JPH0213382A - グラムネガテイブ微生物での構造遺伝子の調節発現法 - Google Patents
グラムネガテイブ微生物での構造遺伝子の調節発現法Info
- Publication number
- JPH0213382A JPH0213382A JP7794589A JP7794589A JPH0213382A JP H0213382 A JPH0213382 A JP H0213382A JP 7794589 A JP7794589 A JP 7794589A JP 7794589 A JP7794589 A JP 7794589A JP H0213382 A JPH0213382 A JP H0213382A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- coli
- sequence
- structural gene
- dna
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 162
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 62
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 77
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 67
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 38
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 claims description 32
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 24
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 17
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 16
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 claims description 16
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical group C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 13
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 241000607720 Serratia Species 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 241000589518 Comamonas testosteroni Species 0.000 claims description 2
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 claims description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims 7
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims 1
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 claims 1
- 241000283160 Inia Species 0.000 claims 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 15
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 abstract description 8
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 19
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 15
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 15
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 14
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 14
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 12
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 101100355584 Mus musculus Rad51 gene Proteins 0.000 description 9
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 8
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 7
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 5
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- -1 but E Proteins 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 101000658545 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Type I restriction enyme HindI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002959 beta galactosidase induction Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- FBOUIAKEJMZPQG-AWNIVKPZSA-N (1E)-1-(2,4-dichlorophenyl)-4,4-dimethyl-2-(1,2,4-triazol-1-yl)pent-1-en-3-ol Chemical compound C1=NC=NN1/C(C(O)C(C)(C)C)=C/C1=CC=C(Cl)C=C1Cl FBOUIAKEJMZPQG-AWNIVKPZSA-N 0.000 description 1
- YQAXFVHNHSPUPO-RNJOBUHISA-N 2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s,4r)-1-[(2s)-1-(2-aminoacetyl)pyrrolidine-2-carbonyl]-4-hydroxypyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1C[C@@H](O)CN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)CN)CCC1 YQAXFVHNHSPUPO-RNJOBUHISA-N 0.000 description 1
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 1
- QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 5-O-(1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimic acid Chemical compound O[C@H]1[C@H](OC(=C)C(O)=O)CC(C(O)=O)=C[C@H]1OP(O)(O)=O QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 101150101112 7 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100132466 Arabidopsis thaliana NAC055 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100132468 Arabidopsis thaliana NAC59 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101100328884 Caenorhabditis elegans sqt-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150117824 Calr gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000011724 DNA Repair Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010076525 DNA Repair Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 235000011511 Diospyros Nutrition 0.000 description 1
- 244000236655 Diospyros kaki Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241000589236 Gluconobacter Species 0.000 description 1
- 101710129449 Glucose-6-phosphate isomerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150026303 HEX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000578940 Homo sapiens PDZ domain-containing protein MAGIX Proteins 0.000 description 1
- 101100420812 Homo sapiens SCN3A gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 1
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101100132474 Oryza sativa subsp. japonica NAC067 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028326 PDZ domain-containing protein MAGIX Human genes 0.000 description 1
- 101150111781 PGL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 101150093766 Segment-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100023720 Sodium channel protein type 3 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M acetylcholine chloride Chemical compound [Cl-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010082685 antiarrhythmic peptide Proteins 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002271 gyrase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- HWGNBUXHKFFFIH-UHFFFAOYSA-I pentasodium;[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O HWGNBUXHKFFFIH-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000011536 re-plating Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
炎亙且Ｉ
本発明は、所望のポリペプチドをコードする構２［遺伝
子のグラムネガティブ微生物での発現を調節する方法及
びそのための手段に関する。
子のグラムネガティブ微生物での発現を調節する方法及
びそのための手段に関する。
発明の背景
Ｅ、ｃｏｌ １及びＥ．ｃｏｌｉバタテリオファージか
ら得られる多くのプロモーターの構造が解明されており
、またそれらの機能についても精力的に研究がされてい
る。プロモーターについてのこれらの知識により、医学
的及び農学的に重要な多くの物質を組換えＤＮＡ技術に
よってＥ、Ｃ０Ｊｊ を中で製造することが可能となっ
ている。しかしながら、Ｅ、ｃｏｊ！ ｉ以外の他のグ
ラムネガティブバクテリアに関しては、それらのプロモ
ーターの機能あるいは構造についての知見が乏しいため
、商業的及び経済的に有用な物質を組換えＤＮＡ技術に
よって製造する際の宿主細胞としてグラムネガティブバ
クテリアを使用することが未だ困難となっている。
ら得られる多くのプロモーターの構造が解明されており
、またそれらの機能についても精力的に研究がされてい
る。プロモーターについてのこれらの知識により、医学
的及び農学的に重要な多くの物質を組換えＤＮＡ技術に
よってＥ、Ｃ０Ｊｊ を中で製造することが可能となっ
ている。しかしながら、Ｅ、ｃｏｊ！ ｉ以外の他のグ
ラムネガティブバクテリアに関しては、それらのプロモ
ーターの機能あるいは構造についての知見が乏しいため
、商業的及び経済的に有用な物質を組換えＤＮＡ技術に
よって製造する際の宿主細胞としてグラムネガティブバ
クテリアを使用することが未だ困難となっている。
医学的及び農学的に重要な物質の生産用にグラムネガテ
ィブ宿主細胞を開発することは多くの理由から極めて有
利と言える。即ち、Ｅ、ｃｏｔ ｉ以外の他のグラムネ
ガティブバクテリアを用いることによって、Ｅ、ｃｏＪ
ｊｌＨＪ主ｌｌｌ１胞によって産生される生産物の場合
に見られるようなエンドトキシンの混入の可能性を避け
ることができ、またヒトに対して毒性を示すエンドトキ
シンのないＥ、ｃｏｌ ＋株を中離しあるいは開発する
必要性もなくなる。更には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの
ようなグラムネガティブバクテリアを宿主！ＩＩＪＩＩ
として用いることによって、ＰＳｅｉＬｌｄＯ１０ｎａ
Ｓの代謝特性及び生理学的特性から非常に多くの経済的
効果がもたらされる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
は、ある条件上では、Ｅ、ｃｏｌｌよりも高い細ｌ１１
ｉ１１１度まで生育することができ、そのために高い取
崩で生産物を術ることができる可能性がある。更には、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは非常に多くの栄養源を基に生
育することができるため、生産性の７レキシピリテイー
がありまた経済的コストを節約することも可能である。
ィブ宿主細胞を開発することは多くの理由から極めて有
利と言える。即ち、Ｅ、ｃｏｔ ｉ以外の他のグラムネ
ガティブバクテリアを用いることによって、Ｅ、ｃｏＪ
ｊｌＨＪ主ｌｌｌ１胞によって産生される生産物の場合
に見られるようなエンドトキシンの混入の可能性を避け
ることができ、またヒトに対して毒性を示すエンドトキ
シンのないＥ、ｃｏｌ ＋株を中離しあるいは開発する
必要性もなくなる。更には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの
ようなグラムネガティブバクテリアを宿主！ＩＩＪＩＩ
として用いることによって、ＰＳｅｉＬｌｄＯ１０ｎａ
Ｓの代謝特性及び生理学的特性から非常に多くの経済的
効果がもたらされる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
は、ある条件上では、Ｅ、ｃｏｌｌよりも高い細ｌ１１
ｉ１１１度まで生育することができ、そのために高い取
崩で生産物を術ることができる可能性がある。更には、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは非常に多くの栄養源を基に生
育することができるため、生産性の７レキシピリテイー
がありまた経済的コストを節約することも可能である。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 、 Ｓｅｒｒａｔｉａ、 Ｅ
ｒｗｉｎｉａなどのグラムネガティブ微生物は、多くの
蛋白を生育培地に活発に排泄している。このような排ｄ
ｊ］経路を利用して目的とするペプチドあるいは蛋白を
分泌又は排泄させる発現系の開発が望まれている。また
、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、イオンキレート分子であ
るシデロボア（５ｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ）を産生ずる
ため、抗生物質のない生育培地中で培養することが出来
る。このイオンキレート分子は、致命的なイオン分子を
産生ずる混入微生物を効゛果的に死滅させることが出来
る。
ｒｗｉｎｉａなどのグラムネガティブ微生物は、多くの
蛋白を生育培地に活発に排泄している。このような排ｄ
ｊ］経路を利用して目的とするペプチドあるいは蛋白を
分泌又は排泄させる発現系の開発が望まれている。また
、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、イオンキレート分子であ
るシデロボア（５ｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ）を産生ずる
ため、抗生物質のない生育培地中で培養することが出来
る。このイオンキレート分子は、致命的なイオン分子を
産生ずる混入微生物を効゛果的に死滅させることが出来
る。
以上から明らかなように、Ｅ、ｃｏｔ ｒに加えて他の
グラムネガティブバクテリア用の経済的に有利な発現系
を開発する必要がある。このような発現系は、経済的に
利用できるように、宿主細胞での目的とする蛋白の産生
をオンオフ制御ｌすることができる（例えば調節もしく
は誘導可能）ようなタイプの発現系であることが理想的
である。
グラムネガティブバクテリア用の経済的に有利な発現系
を開発する必要がある。このような発現系は、経済的に
利用できるように、宿主細胞での目的とする蛋白の産生
をオンオフ制御ｌすることができる（例えば調節もしく
は誘導可能）ようなタイプの発現系であることが理想的
である。
どのような細）泡の場合でし、蛋白をコードする特定の
ＤＮＡ配列に基いて蛋白を産生ずるためには、第１に、
ＤＮＡ配列がメツセンジャーＲＮＡ＜ｍＲＮＡ）に転写
され、第２に、ｒｒｌＮＡが蛋白に翻訳されることが必
要である。転写は、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ配列中
のプロモーター配列に結合することによって開始される
。従って、このプロモーター配列は、宿主細胞のＲＮＡ
ポリメラーゼによって認識されるものでなければならな
い。ＲＮＡポリメラーゼの作用によってＤＮＡ分子がｍ
ＲＮＡ分子に変換され、次いで、ｍＲＮＡ分子が細胞内
のリポソームに結合してｍＲＮＡ分子から蛋白への翻訳
が開始される。従って、ｍＲＮＡ分子は、宿主細胞のリ
ポソームによって認識される結合部位を有していなけれ
ばならない。
ＤＮＡ配列に基いて蛋白を産生ずるためには、第１に、
ＤＮＡ配列がメツセンジャーＲＮＡ＜ｍＲＮＡ）に転写
され、第２に、ｒｒｌＮＡが蛋白に翻訳されることが必
要である。転写は、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ配列中
のプロモーター配列に結合することによって開始される
。従って、このプロモーター配列は、宿主細胞のＲＮＡ
ポリメラーゼによって認識されるものでなければならな
い。ＲＮＡポリメラーゼの作用によってＤＮＡ分子がｍ
ＲＮＡ分子に変換され、次いで、ｍＲＮＡ分子が細胞内
のリポソームに結合してｍＲＮＡ分子から蛋白への翻訳
が開始される。従って、ｍＲＮＡ分子は、宿主細胞のリ
ポソームによって認識される結合部位を有していなけれ
ばならない。
目的とする物質く例えば蛋白又はポリペプチド）を組換
えＤＮＡ技術によって他のグラムネガティブバクテリア
中で産生させるために必要なＥ、ｃｏ！＋以外のプロモ
ーター及びリポソーム結合部位についての知見が乏しく
、またそれらが同定されていないため、Ｅ、ＧＯ１ｉブ
ロモータ−及びリポソーム結合部位を用いて他のグラム
ネガティブバクテリア中で蛋白を産生させる可能性につ
いての研究が行なわれ始めている。
えＤＮＡ技術によって他のグラムネガティブバクテリア
中で産生させるために必要なＥ、ｃｏ！＋以外のプロモ
ーター及びリポソーム結合部位についての知見が乏しく
、またそれらが同定されていないため、Ｅ、ＧＯ１ｉブ
ロモータ−及びリポソーム結合部位を用いて他のグラム
ネガティブバクテリア中で蛋白を産生させる可能性につ
いての研究が行なわれ始めている。
Ｅ、Ｃ０ＩｌｉプロモーターとＰＳｅｕｄＯ１０ｎａＳ
プロモーターとの互換性についての研究の結果、いくつ
かのＥ、ｃｏｉｉプロモーターはｐｓｅｕｄｏｉｏｎａ
ｓ中で機能することはできるがほとんどその調節は不可
能であり、互換性が常にあるとは限らないことが示され
ている。クロモシームＤＮＡとグラムネガティブ微生物
との間で交換が起こると言うＮＥ拠はほとんどなく、従
ってＥ、ｃａ１ｒプロモーターとＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓプロモーターとの間では互換性が乏しいということは
驚くべきことではない。
プロモーターとの互換性についての研究の結果、いくつ
かのＥ、ｃｏｉｉプロモーターはｐｓｅｕｄｏｉｏｎａ
ｓ中で機能することはできるがほとんどその調節は不可
能であり、互換性が常にあるとは限らないことが示され
ている。クロモシームＤＮＡとグラムネガティブ微生物
との間で交換が起こると言うＮＥ拠はほとんどなく、従
ってＥ、ｃａ１ｒプロモーターとＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓプロモーターとの間では互換性が乏しいということは
驚くべきことではない。
グラムネガティブ微生物が、それ自身の酵素及び／又は
発現機構を用いて他の生物由来の調節シグナルを認識す
る可能性はほとんどない。実際に、ＰＳＯＬＩｄＯｌｌ
ＯｎａＳプロモーターの構造についての最近のωＩ究に
よれば、その構造はＥ、ｃｏ７ｉコンセンサスプロモー
ターｈ１造とは有意に相違していることが示されている
［Ｊｅｅｎｅｓ、 Ｄ、Ｊ、ｅｔ ａｌ、。
発現機構を用いて他の生物由来の調節シグナルを認識す
る可能性はほとんどない。実際に、ＰＳＯＬＩｄＯｌｌ
ＯｎａＳプロモーターの構造についての最近のωＩ究に
よれば、その構造はＥ、ｃｏ７ｉコンセンサスプロモー
ターｈ１造とは有意に相違していることが示されている
［Ｊｅｅｎｅｓ、 Ｄ、Ｊ、ｅｔ ａｌ、。
Ｈｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｃｔ、（１９８６）２０３
： ４２１−４２９］。いくつかのＥ、Ｃ０１ｉプロ
モーターがＰＳｅｌＪｄＯｌｌＯｎａＳにおいて転写を
開始させることができるメカニズムについては現在の所
あまり明らかにされておらず、またＥ、Ｃ０Ｉｉプロモ
ーターがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓにおいて機能するか否
かを予想することも困難である。
： ４２１−４２９］。いくつかのＥ、Ｃ０１ｉプロ
モーターがＰＳｅｌＪｄＯｌｌＯｎａＳにおいて転写を
開始させることができるメカニズムについては現在の所
あまり明らかにされておらず、またＥ、Ｃ０Ｉｉプロモ
ーターがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓにおいて機能するか否
かを予想することも困難である。
例えば、プロモーターによって開始される転写のオンオ
フ制御の調節には、誘導物質（例えばオン調節）とプロ
モーターとの相互作用が必要である。この相互作用につ
いては、特にＥ、ｃｏ１ｒ以外のグラムネガティブバク
テリアの場合にはあまり解明されていない。典型的には
、誘導物質が細胞内のレセプター分子との間で特異的に
作用して、レセプター分子がプロモーター領域に結合す
るのを抑制する。レセプター分子の結合が抑制されるこ
とによって転写が活性化される。従って、ある属の生物
から得たプロモーターが第２の属の生物中で調節可能な
状態で機能するためには、誘導物質との間で作用するレ
セプター分子であって該レセプター分子がプロモーター
領域に結合するのを抑制するように誘導物質と作用する
レセプター分子を、第２の属の生物が持っている必要が
ある。従って、遺伝子のオンオフ制御をコントロールす
るためには、宿主細胞のＲＮＡボリメラーぜがプロモー
ター領域を認識するとともに、更に宿主細胞内において
複合体が形成されて特異的な相互作用が起こることが必
要である。
フ制御の調節には、誘導物質（例えばオン調節）とプロ
モーターとの相互作用が必要である。この相互作用につ
いては、特にＥ、ｃｏ１ｒ以外のグラムネガティブバク
テリアの場合にはあまり解明されていない。典型的には
、誘導物質が細胞内のレセプター分子との間で特異的に
作用して、レセプター分子がプロモーター領域に結合す
るのを抑制する。レセプター分子の結合が抑制されるこ
