274 로부터 상류쪽의 영역의 전부 또는 일부가 결실되어 있다. 이로 부터 결실된 영역은 URS 2 영역으로부터 상류쪽에 위치하고 URS 1 영역 및 UAS 영역을 포함하는 한 제한되지 않는다. 이러한 DNA 단편은 단지 적어도 뉴클레오티드 서열 1274 ~ 1528 을 필요로 한다.

(4) 야생형 AOX2 프로모터의 URS1 영역, UAS 영역 및 URS 영역을 포함하여 TATA 영역 (뉴클레오티드 1325 ~ 1330) 으로부터 상류쪽에 위치한 영역이 결실된 DNA 단편 (이하, 부분 DNA 단편 4 라고 한다. TATA 영역 포함)

즉, 이 단편은 뉴클레오티드 1325 로부터 상류쪽의 영역의 전부 또는 일부가 결실되어 있다. 이로부터 결실된 영역은 TATA 영역으로부터 상류쪽에 위치하고 URS1 영역, UAS 영역 및 URS2 영역을 포함하는 한 제한되지 않는다. 이러한 DNA 단편은 단지 적어도 뉴클레오티드 서열 1325 ~ 1528 을 갖는 것이 필요하다.

본 발명에서 언급되는 부분 DNA 단편은 부분적으로 치환, 결실 또는 부가된 야생형 AOX2 프로모터로 부터 유래되는 뉴클레오티드 서열일 수도 있다. 치환, 결실 및 부가 부위뿐만 아니라 그들의 발생은 제한되지 않으며, 이러한 돌연변이는 URS1 영역, UAS 영역, URS2 영역 또는 기타 영역에서 일어날 수도 있다.

전형적인 돌연변이로서는 다음의 것이 주어진다.

A. URS2 영역내의 뉴클레오티드 서열의 일부 (들) 가 치환된다 :

치환부위는 URS2 영역에 존재하는 한 제한되지 않는다. 이 영역에서, 하나이상의 뉴클레오티드가 치환될 수도 있고 치환부위는 하나 이상일 수도 있다. 구체적으로, 1274 번째 티민 (T) 이 시토신 (C) 으로 치환된 DNA 단편이 예시된다.

B. 새로운 올리고뉴클레오티드 (들) 를 URS 2 영역에 부가한다 :

부가 부위는 URS2 영역에 존재하는 한 제한되지 않는다. 이 영역에서, 임의의 수의 뉴클레오티드가 부가될 수도 있고 부가 부위는 하나 이상일 수도 있다. 구체적으로는, 1296 ~ 1314 뉴클레오티드에 상응하는 19 bp 올리고뉴클레오티드 (서열목록, 서열번호 3) 가 1314 번째와 1315 번째 뉴클레오티드 사이에 중복 삽입된 DNA 단편이 예시된다.

C. UAS 영역내의 뉴클레오티드 서열의 일부(들) 가 치환된다 :

치환부위는 UAS 영역내에 존재하는 한 제한되지 않는다. 이 영역에서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환될 수 있고, 치환 부위는 하나 이상일 수도 있다. 구체적으로는, 1209번째 구아닌 (G)이 티민 (T) 으로 치환되고, 1212 번째 티민 (T) 이 구아닌 (G) 으로 치환되며, 1193 번째 및 1195 번째 아데닌 (A) 이 각각 구아닌(G) 으로 치환된 DNA 단편이 예시된다.

본 발명의 변이체 AOX2 프로모터는, 야생형 AOX2 프로모터의 부분 DNA 단편에 올리고뉴클레오티드 (들) (I) 이 단편의 5' 말단에서 정 및/또는 역방향으로 부가된 서열을 갖고 있다.

정 방향으로의 올리고뉴클레오티드 (I) 의 부가는, 올리고뉴클레오티드 (I) 이, 그의 5' 말단에서, 상류 영역이 결여된 AOX2 프로모터와 배위되어 5'-GATAGGCTATTTTTGTCGCATAAAT-3' 를 형성함을 의미하는 것이다. 역방향으로의 올리고뉴클레오티드 (I) 의 첨가는 올리고뉴클레오티드 (I)이, 그의 5' 말단에서, 상류 영역이 결실된 AOX2 프로모터와 배위되어 3'-GATAGGCTATTTTTGTCGCATAAAT-5' 를 형성함을 의미하는 것이다.

본 발명의 돌연변이체 AOX2 프로모터의 특정예는 다음과 같다.

I. 부분 DNA 단편 1 의 5' 말단에 올리고뉴클레오티드 (I) 이 정 또는 역방향으로 부가된 프로모터.

726 ~ 1528 뉴클레오티드의 부분 AOX2 프로모터 단편의 5' 말단에 올리고뉴클레오티드 (I) 가 정 또는 역방향으로 첨가된 프로모터가 예시된다.

II. 부분 DNA 단편 2 의 5' 말단에 올리고뉴클레오티드 (1) 이 정 또는 역방향으로 첨가된 프로모터.

1063 ~ 1528 뉴클레오티드의 부분 AOX2 프로모터 단편의 5' 말단에 올리고뉴클레티드 (I) 이 정 또는 역방향으로 부가된 프로모터 및 1188 ~ 1528 뉴클레오티드의 부분 AOX2 프로모터 단편의 5' 말단에 올리고 뉴클레오티드 (I) 이 정 또는역방향으로 부가된 프로모터가 예시된다.

III. 부분 DNA 단편 3 의 5' 말단에 올리고뉴클레오티드 (I) 이 정 또는 역방향으로 첨가된 프로모터.

1256 ~ 1528 뉴클레오티드의 부분 AOX2 프로모터 단편의 5' 말단에 올리고뉴클레오티드 (I) 이 정 또는 역방향으로 부가된 프로모터가 예시된다.

IV. 부분 DNA 단편 4 의 5' 말단에 올리고뉴클레오티드 (I) 이 정 또는 역 방향으로 부가된 프로모터.

1315 ~ 1528 뉴클레오티드의 부분 AOX2 프로모터 단편의 5' 말단에 올리고뉴클레오티드 (I) 이 정 또는 역방향으로 부가된 프로모터가 예시된다.

본 발명의 돌연변이체 AOX2 프로모터는 상류영역이 결여된 AOX2 프로모터의 부분 DNA 단편의 5' 말단에 다수, 바람직하게는 2 ~ 3 개의 올리고뉴클레오티드 (I) 이 상기 기재된방식으로 연결된 것일 수 있다. 다수의 올리고뉴클레오티드 (I) 이 결찰될때, 뉴클레오티드 서열의 방향은 제한되지 않으며, 정 또는 역방향 또는 양 방향일 수도 있다.

본 발명에 있어서, (1) 돌연변이체 AOX2 프로모터, (2) 이 프로모터를 보유한 벡터, 및 (3) 상기 벡터가 도입된 형질 전환체는 예를들면 다음과 같이 제조된다.

(I) 돌연변이체 AOX2 프로모터

본 발명의 돌연변이체 AOX2 프로모터는 야생형 AOX2 프로모터를 유전공학적으로 처리함으로써 수득되는 부분 DNA 단편의 5' 말단에 화학합성 올리고뉴클레오티드 (I) 을 부가함에 의해 제조될 수 있다. 야생형 AOX2 프로모터 뉴클레오티드 서열의 특정 부위를 결실시키거나, 치환하거나, 또는 새로운 뉴클레오티드를 첨가함으로써 부분 DNA 단편을 제조할 수 있다. 이 단계들은 통상의 유전공학 기술을 사용하여 수행될 수도 있고, 유용한 방법은 예를들면 특정부위 결실법 [Nucl. Acids Res., 11, 1645 (1983)], 특정부위 돌연변이 유발법, 제한효소 처리법, 합성 유전자를 이용한 방법 및 PCR 방법이다.

또한, 프로모터는, 본 발명의 돌연변이체 AOX2 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 기본으로한 화학합성에 의해 제조될 수도 있다.

대안적으로는, AOX1 유전자가 유전적으로 손상되었으므로 단지 AOX2 유전자로부터 알콜 산화 효소를 발현 및 제조하기 위해서는, 빈약한 메탄올 이용성을 가진 균주를 단독 탄소원으로서 메탄올을 함유하는 배지에 계대 배양하여, 개량된 메탄올 이용성을 가진 균주 (초고급 균주 (Super High Grade Strain : SHG 균주) 로 변이시키고, 이로부터 부분 DNA 단편 (부분적으로 변이된 AOX2 프로모터) 을 수득하고, 그의 5' 말단에 화합합성 올리고 뉴클레오티드 (I) 를 첨가하여 본 발명의 돌연변이체 AOX2 프로모터를 수득한다.

