JPS5869897A - Ｄｎａ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は大腸菌のアルカリ性ホスファターゼ（以下＊　
ＡＰａｇｅ　という）の生成分路に関与する遺伝子部分
の単離とその利用に関する。さらに詳しくは、本発明は
、大腸菌のＡＰａ−・遺伝子（以下ｐｈＯＡという）に
由来し、蛋白質の生成分泌に関与し、少なくともプロモ
ーター配列、シャイン・ダルガーノ配列（８Ｄ配列）お
よびシグナル配列ならびにこれらの組合せから選ばれる
配列を有するＤＮＡ遺伝子の単一とその利用に関する。

組換えＤＮＡ技法を用い、大腸菌内に所望の遺伝子産物
を大量に蓄積せしめる九めに、細扇内の遺伝子数（ｇ＠
ｎ・ｄｏｓａｇ・）の増大ならびに轟諌遺伝子の転写、
翻訳効率の増大の２面での改嵐がなされてき友、遺伝子
数の増大は、；ビー数の多いＣＯＩ　Ｈｉ系のプラスミ
ド、Ｒ因子由来のツビー数変異プラス電ド、ファージ複
製糸を含むプラスオドなどをベクターとして利用するこ
とによシ行われ丸、異種遺伝子の発現のためには、高い
効率の転写を行う細菌のプロモーターとして、ラクトー
ス・オペロン、トリプトファン・オペロン、λファージ
などのプロモーターが選出畜れ、さらに轟鋏遺伝子の―
訳の効率を増大させるようにプロモーター領域と構造遺
伝子を結合する方法も検討された０例えば、トリプトフ
ァン遺伝子をマルチ・コピー・プラスオドにタ四−ン化
して合成を誘導し九場合、ｆ＃ｉ生蛋白のｓｓ＊％細胞
蛋白の３０９１がｔｒｐ　ＩＣＤ遺伝子童物産物められ
ると報告され、この系を利用すれば相轟量の目的とする
蛋白が得られると思われる。

しかし、これらの工夫にかかわらず、期待されるほど大
量の蛋白質が生産された例はあまり多くない、これは、
おそらく多くの場合、これらの蛋白質が宿主細菌にとっ
て有害であつ九り〔例えば、プドン（ｃｏａｏｎ　）利
用率の違いから少量しかないｔＲＮ人種を枯渇させ九如
、産物の活性が細菌の代謝系を攪ｔ−ａせたに〕、産物
が異常蛋白として速やかに分解されてしまう丸め、蛋白
質の生産量が制限されてしまう丸めであると考えられる
。

このような諸問題を解決するための１つの方向として、
轟該遺伝子童瞼を細胞質の外側、すなわちペリプラズム
ないし培地中に分泌生産させることが有効であろう。代
謝系から離れ九細胞質の外側に置物を出してしまえば、
細胞の代謝に有害な産物も生産が可能であるし、ｉ九分
解から保−される可能性も生ずる。過剰生産されると（
それ自身あるいはその反応産物を介して）生産が抑制さ
れるような遺伝子産物の場合もフィードバック系から解
放して過剰生産させうる。さらに醗酵生産の工程上から
４、蛋白質の単離精製は細胞内からに比べて蛋白成分の
少ない細胞質外からの方が、はるかに容品かつ効率が嵐
いはずである。宿主に枯草菌のようなダラム陽性曹を用
いれば、細胞膜の外に出た蛋白はその會ま培地中から回
収されるであろうし、大腸菌のようなグラム陰性璽を用
い九場合も、ペリプラズムに蓄積し膜蛋白は浸透圧的破
壊（ｏｓｍｏｔｉｏ　５ｈｏｃｋ　）法で選択的に抽出
”ｔｔｋ、外膜に欠損のある変異株（ｐ＠ｒｌｐｌａｓ
ｍ　−ｌｅａｋｙｍｕｓｔａｎｔ−）なら培地中に漏出
させること４可能である。

犠在、分泌蛋白が細胞から分泌される機構についテハプ
四−ベル（ＢＩＯＭＩ　）のシグナル仮説〔ブローベル
（Ｂｘｏｂ・１．Ｇ）＆ドツパーシ工タイン（Ｂ、　Ｄ
ｏｂｂｅｒｇｔｅｉｎ　）、ジャーナル・オブ・セル・
バイオロジー（、ｙ、ｃ・１１．　Ｂｔｏｘ　）、　ｓ
　ｙ畠３ｉ（１・７５）〕により次のようＫｌ！明され
ている。

