JP3505743B2 - 変異型ａｏｘ２プロモーター、それを担持するベクター、形質転換体および異種蛋白質の製造方法 - Google Patents

変異型ａｏｘ２プロモーター、それを担持するベクター、形質転換体および異種蛋白質の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、異種蛋白遺伝子を発現
する上で好適に使用される変異型ＡＯＸ２プロモータ
ー、該プロモーターを担持するベクター、該ベクターを
導入してなる形質転換体、および該形質転換体を培養す
ることを特徴とする異種蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え技術の分野においては、遺
伝子の発現量及び目的蛋白質の産生量の増大を目的とし
て、従来から遺伝子発現システムの改良、開発が行われ
ている。メタノール資化性酵母を宿主とする発現系は、
このような異種蛋白質遺伝子発現システムとして興味が
もたれている系である。
【０００３】メタノール資化性酵母はメタノールを単一
の炭素源、及びエネルギー源として増殖することが可能
な酵母である。それは、この酵母がメタノールの代謝機
構における第一番目の反応、即ちメタノールを酸化して
ホルムアルデヒドとする反応を触媒する酵素であるアル
コールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．Ｂ、以下ＡＯＸ
ともいう。）をコードする遺伝子を有していることによ
る。
【０００４】ピキア酵母(Pichia pastoris) はメタノー
ル資化性酵母の一つであり、これはＡＯＸ１遺伝子及び
ＡＯＸ２遺伝子の二種類のＡＯＸ系遺伝子を持ってい
る。それらの遺伝子はそれぞれ５’末端側の非翻訳領域
に独自のプロモーターをもつことが知られているが（Ａ
ＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター）、強い転
写活性を有するＡＯＸ１プロモーターに比べて、ＡＯＸ
２プロモーターの転写活性は極めて低く、実際に発現、
産生されているアルコールオキシダーゼはＡＯＸ１遺伝
子由来のものであるとされている [Molecular and Cell
ular Biology, Vol.9, 1316(1989)]。
【０００５】従来、ピキア酵母を用いた異種蛋白質の生
産には、転写活性の強いＡＯＸ１プロモーターが使用さ
れている。また最近、このＡＯＸ系遺伝子の調節領域を
用いて異種蛋白質を生産する方法が研究されている（Ye
ast, 5, 167-177(1989) 、特開平1-128790号、同2-1042
90号公報、ヨーロッパ公開公報347928等) が、更にその
発現量を増幅させるために、強力な転写活性を有するプ
ロモーターの開発が求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、異種
蛋白質を大量に産生する上で有用な高い転写活性を有す
るプロモーター、該プロモーターを担持したベクター、
及び該ベクターを導入した形質転換体を提供することで
ある。さらに本発明は、該形質転換体を培養することに
よる異種蛋白質の製造方法を確立することを目的とする
ものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、転写活性
の高いプロモーターを開発する目的で鋭意研究を重ねた
結果、野生型ＡＯＸ２プロモーターの部分的ＤＮＡ断片
の上流域に特定塩基配列からなるヌクレオチドを挿入し
て得られるＤＮＡ断片をプロモーターとして利用するこ
とによって、その下流域に位置する異種蛋白遺伝子を効
率良く発現させうることを見出し、更に研究をすすめて
本発明を完成した。
【０００８】即ち、本発明は、配列表の配列番号１の塩
基配列を有する野生型ＡＯＸ２プロモーターの部分的Ｄ
ＮＡ断片の５’末端側に新たにＧＡＴＡＧＧＣＴＡＴＴ
ＴＴＴＧＴＣＧＣＡＴＡＡＡＴの塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチド〔配列表，配列番号２；以下、オリゴヌ
クレオチド(I) という。〕が１〜３個正方向または逆方
向に付加してなる変異型ＡＯＸ２プロモーターを提供す
るものである。
【０００９】また本発明は、この変異型ＡＯＸ２プロモ
ーターを担持してなるベクター、該ベクターを導入して
なる形質転換体、及び該形質転換体を培養することを特
徴とする異種蛋白質の製造方法に関する。
【００１０】本発明の完成にあたり、まず、野生型ＡＯ
Ｘ２プロモーターの機能を解析した。その結果、プロモ
ーター転写活性を上昇させる部位（以下、ＵＡＳ領域と
いう。）および抑制する部位２カ所（以下、ＵＲＳ１領
域およびＵＲＳ２領域という。）およびＴＡＴＡ領域の
位置を確認することができた。すなわち本発明において
は、以下野生型ＡＯＸ２プロモーター（配列表，配列番
号１）中の塩基番号８４５〜９６０からなる領域をＵＲ
Ｓ１領域、塩基番号１１９２〜１２１６からなる領域を
ＵＡＳ領域、塩基番号１２７４〜１３１４からなる領域
をＵＲＳ２領域、塩基番号１３２５〜１３３０からなる
領域をＴＡＴＡ領域という。
【００１１】なお以下特に断らない限り、塩基番号とい
う場合、野生型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列（配列
表，配列番号１）における塩基番号をいうものとする。
【００１２】本発明において野生型ＡＯＸ２プロモータ
ーの部分的ＤＮＡ断片とは、野生型ＡＯＸ２プロモータ
ーのある領域を欠失してなるＤＮＡ断片をいう。例え
ば、以下の態様が挙げられる。 野生型ＡＯＸ２プロモーターのＵＲＳ１領域より上流
側に位置する領域を欠失したもの〔以下、部分的ＤＮＡ
断片という。ＵＲＳ１領域、ＵＡＳ領域、ＵＲＳ２領
域およびＴＡＴＡ領域を含有する）。欠失する領域は、
ＵＲＳ１領域より上流側に位置する領域であれば特に限
定されない。
【００１３】野生型ＡＯＸ２プロモーターのＵＲＳ１
領域を含めてＵＡＳ領域より上流側に位置する領域を欠
失したもの〔以下、部分的ＤＮＡ断片という。ＵＡＳ
領域、ＵＲＳ２領域およびＴＡＴＡ領域を含有する〕。
欠失する領域は、ＵＲＳ１領域を含んでＵＡＳ領域より
上流側に位置する領域であれば特に限定されない。
【００１４】野生型ＡＯＸ２プロモーターのＵＲＳ１
領域およびＵＡＳ領域を含めてＵＲＳ２領域より上流側
に位置する領域を欠失したもの〔以下、部分的ＤＮＡ断
片という。ＵＲＳ２領域およびＴＡＴＡ領域を含有す
る。〕。欠失する領域は、ＵＲＳ１領域領域およびＵＡ
Ｓ領域を含んでＵＲＳ２領域より上流側に位置する領域
であれば特に限定されない。
【００１５】野生型ＡＯＸ２プロモーターのＵＲＳ１
領域、ＵＡＳ領域およびＵＲＳ２領域を含めてＴＡＴＡ
領域より上流側に位置する領域を欠失したもの〔以下、
部分的ＤＮＡ断片という。ＴＡＴＡ領域を含有す
る。〕。欠失する領域は、ＵＲＳ１領域領域、ＵＡＳ領
域およびＵＲＳ２領域を含んでＴＡＴＡ領域より上流側
に位置する領域であれば特に限定されない。
【００１６】なお、本発明でいう部分的ＤＮＡ断片は、
野生型ＡＯＸ２プロモーターに由来する塩基配列の一部
が置換，欠失または付加変異されていてもよい。置換，
欠失または付加箇所およびその数は特に限定されず、Ｕ
ＲＳ１領域、ＵＡＳ領域もしくはＵＲＳ２領域中であっ
ても、またそれ以外の領域であってもよい。
【００１７】一例として、次の変異態様が挙げられる。 (a)ＵＲＳ２領域にある塩基配列の一部が置換されてい
る場合 置換位置は、ＵＲＳ２領域内であれば特に制限されな
い。この範囲において、置換される塩基数（ヌクレオチ
ド数）は１つでもそれ以上でもよく、また置換される部
位は１カ所でも数カ所でもよい。具体的には塩基番号１
２７４位に配位するチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置
換されたものが挙げられる。
【００１８】(b)ＵＲＳ２領域において新たなオリゴヌ