とによって転写が活性化される。従って、ある属の生物
から得たプロモーターが第２の属の生物中で調節可能な
状態で機能するためには、誘導物質との間で作用するレ
セプター分子であって該レセプター分子がプロモーター
領域に結合するのを抑制するように誘導物質と作用する
レセプター分子を、第２の属の生物が持っている必要が
ある。従って、遺伝子のオンオフ制御をコントロールす
るためには、宿主細胞のＲＮＡボリメラーぜがプロモー
ター領域を認識するとともに、更に宿主細胞内において
複合体が形成されて特異的な相互作用が起こることが必
要である。
はとんどのグラムネガティブ生物には、損傷ＤＮＡの修
復に関係した蛋白が含まれていると考えられている。こ
のような蛋白の１つとして、Ｅ、ｃｏ！＋には、ｒｅｃ
Ａ？ｆｔ白がある。
復に関係した蛋白が含まれていると考えられている。こ
のような蛋白の１つとして、Ｅ、ｃｏ！＋には、ｒｅｃ
Ａ？ｆｔ白がある。
ＢｅｎｂｒｏｏｋとＨｉ ｌ ｆａｒは、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｕｒｇｉｎｏｓａにはＥ．ｃｏｌｉ
ｒｅｃＡ遺伝子と類似の遺伝子が含まれているが、Ｅ
、ｃｏｌｉ ｒｅｃＡ蛋白の産生を誘導するナリジク
ス酸あるいはノルフロキシンなどの物質によってＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｒ ｅ ｃ Ａ遺伝子の発現は誘導
されないことを報告している［ ＡｎｔｉｌｉＣｒＯｂ
、 八ｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｎ＋ｏｔｈｅｒ、、
（１９８６） 、２９ ： １−６］。従って、Ｅ、
ｃｏｌ；ｒｅｃＡ遺伝子と類似した遺伝子がｐｓｅｕｄ
ｏｔｍｏｎａｓ中に６存在してはいるが、Ｐｓｅｕｄｏ
１０ｎａｓ ｒ ｅ ｃ Ａ蛋白のコントロール（例え
ば調節）は Ｅ、ｃｏｔ ｔの場合と相違している。それ故に、Ｅ、
ｃｏｊｉ ｒｅｃＡプロを一ターがＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓにおいて調節可能な状態で作用することは期待で
きず、またＥ、ｃｏｔ ｉの場合と同様の調節機構のも
とぐ作用することも明らかに期待することはできない。
ｍｏｎａｓ ａｅｕｒｇｉｎｏｓａにはＥ．ｃｏｌｉ
ｒｅｃＡ遺伝子と類似の遺伝子が含まれているが、Ｅ
、ｃｏｌｉ ｒｅｃＡ蛋白の産生を誘導するナリジク
ス酸あるいはノルフロキシンなどの物質によってＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｒ ｅ ｃ Ａ遺伝子の発現は誘導
されないことを報告している［ ＡｎｔｉｌｉＣｒＯｂ
、 八ｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｎ＋ｏｔｈｅｒ、、
（１９８６） 、２９ ： １−６］。従って、Ｅ、
ｃｏｌ；ｒｅｃＡ遺伝子と類似した遺伝子がｐｓｅｕｄ
ｏｔｍｏｎａｓ中に６存在してはいるが、Ｐｓｅｕｄｏ
１０ｎａｓ ｒ ｅ ｃ Ａ蛋白のコントロール（例え
ば調節）は Ｅ、ｃｏｔ ｔの場合と相違している。それ故に、Ｅ、
ｃｏｊｉ ｒｅｃＡプロを一ターがＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓにおいて調節可能な状態で作用することは期待で
きず、またＥ、ｃｏｔ ｉの場合と同様の調節機構のも
とぐ作用することも明らかに期待することはできない。
また、公知のＥ、ｃａｉｉプロモーターの他のグラムネ
ガティブバクテリアでの調節及び公知のＥ、ｃａｐ ｔ
リポソーム結合部位の他のグラムネガティブバクテリア
での有効性については、未だ明らかにされていないこと
も事実である。従って、各秤のグラムネガティブバクテ
リアにおいて作用することのできる有効で確実にコント
ロールされ（例えば調節可能）且つ経済的に有利な発現
系を開発することが望まれている。
ガティブバクテリアでの調節及び公知のＥ、ｃａｐ ｔ
リポソーム結合部位の他のグラムネガティブバクテリア
での有効性については、未だ明らかにされていないこと
も事実である。従って、各秤のグラムネガティブバクテ
リアにおいて作用することのできる有効で確実にコント
ロールされ（例えば調節可能）且つ経済的に有利な発現
系を開発することが望まれている。
本発明の目的は、Ｅ、ｃｏｌ ｉに加えて他のグラムネ
ガティブバクテリアにおいてら作用することの田来る調
ｍ１１能な発現系を提供することにある。
ガティブバクテリアにおいてら作用することの田来る調
ｍ１１能な発現系を提供することにある。
発明の要旨
本発明によれば、１つの態様として、異種グラムネガテ
ィブバクテリア中にて目的とするポリペプチドをコード
する構造遺伝子を調節発現させる方法であって、該構造
遺伝子に作動可能な状態で連結したＥ、Ｃｏｆｉ ｒ
ｅｃＡプロモーターを誘導し、それによって該ポリペプ
チドを得ることを含む上記方法が提供される。好ましい
態様においては、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモータ
ーと構造遺伝子は、目的とする蛋白の産生を促進するバ
クテリオファージＴグリポソーム結合部位に作動可能な
状態で連結している。
ィブバクテリア中にて目的とするポリペプチドをコード
する構造遺伝子を調節発現させる方法であって、該構造
遺伝子に作動可能な状態で連結したＥ、Ｃｏｆｉ ｒ
ｅｃＡプロモーターを誘導し、それによって該ポリペプ
チドを得ることを含む上記方法が提供される。好ましい
態様においては、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモータ
ーと構造遺伝子は、目的とする蛋白の産生を促進するバ
クテリオファージＴグリポソーム結合部位に作動可能な
状態で連結している。
更に他の＠様として、本発明によれば、目的とするポリ
ペプチドをコードする構造遺伝子に！Ｉ動＋ｉＪ能な状
態で連結したＥ、Ｃｏ１１ ｒｅＣＡプロモーターと
広範囲宿主複製開始点とを含む組換えＤＮＡ発現ベヒク
ルであって、ｒｅＣＡプロモーターが異種グラムネガテ
ィブバクテリア中にて発現を誘導できるような状態で連
結されている上記組換えＤＮＡ発現ベヒクルが提供され
る。
ペプチドをコードする構造遺伝子に！Ｉ動＋ｉＪ能な状
態で連結したＥ、Ｃｏ１１ ｒｅＣＡプロモーターと
広範囲宿主複製開始点とを含む組換えＤＮＡ発現ベヒク
ルであって、ｒｅＣＡプロモーターが異種グラムネガテ
ィブバクテリア中にて発現を誘導できるような状態で連
結されている上記組換えＤＮＡ発現ベヒクルが提供され
る。
また本発明によれば、組換え非Ｅ、ｃｏＩｉ（Ｅ、ｃｏ
ｌ ｉ以外の）ゲノムネガティブバクテリアであって、
そのゲノムがＥ、ｃｏｔ ｔｒｅＣＡプロモーターを含
んでおり該プロモーターは本発明の発現ベヒクル及び方
法を用いて目的とするポリペプチドを産生ずることがぐ
きる組換え非Ｅ、ｃｏＪｉグラムネガティブバクテリア
が提供される。
ｌ ｉ以外の）ゲノムネガティブバクテリアであって、
そのゲノムがＥ、ｃｏｔ ｔｒｅＣＡプロモーターを含
んでおり該プロモーターは本発明の発現ベヒクル及び方
法を用いて目的とするポリペプチドを産生ずることがぐ
きる組換え非Ｅ、ｃｏＪｉグラムネガティブバクテリア
が提供される。
図面の説明
以下に示す図面においては、核酸配列は他にことわりの
ない限り５′末端から３′末端の方向で示されており、
ヌクレオシドアデノシン、グアニン、シトシン、チミン
はそれぞれΔ、Ｇ、Ｃ，王で略記されている。矢印の付
いた線は、ＤＮＡコード配列の５′末端から３′末端の
方向性を示している。’ｐｒｅｃ″はＥ、ｃｏｊ！ｉ
ｒｅｃＡプロモーター ｔｔ Ｐ 、 ：ｒはバクテ
リアファージラムダＰ、プロモータ １１３ Ｑ ＩＩ
はＳＤ配列。
ない限り５′末端から３′末端の方向で示されており、
ヌクレオシドアデノシン、グアニン、シトシン、チミン
はそれぞれΔ、Ｇ、Ｃ，王で略記されている。矢印の付
いた線は、ＤＮＡコード配列の５′末端から３′末端の
方向性を示している。’ｐｒｅｃ″はＥ、ｃｏｊ！ｉ
ｒｅｃＡプロモーター ｔｔ Ｐ 、 ：ｒはバクテ
リアファージラムダＰ、プロモータ １１３ Ｑ ＩＩ
はＳＤ配列。
”ａｍｐ”はアンピシリン耐性遺伝子。
ｏ Ｇ ｍ ｒｒはゲンタマイシン耐性遺伝子。
” ｌ ａ ｃ ；ｌ“はベーターガラクトシダーげ構
造遺伝子、ｔｔ ｋｂｎはキロベース、” ｏ ｒ ｉ
”は複製開始点を示す。制限酵素部位ら示されている
。矢印の付いた線があるＤＮＡｆＡ域は、本図面の説明
のためにのみ用いたものであって、他にことわりのない
限りそのスケールを示すものではない。
造遺伝子、ｔｔ ｋｂｎはキロベース、” ｏ ｒ ｉ
”は複製開始点を示す。制限酵素部位ら示されている
。矢印の付いた線があるＤＮＡｆＡ域は、本図面の説明
のためにのみ用いたものであって、他にことわりのない
限りそのスケールを示すものではない。
第１図は、合成２本鎖Ｇ１０Ｌ配列のＤＮＡ配列を示す
。下線を引いたヌクレオチドは天然のバクテリオファー
ジエフ遺伝子１０のヌクレオチドと相違するヌクレオチ
ドを示し、〈Ｈ＋）はＳＤ配列を示す。（Ｎｄｅｌ）は
、天然のバクテリオファージエフ遺伝子１０配列中のＮ
ｄｅｌ制限酵素部位を示す。
。下線を引いたヌクレオチドは天然のバクテリオファー
ジエフ遺伝子１０のヌクレオチドと相違するヌクレオチ
ドを示し、〈Ｈ＋）はＳＤ配列を示す。（Ｎｄｅｌ）は
、天然のバクテリオファージエフ遺伝子１０配列中のＮ
ｄｅｌ制限酵素部位を示す。
第２図は、第１図に示した合成Ｇ１０Ｌ配列の構成を示
し、セグメント＃１−＃６はそれぞれの合成オリゴヌク
レオチドを示す。
し、セグメント＃１−＃６はそれぞれの合成オリゴヌク
レオチドを示す。
第３図は、Ｐｒｅｃ、Ｇ１０Ｌ配４１（Ｇ１０Ｌｉ及び
アトリオベブチゲン（ＡＰｇｅｎ）構造遺伝子を含むｐ
ＭＯＮ５５１５の構築を示す。
アトリオベブチゲン（ＡＰｇｅｎ）構造遺伝子を含むｐ
ＭＯＮ５５１５の構築を示す。
第４図は、Ｐｒｅｃ、０１０Ｌ配列及びｐａｃＺ構造遺
伝子が挿入されたｐＥＭＢＬプラスミドを含むｐＭＯＮ
５５４２の構築を示す。
伝子が挿入されたｐＥＭＢＬプラスミドを含むｐＭＯＮ
５５４２の構築を示す。
第５図は、２つの広範囲宿主発現ベヒクルｐＭＯＮ５７
５７及びｐＭＯＮ５７５８であって、それぞれ、１ｎｃ
Ｑレプリコン（ＩｎｃＱ）、ゲンタマイシン耐性選択マ
ーカー遺伝子（Ｇｍ’ ”）。
５７及びｐＭＯＮ５７５８であって、それぞれ、１ｎｃ
Ｑレプリコン（ＩｎｃＱ）、ゲンタマイシン耐性選択マ
ーカー遺伝子（Ｇｍ’ ”）。
Ｐｒｅｃ、Ｇ１０Ｌ配列及びベーターガラクトシダーゼ
構造遺伝子（ＬａｃＺ）を含む上記発現ベヒクルの構築
を示す。
構造遺伝子（ＬａｃＺ）を含む上記発現ベヒクルの構築
を示す。
第６図は、プラスミドｐＭＯＮ５０１４゜ｐＭＯＮ５７
５６． ｐＭＯＮ５７５９．１）ＭＯＮ５７６０及びｐ
ＭＯＮ５７６１の構成を示す。
５６． ｐＭＯＮ５７５９．１）ＭＯＮ５７６０及びｐ
ＭＯＮ５７６１の構成を示す。
１乳Δ几！皇ヱｊ
本発明は、ｌ：、ｃｏｊ！ｉ ｒｅｃＡプロモーター
はＥ、ＣＯｊ！ ｉ以外のグラムネガティブ微生物にお
いて所望の構３２！遺伝子の発現を引き起こすこ）
とができると言う新たな知児に関するものである。
はＥ、ＣＯｊ！ ｉ以外のグラムネガティブ微生物にお
いて所望の構３２！遺伝子の発現を引き起こすこ）
とができると言う新たな知児に関するものである。
更に本発明は、Ｅ、ｃｏｉｉ ｒｅｃ、６．プロモー
ターは異種グラムネガティブ微生物中にて誘導すること
ができ、従って該微生物中にて目的とする生産物の産生
を調節することが可能であると古う新たな知見に関する
ものである。
ターは異種グラムネガティブ微生物中にて誘導すること
ができ、従って該微生物中にて目的とする生産物の産生
を調節することが可能であると古う新たな知見に関する
ものである。
これらの知見によって、新たな組換え異＋４（例えば非
Ｅ、ＣＯｉ’ｉ）グラムネガティブバクテリアであって
そのゲノムがＥ、ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーターを
含んでおり目的とする生産物の産生に有用な上記組換え
グラムネガティブバクテリアの造成が可能となった。更
にこれらの知見によって、目的とする構造遺伝子を広範
囲な微生物中にて発現させることができる組換え発現ベ
ヒクルの構築が可能となり、従って、これらの微生物を
、医学、化学及び農学上重要な生産物の商業的生産に使
用することが可能となった。
Ｅ、ＣＯｉ’ｉ）グラムネガティブバクテリアであって
そのゲノムがＥ、ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーターを
含んでおり目的とする生産物の産生に有用な上記組換え
グラムネガティブバクテリアの造成が可能となった。更
にこれらの知見によって、目的とする構造遺伝子を広範
囲な微生物中にて発現させることができる組換え発現ベ
ヒクルの構築が可能となり、従って、これらの微生物を
、医学、化学及び農学上重要な生産物の商業的生産に使
用することが可能となった。
１、 Ｅ、ｃｏｉｉ ｒｅｃＡプロ七−ターＥ、
ｃｏｐ ｒのｒｅｃＡ遺伝子は既にクローン化されてお
りそのヌクレオチド配列も決定されている［１１０ｒｉ
ｉ ｅｔ ａｔ、、 １９８０ 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ。
ｃｏｐ ｒのｒｅｃＡ遺伝子は既にクローン化されてお
りそのヌクレオチド配列も決定されている［１１０ｒｉ
ｉ ｅｔ ａｔ、、 １９８０ 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、 Ｕ、Ｓ、＾、 ７７ ：３１３−３１
７ ：５ａｎｃａｒｅｔ ａｌ、、 １ ９ ８
０ 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ
、、 Ｕ、Ｓ、八。
７ ：５ａｎｃａｒｅｔ ａｌ、、 １ ９ ８
０ 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ
、、 Ｕ、Ｓ、八。
７７ ： ２６１１−２６１５］。従って、Ｅ、Ｃ０ｆ
ｉ ｒｅｃＡプロモーター／オペレーター領域（以後
” ｐ ｒ ｅ ｃ ”と言う）は、化学合成及び／又
は適当なゲノムライブラリーからの単離などの慣用的手
段によって構築することができる。また、ｐｒｅＣは、
アメリカン・タイプ・カルチ１７−・コレクション（Ａ
Ｔ ＣＣ）受託番号６７０４４のＥ、ｃｏｆｉ Ｊ
Ｍ１０ｌに含まれているプラスミドｐＭＯＮ６００２か
ら３ａＩＩ−ＢＱＩ ＩＩ断片として単離することもで
きる。
ｉ ｒｅｃＡプロモーター／オペレーター領域（以後
” ｐ ｒ ｅ ｃ ”と言う）は、化学合成及び／又
は適当なゲノムライブラリーからの単離などの慣用的手
段によって構築することができる。また、ｐｒｅＣは、
アメリカン・タイプ・カルチ１７−・コレクション（Ａ
Ｔ ＣＣ）受託番号６７０４４のＥ、ｃｏｆｉ Ｊ
Ｍ１０ｌに含まれているプラスミドｐＭＯＮ６００２か
ら３ａＩＩ−ＢＱＩ ＩＩ断片として単離することもで
きる。
前記したように、ｐｒｅｃは、ＤＮＡ修復酵素として通
常機能しているｌ：、ｃｏｌｉ ｒｅｃＡ蛋白の発現
をコントロールすることができる。
常機能しているｌ：、ｃｏｌｉ ｒｅｃＡ蛋白の発現
をコントロールすることができる。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅＣＡプ０−Ｅ−９（ＤＭ４’））
’ｆＱには、一連の修復酵素が共に誘導される ［Ｋｅｎｙｏｎ、Ｃ，Ｊ、ｅｔ ａｔ、、 １９８２
、 Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ。
’ｆＱには、一連の修復酵素が共に誘導される ［Ｋｅｎｙｏｎ、Ｃ，Ｊ、ｅｔ ａｔ、、 １９８２
、 Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ。
１６０：４４５−４５７；Ｗａｌｋｅｒ、 Ｇ、Ｄ、、
１９８４ 、 Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、４８
： ６０−９３ ］。
１９８４ 、 Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、４８
： ６０−９３ ］。
ｐｒｅｃ及び関連遺伝子のＥ、ｃｏｌ １における誘導
は、ＤＮＡを修飾しあるいはＤＮＡにダメージを与える
ような条件によって達成される。このような条件には、
特に限定されないが、例えば、ナリジクス酸、ノルフロ
キシン、Ｅ、ｃｏ！ｔＤＮＡギラーゼ抑制因子またはマ
イトマイシンＣなどの物質の培養培地への添加、紫外線
照射、温度上昇、チミン欠損などがある。
は、ＤＮＡを修飾しあるいはＤＮＡにダメージを与える
ような条件によって達成される。このような条件には、
特に限定されないが、例えば、ナリジクス酸、ノルフロ
キシン、Ｅ、ｃｏ！ｔＤＮＡギラーゼ抑制因子またはマ
イトマイシンＣなどの物質の培養培地への添加、紫外線
照射、温度上昇、チミン欠損などがある。
本川Ｉｌｌ南で十分に記述される如く、本発明は、Ｅ、
ｃｏ、ａｉ ｒｅｃＡプロモーターは異種（例えば非Ｅ
、Ｃ０１ｉ）グラムネガティブバクテリア中においても
調節することかでき、従って所望の構造遺伝子を該バク
テリア中にて発現させることができると言う知見に関す
るものである。かかる知見から、Ｅ、Ｃ０ｊｊ ｉにお
いてＰｒｅＣを誘導する物質及び／又は条件によって異
種グラムネガティブバクテリアにおいてもＰｒｅＧを誘
導することができることが理解されよう。更には、かか
る知見から、共に発現されるＤＮＡ修復酵素の発現をコ
ントロールするプロモーター［ＫｅｎｙＯｒ。
ｃｏ、ａｉ ｒｅｃＡプロモーターは異種（例えば非Ｅ
、Ｃ０１ｉ）グラムネガティブバクテリア中においても
調節することかでき、従って所望の構造遺伝子を該バク
テリア中にて発現させることができると言う知見に関す
るものである。かかる知見から、Ｅ、Ｃ０ｊｊ ｉにお
いてＰｒｅＣを誘導する物質及び／又は条件によって異
種グラムネガティブバクテリアにおいてもＰｒｅＧを誘
導することができることが理解されよう。更には、かか
る知見から、共に発現されるＤＮＡ修復酵素の発現をコ
ントロールするプロモーター［ＫｅｎｙＯｒ。
Ｃ，Ｊ、ｅｔ ａｔ、、 １９８２ ：Ｗａｌｋｅｒ
、 Ｇ、Ｃ，、１９８４１も、異種グラムネガティブバ
クテリアにおける所望の構造遺伝子の発現誘導に使用で
きると言うことが予想される。
、 Ｇ、Ｃ，、１９８４１も、異種グラムネガティブバ
クテリアにおける所望の構造遺伝子の発現誘導に使用で
きると言うことが予想される。
本発明の１つの態様においては、誘埼試桑又は条件とし
てナリジクス酸が使用される。
てナリジクス酸が使用される。
Ｅ、ｃｏＪｉ ｒｅｃＡプロモーターのコントロール
下でＤＮＡ配列の発現誘導に適したナリジクス酸の最適
濃度は、通常の技術によって決定することができ、また
それは用いる宿ｉｓ胞と培地によって変動する。ナリジ
クス酸の好ましい濃度範囲は、約５０−約１０００μｇ
／ｄ、最も好ましい範囲は、約５０−約１００μｇ／Ｉ
ＩＩである。
下でＤＮＡ配列の発現誘導に適したナリジクス酸の最適
濃度は、通常の技術によって決定することができ、また
それは用いる宿ｉｓ胞と培地によって変動する。ナリジ
クス酸の好ましい濃度範囲は、約５０−約１０００μｇ
／ｄ、最も好ましい範囲は、約５０−約１００μｇ／Ｉ
ＩＩである。
Ｅ、ｃｏＪｉ ｒｅｃＡプロモーター及びそれに関連
して発現される（即ち誘導される）プロモーターを誘導
するＥ記した条件の最適化は、通常の方法によって達成
することができる。
して発現される（即ち誘導される）プロモーターを誘導
するＥ記した条件の最適化は、通常の方法によって達成
することができる。
例えば、構造遺伝子及び／又は各種の転写及び翻訳調節
配列（例えば発現コンポーネント）を含むＤＮＡ分子に
ｐｒｅｃを作動可能な状態で連結するには、生物学的方
法及び／又は酵素的方法及び／又は化学的方法、例えば
、リガーピを用いる方法などを用いる。得られる組換え
ＤＮＡにおいては、ｐｒｅｃ、ＤＮＡコード配列及び／
又は所望のペプチド産生に関連した他のコンポーネント
もしくは領域は、隣接していても隣接していなくともよ
く、ｐｒｅＣが目的とする構造遺伝子の転写を誘導でき
ればよい。Ｐｒｅｃは、目的とする生産物の産生もしく
は活性に関連した蛋白らしくはＰ？Ｐ索の構造遺伝子に
連結させることができる。
配列（例えば発現コンポーネント）を含むＤＮＡ分子に
ｐｒｅｃを作動可能な状態で連結するには、生物学的方
法及び／又は酵素的方法及び／又は化学的方法、例えば
、リガーピを用いる方法などを用いる。得られる組換え
ＤＮＡにおいては、ｐｒｅｃ、ＤＮＡコード配列及び／
又は所望のペプチド産生に関連した他のコンポーネント
もしくは領域は、隣接していても隣接していなくともよ
く、ｐｒｅＣが目的とする構造遺伝子の転写を誘導でき
ればよい。Ｐｒｅｃは、目的とする生産物の産生もしく
は活性に関連した蛋白らしくはＰ？Ｐ索の構造遺伝子に
連結させることができる。
本発明の１つの態様においては、限られたあるいは広範
囲宿主のり［１−ニングベクター及び発現ベクタ線中の
各種の真核及び原核生物構造遺伝子に、ｐｒｅｃを連結
することができる。広範囲宿主発現ベヒクル中の構造遺
伝子にｐｒｅｃを作動可能な状態で連結することによっ
て、ｐｒｅｃは広範囲グラムネガティブバクテリア中に
て調節可能な発現を引き起こすことができることが見出
された。
囲宿主のり［１−ニングベクター及び発現ベクタ線中の
各種の真核及び原核生物構造遺伝子に、ｐｒｅｃを連結
することができる。広範囲宿主発現ベヒクル中の構造遺
伝子にｐｒｅｃを作動可能な状態で連結することによっ
て、ｐｒｅｃは広範囲グラムネガティブバクテリア中に
て調節可能な発現を引き起こすことができることが見出
された。
２、所望のポリペプチドをコードする構゛告遺−子の調
製 ここで用いる゛構造遺伝子″とは、所望のあるいは目的
とするポリペプチドもしくはその断片をコードするＤＮ
Ａ配列もしくは分子を意味する。
製 ここで用いる゛構造遺伝子″とは、所望のあるいは目的
とするポリペプチドもしくはその断片をコードするＤＮ
Ａ配列もしくは分子を意味する。
このようなＤＮＡ配列もしくは分子は、化学的に合成す
ることができ、適当なゲノムもしくはｃＤＮＡライブラ
リーから単離することができ、及び／又は通常の手段に
よって？ｉｌ素的に構築することができる。−旦化学的
に合成されあるいは単離された場合には、本発明の構造
遺伝ｆ及び／又は他のＤＮＡ配列は、以後に詳細に説明
するように、本質的に純粋な核酸配列もしくは分子であ
ることを示す。本発明の核酸配列（例えばＤＮＡ。
ることができ、適当なゲノムもしくはｃＤＮＡライブラ
リーから単離することができ、及び／又は通常の手段に
よって？ｉｌ素的に構築することができる。−旦化学的
に合成されあるいは単離された場合には、本発明の構造
遺伝ｆ及び／又は他のＤＮＡ配列は、以後に詳細に説明
するように、本質的に純粋な核酸配列もしくは分子であ
ることを示す。本発明の核酸配列（例えばＤＮＡ。
ＲＮＡ）を表わす時に用いる゛本質的に純粋″と言う言
葉は、天然では共に存在する核酸配列を含まない核酸配
列を意味する。本質的に純粋な核酸配列もしくは分子の
例としては、これらに限定されないが、例えば、大きな
分子（天然に生じる）から酵素的にもしくは化学的に遊
離された核酸配列、天然の介在配列もしくは隣接配列を
含まない化学的に合成された核酸配列、あるいは、天然
では共に存在しないあるいは結合していない配列もしく
は分子と一緒になった核酸配列などが挙げられる。この
ように、本質的に純粋な分子が創製される方法による場
合には、本質的に純粋な分子は時として”合成″核酸配
列もしくは分子と言うことがある。
葉は、天然では共に存在する核酸配列を含まない核酸配
列を意味する。本質的に純粋な核酸配列もしくは分子の
例としては、これらに限定されないが、例えば、大きな
分子（天然に生じる）から酵素的にもしくは化学的に遊
離された核酸配列、天然の介在配列もしくは隣接配列を
含まない化学的に合成された核酸配列、あるいは、天然
では共に存在しないあるいは結合していない配列もしく
は分子と一緒になった核酸配列などが挙げられる。この
ように、本質的に純粋な分子が創製される方法による場
合には、本質的に純粋な分子は時として”合成″核酸配
列もしくは分子と言うことがある。
］」的とするポリペプチドのアミノ酸配列が公知の場合
には、遺伝子コードに基づいて複数の構造遺伝子又はＤ
ＮＡコード配列を構築することができる。構造遺伝子を
構築する際に用いるアミノ酸コドンは、得られる配列の
転写及び翻訳（例えば構Ｂ遺伝子の発現）並びに宿主細
胞中での目的とする遺伝子生産物の蓄積が最も効率良く
起こるような配列となるように選択される。
には、遺伝子コードに基づいて複数の構造遺伝子又はＤ
ＮＡコード配列を構築することができる。構造遺伝子を
構築する際に用いるアミノ酸コドンは、得られる配列の
転写及び翻訳（例えば構Ｂ遺伝子の発現）並びに宿主細
胞中での目的とする遺伝子生産物の蓄積が最も効率良く
起こるような配列となるように選択される。
構造遺伝子によりコードされる生産物又は構造遺伝子に
よりコードされる蛋白から得られる生産物としては、有
用ポリペプチドもしくはペプチドが典型的な例である。
よりコードされる蛋白から得られる生産物としては、有
用ポリペプチドもしくはペプチドが典型的な例である。
このような生産物には、原核生物及び真核生物起源の蛋
白が含まれる。本川ＩＩ潟においては、ブタ成長ホルモ
ンなどの動物成長囚ｆ又はベーターガラクトシダーゼな
どの原核生物酵素をコードする構造遺伝子の発現の成功
例が具体的に記載されているが、本明ｍ占で言う”構造
遺伝子″とは、公知の蛋白及びアミノ酸配列をコードす
るほとんど全部のＤＮＡ配列を含む意味で用いられる。
白が含まれる。本川ＩＩ潟においては、ブタ成長ホルモ
ンなどの動物成長囚ｆ又はベーターガラクトシダーゼな
どの原核生物酵素をコードする構造遺伝子の発現の成功
例が具体的に記載されているが、本明ｍ占で言う”構造
遺伝子″とは、公知の蛋白及びアミノ酸配列をコードす
るほとんど全部のＤＮＡ配列を含む意味で用いられる。
このような蛋白としては、これらに限定されないが、例
えば、神経成長因子。
えば、神経成長因子。