(Ⅱ) (i) 재조합 벡터의 구축

이렇게 수득된 돌연변이체 AOX2 프로모터를 적절한 플라스미드 벡터 또는 파아지 벡터내에 삽입시키고, 이종 단백질을 발현시키기 위한 벡터로 사용한다.

상기 프로모터를 각종 플라스미드 및 파아지로 삽입하는 것은 Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Lab. 1989) 에 기재된 방법과 같은 통상적인 DNA 재조합 방법에 따라 수행될 수 있다.

(ii) 재조합 발현 벡터의 구축

돌연변이체 AOX2 프로모터의 제어하에서 이종 단백질 유전자가 발현되는 본 발명의 재조합 발현 벡터는, 목적하는 이종 단백질의 유전자를 번역 개시 코돈을 거쳐 상기 수득된 재조합 벡터에 있는 돌연변이체 AOX2 프로모터의 3'- 플랭킹 영역내로 삽입함으로써 구축될 수 있다.

대안적으로는, 제안효소를 사용하여 상기 언급된 재조합 플라스미드 벡터 또는 파아지 벡터로 부터 본 발명의 돌연변이체 AOX2 프로모터를 절단해내고, 이종 단백질의 구조 유전자를 가진 벡터의 프로모터 영역을 제한효소, DNA 리가아제등을 사용하여 돌연변이체 AOX2프로모터로 치환시킴으로써 본 발명의 재조합 발현 벡터를 구축할 수도 있다.

더욱 상세하게는, 본 발명의 벡터는 이종 단백질의 효율적인 발현을 위해 (1) 돌연변이체 AOX2 프로모터, (2) 리보소옴 결합 부위, (3) 번역 개시 코오돈, (4) 시그날 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA, (5) 이종 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA, (6) 번역 종료 코오돈, (7) 터미네이터, (8) 선별 마커 유전자, (9) 자율복제 서열, 및 (10) 상동 서열이 필요에 따라 하류 방향으로 순서적으로 포함되는 방식으로 구축된다.

구조 유전자는 인간혈청 알부민, 프로우로키나아제, 조직 플라스미노겐 액티베이터, 헤파티티스 B 표면 항원 및 각종 인터페론과 같은 목적하는 이종 단백질을 코딩하는 이상 특별히 제한되지 않으며, 임의의 방법으로 제조될 수도 있다. 특히,mRNA으로부터 합성된 cDNA, 게놈 DNA, 화학 - 합성 DNA 및 이들의 조합에 의해 구축된 DNA를 예시할 수 있다.

특정 예로는 HSA 구조 유전자, AOX1 구조 유전자 및 AOX2 구조 유전자가 포함된다.

상기 언급된 구조 유전자는 유전자의 5' 말단에 ATG를 번역 개시 코돈으로 가질 수도 있고, 유전자의 3'- 말단에 번역 종료 코돈을 가질 수도 있다. 번역 종료 코돈의 예로는 TAA, TGA 및 TAG 가 포함된다. 이러한 코돈들중의 하나 또는 그 이상을 각각의 영역에 조합하여 혼입할 수도 있고, 특별히 한정되지 않는다.

터미네이터는, 목적하는 이종 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 적절한 숙주가 사용되는 이상, 특별히 제한되지 않는다. 예를들면, AOX1 터미네이터 또는 AOX2 터미네이터가 사용될 수도 있다.

선별 마커 유전자의 예는 항생물질 내성 유전자 및 영양요구성 유전자이다. 일반적으로, 숙주가 세균인 경우에, 항생물질 - 내성 유전자가 사용될 수도 있고, 그의 예로는 시클로헥시미드 - 내성 유전자, 암피실린 - 내성 유전자, 클로람페니콜 - 내성 유전자, 블레오마이신 - 내성 유전자, 히그로마이신 - 내성 유전자, 및 G - 418 내성 유전자가 포함된다. 숙주가 효모와 같이 세균 이외의 것일때, 영양요구성 유전자가 사용될 수도 있고, 그의 예로는 HIS 4, URA 3, LEU 2및 ARG 4 가 포함된다. 이러한 선별 마커는 바람직하게는 상기 벡터내의 적절한 부위에 단독으로 또는 서로 조합하여 혼입될 수도 있다.

숙주 염색체내에 통합되는 상동지역의 특정 예로는 HIS 4, URA 3, LEU 2,ARG 4 및 TRP 1 이 있다.

본 발명의 벡터는 본 발명의 몇개의 돌연변이체 AOX2 프로모터가 결합되어 이루어질 수도 있다 (다시 말해서, 세로연결된 이량체, 세로연결된 삼량체). 이러한 경우에, 프로모터 사이에 번역 개시 코돈이 삽입되지 않은 것이 바람직하다.

(III) 형질 전환체 및 그의 배양

본 발명의 형질 전환체는 상기 수득된 것과 같은 재조합 발현 벡터를 적절한 숙주 세포내로 도입함으로써 제조된다.

더욱 상세하게는, 본 발명의 형질 전환체는 상기 (II)의 재조합 발현벡터를 콤피턴트 세포 방법 (J. Mol. Biol., 53, 154, 1970), 원형질체 폴리에틸렌 융합법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978), 아세트산 리튬법 [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] 칼슘 인산염 방법 (Science, 221, 55, 1983), DEAE 텍스트란 방법 (Science, 215, 166, 1982), 전기 펄스법 (Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 81, 7161, 1984), 시험관내 팩키징 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975), 비루스 벡터법 (Cell, 37, 1053, 1984), 또는 마이크로 주사법 (Exp. Cell. Res., 153, 347, 1984)과 같은 공지의 방법에 의해 숙주내로 도입함으로써 제조된다.

사용되는 숙주로는, 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 또는 효모가 예시되며, 효모, 구체적으로는 피키아 (Pichia) 효모, GTS 115 (NRRL 수탁번호 Y - 15851) 가 바람직하다.

숙주 세포내에 도입된 벡터는 삽입 또는 치환에 의해 염색체내로 통합될 수도 있다. 또는 플라스미드로서 존재할 수도 있다.

숙주내로 도입되는 외인성 유전자의 카피의 수는 1 개 또는 수개일 수도 있다.

이렇게 수득된 형질 전환체를, 목적하는 재조합 이종 단백질의 제조를 위해 사용되는 숙주에 따라 선택되는 적절한 공지의 배지에서 배양한다. 배지는 탄소원, 질소원, 미네랄, 비타민, 및 상기 형질 전환체의 생육을 위해 필수적인 약제를 함유한다.

배지의 예로는 숙주가 에스케리키아 콜리인 경우에 LB 배지 (일본국 니쓰이 세이야꾸 가부시끼가이샤 제) 및 M 9 배지 (J, Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor, Laboratory, New York, p. 431, 1972) : 숙주가 효모인 경우에는 YPD 배지 (1% 박토 효모 추출물, 2% 박토펩톤, 2% 글루코오스), YPG 배지 (1% 박토 효모 추출물, 2% 박토 펩톤, 2% 글리세롤), YPM 배지 (1% 박토 효모 추출물, 2% 박토 펩톤, 2% 메탄올), YPDM배지 (1% 박토 효모 추출물, 2% 박토 펩톤, 2% 텍스트로스, 2% 메탄올), 0.1 ~ 5% 메탄올을 함유한 YNB 액체 배지 (0.7% 효모질소염기, Difco 제), 0.01 ~ 5% 메탄올을 함유한 YP 배지 (1% 박토 효모 추출물, Difco 제, 2% 폴리펩톤 (일본국 다이고 에이요샤 가부시끼가이샤 제), 및 SMM 배지 (2% 메탄올, 0.5% CH₃COONH₄합성 배지) 를 들 수 있다.

통상 15℃ 내지 45℃ 온도, 바람직하게는 약 30℃에서 20 ~ 360 시간동안 배양을 수행하고, 필요에 따라 통기 및 / 또는 교반을 적용할 수도 있다. 배양액의pH 는 바람직하게는 5 내지 8 이다.