クレオチドが付加されている場合。 付加部位はＵＲＳ２領域内であれば、特に制限されな
い。その範囲において付加されるヌクレオチドはいくつ
でもよく、また付加される部位は１カ所でも数カ所でも
よい。具体的には塩基番号１３１４位と１３１５位のヌ
クレオチドとの間に塩基番号１２９６〜１３１４に相当
する１９ｂｐのオリゴヌクレオチド（塩基配列表、配列
番号３）が重複して挿入されてなるものが挙げられる。
【００１９】(c)ＵＡＳ領域にある塩基配列の一部が置
換されている場合 置換位置は、ＵＡＳ領域内であれば特に制限されない。
この範囲において、置換される塩基数（ヌクレオチド
数）は１つでもそれ以上でもよく、また置換される部位
は１カ所でも数カ所でもよい。具体的には塩基番号１２
０９位に配位するグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に、か
つ塩基番号１２１２位に配位するチミン（Ｔ）がグアニ
ン（Ｇ）に置換されたもの、塩基番号１１９３位および
１１９５位に配位するアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）
にそれぞれ置換されたものが挙げられる。
【００２０】本発明の変異型ＡＯＸ２プロモーターは、
野生型ＡＯＸ２プロモーターの部分的ＤＮＡ断片の５’
末端側にオリゴヌクレオチド(I)が正方向もしくは逆方
向に付加したものである。
【００２１】オリゴヌクレオチド(I) が正方向に付加す
るとは、上流域を欠失したＡＯＸ２プロモーターの５’
末端側にオリゴヌクレオチド(I) が５’−ＧＡＴＡＧＧ
ＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＡＴＡＡＡＴ−３’となる
ように配位することを意味する。また、オリゴヌクレオ
チド(I) を逆方向に付加するとは、上流域を欠失したＡ
ＯＸ２プロモーターの５’末端側にオリゴヌクレオチド
(I) が３’−ＧＡＴＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣ
ＡＴＡＡＡＴ−５’となるように配位することを意味す
る。
【００２２】本発明の変異型ＡＯＸ２プロモーターとし
て、具体的には以下の態様のものが例示される。部分
的ＤＮＡ断片の５’末端側にオリゴヌクレオチド(I)
が正方向もしくは逆方向に付加したもの。例えば、塩基
番号７２６〜１５２８からなるＡＯＸ２プロモーターの
部分的断片の５’末端側にオリゴヌクレオチド(I)が正
方向もしくは逆方向に付加したものが挙げられる。
【００２３】部分的ＤＮＡ断片の５’末端側にオリ
ゴヌクレオチド(I) が正方向もしくは逆方向に付加した
もの。例えば、塩基番号１０６３〜１５２８からなるＡ
ＯＸ２プロモーターの部分的断片の５’末端側にオリゴ
ヌクレオチド(I) が正方向もしくは逆方向に付加したも
の, および塩基番号１１８８〜１５２８からなるＡＯＸ
２プロモーターの部分的断片の５’末端側にオリゴヌク
レオチド(I) が正方向もしくは逆方向に付加したものが
挙げられる。
【００２４】部分的ＤＮＡ断片の５’末端側にオリ
ゴヌクレオチド(I) が正方向もしくは逆方向に付加した
もの。例えば、塩基番号１２５６〜１５２８からなるＡ
ＯＸ２プロモーターの部分的断片の５’末端側にオリゴ
ヌクレオチド(I) が正方向もしくは逆方向に付加したも
のが挙げられる。
【００２５】部分的ＤＮＡ断片の５’末端側にオリ
ゴヌクレオチド(I) が正方向もしくは逆方向に付加した
もの。例えば、塩基番号１３１５〜１５２８からなるＡ
ＯＸ２プロモーターの部分的断片の５’末端側にオリゴ
ヌクレオチド(I) が正方向もしくは逆方向に付加したも
のが挙げられる。
【００２６】本発明の変異型ＡＯＸ２プロモーターは、
上述の態様で上流域を欠失したＡＯＸ２プロモーターの
部分的ＤＮＡ断片の５’末端側にオリゴヌクレオチド
(I) を連結状に複数個、好ましくは２〜３個含有してい
てもよい。また、複数含有されるオリゴヌクレオチド
(I) の塩基配列の方向性も問わず、正方向でも逆方向で
もよく、さらには正逆が混合してなるものであってもよ
い。
【００２７】本発明の（１）変異型ＡＯＸ２プロモータ
ー、（２）該プロモーターを担持してなるベクター、及
び（３）該ベクターを導入してなる形質転換体は、例え
ば次のようにして調製される。
【００２８】（１）変異型ＡＯＸ２プロモーター 本発明の変異型ＡＯＸ２プロモーターは、野生型ＡＯＸ
２プロモーターを遺伝子工学的手法によって処理した部
分的ＤＮＡ断片の５’末端側に化学合成したオリゴヌク
レオチド(I) を付加することによって調製することがで
きる。ここで部分的ＤＮＡ断片は、具体的には、野生型
ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列のある部位を、欠失、
置換または新たなる塩基を付加処理することによって調
製される。この処理は、通常の遺伝子工学的手法による
ことができ、例えば部位指定削除法〔Site-directed de
letion, Nucl. Acids Res., 11, 1645(1983)〕、部位特
異的変異法〔Site-directed Mutagenesis 〕、制限酵素
処理、合成遺伝子の利用による方法、ＰＣＲ法などが挙
げられる。
【００２９】また、本発明で示す変異型ＡＯＸ２プロモ
ーターの塩基配列に基づいて、化学的に合成することに
よっても得ることができる。
【００３０】更に、ＡＯＸ１遺伝子が遺伝子工学的に破
壊されており、残存するＡＯＸ２遺伝子のみからアルコ
ールオキシダーゼを発現、産生させるために、メタノー
ル資化能が低い菌株をメタノールを単一の炭素源とする
培地で継代培養を行うことにより変異させ、その結果メ
タノール資化能が上昇した菌株（Super High Grade Str
ain:ＳＨＧ株）から、ＡＯＸ２プロモーターの一部が変
異した部分的ＤＮＡ断片を得て、その５’末端側に化学
合成したオリゴヌクレオチド(I) を付加することによっ
て、本発明の変異型ＡＯＸ２プロモーターを調製するこ
ともできる。
【００３１】（２）(i) 組換えベクターの構築 上記で得られた変異型ＡＯＸ２プロモーターは適当なプ
ラスミドベクターまたはファージベクターの中に挿入さ
れ、異種蛋白質を発現するためのベクターとして使用さ
れる。
【００３２】当該プロモーターの各種プラスミド、ファ
ージへの挿入は、ＤＮＡ組換えの一般方法、例えば Mol
ecular Cloning.(1989), (Cold Spring Harbor Lab.)に
記載の方法に従って行うことができる。
【００３３】(ii)組換え発現ベクターの構築 上記で得られる組換えベクター中の、変異型ＡＯＸ２プ
ロモーターの３’側下流域に翻訳開始コドンを介して、
所望の異種蛋白遺伝子を挿入することによって、変異型
ＡＯＸ２プロモーター支配下で異種蛋白遺伝子が発現す
る本発明の組換え発現ベクターを構築することができ
る。または、上記の組換えプラスミドベクターまたはフ
ァージベクターから、制限酵素によって本発明の変異型
ＡＯＸ２プロモーターを切り出し、異種蛋白遺伝子を構
造遺伝子領域にもつベクターのプロモーター領域に、制
限酵素とＤＮＡリガーゼなどを用いて組み込むことによ
ってもよい。
【００３４】詳しくは、本発明のベクターは異種蛋白質
を効率よく発現させるために、転写の下流方向順に必要
により(1) 変異型ＡＯＸ２プロモーター、(2) リボソー
ム結合部位、(3) 翻訳開始コドン、(4) シグナルペプチ
ドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ、(5) 異種蛋白質
をコードする塩基配列をもつＤＮＡ、(6) 翻訳終始コド
ン、(7) ターミネーター、(8) 選択マーカー遺伝子、
(9) 宿主中で自己複製可能な自律性複製配列、(10)相同
領域等をふくむように構築される。
【００３５】構造遺伝子としては、所望の異種蛋白質
（例えば、ヒト血清アルブミン、プロウロキナーゼ、組