心房ペプチド、インシュリン様成長因子、形質転換成長
因子α９表皮成長因子１組織プラスミノーゲン活性化因
子、ウィルス抗原、インター［１イキン、ウシ成長ホル
モンなどが挙げられる。更には、ポリアミノ酸、融合蛋
白、調節蛋白、ブ［１テア一ゼ２分泌もしくは排泄され
るポリペプチド及びペプチド断片なども本発明で言う構
造遺伝子によりコードすることができ、従って本発明に
より製造することができる。本発明の材料及び方法によ
って産生きれるこれらの蛋白及び他の蛋白は、当業者に
公知の方法により、回収し及び／又はそれぞれ天然の形
態に再構成することができる。
因子α９表皮成長因子１組織プラスミノーゲン活性化因
子、ウィルス抗原、インター［１イキン、ウシ成長ホル
モンなどが挙げられる。更には、ポリアミノ酸、融合蛋
白、調節蛋白、ブ［１テア一ゼ２分泌もしくは排泄され
るポリペプチド及びペプチド断片なども本発明で言う構
造遺伝子によりコードすることができ、従って本発明に
より製造することができる。本発明の材料及び方法によ
って産生きれるこれらの蛋白及び他の蛋白は、当業者に
公知の方法により、回収し及び／又はそれぞれ天然の形
態に再構成することができる。
発現ベヒクルもしくはベクターは、バクテリア宿主細胞
を形質転換することができ且つ該細胞にて所望の遺伝子
の発現を引き起こすことのできるファージ、トランスボ
ゾン又はコスミドＤＮＡ’７どのＤＮＡ分子を含むもの
である。ベクターが宿主細胞中にて活性を保持しながら
維持されるためには、ベクターは、典型的には、？ｌＪ
開始点（ｏｒｉ）、宿主細胞中での複製が促進されるの
に必要な酵素もしくは蛋白をコードする遺伝子を有して
いる。更には、好ましくは、当該ベクターを保持するバ
クテリア細胞の選択を１可能にする例えば薬剤耐性マー
カーなどの選択マーカーを有し、且つ、プロモーター（
即らｐｒｅｃ）、リポソーム結合部位、翻訳開始シグナ
ルコドン（ＡＴＧ）及び構造遺伝子（例えば所望の蛋白
もしくはペプチドをコードするＤＮＡ配列）を当該ベク
ターに挿入するための各種ユニーク制限酵素部位を有し
ている。
を形質転換することができ且つ該細胞にて所望の遺伝子
の発現を引き起こすことのできるファージ、トランスボ
ゾン又はコスミドＤＮＡ’７どのＤＮＡ分子を含むもの
である。ベクターが宿主細胞中にて活性を保持しながら
維持されるためには、ベクターは、典型的には、？ｌＪ
開始点（ｏｒｉ）、宿主細胞中での複製が促進されるの
に必要な酵素もしくは蛋白をコードする遺伝子を有して
いる。更には、好ましくは、当該ベクターを保持するバ
クテリア細胞の選択を１可能にする例えば薬剤耐性マー
カーなどの選択マーカーを有し、且つ、プロモーター（
即らｐｒｅｃ）、リポソーム結合部位、翻訳開始シグナ
ルコドン（ＡＴＧ）及び構造遺伝子（例えば所望の蛋白
もしくはペプチドをコードするＤＮＡ配列）を当該ベク
ターに挿入するための各種ユニーク制限酵素部位を有し
ている。
本発明の１つの態様においては、クローニングベヒクル
らしくは発現ベヒクルには、バクテリアの少なくとも１
つの属において複製することのできるプラスミドＤＮＡ
分子が含まれており、そして好ましくは、これらのベヒ
クルは形質転換細胞中にて高コピー数で存在することが
でき且つ安定に維持されるのが望ましい。本明細書にお
いて用いる゛限られた範囲の宿主ベクターもしくはベヒ
クル″とは、あるベクターがバクテリアの１つもしくは
２，３の属においてしか複製できないことを意味する。
らしくは発現ベヒクルには、バクテリアの少なくとも１
つの属において複製することのできるプラスミドＤＮＡ
分子が含まれており、そして好ましくは、これらのベヒ
クルは形質転換細胞中にて高コピー数で存在することが
でき且つ安定に維持されるのが望ましい。本明細書にお
いて用いる゛限られた範囲の宿主ベクターもしくはベヒ
クル″とは、あるベクターがバクテリアの１つもしくは
２，３の属においてしか複製できないことを意味する。
本発明の１つの態様においては、広範囲宿主ベヒクルが
使用される。本発明において有用な広範囲用宿主クロー
ニングベヒクルもしくは発現ベヒクルとしては、例えば
、バクテリアの２つもしくはそれ以上の属において機能
でることのできる複製開始点を最低限有しでおり、そし
て望ましくはプラスミドＤＮＡの複製に必要な酵素もし
くは蛋白をフードする遺伝子を有しているプラスミドが
挙げられる。このような広範囲宿主ベクターの例として
は、ＩｎｃＰ−１，ＩｎｃＰ−２，ＩｎｃＷ、ＩｎｃＮ
、ＩｎｃＱ、あるいはＢｕｋｈａｒｉ、八、■。
使用される。本発明において有用な広範囲用宿主クロー
ニングベヒクルもしくは発現ベヒクルとしては、例えば
、バクテリアの２つもしくはそれ以上の属において機能
でることのできる複製開始点を最低限有しでおり、そし
て望ましくはプラスミドＤＮＡの複製に必要な酵素もし
くは蛋白をフードする遺伝子を有しているプラスミドが
挙げられる。このような広範囲宿主ベクターの例として
は、ＩｎｃＰ−１，ＩｎｃＰ−２，ＩｎｃＷ、ＩｎｃＮ
、ＩｎｃＱ、あるいはＢｕｋｈａｒｉ、八、■。
ｅｔ、ａｌ、、 ｅｄｓ、 （１９７９） （
Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉｒ＋ｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋｐｐ、６０１−６７０に
記載されたベクターなどがある。
Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉｒ＋ｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋｐｐ、６０１−６７０に
記載されたベクターなどがある。
本発明の１つの態様においては広範囲宿主発現ベヒクル
は、より限られた範囲の宿主クローニングベクターもし
くは発現ベクターと、広範囲宿主複製開始点及び複製遺
伝子を右するＤＮＡ分子とを融合することによって得る
ことができる。好ましい態様においては、広範囲宿主複
製開始点及びＩｎＣＱ？Ｑ製遺伝子（” ｌ ｎ ｃ
Ｑレプリコーン″又は’ｒｎｃＱ″）が用いられる。［
ｎｃＱレプリコーンは、Ｇｅｕｒｒｙ、Ｐ、ｃｔ ａｔ
、、 １９７４ 。
は、より限られた範囲の宿主クローニングベクターもし
くは発現ベクターと、広範囲宿主複製開始点及び複製遺
伝子を右するＤＮＡ分子とを融合することによって得る
ことができる。好ましい態様においては、広範囲宿主複
製開始点及びＩｎＣＱ？Ｑ製遺伝子（” ｌ ｎ ｃ
Ｑレプリコーン″又は’ｒｎｃＱ″）が用いられる。［
ｎｃＱレプリコーンは、Ｇｅｕｒｒｙ、Ｐ、ｃｔ ａｔ
、、 １９７４ 。
Ｊ、Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、 １１７ ： ６１９−６３
０に記載されており、この文献を不明ＨＪ書に引用する
。前記したように、機能性発現ベクターには、構造遺伝
子の完全な転写及び目的とする蛋白生産物をコードする
メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳に必要なＤＮ
Ａ配列も含まれている。
０に記載されており、この文献を不明ＨＪ書に引用する
。前記したように、機能性発現ベクターには、構造遺伝
子の完全な転写及び目的とする蛋白生産物をコードする
メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳に必要なＤＮ
Ａ配列も含まれている。
前記したように、また以後の実施例にて示すように、本
発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅＣＡプロモーター（ｐｒ
ｅｃ）が異種グラムネガティブバクテリアにて所望の構
造遺伝子の転写を誘導できると言う知見に関するもので
ある。所望の構造遺伝子をｍＲＮＡ分子に完全に転写す
るために必要なものとしてｐｒｅｃのみが示されている
が、Ｐｒｅｃに加えて転写コントロールエレメントを、
構造遺伝子に連結されたｐｒｅｃを含む発現ベヒクルに
含有させることもできる。このような転写コントロール
エレメント（例えば配列）には、特に限定されないが、
例えば転写ウーミネーション配列がある。
発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅＣＡプロモーター（ｐｒ
ｅｃ）が異種グラムネガティブバクテリアにて所望の構
造遺伝子の転写を誘導できると言う知見に関するもので
ある。所望の構造遺伝子をｍＲＮＡ分子に完全に転写す
るために必要なものとしてｐｒｅｃのみが示されている
が、Ｐｒｅｃに加えて転写コントロールエレメントを、
構造遺伝子に連結されたｐｒｅｃを含む発現ベヒクルに
含有させることもできる。このような転写コントロール
エレメント（例えば配列）には、特に限定されないが、
例えば転写ウーミネーション配列がある。
前記したように、所望のペプチドもしくはその断片をコ
ードするｍ ＲＮ Ａ分子を所望のそれらの蛋白に翻訳
するには、先ずｍＲＮＡ分子が宿主細胞のリポソームに
結合することが必要である。この結合は、ｍＲＮＡ分子
中に存在するリポソーム結合部位もしくは配列（以後Ｓ
Ｄ配列ｂｔ、＜はＳＤと言う）によって達成される。Ｓ
Ｄ配列は、通常はプロモーター配列と転写間始シグナル
コドンとの間に位置しており、好ましくは、転写開始シ
グナルコドンから約５−約９ｊ！ａ基対上流に位置して
いる。
ードするｍ ＲＮ Ａ分子を所望のそれらの蛋白に翻訳
するには、先ずｍＲＮＡ分子が宿主細胞のリポソームに
結合することが必要である。この結合は、ｍＲＮＡ分子
中に存在するリポソーム結合部位もしくは配列（以後Ｓ
Ｄ配列ｂｔ、＜はＳＤと言う）によって達成される。Ｓ
Ｄ配列は、通常はプロモーター配列と転写間始シグナル
コドンとの間に位置しており、好ましくは、転写開始シ
グナルコドンから約５−約９ｊ！ａ基対上流に位置して
いる。
１つの態様においては、ここで用いられるＳＤ配列は以
下の配列を含む。
下の配列を含む。
Ｂｇｌｌｌ Ｎｃａ１５°−＾ＧＡ
ＴＣＴＧＴＴＧＴ八＾ＧＧＡＧＴＣＴ＾へＡＣＣＡＴＧ
Ｇ−３’ＴＣＴ八ＧＡＣＡＡＣＡ ｒＴｃｃＴｃＡＧ＾
ＴＣＴＧＧＴ＾Ｃにこで、（＋÷＋）はＥ、ｃｏｉｉリ
ポソームＲＮＡに相補的なヌクレオチドを示し、上記の
全配列がこれまでに報告されているＳＤ配列［５ｃｈｅ
ｒｅｒ ｅｔ ａｌ、、 １９８０ 、 Ｎｕｃ、Ａ
ｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、８ ：３８９５−３９０５］から誘
導された合成配列を示している。上記の配列を、以ｍコ
ンセンサス（ｃｏｎｓ）リポソーム結合部位と言う。上
記のＦ３ＱＩ ＩＩ及びＮＣ０Ｉ制限酵素部位の存在に
より、上記配列を発現ベクタ線中に所望の方向で挿入す
ることが可能であり、また発現ベクタ線中の構造遺伝子
の直前に翻訳開始コドンを造成することが可能となる。
ＴＣＴＧＴＴＧＴ八＾ＧＧＡＧＴＣＴ＾へＡＣＣＡＴＧ
Ｇ−３’ＴＣＴ八ＧＡＣＡＡＣＡ ｒＴｃｃＴｃＡＧ＾
ＴＣＴＧＧＴ＾Ｃにこで、（＋÷＋）はＥ、ｃｏｉｉリ
ポソームＲＮＡに相補的なヌクレオチドを示し、上記の
全配列がこれまでに報告されているＳＤ配列［５ｃｈｅ
ｒｅｒ ｅｔ ａｌ、、 １９８０ 、 Ｎｕｃ、Ａ
ｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、８ ：３８９５−３９０５］から誘
導された合成配列を示している。上記の配列を、以ｍコ
ンセンサス（ｃｏｎｓ）リポソーム結合部位と言う。上
記のＦ３ＱＩ ＩＩ及びＮＣ０Ｉ制限酵素部位の存在に
より、上記配列を発現ベクタ線中に所望の方向で挿入す
ることが可能であり、また発現ベクタ線中の構造遺伝子
の直前に翻訳開始コドンを造成することが可能となる。
本発明の１つの好ましい態様においては、バクテリオフ
ァージエフ遺伝子１０コード配列の翻訳開始コドンの直
ぐ上流（５′側）の最初の約１０４個のヌクレオチドか
ら得られる配列中にＳＤ配列が含まれている。この約１
０４個のヌクレオチド配列には、バクテリＡファージＴ
７遺伝子１０蛋白のプロモーターと遺伝子１０ ｍ ｌ
’＜ Ｎ Ａの５′非翻訳領域とが含まれている。この
ＤＮＡもしくはそのＲＮＡ配列もしくはそれらの断片を
、以後まとめて１ゝＧ１０Ｌ配列″と言う。これについ
ては欧州特許公開Ｎ１１２４１．４４６ （１９８７年
１０月１４日公開）に詳細に記載されており、この公報
を本川ａａに引用する。
ァージエフ遺伝子１０コード配列の翻訳開始コドンの直
ぐ上流（５′側）の最初の約１０４個のヌクレオチドか
ら得られる配列中にＳＤ配列が含まれている。この約１
０４個のヌクレオチド配列には、バクテリＡファージＴ
７遺伝子１０蛋白のプロモーターと遺伝子１０ ｍ ｌ
’＜ Ｎ Ａの５′非翻訳領域とが含まれている。この
ＤＮＡもしくはそのＲＮＡ配列もしくはそれらの断片を
、以後まとめて１ゝＧ１０Ｌ配列″と言う。これについ
ては欧州特許公開Ｎ１１２４１．４４６ （１９８７年
１０月１４日公開）に詳細に記載されており、この公報
を本川ａａに引用する。
バクテリオファージＴ７グノムの全ＤＮＡ配列は、Ｄｕ
ｎｎと５ｔｕｄ ｔｅｒによって１９８３年に報告され
ており、本明細書にそれらを引用する。本発明で用いら
れるＧ１０Ｌ配列は、バクテリオファージＴ７ＤＮＡゲ
ノムを単離し、次いで当業者に公知の方法によってそこ
からＧ１０Ｌ配列を分離することによって４！？ること
ができる。あるいは、本発明のＧ１０Ｌ配列は通常の方
法によって独自に合成することもできる。
ｎｎと５ｔｕｄ ｔｅｒによって１９８３年に報告され
ており、本明細書にそれらを引用する。本発明で用いら
れるＧ１０Ｌ配列は、バクテリオファージＴ７ＤＮＡゲ
ノムを単離し、次いで当業者に公知の方法によってそこ
からＧ１０Ｌ配列を分離することによって４！？ること
ができる。あるいは、本発明のＧ１０Ｌ配列は通常の方
法によって独自に合成することもできる。
本発明の１つの態様においては、バクテリオファージエ
フ遺伝子１０のコード配列の直ぐ上流の最初の約１０４
個の塩基対（ｂｐ）に相当するＤＮＡセグメントは、バ
クテリオファージ丁７ゲノムの公知の配列［Ｄｕｎｎと
５ｔｕｄｉｅｒ （１９８３） ］に基づいて化学的
合成により構築することができる。具体的には、第１図
に示したＧ１０Ｌ配列が構築され、これは以下に示す修
止を除けば天然のＧ１０Ｌ配列に対応するものである。
フ遺伝子１０のコード配列の直ぐ上流の最初の約１０４
個の塩基対（ｂｐ）に相当するＤＮＡセグメントは、バ
クテリオファージ丁７ゲノムの公知の配列［Ｄｕｎｎと
５ｔｕｄｉｅｒ （１９８３） ］に基づいて化学的
合成により構築することができる。具体的には、第１図
に示したＧ１０Ｌ配列が構築され、これは以下に示す修
止を除けば天然のＧ１０Ｌ配列に対応するものである。
即ち、ＢＱｊ！ Ｉ及び△ｐａＩ制限Ｍ桑部位がＧ１０
Ｌ配列の５′末端に挿入されており、またＮ ｃ ｏ
Ｉ ＆１１限酵素部位が０１０Ｌ配列の３′末端に挿入
されている。これらの制限酵素部位が挿入された結果、
第１図に下線で示したようなヌクレオチドの置換が行な
われた。Ｇ１０［配列の末端にこれらの２つの制限酵素
部位が挿入されることによって、該０１０Ｌ断片を発現
ベクターもしくは発現ベヒクルに挿入することが容易と
なる。Ｇ１０Ｌ配列を本発明の望ましい発現ベクターに
挿入するための好ましい制限酵素部位としてＢＣＪＪ！
ＩＩとＮＣ０Ｉとを示したが、他の通常の制限酵素部
位を用いることもできる。あるいはまた、例えばクロー
ニングベヒクルもしくは発現ベヒクル又はクロモシーム
ＤＮＡに核酸分子を挿入あるいは連結する伯の公知の方
法を用いることもできる。このような方法としては、こ
れらに限定されないが、例えば平滑末端リゲーション、
あるいは構造遺伝子にＧ１０Ｌ配列が作動可能な状態で
連結されている核ＭＩＩ片の化学的合成法［Ｈａｎｉａ
ｔｉｓ ｅｊ ａｔ、、 １９８２ 、 Ｈｏｌｅｗ
ｌａｒ Ｃ１０ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ。
Ｌ配列の５′末端に挿入されており、またＮ ｃ ｏ
Ｉ ＆１１限酵素部位が０１０Ｌ配列の３′末端に挿入
されている。これらの制限酵素部位が挿入された結果、
第１図に下線で示したようなヌクレオチドの置換が行な
われた。Ｇ１０［配列の末端にこれらの２つの制限酵素
部位が挿入されることによって、該０１０Ｌ断片を発現
ベクターもしくは発現ベヒクルに挿入することが容易と
なる。Ｇ１０Ｌ配列を本発明の望ましい発現ベクターに
挿入するための好ましい制限酵素部位としてＢＣＪＪ！
ＩＩとＮＣ０Ｉとを示したが、他の通常の制限酵素部
位を用いることもできる。あるいはまた、例えばクロー
ニングベヒクルもしくは発現ベヒクル又はクロモシーム
ＤＮＡに核酸分子を挿入あるいは連結する伯の公知の方
法を用いることもできる。このような方法としては、こ
れらに限定されないが、例えば平滑末端リゲーション、
あるいは構造遺伝子にＧ１０Ｌ配列が作動可能な状態で
連結されている核ＭＩＩ片の化学的合成法［Ｈａｎｉａ
ｔｉｓ ｅｊ ａｔ、、 １９８２ 、 Ｈｏｌｅｗ
ｌａｒ Ｃ１０ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｔｌａｒｂｏｒ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］などが挙げられる。
ａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｔｌａｒｂｏｒ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］などが挙げられる。
約１０４個のＭＡ基対（ｂｐ）の全ＧＩ ＯＬ配列には
バクテリオファージエフプロモーター配列が含まれてい
るが、この配列はＥ、ｃｏｊ！ｉ ＲＮＡポリメラー
ゼによっては認識されず、それ自身のＴ７でコードされ
るＲＮＡポリメラーゼが必要であることが示された。実
際に以後の実施例５で丞すように、Ｔ７遺伝子１０プロ
モーターは、それが挿入された全てのバクテリアにおい
て所望の構造遺伝子の調節発現を引き起こすことができ
ない。
バクテリオファージエフプロモーター配列が含まれてい
るが、この配列はＥ、ｃｏｊ！ｉ ＲＮＡポリメラー
ゼによっては認識されず、それ自身のＴ７でコードされ
るＲＮＡポリメラーゼが必要であることが示された。実
際に以後の実施例５で丞すように、Ｔ７遺伝子１０プロ
モーターは、それが挿入された全てのバクテリアにおい
て所望の構造遺伝子の調節発現を引き起こすことができ
ない。
Ｐｒｅｃが欠失している発現ベクターを保持している形
質転換生物において無視できる程度の目的とする遺伝子
生産物が検出されているが、これは発現ベクタ線中に保
持されている他のブ臼モーターにより誘導されたものと
考えられる。
質転換生物において無視できる程度の目的とする遺伝子
生産物が検出されているが、これは発現ベクタ線中に保
持されている他のブ臼モーターにより誘導されたものと
考えられる。
本発明の好ましい態様においては、広範囲宿主発現ベヒ
クルは、Ｐｒｅｃ、Ｇ１０Ｌ、１１訳開始シグナルコド
ン次いで＃４造遺伝子の順でこれらのＤＮＡ配列が含ま
れるように構築される。このようなベクターは、１ｎｃ
Ｑレプリコーンを含んでもよく、また好ましくは選択マ
ーカーを含んでいる。このようなベクターの具体例とし
ては、これらに限定されないが、例えば、以下の実施例
に示すｐＭＯＮ５７５６．ｐＭＯＮ５７５７及びｐＭＯ
Ｎ５７５８ （第５図）が挙げられる。
クルは、Ｐｒｅｃ、Ｇ１０Ｌ、１１訳開始シグナルコド
ン次いで＃４造遺伝子の順でこれらのＤＮＡ配列が含ま
れるように構築される。このようなベクターは、１ｎｃ
Ｑレプリコーンを含んでもよく、また好ましくは選択マ
ーカーを含んでいる。このようなベクターの具体例とし
ては、これらに限定されないが、例えば、以下の実施例
に示すｐＭＯＮ５７５６．ｐＭＯＮ５７５７及びｐＭＯ
Ｎ５７５８ （第５図）が挙げられる。
このようなベクターが構築された場合には、その内にあ
る」ンボーネントを通常の方法によって他のコンポーネ
ントに交換することができる。例えば、Ｇ１０Ｌ配列及
び／又は構造遺伝子に接している制限酵素部位を利用し
て、他のＳＤ配列及び／又は他の構造遺伝子を酵素的も
しくは化学的結合によって挿入することができる。更に
は、形質転換マーカーとして他の抗生物質耐性遺伝子と
置換することもできる。
る」ンボーネントを通常の方法によって他のコンポーネ
ントに交換することができる。例えば、Ｇ１０Ｌ配列及
び／又は構造遺伝子に接している制限酵素部位を利用し
て、他のＳＤ配列及び／又は他の構造遺伝子を酵素的も
しくは化学的結合によって挿入することができる。更に
は、形質転換マーカーとして他の抗生物質耐性遺伝子と
置換することもできる。
４、宿主細胞
本発明において証明されるように、本発明に包含される
発現ベヒクルを用いて、Ｅ、ｃｏｔ ｒ。
発現ベヒクルを用いて、Ｅ、ｃｏｔ ｒ。
Ｐｓｅｕｄｏｎｉｏｎａｓ 、 Ｓｅｒｒａｔｉａ、
Ｅｒｗｉｎｉａ 、 Ｐｒｏｔｅｕｓ 。
Ｅｒｗｉｎｉａ 、 Ｐｒｏｔｅｕｓ 。
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ 、 Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔ
ｅｒ 、 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ。
ｅｒ 、 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ。
Ｖｉｂｒｉｏ、 ＾ｅｒｏｍｏｎａｓ 、 Ｚｙ
＋ｇｏｍｏｎａｓ 。
＋ｇｏｍｏｎａｓ 。
ＦＩａＶＯｂａＣｔＱｒｉｕｌｌ、＾ｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ 、 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ。
ｅｓ 、 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ。
にＩｅｂｓｉｅｌｌａ、 Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ
、 Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 。
、 Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 。
＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 、 ８ｒａｄｙｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍなどのグラムネガティブバクテリアを形質転
換することができる１゜本川１１１ｍ１ｍにおいて言う
゛異種″とは、グラムネガティブバクテリアに対して用
いる場合には、本来Ｅ、ｃｏｊ！ｉ ｒｅｃＡプロモ
ーターを有していないバクテリアを意味する。また゛形
質転換″とは、宿主細胞のゲノムに外来ＤＮＡを導入す
るいずれの方法をも含む意味である。このような方法と
しては、これらに限定されるものではないが、例えば、
形質転換、形質導入、コンジュゲーション、トランスフ
ェクション、クロモシームＤ Ｎ Ａへの組込みなどが
挙げられる。゛１ゲノム“とは、染色体ＤＮＡ及び染色
体外ＤＮＡの両者を含む意味である。
ｏｂｉｕｍなどのグラムネガティブバクテリアを形質転
換することができる１゜本川１１１ｍ１ｍにおいて言う
゛異種″とは、グラムネガティブバクテリアに対して用
いる場合には、本来Ｅ、ｃｏｊ！ｉ ｒｅｃＡプロモ
ーターを有していないバクテリアを意味する。また゛形
質転換″とは、宿主細胞のゲノムに外来ＤＮＡを導入す
るいずれの方法をも含む意味である。このような方法と
しては、これらに限定されるものではないが、例えば、
形質転換、形質導入、コンジュゲーション、トランスフ
ェクション、クロモシームＤ Ｎ Ａへの組込みなどが
挙げられる。゛１ゲノム“とは、染色体ＤＮＡ及び染色
体外ＤＮＡの両者を含む意味である。
形質転換細胞が選択され［ＨａｎｉａｔｉＳ ｅｔ ａ
ｌ、。
ｌ、。
（１９８２）］、次いで所望の構造遺伝ｆの発現が引き
起こされるＪ：うな条件下で培養される。以後の実施例
でよく示されているように、ｐｒｅｃはそれに作動可能
な状態で結合している構造遺伝子の構成発現を有効に引
き起こすことができる。
起こされるＪ：うな条件下で培養される。以後の実施例
でよく示されているように、ｐｒｅｃはそれに作動可能
な状態で結合している構造遺伝子の構成発現を有効に引
き起こすことができる。
実際に、形質転換ｐｓｅｕｉｏｍｏｎａｓにおける目的
とする生産物の非誘導条件下でのｐｒｅＣ発現はＥ、ｃ
ｏｌ ｉの場合よりも高レベルである５、更には、異種
グラムネガティブバクテリアにおいて目的とする構造遺
伝子の誘導発現を、ｐｒｅＣはほとんどの場合に有意に
引き起こすことが出来る。
とする生産物の非誘導条件下でのｐｒｅＣ発現はＥ、ｃ
ｏｌ ｉの場合よりも高レベルである５、更には、異種
グラムネガティブバクテリアにおいて目的とする構造遺
伝子の誘導発現を、ｐｒｅＣはほとんどの場合に有意に
引き起こすことが出来る。
かくして得られる目的とする蛋白は、通常の方法によっ
て精製することができ、また産生蛋白に適した方法によ
ってその産生をアッセイすることができる。このような
精製法及び／又は蛋白アッセイを用いて、蛋白の産生レ
ベルを確認することもできる。
て精製することができ、また産生蛋白に適した方法によ
ってその産生をアッセイすることができる。このような
精製法及び／又は蛋白アッセイを用いて、蛋白の産生レ
ベルを確認することもできる。
以下に示す微生物が、ブタベスト条約に基いてアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３０１Ｐ
ａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３０１Ｐ
ａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。
Ｍａｒｙｌａｎｄ、 ２０８５２ 、 Ｕ、Ｓ、Ａ
）に゛３託されており、それぞれ以下に示す受託番号が
付されている。
）に゛３託されており、それぞれ以下に示す受託番号が
付されている。