배양후에, 배양액 상층액 또는 형질 전환체에 축적된 목적하는 이종 단백질을 공지된 방법에 의해 추출 및 정제한다. 예를들면, 염석, 용매침전, 투석, 한외여과, 겔 전기영동, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피등을 병용할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 다양한 기술, 반응 및 분석 방법은 당 기술분야의 숙련자에게 공지된 것임을 주목한다. 또한, 효소, 플라스미드, 숙주 등도 통상적으로 입수 가능한 것이다.

본 발명은 이하 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명되지만, 본 발명이 이것에 제한되지는 않는다.

하기 실시예 및 실험예에서 사용된 모든 효소는, 구체적인 확인이 없는 한, 일본국 다까라 슈조 가부시끼가이샤와 같은 시판 공급원에서 구입된 것이다.

효소 반응 및 반응조건을 위한 완충액도, 특별한 언급이 없는한, 각각의 효소에 대한 제조업자의 추천을 따른다.

피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) GTS 115, PC 4130, PC 4105, 및 플라스미드 pPGP 1 은 필립스 페트롤륨 (Phillips Petroleum) 에서 구입된 것이다.

벡터로서 플라스미드를 사용한 에스케리키아 콜리의 형질전환, 플라그 하이브리드형성, 및 전기영동은 문헌 [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] 에 기재된 방법에 따라 수행된다.

실시예 1

AOX2 유전자의 클로닝, 및 재조합 벡터의 제조

AOX2 유전자 및 그의 주변의 서열 및 제한 효소 지도는 Cregg 등 [Mol. Cell. Biol., 9, 1316 - 1323 (1989)] 및 Koutz 등 [YEAST, 5, 167 - 177 (1989)] 에 의해 보고되어 있다. 이 보고 문헌을 참조하여, AOX2 유전자의 클로닝을 계획한다. AOX2 유전자 및 그의 주변의 제한 효소 지도를 제 1 도에 나타낸다.

먼저 염색체 DNA 를 카메론 (Cameron) 등의 방법 [Nucleic Acids Res., 4, 1429 (1977)] 에 따라 PC 4130 균주로부터 추출하고 정제한다.

PC 4130 균주는 GTS 115 (HIS 4) 의 AOXI 유전자의 영역의 일부를 pPGP1 플라스미드 (AOX1 프로모터의 제어하에서 HSA 발현을 가능케하는 전사단위를 가진 플라스미드) 의 Not I - 단편으로 치환함으로써 수득되는 유전자 영역을 포함하고 있다 (제 2도).

AOX2 프로모터 영역, AOX2 구조 유전자 및 AOX2 터미네이터 영역이 염색체 DNA 내에 완전히 포함되도록 하는 방식으로 염색체 DNA를 제한 효소 Xba I 및 Pst I 으로 완전히 소화시킨다.

이렇게 수득된 DNA 단편을 에탄올로 침전시키고 원심 분리하고 건조시킨 다음 멸균수에 의해 용해시킨다. 이어서, EcoRI 메틸라제 (일본국 다까라 슈조 가부시끼가이샤 제)를 여기에 첨가하여 반응시킨다. 그 다음, TE 포화 페놀, 클로로포름 추출 및 클로로포름 추출을 연속하여 수행한다. 수층을 에탄올 침전시키고, 원심분리하고 건조시키고 멸균수에 용해시킨다. DNA 블런팅 키트 (일본국 다까라 슈조 가부시끼가이샤 제)를 사용하여 DNA단편 말단을 블런트화하고, DNA 결찰 키트 (일본국 다까라 슈조 가부시끼 가이샤 제)를 사용하여 EcoRI 링커 d (pG - G - A - A - T - T - C - C) (일본국 다까라 슈조 가부시끼가이샤 제) 와 결찰시킨다. 에탄올 침전을 다시 수행한다. 원심분리 및 건조후에, 침전물을 멸균수에 용해시키고 여기에 EcoRI 을 첨가하고 37℃에서 1시간동안 보온한다. 혼합물을 1% 아가로오스 겔 전기 영동하고 ; 4-5Kb 에 상응하는 띠를 아가로오스 겔에서 절단해 내고 ; GENE CLEAN II (BIO 101 제)을 사용한 용출 및 정제에 의해 겔로부터 DNA를 회수한다. 수득된 DNA를 멸균수에 용해시킨다.

정제된 DNA 단편을 λgt 10 암 (Protoclone^TM시스템, Promega 제) 과 결찰시키고, Gigapack - GOLD 3 (Stratagene 제) 을 사용하여 시험관내 팩키징 시킨다.

재조합 파아지를 A₆₀₀= 2 로 조절한 이. 콜리 C600 hf 1 균주에 감염시키고, NZY 플레이트 (1% NZ 아민, 0.5% 염화 나트륨, 0.5% 효모 추출물, 0.02% 황산 마그네슘, 1.5% 한천분말)상에 접종하여 각각의 플레이트 상에 약 500 개의 플라그가 생육되도록 한다. 생육된 플라그로 부터, 상기 - 언급된 DNA 단편을 함유하는 클론 (양성 클론) 을 콜로니 하이브리드 형성 방법에 의해 선별하고 수득한다. 즉, 4 개의 나일론 막 콜로니 /플라그 스크린 "^TM(NEN 제)을 사용하여, 플라그를 막으로 옮긴 다음, 변성시키고, 중화시키고 고정화한다. 프로브로서, 피키아 파스토리스에서 유래된 AOX1 구조 유전자의 앞부분 절반을 Eco RV 및 Bal II 로 소화시킨 다음, 유전자를 랜덤 프라이머 라벨링 키트 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제)를 사용하여³²P로 라벨링 시킴으로써 수득되는 단편을 사용한다. 1% BSA, 1mM EDTA, 0.5M NaH₂PO₄(pH 7,2) 및 7% SDS 의 용액중에서 65℃ 에서 5 분동안 예비하이브리드 형성을 수행한다. 1% BSA, 1mM EDTA, 0.5M NaH₂PO₄(pH 7.2), 7% SDS 및³²P - 프로브의 용액중에서 65℃ 에서 밤새 하이브리드 형성을 수행한 다음, 0.5M NaH₂PO₄의 용액 (pH 7.2) 내에서 실온에서 10 분동안 보온 / 세척을 수행하고, 0.5% BSA, 1mM EDTA, 40mM NaH₂PO₄(pH 7.2)및 5% SDS 의 용액내에서 37℃ 에서 30 분동안 더욱 보온한다 (3회). 필터를 통풍 건조시키고, 방사성 사진을 위해 -80℃ 에서 16 시간동안 X - 필름 노출 카셋트내의 X - 선 필름상에 깔아서 방치한다. 그 결과, 2 개의 양성 클론이 수득된다. 이들중의 하나를 배양하여 파아지를 생육시켜 파아지 DNA 를 추출한다. DNA 를 EcoRI 으로 절단하고, 아가로오스 전기영동하여 목적하는 단편 (1.5kb 및 2.9kb) 의 존재를 확인한다.

한편, 선별 마커로서 암피실린 - 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pUC19 (Bethesda Research Laboratories 제) 를 EcoRI 으로 절단하고, 알칼리 포스 파타제로 처리하고 회수한다. 상기 언급된 파아지로부터 수득되고 그 EcoRI 으로 소화된 DNA 단편을 EcoRI - 절단 플라스미드와 결찰시켜 플라스미드 벡터를 구축한 다음 이를 이. 콜리 HB101 내로 도입하여 형질 전환체를 수득한다. 40㎍/ml 암피실린을 함유하는 L 플레이트 상에 형질 전환체를 접종하고 37℃ 에서 밤새 배양한다. [L플레이트는 다음과 같이 제조한다. 트리스 염기 0.62g, 폴리펩톤 10g, 효소 추출물 5g, 및 염화 나트륨 5g 을 물에 용해시켜 총랑 1ℓ를 만들고, 여기에 15g 의 한천분말을 첨가한 다음 오토클레이브시킨다. 냉각후에, 암피실린을 첨가하고, 혼합물을 플라스틱 샤알레에 분배하고 고정화 시켜 플레이트를 수득한다]. 콜로니를 스크리닝 하고 (EcoRI - 소화 단편을 미니프레프에 의해 확인한다). 1.5kb 단편 및 2.7kb 단편을 함유하는 pUC19 를 보유한 클론이 수득됨을 확인한다. 클론을 40㎍/m1 암피실린 - 함유 슈퍼 브로쓰 (A 용액 및 B 용액의 혼합에 의해 수득되는 배양 배지 ; A 용액은 박토트립톤 12g, 효모 추출물 24g 및 글리세를 5ml 를 물에용해시켜 총량 900ml 를 만들고 오토클레이브시킴으로써 제조되며, B 용액은 인산이수소칼륨 3.81g 및 인산수소이칼륨 12.5g 을 물에 용해시켜 총량 100ml 를 만들고 오토클레이브 시킴으로써 제조된다) 내에서 9 : 1 (v/v) 의 비율로 37℃ 에서 밤새 진탕배양하고, 플라스미드 DNA 를 알칼리 - SDS 방법에 의해 다량 추출 및 정제한다. AOX2 프로모터 영역을 포함한 플라스미드를 pMM 030으로 명명하고 (제 3 도), AOX2 구조 유전자 및 터미네이터를 포함한 플라스미드를 pMM 031로 명명한다 (제 4 도). 이들 플라스미드를 각종 제한 효소로 소화시킴으로써 생성된 단편의 크기는 이미 보고되어 있는것과 동일한 패턴을 나타낸다.