織プラスミノーゲンアクチベーター、Ｂ型肝炎表面抗
原、各種インターフェロン等）をコードする遺伝子であ
れば特に制限はなく、またいかなる方法で得られるもの
であってもよい。例えばｍＲＮＡから合成されたｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、これらを適
当に組み合わせて構築したＤＮＡなどが挙げられる。具
体的には、ＨＳＡ構造遺伝子、ＡＯＸ１構造遺伝子、Ａ
ＯＸ２構造遺伝子などが例示される。
【００３６】上記構造遺伝子の５’末端側に、翻訳開始
コドンとしてＡＴＧを配していてもよい。また、３’末
端側に翻訳終止コドンを配していてもよい。翻訳終止コ
ドンとしては、ＴＡＡ、ＴＧＡ、またはＴＡＧが例示さ
れる。これらそれぞれのコドンは、必要に応じてその各
領域において１つ以上組み合わて配列されてもよく、こ
れらに特に限定はない。
【００３７】ターミネーターとしては、目的とする異種
蛋白質をコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に
対応したものであれば特に制限はない。例えばＡＯＸ１
ターミネーターまたはＡＯＸ２ターミネーター等が挙げ
られる。
【００３８】選択マーカー遺伝子として、抗生物質耐性
遺伝子または栄養要求性遺伝子などが例示される。一般
に宿主が細菌である場合、抗生物質耐性遺伝子を用いる
ことができ、抗生物質耐性遺伝子としてはシクロヘキシ
ミド耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフ
ェニコール耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ハ
イグロマイシン耐性遺伝子、Ｇ−４１８耐性遺伝子等が
例示される。また、宿主がそれ以外の例えば酵母等の場
合、栄養要求性遺伝子を用いることができ、栄養要求性
遺伝子としてはＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ
４等が例示される。これらの選択マーカーは、１種また
は２種以上組み合わせて該ベクターの適切な位置に含有
されることが好ましい。
【００３９】また、宿主染色体上に導入するための相同
領域として、具体的にはＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ
２、ＡＲＧ４、ＴＲＰ１等が例示される。
【００４０】また本発明のベクターは、本発明の変異型
ＡＯＸ２プロモーターを連結状に複数個、即ち直列状二
量体、三量体等として含有していてもよい。この場合、
該プロモーター間に翻訳開始コドンを有さないものが好
ましい。
【００４１】（３）形質転換体とその培養 本発明の形質転換体は、上記で得られた組換え発現ベク
ターを適当な宿主細胞に導入することによって調製され
る。
【００４２】詳細には、上述（２）の組換え発現ベクタ
ーを公知の方法、例えばコンピテント細胞法(J. Mol. B
iol., 53, 154, 1970)、プロトプラストポリエチレン融
合法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978)
、リチウムアセテート法（J.Bacteriol., 153, 163, 1
983)、リン酸カルシウム法 (Science, 221, 551, 198
3) 、ＤＥＡＥデキストラン法 (Science, 215, 166, 1
982) 、電気パルス法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
1, 7161, 1984）、インビトロパッケージング法（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975 ）、ウイルス
ベクター法（Cell, 37, 1053, 1984）、またはマイクロ
インジェクション法（Exp. Cell. Res., 153, 347, 198
4)などによって宿主に導入することによって作製され
る。
【００４３】使用される宿主としては、大腸菌、枯草
菌、酵母などの微生物が挙げられるが、好ましくは酵
母、より好適にはピキア酵母である。具体的にはＧＴＳ
１１５（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）等が例示さ
れる。
【００４４】ベクターの宿主細胞中での存在様式は、染
色体中に挿入されて、あるいは置換されて組み込まれ
る。またはプラスミド状態で存在してもよい。宿主に導
入される外来遺伝子のコピー数は１コピーでも複数であ
ってもよい。
【００４５】このようにして得られた形質転換体は、目
的とする組換え異種蛋白質を産生させるためにその宿主
に応じて適切な公知培地中で培養することができる。培
地には該形質転換体の生育に必須な炭素源、窒素源、無
機物、ビタミン、薬剤などが含有される。
【００４６】培地の一例としては、形質転換体の宿主が
大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地（J. E
xp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, Ne
w York, 1972. p.431)などが、また宿主が酵母の場合、
ＹＰＤ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto P
eptone, ２％ Glucose）、ＹＰＧ培地（１％ Bacto Yea
st Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Glycerol ）、
ＹＰＭ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto P
eptone, ２％ Methanol)、ＹＰＤＭ培地（１％Bacto Ye
ast Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Dextrose,２
％ Methanol)、０．１〜５％メタノールを含有したＹＮ
Ｂ液体培地〔０．７％ Yeast NitrogenBase(Difco
社）〕、及び０．０１〜５％メタノールを含有したＹＰ
培地〔１％ Bacto Yeast Extract(Difco社) , ２％ Pol
y Peptone(大五栄養社）〕、及びＳＭＭ培地 (２％ Met
hanol,０．５％ CH 3 COONH 4 -synthetic medium)など
が例示される。
【００４７】培養は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは
３０℃前後で２０〜３６０時間程度実施され、必要に応
じて通気、攪拌を加えることもできる。培養液のｐＨは
５〜８の範囲が好ましい。
【００４８】培養後、培養上清中または形質転換体中に
蓄積された目的の異種蛋白質は公知の方法で抽出、精製
される。例えば、塩析法、溶媒沈澱法、透析法、限外濾
過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の手
法を組み合わせて分離精製することができる。
【００４９】なお、本発明において使用する多くの技
法、反応及び分析方法は当業者らに自体周知のものであ
る。また、酵素、プラスミド、宿主等は商業的に入手で
きるものである。
【００５０】
【実施例・実験例】本発明をより詳細に説明するため
に、以下に実施例及び実験例を挙げるが、本発明はこれ
らにより何ら限定されるものではない。
【００５１】以下の実施例及び実験例で使用した全ての
酵素は、特に断らない限り商業的供給源、例えば宝酒造
株式会社等から入手したものである。
【００５２】酵素反応のための緩衝液及び反応条件は特
に断らない限り各酵素の製造元の推奨に従って使用し
た。
【００５３】ピキアパストリス(Pichia pastoris) ＧＴ