ＡＴＣＣ３９９３６−Ｅ、ｃｏｌｉ Ｗ３１１０八Ｔ
ＣＣ５３４６９−Ｅ、ｃｏｌｉ Ｎ６４０５Ａ丁ＣＣ
６７０４３−Ｅ、ｃｏｌｉ ８５２１９（ｐ）ｌＯＮ
５５１０）ＡＴＣＣ６７０４４−Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＨ１
０ｔ（＋）ＨＯＮ６００２）八ＴＣＣ５３０２３−Ｅ、
ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＤＨＯＮ３２１３）実施例 材料と方法 全てのオリゴヌクレチドは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｓｓ Ｄ Ｎ Ａシンセサイザーを用いて、製
造業者Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｔｏｓｙｓｔｅｍｓ、 Ｉｎ
ｃ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ。
ＣＣ５３４６９−Ｅ、ｃｏｌｉ Ｎ６４０５Ａ丁ＣＣ
６７０４３−Ｅ、ｃｏｌｉ ８５２１９（ｐ）ｌＯＮ
５５１０）ＡＴＣＣ６７０４４−Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＨ１
０ｔ（＋）ＨＯＮ６００２）八ＴＣＣ５３０２３−Ｅ、
ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＤＨＯＮ３２１３）実施例 材料と方法 全てのオリゴヌクレチドは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｓｓ Ｄ Ｎ Ａシンセサイザーを用いて、製
造業者Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｔｏｓｙｓｔｅｍｓ、 Ｉｎ
ｃ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ。
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）の指針に従って合成した。３２
Ｐ−ラベル化ヌクレオチドは八ａ＋ｅｒｓｈａｍ （八
ｒｌｉｎｇｔｏｎ１１ｅｒｇｈｔｓ、 ｌ１ｌｉｎｏｉ
ｓ ）から入手した。
Ｐ−ラベル化ヌクレオチドは八ａ＋ｅｒｓｈａｍ （八
ｒｌｉｎｇｔｏｎ１１ｅｒｇｈｔｓ、 ｌ１ｌｉｎｏｉ
ｓ ）から入手した。
伯にことわりのない限り、全ての化学薬品はＳｉｇｍａ
（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、 Ｈｉｓｓｏｕｒｉ）から入手し
た。制限酵素及びＤＮＡ修飾酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄＢｉｏｌａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ、 Ｍａｓ
ｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ） 、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ （Ｂｏｓｔｏｎ、 Ｍａｓｓａｃｈｕ
ｓｅｔｔｓ ）及びＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｒｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｏ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手し、それぞれの製
造業室の指針に従って使用した。
（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、 Ｈｉｓｓｏｕｒｉ）から入手し
た。制限酵素及びＤＮＡ修飾酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄＢｉｏｌａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ、 Ｍａｓ
ｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ） 、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ （Ｂｏｓｔｏｎ、 Ｍａｓｓａｃｈｕ
ｓｅｔｔｓ ）及びＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｒｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｏ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手し、それぞれの製
造業室の指針に従って使用した。
Ｅ、 ｃｏＪ ｉ ＪＭ１０ｌ、 Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓしｅｓｔＯ３ｔｅｒＯｎｉ及びＳｅｒｒａｔｉａ
ｌ１ａｒＣ８ＳＣｅｎＳを、それぞれ受託番号３３８
７６．１７４５９．２５４１９に基づきアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ） （Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ）より入手し
た。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ １ｌｔ−
２はＨ，Ｂａｇｄａｓａｒｒａｎ （Ｈａｘ Ｐｌａ
ｎｋ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｄ −１０００Ｂｅｒｌ
ｉｎ−Ｄｅｂｌｉｎ、 Ｆ、Ｒ，Ｇ、 ）から入手した
。これはＨｕｒｒａｙ。
ｎａｓしｅｓｔＯ３ｔｅｒＯｎｉ及びＳｅｒｒａｔｉａ
ｌ１ａｒＣ８ＳＣｅｎＳを、それぞれ受託番号３３８
７６．１７４５９．２５４１９に基づきアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ） （Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ）より入手し
た。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ １ｌｔ−
２はＨ，Ｂａｇｄａｓａｒｒａｎ （Ｈａｘ Ｐｌａ
ｎｋ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｄ −１０００Ｂｅｒｌ
ｉｎ−Ｄｅｂｌｉｎ、 Ｆ、Ｒ，Ｇ、 ）から入手した
。これはＨｕｒｒａｙ。
に、ｅｔ ａｌ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
（１９７２）２８ ： ３０１−３１０に記載され
ている。Ｐｓａｕｄｏｒａｏｎａｓａｅｒｕａｉｎｏｓ
ａ ２００３はＨ，Ｖａｓｉｌ （Ｕｎｉｖ。
（１９７２）２８ ： ３０１−３１０に記載され
ている。Ｐｓａｕｄｏｒａｏｎａｓａｅｒｕａｉｎｏｓ
ａ ２００３はＨ，Ｖａｓｉｌ （Ｕｎｉｖ。
Ｃｏ１ｏｒａｄｏ Ｈｅｄ、５ｃｈｏｏｌ、Ｄｅｎｖ
ｅｒ、 Ｃｏ１ｏｒａｄｏ ）から入手した。これはＶ
ａｓｉｌ、 Ｈ，Ｌ、ｅｔ ａｌ。
ｅｒ、 Ｃｏ１ｏｒａｄｏ ）から入手した。これはＶ
ａｓｉｌ、 Ｈ，Ｌ、ｅｔ ａｌ。
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｌ （１９８２）１５２：４３
１−４４０に記載されている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｙｒｉｎｇａｅ ＪＬ２０００はＪ、Ｌｏｐｅｒ（
Ｄｅｐｔ、Ｂｏｔａｎｙ ａｎｄ ＰｌａｎｔＰａｔｈ
ｏ１０ｇｙ、ｏｒｅｇｏｎ ５ｔａｔｅ ｕｎｉｖｅ
ｒｓ；ｔｙ。
１−４４０に記載されている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｙｒｉｎｇａｅ ＪＬ２０００はＪ、Ｌｏｐｅｒ（
Ｄｅｐｔ、Ｂｏｔａｎｙ ａｎｄ ＰｌａｎｔＰａｔｈ
ｏ１０ｇｙ、ｏｒｅｇｏｎ ５ｔａｔｅ ｕｎｉｖｅ
ｒｓ；ｔｙ。
Ｃａｒｖａｌｌｉｓ、 Ｏｒｅｇｏｎ ９７３３１ ）
から入手した。
から入手した。
これはＪ、Ｅ、ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｇｅｎ、Ｈｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ 、 （１９８４）１３０：１５０７−１
５１５に記載されている。Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉ
ｃｏｌａ ＄ ２６はＡ、にｅｌｎａｎのコレクション
（Ｏｎ ｉｖ、 Ｗｉｓｃｏｎｓ ｉｎ、 Ｈａｄ １
ｓｏｎ、 Ｗｉｓｃｏｎｓ ｉｎ ）から入手した。Ｐ
ｓｅｕｄｏ１０ｎａｓ ｌ＋ｏｒｅｓｃｅｎｓ ７０１
Ｅ １ は、 ロ、Ｄｒａｈｏｓ ｅｔ ａｌ、、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１０ｏＶ （１９８６）４ ：４
３９−４４４に記載されているタイプのものである。Ｐ
ｓｅｕｄｏｎ＋ｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ １
１４１Ｆ１は、８．Ｎ（３１１１１１ｉ１）Ｇのコレク
ション（Ｈｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ、、 Ｓｔ、Ｌｏｕｉ
ｓ、 Ｈｉｓｓｏｕｒｉ）からの単離物である。Ｅ、ｃ
ｏｔｔ ｒ株Ｗ３１１０は、ＡＴＣＣ受託番号３９９３
６に基づきＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌ
ａｎｄ）より入手することができる。Ｅ、ｃｏｔ ｒ株
Ｎ６４０５はＯｒ、 Ｈ，ＧＯｔｔｆ３ＳＩａ１ｍ（１
’１ａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ Ｏｆ ｔ
ｌｅａｌｔｈ、 Ｂｃｔｈｃｓｄａ 。
ｏｂｉｏｌ 、 （１９８４）１３０：１５０７−１
５１５に記載されている。Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉ
ｃｏｌａ ＄ ２６はＡ、にｅｌｎａｎのコレクション
（Ｏｎ ｉｖ、 Ｗｉｓｃｏｎｓ ｉｎ、 Ｈａｄ １
ｓｏｎ、 Ｗｉｓｃｏｎｓ ｉｎ ）から入手した。Ｐ
ｓｅｕｄｏ１０ｎａｓ ｌ＋ｏｒｅｓｃｅｎｓ ７０１
Ｅ １ は、 ロ、Ｄｒａｈｏｓ ｅｔ ａｌ、、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１０ｏＶ （１９８６）４ ：４
３９−４４４に記載されているタイプのものである。Ｐ
ｓｅｕｄｏｎ＋ｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ １
１４１Ｆ１は、８．Ｎ（３１１１１１ｉ１）Ｇのコレク
ション（Ｈｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ、、 Ｓｔ、Ｌｏｕｉ
ｓ、 Ｈｉｓｓｏｕｒｉ）からの単離物である。Ｅ、ｃ
ｏｔｔ ｒ株Ｗ３１１０は、ＡＴＣＣ受託番号３９９３
６に基づきＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌ
ａｎｄ）より入手することができる。Ｅ、ｃｏｔ ｒ株
Ｎ６４０５はＯｒ、 Ｈ，ＧＯｔｔｆ３ＳＩａ１ｍ（１
’１ａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ Ｏｆ ｔ
ｌｅａｌｔｈ、 Ｂｃｔｈｃｓｄａ 。
Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手することができ、またＡ
Ｔ ＣＣ受託番号５３４６９に基づきＡＴＣＣから入手
することもできる。Ｆ、ｃｏｊ １ａＲＷ３１３はＯｒ
、Ｔｈｏｍａｓ Ｋｕｎｋｅｌ （Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｏｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｈａ口ｏｎａｌ Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅ ｏｆＥｎｖｉｒｏｎ＊ａｎｔａｌ Ｈ
ｅａｌｔｈ ５ｃｉｅｎｃｅｓ、ＲｅｓｅａｒｃｈＴ
ｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉ
ｎａ、 ２７７０９ ）から入手することができる。ベ
クターｐＢＲ３２７及びＭｌ ３ｍ１）９はＰｈａｒｍ
ａｃｉａ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ、＋ｅｒ
ｓｅｙ ）から入手することができる。プラスミドＤＶ
Ｃ１８は、 Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ａｔ
ａｔ、、 Ｇｅｎｅ（１９８５）３３：１０３−１
１９に記載されており、Ｐｈａｒｍａｃｉａ （Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ、 Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手す
ることができる。ベクターＭ１３ｍｐ１９はＮｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ。
Ｔ ＣＣ受託番号５３４６９に基づきＡＴＣＣから入手
することもできる。Ｆ、ｃｏｊ １ａＲＷ３１３はＯｒ
、Ｔｈｏｍａｓ Ｋｕｎｋｅｌ （Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｏｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｈａ口ｏｎａｌ Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅ ｏｆＥｎｖｉｒｏｎ＊ａｎｔａｌ Ｈ
ｅａｌｔｈ ５ｃｉｅｎｃｅｓ、ＲｅｓｅａｒｃｈＴ
ｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉ
ｎａ、 ２７７０９ ）から入手することができる。ベ
クターｐＢＲ３２７及びＭｌ ３ｍ１）９はＰｈａｒｍ
ａｃｉａ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ、＋ｅｒ
ｓｅｙ ）から入手することができる。プラスミドＤＶ
Ｃ１８は、 Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ａｔ
ａｔ、、 Ｇｅｎｅ（１９８５）３３：１０３−１
１９に記載されており、Ｐｈａｒｍａｃｉａ （Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ、 Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手す
ることができる。ベクターＭ１３ｍｐ１９はＮｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ。
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ）から入手することがで
きる。
きる。
Ｆ因子ベーターガラクトシダーぜ相補性配列を欠いたＥ
、ｃｏｊ！ｉ ＪＭ１０ＩＦ−は、プラスミド配列と
クロモシーム配列との相同性組換えを避けるためにＥ、
ｃｏｊ！ｉ ＪＭ１０ｌから造成した。Ｅ、ｃｏＪｉ
ＪＭ１０ｌからＪＭ１０ｌＦ−への変換は、Ｈｉｒ
ｏｔａ、 Ｙ、、Ｐｒｏｃ。
、ｃｏｊ！ｉ ＪＭ１０ＩＦ−は、プラスミド配列と
クロモシーム配列との相同性組換えを避けるためにＥ、
ｃｏｊ！ｉ ＪＭ１０ｌから造成した。Ｅ、ｃｏＪｉ
ＪＭ１０ｌからＪＭ１０ｌＦ−への変換は、Ｈｉｒ
ｏｔａ、 Ｙ、、Ｐｒｏｃ。
Ｈｏ口、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、（１，Ｓ、Ａ （１９６
０） ４６ ： ５７−６４に記載された方法に基づい
て達成される。
０） ４６ ： ５７−６４に記載された方法に基づい
て達成される。
バクテリア用の生育培地、形質転換用の条件、及び通常
の抗生物質耐性マーカーを有する発現ベヒクルを保持し
たＥ、ｃｏＪ １ＩＩｌ胞の選択条件は、例えばＨａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、ｅｄｓ、 （１９８２）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１０ｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ １
ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ。
の抗生物質耐性マーカーを有する発現ベヒクルを保持し
たＥ、ｃｏＪ １ＩＩｌ胞の選択条件は、例えばＨａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、ｅｄｓ、 （１９８２）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１０ｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ １
ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されたのと本質的に同様である
。
。
バクテリア生育培地用の全ての成分及び抗生物質は、Ｓ
ｉｇｎ＋ａ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｈｉｓｓｏｕｒｉ）又
はＤｉｆＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉ
ｔ、Ｈｉｃｈｉｇａｎ ）から入手した。
ｉｇｎ＋ａ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｈｉｓｓｏｕｒｉ）又
はＤｉｆＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉ
ｔ、Ｈｉｃｈｉｇａｎ ）から入手した。
具体的には、所望のプラスミドを保持する細胞を５０μ
ｇ／−カナマイシンの存在トで生育せしめ、カナマイシ
ン耐性（Ｋｎ’）マーカーを存する発現ベヒクルの存在
により選択した。アンピシリン耐性（ａｍｐ’ ）又は
ゲンタマイシン耐性（Ｑｅｎ’ ）マーカーを有する発
現ベヒクルを保持する細胞を、それぞれ２００μｇ／ｄ
アンピシリン又は１０μ９／ｒｄゲンタマイシンを含む
培地中で生育した。ｐ、 ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉに
ついては、５００μｇ／−ゲンタマイシンを選択用に使
用した。
ｇ／−カナマイシンの存在トで生育せしめ、カナマイシ
ン耐性（Ｋｎ’）マーカーを存する発現ベヒクルの存在
により選択した。アンピシリン耐性（ａｍｐ’ ）又は
ゲンタマイシン耐性（Ｑｅｎ’ ）マーカーを有する発
現ベヒクルを保持する細胞を、それぞれ２００μｇ／ｄ
アンピシリン又は１０μ９／ｒｄゲンタマイシンを含む
培地中で生育した。ｐ、 ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉに
ついては、５００μｇ／−ゲンタマイシンを選択用に使
用した。
用いた生育培地はＬＢ培地（Ｈａｎｉａｔｉｓ ａｔ
ａｌ、、 １９８２）であり、２５０ ｒｐｍで振とう
しながら３０℃又は３７℃でバクテリア培％細胞をイン
キュベーションして生育させた。
ａｌ、、 １９８２）であり、２５０ ｒｐｍで振とう
しながら３０℃又は３７℃でバクテリア培％細胞をイン
キュベーションして生育させた。
［、ｃｏｉｉ株以外の上記のバクテリア株についてリフ
ァンピシン耐性誘導体株を造成し、所望のベクターを導
入するためのカウンター選択マーカーとした。ＬＢ培地
で３０℃で１晩生育ゼしめたそれぞれの１００μｌアリ
コートを、５０μ７／ｄリフアンピシンが添加されたし
１３培地が入ったベトリ皿の表面上広げた。リファンピ
シン耐性変異株を選択し、リファンピシン（５０μｇ／
ｄ）を含む他のしＢプレート上にそれのコロニーを再塗
布して更に精製した。これらのりファンピシン耐性誘導
体株は、Ｄｉｔｔａ、Ｇ、Ｓ、ｅｔ ａｌ、、Ｐｒ０Ｃ
，Ｎａ口。
ァンピシン耐性誘導体株を造成し、所望のベクターを導
入するためのカウンター選択マーカーとした。ＬＢ培地
で３０℃で１晩生育ゼしめたそれぞれの１００μｌアリ
コートを、５０μ７／ｄリフアンピシンが添加されたし
１３培地が入ったベトリ皿の表面上広げた。リファンピ
シン耐性変異株を選択し、リファンピシン（５０μｇ／
ｄ）を含む他のしＢプレート上にそれのコロニーを再塗
布して更に精製した。これらのりファンピシン耐性誘導
体株は、Ｄｉｔｔａ、Ｇ、Ｓ、ｅｔ ａｌ、、Ｐｒ０Ｃ
，Ｎａ口。
Ａｃａｄ、 Ｓｃ ｉ、 、 Ｕ、 Ｓ、＾、、１９８
０．７７：７３４７−７３５１に記載された方法を用い
たＨ８１０１（ｐＲＫ２０１３）と所望のプラスミドを
保持した適当なＥ、Ｃ０１１培養細胞とについてのトリ
バレンタルミーティングに有用である。ベーターガラク
トシダーゼを産生ずる組換え細胞の選択は、上記したよ
うにリファンピシン（５０μｇ／ｄ）とカナマイシン（
５０μｇ／ｄ）を含むＬＢ培地上で行なうことができる
。
０．７７：７３４７−７３５１に記載された方法を用い
たＨ８１０１（ｐＲＫ２０１３）と所望のプラスミドを
保持した適当なＥ、Ｃ０１１培養細胞とについてのトリ
バレンタルミーティングに有用である。ベーターガラク
トシダーゼを産生ずる組換え細胞の選択は、上記したよ
うにリファンピシン（５０μｇ／ｄ）とカナマイシン（
５０μｇ／ｄ）を含むＬＢ培地上で行なうことができる
。
Ｅ、ｃｏＪｉ ｒｅＣＡプロモーターからの転写誘導
は以下のようにして行なうことができる。
は以下のようにして行なうことができる。
発現ベヒクルを保持する組換えバクテリアを、５０μｇ
／ｑカナマイシンを含むＬＢ培地（Ｈａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａｌ、、 １９８２ ）中で、指数増殖器まで、
典型的には約１００に＋ｅｔｔユニット（に＋ｅｔｔ−
ｓｕｍｍｅｒｓｏｎメーターで測定した。にｌｅｔｔ−
ｓｕｍｍｅｒｓｏｎメーター、に１ｅｔｔ Ｈｆｇ、Ｃ
ｏ、Ｎｃｗ ＷｏｒｋＣｉｔｙ、 Ｎｅｖ Ｙｏｒｋ）
の細胞濃度ま′ｃ−’ｉ＋ 今せしめる。
／ｑカナマイシンを含むＬＢ培地（Ｈａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａｌ、、 １９８２ ）中で、指数増殖器まで、
典型的には約１００に＋ｅｔｔユニット（に＋ｅｔｔ−
ｓｕｍｍｅｒｓｏｎメーターで測定した。にｌｅｔｔ−
ｓｕｍｍｅｒｓｏｎメーター、に１ｅｔｔ Ｈｆｇ、Ｃ
ｏ、Ｎｃｗ ＷｏｒｋＣｉｔｙ、 Ｎｅｖ Ｙｏｒｋ）
の細胞濃度ま′ｃ−’ｉ＋ 今せしめる。
次いで５Ｉｄサンプルを取り、残りの培ａｍ胞に終濃度
が５０μ’Ｊ／ｄとなるようにナリジクス酸（１０１１
！９／ｄの０．１Ｎ Ｎａ０）−１溶液）を加える。
が５０μ’Ｊ／ｄとなるようにナリジクス酸（１０１１
！９／ｄの０．１Ｎ Ｎａ０）−１溶液）を加える。
誘導後、数時間生育せしめる。その間、目的とする蛋白
産生のピークを測定するためにあらかじめ決めた間隔（
＠えば１時間毎）でアリコートを採取する。目的とする
遺伝子生産物の産生が最大となるように高レベルぐ通気
し、培養温度を３０℃又は３７℃に維持する。
産生のピークを測定するためにあらかじめ決めた間隔（
＠えば１時間毎）でアリコートを採取する。目的とする
遺伝子生産物の産生が最大となるように高レベルぐ通気
し、培養温度を３０℃又は３７℃に維持する。
組換え宿主細胞中で産生される目的とするポリペプチド
のレベルは、酵素活性、ウェスタン・イムノブロッティ
ング［Ｒｅｎａｒｔ Ｃｔ ａｌ、、 （１９７９）Ｐ
ｒｏｃ、Ｈａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、八、
７６：３１１６−３１２０１などの蛋白特異的アッセイ
法により測定することができる。例えば、ベーターガラ
クトシダーゼ（β−ｇａｌ）の産生量レベルは以下のよ
うにして測定できる。発現ベクターを保持する州胞を、
前記したように、該発現ベクターの耐性マーカーに適し
た濃度の抗生物質を含むＬＢ培地中で、約１００ＫＩｅ
ｔｔユニツトの光学ａ度になるまで生育せしめる。培養
液５．０ｄから遠心により細胞を採取し、得られるベレ
ットを１．０ｄＺバツフアー（６０１１４−４３）３リ
ン酸ナトリウム、４０−Ｈ二塩基酸リン酸プトリウム、
１０■８１！Ｉ化カリウム及び５ＱｍＨベーターメルカ
プドールを含み、ｐｔ＋７．０に調製されている）に懸
濁する。測定可能な活性となるように、アッセイ前に抽
出物を２バツフアーで２．−１００倍に希釈する。希釈
サンプル２５−１００μノを７バツフアーに加えて終容
ｆｆ１１．Ｏｄとする。チューブを３７℃で平衡化せし
めて、０−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（
ＯＮＰＧ）（４ｑ／ｄのＯ，１Ｍリン酸バッファー溶液
、ｐＨ７，Ｏ）０．２ｄを加える。
のレベルは、酵素活性、ウェスタン・イムノブロッティ
ング［Ｒｅｎａｒｔ Ｃｔ ａｌ、、 （１９７９）Ｐ
ｒｏｃ、Ｈａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、八、
７６：３１１６−３１２０１などの蛋白特異的アッセイ
法により測定することができる。例えば、ベーターガラ
クトシダーゼ（β−ｇａｌ）の産生量レベルは以下のよ
うにして測定できる。発現ベクターを保持する州胞を、
前記したように、該発現ベクターの耐性マーカーに適し
た濃度の抗生物質を含むＬＢ培地中で、約１００ＫＩｅ
ｔｔユニツトの光学ａ度になるまで生育せしめる。培養