실시예 2

AOX2 프로모터 영역의 뉴클레오티드 서열의 결정

실시예 1 에서 수득된 플라스미드 백터 pMM 030 을 EcoRI 으로 소화시킨다.수득된 1.5kb 단편을 회수하고 DNA 단편을 DNA 블런팅 키드 (다까라 슈조 가브시끼가이샤 제)로 처리하여 블런트 말단을 가진 DNA 단편을 수득한다.

한편, 플라스미드 pUC 19 를 Xba I 으로 소화시키고 멍 비인 (Mung Bean) 뉴클레아제 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제)로 처리하고, 알칼리 포스파타제로 처리한 다음, 상기 수득된 DNA 단편을 Xba I 절단 부위와 결찰시킨다. 이러한 절차에 의해 AOX2 프로모터 영역 DNA 가 pUC19 의 Xba I 부위에 서브클로닝된 플라스미드를 수득한다.

킬로시퀀스 (kilo Sequence) 용 결실 키드 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제)를 사용하여 플라스미드를 처리하여, 150 내지 300bp 의 삽입 크기를 가진 결실 변이주의 5 또는 6 개 클론을 제조한다. 이들 결신 변이주의 뉴클레오티드 서열을 M13 디데옥시 서열 키트 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제)를 사용하여 확인한다. 그 결과, AOX2 구조 유전자의 ATG 로부터 1.5Kb 상류에 대한 전체 뉴클레오티드 서열이 동정된다.

실시예 3

AOX2 프로모터에 의해 제어되는 HSA 발현 백터의 구축

pPGPl 을 Not I 으로 소화시키고 DNA 블런팅 키트 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제) 를 사용하여 블런트화한다. 여기에 EcoRI 링커 d (pG - G -A - A - T - T - C - C) (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제) 를 결찰시킨다. SphI 로 완전 소화시키고 EcoRI 로 부분 소화시켜, 6.5kb DNA 단편을 회수 및 정제한다. pUC19 를 EcoRI 및 SphI 으로 소화시키고, 알칼리 포스파타제로 처리하고, 상기 - 언급된 단편과 결찰시킨다. 따라서, AOX1 프로모터의 제어하에서 HSA 가 발현되는, HIS4 를 선별 마커로 갖는 pUC19 - 유래 플라스미드 pPG 001 을 수득한다(제 5 도). pPG001 을EcoRI 으로 부분 소화시키고 DNA 블런팅 키트 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제) 로 블런트화 한다. 한편, GGGATCCC의 서열을 가진 Bam HI 링커를 DNA 합성기 모델 381 A (Applied Biosystem 제)를 사용하여 포스포르아미다이트 방법에 의해 합성한 다음, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제)로 포스포릴화하고, 상술된 바와같이 미리 블런트화된 pPG001 의 단편과 결찰시킨다. 이어서, Asu II 및 Ｂam HI으로 소화시키고 7.1kb 단편을 정제한다. 한편, pPGP1을 Hind III로 소화시키고, DNA 블런팅 키트 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제) 를 사용하여 블런트화하고 이것을 Bam HI 링커 d (pG - G - G - A - T - C - C - C) (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제) 와 결찰시킨다. 이것을 Asu II 및 Bam HI 으로 소화시키고, 1.9kb 단편을 정제하고, 이것을 상기 - 언급된 7.1kb 단편과 결찰시켜 pPG002 를 수득한다(제 6 도).

pMM030 을 Eae I 으로 소화시키고 1.5kb 단편을 회수한다. 이것을 멍 비인 뉴클레아제 처리 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제) 에 의해 블런트화한다. 이어서, DNA 합성기 모델 381A (Applied Biosystem 제) 를 사용하여, CTTCGAAG 의 서열을 가진 Asu II 링커를 포스포르아미다이트법에 의해 합성한다. Asu II 링커를 T4 폴리뉴클레오티드 키나이제 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제) 로 포스포릴화하고, 상술된 바와같이 미리 블런트화시킨 pMM030 의 단편과 결찰시킨다. 이어서, EcoRI 및 Asu II 로 소화시켜, 1.5kb AOX 2 프로모터 단편을 회수한다. 한편, AOX1 프로모터의 제어하에서 HSA가 발현되는, HIS 4 영역을 가진 플라스미드 pPG002 를 EcoRI 및 Asu II 로 소화시키고, AOX1 프로모터 영역이 결실된 8.1kb 단편을 알칼리 포스파타제로 처리하고 회수한 후, 이것을 AOX2 프로모터 영역 1.5kb 단편과 결찰시켜, AOX2 프로모터의 제어하에서 HSA 의 발현이 가능한 플라스미드 pMM041 을 제조한다 (제 6 도). pMM041 의 제한 효소 지도를 제 7 도에 나타낸다.

실시예 4

5' 상류 영역의 결실을 거친 AOX2 프로모터 유전자의 PCR 법에 의한 증폭

PCR 법에 의해 증폭시키기 위하여, 번역 개시 코돈 ATG로 부터 803bp, 462bp, 341bp, 273bp, 또는 2140p 의 상류 영역의 길이를 갖는 AOX2 프로모터 단편을 사용하여, 5' 말단에 EcoRI 부위 또는 3' 말단에 Asu II 부위를 갖는 프라이머 서열을 고안하고, 포스포르아미다이트법에 의해 392형 DNA / RNA 합성기 (Applied Biosystem 제) 를 사용하여 합성하고, XAP 10 컬럼 (Pharmacia 제) 에 의해 정제한다.각각의 서열을 표 1에 나타낸다.

표 1

정사슬 및 역사슬 프라이머 PCRRV 중의 어느 것을사용하여, 피키아 파스토리스 염색체 DNA 로 PCR 을 수행한다. PCR 장치는 퍼킨엘머 (Perkinelmer) DNA 열순환계 (thermalcycler) (CETUS CORPORATION 제) 이며, 시약은 Gene Amp^TMDNA 증폭키트 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제) 이다. 반응 혼합물에 존재하는 저분자 물질을 울트라프리 (Ultrafree) C3 TK (밀리포어제)에 의해 제거하고 얻어진 혼합물을 정제된 PCR 생성물로 사용한다.

실시예 5

상류 결실된 AOX2 프로모터에 의해 제어되는 HSA 발현 벡터의 구축.