Ｓ１１５、ＰＣ４１３０、ＰＣ４１０５およびプラスミ
ドｐＰＧＰ１はフィリップス・ペトロリウム社から入手
した。
【００５４】ベクターとしてプラスミドを使用した大腸
菌の形質転換法、プラークハイブリダイゼーション法、
及び電気泳動法は「モレキュラークローニング」コール
ドスプリングハーバーラボラトリー〔「Molecular Clon
ing 」Cold Spring Harbor Laboratory(1982) 〕に記載
されている方法により行った。
【００５５】実施例１ ＡＯＸ２遺伝子のクローニン
グ、及び組換えベクターの取得 ＡＯＸ２遺伝子付近の配列及び制限酵素地図は Creggら
Mol. Cell. Biol, 9,1316-1323(1989)及び Koutzら YE
AST, 5, 167-177(1989)によって報告されており、それ
らを参考にしてＡＯＸ２遺伝子のクローニングを計画し
た。ＡＯＸ２遺伝子付近の制限酵素地図を図１に示し
た。
【００５６】まず、ＰＣ４１３０株より Cameronらの方
法〔 Nucleic Acids Res., 4, 1429(1977) 〕により染
色体ＤＮＡを抽出精製した。なお、ＰＣ４１３０株はＧ
ＴＳ１１５（ＨＩＳ４）のＡＯＸ１遺伝子領域の一部
を、ｐＰＧＰ１プラスミド（ＡＯＸ１プロモーター支配
下にＨＳＡが発現する転写ユニットをもつプラスミド）
をＮｏｔＩで切断した断片と置換してなる遺伝子領域を
もつものである（図２）。この染色体ＤＮＡをＡＯＸ２
プロモーター領域、ＡＯＸ２構造遺伝子及びＡＯＸ２タ
ーミネーター領域が完全に含まれるように制限酵素Ｘｂ
ａＩとＰｓｔＩで完全に消化を行った。得られたＤＮＡ
断片をエタノール沈澱し、遠心して乾燥後に滅菌水に溶
かし、ＥｃｏＲＩメチラーゼ（宝酒造製）を添加し反応
させた。ＴＥ飽和フェノール・クロロホルム抽出、続い
てクロロホルム抽出を行い、水層についてエタノール沈
澱を行い、遠心、乾燥後に滅菌水に溶解した。ＤＮＡブ
ランティングキット（宝酒造製）を用いてＤＮＡ断片の
末端を平滑化し、そこにＥｃｏＲＩリンカー d(pG-G-A-
A-T-T-C-C)（宝酒造製）をＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造製）を使用してライゲーションした。再度エタ
ノール沈澱を行い、遠心、乾燥後に滅菌水に溶かし、Ｅ
ｃｏＲＩを加え３７℃１時間インキュベーションした。
１％アガロース電気泳動で４〜５Kbに相当する領域を切
り出し、GENE CLEAN II(BIO 101 社製) による溶出精製
を行ってＤＮＡを回収し、滅菌水に溶かした。
【００５７】精製されたＤＮＡ断片をλgt10 arms (Pro
toclone TM System ：プロメガ社製) とライゲーション
し、Gigapack-GOLD3（ストラタジーン社製) を用いてイ
ンビトロパッケイジングを行った。その組換えファージ
をＡ600 ＝２に調製しておいたE.coli C600hfl株に吸着
させ、ＮＺＹプレート（１％ＮＺアミン、０．５％塩化
ナトリウム、０．５％イーストエキストラクト、０．０
２％硫酸マグネシウム、１．５％寒天末）に、１プレー
トに約５００個ずつのプラークが生じるように蒔いた。
生じたプラークのうち、上記のＤＮＡ断片を含有してな
るクローン（ポジティブクローン）をコロニーハイブリ
ダイゼーション法にて選択、取得した。即ち、４枚のナ
イロンメンブランColony/Plaque Screen TM （ＮＥＮ
製）を用いて、プラークをメンブランに移行させ、変成
・中和・固定処理を行った。プローブとして、Pichia p
astoris由来のＡＯＸ１構造遺伝子前半分に当たる部分
をＥｃｏＲＶとＢａｌIIとで消化し得られた断片をラン
ダムプライマーラベリングキット( 宝酒造製) を用いて
32Ｐ標識して用いた。プレハイブリダイゼーションは１
％ＢＳＡ、１ｍＭＥＤＴＡ、0.5 M NaH 2 PO4 (pH7.2)
、７％ＳＤＳ溶液中６５℃で５分間行った。ハイブリ
ダイゼーションは１％ＢＳＡ、１ｍＭＥＤＴＡ、0.5 M
NaH 2 PO4 (pH7.2) 、７％ＳＤＳ、32Ｐ−プローブ溶液
中６５℃、一夜行った。その後 0.5 M NaH 2 PO 4 (pH
7.2)溶液中で室温１０分間インキュベートして洗浄し、
更に0.5 % ＢＳＡ、１mMＥＤＴＡ、40 mM NaH 2 PO4 (p
H7.2) 、５％ＳＤＳ溶液中で３７℃３０分間３回インキ
ュベートした。フィルターを風乾し、Ｘ線フィルム露光
カセット中Ｘ線フィルムと合わせて−８０℃１６時間放
置し、オートラジオグラフィーを行った。その結果、２
個のポジティブクローンが得られた。その内の１クロー
ンについてファージの増殖を行い、ファージＤＮＡを抽
出した。該ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電
気泳動で目的の断片（1.5Kb と 2.9Kb )が生じているこ
とを確かめた。
【００５８】一方、選択マーカーとしてアンピシリン耐
性遺伝子を持つプラスミドｐＵＣ１９（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリー社製) をＥｃｏＲＩで切断し、アル
カリフォスファターゼ処理した断片を作製、回収した。
そのプラスミドのＥｃｏＲＩ切断部位に、先のファージ
から回収してＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡ断片とをライゲ
ーションしてプラスミドベクターを構築し、E.coli HB1
01に導入して形質転換体を作製した。その形質転換体を
４０μg/mLアンピシリン含有Ｌプレート（トリスベース
０．６２ｇ、ポリペプトン１０ｇ、イーストエキストラ
クト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを水に溶解し、１Ｌに調
整した後に１５ｇの寒天末を加えてオートクレーブ滅菌
する。冷却後アンピシリンを添加し、プラスチックシャ
ーレに分注固化してプレートとする。）に蒔き、３７℃
一夜培養した。生じたコロニーをスクリーニング（ミニ
プレップして、ＥｃｏＲＩ消化断片を確認した。）し
て、１．５ｋｂと２．７ｋｂの断片がｐＵＣ１９に挿入
されたクローンが得られていることを確認した。そのク
ローンを４０μg/mLアンピシリン含有スーパーブロス(
バクトトリプトン１２ｇ、イーストエキストラクト２４
ｇ、グリセロール５ｍＬを水に溶解し、９００ｍＬとし
てオートクレーブ滅菌したＡ液、及びリン酸２水素カリ
ウム３．８１ｇ、リン酸１水素カリウム１２．５ｇを水
に溶解して１００ｍＬとしてオートクレーブ滅菌したＢ
液とを９：１（ｖ／ｖ）の割合で混合した培養基）中、
３７℃、一夜振盪培養し、アルカリ−ＳＤＳ法にてプラ
スミドＤＮＡを大量に抽出精製した。ＡＯＸ２プロモー
ター領域を含むプラスミドをｐＭＭ０３０（図３参
照）、ＡＯＸ２構造遺伝子及びターミネーターを含むプ
ラスミドをｐＭＭ０３１（図４参照）と命名した。これ
らのプラスミドの各種制限酵素消化により生じる断片の
大きさは報告されているパターンと一致していた。
【００５９】実施例２ ＡＯＸ２プロモーター領域の
塩基配列決定 実施例１において得られたプラスミドベクターｐＭＭ０
３０をＥｃｏＲＩで消化した。得られた１．５ｋｂ断片
を回収し、そのＤＮＡ断片をＤＮＡブランティングキッ
ト（宝酒造製）で処理して、平滑末端を有するＤＮＡ断
片を得た。一方、プラスミドｐＵＣ１９をＸｂａＩ消
化、マングビーンヌクレアーゼ（宝酒造製）処理、及び
アルカリフォスファターゼ処理を施し、そのＸｂａＩ切
断部位に先に得られたＤＮＡ断片をライゲーションし
た。この操作によりＡＯＸ２プロモーター領域ＤＮＡが
それぞれｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位にサブクローニング
されたプラスミドが得られた。これらのプラスミドをキ
ロシークエンス用デレーションキット（宝酒造製）を用