液５．０ｄから遠心により細胞を採取し、得られるベレ
ットを１．０ｄＺバツフアー（６０１１４−４３）３リ
ン酸ナトリウム、４０−Ｈ二塩基酸リン酸プトリウム、
１０■８１！Ｉ化カリウム及び５ＱｍＨベーターメルカ
プドールを含み、ｐｔ＋７．０に調製されている）に懸
濁する。測定可能な活性となるように、アッセイ前に抽
出物を２バツフアーで２．−１００倍に希釈する。希釈
サンプル２５−１００μノを７バツフアーに加えて終容
ｆｆ１１．Ｏｄとする。チューブを３７℃で平衡化せし
めて、０−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（
ＯＮＰＧ）（４ｑ／ｄのＯ，１Ｍリン酸バッファー溶液
、ｐＨ７，Ｏ）０．２ｄを加える。
黄色にきわだって発色するまで反応を進行さゼる。
次いで、１Ｍ Ｎａ２Ｃｏ３０．５１１ｔ１を加えて反
応を止め、４２０ｒｖで吸光度を測定する。Ｍｉｌｌｅ
ｒ。
応を止め、４２０ｒｖで吸光度を測定する。Ｍｉｌｌｅ
ｒ。
Ｊ、１４．（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉ
ｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ 、 Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ。
ｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ 、 Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ。
Ｃｏ１ｄ １ｐｒｉｎｏ １ｔａｒｂｏｒ、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋに記載された方法に従い、ベーターガラクトシ
ダーゼ活性は、０ＮＰＧのμＭ消衰係数４．５を用いて
１分間で蛋白１１Ｉ！Ｊ当りに形成される生産物のμｍ
ｏｌ数で表わした。蛋白濃度は、Ｂｒａｆｏｒｄ、Ｈ，
Ｈ，、Ａｎａｌ。
Ｙｏｒｋに記載された方法に従い、ベーターガラクトシ
ダーゼ活性は、０ＮＰＧのμＭ消衰係数４．５を用いて
１分間で蛋白１１Ｉ！Ｊ当りに形成される生産物のμｍ
ｏｌ数で表わした。蛋白濃度は、Ｂｒａｆｏｒｄ、Ｈ，
Ｈ，、Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅ＠、 （１９７６） ７２ ： ２４８−
２５４に記載された方法に従って測定した。
２５４に記載された方法に従って測定した。
ブタ成長ホルモン（ＰＧＨ）のレベルは、Ｒｅｎａｒｔ
ｃｔ ａｌ、、 （１９７９）に記載された方法に従
って、ウェスタンイムノブロッティングにより測定した
。
ｃｔ ａｌ、、 （１９７９）に記載された方法に従
って、ウェスタンイムノブロッティングにより測定した
。
プラスミドｐＭＯＮ６００２．ｐＭＯＮ５５１５、ｐＭ
ＯＮ５５１４．ｐＭＯＮ５５３７．ｐＭＯＮ５５１０．
ｐＭＯＮ５５３９．ｐＮＤＣ８゜ｐＢ Ｇ Ｈｅｘ−１
及びＭｌ ３ｍｐ９／１３Ｇ）−１は、欧州特許公開Ｎ
Ｑ２４１，４４６ （１９８７年１０月１４日公開）に
記載されており、その記載を本明細内に引用する。同時
に出願され公開された出願も引用する。
ＯＮ５５１４．ｐＭＯＮ５５３７．ｐＭＯＮ５５１０．
ｐＭＯＮ５５３９．ｐＮＤＣ８゜ｐＢ Ｇ Ｈｅｘ−１
及びＭｌ ３ｍｐ９／１３Ｇ）−１は、欧州特許公開Ｎ
Ｑ２４１，４４６ （１９８７年１０月１４日公開）に
記載されており、その記載を本明細内に引用する。同時
に出願され公開された出願も引用する。
友７４ ｍユ
本実施例は、第１図に示す合成Ｇ １０１分子の構築及
び組立てについて記載するものである。合成２本鎖ＤＮ
Ａ （ｄｓＤＮＡ）Ｇ１０Ｌ分子は、バタテリオファー
ジＴ７遺伝子１０コード配列の翻訳開始コドン（Ａ −
ｒ Ｇ ’）の直ぐ５′側の最初の約１００個の塩基対
（ｂｐ） 、 ＡＴＧ１７１始コドン及びそれに続＜Ｇ
−Ｃｂｐを含み、第１図に下線で示した置換ｂｐを有し
ている。
び組立てについて記載するものである。合成２本鎖ＤＮ
Ａ （ｄｓＤＮＡ）Ｇ１０Ｌ分子は、バタテリオファー
ジＴ７遺伝子１０コード配列の翻訳開始コドン（Ａ −
ｒ Ｇ ’）の直ぐ５′側の最初の約１００個の塩基対
（ｂｐ） 、 ＡＴＧ１７１始コドン及びそれに続＜Ｇ
−Ｃｂｐを含み、第１図に下線で示した置換ｂｐを有し
ている。
第１図に示したｄｓＤＮＡ分子を構築するために、第５
図に示した６個の部分重複した相補性オリゴヌクレオチ
ドを合成した。粗合成オリゴヌクレオチドのアリコート
を、ポリアクリルアミドウレアゲル（７Ｍウレア中に１
６％（Ｗ／Ｖ）（Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、
１９８２ ）を用いた電気泳動により精製した。それぞ
れの調製物中の合成ＤＮＡの濃度は、１分間当りＡＴＰ
１モルに対して２２．０００−２４．０００カウント（
ＣＤＩｌｌ）の比活性のγ−３２Ｐ−ＡＴＰ及びＴ４Ｄ
ＮＡキナーゼを用いた定量的５′末端ラベル化反応によ
り測定しノた。
図に示した６個の部分重複した相補性オリゴヌクレオチ
ドを合成した。粗合成オリゴヌクレオチドのアリコート
を、ポリアクリルアミドウレアゲル（７Ｍウレア中に１
６％（Ｗ／Ｖ）（Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、
１９８２ ）を用いた電気泳動により精製した。それぞ
れの調製物中の合成ＤＮＡの濃度は、１分間当りＡＴＰ
１モルに対して２２．０００−２４．０００カウント（
ＣＤＩｌｌ）の比活性のγ−３２Ｐ−ＡＴＰ及びＴ４Ｄ
ＮＡキナーゼを用いた定量的５′末端ラベル化反応によ
り測定しノた。
合成ＤＮＡ上セグメント−６（第５図）の組立ては以下
のようにして実施した。６個のオリゴヌクレオチド全て
に対して、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５′
末端のホスホリル化を実施した。オリゴヌクレオチドの
相補性ベアー（１／２．３／４及び５／６）を、丁４リ
ガーゼバッファ線中でそれぞれ５ピコＩ０１／μｌの濃
度で混合した。次いでそれぞれのベアーを１５分間で７
５℃まで加熱した。次いで混合物を冷却させた（即ちア
ニーリングを行なった）。次いで、オリゴヌクレオチド
の３つのベアーを混合し、１５℃で連結させた。次いで
、形成されたＧ１０Ｌポリマーを除去するためにＢＱＪ
ＩＴＩ及びＮｃｏＩ制限酵素で処理し、組立てられたＧ
１０Ｌ断片を、非変性１２％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリルア
ミドゲル（Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ、、 １９８
２ ）を用いた電気泳動により精製した。得られる１０
４ｂｌ）ＤＮＡ分子をゲルから電気溶出させ、第１図に
示した［）ＮＡ配列を有する分子を得た。
のようにして実施した。６個のオリゴヌクレオチド全て
に対して、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５′
末端のホスホリル化を実施した。オリゴヌクレオチドの
相補性ベアー（１／２．３／４及び５／６）を、丁４リ
ガーゼバッファ線中でそれぞれ５ピコＩ０１／μｌの濃
度で混合した。次いでそれぞれのベアーを１５分間で７
５℃まで加熱した。次いで混合物を冷却させた（即ちア
ニーリングを行なった）。次いで、オリゴヌクレオチド
の３つのベアーを混合し、１５℃で連結させた。次いで
、形成されたＧ１０Ｌポリマーを除去するためにＢＱＪ
ＩＴＩ及びＮｃｏＩ制限酵素で処理し、組立てられたＧ
１０Ｌ断片を、非変性１２％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリルア
ミドゲル（Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ、、 １９８
２ ）を用いた電気泳動により精製した。得られる１０
４ｂｌ）ＤＮＡ分子をゲルから電気溶出させ、第１図に
示した［）ＮＡ配列を有する分子を得た。
友亙璽ユ
この実施例は、合成Ｇ１０Ｌ配列及び／又は構造遺伝子
に作動可能な状態で結合した Ｅ、ｃｏｊｉ ｒｅＣＡプロモーターを含む各種の発
現ベヒクルの構築を示すものである。具体的には、この
実施例は、Ｅ、ｃｏｊｉベーターガラクトシダーゼ（Ｊ
ｌａＣＺ”）構造遺伝ｆ及びコンセンサスＥ、ＣＯＪ＋
リポソーム結合（Ｓ、Ｄ、）配列：Ｅ、ＣＯ１＋ベータ
ーガラクトシダーｔ２構造遺伝子及びＧ１０Ｌ配列：あ
るいはブタ成Ｑホルモン（ＰＧＨ）構造遺伝子及びＧ
１０ Ｌ、配列に作動可能な状態で結合したＥ、ｃａ１
ｉｒｅＣＡプロモーター（ＰｒｅＣ）を含む広範囲宿主
発現ベヒクルの構築を示すものである。１ａ、 １）
ｒｅｃ−Ｇ１０Ｌ−１ａｃＺＥ．ｃｏｌｉ ｒｅＣＡ
プロモーター（ＰｒｅＧ）、］ンセンサスＳＤ配列（Ｓ
ｔ”））及びＥ、ｃｏｌｉ ３’ −エノールビルボイ
ルシキミ酸−５−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）ＤＮＡ
コ−ド配列が挿入されたｏ Ｂ Ｒ３２７ブラスミドを
含む組換え発現ベクターｐＭＯＮ６００２を、制限酵素
５ａｚｎ及びＮＣ０Ｉで消化し、ラージベクター断片を
、ＮＡＣ３樹脂（ＢＯｔｈｅＳｄａＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ 。
に作動可能な状態で結合した Ｅ、ｃｏｊｉ ｒｅＣＡプロモーターを含む各種の発
現ベヒクルの構築を示すものである。具体的には、この
実施例は、Ｅ、ｃｏｊｉベーターガラクトシダーゼ（Ｊ
ｌａＣＺ”）構造遺伝ｆ及びコンセンサスＥ、ＣＯＪ＋
リポソーム結合（Ｓ、Ｄ、）配列：Ｅ、ＣＯ１＋ベータ
ーガラクトシダーｔ２構造遺伝子及びＧ１０Ｌ配列：あ
るいはブタ成Ｑホルモン（ＰＧＨ）構造遺伝子及びＧ
１０ Ｌ、配列に作動可能な状態で結合したＥ、ｃａ１
ｉｒｅＣＡプロモーター（ＰｒｅＣ）を含む広範囲宿主
発現ベヒクルの構築を示すものである。１ａ、 １）
ｒｅｃ−Ｇ１０Ｌ−１ａｃＺＥ．ｃｏｌｉ ｒｅＣＡ
プロモーター（ＰｒｅＧ）、］ンセンサスＳＤ配列（Ｓ
ｔ”））及びＥ、ｃｏｌｉ ３’ −エノールビルボイ
ルシキミ酸−５−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）ＤＮＡ
コ−ド配列が挿入されたｏ Ｂ Ｒ３２７ブラスミドを
含む組換え発現ベクターｐＭＯＮ６００２を、制限酵素
５ａｚｎ及びＮＣ０Ｉで消化し、ラージベクター断片を
、ＮＡＣ３樹脂（ＢＯｔｈｅＳｄａＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ 。
Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いたクロマトグラフィーにより
製造業者の指針に従って精製した。その後、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼの存在下でベクター断片と合成０１０１分子（
第１図）とを混合し、プラスミドｐＭＯＮ５５３７ （
第３図）を作成した。プラスミド６００２は、ＡＴＣＣ
受託番号６７０４４に基づきＡ Ｔ ＣＣ（Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）より入手することができ
る。次いで４ＵられるベクターｐＭＯＮ５５３７を用い
てＥ、ｃｏｉｉ ＪＭ１０１細胞を形質転換した。２
００μｇ／ｒ！Ｉ！アンピシリンを含む培地で生育ざμ
ることによって形質転ｅＥ、ｃｏｉｉ宿主細胞を選択し
た。発現ベクターｐＭＯＮ５５３７の造成は、形質転換
細胞から発現ベクターを単離し、次いでＧ１０Ｌ及びＥ
Ｐ’ Ｓ Ｐ配列に特有の制限酵素で消化することに
よってｌ明できる。
製造業者の指針に従って精製した。その後、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼの存在下でベクター断片と合成０１０１分子（
第１図）とを混合し、プラスミドｐＭＯＮ５５３７ （
第３図）を作成した。プラスミド６００２は、ＡＴＣＣ
受託番号６７０４４に基づきＡ Ｔ ＣＣ（Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）より入手することができ
る。次いで４ＵられるベクターｐＭＯＮ５５３７を用い
てＥ、ｃｏｉｉ ＪＭ１０１細胞を形質転換した。２
００μｇ／ｒ！Ｉ！アンピシリンを含む培地で生育ざμ
ることによって形質転ｅＥ、ｃｏｉｉ宿主細胞を選択し
た。発現ベクターｐＭＯＮ５５３７の造成は、形質転換
細胞から発現ベクターを単離し、次いでＧ１０Ｌ及びＥ
Ｐ’ Ｓ Ｐ配列に特有の制限酵素で消化することに
よってｌ明できる。
発現ベクター１）ＭＯＮ５５１０は、ＡＴＣＣ受託番号
６７０４３を有するＥ、ｃｏｌ ｉａＭ５２１９から単
離され、第３図に示すように、このベクターは、バクテ
リオファージラムダＰＬプロモーター（Ｐ、）の２つの
タンデムコピー、コンセンナスＳＤ配列（ＳＤ）及びラ
ットアトリオベブチゲン（ＡＰＩＪｆ３ｎ）コード配列
が挿入されたプラスミドｐＢＲ３２７を含むものである
。このベク’）−をＮｃｏＩ及びｌ１ｉｎｄｌｌｌで消
化して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
（Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 １９８２ ）で
ＡＰ（ＩＱｒｌコード配列を単離した。Ａｐｇｅｎコー
ド配列を、あらかじめＮｃｏＩ及び１（ｉｎｄｌｌｌで
消化しウシ腸アルカリ小スファターゼ（ＣＩＡＰ）で処
理した１）ＭＯＮ５５３７と、Ｔ４ＤＮ△リガーゼの存
在下で混合した。次いで、得られるｐＭＯＮ ５５１５
ベクターを用いてＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０１１胞を形
質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で生
育させて形質転換体を選択した。
６７０４３を有するＥ、ｃｏｌ ｉａＭ５２１９から単
離され、第３図に示すように、このベクターは、バクテ
リオファージラムダＰＬプロモーター（Ｐ、）の２つの
タンデムコピー、コンセンナスＳＤ配列（ＳＤ）及びラ
ットアトリオベブチゲン（ＡＰＩＪｆ３ｎ）コード配列
が挿入されたプラスミドｐＢＲ３２７を含むものである
。このベク’）−をＮｃｏＩ及びｌ１ｉｎｄｌｌｌで消
化して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
（Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 １９８２ ）で
ＡＰ（ＩＱｒｌコード配列を単離した。Ａｐｇｅｎコー
ド配列を、あらかじめＮｃｏＩ及び１（ｉｎｄｌｌｌで
消化しウシ腸アルカリ小スファターゼ（ＣＩＡＰ）で処
理した１）ＭＯＮ５５３７と、Ｔ４ＤＮ△リガーゼの存
在下で混合した。次いで、得られるｐＭＯＮ ５５１５
ベクターを用いてＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０１１胞を形
質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で生
育させて形質転換体を選択した。
ＤＭＯＮ５５１５ベクターにＡＰＯｃｎ ＤＮＡＤ−
ド配列が挿入されたことは、ベクターを単離してＧ１０
Ｌ及びＡＰａｅｎ配ダ１に特有の制限Ｍ索で消化するこ
とによって確認した。
ド配列が挿入されたことは、ベクターを単離してＧ１０
Ｌ及びＡＰａｅｎ配ダ１に特有の制限Ｍ索で消化するこ
とによって確認した。
第４図に示したように、Ｇ１０Ｌ配列と１ａｃＺ構造遺
伝子に対して作動可能な状態でＥ。
伝子に対して作動可能な状態でＥ。
ＣＯｊ！ｉ ｒｅＣＡプロモーター（ｐｒｅＣ）が連
結している発現ベヒクルＤＭＯＮ ５５４２は次のよう
にして構築される。Ｎｉｇｅｌ Ｐ、Ｈｉｎｔｏｎ、Ｇ
ｅｎｅ（１９８４）３１ ：２６９−２７３に記載され
た１８ＣＺ構造遺伝子を有するプラスミドＤＮＭ４８ｏ
をＮｅｏＩで開裂し、Ｅ、ｃｏｊ！ｉ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（クレノー断片）で充填してＮＣｏＩ部位を除去
し、次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼで再連結してｐＭＯ
Ｎ５５２６を作成したく第４図）。プラスミドｐＭＯＮ
５５１５（第３図）を△ｖａ■及びＮＧＯｆで開裂し、
ＰｒｅｃとＧ１０Ｌとを有するＡＶａＩ／ＮｃｏＩ小断
片を１１１し、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で
、あらかじめＳｍａ Ｉで開裂したＥ）ＭＯＮ ５５２
６と混合した。次いで、得られる連結混合物を用いて、
Ｅ、ｃｏｊ！ｉ ＭＣ１０００１１１胞を形質転換し
、アンピシリンを含むｆ８地で生育せしめて形質転換体
を選択した。Ｐｒｅｃ、Ｇ１０Ｌ及びｔｔａｃＺ４１１
造遺伝了を有する目的とするベクターｐＭＯＮ５５２７
（第４図）が構築されたことは、制限酵素で消化し次い
でアンピシリンを含む）１ａｃｃＯｎｋＯｙ寒天プレー
ト上にプレートして確認した。
結している発現ベヒクルＤＭＯＮ ５５４２は次のよう
にして構築される。Ｎｉｇｅｌ Ｐ、Ｈｉｎｔｏｎ、Ｇ
ｅｎｅ（１９８４）３１ ：２６９−２７３に記載され
た１８ＣＺ構造遺伝子を有するプラスミドＤＮＭ４８ｏ
をＮｅｏＩで開裂し、Ｅ、ｃｏｊ！ｉ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（クレノー断片）で充填してＮＣｏＩ部位を除去
し、次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼで再連結してｐＭＯ
Ｎ５５２６を作成したく第４図）。プラスミドｐＭＯＮ
５５１５（第３図）を△ｖａ■及びＮＧＯｆで開裂し、
ＰｒｅｃとＧ１０Ｌとを有するＡＶａＩ／ＮｃｏＩ小断
片を１１１し、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で
、あらかじめＳｍａ Ｉで開裂したＥ）ＭＯＮ ５５２
６と混合した。次いで、得られる連結混合物を用いて、
Ｅ、ｃｏｊ！ｉ ＭＣ１０００１１１胞を形質転換し
、アンピシリンを含むｆ８地で生育せしめて形質転換体
を選択した。Ｐｒｅｃ、Ｇ１０Ｌ及びｔｔａｃＺ４１１
造遺伝了を有する目的とするベクターｐＭＯＮ５５２７
（第４図）が構築されたことは、制限酵素で消化し次い
でアンピシリンを含む）１ａｃｃＯｎｋＯｙ寒天プレー
ト上にプレートして確認した。
Ｄｅｎｔｅ ｅｄｓ、ｅｔ ａｌ、、 ＤＮＡ Ｃ１
０ｎｉｎｇ Ｖｏｌ、１ 。
０ｎｉｎｇ Ｖｏｌ、１ 。
”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ” ９．
１０１−１０８゜Ｉ ＲＬ Ｐｒｅｓｓ、 １９８５
、 ＨｃＬｅａｎ、 Ｖｉｒａｉｎｉａに記載され
ているプラスミドＤＥＭＬ３Ｌ１８をｐｖｕ■で開裂し
、小断片を取り出した。プラスミドｐＭＯＮ５５２７を
［）ｒａＩｒｌ／ｌｆ裂し、Ｐｒｅｃ。
１０１−１０８゜Ｉ ＲＬ Ｐｒｅｓｓ、 １９８５
、 ＨｃＬｅａｎ、 Ｖｉｒａｉｎｉａに記載され
ているプラスミドＤＥＭＬ３Ｌ１８をｐｖｕ■で開裂し
、小断片を取り出した。プラスミドｐＭＯＮ５５２７を
［）ｒａＩｒｌ／ｌｆ裂し、Ｐｒｅｃ。
Ｇ１０Ｌ及び１ ａＣＺ配列を含む約４８００ ＝ ５
０００塩基対（ｂｐ）断片を甲離し、ｒ４ＤＮＡリガー
ゼの存在下で、ＰｖｕＩＩで開裂したプラスミドＤＥＭ
Ｂ１１８と混合した。次いで連結混合物を用いて、Ｅ、
ｃｏＪｉ ＭＣ１００Ｏを形質転換し、アンピシリン
を含む５ａｃｃｏｎｈｅｙ寒天からなるプレート上で生
育せしめて形質転換体を選択した。Ｇ１０Ｌ及びＬａｃ
Ｚ構３ｉ！ｉ遺伝子に作動可能な状態で連結したＰｒｅ
ｃを含む得られる発現ベクターをｐＭＯＮ ５５４２と
命名した（第４図）。
０００塩基対（ｂｐ）断片を甲離し、ｒ４ＤＮＡリガー
ゼの存在下で、ＰｖｕＩＩで開裂したプラスミドＤＥＭ
Ｂ１１８と混合した。次いで連結混合物を用いて、Ｅ、
ｃｏＪｉ ＭＣ１００Ｏを形質転換し、アンピシリン
を含む５ａｃｃｏｎｈｅｙ寒天からなるプレート上で生
育せしめて形質転換体を選択した。Ｇ１０Ｌ及びＬａｃ
Ｚ構３ｉ！ｉ遺伝子に作動可能な状態で連結したＰｒｅ
ｃを含む得られる発現ベクターをｐＭＯＮ ５５４２と
命名した（第４図）。
ＰｒｅｃがＧ１０Ｌ及びＬ ａ ＣＺ４ｉ造遺伝ｆに対
して作動可能な状態で連結していることは、制限酵素を
用いた消化により確認した。
して作動可能な状態で連結していることは、制限酵素を
用いた消化により確認した。
ＪＴ）ｒｅｃ、Ｇ１０Ｌ及び１８ＣＺ配列を含む広範囲
宿主発現ベヒクルを造成するために、プラスミドＤＭＯ
Ｎ５５４２を広範囲宿主プラスミドｐＭＯＮ７０５１に
連結した。広範囲のグラムネガティブバクテリアにおい
て作動する複製同始点と１ｎｃＱ複製遺伝子とを含むプ
ラスミドｐＭＯＮ７０５１は次のようにして構築した。
宿主発現ベヒクルを造成するために、プラスミドＤＭＯ
Ｎ５５４２を広範囲宿主プラスミドｐＭＯＮ７０５１に
連結した。広範囲のグラムネガティブバクテリアにおい
て作動する複製同始点と１ｎｃＱ複製遺伝子とを含むプ
ラスミドｐＭＯＮ７０５１は次のようにして構築した。
ゲンタマイシン耐性遺伝子（Ｇｍ ）を、プラスミド
ｐＰ ＨＩ Ｊ Ｉ （１ｌｉｒｓｃｈ、 Ｐ、Ｒ，と
Ｂｅｒｉｎｇｅｒ、 Ｊ、Ｅ、。
ｐＰ ＨＩ Ｊ Ｉ （１ｌｉｒｓｃｈ、 Ｐ、Ｒ，と
Ｂｅｒｉｎｇｅｒ、 Ｊ、Ｅ、。
１９８４、プラスミド１２：１３９−１４１）からＥｃ
ｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片として単離した。
ｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片として単離した。
次いで、Ｇｍ を含むＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ）ｌＴｌｌ
ｉ片を、ＥｃｏＲＩと８ａｍ）ＩＩで開裂したＥ．ｃｏ
ｌｉクローニングプラスミドｐＫＣ７（Ｒｏｇｅｒｓ、
Ｓ、Ｇ、ｅｔ ａｔ、、 １９７９． Ｃｅｎｅ７
： ７９ ）に連結した。連結混合物を用いてＥ、ｃｏ
ｌ ｒを形質転換し、アンピシリン及びゲンタマイシン
を含む培地で生育せしめて形質転換体を選択した。
ｉ片を、ＥｃｏＲＩと８ａｍ）ＩＩで開裂したＥ．ｃｏ
ｌｉクローニングプラスミドｐＫＣ７（Ｒｏｇｅｒｓ、
Ｓ、Ｇ、ｅｔ ａｔ、、 １９７９． Ｃｅｎｅ７
： ７９ ）に連結した。連結混合物を用いてＥ、ｃｏ
ｌ ｒを形質転換し、アンピシリン及びゲンタマイシン
を含む培地で生育せしめて形質転換体を選択した。
１３ ａｍＨＩ近位末端での５ｐｈＩを用いたデレージ
ョンにより、Ｇｍ’遺伝子のサイズを約１９００ｂｐに
した。次いで、Ｅ ＣＯＲＩ近位Ｈｉｎｄｌｌ［を、ク
レノーポリメラーゼで処理し再連結して不活性化した。
ョンにより、Ｇｍ’遺伝子のサイズを約１９００ｂｐに
した。次いで、Ｅ ＣＯＲＩ近位Ｈｉｎｄｌｌ［を、ク
レノーポリメラーゼで処理し再連結して不活性化した。
Ｇｍｒを含むＥｃｏＲＩ／５ｐｈＩ断片を、Ｇｅｕｒｒ
ｙ、Ｐ、ｅｔ ａｌ、、 １９７４ 。
ｙ、Ｐ、ｅｔ ａｌ、、 １９７４ 。
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １１７ ： ６１９−６３
０に記載された１ｎｃＱレプリコーン、Ｒ８Ｆ１０１０
にクローン化し、ｐＭＯＮ７０５１を得た。具体的には
、最初に、Ｒ８Ｆ１０１０の遠位５ｐｈＩ部位にＧｍ’
３１１伝子断片を挿入してＲ８Ｆ１０１０のストレプ
トマイシン耐性遺伝子を不活性化した。
０に記載された１ｎｃＱレプリコーン、Ｒ８Ｆ１０１０
にクローン化し、ｐＭＯＮ７０５１を得た。具体的には
、最初に、Ｒ８Ｆ１０１０の遠位５ｐｈＩ部位にＧｍ’
３１１伝子断片を挿入してＲ８Ｆ１０１０のストレプ
トマイシン耐性遺伝子を不活性化した。
１ｎｃＱレプリコーンからの５ｏｏｂｐ ＰｓｔＩ新
片のデレージョンにより、士民のスルファニルアミド耐
性遺伝子とそのプロモーターを除去した。
片のデレージョンにより、士民のスルファニルアミド耐
性遺伝子とそのプロモーターを除去した。
次いで、プラスミドｐＭＯＮ５５４２とｐＭＯＮ７０５
１とをＥｃｏＲＩで開裂し更に開裂したプラスミドをＴ
４ＤＮＡリガーゼの存在下に混合して、ｐＭＯＮ５５４
２１）ＭＯＮ７０５１に３％結した。次いで、連結混合
物を用いてＥ、ｃｏｔ ｔＪＭ１０ｌＦ−を形質転換し
、アンピシリン（２００ｕ９／＃Ｉｉ！＞とゲンタマイ
シン（１０μ９／ｍｅ）とを含む培地で生育せしめて形
質転換体を選択した。
１とをＥｃｏＲＩで開裂し更に開裂したプラスミドをＴ
４ＤＮＡリガーゼの存在下に混合して、ｐＭＯＮ５５４
２１）ＭＯＮ７０５１に３％結した。次いで、連結混合
物を用いてＥ、ｃｏｔ ｔＪＭ１０ｌＦ−を形質転換し
、アンピシリン（２００ｕ９／＃Ｉｉ！＞とゲンタマイ
シン（１０μ９／ｍｅ）とを含む培地で生育せしめて形
質転換体を選択した。
ゲンタマイシン耐性遺伝子に対して逆の方向であるいは
同じ方向で、Ｇ１０Ｌ及びＪ ａｃｌ構造遺伝遺伝作動
可能な状態でＥ、ｃｏ！＋ｒｅＣＡブＯモーターが連結
している得られる広範囲宿主プラスミドを、それぞれｌ
）ＭＯＮ５７５７、ｐＭＯＮ５７５８と命名した（第５
図）。
同じ方向で、Ｇ１０Ｌ及びＪ ａｃｌ構造遺伝遺伝作動
可能な状態でＥ、ｃｏ！＋ｒｅＣＡブＯモーターが連結
している得られる広範囲宿主プラスミドを、それぞれｌ
）ＭＯＮ５７５７、ｐＭＯＮ５７５８と命名した（第５
図）。
Ｇ１０Ｌ配列と１８ＣＺ構造遺伝子に作動可能な状態で
Ｅ、ｃｏｊ！ｉ ｒｅｃＡプａｔ−ターが連結してい
る広範囲宿主発現ベヒクルｐＭＯＮ５０１４（第６図）
は次のようにして構築した。
Ｅ、ｃｏｊ！ｉ ｒｅｃＡプａｔ−ターが連結してい
る広範囲宿主発現ベヒクルｐＭＯＮ５０１４（第６図）
は次のようにして構築した。
プラスミドｐＭＯＮ５５２７（第４図）をＥＣ０ＲＩと
Ｄｒａ■で消化し、Ｐｒｅｃ、Ｇ１０Ｌ及び１ａｃｚ構
造遺伝子を含む約４．４キロベース（ｋｂ）断片を単離