HSA 발현 벡터 pMM041 을 EcoRI 및 Asu II 로 이중소화 시키고 ; 천연 AOX2 프로모터를 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리 및 제거하고 ; 실시예 4 에서 수득된 것과 같이, EcoRI 및 Asu II 로 이중 - 소화된 정제된 PCR 생성물을 벡터 부분에 삽입시켜 5'- 결실된 AOX2 프로모터를 함유한 플라스미드를 제조한다. 삽입된 DNA 단편이 5'- 상류 영역이 결실된 AOX2 프로모터 유전자임을 확인하기 위하여, ALF. DNA 서열기 (Pharmacia 제) 에 의해 형광 프라이머를 사용한 디데옥시법에 의해 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 사용되는 형광 프라이머는 유니버샬 (Universal) 프라이머 (Pharmacia 제) 이며, 사용되는 반응키트는 자동 판독 (Auto read) 서열키트 (Pharmacia 제) 이다. 그 결과, 제조된 플라스미드는, 원래 계획된 바와같이, 5'- 결실된 AOX2 프라이머에 의해 제어되는 HSA 발현 벡터임이 모두 확인되었다. 프라이머 PCR60 을 사용하여 수득되고 ATG 로부터의 상류 영역 길이가 803bp 인 HSA 발현 벡터 (프로모터의 5' 말단점의 뉴클레오티드 번호는 726 이다)를 pH0060 이라 명명하고 ; 프라이머 PCR65 을 사용하여 수득되고 ATG 로 부터의상류 영역 길이가 462bp 인 벡터 (프로모터의 5' 말단점의 뉴클레오티드 번호는 1067 이다) 를 pH0065 라고 명명하고 ; 프라이머 PCR71 을 사용하여 수득되고 ATG 로부터의 상류 영역 길이가 341 bp 인 벡터 (프로모터의 5' 말단점의 뉴클레오티드 번호는 1188 이다)를 pYI071 이라 명명하고 ; 프라이머 PCR66 을 사용하여 수득되고 ATG 로부터의 상류 영역 길이가 273bp 인 벡터 (프로모터의 5' 말단점의 뉴클레오티드 번호는 1256 이다)를 pH0066 이라 명명하고 ; 프라이머 PCR68 을 사용하여 수득되고 ATG 로 부터의 상류 영역 길이가 214bp인 벡터 (프로모터의 5' 말단점의 뉴클레오티드 번호는 1315 이다)를 pH0068 이라 명명한다(제 8 도).

실시예 6

HSA 발현 벡터 pHO 090 및 pHO 095 의 구축

AOX2 프로모터의 뉴클레오티드 1188 - 1212 영역내에 2 종류의 특정 부위 돌연변이를 PCR 법에 의해 도입하고, 프로모터의 전사 활성에 대한 돌연변이의 영향을 분석한다.

PCR 법을 이용한 특정부위 돌연변이의 도입은 문헌 (Ito, W., 등, Gene, 102, 67 - 70, 1991)에 기재된 방법을 따른다. 주형 플라스미드로는, AOX2 프로모터 및 HSA 발현 벡터 pHO065 로부터의 HSA 의 5'- 영역의 약 1.2kb 를 EcoRI 및 Pst I 으로 절단하고, 이를 클로닝 벡터 pUC19의 EcoRI / Pst I 부위에 서브클로닝 함으로써 수득되는 플라스미드 pHO074 가 사용된다. 이어서, 특정 부위의 돌연변이 유발을 위한 2 종류의 프라이머 UASp 들을 합성한다. 이들의 서열을 제 9 도에 나타내고, 돌연변이 도입 단계를 제 10 도 및 11 도에 요약한다.

먼저, UASp 및 멀티클로닝 부위의 3' 서열에 상보적인 플라이머 RV (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제)를 사용하여 각각의 PCR 생성물을 제조한다. 또한, 멀티클로닝 부위의 5' 서열에 상보적인 플라이머 M4 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제), 및 멀티클로닝 부위의 3' 서열에 상보적 이지만 멀티클로닝 부위의 Sph I 및 Hind III 부위에 상응하는 부위를 뉴클레오티드 치환에 의해 미리 결실시킨 프라이머 MUTF 3 (다까라 슈조 가부시끼가이샤 제) 를 사용하여 다른 반응 시험관에서 PCR 생성물을 제조한다. 후자의 PCR 생성물에서 멀티클로닝 부위의 Sph I 부위 및 Hind III 부위에 상응하는 부위를 결실시킨다. 양자의 PCR 생성물로 부터 저분자 물질을 제거한 후, 동량의 2개의 생성물을 혼합하고, 열로 변성시키고, 어닐링을 위해 냉각하여 헤테로 이중사슬을 형성한다. 헤테로 이중사슬을 폴리머라제 반응에 의해 완결시키고, 제 2의 PCR 을 M4 및 RV 을 사용하여 수행한다.

이 방법에 의해, 2 종류의 PCR 생성물 즉, 돌연변이가 도입된 목적하는 UAS 및 멀티클로닝 부위의 Sph I 및 Hind III 부위에 상응하는 부위가 제거된 USA 가 이론적으로 수득될 수 있다. 따라서, 돌연변이가 도입된 UAS 는 혼합물을 EcoRI 및 Sph I 으로 소화시키고, 저 분자 물질의 제거시에 이를 pUC 19 의 EcoRI / Sph I 에 재클로닝 함으로써 수득될 수 있다. 이렇게 수득된 여러 종류의 플라스미드의 AOX2 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 특정부위 돌연변이가 도입된 AOX2 프로모터를 수득한다. 이들을 보유한 플라스미드를 각각 pHO0086 및 pHO0087 이라 명명한다.

pHO086 및 pHO 087 을 EcoRI 및 Pst I 으로 소화시켜 462bp AOX2 프로모터및 약 1.2kb 의 HSA 유전자의 5' 영역을 함유한 단편을 수득한다. HSA 발현 벡터 pMM041 을 EcoRI 및 Pst I 으로 소화시킴으로써 수득되는 HSA 유전자의 5' 영역 및 천연 AOX2 프로모터를 포함한 약 11700b 단편으로 단편을 교환함으로써, 특정부위 돌연변이된 프로모터의 제어하에 있는 HSA 발현 벡터 pHO090 및 pHO095 를 구축한다(제 12 도).

실시예 7

돌연변이된 URS 2 영역 (뉴클레오티드 1274 - 1314) 을 가진 AOX2 프로모터의 제조 및 이 프로모터를 보유한 HSA 발현 벡터

AOX1 유전자의 결실에 기인하여 빈약한 메탄올 이용성을 나타내는 피키아 파스토리스 균주를 메탄올을 단독 탄소원으로 함유하는 배지에서 계대배양함으로써, 개량된 생육을 나타내는 변이 균주뿐만 아니라 AOX1 유전자를 갖는 균주를 수득할 수 있다. AOX2 프로모터에서 발생하는 돌연변이는 전사 활성을 개량시키고, 결국 균주 생육을 향상시키는 것이 명백해졌다(일본국 특허출원 제 63598 / 1991 호). 이 방법을 사용하여, AOX1 - 결실된 균주로부터 메탄올 이용성이 개량된 변이 균주를 수득할 수 있다. AOX1 - 결실 균주인 PC 4105 균주를 메탄올을 단독 탄소원으로 함유하는 YPM 배지에서 연속적으로 계대배양한다. 계대배양액을 YNB W/O a.a - MeOH 한천배지 (아미노산을 갖지 않는 0.67% 효모 질소염기, 2% 메탄올, 1.5% 한천) 상에 한천 배지당 10⁷- 10⁸세포로 분배한다. AOX1 결실 균주는 현저히 느린 생육을 나타내는 반면, 변이 균주의 생육은 3 또는 4 일에 콜로니를 형성하는 정도로 빠르다. 이러한 방식으로, 향상된 메탄올 이용성을 나타내는 변이 균주는 20 ~ 45 세대동안 계대배양된 세포로부터 수득되며, SHG4105 - 4 균주 및 SHG4105 - 8 균주라 명명한다.

수득된 변이 균주의 AOX2 프로모터론 PCR 법을 사용하여 클로닝한다. 즉, AOX2 프로모터의 뉴클레오티드 726 - 743 에 대한 하이브리드 형성을 위해 5'- 말단에 BamHI 부위를 갖는 DNA 단편 (5'- CCGGATCCACTAAGCGAGTCATCATC - 3') 을 정 사슬 프라이머로 사용하고, 뉴클레오티드 1386 - 1369 에 대한 하이브리드 형성을 위해 5' 말단에 EcoRI 부위를 갖는 DNA 단편 (5'- CCGAATTCGACAATATTCTTTGATGC - 3') 을 역사슬 프라이머로 사용하여, 변이 균주 및 PC 4105 균주의 염색체 DNA 를 가지고 PCR 을 수행한다. 상술된 바와같이 중폭된 AOX2 프로모터 단편을 pUC 19 의 Bam HI / EcoRI 부위에 클로닝한다.

이어서, 클로닝 벡터상의 AOX2 프로모터 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 친균주 PC4105 에서, AOX2 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 완전히 원상그대로 이다. SHG4105 - 4균주에서, 천연 AOX2 프로모터의 T (1274) 는 C 로 치환된다. SHG4105 - 8 균주에서, 천연 AOX2 프로모터의 T (1274) 는 유지되지만, 뉴클레오티드 1296 - 1314 는 한번 중복된다.