■分泌蛋白は生合成過程では、疎水性アミノ酸に富む１
５−３０残基のペプチド（シグナル・ペプチド）をＮ末
端にもつ前駆体として合成され始める。

■　シグナル・ペプチドは、細胞質量−と同じ機構で開
始され膜蛋白合成装置を膜上のレセプターとの相互作用
で小胞体膜に結合させるとともに１膜内のポリペプチド
透過孔の形成を誘起して、分泌と共役した蛋白合成を遂
行させる。

■シグナル・ペプチドは、ポリペプチド金成中に膜上の
グロテアーゼによ多切断除去される。

本仮説は、動物細胞の分泌蛋白の合成と分泌の機構の説
明として提出され九ものであり九が、その後多くの動物
、微生物の分泌蛋白、膜蛋白のメツセンジャーＲＮＡ＄
するいはＤＮ人の構造が明らかになゐにつれ、そのほと
んどが成熟蛋白では切断除去されるペプチド（シグナル
・ペプチド）をＮ末端に有することが判シ次第に定説化
してきた。さらに二大腸薗の変異株の解析から、分泌効
率の低下し九変異蛋白ではシグナル・ペプチドの疎水性
アズノ酸が酸性ああいは塩基性アミノ酸に変化していた
ことが明らかにされ、この部分が分泌の少なくとも初発
の過程に重要な役割を果していることが証明され九。

そζで本発明省らは、所望のべ゛グチドを分泌し大量に
生成せしめる系の確立をめざし、大腸菌のペリプラズム
１１１ｍ（エル・ヘツペル゛ストツクチャー・アンド・
ファンクシ曹ン・オプ・バイオロジカル・メンブレンズ
　２２３頁１９７１ｊｐ）の一つである人ＰａＳ・を選
び、研究を行った０本酵素は分子量４亀０００Ｚｎを４
原子會む霊量体として存在し、その生成は培地中の無機
リン酸で調節され、リン酸欠乏時に誘導的に新生蛋白の
６憾という高い効率で生合成される。従って、本酵素の
生合成分泌に関与する遺伝子部位をり四−ン化して、所
望のペプチドを；−ドする遺伝子と結合すれば、その所
望のポリペプチドを培地中のリン酸濃度の＠何丁にペリ
プラズムに高効率で分泌主意する仁とがで自るはずであ
る。本発明者らはＡＰａ−・のに末端部とプロモーター
を含むＮｍ＊部位を含むＤＮＡ断片を、グーモーターク
ローン用ベクターであるｐＭｃ１４０ｍ（エム・キャサ
ダパン（Ｍ、　Ｃａ５ａｄ亀’ｂａｎ　）他、ジャーナ
ル自オブ・バタテリオロジ−１４３４）　　９７１〜９
−０頁１１１（１年〕にクローン化し、その塩基配列を
決定した。これによりｐｈｏ　Ａプロモーターの下流に
所望のペプチドをブードする遺伝子を結合し、その強力
な発現を図ることを可能とし友。

またＡＰａｓ・のシグナル配列の下流に、所望の遺伝子
を発現されるように種々の方法で読み取り枠（ｒ＠ａｄ
ｉｎｇ　ｆｒａｍ・）を調節して結合することが可能と
なり、ζζに所望のポリペプチドを分泌する手段を提供
する本発明を完成するに至り九。

本発明のＤＮＡ遺伝子の単離およびその塩基配列の決定
は次のとおり行なっ九。

（１）　　ｐｈｏ　Ａ形質導入７アージの１Ｉｌｌｌ製
７７−ジλの付着部位を欠失した大腸薗薗株九とえば大
腸菌に１２株ＫＳ　３０２（毫しキュ２−・アンド・ヂ
エネヲル・ヂエネテイタス（Ｍｏｂ、　（）ｅｎ、　Ｇ
＠ｎ＠ｔ、　）　１８７４．１０１頁、ｌ・７ｓ年〕に
７アージ九とえばλｂ５１５ｂ５１１１ｘｉ＊６ｏＩ８
！１７Ｂ７ｎｉｎ！Ｉファージ〔同上文献−１［）　を
感鍮させ墨合涛薗液法〔同上文献参照〕にょ都ｐｈｏＡ
欠失株大腸曹ｙＫｓ１４　（Ｆ−、ｚｈｔ　ｘ＊ｕｌａ
ｏ　Ｙ　ｇａｌｌ　ｒｐｍ　Ｌ　ｐｈＯＡ８　ｒＫ−ｍ
Ｋ−）をｐｈｏ　Ａ”、４％とするｐｈｏ　Ａ　形質導
入ファージλｄｐｈｏ−１を得る。