した。次いで、この４．４ｋｂ断片を、あらかじめＥＣ
０ＲＩとＨｐａＩで消化したｐＭＯＮ７０３０に挿入し
た。
Ｄｒａ■で消化し、Ｐｒｅｃ、Ｇ１０Ｌ及び１ａｃｚ構
造遺伝子を含む約４．４キロベース（ｋｂ）断片を単離
した。次いで、この４．４ｋｂ断片を、あらかじめＥＣ
０ＲＩとＨｐａＩで消化したｐＭＯＮ７０３０に挿入し
た。
約９．４ｋｂ１７）ブ５ スミｔ’ ＯＭ ＯＮ ７０
３０１．ｔ ’７ ラスミドｐＮＪ９２７９ （Ｇｒｉ
ｎｔｅｒ、 Ｎ、Ｊ、、１９８３゜Ｇｅｎｅ２１ ：１
３３−１４３）を含んでおり、プラスミドｐＭＯＮ７０
３０は、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏ
ｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｓｃｏ
口ａｎｄ）より受託番号ＮＣｌＢ１１７１５として入手
することができる。このプラスミドｌ）ＭＯＮ７０３０
をＰＳｔＩで消化して、カナマイシン（Ｋｍ ）耐性
遺伝子、広範囲宿主視製同始点及び複製遺伝子は保持し
たままでＴｎ７配列を除去した。得られる広範囲宿主プ
ラスミドｐＭＯＮ５０１４は、Ｇ１０Ｌ配列と１８ＣＺ
構造遺伝子に作動可能な状態で連結しているｐｒｅｃを
有しており、更にカナフィシン耐性マーカーを保持して
いてｐＭＯＮ５０１４による形質転換体の選択が可能と
なっている。
３０１．ｔ ’７ ラスミドｐＮＪ９２７９ （Ｇｒｉ
ｎｔｅｒ、 Ｎ、Ｊ、、１９８３゜Ｇｅｎｅ２１ ：１
３３−１４３）を含んでおり、プラスミドｐＭＯＮ７０
３０は、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏ
ｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｓｃｏ
口ａｎｄ）より受託番号ＮＣｌＢ１１７１５として入手
することができる。このプラスミドｌ）ＭＯＮ７０３０
をＰＳｔＩで消化して、カナマイシン（Ｋｍ ）耐性
遺伝子、広範囲宿主視製同始点及び複製遺伝子は保持し
たままでＴｎ７配列を除去した。得られる広範囲宿主プ
ラスミドｐＭＯＮ５０１４は、Ｇ１０Ｌ配列と１８ＣＺ
構造遺伝子に作動可能な状態で連結しているｐｒｅｃを
有しており、更にカナフィシン耐性マーカーを保持して
いてｐＭＯＮ５０１４による形質転換体の選択が可能と
なっている。
ｂ、 Ｐｒｅｃ−ｍｌンセンサスＳ、Ｄ、 −ｊｊ
ａ ｃ ＺＥ、ＣＯｌ ｉコンセンサスリポソーム結合
部位（コンセンサスＳＤ）及び１ａＣＺ構造遺伝子に対
して作動可能な状態で［：、ｃｏ、ｊｉ ｒｅｃＡプ
ロモーター（ＰｒｅＧ）が連結しているｐＥＭＢＬベク
ターであってＩ）ＭＯＮ５５７５と命名されるベクター
を以下のようにして構築した。
ａ ｃ ＺＥ、ＣＯｌ ｉコンセンサスリポソーム結合
部位（コンセンサスＳＤ）及び１ａＣＺ構造遺伝子に対
して作動可能な状態で［：、ｃｏ、ｊｉ ｒｅｃＡプ
ロモーター（ＰｒｅＧ）が連結しているｐＥＭＢＬベク
ターであってＩ）ＭＯＮ５５７５と命名されるベクター
を以下のようにして構築した。
ΔＴＣＣ受託ｔＲ号６７０４４のＥ、ｃｏ！ｉＪＭ１０
１から得られる！ラスミドｐＭＯＮ６００２と上記した
プラスミドｐＭＯＮ５５１５とを、それぞれ、ＮｃｏＩ
とＥＣ０ＲＩで消化した後、１’ ４ Ｄ Ｎ Ａリガ
ーゼの存在下で混合した。次いで、得られる連結混合物
を用いてＥ、ＣＯｊ！ ｉＪＭ１０Ｉを形質転換し、ア
ンピシリンを含む培地で生育せしめることにより形質転
換体を選択した。コンセンサスＳ、０．及びアトリアル
ベプチゲンコード配列（ＡＰａｅｎ）に作動可能な状態
でｐｒｅｃが連結している目的とするベクターｐＭＯＮ
５５１４が得られたことは、υ１限酵素で消化してＧ１
０Ｌ配列が存在せずアトリアルベブチゲンコード配列が
存在することが明らかにされることによって確認した。
１から得られる！ラスミドｐＭＯＮ６００２と上記した
プラスミドｐＭＯＮ５５１５とを、それぞれ、ＮｃｏＩ
とＥＣ０ＲＩで消化した後、１’ ４ Ｄ Ｎ Ａリガ
ーゼの存在下で混合した。次いで、得られる連結混合物
を用いてＥ、ＣＯｊ！ ｉＪＭ１０Ｉを形質転換し、ア
ンピシリンを含む培地で生育せしめることにより形質転
換体を選択した。コンセンサスＳ、０．及びアトリアル
ベプチゲンコード配列（ＡＰａｅｎ）に作動可能な状態
でｐｒｅｃが連結している目的とするベクターｐＭＯＮ
５５１４が得られたことは、υ１限酵素で消化してＧ１
０Ｌ配列が存在せずアトリアルベブチゲンコード配列が
存在することが明らかにされることによって確認した。
プラスミドｐＭＯＮ５５１４をＡＶａ■とＮｃｏＩで開
裂して、ｐｒｅｃとコンセンサスＳ、０．配列とを含む
約１２００ ｂｐ１ｇｉ片を得た。次いで、この断片を
精製してｐＭＯＮ５５２６ （第４図）のＳｍａ■部位
に挿入した。得られるプラスミドをｐＭＯＮ ５５４０
と命名した。このプラスミドは、コンセンサスＳ、０．
と１ａｃＺＪａＴｉ遺伝子に作動可能な状態でｐｒｅｃ
が連結しているｐ８Ｒ３２２プラスミド誘導体を有して
いる。ｐｒｅｃと０１０Ｌ配列を有しているｐＭＯＮ
５５４２のＥ ＣＯＲＩ ／Ｈｉｎｄｌｌｌ領域を、ｐ
ｒｅｃとコンセンサスＳ、Ｄ、配列を有しているｐＭＯ
Ｎ ５５４０のＥ ｃ ｏ ＩＩ Ｉ／ＨｉｎｄＤＩ断
片と置換することにより、ρＭＯＮ５５７５ ｐＥＭ
８Ｌプラスミド誘導体を構築した。
裂して、ｐｒｅｃとコンセンサスＳ、０．配列とを含む
約１２００ ｂｐ１ｇｉ片を得た。次いで、この断片を
精製してｐＭＯＮ５５２６ （第４図）のＳｍａ■部位
に挿入した。得られるプラスミドをｐＭＯＮ ５５４０
と命名した。このプラスミドは、コンセンサスＳ、０．
と１ａｃＺＪａＴｉ遺伝子に作動可能な状態でｐｒｅｃ
が連結しているｐ８Ｒ３２２プラスミド誘導体を有して
いる。ｐｒｅｃと０１０Ｌ配列を有しているｐＭＯＮ
５５４２のＥ ＣＯＲＩ ／Ｈｉｎｄｌｌｌ領域を、ｐ
ｒｅｃとコンセンサスＳ、Ｄ、配列を有しているｐＭＯ
Ｎ ５５４０のＥ ｃ ｏ ＩＩ Ｉ／ＨｉｎｄＤＩ断
片と置換することにより、ρＭＯＮ５５７５ ｐＥＭ
８Ｌプラスミド誘導体を構築した。
広範囲宿主ベヒクルｐＭＯＮ５７５９ （第６図）は、
Ｉ）ＭＯＮ５５７５とｐＭＯＮ７０５１とを融合するこ
とによって構築した。置体的には、１）ＭＯＮ５５７５
とｐＭＯＮ７０５１とをそれぞれＥｃｏＲＩで消化した
後で連結し、次いで得られる連結混合物を用いてＥ、ｃ
ｏＪｉ ＪＭ１０ｌＦ−を形質転換し、ゲンタマイシ
ンとアンピシリンとを含む培地で生育せしめて形質転換
体を選択した。得られる広範囲宿主発現ベヒクル１）Ｍ
ＯＮ５７５９は、コンセンサスリポソーム結合部位（Ｓ
Ｄ）と１ａｃＺ構造遺伝子に作動可能 ゛な状態ぐ連結
しているｐｒｅｃを含んでいる。またベクターｐＭＯＮ
５７５９はＧｍ’遺伝子とＩｎｃＱレプリコーンを含ん
でいる。
Ｉ）ＭＯＮ５５７５とｐＭＯＮ７０５１とを融合するこ
とによって構築した。置体的には、１）ＭＯＮ５５７５
とｐＭＯＮ７０５１とをそれぞれＥｃｏＲＩで消化した
後で連結し、次いで得られる連結混合物を用いてＥ、ｃ
ｏＪｉ ＪＭ１０ｌＦ−を形質転換し、ゲンタマイシ
ンとアンピシリンとを含む培地で生育せしめて形質転換
体を選択した。得られる広範囲宿主発現ベヒクル１）Ｍ
ＯＮ５７５９は、コンセンサスリポソーム結合部位（Ｓ
Ｄ）と１ａｃＺ構造遺伝子に作動可能 ゛な状態ぐ連結
しているｐｒｅｃを含んでいる。またベクターｐＭＯＮ
５７５９はＧｍ’遺伝子とＩｎｃＱレプリコーンを含ん
でいる。
ｃ、 Ｐｒｅｃ−Ｇ１０Ｌ−ＰＧＨ
Ｇ１０Ｌとブタ成長ホルモン（Ｐ Ｇ Ｉ−１）構造遺
伝子に作動可能な状態でＥ、ｃｏｊ！ｉ ｒｅＣＡプ
ロモーター（Ｐｒｃｃ）が連結している広範囲宿主発現
ベヒクルｐＭＯＮ５７５６ （第６図）は次のようにし
て構築した。
伝子に作動可能な状態でＥ、ｃｏｊ！ｉ ｒｅＣＡプ
ロモーター（Ｐｒｃｃ）が連結している広範囲宿主発現
ベヒクルｐＭＯＮ５７５６ （第６図）は次のようにし
て構築した。
ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のＤＮＡコード配列を有す
るプラスミドｐＢＧＨｏｘ−１を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ
、Ｉｎｃ、 （Ｓｏ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。このプラスミド
は、欧州特許公開島７５．４４４ （１９８３年３月３
０日公開）：Ｓｅｅｂｕｒｇ ｅｔ ａｔ、、 １９
８３． ＤＮＡ ２１ ： ３７〜４５ ：Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ ｅｔ ａｌ、、 １９７９． Ｎａｔｕｒｅ
２８１ ： ５４４−５４８ ；ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ
ａｌ、、１９８２゜Ｐｒ０ｍ０ｔｅｒＳ ：構造と
機能、 ＣｈａｍｂｅｒｌｉｎとＲｏｄｒｉｇｕｅｚ、
ｅｄｓ、、チャプター２ ｇ ３ ： ＋１ｏｚｚａ
ｒｅとＹａｎｏｆｓｋｙ、 １９７８． Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、１３３ ： １４５７−１４６６：及びＲ
ｏｓｅｎｂｅｒｇとＣｏｕｒｔ、 １９７９ 、 Ａｎ
ｎ、Ｒｅｖ、Ｇｃｎｅｔ、 １３ ： ３１９−３５３
に記載された方法に従って調製することができる。発現
ベクターｐＢＧＨｏｘ−１は、［３ＧＨ［ＢＧＨ−１（
Ｐ）］のための遺伝子を含むｐＢＲ３２２バクテリアプ
ラスミドであって、そこでコードされるＢ Ｇ Ｈ１白
のＮ末端アミノ酸は、ＮＨ２−メチオニン（ｍａｔ）と
フェニルアラニン（ｐｈｅ）である。
るプラスミドｐＢＧＨｏｘ−１を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ
、Ｉｎｃ、 （Ｓｏ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。このプラスミド
は、欧州特許公開島７５．４４４ （１９８３年３月３
０日公開）：Ｓｅｅｂｕｒｇ ｅｔ ａｔ、、 １９
８３． ＤＮＡ ２１ ： ３７〜４５ ：Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ ｅｔ ａｌ、、 １９７９． Ｎａｔｕｒｅ
２８１ ： ５４４−５４８ ；ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ
ａｌ、、１９８２゜Ｐｒ０ｍ０ｔｅｒＳ ：構造と
機能、 ＣｈａｍｂｅｒｌｉｎとＲｏｄｒｉｇｕｅｚ、
ｅｄｓ、、チャプター２ ｇ ３ ： ＋１ｏｚｚａ
ｒｅとＹａｎｏｆｓｋｙ、 １９７８． Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、１３３ ： １４５７−１４６６：及びＲ
ｏｓｅｎｂｅｒｇとＣｏｕｒｔ、 １９７９ 、 Ａｎ
ｎ、Ｒｅｖ、Ｇｃｎｅｔ、 １３ ： ３１９−３５３
に記載された方法に従って調製することができる。発現
ベクターｐＢＧＨｏｘ−１は、［３ＧＨ［ＢＧＨ−１（
Ｐ）］のための遺伝子を含むｐＢＲ３２２バクテリアプ
ラスミドであって、そこでコードされるＢ Ｇ Ｈ１白
のＮ末端アミノ酸は、ＮＨ２−メチオニン（ｍａｔ）と
フェニルアラニン（ｐｈｅ）である。
この遺伝子は、トリプトファンプロモーター（ｐｔｒｐ
）、５’非翻訳ｍＲＮＡのセグメント。
）、５’非翻訳ｍＲＮＡのセグメント。
８Ｇ）ＩのＮ末端ｐｈｅ （Ｐ）Ｄトン（以後Ｂ Ｇ
ｌ−１（Ｐ）と言う）に隣接した翻訳開始コドン。
ｌ−１（Ｐ）と言う）に隣接した翻訳開始コドン。
Ｂ Ｇ Ｈコード配列及び翻訳終止コドンを含んでいる
。
。
ＢＧＨ（Ｐ）コード配列が、Ｎ末端翻訳開始（ＡＴＧ）
メチオニンコドンの直ぐ後にアラニン＜ａｐａ＞コドン
を有し更に翻訳開始コドン（△Ｔ Ｇ ）に重複してい
るＮＣｏＴ部僚を有するように、以下のようにしてオリ
ゴヌクレオヂド部位特異的突然変異により１３Ｇ＋−１
（＋））コード配列を修■几た。プラスミドＢ Ｇ ｌ
−１ｅｘ−１からＨｉｎｄｌ［［／ＥｃｏＲＩ断片とじ
ＴＢＧＨ（Ｐ）ＤＮＡコード配列を切り出し、２本鎖Ｍ
１３＋ｅｐ９ＤＮＡ （ＲＦＤＮＡ）のＨｉｎｄ！Ｉｆ
／ＥｃｏＲ丁部位にクローン化した。ＲＦＭＩ ３ｍｐ
９ＤＮΔのＨｉｎｄｌ［［／ＥｃｏＲ１部位へ ＢＧＨ（Ｐ）ＤＮＡコード配列が挿入された組換えベク
ターＭ １３ ｍ ｐ ９ ／ Ｂ Ｇ Ｈが造成され
たことは、バクテリア生育培地上に無色のプラークが形
成されたことによって先づ確認した。即ら、Ｈａｎｉａ
ｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 （１９８２）に記載されたソ
フトアガー重層法を用いて、１ＸＹＴｗＳ地［トップア
ガー３−中に、１０ｄｌ ＯＯｍＨＩ ＰＴＧ （イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）と５０μ
ｍ２％（ｗ／ｖ）Ｘ−ＧＡＬ （５−７０−Ｅ−４−ク
ロ［１−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
）とを含有する１上でＥ、ｃａｌｒＪＭ１０Ｉを生育せ
しめ、次いでＨａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ。
メチオニンコドンの直ぐ後にアラニン＜ａｐａ＞コドン
を有し更に翻訳開始コドン（△Ｔ Ｇ ）に重複してい
るＮＣｏＴ部僚を有するように、以下のようにしてオリ
ゴヌクレオヂド部位特異的突然変異により１３Ｇ＋−１
（＋））コード配列を修■几た。プラスミドＢ Ｇ ｌ
−１ｅｘ−１からＨｉｎｄｌ［［／ＥｃｏＲＩ断片とじ
ＴＢＧＨ（Ｐ）ＤＮＡコード配列を切り出し、２本鎖Ｍ
１３＋ｅｐ９ＤＮＡ （ＲＦＤＮＡ）のＨｉｎｄ！Ｉｆ
／ＥｃｏＲ丁部位にクローン化した。ＲＦＭＩ ３ｍｐ
９ＤＮΔのＨｉｎｄｌ［［／ＥｃｏＲ１部位へ ＢＧＨ（Ｐ）ＤＮＡコード配列が挿入された組換えベク
ターＭ １３ ｍ ｐ ９ ／ Ｂ Ｇ Ｈが造成され
たことは、バクテリア生育培地上に無色のプラークが形
成されたことによって先づ確認した。即ら、Ｈａｎｉａ
ｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 （１９８２）に記載されたソ
フトアガー重層法を用いて、１ＸＹＴｗＳ地［トップア
ガー３−中に、１０ｄｌ ＯＯｍＨＩ ＰＴＧ （イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）と５０μ
ｍ２％（ｗ／ｖ）Ｘ−ＧＡＬ （５−７０−Ｅ−４−ク
ロ［１−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
）とを含有する１上でＥ、ｃａｌｒＪＭ１０Ｉを生育せ
しめ、次いでＨａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ。
（１９８２）に記載された方法に従って上記組換えベク
ターをトランスフェクションして、無色のプラークが形
成されるか否かを調べた。更に、ＢＧＨ（Ｐ）コード配
列が挿入されていることを、Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ、、 （１９８２）に記載されたようにして無色の
プラークからｆ」ｉ ｎ ｄ ｍとＥＣ０ＲＩとを用い
て組換えベクタ線中のＲＦＤＮＡを開裂せしめて挿入配
列を含む５９０ｂｐｆ！Ｆｉ片が得られることによって
確認した。
ターをトランスフェクションして、無色のプラークが形
成されるか否かを調べた。更に、ＢＧＨ（Ｐ）コード配
列が挿入されていることを、Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ、、 （１９８２）に記載されたようにして無色の
プラークからｆ」ｉ ｎ ｄ ｍとＥＣ０ＲＩとを用い
て組換えベクタ線中のＲＦＤＮＡを開裂せしめて挿入配
列を含む５９０ｂｐｆ！Ｆｉ片が得られることによって
確認した。
Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 （１９８２）に記
載されたようにして、１％（Ｗ／Ｖ）アガロースでの７
ガロースゲル電気泳動により５９０塩基対（ｂｐ）断片
を同定した。全ての１ｔｉｌｌ限酵素断片を、Ｈａｎｉ
ａｔｉｓ ｅｔａｌ、、（１９８２）に記載された方法
に従って同定した。Ｈｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、、
（１９８２） Ｇｅｎｃｌ ９ ：２６９に記載され
た方法に従って、１本！ＩＩ（８８）ファージＤＮＡを
単離した。 ２ｏ１１ｅｒと！１ｖｉｔｈ（１９８２）
Ｎｕｃ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｃｓ、 １０ ： ６４
８７−６５００ ： ＺｏｌｌｃｒとＳｍ１ｔｈ （
１９８３） Ｈｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、
１００：４６８−５００：及びＮｏｒｒｉｓｅｔ ａ
ｌ、 （１９８３） ＮｕＣ，八ｃｉｃｌｓ Ｒ
ｅＳ、１ １ ： ５ １ ０３−５１１２に記載
された方法と木質的に同様にして、オリゴヌクレオヂド
部位特異的突然変異用にＭ１３ｆｆ１９８Ｇｌｌベクタ
ーをテンプレートとして用いた。これら文献の相当部分
の記載を水圏１１１、！Ｊに引用する。
載されたようにして、１％（Ｗ／Ｖ）アガロースでの７
ガロースゲル電気泳動により５９０塩基対（ｂｐ）断片
を同定した。全ての１ｔｉｌｌ限酵素断片を、Ｈａｎｉ
ａｔｉｓ ｅｔａｌ、、（１９８２）に記載された方法
に従って同定した。Ｈｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、、
（１９８２） Ｇｅｎｃｌ ９ ：２６９に記載され
た方法に従って、１本！ＩＩ（８８）ファージＤＮＡを
単離した。 ２ｏ１１ｅｒと！１ｖｉｔｈ（１９８２）
Ｎｕｃ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｃｓ、 １０ ： ６４
８７−６５００ ： ＺｏｌｌｃｒとＳｍ１ｔｈ （
１９８３） Ｈｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、
１００：４６８−５００：及びＮｏｒｒｉｓｅｔ ａ
ｌ、 （１９８３） ＮｕＣ，八ｃｉｃｌｓ Ｒ
ｅＳ、１ １ ： ５ １ ０３−５１１２に記載
された方法と木質的に同様にして、オリゴヌクレオヂド
部位特異的突然変異用にＭ１３ｆｆ１９８Ｇｌｌベクタ
ーをテンプレートとして用いた。これら文献の相当部分
の記載を水圏１１１、！Ｊに引用する。
Ｎ末端メチオニンコドンの直ぐ後にフェニルアラニンコ
ドンを有しＮＣＯＩ部位を欠いたＢＧＨ“コード配列か
ら、以下に示した突然変異法により、Ｎ 、を端メチオ
ニンコドンの直ぐ後に７ラニンコドン及びＮｃｏＩ部位
を右するＢＧＩ−１コ一ド配列［ＢＧＨ（Ａ）］を造成
した。即ち、先ず、目的とする変異配列を含むオリゴヌ
クレオチドブライマーを用いて、５ｓＤＮＡ Ｍｌ
３ｍｐ９／ＢＧ！−１テンプレートの閉環状ＤＮＡコピ
ーの合成を行なった。このプライマーの配列は次の通り
である。
ドンを有しＮＣＯＩ部位を欠いたＢＧＨ“コード配列か
ら、以下に示した突然変異法により、Ｎ 、を端メチオ
ニンコドンの直ぐ後に７ラニンコドン及びＮｃｏＩ部位
を右するＢＧＩ−１コ一ド配列［ＢＧＨ（Ａ）］を造成
した。即ち、先ず、目的とする変異配列を含むオリゴヌ
クレオチドブライマーを用いて、５ｓＤＮＡ Ｍｌ
３ｍｐ９／ＢＧ！−１テンプレートの閉環状ＤＮＡコピ
ーの合成を行なった。このプライマーの配列は次の通り
である。
５°−ＧＴＧＡ＾ＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＴ丁丁ＣＣＣ
ＡＧＣＴＡＴＧＴＣ−３′かくして造成された閉環状ｄ
ＳＤＮＡ分子を、ＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈ （１９
８３）に記載されたアルカリシュクロースグラジェント
遠心により不完全環状分子及び５ｓＤＮＡ環状分子より
分離した。
ＡＧＣＴＡＴＧＴＣ−３′かくして造成された閉環状ｄ
ＳＤＮＡ分子を、ＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈ （１９
８３）に記載されたアルカリシュクロースグラジェント
遠心により不完全環状分子及び５ｓＤＮＡ環状分子より
分離した。
Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、、 （１９８２）に記
載された方法に従って、閉環状ｄｓＤＮＡ分子を用いて
Ｅ、ｃｏｉｉ ＪＭ１０ｌを形質転換し、得られる無
色プラークを、Ｐａ１ｌυ目ｒａｆｉｎｅ Ｆｉｌｔｒ
ａｔｉｏｎＣｏｒｐ、 （Ｇｌｅｎ Ｃｏｖｅ、 Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ ）から入手したナイロンバイオダイン
１Ｈフイルター上に取り、部位特異的突然変異に用いた
オリゴヌクレオチドブライマーの３２Ｐ−ラベル体とハ
イブリダイズするか否かをスクリーニングした。製造業
者の指針に従って、プラークを上記のフィルター上に取
った。
載された方法に従って、閉環状ｄｓＤＮＡ分子を用いて
Ｅ、ｃｏｉｉ ＪＭ１０ｌを形質転換し、得られる無
色プラークを、Ｐａ１ｌυ目ｒａｆｉｎｅ Ｆｉｌｔｒ
ａｔｉｏｎＣｏｒｐ、 （Ｇｌｅｎ Ｃｏｖｅ、 Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ ）から入手したナイロンバイオダイン
１Ｈフイルター上に取り、部位特異的突然変異に用いた
オリゴヌクレオチドブライマーの３２Ｐ−ラベル体とハ
イブリダイズするか否かをスクリーニングした。製造業
者の指針に従って、プラークを上記のフィルター上に取
った。
Ｐａ１ｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
（Ｇｌｅｎｎ Ｃｏｖｅ、 Ｎ、Ｙ、）成した’ Ｐａ
１ｌ Ｂｉｏｄｙｎｅ” Ｎｙ１０ｎ Ｆｉｌｔｅｒ
ヘＤＮＡをトランスファーするためのプロトコールガイ
ド（１９８３）”に記載された方法に従って、ナイロン
Ｂｉｏｄｙｎｅフィルターを用いてハイブリダイげ一ジ
ョンスクリーニングを実施した。Ｍ１３ｍｐ８ ／ ｂ
Ｇ ｌ（ｅｘ−１フアージを用いて調製したコントロ
ールフィルターから放射ラベル化シグナルがなくなるま
でフィルターを温度上昇Ｆに洗浄した。
（Ｇｌｅｎｎ Ｃｏｖｅ、 Ｎ、Ｙ、）成した’ Ｐａ
１ｌ Ｂｉｏｄｙｎｅ” Ｎｙ１０ｎ Ｆｉｌｔｅｒ
ヘＤＮＡをトランスファーするためのプロトコールガイ
ド（１９８３）”に記載された方法に従って、ナイロン
Ｂｉｏｄｙｎｅフィルターを用いてハイブリダイげ一ジ
ョンスクリーニングを実施した。Ｍ１３ｍｐ８ ／ ｂ
Ｇ ｌ（ｅｘ−１フアージを用いて調製したコントロ
ールフィルターから放射ラベル化シグナルがなくなるま
でフィルターを温度上昇Ｆに洗浄した。
典型的な洗浄プロトコロールは、室温で１０分間６ＸＳ
ＳＣ（０，９Ｍ ＮａＣ１及び０．０９Ｍクエン酸ナ
トリウム）で洗浄し、次いで５０℃で５分間６ＸＳＳＣ
で洗浄し、更に５℃上界した温度で洗浄する方法である
。コントロールファージよりも高い温度で放射ラベル化
オリゴヌクレオチドブライマーにハイブリダイズするプ
ラークが、新たに造成されたＢＧ１〜１（Ａ）コード配
列を保持していると考え、ボテンシＶルポジティブとし
た。
ＳＣ（０，９Ｍ ＮａＣ１及び０．０９Ｍクエン酸ナ
トリウム）で洗浄し、次いで５０℃で５分間６ＸＳＳＣ
で洗浄し、更に５℃上界した温度で洗浄する方法である
。コントロールファージよりも高い温度で放射ラベル化
オリゴヌクレオチドブライマーにハイブリダイズするプ
ラークが、新たに造成されたＢＧ１〜１（Ａ）コード配
列を保持していると考え、ボテンシＶルポジティブとし
た。
あるいは他の方法として、Ｅ、ｃｏｊ！ｉ ＪＭ１０
１形質転換体から無色プラークを採取し、１゜６％ （
ｗ／Ｖ） ト！Ｊプトン、１．０％（Ｗ／Ｖ）酵母抽出
物及び０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣ１を含む２ＸＹＴ培地
５−で３７℃で通気しながら１晩生育サセタ。次イテ、
Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、、 （１９８２）に記
載された方法に従って調製したファージＤＮＡをニトロ
セルロース上にスポットし、放射ラベル化ブライマーと
ハイブリダイズさゼ、次いで上記と同様にして温度上昇
下に洗浄した。Ｍ１３ｍｐ９８ＧＨコントロールプラコ
ントロールファージハイブリダイズするファージＤＮＡ
を同様にポテンシャルポジティブとした。上記の両者の
スクリーニング法により得たポテンシャルポジティブプ
ラークを上記と同様にして生育せしめ、これを用いてＳ
ＳファージＤＮＡを調製し、５ａｎａｅｒ ｅｔ
ａｌ、 （１９７７） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八
ｃａｄ。
１形質転換体から無色プラークを採取し、１゜６％ （
ｗ／Ｖ） ト！Ｊプトン、１．０％（Ｗ／Ｖ）酵母抽出
物及び０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣ１を含む２ＸＹＴ培地
５−で３７℃で通気しながら１晩生育サセタ。次イテ、
Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、、 （１９８２）に記
載された方法に従って調製したファージＤＮＡをニトロ
セルロース上にスポットし、放射ラベル化ブライマーと
ハイブリダイズさゼ、次いで上記と同様にして温度上昇
下に洗浄した。Ｍ１３ｍｐ９８ＧＨコントロールプラコ
ントロールファージハイブリダイズするファージＤＮＡ
を同様にポテンシャルポジティブとした。上記の両者の
スクリーニング法により得たポテンシャルポジティブプ
ラークを上記と同様にして生育せしめ、これを用いてＳ
ＳファージＤＮＡを調製し、５ａｎａｅｒ ｅｔ
ａｌ、 （１９７７） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八