いて処理し、１５０〜３００ｂｐずつインサートサイズ
が異なるデレーションミュータントを５〜６クローン作
製した。これらのデレーションミュータントの塩基配列
をＭ１３ジデオキシシークエンスキット（宝酒造製）を
用いて決定した。その結果、ＡＯＸ２プロモーター領域
のＡＴＧから上流１．５ｋｂの全塩基配列が決定され
た。
【００６０】実施例３ ＡＯＸ２プロモーターにより支
配されるＨＳＡ発現ベクターの構築 ｐＰＧＰ１をＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡブランティング
キット（宝酒造製）を用いて末端を平滑化した。そこに
ＥｃｏＲＩリンカーｄ（ｐＧ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ
−Ｃ）（宝酒造製）をライゲーションした。ＳｐｈＩに
よる完全な消化及びＥｃｏＲＩによる部分消化を行い、
６．５ｋｂ断片を回収・精製した。ｐＵＣ１９をＥｃｏ
ＲＩ及びＳｐｈＩで消化し、アルカリフォスファターゼ
処理の後、前記断片をライゲーションし、ｐＵＣ１９に
ＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現し、ＨＩＳ
４を選択マーカーに持つプラスミドｐＰＧ００１を得た
（図５参照）。ｐＰＧ００１をＥｃｏＲＩで部分消化
し、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造製）を用いて
末端を平滑化した。一方、アプライドバイオシステム社
製ＤＮＡ合成機モデル３８１Ａを用いてホスホアミダイ
ト法によってＧＧＧＡＴＣＣＣの配列を持つＢａｍＨＩ
リンカーを合成した。これをＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造製）によりリン酸化し、先に平滑化処理し
た断片とライゲーションした。ＡｓｕII及びＢａｍＨＩ
で消化し、７．１ｋｂ断片を精製した。一方、ｐＰＧＰ
１をＨｉｎｄIII で消化し、DNA ブランティングキット
（宝酒造製）を用いて末端を平滑化した。そこにＢａｍ
ＨＩリンカーｄ（ｐＧ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ）
（宝酒造製）をライゲーションし、ＡｓｕII及びＢａｍ
ＨＩで消化し、１．９ｂｐ断片を精製した。前出の７．
１ｋｂ断片とライゲーションし、ｐＰＧ００２を得た
（図６参照）。
【００６１】ｐＭＭ０３０をＥａｅＩで消化し、１．５
ｋｂの断片を回収した。マングビーンーヌクレアーゼ
（宝酒造製）処理により末端を平滑化した。そこにアプ
ライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成機モデル３８１Ａ
を用いてホスホアミダイト法にてＣＴＴＣＧＡＡＧの配
列をもつＡｓｕIIリンカーを合成した。これをＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）によりリン酸化し、
先に平滑化処理した断片とライゲーションした。それを
ＥｃｏＲＩ及びＡｓｕIIで消化し、1.5kb のＡＯＸ２プ
ロモーター領域断片を回収した。一方、ＡＯＸ１プロモ
ーター支配下にＨＳＡが発現し、ＨＩＳ４領域を持つプ
ラスミドｐＰＧ００２をＥｃｏＲＩおよびＡｓｕIIで消
化し、ＡＯＸ１プロモーター領域を除いた８．１ｋｂ断
片をアルカリフォスファターゼ処理を行った後に回収し
た。ＡＯＸ２プロモーター領域１．５Ｋｂ断片とライゲ
ーションし、ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡが発
現するプラスミドｐＭＭ０４１を作製した（図６参
照）。ｐＭＭ０４１の制限酵素地図を図７に示す。
【００６２】実施例４ 上流領域を欠失したＡＯＸ２プ
ロモーター遺伝子のＰＣＲ法による増幅 翻訳開始点ＡＴＧ上流領域の長さが８０３ｂｐ、４６２
ｂｐ、３４１ｂｐ、２７３ｂｐ、２１４ｂｐのＡＯＸ２
プロモーター断片をその５’末端にＥｃｏＲＩサイト、
３’末端にＡｓｕIIサイトを付加してＰＣＲ法で増幅で
きるようにプライマーの配列を設計し、３９２型ＤＮＡ
／ＲＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステム社
製）を用いてホスホアミダイト法にて合成し、ＮＡＰ１
０カラム（ファルマシア製）により精製した。それぞれ
の配列を表１に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】正鎖のいずれかと逆鎖のプライマーＰＣＲ
−ＲＶを用いて、ピキアパストリスの染色体ＤＮＡに対
してＰＣＲを行った。ＰＣＲ装置には、パーキンエルマ
ーＤＮＡサーマルサイクラー（シータス製）を用い、試
薬は GeneAmpTMＤＮＡアンプリフィケーションキット
（宝酒造製）を用いた。反応液に混在する低分子をウル
トラフリーＣ３ＴＫ（ミリポア製）により除去したもの
を精製ＰＣＲ産物とした。
【００６５】実施例５ 上流欠失型ＡＯＸ２プロモータ
ーにより支配されるＨＳＡ発現ベクターの構築 ＨＳＡ発現ベクターｐＭＭ０４１をＥｃｏＲＩ及びＡｓ
ｕIIで二重消化してアガロースゲル電気泳動により天然
型ＡＯＸ２プロモーター分離、除去し、ベクター部分に
実施例４で得られたＥｃｏＲＩ及びＡｓｕIIで二重消化
した精製ＰＣＲ産物を挿入したプラスミドを作製した。
挿入されたＤＮＡ断片が上流領域を欠失したＡＯＸ２プ
ロモーター遺伝子であることを確認するために、ＡＬ
Ｆ．ＤＮＡシーケンサー（ファルマシア製）を用いて、
蛍光標識プライマーによるダイデオキシ法で塩基配列の
決定を行った。蛍光プライマーはユニバーサルプライマ
ー（ファルマシア製）を、反応キットはオートリードシ
ーケンシングキット（ファルマシア製）を用いた。その
結果、作製したプラスミドはすべて当初の設計どおり、
上流領域を欠失したＡＯＸ２プロモーターにより支配さ
れるＨＳＡ発現ベクターであることが確認された。プラ
イマーＰＣＲ６０を用いて得たＡＴＧ上流領域の長さが
８０３ｂｐ（プロモーターの５’末の塩基番号は７２
６）のＨＳＡ発現ベクターをｐＨＯ０６０、プライマー
ＰＣＲ６５を用いて得たＡＴＧ上流領域の長さが４６２
ｂｐ（プロモーターの５’末の塩基番号は１０６７）の
ＨＳＡ発現ベクターをｐＨＯ０６５、プライマーＰＣＲ
７１を用いて得たＡＴＧ上流領域の長さが３４１ｂｐ
（プロモーターの５’末の塩基番号は１１８８）のＨＳ
Ａ発現ベクターをｐＹＩ０７１、プライマーＰＣＲ６６
を用いて得たＡＴＧ上流領域の長さが２７３ｂｐ（プロ
モーターの５’末の塩基番号は１２５６）のＨＳＡ発現
ベクターをｐＨＯ０６６、プライマーＰＣＲ６８を用い
て得たＡＴＧ上流領域の長さが２１４ｂｐ（プロモータ
ーの５’末の塩基番号は１３１５）のＨＳＡ発現ベクタ
ーをｐＨＯ０６８と命名した（図８）。
【００６６】実施例６ ＨＳＡ発現ベクターｐＨＯ０
９０、ｐＨＯ０９５の構築 ＡＯＸ２プロモーターの塩基番号１１８８〜１２１２に
わたる領域にＰＣＲ法を用いて２種の部分変異を導入
し、それらの変異がプロモーターの転写活性に及ぼす影
響について解析を行った。ＰＣＲ法を用いた部分変異導
入法は文献（Ito, W., et al, Gene, 102, 67-70, 199
1) 記載の方法に従った。鋳型プラスミドとしてはＨＳ
Ａ発現ベクターｐＨＯ０６５のＡＯＸ２プロモーター及
びＨＳＡ前半領域の約１．２ｋｂをＥｃｏＲＩとＰｓｔ
Ｉで切り出し、クローニングベクターｐＵＣ１９のＥｃ
ｏＲＩ及びＰｓｔＩサイトにサブクローニングしたプラ
スミドｐＨＯ０７４を用いた。さらに、２種の部分変異
導入プライマーＵＡＳｐを合成した。その配列を図９に
示す。また変異導入の操作手順を図１０および図１１に
示す。
【００６７】まず、ＵＡＳｐとマルチクローニングサイ
トの３’側に相補的なプライマーＲＶ（宝酒造製）を用
いてＰＣＲ産物を調製した。さらに別の反応チューブで
マルチクローニングサイトの５’側に相補的なプライマ