클로닝된 돌연변이체 AOX2 프로모터의 제어하에서 HSA 발현이 가능한 벡터를 구축한다. 먼저, 변이체 AOX2 프로모터의 5'- 말단에 있는 Bam HI 부위를 EcoRI 부위를 전환시키고, 변이체 AOX2 프로모터 단편을 EcoRI - SspI 으로 단리시킨다. 이어서, HSA 발현 벡터 pMM 041 내의 천연 AOX2 프로모터를 돌연변이체 AOX2 프로모터로 치환하여 돌연변이체 AOX2 프로모터의 제어하에서 HSA 발현이 가능한 벡터 pHO059 (점변이) 및 PHO061 (중복변이)를 얻는다(제 13도).

실시예 8

URS 1 은 없지만 변이체 URS 2를 갖는 AOX2 프로모터의 제조 및 이 프로모터를 보유한 HSA 발현 벡터.

뉴클레오티드 1274 에서 점변이된 AOX2 프로모터를 갖는 SHG 4105 - 4 균주, 뉴클레오티드 1296 - 1314 의 중복 변이를 갖는 SHG 4105 - 8 균주, 및 천연 AOX2 프로모터를 갖는 GTS 115 균주의 염색체 DNA 들을, AOX2 프로모터의 뉴클레오티드 1188 -1206 에 대한 하이브리드 형성을 위해 5' 말단에 EcoRI 부위를 가진 DNA 단편 (5'- GAATTCCCAAGATAGGCTATTTTTG - 3') 을 정 사슬 프라이머로 사용하고, 뉴클레오티드 1529 - 1501 에 대한 하이브리드 형성을 위해 5' 말단에 Asu II 부위를 갖는 DNA 단편 (5'-TTCGAAGTTTTTCTCAGTTGATTTGTTTGTGGGGAT - 3') 을 역 사슬 프라이머로 사용하여, 각각 PCR 시킨다. 상술된 바와같이 중폭된 DNA 단편은 뉴클레오티드 1187 을 포함하여 이로부터 상류로 뻗은 영역은 갖고 있지 않기 때문에, URS 1 은 없지만 UAS 를 유지한다. DNA 단편을 EcoRI 및 Asu II로 소화시킨 후, HSA 발현 벡터 pMM041 의 천연 AOX2 프로모터를 이들로 치환하여, 벡터 pYI070 (점변이), pYI072 (중복변이) 및 PYI071 (천연형) 을 수득한다 (제 14 및 15도).

실시예 9

올리고뉴클레오티드 (I)의 합성 및 서브클로닝과 이 뉴클레오티드를 가진 HSA 발현 벡터의 구축

AOX1 프로모터와 AOX2 프로모터의 뉴클레오티드 서열의 상동성을 조사하여 2개의 상동서열을 발견하였다 (제 16 도). 이 결과를 근거로 하여, AOX 2 프로모터에 다수의 UAS 를 포함하는 영역, 즉 뉴클레오티드 1192 - 1216, 5'- GATAGGCTATTTTTTGTCGCATAAAT - 3' 의 기능을 조사한다. 다시말해서, 뉴클레오티드 1192 - 1216 의 25 bp 단편의 양말단에 EcoRI 부위가 부가된 서열을 DNA / RNA 합성기 (모델 392, ABI제) 를 사용하여 화학 합성한다. 서열은 정사슬 5'-AATTCGATAGGCTATTTTTGTCGCATAAATG 3', 역사슬 5'- AATTCATTTATGCGACAAAAATAGCCTATCG - 3' 이다. 합성 후에, 이들을 NAP 10 컬럼 (Pharmacia 제) 으로 정제한다. 각각 약 5 μg 의 정사슬 뉴클레오티드 및 역사슬 뉴클레오티드를 혼합하고, 95 에서 5 분간 가열하고 어닐링을 위해 냉각한다. 어닐링 후에, 이것을 pUC19 의 Eco RI 부위에 서브클로닝한다.플라스미드를 pHO 103 이라 명명한다. 그의 구축을 제 17도에 나타낸다.

실시예 5에서 수득된 HSA발현 벡터 pHO060, pHO066, pHO068 및 pYI 071, 실시예 6에서 수득되고 부분적 돌연변이체 UAS 영역을 갖는 HSA 발현 벡터 pHO090 및 pHO095, 실시예 7 에서 수득된 HSA 발현벡터 pHO059 및 pHO061, 및 실시예 8 에서 수득된 HSA 발현 벡터 pYI070, pYI072 및 pYI071 을 각각 EcoRI 으로 소화시킨다.직선형 단편 및 상기 언급된 어닐링된 합성 DNA 단편 [올리고 뉴클레오티드 (I)] 을 결찰시킨다. 결찰된 단편을 사용하여, E. coli JM109 를 형질전환시킨다. 몇개의 형질 전환체로부터 플라스미드를 제조하고, 제한 효소 분석 및 DNA 시퀀싱에 의해 EcoRI 부위에 삽입된 단편을 갖는 플라스미드를 선별한다. 이어서, 여기에 삽입된 합성 DNA 서열 단편의 카피수와 방향을 DNA 시퀀싱에 의해 결정한다. 그 결과, 1 ~ 3개의 합성 서열이 각종 AOX2 프로모터로부터 상류쪽에 삽입된 HSA 발현 벡터가 스크리닝에 의해 수득된다. 수득된 벡터에 보유된 프로모터의 일부구조를 제 18 도 및 제 19 도에 나타낸다.

제 18 도 및 제 19 도에서, AOX2 프로모터의 상류쪽에 정방향으로 삽입된 합성 DNA서열 단편을 가진 HSA 발현 벡터는 HSA 발현 벡터의 이름에 접미사로서 F 를 붙여서 표시하고, 역방향으로 삽입된 HSA 발현 벡터는 접미사로서 R 을 붙여서 표시하였다.

실시예 10

단일 카피 형질전환체의 제조

구축된 HSA 발현 벡터를 StuI 으로 소화시켜 1 μg/ml 로 조절한 다음, 이것을 숙주 P. 파스토리스 GTS 115 균주의 HIS 4 영역에 통합하고, 아세트산 리튬법에 따라 ALKALICATION 효모 형질전환키트 (Bio 101)를 사용하여 이로부터 형질전환체론 제조한다. 각각의 플라스미드당 적절한 수의 콜로니를 찍어내어 보존 플레이트로서 사용되는 SD w/o a.a. 플레이트상에 도말한다. 그 위에 니트로셀룰로오스막을 놓은 YPM 한천 배지 (1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2 % 메탄올 1.5% 한천) 상에서 형질전환체를 복제시키고 72 시간동안 배양한다. 이어서, 니트로셀룰로오스막에 의해 모아진 분비된 HSA 를 항-HSA 항체를 사용한 면역 블롯팅법에 의해 정량 분석하여, HSA - 생성 균주의 1차 스크리닝을 수행한다. 수개의 HSA 생성균주로 부터 각각의 플라스미드당 DNA 를 추출하고 Bg1II 로 소화시킨다. 소화된 DNA 단편을 아가로오스겔 전기영동하고, 분리된 단편을 나일론 막으로 옮긴다음, HSAcDNA 단편을 프로브로 사용하는 서어던 블롯팅에 의해 분석한다. 전기영동에서 4.5 kb 단일밴드로서 이동하는 DNA 를 갖는것으로 확인된 형질전환체를 형질전환체로서 취하고, 여기에 단일 카피의 플라스미드를 통합시킨다.

단일 카피 형질전환체에 의한 HSA 생성을 지표로 삼아 합성된 DNA 서열의 기능을 조사한다.