ｃａｄ。
Ｓｃｉ、、 Ｉｌ、Ｓ、＾、７４ ： ５４６３に記載
された方法に従って配列決定を行ない、ＢＧＩ−１（Ａ
）コード配列を保持していることを確認した。ＢＧＨ（
Ａ＞コード配列及びＮｃｏＩ部位を含む得られる組換え
Ｍ１３ｍｐ９ファージＤＮＡをｐＮｃＤ８と命名した。
された方法に従って配列決定を行ない、ＢＧＩ−１（Ａ
）コード配列を保持していることを確認した。ＢＧＨ（
Ａ＞コード配列及びＮｃｏＩ部位を含む得られる組換え
Ｍ１３ｍｐ９ファージＤＮＡをｐＮｃＤ８と命名した。
次いで、ＢＧＨ（Ａ）コード配列に作動可能な状態でＧ
１０Ｌ配列が連結したプラスミドｐＢＲ３２７を構築し
た。具体的には、ｐＮｃＤ８を１−１ｉｎｄｌ［Ｉ及び
ＮＣ０Ｉで消化して、ＢＧＩ−１＜Ａ）コード配列を含
む５８０ｂｌ）ＤＮＡＩＩ片を単離した。
１０Ｌ配列が連結したプラスミドｐＢＲ３２７を構築し
た。具体的には、ｐＮｃＤ８を１−１ｉｎｄｌ［Ｉ及び
ＮＣ０Ｉで消化して、ＢＧＩ−１＜Ａ）コード配列を含
む５８０ｂｌ）ＤＮＡＩＩ片を単離した。
次いで、この５８０ ｂｐＤ Ｎ Ａ断片を、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼの存在下で、あらかじめＮｅｏ ＩとＨｉｎ
ｄｌｌｌで消化したｐＭＯＮ５５１５と混合し、ウシ腸
アルカリホスファターゼで処理した。次いで、得られる
混合物を用いてＥ、ｃｏｌ： ＪＭ１０ｌを形質転換
し、アンピシリンを金石する培地で生育せしめて形質転
換体を選択した。
Ａリガーゼの存在下で、あらかじめＮｅｏ ＩとＨｉｎ
ｄｌｌｌで消化したｐＭＯＮ５５１５と混合し、ウシ腸
アルカリホスファターゼで処理した。次いで、得られる
混合物を用いてＥ、ｃｏｌ： ＪＭ１０ｌを形質転換
し、アンピシリンを金石する培地で生育せしめて形質転
換体を選択した。
ｐｒｅｃ配列、Ｇ１０Ｌ配列及びＢＧＨ（Ａ）コード配
列が挿入されたプラスミドｐＢＲ３２７を含む得られる
組換えプラスミドをｐＭＯＮ ５５３９と命名した。
列が挿入されたプラスミドｐＢＲ３２７を含む得られる
組換えプラスミドをｐＭＯＮ ５５３９と命名した。
次いで、ブタ成長ホルモン［ＰＧｌ−１（Ａ）］蛋白（
例えばＮ末端アラニンを含むブタ成長ホルモン蛋白）を
コードするＤＮＡ配列を、以下のようにして、ＢＧＨ（
Ａ）コード配列に代えてｐＭＯＮ５５３９に挿入した。
例えばＮ末端アラニンを含むブタ成長ホルモン蛋白）を
コードするＤＮＡ配列を、以下のようにして、ＢＧＨ（
Ａ）コード配列に代えてｐＭＯＮ５５３９に挿入した。
即ち、先ず、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異に
より、ｐＭＯＮ３２１３中に含まれているＰＧＭ（Ａ）
コード配列の５′末端にＮｃｏ Ｉ部位を導入した。
より、ｐＭＯＮ３２１３中に含まれているＰＧＭ（Ａ）
コード配列の５′末端にＮｃｏ Ｉ部位を導入した。
ｐＭＯＮ３２１３は、Ａ Ｔ ＣＣ受託番号５３０２３
を有するＦ、ｃｏｉｉ Ｗ３１１０から１ｉ′？るこ
とができ、また欧州特許公開Ｎα１９３．５１５（１９
８６年９月９日公開）に記載されておりそこでの記載を
明ｍｓに引用する。具体的には、ｐＭＯＮ３２１３をＥ
ＣＯＲ■とＨｉｎｄｌｌｌｒ開裂して、得られる５９０
ｂｐ所片を単離し、Ｍ１３ｍｐ１９へ挿入した。得られ
る相換えＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡのチミジンの位置の部分
にウラシル残基を導入するために、にｕｎｋｅｌ （１
９８５） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、、
Ｕ、Ｓ、Ａ、、８２ ： ４８８−４９２に記載され
た方法に従い、組換えＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡをＥ、ｃｏ
ｉ １ａＢＷ３１３に２回通した。Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅ
ｔ ａｌ、、 （１９８２）に記載された方法に従っ
て、組換えＭ１３ｍｌ）１９ＤＮＡ１７）１本１１ （
ｓｓ）ＤＮＡ体を単離し、ＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈ
（１９８２、１９８３）及びＮｏｒｒｉｓ ｅｔ ａ
ｔ、、 （１９８３）に記載された方法により、オリゴ
ヌクレオチド部位特異的突然変異のテンブレー１・とじ
て用いた。次に示す２７塩１□ｔオリゴヌクレオヂドブ
ライマーを用いて相同性ＤＮＡ鎖のｉｎ ｖ目ｒＯ合成
を行なった。
を有するＦ、ｃｏｉｉ Ｗ３１１０から１ｉ′？るこ
とができ、また欧州特許公開Ｎα１９３．５１５（１９
８６年９月９日公開）に記載されておりそこでの記載を
明ｍｓに引用する。具体的には、ｐＭＯＮ３２１３をＥ
ＣＯＲ■とＨｉｎｄｌｌｌｒ開裂して、得られる５９０
ｂｐ所片を単離し、Ｍ１３ｍｐ１９へ挿入した。得られ
る相換えＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡのチミジンの位置の部分
にウラシル残基を導入するために、にｕｎｋｅｌ （１
９８５） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、、
Ｕ、Ｓ、Ａ、、８２ ： ４８８−４９２に記載され
た方法に従い、組換えＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡをＥ、ｃｏ
ｉ １ａＢＷ３１３に２回通した。Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅ
ｔ ａｌ、、 （１９８２）に記載された方法に従っ
て、組換えＭ１３ｍｌ）１９ＤＮＡ１７）１本１１ （
ｓｓ）ＤＮＡ体を単離し、ＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈ
（１９８２、１９８３）及びＮｏｒｒｉｓ ｅｔ ａ
ｔ、、 （１９８３）に記載された方法により、オリゴ
ヌクレオチド部位特異的突然変異のテンブレー１・とじ
て用いた。次に示す２７塩１□ｔオリゴヌクレオヂドブ
ライマーを用いて相同性ＤＮＡ鎖のｉｎ ｖ目ｒＯ合成
を行なった。
ＥｃｏＲＩ Ｎｃａｌ
ｍｅｔａｌａｐｈｅｐｒ。
ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣ八ＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡ
へＣ第２（ｐＡえば相同性）の鎖合成の後に、そのＤＮ
Ａを野生型Ｅ、Ｃｏｌ１株ＪＭ１０１に挿入して、変異
ＤＮＡを含むプラークを増加させた。
へＣ第２（ｐＡえば相同性）の鎖合成の後に、そのＤＮ
Ａを野生型Ｅ、Ｃｏｌ１株ＪＭ１０１に挿入して、変異
ＤＮＡを含むプラークを増加させた。
変異ＤＮＡを野生型Ｅ、ｃｏｌ ｉＪＭ１０ｌに挿入し
て４つの透明なプラークを得た。プラークを選択して、
２ＸＹＴ培地で３７℃で１晩生台させた。１本鎖ＤＮＡ
を調製して、ｓａｎｇｃｒ ａｔ ａｌ、。
て４つの透明なプラークを得た。プラークを選択して、
２ＸＹＴ培地で３７℃で１晩生台させた。１本鎖ＤＮＡ
を調製して、ｓａｎｇｃｒ ａｔ ａｌ、。
（１９７７）に記載されたジデオキシチエインターミネ
ーション法により配列決定を行なった。配列決定した４
つのＤＮＡのうち２つがＮＣｏＩ部位を有していた。Ｎ
ｃｏ Ｉ部位の存在はＮＧＯＩ消化によっても確認した
。５′末端にＮＣｏ Ｉ部位を有するＰＧＨ（Ａ）遺伝
子をＭ１３ｍｐ１９にクローン化し、これをｐＭＯＮ３
２６７と命名した。
ーション法により配列決定を行なった。配列決定した４
つのＤＮＡのうち２つがＮＣｏＩ部位を有していた。Ｎ
ｃｏ Ｉ部位の存在はＮＧＯＩ消化によっても確認した
。５′末端にＮＣｏ Ｉ部位を有するＰＧＨ（Ａ）遺伝
子をＭ１３ｍｐ１９にクローン化し、これをｐＭＯＮ３
２６７と命名した。
次イテ、ＤＭＯＮ３２６７をＮＣ０ＩとＨｉｎｄＩ［［
ｔ’消化して、ＰＧＨ（Ａ）ｌ）ＮＡ配列をＮｃｏｌ／
Ｈｉ ｎｄＩ［［断片として単離した。このＰＧＩ−１
（Ａ）ＤＮＡコード配列を、Ｔ ４１） Ｎ Ａリガー
ビの存在下で、あらかじめＮＣｏＩと）１ｉｎｄｌ［ｒ
消化してＤＭＯＮ５５３９と混合した。次いで、（ｑら
れるプラスミドを用いてＥ、ｃｏｔ ｉＪＭ１０ｌを形
質転換し、７ンビシリンを含む培地で生育せしめて形質
転換体を選択した。得られるプラスミドは、Ｐｒｅｃ。
ｔ’消化して、ＰＧＨ（Ａ）ｌ）ＮＡ配列をＮｃｏｌ／
Ｈｉ ｎｄＩ［［断片として単離した。このＰＧＩ−１
（Ａ）ＤＮＡコード配列を、Ｔ ４１） Ｎ Ａリガー
ビの存在下で、あらかじめＮＣｏＩと）１ｉｎｄｌ［ｒ
消化してＤＭＯＮ５５３９と混合した。次いで、（ｑら
れるプラスミドを用いてＥ、ｃｏｔ ｉＪＭ１０ｌを形
質転換し、７ンビシリンを含む培地で生育せしめて形質
転換体を選択した。得られるプラスミドは、Ｐｒｅｃ。
Ｇ１０Ｌ配列（例えば１０４ ｂｐ）及びＰＧＨ（Ａ）
コード配列をこの順序で作動可能な状態で有していた。
コード配列をこの順序で作動可能な状態で有していた。
このプラスミドをあらかじめＥＣ０ＲＩで開裂せしめ、
これを、ＥＣ０ＲＩであらかじめ開裂したｐＭＯＮ７０
５１に上記と同様にして連結することによりプラスミド
ｐＭＯＮ５７５６ （第６図）を構築した。プラスミド
ｐＭＯＮ５７５６は、・Ｇ１０Ｌ及びＰＧＨＩ造遺伝了
遺伝ｒｅｃ及び１ｎｃＱレプリコーンが作動可能な状態
で連結している広範囲宿主発現ベヒクルである。
これを、ＥＣ０ＲＩであらかじめ開裂したｐＭＯＮ７０
５１に上記と同様にして連結することによりプラスミド
ｐＭＯＮ５７５６ （第６図）を構築した。プラスミド
ｐＭＯＮ５７５６は、・Ｇ１０Ｌ及びＰＧＨＩ造遺伝了
遺伝ｒｅｃ及び１ｎｃＱレプリコーンが作動可能な状態
で連結している広範囲宿主発現ベヒクルである。
実施例３
本実施例は、Ｅ、ｃｏＪｉ ｒｅｃＡプロモーター（
Ｐｒｅｃ）は２．３の異種グラムネガティブバクテリア
において目的とする構造遺伝子の発現を引き起こすこと
ができることを示す６のである。
Ｐｒｅｃ）は２．３の異種グラムネガティブバクテリア
において目的とする構造遺伝子の発現を引き起こすこと
ができることを示す６のである。
下の表１に示すように、Ｅ、ｃｏ１ｉベーターガラクｌ
−シダーゼ構造遺伝子１ａＣＺ）にＰｒｅｃが作動可能
な状態で連結した発現ベクターで形質転換された各種の
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種は、非誘導条件下で高レベル
のベーターガラクトシダーゼ（β−ｑａＪ）活性を示し
た。Ｅ、 ｃｏｔｔ ｉＪＭ ｌ Ｑ １１ｍ−、Ｐｓ
ｅｕｄｏｎ＋ｏｎａｓ （Ｐ） 。
−シダーゼ構造遺伝子１ａＣＺ）にＰｒｅｃが作動可能
な状態で連結した発現ベクターで形質転換された各種の
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種は、非誘導条件下で高レベル
のベーターガラクトシダーゼ（β−ｑａＪ）活性を示し
た。Ｅ、 ｃｏｔｔ ｉＪＭ ｌ Ｑ １１ｍ−、Ｐｓ
ｅｕｄｏｎ＋ｏｎａｓ （Ｐ） 。
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ７０１ Ｅ １及びｐ、 ｔ
ｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのそれぞれ全てを、前記した方
法に基づき、前記のβ−Ｑａ１発現ベヒクルＤＭＯＮ５
０１４で形質転換した。すべての形質転換バクテリアを
、前記したように、５０μ’Ｊ／ｄカナマイシンを含む
ＬＢ培地で３０℃で生育させた。形質転換バクテリア中
で産生されるβ−ＱａＪの基本レベルは前記したと同様
にして測定し、１分間での蛋白１Ｒｇ当りのμＭ数で示
した。驚くべきことに、組換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
種の２つともが、同種の１ａｃＺ構造遺伝子を有する形
質転換Ｅ、ＣＯＪ ｉより６高いレベルのβ−ｇａｉ産
生を示した。
ｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのそれぞれ全てを、前記した方
法に基づき、前記のβ−Ｑａ１発現ベヒクルＤＭＯＮ５
０１４で形質転換した。すべての形質転換バクテリアを
、前記したように、５０μ’Ｊ／ｄカナマイシンを含む
ＬＢ培地で３０℃で生育させた。形質転換バクテリア中
で産生されるβ−ＱａＪの基本レベルは前記したと同様
にして測定し、１分間での蛋白１Ｒｇ当りのμＭ数で示
した。驚くべきことに、組換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
種の２つともが、同種の１ａｃＺ構造遺伝子を有する形
質転換Ｅ、ＣＯＪ ｉより６高いレベルのβ−ｇａｉ産
生を示した。
表 工
非誘導条件下での − ａｌの、坦
Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＨ１０ｌＦ −ｐＨ０Ｎ５０７４
２．４Ｐ、 ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓ ｐＨ０
Ｎ５０１４ １５（７０１Ｅｌ） Ｐ、ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ｐＨ０Ｎ５０ｔ４
１０（／１ｒｃｃ １７４０９） 上記の表■に示したように、ｐｒｅｃが１８ＣＺ構造遺
伝子に作動可能な状態で連結した場合には、ｐｒｅｃは
、Ｅ、ｃｏ！＋及び各柿の形質転換Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎ
ａｓ （Ｐ、）種の両名ニおイテヘーターガラクトシ
ダーゼ（β−Ｑａｉ）の発現を引き起こりことができる
。実際に、テストした組換えρ５ｅｕｄｏｆｆｉｏｎａ
３種の２つともが、ｐｒｅｃを含む発現ベヒクルで形質
転換したＥ、ｃｏｊ！ｒ種よりも高レベルのβ−Ｑａ１
産生を示した。
２．４Ｐ、 ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓ ｐＨ０
Ｎ５０１４ １５（７０１Ｅｌ） Ｐ、ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ｐＨ０Ｎ５０ｔ４
１０（／１ｒｃｃ １７４０９） 上記の表■に示したように、ｐｒｅｃが１８ＣＺ構造遺
伝子に作動可能な状態で連結した場合には、ｐｒｅｃは
、Ｅ、ｃｏ！＋及び各柿の形質転換Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎ
ａｓ （Ｐ、）種の両名ニおイテヘーターガラクトシ
ダーゼ（β−Ｑａｉ）の発現を引き起こりことができる
。実際に、テストした組換えρ５ｅｕｄｏｆｆｉｏｎａ
３種の２つともが、ｐｒｅｃを含む発現ベヒクルで形質
転換したＥ、ｃｏｊ！ｒ種よりも高レベルのβ−Ｑａ１
産生を示した。
実施例４
本実施例は、異種グラムネガティブ生物でのｐｒｅｃの
誘導性を丞すものである。具体的には、Ｐｓａｕｄｏｍ
ｏｎａｓ 、 Ｓｅｒｒａｔｉａ、 Ｅｒｗｉｎｉａな
どの５！１種グラムネガデイプバクテリアにおいては、
ＰｒｅＣはナリジクス酸によって誘う可能であることが
示された。Ｐｒｅｃが作動可能な状態で構造遺伝子に連
結した発現ベヒクルを保持するグラムネガティブバクテ
リアにおけるＰｒｅｃの誘導性が以五の表２−４に示さ
れている。
誘導性を丞すものである。具体的には、Ｐｓａｕｄｏｍ
ｏｎａｓ 、 Ｓｅｒｒａｔｉａ、 Ｅｒｗｉｎｉａな
どの５！１種グラムネガデイプバクテリアにおいては、
ＰｒｅＣはナリジクス酸によって誘う可能であることが
示された。Ｐｒｅｃが作動可能な状態で構造遺伝子に連
結した発現ベヒクルを保持するグラムネガティブバクテ
リアにおけるＰｒｅｃの誘導性が以五の表２−４に示さ
れている。
１つのテストでは、Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０Ｉ。
Ｐ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ７０１ Ｅ １及びＰ、
ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉを発現ベヒクルｐＭＯＮ５
０１４（第６図）で形質転換した。形質転換（組換え）
バクテリアを、他にことわりのない限り、３０℃でＬＢ
培地にて生育せしめ、前記したようにしてナリジクス酸
（終ａｔα５０μｇ／Ｉｄ）で銹々した。次いで、誘ｓ
４時間後のβ−ｑａｚ活性を測定し、４時間後のβ−に
Ｊａ１活性レベルとナリジクス酸添加直前（０時間）の
β−ＣＪａｌ活性レベルとを比較して、誘導レベルを求
めた。結果を下の表２に示した。この結果から、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓなどの非Ｅ．ｃｏｌｉグラムネガティ
ブ属においてＰｒｅｃは認識され誘導されることが判る
。
ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉを発現ベヒクルｐＭＯＮ５
０１４（第６図）で形質転換した。形質転換（組換え）
バクテリアを、他にことわりのない限り、３０℃でＬＢ
培地にて生育せしめ、前記したようにしてナリジクス酸
（終ａｔα５０μｇ／Ｉｄ）で銹々した。次いで、誘ｓ
４時間後のβ−ｑａｚ活性を測定し、４時間後のβ−に
Ｊａ１活性レベルとナリジクス酸添加直前（０時間）の
β−ＣＪａｌ活性レベルとを比較して、誘導レベルを求
めた。結果を下の表２に示した。この結果から、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓなどの非Ｅ．ｃｏｌｉグラムネガティ
ブ属においてＰｒｅｃは認識され誘導されることが判る
。
表 ２
ナリジクス酸によるβ−ｇａｉ活性の誘導生 物＊
誘導時１ｆｆｌ （ｈｒ） ＳＤ Ａ
ｃｔ Ｚｍｆａ数４ ９．９
２．８Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＨ１０ｌＦ ” （３
７℃＞ ０ ３．５ −
４ １１．０ ３．２Ｐ、ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ Ｏ１６，Ｏ−（７０
１Ｅ１） ４ ５１
．０ ３．１Ｐ むｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ
Ｏ９，７−（＾丁ＣＣ１７４
０９） ４ １
４．０ １．４＊ ：全ての生物はプラス
ミドｐＭＯＮ５０１４を保持している。
誘導時１ｆｆｌ （ｈｒ） ＳＤ Ａ
ｃｔ Ｚｍｆａ数４ ９．９
２．８Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＨ１０ｌＦ ” （３
７℃＞ ０ ３．５ −
４ １１．０ ３．２Ｐ、ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ Ｏ１６，Ｏ−（７０
１Ｅ１） ４ ５１
．０ ３．１Ｐ むｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ
Ｏ９，７−（＾丁ＣＣ１７４
０９） ４ １
４．０ １．４＊ ：全ての生物はプラス
ミドｐＭＯＮ５０１４を保持している。
β−ｇａ１の発現をコントロールするＰｒｅｃの有効な
誘導（例えば調節）は、ドデシル硫酸プトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ８−ＰＡＧＥ）により
確認した。具体的には、培養細胞の約５に１ｅｔｔユニ
ツトを９％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、
Ｗ、ｅｔ ａｌ、。
誘導（例えば調節）は、ドデシル硫酸プトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ８−ＰＡＧＥ）により
確認した。具体的には、培養細胞の約５に１ｅｔｔユニ
ツトを９％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、
Ｗ、ｅｔ ａｌ、。
１９８１、 Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １１８
：１９７−２０３に記載されているようにしてゲル
を銀染色した。
：１９７−２０３に記載されているようにしてゲル
を銀染色した。
Ｅ、ｃｏｌ ｉｌＸ外の広範囲なグラムネガティブバク
テリアにおいて、Ｐｒｅｃは構造遺伝子の調節可能な発
現を引き起こすことができることを示す他の結果が、以
下の表３に示されている。
テリアにおいて、Ｐｒｅｃは構造遺伝子の調節可能な発
現を引き起こすことができることを示す他の結果が、以
下の表３に示されている。
目的とする構造遺伝子（例えば１８Ｃ’ｌ＞の発現には
Ｐｒｅｃが必要であることは、Ｐｒｅｃ配列を欠く以外
は同じである発現ベヒクルを構築することによって証明
された。具体的には、前記したｐＭＯＮ５７５７（第６
図）をテストに用いた。
Ｐｒｅｃが必要であることは、Ｐｒｅｃ配列を欠く以外
は同じである発現ベヒクルを構築することによって証明
された。具体的には、前記したｐＭＯＮ５７５７（第６
図）をテストに用いた。
このベクターはＰｒｅｃに作動可能な状態で連結してい
るＧ１０Ｌ配列を含んでいる。他のベクターとしてｐＭ
ＯＮ５７６１ （第６図）を用いた。
るＧ１０Ｌ配列を含んでいる。他のベクターとしてｐＭ
ＯＮ５７６１ （第６図）を用いた。
このベクターは、ｐｒｅｃ配列が欠失されている以外は
ｐＭＯＮ５７５７と同じである。本テストでは、更に他
の３つのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ４！ｆ＋及び更に他
の２つのグラムネガティブバクテリア種、即らＥｒｗｉ
ｎｉａ （Ｅ 、 ）とＳｅｒｒａｔｉａ （Ｓ、
）も、構造遺伝子（例えば１ａｃＺ）に作動可能な状態
で連結しているｐｒｅｃを含む発現ベヒクルで形質転換
したため、ｐｒｅｃによる調節可能な発現は広範囲のグ
ラムネガティブバクテリアに適用可能であることが証明
された。
ｐＭＯＮ５７５７と同じである。本テストでは、更に他
の３つのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ４！ｆ＋及び更に他
の２つのグラムネガティブバクテリア種、即らＥｒｗｉ
ｎｉａ （Ｅ 、 ）とＳｅｒｒａｔｉａ （Ｓ、
）も、構造遺伝子（例えば１ａｃＺ）に作動可能な状態
で連結しているｐｒｅｃを含む発現ベヒクルで形質転換
したため、ｐｒｅｃによる調節可能な発現は広範囲のグ
ラムネガティブバクテリアに適用可能であることが証明
された。
発現プラスミドｐＭＯＮ ５７５７又はｐＭＯＮ５７６
１を、前記したようにして、以下の表３に示した生物に
形質転換法又はコンジュゲーションにより導入した。そ
れぞれの生物について天然のりファンビシン耐性誘導体
生物を選択して、この適当な生物に上記のプラスミドを
導入し、ゲンタマイシン及びリファンピシン耐性に基づ
き選択した。適当なプラスミドを保持した全ての組換え
生物を生育させて、カナマイシンの代わりにゲンタマイ
シンを用いる以外は前記と同様にしてナリジクス酎で誘
導した。
１を、前記したようにして、以下の表３に示した生物に
形質転換法又はコンジュゲーションにより導入した。そ
れぞれの生物について天然のりファンビシン耐性誘導体
生物を選択して、この適当な生物に上記のプラスミドを
導入し、ゲンタマイシン及びリファンピシン耐性に基づ
き選択した。適当なプラスミドを保持した全ての組換え
生物を生育させて、カナマイシンの代わりにゲンタマイ
シンを用いる以外は前記と同様にしてナリジクス酎で誘
導した。
３ ０．２７ ０，３３
０．０８ １３
０．８７ １．１ｙ）Ｑ＋川用υ
ノ情填七角しくい０゜ 上記の表３の結果から、広範囲のグラムネガティブ生物
においてＥ．ｃｏｌｉ ｒｅＣＡプロモーターはそれ
に作動可能な状態で連結した構造遺伝子の発現を引き起
こすことができ、且つそのような発現は調節するこがで
きることが判る。
０．０８ １３
０．８７ １．１ｙ）Ｑ＋川用υ
ノ情填七角しくい０゜ 上記の表３の結果から、広範囲のグラムネガティブ生物
においてＥ．ｃｏｌｉ ｒｅＣＡプロモーターはそれ
に作動可能な状態で連結した構造遺伝子の発現を引き起
こすことができ、且つそのような発現は調節するこがで
きることが判る。
Ｐｒｅｃ配列が欠失した培養生物の場合には、１ａＣ−
７遺伝子発現は全く誘導されなかったかあるいは低レベ
ルでしか誘導されなかった。
７遺伝子発現は全く誘導されなかったかあるいは低レベ
ルでしか誘導されなかった。
ブタ成長ホルモン（Ｐ Ｇ Ｈ）をコードする構造遺伝
子がＰｒｅｃに作動可能な状態で連結されている場合に
は、各棒のグラムネガティブバクテリアにおいて該構造
遺伝子を調節発現覆ることができることを証明する実験
結果を以上の表４に示ず。
子がＰｒｅｃに作動可能な状態で連結されている場合に
は、各棒のグラムネガティブバクテリアにおいて該構造
遺伝子を調節発現覆ることができることを証明する実験
結果を以上の表４に示ず。
Ｇ１０Ｌ配列とＰＧ）ｌ構造遺伝子に作動可能な状態で
連結しているｐｒｅｃを含む前記した発現ベクターｐＭ
ＯＮ５７５６（第６図）を、以下の表４に示した生物に
導入し、得られる組換え」−物を３０℃でアンピシリン
添加ＬＢ培地で生育せしめた。次いで、培養生物を前記
したと同様にして５０μｇ／Ｉｄのナリジクス酸で誘導
し、誘導直前（０時間）及び誘導３時間後のＰＧＨ産生
を１５％（ｗ／ｖ）ＳＯ８−ＰＡＧＥゲルを用いたウェ
スタンブロッティングによりアッセイし、その後、Ｌ
Ｋ Ｂ Ｕｌｔｒｏｓｃａｎ Ｘ Ｌレーザーデンシ
トメーター （Ｌ Ｋ Ｂ 、 Ｕｐｐｓａｌａ 、
Ｓｗｅｄｅｎ）を製造業者の指針に従って用いて全蛋白
量をスキャンした。
連結しているｐｒｅｃを含む前記した発現ベクターｐＭ
ＯＮ５７５６（第６図）を、以下の表４に示した生物に
導入し、得られる組換え」−物を３０℃でアンピシリン
添加ＬＢ培地で生育せしめた。次いで、培養生物を前記
したと同様にして５０μｇ／Ｉｄのナリジクス酸で誘導
し、誘導直前（０時間）及び誘導３時間後のＰＧＨ産生