ーＭ４（宝酒造製）とマルチクローニングサイトのＳｐ
ｈＩとＨｉｎｄIII を塩基置換により消失させたプライ
マーＭＵＴＦ３（宝酒造製）を用いてＰＣＲ産物を調製
した。後者のＰＣＲ産物はマルチクローニングサイトの
ＳｐｈＩとＨｉｎｄIII が消失する。両ＰＣＲ産物の低
分子を除去した後、等量混合し、熱変性後、徐冷してア
ニーリングを行い、ヘテロな２本鎖を形成させた。ポリ
メレース反応により２本鎖を完成させ、Ｍ４およびＲＶ
で第２のＰＣＲを行った。この場合、ＰＣＲ産物は理論
上目的のＵＡＳに変異が導入されたものと、マルチクロ
ーニングサイトのＳｐｈＩとＨｉｎｄIII が消失したも
のの２種類が生成する。従って、混合物をＥｃｏＲＩ−
ＳｐｈＩで消化し、低分子を除去した後、ｐＵＣ１９に
リクローニングをおこなえば、ＵＡＳに変異が導入され
たものだけを得ることができる。このようにして得た数
種のプラスミドのＡＯＸ２プロモーターの塩基配列を決
定したところ、部分変異導入が導入されたＡＯＸ２プロ
モーターが得られた。これらを持つプラスミドをｐＨＯ
０８６、ｐＨＯ０８７とした。
【００６８】ｐＨＯ０８６、ｐＨＯ０８７をＥｃｏＲＩ
及びＰｓｔＩで消化して４６２ｂｐのＡＯＸ２プロモー
ター及びＨＳＡ遺伝子の５’側の約１．２Ｋｂの断片を
得た。これとＨＳＡ発現ベクターｐＭＭ０４１をＥｃｏ
ＲＩ及びＰｓｔＩで消化して得られる天然型ＡＯＸ２プ
ロモーター及びＨＳＡ遺伝子の５’側を含む約１１７０
ｂｐを交換することにより、部分変異を導入したプロモ
ーター支配下のＨＳＡ発現ベクターｐＨＯ０９０、ｐＨ
Ｏ０９５を構築した（図１２参照）。
【００６９】実施例７ ＵＲＳ２領域（塩基番号１２７
４〜１３１４）が変異してなるＡＯＸ２プロモーター、
該プロモーターを担持するＨＳＡ発現ベクターの取得 ＡＯＸ１遺伝子が欠失しているためにメタノール資化能
が低いピキアパストリス株をメタノールを単一炭素源と
する培地で継代培養を行うことにより、ＡＯＸ１遺伝子
を有する株と同程度に増殖が良好になった変異株を取得
することができる。増殖が良好になったのはＡＯＸ２プ
ロモーターに変異が生じその転写活性が上昇したのが原
因であることが明らかになっている（特願平３−６３５
９８号）。この方法を利用して、ＡＯＸ１欠失株からメ
タノール資化能が上昇した変異株の取得を行った。ＡＯ
Ｘ１欠失株であるＰＣ４１０５株をメタノールを単一炭
素源とするＹＰＭ培地で継代培養を続けた。この継代培
養液を１０7 〜１０8 細胞数／寒天培地の割合でＹＮＢ
w/o a.a. −ＭｅＯＨ寒天培地（０．６７％イーストニ
トロゲンベース不含アミノ酸、２％メタノール、１．５
％寒天）に蒔くとＡＯＸ１欠失株は著しく生育が遅い
が、変異株の生育は早く、３〜４日でコロニーを形成す
る。このようにして、２０〜４５世代継代後の菌体より
メタノール資化能が強くなった変異株を取得した。これ
らをＳＨＧ４１０５−４株、ＳＨＧ４１０５−８株と命
名した。
【００７０】取得した変異株のＡＯＸ２プロモーター領
域をＰＣＲ法でクローニングした。すなわち、変異株及
びＰＣ４１０５株の染色体ＤＮＡに対して、ＡＯＸ２プ
ロモーターの塩基番号７２６〜７４３にハイブリダイズ
して、５’末端にＢａｍＨＩサイトを付加した主鎖側プ
ライマー（５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＡＧＣＧＡ
ＧＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’）、及び塩基番号１３８６〜
１３６９にハイブリダイズし、５’末端にＥｃｏＲＩサ
イトを付加した逆鎖側プライマー（５’−ＣＣＧＡＡＴ
ＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧＣ−３’）を
用いてＰＣＲを行った。これにより増幅されたＡＯＸ２
プロモーター断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩサイトにクローニングした。
【００７１】次にクローニングベクター上のＡＯＸ２プ
ロモーター断片の塩基配列を決定した。まず、親株のＰ
Ｃ４１０５株ではＡＯＸ２プロモーターの塩基配列は完
全に保持されていた。ＳＨＧ４１０５−４株は塩基番号
１２７４のＴがＣに置換されていた。ＳＨＧ４１０５−
８株においては塩基番号１２７４のＴは保存されていた
が、塩基番号１２９６〜１３１４の配列がその両端の配
列“ＧＧＡＧＡ”を介して重複していた。
【００７２】クローニングした変異型ＡＯＸ２プロモー
ター支配下でＨＳＡを発現するベクターを構築した。ま
ず、変異型ＡＯＸ２プロモーターの５’末端のＢａｍＨ
ＩサイトをＥｃｏＲＩに変換した。次にＥｃｏＲＩ−Ｓ
ｓｐＩで変異型ＡＯＸ２プロモーター断片を分離し、Ｈ
ＳＡ発現ベクターｐＭＭ０４１の天然型ＡＯＸ２プロモ
ーターと交換して、変異型ＡＯＸ２プロモーター支配下
でＨＳＡを発現するベクターｐＨＯ０５９（点変異）、
ｐＨＯ０６１（重複変異）を構築した（図１３）。
【００７３】実施例８ ＵＲＳ１が欠失してかつＵＲ
Ｓ２に変異の生じたＡＯＸ２プロモーター、および該プ
ロモーターを担持するＨＳＡ発現ベクターの取得 塩基配列１２７４の点変異ＡＯＸ２プロモーターを持つ
ＳＨＧ４１０５−４株、塩基番号１２９６〜１３１４の
重複変異をもつＳＨＧ４１０５−８株、及び天然型のＧ
ＴＳ１１５株の染色体ＤＮＡそれぞれに対して、プロモ
ーターの塩基番号１１８８〜１２０６にハイブリダイズ
し、５’末端にＥｃｏＲＩサイトを付加した主鎖側プラ
イマー（５’−ＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＧＡＴＡＧＧＣＴ
ＡＴＴＴＴＴＧ−３’）、及び塩基番号１５２９〜１５
０１にハイブリダイズし、５’末端にＡｓｕIIサイトを
付加した逆鎖側プライマー（５’−ＴＴＣＧＡＡＧＴＴ
ＴＴＴＣＴＣＡＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧＧＧ
ＡＴ−３’）を用いてＰＣＲを行った。これにより増幅
されたＤＮＡ断片は塩基番号１１８７より上流を欠失し
たプロモーター断片であるのでＵＲＳ１が欠失している
がＵＡＳは保存されている。これをＥｃｏＲＩ−Ａｓｕ
IIで消化後、ＨＳＡ発現ベクターｐＭＭ０４１の天然型
ＡＯＸ２プロモーターと交換して、ベクターｐＹＩ０７
０（点変異）、ｐＹＩ０７２（重複変異）、ｐＹＩ０７
１（天然型）を構築した（図１４、図１５）。
【００７４】実施例９ オリゴヌクレオチド(I) の合
成とサブクローニングおよび該配列を有するＨＳＡ発現
ベクターの構築 ＡＯＸ２プロモーターとＡＯＸ１プロモーターの塩基配
列のホモロジー検索を行ったところ、２箇所の相同配列
を見出した（図１６）。その結果から、推定されるＡＯ
Ｘ２プロモーターのＵＡＳ配列を含む領域、すなわち塩
基番号１１９２〜１２１６領域、５’−ＧＡＴＡＧＧＣ
ＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＡＴＡＡＡＴ−３’の機能を
調べた。まず、塩基番号１１９２〜１２１６の２５ｂｐ
をその両端にＥｃｏＲＩサイトを付加してＤＮＡ／ＲＮ
Ａシンセサイザー（Ｍｏｄｅｌ３９２，ＡＢＩ社製）で
化学合成した。その配列は、正鎖：５’−ＡＡＴＴＣＧ
ＡＴＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＡＴＡＡＡＴＧ
−３’、逆鎖：５’−ＡＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＧＣＧＡ
ＣＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＴＡＴＣＧ−３’である。合成
後、ＮＡＰ１０カラム（ファルマシア製）で精製した。
約５μｇの正鎖ヌクレオチドおよび逆鎖ヌクレオチドを
混合し、９５℃で５分間加熱し、徐冷して両鎖をアニー
リングした。アニーリング後、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ
サイトにサブクローニングした。このプラスミドをｐＨ
Ｏ１０３とした。構築過程を図１７に示す。
【００７５】実施例５で得られたＨＳＡ発現ベクターｐ
ＨＯ０６０，ｐＨＯ０６６，ｐＨＯ０６８，ｐＹＩ０７
１、実施例６においてＵＡＳ領域が部分的に変異してな
るＨＳＡ発現ベクターｐＨＯ０９０，ｐＨＯ０９５、実
施例７で得られたＨＳＡ発現ベクターｐＨＯ０５９，ｐ
ＨＯ０６１および実施例８で得られたＨＳＡ発現ベクタ
ーｐＹＩ０７０，ｐＹＩ０７２，ｐＹＩ０７１をそれぞ
れＥｃｏＲＩで消化し、線状化した断片と、先のアニー
リングした合成ＤＮＡ配列断片〔オリゴヌクレオチド
(I) 〕を連結した。これでＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形
質転換した。数個の形質転換体よりプラスミドを調製
し、制限酵素分析およびＤＮＡシーケンシンングにより
ＥｃｏＲＩサイトに挿入断片の存在しているプラスミド
を選択し、挿入されている合成ＤＮＡ配列断片のコピー
数、および方向をＤＮＡシークエンシングにより決定し
た。その結果、１〜３個の合成配列が種々のＡＯＸ２プ
ロモーターの上流に挿入されたＨＳＡ発現ベクターがス
クリーニングして得られた。得られたベクターのプロモ
ーター構造の一部を図１８および図１９に示す。なお、
図１８および図１９において合成ＤＮＡ配列断片がＡＯ
Ｘ２プロモーターの上流に正方向に挿入されたＨＳＡ発
現ベクターについては、ＨＳＡ発現ベクターの名の後ろ
にＦの記号を、逆方向に挿入されたＨＳＡ発現ベクター
についてはＲの記号を付けて示した。
【００７６】実施例１０ １コピー形質転換体の取得 構築したＨＳＡ発現ベクターをＳｔｕＩで消化して１μ
ｇ／μｌに調製した。これを宿主である P. pastorisＧ
ＴＳ１１５株のＨＩＳ４領域に組み込み、ＡＬＫＡＬＩ
ＣＡＴＩＯＮ Yeast Translation Kit (Bio101)を用い
て酢酸リチウム法により形質転換体を作成した。これら
のコロニーを各プラスミドにつき適当個拾い、ＳＤ w/o
a.a.plateに釣菌して保存用プレートとした。これをニ
トロセルロース膜を上に敷いたＹＰＭ寒天培地（１％酵
母エキス，２％ペプトン，２％メタノール，１．５％寒
天）にレプリカを行い、７２時間培養した。その後ニト
ロセルロース膜にトラップされた分泌ＨＳＡを抗ＨＳＡ
抗体によるイムノブロティングで定性的に検出した。こ
れによりＨＳＡ産生株を１次スクリーニングした。次に
各プラスミドにつき数個のＨＳＡ産生株からＤＮＡを抽
出し、ＢｇｌIIで消化した。消化ＤＮＡ断片のアガロー
スゲル電気泳動を行い、分離断片をナイロン膜にトラン
スファーした。ＨＳＡｃＤＮＡ断片をプローブとしたサ
ザンブロット法による解析を行い、４．５ｋｂの単一バ
ンドが確認された形質転換体を１コピーのプラスミドが
組み込まれた形質転換体とした。取得したこれらの１コ
ピー形質転換体のＨＳＡ産生量を指標として合成ＤＮＡ
配列の機能を調べた。
【００７７】１コピー形質転換体の培養は、まず２ｍｌ
ＹＰＤ（１％イーストエキストラクト，２％ペプトン，
２％グルコース）培地／試験管で２９．５℃で１７０ｒ
ｐｍの前培養を１〜３日行い、得られた前培養液を植え
込み時のＯＤ540nm 値が０．１となるように３ｍｌのＹ
ＰＭ（ＹＰ−２％メタノール）培地／試験管に植え込
み、２９．５℃で１７０ｒｐｍで７２時間まで培養を行
うことにより実施した。培養７２時間目の上清中のＨＳ
Ａ産生量をＲＰＨＡ法により測定した。その結果を以下
にまとめる（図１８および図１９参照）。ｐＨＯ０６０
形質転換体は２μｇ／ｍｌのＨＳＡ産生にとどまった。
しかし、ｐＨＯ０６０のＡＯＸ２プロモーター５’上流
（ＵＲＳ１のさらに上流）に合成ＤＮＡ配列断片を正方
向に挿入したプラスミドｐＨＯ０６０Ｆの形質転換体で
は５倍のＨＳＡ産生量（１０μｇ／ｍｌ）が認められ
た。ｐＨＯ０６０Ｆ形質転換体のＨＳＡ産生量の上昇は
挿入された合成ＤＮＡ配列断片によるものと推察され
た。同様に合成ＤＮＡ配列断片が逆方向に挿入されたプ
ラスミドｐＨＯ０６０Ｒの形質転換体でも１０μｇ／ｍ
ｌのＨＳＡ産生量が認められたので、合成ＤＮＡ配列断
片の挿入方向は転写増強活性と無関係であることが示唆
された。さらに、３コピーの合成ＤＮＡ配列断片が５’
末端側より順に逆、正、正方向に挿入されたｐＨＯ０６
０ＲＦＦ形質転換体では５０μｇ／ｍｌのＨＳＡ産生量
となり、ｐＨＯ０６０形質転換体の２５倍もの転写量で
あった。ｐＨＯ０６０由来プラスミドによる形質転換体
で見られたＨＳＡ産生量増強活性は、ｐＹＩ０７１，ｐ
ＨＯ０６６，ｐＨＯ０６８由来プラスミドによる形質転
換体にも認められた。従って合成ＤＮＡ配列断片は“Ｕ
ＡＳ”として機能し、かつマルチコピーの挿入によっ
て、さらにその機能が増強されることが明らかになっ
た。ｐＨＯ０６８Ｆを始めとするｐＨＯ０６８に合成Ｄ
ＮＡ配列断片を挿入したプラスミドはプロモーターのエ
レメントとしておそらくＵＡＳとＴＡＴＡ ｂｏｘしか
含んでいない。しかもＴＡＴＡ ｂｏｘの５’末端側に
近接してＵＡＳが位置している。しかしながら、これら
プラスミド形質転換体ではメタノール誘導性の十分なＨ
ＳＡ産生を認めた。すなわち、プロモーターとして重要
なエレメントはＵＡＳとＴＡＴＡ ｂｏｘのみであると
いえる。合成ＤＮＡ配列断片のＵＡＳとしての機能はま
た、ｐＨＯ０９０やｐＨＯ０９５のＡＯＸ２プロモータ
ー５’末端側に挿入した場合にも認められた。つまり、
ｐＨＯ０９０，ｐＨＯ０９５は本来のＵＡＳが部位特異
変異され、その機能をほぼ失っているが、合成ＤＮＡ配
列断片を挿入した場合には機能が回復していた。以上の
結果より、合成ＤＮＡ断片はプロモーターの転写活性を
そのコピー数に依存して増強させた。挿入方向と増強機
能は無関係であった。またＴＡＴＡ ｂｏｘの５’側上
流の任意の位置で増強機能を認めた。これらのことは酵
母のＵＡＳとしての条件を満たしていた。従って、２５
ｂｐの合成ＤＮＡ配列断片にはＡＯＸ２プロモーターの
ＵＡＳが完全に含まれていることが明らかになった。
【００７８】実施例１１ 変異型ＡＯＸ２プロモーター
のグルコース抑制 本発明の変異ＡＯＸ２プロモーター制御下でＨＳＡを発
現するピキア酵母の全種をＹＰＭ，ＹＰＤおよびＹＰＤ
Ｍ培地で培養し、ＨＳＡの発現を指標にプロモーターの
転写制御について解析を行った。なお、培養は２ｍｌＹ
ＰＤ（１％イーストエキストラクト，２％ペプトン，２
％グルコース）培地／試験管で２９．５℃で１７０ｒｐ
ｍの前培養を１〜３日行い、得られた前培養液を植え込
み時のＯＤ540nm 値が０．１となるように３ｍｌのＹＰ
Ｍ（ＹＰ−２％メタノール）培地／試験管、ＹＰＤ培地
／試験管およびＹＰＤＭ（ＹＰ−２％グルコース，２％
メタノール）培地／試験管に植え込み、２９．５℃で１
７０ｒｐｍで９６時間まで培養を行うことにより実施し
た。ＨＳＡ産生量は、ＲＰＨＡ法により測定した。
【００７９】すべての菌体の３種の培地における菌体増
殖度と上清のＨＳＡ産生量を確認した。また、対数増殖
後期にあたる培養４８時間目の上清のＨＳＡ産生量をプ
ロモーター転写制御エレメントの有無と共に表２および
表３に示した。また、定常期にあたる培養７２時間めの
上清のＨＳＡ産生量をプロモーター転写制御エレメント
の有無と共に表４および表５に示した。なお表中、−は
エレメントの欠失，＋は天然型エレメント，
【外１】 は人工的に付加したエレメント，ＳＭはエレメントの部
分的変異，ＰＭはエレメントの点変異（１２７４位のＴ
がＣに変異），ＤＭはエレメントの重複変異（１２９４
位〜１３１４位）を意味する。
【００８０】
【表２】
【００８１】
【表３】
【００８２】
【表４】
【００８３】
【表５】
【００８４】これらの結果、ＡＯＸ２プロモーターに機
能的なＵＡＳが存在する場合にＨＳＡ発現のメタノール
誘導、およびグルコースが消費されるまではメタノール
誘導性のＨＳＡ発現の見られないグルコースカタボライ
ト抑制が認められた（ＹＰＤＭの培養においてグルコー