단일 카피 형질전환체의 배양을 다음과 같이 수행한다. 먼저, 2ml 의 YPD (1 % 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코오스) 배지 / 시험관 내에서 29.5℃ 에서 170 rpm 으로 1 내지 3 일간 예비배양한다. 수득된 예비 배양액을 접종시에 OD 540 nm 가 0.1 이 되도록 3 ml 의 YPH (YP-2%메탄올) 배지 / 시험관에 접종하고, 29.5 에서 170 rpm 으로 72 시간동안 배양한다. 배양 72 시간에 상층액에 생성된 HSA 를 RPHA 법에 의해 결정한다. 결과를 제 18 도 및 제 19 도에 나타낸다.

pHO060 형질전환체는 2 μg/ml HSA 생성을 나타낸다. 반대로, 합성 DNA 단편이 pHO060 의 5' 상류 (URS1 으로부터 더욱 상류) 에서 정방향으로 AOX2 프로모터에 삽입되어 있는 플라스미드 pHO060F 로 형질 전환된 형질전환체는 5배 이상의 HSA 생성을 나타낸다. (10 μg/ml). pHO060F 에 의한 HSA 생성의 증가는 삽입된 합성 DNA 단편에 기인하는 것으로 추측된다. 유사한 방식으로, 합성 DNA 단편이 역방향으로 삽입되어 있는 플라스미드 pHO060R 로 형질전환된 형질 전환체는 10 μg/ml 의 HSA 생성을 나타내며, 이는 전사 증가 활성과 삽입 방향 사이에 아무런 관계가 없음을 증명하는 것이다. 5' 말단으로부터의 순서로 역방향, 정방향 및 정방향으로3 개 카피의 합성 DNA 단편이 삽입된 pHO060RFF 형질전환체는 50 μg/ml의 HSA 를 생성하며, 이는 pHO060 형질전환체의 생성에 비해 25 배 많은 양이다.

pHO060 - 유래 플라스미드에 기인한 HSA생성 - 증가 활성은 또한 pYI071, pHO066 또는 pHO068 - 유래 플라스미드 형질전환체에서도 나타낸다. 따라서, 합성 DNA 단편은 "UAS" 로서 작용하며, 그 기능은 다중 카피의 삽입에 의해 더욱더 향상된다는것을 알아내었다. 단편을 pHO068 에 삽입함에 의해 수득되는 pHO068F 를 포함한 플라스미드는 프로모터요소로서 단지 UAS 및 TATA 박스를 포함하고 있는 것으로 추측된다. 게다가, UAS 는 TATA 박스로부터 5' 말단 근처에 위치한다.

이러한 사실에도 불구하고, 플라스미드 형질 전환체는 메탄올에 의해 유도되는 충분한 HSA 생성을 나타낸다. 다시말해서, 프로모터로서 작용하는 중요한 요소는 단지 USA 및 TATA 박스이다.

합성 DNA 단편의 USA로서의 기능은 또한 pHO090 및 pHO095의 AOX 프로모터의 5' 말단에 단편이 삽입될때도 인지된다. 즉, pHO090 및 pHO095 의 경우에서, 원래의 UAS 는 특정부위 돌연변이되어 그의 기능의 대부분을 상실하며, 합성 DNA 단편의 삽입에 의해 그 기능이 회복된다.

상기 결과를 근거로하여, 합성 DHA단편은 카피 수 - 의존 방식으로 프로모터의 전사 활성을 강화시키는 것을 알아내었다. 또한 삽입방향과 강화 활성과는 무관함을 알아내었다. 또한, TATA 박스의 5' 말단으로부터 상류의 임의의 위치에 삽입하면 강화효과가 얻어진다. 이러한 결과는 합성 DNA 단편이 효모를 위한 UAS 로서 이용되기에 충분함을 나타낸다. 25 bp 합성 DNA 단편은 AOX2 프로모터의 완전한UAS 를 함유하고 있음이 명백해졌다.

실시예 11

돌연변이체 AOX2 프로모터의 글루코오스 억제

본 발명의 변이체 AOX2 프로모터의 제어하에서 HSA 를 발현시키는 모든 피키아 (Pichia) 균주를 YPM, YPD 또는 YPDM 배지에 배양시키고, HSA 발현을 지표로 삼아 프로모터에 의한 전사조절을 분석한다. 2 ml의 YPD (1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2 % 글루코오스) 배지 / 시험관 내에서 29.5 에서 170 rpm으로 1 내지 3 일간 예비배양한다. 수득된 예비 배양액을 접종시 OD 540 nm 가 0.1 이 되는 방식으로 3 ml 의 YPM (YP - 2% 메탄올) 배지/시험관, YPD 배지 / 시험관 및 YPDM (YP - 2% 글루코오스, 2% 메탄올)배지/시험관에 접종하고, 29.5 에서 170 rpm으로 96 시간동안 배양한다. RPHA 방법에 의해 HSA 생성을 결정한다.

3 종류의 배지에 있는 모든 세포에 대하여 상층액내의 세포중식과 HSA 생성을 조사한다. 대수 증식기의 말기에서 프로모터 전사 조절 요소 URS1, UAS 또는 URS2 의 존재 또는 부재에 따른 48 시간 배양시의 HSA 생성을 표 2 및 표 3 에 나타낸다. 정지기에서 프로모터 전사 조절 요소의 존재 또는 부재에 따른 72 시간 배양시의 HSA 생성을 표 4 및 표 5 에 나타낸다. 표에서, - 는 결실된 요소이고, + 는 천연 요소이고,는 인공 첨가된 요소이며, SM 는 요소의 특정부위 돌연변이이고, PM 은 요소의 점변이 (1274 번째 T 의 C 로의 변화) 이며, DH 은 요소의 중복 변이 (1294 번째 내지 1314 번째 뉴클레오티드) 이다.

표 2

표 3

표 4

표 5

그 결과, AOX2 프로모터상에서 작용가능한 UAS 가 존재할때, HSA 발현의 메탄올 유도 및 글루코오스 분해대사 억제가 글루코오스 소모 도중에는 메탄올 - 유도 HSA 발현을 억제하는 것을 알아내었다 (YPDM 배지에서 배양시, 메탄올 - 유도 HSA 생성은 글루코오스 소모 72 시간후에 일어났다).

프로모터 전사 조절 요소로서 단지 UAS 및 TATA 박스를 갖는 프로모터 (pHO068F, pHO068R 및 기타 pHO068 - 유래 플라스미드) 에서, 메탄올 유도, 글루코오스 억제 및 충분한 전사 활성이 발견되었다.

한편, UAS 가 결실되었거나 변이체 UAS 를 갖는 프로모터는 메탄올 유도를 나타내지 않고 HSA 를 거의 생산하지 않았다. 이로부터, 메탄올이 UAS 에 작용하는전사 촉진 인자의 생성을 유도한다는 것이 제안되었다.

UAS 는 존재하지만 다른 서열이 비어 있는 경우 (pHO068F) 에 글루코오스분해 대사 억제에 대해서는, 글루코오스가 우선적으로 메탄올에 의한 전사 유도 경로를 차단한다는 것이 제안되었다. 또한, 메탄올 및 글루코오스의 조절과 URS1 또는 URS2 의 존재는 무관하다. 이로부터, URS1 및 URS2 는 단지 UAS-관련 인자의 활성을 억제할 뿐, 탄소원에 의한 프로모터 전사조절에는 관여하지 않음을 알아내었다.

본 발명의 변이체 AOX2 프로모터는 천연 AOX2 프로모터에 비해 현저히 향상된 프로모터의 활성을 갖고 있다. 따라서, 본 발명의 프로모터는 이종 단백질 발현이 가능한 벡터를 위한 프로모터로서 매우 유용하다.

또한, 본 발명의 벡터는 숙주내에서 각종의 유용한 이종단백질을 효율적으로 발현 및 생산할 수 있다.

서열목록

서열번호 : 1

서열 길이 : 1528

서열 유형 : 핵산

사슬 : 이중

위상 : 선형

서열종류 : 기타핵산플라스미드 DNA

서열의 특징

특징을 나타내는 부호 : 프로모터

특징 결정 방법 : E

서열

서열번호 : 2

서열 길이 : 25

서열 유형 : 핵산

사슬 : 이중

위상 : 선형

서열종류 : 기타핵산플라스미드 DNA

서열의 특징

특징을 나타내는 부호 : 상류 활성화 서열

특징 결정 방법 : E

서열

서열번호 : 3

서열 길이 : 19

서열 유형 : 핵산

사슬 : 이중

위상 : 선형

서열종류 : 기타 핵산 추가의 DNA

서열의 특징

특징을 나타내는 부호 : 삽입 서열

특징 결정 방법 : E

서열

제 1 도는 AOX2 유전자 및 그 주변영역의 제한 효소 지도를 나타낸다. 괄호안의 숫자는 Xba I 인식 부위를 0 으로 했을때의 거리 (× 100 뉴클레오티드)를 표시한 것이다.