を１５％（ｗ／ｖ）ＳＯ８−ＰＡＧＥゲルを用いたウェ
スタンブロッティングによりアッセイし、その後、Ｌ
Ｋ Ｂ Ｕｌｔｒｏｓｃａｎ Ｘ Ｌレーザーデンシ
トメーター （Ｌ Ｋ Ｂ 、 Ｕｐｐｓａｌａ 、
Ｓｗｅｄｅｎ）を製造業者の指針に従って用いて全蛋白
量をスキャンした。
表 ４
ナリジクス酸によるＰＧＨの発現誘導
生 物“ 誘導時間（ｈｒｓ） 誘導レベル１＊Ｅ
、ｃｏｌｉ ＪＨ１０ｌＦ −３ Ｐ、ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ３Ｐ、Ｎｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｓ ３Ｐ、ｐｕｔｉｄａ
３Ｓ、ｎ＋ａｒｃｅｓｃｅｎｓ
３＊：全ての生物は発現ベヒクルｐＭＯＮ
５７５６で形質転換した。
、ｃｏｌｉ ＪＨ１０ｌＦ −３ Ｐ、ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ３Ｐ、Ｎｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｓ ３Ｐ、ｐｕｔｉｄａ
３Ｓ、ｎ＋ａｒｃｅｓｃｅｎｓ
３＊：全ての生物は発現ベヒクルｐＭＯＮ
５７５６で形質転換した。
＊本：ウェスタンプロッティング及びＬＫＢ旧ｔｒｏｓ
ｃａｎ Ｘ Ｌレーザーデンシトメーター（Ｌ Ｋ Ｂ
、 ＬｌｐＤｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用イテ１）
Ｇ Ｈ産生レベルを確認した。
ｃａｎ Ｘ Ｌレーザーデンシトメーター（Ｌ Ｋ Ｂ
、 ＬｌｐＤｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用イテ１）
Ｇ Ｈ産生レベルを確認した。
上記の表４の結果から明らかなように、３つの異なるＰ
Ｓ１３ｔｌｄ０１０ｎａＳ種及び更に他の１つのグラム
ネガティブバクテリア種の全てがＰＧＨの誘導可能な発
現を示した。
Ｓ１３ｔｌｄ０１０ｎａＳ種及び更に他の１つのグラム
ネガティブバクテリア種の全てがＰＧＨの誘導可能な発
現を示した。
実施例５
本実施例は、異種グラムネガティブバクテリアでのｐｒ
ｅｃの誘導性を証明し、史には、異種バクテリアでの所
望の蛋白産生が、ｐｒｅｃ及び所望の構造遺伝子に作動
可能な状態で連結したＧ１０Ｌ配列によって促進される
ことを証明するものである。
ｅｃの誘導性を証明し、史には、異種バクテリアでの所
望の蛋白産生が、ｐｒｅｃ及び所望の構造遺伝子に作動
可能な状態で連結したＧ１０Ｌ配列によって促進される
ことを証明するものである。
Ｅ、ｃｏＪｉ ＪＭ１０ｌＦ−を表５Ｂに示した発現
ベクターで形質転換し、１０μｇ／Ｉｄゲンタマイシン
を用いる以外は前記と同様にして形質転換体を選択した
。Ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株７０１Ｅ１及びＰ、
ｆ Ｉｕｏｒｃｓｃｅｎｓ株１１４１Ｆ１については
５０μｇ／−ゲンタマイシン及びリファンピシンを用イ
テ、ｐ、 ｔｅｓｔＯ３ｔｏｒｏｎｉについては２５０
μｇ／ｄゲンタマイシン及びリファンピシンを用いて、
所望の発現ベクターを表５Ａ及び５Ｂのρ５ｅｕｄｏｌ
ｌ１０ｎａｓ種にコンシュゲージコン（例えば形質導入
）した、得られる全ての形質転換生物を生育せしめて前
記したと同様にしてナリジクス酸で誘導した。プラスミ
ドｐＭＯＮ５７６０及びｐＭＯＮ５７６１ （第６図）
は、ｐｒｅｃを特異的に除去するために特定数のヌクレ
オチドを除くことにより構築した。
ベクターで形質転換し、１０μｇ／Ｉｄゲンタマイシン
を用いる以外は前記と同様にして形質転換体を選択した
。Ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株７０１Ｅ１及びＰ、
ｆ Ｉｕｏｒｃｓｃｅｎｓ株１１４１Ｆ１については
５０μｇ／−ゲンタマイシン及びリファンピシンを用イ
テ、ｐ、 ｔｅｓｔＯ３ｔｏｒｏｎｉについては２５０
μｇ／ｄゲンタマイシン及びリファンピシンを用いて、
所望の発現ベクターを表５Ａ及び５Ｂのρ５ｅｕｄｏｌ
ｌ１０ｎａｓ種にコンシュゲージコン（例えば形質導入
）した、得られる全ての形質転換生物を生育せしめて前
記したと同様にしてナリジクス酸で誘導した。プラスミ
ドｐＭＯＮ５７６０及びｐＭＯＮ５７６１ （第６図）
は、ｐｒｅｃを特異的に除去するために特定数のヌクレ
オチドを除くことにより構築した。
表 ５Ａ
Ｇ１０Ｌ 列によるβ−８１産生の ｐ、 ｆ１０
ｕｒｅｓｃｅｎｓ Ｐ、 ｒ＋ｏｕｒｅｓ
ｃｅｎｓ７０１Ｅ１ １１４１Ｆ
１プラスミド 誘導時間 β−ｇａｌ” 誘導１ 促
進１ β−ＩＪａｌ 誘導 促進（ＰｒｅｃＧ１
０Ｌ） ４ ７６．０ ３．６ １４
．３ ３３．０ ３．０ ２Ｇ、６ｐＭＯＮ５
７５８ ０ ２７．０ −
１８．ｏ −−ｆＰｒｅｃ Ｇ１０Ｌ）
４ ８７．０ ３．２ １６，４
３７．０ ２．１ ２３．１９ＨＯＮ５７５９十
０ ０．３＋ −０，２９−−（Ｐｒｅ
ｃｃｏｎｓｌ ４ ５．３ １７．０
− １．６ ５．７−ｐＨＯＮ５７６０
０ １．６ − ２
．８ − −（Ｇ１０ＬＩ ４ １．６
１０ − １．５ ０．５−◆
：同じ方向のｊａＣＺ遺伝子を有するプラスミドを示す
。
ｕｒｅｓｃｅｎｓ Ｐ、 ｒ＋ｏｕｒｅｓ
ｃｅｎｓ７０１Ｅ１ １１４１Ｆ
１プラスミド 誘導時間 β−ｇａｌ” 誘導１ 促
進１ β−ＩＪａｌ 誘導 促進（ＰｒｅｃＧ１
０Ｌ） ４ ７６．０ ３．６ １４
．３ ３３．０ ３．０ ２Ｇ、６ｐＭＯＮ５
７５８ ０ ２７．０ −
１８．ｏ −−ｆＰｒｅｃ Ｇ１０Ｌ）
４ ８７．０ ３．２ １６，４
３７．０ ２．１ ２３．１９ＨＯＮ５７５９十
０ ０．３＋ −０，２９−−（Ｐｒｅ
ｃｃｏｎｓｌ ４ ５．３ １７．０
− １．６ ５．７−ｐＨＯＮ５７６０
０ １．６ − ２
．８ − −（Ｇ１０ＬＩ ４ １．６
１０ − １．５ ０．５−◆
：同じ方向のｊａＣＺ遺伝子を有するプラスミドを示す
。
寧：β−ｑａＩ比活性はμＭ／ｍ ｉ ｎ／霞９蛋白で
示した。
示した。
傘１１：ナリジクス！！添加４時間後におけるβ−Ｑａ
ｉ比活性の誘導倍数を示す。
ｉ比活性の誘導倍数を示す。
傘＄傘：Ｇ１０Ｌ配列（Ｇ１０Ｌ）を含むプラスミドを
、コンセンサス３． Ｄ、 （ｃａｎｓ）配列を含むプ
ラスミドと比較した時のβ−Ｑａｊ蛋白活性の促進倍数
を示す。
、コンセンサス３． Ｄ、 （ｃａｎｓ）配列を含むプ
ラスミドと比較した時のβ−Ｑａｊ蛋白活性の促進倍数
を示す。
表 ５Ｂ
プラスミド 誘導時間 β−ｇａｌ” 誘導“８ 促
進９＊１ β−ｇａｌ 誘導 促進（ｈｒ） ◆ ：同じ方向のＪａｃＺ遺伝子を有するプラスミドを
示す。
進９＊１ β−ｇａｌ 誘導 促進（ｈｒ） ◆ ：同じ方向のＪａｃＺ遺伝子を有するプラスミドを
示す。
＄：β−Ｑａｉ比活性はμＨ／ｓｉｎ／−〇蛋白で示し
た。
た。
＊傘：ナリジクス酸添加４時間後におけるβ−ＣＪａｌ
比活性の誘導倍数を示す。
比活性の誘導倍数を示す。
−−−： Ｇ １０ Ｌ配列（Ｇ１０Ｌ）を含むプラス
ミドを、コンセンサスＳ、 Ｄ、 （ＣＯｎＳ）配列を
含むプラスミドと比較した時のβ−Ｏａ！蛋白活性の促
進倍数を示す。
ミドを、コンセンサスＳ、 Ｄ、 （ＣＯｎＳ）配列を
含むプラスミドと比較した時のβ−Ｏａ！蛋白活性の促
進倍数を示す。
表５Ａ及び５Ｂに示した酸素分析により観察されるβ−
Ｇａｊ！産生誘導は、Ｅ、ｃｏｔ ｉ及びＰ、Ｎｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓ ７０１ Ｅ １について、前記したと同
様にして９％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白分
析をした所この蛋白分析によっても確認された。
Ｇａｊ！産生誘導は、Ｅ、ｃｏｔ ｉ及びＰ、Ｎｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓ ７０１ Ｅ １について、前記したと同
様にして９％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白分
析をした所この蛋白分析によっても確認された。
表５Ａ及び５Ｂから明らかなように、発現ベヒクル中に
含まれる１ａＣＺ構造遺伝子のナリジクス酎ににる誘導
発現は、Ｐｒｅｃのみに基づくものである。ＰｒｅＣが
除去された場合には、誘導は全＜ｉ察されず、ＪａＣＺ
遺伝子の発現は低下した。Ｇ１０Ｌｉｌｌｌ訳エンハン
サ−配列を含むがｐｒｃｃを欠いたｐＭＯＮ５７６０又
はｐＭＯＮ５７６１を保持するバクテリアでは、発現は
全く誘導されず、また発現レベルは低くかった。
含まれる１ａＣＺ構造遺伝子のナリジクス酎ににる誘導
発現は、Ｐｒｅｃのみに基づくものである。ＰｒｅＣが
除去された場合には、誘導は全＜ｉ察されず、ＪａＣＺ
遺伝子の発現は低下した。Ｇ１０Ｌｉｌｌｌ訳エンハン
サ−配列を含むがｐｒｃｃを欠いたｐＭＯＮ５７６０又
はｐＭＯＮ５７６１を保持するバクテリアでは、発現は
全く誘導されず、また発現レベルは低くかった。
表５Ａ及び５Ｂに示したように、Ｇ１０Ｌリポソーム結
合部位がｐｒｅｃに作動可能な状態で連結している（ｐ
ＭＯＮ５７５７及びｐＭＯＮ ５７５８）場合、あるい
はＥ、ｃｏｌ ｒコンセンリスリポソーム結合部位がＰ
ｒｅｃに作動可能な状態で連結している（ＤＭＯＮ５７
５９）場合には、いずれも、ナリジクス酸によるｐｒｅ
ｃ誘導が観察された。更には、Ｇ１０Ｌ配列を含むベク
ターｐＭＯＮ ５７５７又はｐＭＯＮ５７５８で形質転
換された全ての生物は、Ｅ．ｃｏｌｉコンセンサス（ｃ
ｏｎｓ ）リポソーム結合部位の場合に比べて１４−２
５倍高いβ−ｇａ１ｇ生レベルを水レベル以上に述べた
例は本発明の好ましい態様を説明するためのものであり
、本発明の絶間を限定するものではない。好ましい態様
を挙げて本発明を説明したが、本明細書の記載から各棹
の改良が当業者には明らかであろう。
合部位がｐｒｅｃに作動可能な状態で連結している（ｐ
ＭＯＮ５７５７及びｐＭＯＮ ５７５８）場合、あるい
はＥ、ｃｏｌ ｒコンセンリスリポソーム結合部位がＰ
ｒｅｃに作動可能な状態で連結している（ＤＭＯＮ５７
５９）場合には、いずれも、ナリジクス酸によるｐｒｅ
ｃ誘導が観察された。更には、Ｇ１０Ｌ配列を含むベク
ターｐＭＯＮ ５７５７又はｐＭＯＮ５７５８で形質転
換された全ての生物は、Ｅ．ｃｏｌｉコンセンサス（ｃ
ｏｎｓ ）リポソーム結合部位の場合に比べて１４−２
５倍高いβ−ｇａ１ｇ生レベルを水レベル以上に述べた
例は本発明の好ましい態様を説明するためのものであり
、本発明の絶間を限定するものではない。好ましい態様
を挙げて本発明を説明したが、本明細書の記載から各棹
の改良が当業者には明らかであろう。
第１図は、合成２本１）Ｇ１０１−配列のＤＮＡ配列を
示す。 第２図は、第１図に示した合成Ｇ１０Ｌ配列の構成を示
す。 第３図は、プラスミドｐＭＯＮ５５１５の構築を示す。 第４図は、プラスミドｐＭＯＮ５５４２の構築を示す。 第５図は、プラスミドｐＭＯＮ５７５７及びｐＭＯＮ５
７５８の構築を示す。 第６図は、プラスミドＤＭＯＮ５０１４゜ｐＭＯＮ５７
５６．ｐＭＯＮ５７５９．ｐＭＯＮ５７６０及びｐＭＯ
Ｎ５７６１の構成を示ず。
示す。 第２図は、第１図に示した合成Ｇ１０Ｌ配列の構成を示
す。 第３図は、プラスミドｐＭＯＮ５５１５の構築を示す。 第４図は、プラスミドｐＭＯＮ５５４２の構築を示す。 第５図は、プラスミドｐＭＯＮ５７５７及びｐＭＯＮ５
７５８の構築を示す。 第６図は、プラスミドＤＭＯＮ５０１４゜ｐＭＯＮ５７
５６．ｐＭＯＮ５７５９．ｐＭＯＮ５７６０及びｐＭＯ
Ｎ５７６１の構成を示ず。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）非Ｅ．ｃｏｌｉグラムネガテープバクテリアにお
いて所望のポリペプチドをコードする構造遺伝子の調節
発現を引き起こす方法であつて、該構造遺伝子に作動可
能な状態で連結した Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーターを誘導して、該ポ
リペプチドを得ることを含む上記方法。 （２）構造遺伝子が真核生物蛋白をコードするＤＮＡ配
列を含む請求項１記載の方法。 （３）真核生物蛋白がブタ成長ホルモンである請求項２
記載の方法。 （４）バクテリアＤＮＡにダメージを与える又はバクテ
リアＤＮＡを修飾する条件によつて Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーターを誘導する請求項
１記載の方法。 （５）該条件が、ＤＮＡギラーゼ（ｇｙｒａｓｅ）を抑
制する物質の添加である請求項４記載の方法。 （６）該物質がナリジクス酸である請求項５記載の方法
。 （７）非Ｅ．ｃｏｌｉグラムネガテープバクテリアが、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ及びＳｅｒｒ
ａｔｉａから成る群より選ばれるものである請求項１記
載の方法。（８）非Ｅ．ｃｏｌｉグラムネガティブバク
テリアが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅ
ｒｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ及びＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂ
ｉｃｏｌａから成る群より選ばれるものである請求項１
記載の方法。 （９）プラスミド中にて、Ｅ．ｃｏｌｉｒｅｃＡプロモ
ーターが構造遺伝子に作動可能な状態で連結している請
求項１記載の方法。 （１０）プラスミドが広範囲宿主発現ベクターである請
求項９記載の方法。 （１１）広範囲宿主発現ベクターがＩｎｃＱレプリコー
ンを含んでいる請求項１０記載の方法。 （１２）該ベクターが、ＰＭＯＮ５７５６、ｐＭＯＮ５
７５７、ｐＭＯＮ５７５９及び ｐＭＯＮ５７５８から成る群より選ばれる請求項１１記
載の方法。 （１３）Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーターが、作動
可能な状態で更にＧ１０Ｌ配列に連結している請求項１
記載の方法。 （１４）Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ及びＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓから成る群より選ばれるバクテリアに
おいて所望のポリペプチドをコードする構造遺伝子の誘
導発現を引き起こす方法であつて、該構造遺伝子に作動
可能な状態で連結したＥ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモー
ターを誘導して、該ポリペプチドを得ることを含む上記
方法。 （１５）Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーターが、作動
可能な状態で更にＧ１０Ｌ配列に連結している請求項１
４記載の方法。 （１６）プラスミド中にて、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーターが構造遺伝子及びＧ１０Ｌ配列に
作動可能な状態で連結している請求項１５記載の方法。 （１７）Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーター及び広範
囲宿主レプリコーンを含む合成ＤＮＡ分子。 （１８）Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーターに作動可
能な状態で更に構造遺伝子が連結している請求項１７記
載の分子。 （１９）更にＧ１０Ｌ配列を含む請求項１７又は１８記
載の分子。 （２０）構造遺伝子が真核生物蛋白をコードするＤＮＡ
配列を含む請求項１８記載の分子。 （２１）真核生物蛋白がブタ成長ホルモンである請求項
２０記載の分子。 （２２）更に選択マーカーを含む請求項１７記載の分子
。 （２３）非Ｅ．ｃｏｌｉグラムネガティブバクテリアで
のブタ成長ホルモンの製造方法であつて、Ｇ１０Ｌ敗列
及び該成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列に作動可能
な状態で連結したＥ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーター
を誘導して、該成長ホルモンを得ることを含む上記方法
。 （２４）該成長ホルモンが、ウシ成長ホルモン又はブタ
成長ホルモンである請求項２３記載の方法。 （２５）非Ｅ．ｃｏｌｉグラムネガティブバクテリアが
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ及びＥｒｗ
ｉｎｉａから成る群より選ばれるものである請求項２３
記載の方法。 （２６）請求項１８記載の合成ＤＮＡ分子で形質転換し
た組換え非Ｅ．ｃｏｌｉグラムネガテープバクテリア。 （２７）Ｇ１０Ｌ配列及び構造遺伝子に作動可能な状態
で連結したＥ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーター及び広
範囲宿主レプリコーンを含むＤＮＡ分子で形質転換され
た組換え非Ｅ．ｃｏｌｉグラムネガティブバクテリア。 （２８）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ及
びＥｒｗｉｎｉａから成る群より選ばれる請求項２７記
載のバクテリア。 （２９）非Ｅ．ｃｏｌｉグラムネガテープバクテリアで
のポリペプチドの製造方法であつて、 Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーターに作動可能な状態
で連結したポリペプチドをコードする構造遺伝子の発現
を引き起こして、ポリペプチドを得ることを含む上記方
法。 （３０）構造遺伝子が作動可能な状態で更にＧ１０Ｌ配
列に連結している請求項２９記載の方法。 （３１）ポリペプチドが真核生物蛋白である請求項２９
又は３０記載の方法。 （３２）広範囲宿主発現ベクタ線中にて、構造遺伝子に
作動可能な状態でＥ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモーター
が連結している請求項２９記載の方法。 （３３）そのゲノムにＥ．Ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモー
ターが含まれている組換え非Ｅ．Ｃｏｌｉグラムネガテ
ープバクテリア。 （３４）ゲノムが更に、Ｅ．Ｃｏｌｉ ｒｅｃＡプロモ
ーターに作動可能な状態で連結しているＧ１０Ｌ配列を
含む請求項３３記載の組換えバクテリア。 （３５）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ及び
Ｓｅｒｒａｔｉａから成る群より選ばれる請求項３３又
は３４記載のバクテリア。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17508288A | 1988-03-30 | 1988-03-30 | |
| US175082 | 1988-03-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0213382A true JPH0213382A (ja) | 1990-01-17 |
Family
ID=22638805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7794589A Pending JPH0213382A (ja) | 1988-03-30 | 1989-03-29 | グラムネガテイブ微生物での構造遺伝子の調節発現法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0335854A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0213382A (ja) |
| AU (1) | AU3176489A (ja) |
| ES (1) | ES2013696A4 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0690924B1 (en) * | 1993-03-27 | 2000-05-31 | The University Of Dundee, University Court | Anti-microbial agents and screening method therefor |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5965099A (ja) * | 1982-10-05 | 1984-04-13 | Takeda Chem Ind Ltd | 発現用プロモ−タ−およびその用途 |
| JPS59169494A (ja) * | 1983-03-17 | 1984-09-25 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規組み換えｄｎａおよびその用途 |
| JP2611206B2 (ja) * | 1985-11-15 | 1997-05-21 | 武田薬品工業株式会社 | 遺伝子およびその利用方法 |
| AU597951B2 (en) * | 1986-03-27 | 1990-06-14 | Monsanto Company | Enhanced protein production in bacteria by employing a novel ribosome binding site |
-
1989
- 1989-03-29 JP JP7794589A patent/JPH0213382A/ja active Pending
- 1989-03-29 EP EP89870044A patent/EP0335854A3/en not_active Withdrawn
- 1989-03-29 ES ES89870044T patent/ES2013696A4/es active Pending
- 1989-03-29 AU AU31764/89A patent/AU3176489A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2013696A4 (es) | 1990-06-01 |
| AU3176489A (en) | 1989-10-05 |
| EP0335854A2 (en) | 1989-10-04 |
| EP0335854A3 (en) | 1990-08-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR960011919B1 (ko) | IgA 단백질 분해효소를 이용한 재조합 단백질의 효소적 절단방법 | |
| Kaster et al. | Analysis of a bacterial hygromycin B resistance gene by transcriptional and translational fusions and by DNA sequencing | |
| JP2686090B2 (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| JP3503705B2 (ja) | 細菌におけるポリペプチド産生の調節方法 | |
| JP4243104B2 (ja) | 重要なタンパク質の細菌培養上清中への分泌のための融合タンパク質 | |
| US5470719A (en) | Modified OmpA signal sequence for enhanced secretion of polypeptides | |
| JPH05501799A (ja) | 融合タンパク質、その調製及び用途 | |
| WO1996004373A2 (en) | Recombinant production of biologically active peptides and proteins | |
| JPH0376580A (ja) | 大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法 | |
| JPS62181789A (ja) | バチルスの制御領域のクロ−ニング及び解析のためのプラスミド | |
| CA2291883C (en) | Trigger factor expression plasmids | |
| US5459051A (en) | Methods and vectors for over-expression of ubiquitin fusion proteins in host cells | |
| JPS5869897A (ja) | Ｄｎａ遺伝子 | |
| JP4117033B2 (ja) | 化学物質の生合成による製造方法 | |
| JPS5951793A (ja) | 新規クロ−ニングビヒクル | |
| JP2612264B2 (ja) | Ｄｎａ配列体 | |
| JPH0213382A (ja) | グラムネガテイブ微生物での構造遺伝子の調節発現法 | |
| EP0342658B1 (en) | Biosynthetic process for the preparation of chemical compounds | |
| JPH0372888A (ja) | 抗酸菌分泌発現ベクター及び抗酸菌 | |
| JPS6047685A (ja) | 改良された抗生物質耐性遺伝子 | |
| EP1555320B1 (en) | Expression system derived from the lipase regulation cascade of Pseudomonas alcaligenes | |
| JPS6091984A (ja) | 新規プラスミドベクタ− | |
| JP2003079379A (ja) | 成長ホルモンの高発現用ｄｎａおよびその使用 | |
| JP3505743B2 (ja) | 変異型ａｏｘ２プロモーター、それを担持するベクター、形質転換体および異種蛋白質の製造方法 | |
| JP2537764B2 (ja) | 高発現ベクタ―、バチルス属細菌、およびペプチド又は蛋白質の製造方法 |