スが消費された７２時間目以降にメタノール誘導性のＨ
ＳＡ産生が認められた。）。また、プロモーター転写制
御エレメントとしてＵＡＳとＴＡＴＡ ｂｏｘのみを有
するプロモーター（ｐＨＯ０６８Ｆ，ｐＨＯ０６８Ｒお
よび他のｐＨＯ０６８誘導プラスミド）において、メタ
ノール誘導性，グルコース抑制性，十分な転写活性を認
めた。一方、ＵＡＳが欠失しているか、ＵＡＳ部分が変
異しているプロモーターにおいては、メタノール誘導性
が認められずＨＳＡ発現がほとんど見られなかった。以
上から、メタノールが、転写促進因子の生成を誘導し、
ＵＡＳに作用することが示唆された。また、一方でＵＡ
Ｓ存在下で他の配列のない場合（ｐＨＯ０６８Ｆ）でも
グルコースカタボライト抑制を示したことから、グルコ
ースはメタノールによる転写誘導経路を優先的にブロッ
クしていることが示唆された。しかもこれらの制御とＵ
ＲＳ１およびＵＲＳ２の存在の有無は無関係であった。
このことから、ＵＲＳ１およびＵＲＳ２はＵＡＳ関連因
子の活性を阻害するのみで、炭素源によるプロモーター
転写制御には無関係であることが示唆された。
【００８５】
【発明の効果】本発明により得られた変異型ＡＯＸ２プ
ロモーターは野生型ＡＯＸ２プロモーターと比べてプロ
モーター活性が格段に増強されている。ゆえに本プロモ
ーターは、異種遺伝子を発現しうる発現ベクターにおけ
るプロモーターとして利用価値が極めて高い。また、本
発明のベクターは種々の有用な異種蛋白質を宿主内で効
率よく発現、産生することができる。
【００８６】
【表６】
【００８７】
【表７】
【００８８】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＯＸ２遺伝子付近の染色体の制限酵素地図を
示す図である。なお、括弧内の数字は、Ｘｂａｌ認識部
位を０とした時の距離（×１００塩基）を示す。
【図２】ＰＣ４１３０株のＡＯＸ１、ＡＯＸ２遺伝子領
域を示す図である。
【図３】プラスミドｐＭＭ０３０のＡＯＸ２遺伝子付近
の制限酵素地図を示す図である。なお、括弧内の数字
は、ＥｃｏＲＩ認識部位を０とした時の距離（×１００
塩基）を示す。
【図４】プラスミドｐＭＭ０３１のＡＯＸ２遺伝子付近
の制限酵素地図を示す図である。なお、括弧内の数字
は、ＥｃｏＲＩ認識部位を０とした時の距離（×１００
塩基）を示す。
【図５】ｐＰＧ００１の構築を説明する図である。
【図６】ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡが発現す
るプラスミドベクターｐＭＭ０４１の構築を説明する図
である。
【図７】ＨＳＡ発現ベクターｐＭＭ０４１の制限酵素地
図を示す図である。なお、図中、ＡＯＸ２ｐはＡＯＸ２
プロモーターを、ＡＯＸ１ｔはＡＯＸ１ターミネーター
を、prepro ＨＳＡはプレプロＨＳＡ配列を、ＨＳＡは
ＨＳＡｃＤＮＡを、ＨＩＳ４はP. pastoris ＨＩＳ４遺
伝子を、Ａｍｐr はアンピシリン耐性遺伝子を、ｐＵＣ
１９はｐＵＣ１９由来配列を、ｐＢＲ３２２はｐＢＲ３
２２由来配列を意味するものである。
【図８】上流欠失型ＡＯＸ２プロモーターにより支配さ
れるＨＳＡ発現ベクターを示す図である。
【図９】部分変異導入用プライマー（２種類）の塩基配
列を示す図である。最上段の塩基配列はＡＯＸ２プロモ
ーターの配列を示す。４種のプライマーＵＡＳｐの名称
に続いて、その塩基配列を示した。* はＡＯＸ２プロモ
ーターの配列と同じ塩基を示す。
【図１０】ＵＡＳ領域に変異を導入してなるＡＯＸ２プ
ロモーターをもつＨＳＡ発現ベクター（例えばｐＨＯ０
９０）の構築手順を示す図である。図１１に続く。
【図１１】ＵＡＳ領域に変異を導入してなるＡＯＸ２プ
ロモーターをもつＨＳＡ発現ベクター（例えばｐＨＯ０
９０）の構築手順を示す図である。
【図１２】ＵＡＳ領域に変異を導入したＡＯＸ２プロモ
ーター支配下のＨＳＡ発現ベクター（ｐＨＯ０９０，ｐ
ＨＯ０９５）を示す図である。
【図１３】ＵＲＳ２領域（塩基番号１２７４〜１３１
４）に変異を生じたＡＯＸ２プロモーター支配下のＨＳ
Ａ発現ベクターの構築手順を示す図である。
【図１４】ＵＲＳ１が欠失してかつＵＲＳ２に変異の生
じたＡＯＸ２プロモーター支配下のＨＳＡ発現ベクター
の構築手順を示す図である。図１５に続く。
【図１５】ＵＲＳ１が欠失してかつＵＲＳ２に変異の生
じたＡＯＸ２プロモーター支配下のＨＳＡ発現ベクター
の構築手順を示す図である。
【図１６】ＡＯＸ２プロモーターとＡＯＸ１プロモータ
ーの相同配列を示す図である。
【図１７】ＵＡＳ候補配列である塩基番号１１９２〜１
２１６に相当する配列を化学合成したＤＮＡ断片を含む
プラスミドｐＨＯ１０３構築手順を示す図である。
【図１８】ＵＡＳ候補配列である合成ＤＮＡ断片を５’
末端側に有する変異型ＡＯＸ２プロモーターの構造、お
よびそれらのＨＳＡ産生量を示す図である。図１９に続
く。
【図１９】ＵＡＳ候補配列である合成ＤＮＡ断片を５’
末端側に有する変異型ＡＯＸ２プロモーターの構造、お
よびそれらのＨＳＡ産生量を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 大村 孝男 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 野生型ＡＯＸ２プロモーター（配列番号
    １）の部分的ＤＮＡ断片の５’末端側に新たにＧＡＴＡ
    ＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＡＴＡＡＡＴの塩基配
    列からなるオリゴヌクレオチドが１〜３個正方向または
    逆方向に付加してなる変異型ＡＯＸ２プロモーター、 ここで、部分的ＤＮＡ断片は、 (i) 野生型ＡＯＸ２プロ
    モーターのＵＲＳ１領域より上流側に位置する領域を欠
    失したもの、 (ii) 野生型ＡＯＸ２プロモーターのＵＲＳ
    １領域を含めてＵＡＳ領域より上流側に位置する領域を
    欠失したもの、 (iii) 野生型ＡＯＸ２プロモーターのＵ
    ＲＳ１領域およびＵＡＳ領域を含めてＵＲＳ２領域より
    上流側に位置する領域を欠失したもの、 (iv) 野生型ＡＯ
    Ｘ２プロモーターのＵＲＳ１領域、ＵＡＳ領域およびＵ
    ＲＳ２領域を含めてＴＡＴＡ領域より上流側に位置する
    領域を欠失したもの、から選ばれる（ここで、野生型Ａ
    ＯＸ２プロモーター（配列番号１）中の塩基番号８４５
    〜９６０位からなる領域をＵＲＳ１領域、塩基番号１１
    ９２から１２１６位からなる領域をＵＡＳ領域、塩基番
    号１２７４〜１３１４位からなる領域をＵＲＳ２領域、
    塩基番号１３２５〜１３３０からなる領域をＴＡＴＡ領
    域という） 。
  2. 【請求項２】 請求項１記載の変異型ＡＯＸ２プロモー
    ターを担持してなるベクター。
  3. 【請求項３】 異種蛋白構造遺伝子が請求項１の変異型
    ＡＯＸ２プロモーターの転写制御下にある、請求項２記
    載のベクター。
  4. 【請求項４】 請求項２または請求項３のベクターを導
    入してなる形質転換酵母。
  5. 【請求項５】 請求項４の形質転換酵母を培養して、該
    培養物から異種蛋白質を採取することを特徴とする異種
    蛋白質の製造方法。
  6. 【請求項６】 変異型ＡＯＸ２プロモーターが、図１８
    で示したｐＨＯ０６０Ｆ、ｐＨＯ０６０Ｒ、ｐＨＯ０６
    ０ＲＦＦ、ｐＨＯ０９０Ｆ、ｐＨＯ０９０ＲＦ、ｐＨＯ
    ０９５Ｆ、ｐＨＯ０９５Ｒ、図１９で示したｐＹＩ０７
    １Ｆ、ｐＹＩ０７１Ｒ、ｐＹＩ０７１ＦＲＦ、ｐＨＯ０
    ６６Ｒ、ｐＨＯ０６６ＦＲ、ｐＨＯ０６８Ｆ、ｐＨＯ０
    ６８Ｒ、ｐＨＯ０６８ＦＦ、ｐＨＯ０６８ＦＲ、ｐＨＯ
    ０６８ＦＲＲから選ばれる、請求項１記載の変異型ＡＯ
    Ｘ２プロモーター。
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