제 2 도는 PC4130 균주의 AOX1 유전자 영역 및 AOX2 유전자 영역을 나타낸다. 도면에서 term. 은 터미네이터를 의미하고 prom. 은 프로모터를 의미한다.

제 3 도는 pMM030 플라스미드에 클로닝된 AOX2 프로모터의 제한 효소 지도를 나타낸다. 괄호안의 숫자는 EcoRI 인식 부위를 0 으로 했을때의 거리 (× 100 뉴클레오티드) 를 표시한 것이다.

제 4 도는 pMM031 플라스미드에 클로닝된 AOX2 구조 유전자의 제한 효소 지도를 나타낸다. 괄호안의 숫자는 EcoRI 인식 부위를 0 으로 했을때의 거리 (× 100 뉴클레오티드) 를 표시한 것이다.

제 5 도는 pPG001 의 구축을 묘사한 것이다.

제 6 도는 AOX2 프로모터의 조절하에 HSA 가 발현되는 pMM041 의 구축을 묘사한 것이다. 도면에서, t. 는 터미네이터를 의미하고 p. 는 프로모터를 의미한다.

제 7 도는 HSA 발현 벡터 pMM041 의 제한 효소 지도를 나타낸다. 도면에서AOX2 p. 는 AOX2 프로모터이고, AOX1 t. 는 AOX1 터미네이터이고, prepro HSA 는 프리프로 HSA 서열이고, HSA 는 HSA cDNA이고, HIS4는 피. 파스토리스 (P. pastoris) HIS 4 유전자이고, Amp^r는 암피실린 -내성 유전자이고, pUC19 는 pUC19 - 유래의 서열이고, pBR322 는 pBR322 - 유래의 서열이다.

제 8 도는 상류 - 결실된 AOX2 프로모터에 의해 제어되는 HSA 발현 벡터를 나타낸다.

제 9 도는 특정 부위 돌연변이를 도입하기위해 사용되는 2 종류의 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, 여기에서 제일 위쪽의 뉴클레오티드 서열은 AOX2 프로모터이다. 각각의 뉴클레오티드 서열은 2 종류의 프라이머 UASp 의 이름 뒤에 나타내었으며, * 는 AOX2 프로모터의 서열과 동일함을 의미하는 것이다.

제 10 는 변이체 UAS 영역을 가진 AOX2 프로모터를 보유한 HSA 발현 벡터(예. pHO090) 의 구축을 나타낸다.

제 11 도는 변이체 UAS 영역을 가진 AOX2 프로모터를 보유한 HSA 발현 벡터(예. pHO090) 의 구축을 나타낸다.

제 12 도는 변이체 UAS 영역을 가진 AOX2 프로모터의 제어하에 있는 HSA 발현 벡터 (예. pHO090, pHO095) 를 나타낸다.

제 13 도는 URS 2 에 돌연변이를 가진 AOX2 프로모터 (뉴클레오티드 1274 ~1314, 서열목록, 서열번호 1) 의 제어하에 있는 HSA 발현 벡터의 구축을 나타낸다.

제 14 도는 URS1 이 결실되고 URS2 가 돌연변이된 AOX2 프로모터 제어하에 있는 HSA 발현벡터의 구축을 나타낸다.

제 15 도는 URS1 이 결실되고 URS2 가 돌연변이된 AOX2 프로모터 제어하에 있는 HSA 발현벡터의 구축을 나타낸다.

제 16 도는 AOX2 프로모터와 AOX1 프로모터 사이의 뉴클레오티드 서열의 상둥성을 나타낸다.

제 17 도는 추정상의 USA 서열인 서열목록, 서열번호 1 의 뉴클레오티드 서열 1192 ~ 1216 을 갖는 합성 DNA 단편을 지닌 플라스미드 pHO103 의 구축을 나타낸다.

제 18 도는 5' 말단에 UAS 서열을 추정적으로 갖는 합성 DNA 서열을 지닌 돌연변이체 AOX2 프로모터 및 이에 의해 제조된 HSA의 구조를 나타낸다. 사선무늬 화살표는 야생형 UAS 이고, 검은색 화살표는 합성된 UAS 이며, 흰색 화살표는 돌연변이된 UAS 이다 (제 19 도에 계속).

제 19 도는 5' 말단에 UAS 서열을 추정적으로 갖는 합성 DNA 서열을 지닌 돌연변이체 AOX2 프로모터 및 이에 의해 제조된 HSA 의 구조를 나타낸다.

Claims

피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 야생형 AOX2 프로모터 (서열 번호 1)의 부분 DNA 단편의 5' 말단에 1 내지 3 개의 올리고뉴클레오티드(들) GATAGGCTATTTTTGTCGCATAAAT(서열 번호 2) 가 정방향, 역방향, 또는 정방향 및 역 방향으로 첨가된 돌연변이체 AOX2 프로모터.
제 1 항에 있어서, 부분 DNA 단편이 서열목록, 서열번호 1 에 표시된 뉴클레오티드중 적어도 1325 ~ 1528 을 포함하는 돌연변이체 AOX2 프로모터.
제 1 항에 있어서, 부분 DNA 단편이 서열목록, 서열번호 1 에 표시된 뉴클레오티드중 적어도 1274 ~ 1528 을 포함하는 돌연변이체 AOX2 프로모터.
제 1 항에 있어서, 부분 DNA 단편이 서열목록, 서열번호 1 에 표시된 뉴클레오티드중 적어도 1192 ~ 1528 을 포함하는 돌연변이체 AOX2 프로모터.
제 1 항에 있어서, 부분 DNA 단편이 서열목록, 서열번호 1 에 표시된 뉴클레오티드중 적어도 845 ~ 1528 을 포함하는 돌연변이체 AOX2 프로모터.
야생형 AOX2 프로모터로부터의 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 기재된부분 DNA 단편을 부분적으로 치환, 결실 또는 첨가함으로써 수득 가능한 부분 DNA 단편의 5' 말단에 1 내지 3 개의 올리고뉴클레오티드(들) GATAGGCTATTTTTGTCGCATAAAT 를 정방향, 역방향, 또는 정방향 및 역방향으로 첨가함으로써 수득가능한 돌연변이체 AOX2 프로모터.
제 6 항에 있어서, 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항 및 제 5 항중 어느 한 항에 기재된 부분 DNA 단편의 뉴클레오티드 1274 ~ 1314 가 부분적으로 치환, 결실 또는 첨가된 돌연변이체 AOX2 프로모터.
제 6 항에 있어서, 제 1 항, 제 4 항 및 제 5 항중 어느 한 항에 기재된 부분 DNA 단편의 뉴클레오티드 1192 ~ 1215 이 부분적으로 치환, 결실 또는 첨가된 돌연변이체 AOX2 프로모터.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 야생형 AOX 2 프로모터로부터의 제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항중 어느 한 항에 기재된 부분 DNA 단편을 하기 돌연변이 형태중의 하나이상으로 변이시킨 돌연변이체 AOX2 프로모터 :

a) 1274 번째 티민을 시토신으로 치환,

b) 1314 번째 뉴클레오티드와 1315 번째 뉴클레오티드 사이에 뉴클레오티드 296 ~ 1314 의 첨가.

c) 1209 번째 구아닌을 티민으로 치환,

d) 1212 번째 티민을 구아닌으로 치환,

e) 1193 번째 아데닌을 구아닌으로 치환, 및

f) 1195 번째 아데닌을 구아닌으로 치환.
제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 기재된 돌연변이체 AOX2 프로모터를 보유한 백터.
제 10 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 기재된 돌연변이체 AOX2 프로모터의 전사 조절하에 있는 이종 단백질 구조 유전자를 포함하는 백터.
제 11 항에 있어서, 구조 유전자가 인간혈청 알부민, 프로우로키나아제, 조직 플라스미노겐 액티베이터 및 인터페론으로 구성된 군에서 선택되는 백터.
제 10 항 내지 제 12 항중 어느 한 항에 기재된 백터로 형질 전환된 형질 전환체.
제 13 항에 있어서, 숙주가 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 인 형질 전환체.
제 13 항 또는 제 14 항의 형질 전환체를 배양하고, 그 배양액으로 부터 이종 단백질을 수집함을 특징으로 하는 이종 단백질의 제조방법.