（２）　　ｐｈＯＡおよびその発現調節部位を含むＤＮ
Ａ断片のｐＢＲ３２２へのり四−ン化 λｄＬｐｈｏ’−ＩＤＮＡとプ１ｑドｐＢＲ３２２をそ
れぞれ同じ一眼酵素たとえばＨ１ｎｌ璽とＢａｍＨＩで
二重消化後混合し、断片をＴ４リガーゼで連結してｐｈ
ＯＡをクローン化したプラスきドｐＫ１−ｘを得る。

（３）　　ｐｈｏ＊プロモーター領域のタローニングｐ
ＫＩ−２とぺＩｆｉ−ＤＮＡ九とえばｐＭＣｌ　４０　
ｍ　（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｕｌ、　１４３．９７１−
９８１（１９８０）参照〕を混合して１１１１隈酵素た
とえば１ｏｏＲ１で消化し、Ｔ纏りガーゼで連結し、ｐ
ｈＯＡを含むグラスオドｐＹＫ１７１を得る。

ｐＹＫ１７ｊを制限簿素九とえばＨｌｎｆ　ｌで部分分
解し九のち、−眼酵素九とえばＳｍｍ　ｌで処場するこ
とにょシ、）ｈＯＡを會みｐＹＫ１７１よ）′Ｍ１か（
なつ九プラスミドｐＹＫ１９０を得る。

（４）　　ＰＹＫ１９０Ｖｒ１１１１１限酵嵩たとえば
ＢｉｎｄｌとＢａｍＨＩで二重消化し、ｐｈｏＡプロモ
ーターを含む１ｍ２Ｇ塩基対（ｂｐ）の大急さの断片を
単層し、マキサムとギルバートの方法〔マキサム（Ａ、
　Ｍ、　ＭＩＬＸＩＬ！１１　）とギルパー）　（Ｗ、
　Ｇ１１ｂｅｒｔ　）、メソッド・イン・エンザイモロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　ＷｎＭ７ｍＯ１０’１７　
）　、アカデミツク・プレス（Ａｏａｄ＠ｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ　）　ＬＸＶ＠、４９１１〜Ｂ＠０頁（１９７９
年）〕に従って、その塩基配列を決定する。

本発明による塩基配列の決定、制限地図の作成により、
多くの制限部位が所望の遺伝子の結合部位として利用可
能となった。即ち■第２図の配列中に示されているごと
く、ｐｈｏＡのシグナル配列の最後の７２ノ酸であるア
２二ンと、ＡＰａｓ＠イソ酵素１・０−１のサブユニッ
トのＮ末端であるアルギニンに相当するトリプレット（
ｔｒｉｐｌｅｔ　）の間にあるＨｐａ１部位、さらに下
流にある２つのＨｐａ　１部位、ＢＯ１１部位、ＭｂＯ
１部位、Ｈｌｎｆ　１部位、Ｂａｎ　Ｈｌ、　Ｍｂ。

■部位（ｐＭｃ１４０３由来の部位）、を丸さらに第１
１１ｐＫＩＩＫ示した雪）４Ｄ］ＥａｏＲ１部位などの
利用が好適と考えられる。利用部位が下流になるに従い
所望のペプチドのＮ末端に隣接して人Ｐａｓ＠のＮ末端
側のアミノ酸が次第に数多く存在する融合蛋白（ｆｕ−
・ａ　ｐｒｏｔ・Ｉｍ）が発現の書物となる。■所望の
ペプチドをコードする遺伝子を、所望のペプチドのＮ末
端にできる限り近い一隅部位を利用して結合する。最も
理想的にはＮ末端アミノ酸をコードするトリプレットの
第一ヌクレオチドと直接結合する。■この雪りの断片、
即ちｐｈＯＡのプ四モーター、８Ｄ、シグナル配列を含
む断片と所望の遺伝子をコードする遺伝子の断片０結舎
はプラス２ド上で行なうこともできるし、まえ、あらか
じめ結合したものを適当なプラスミドに挿入することも
できる。いずれのＤＮ人の塩基配列も少なくとも結合部
位附近は判っていると考えてよく、それぞれの場合に応
じて読み職シ枠（ｒ＠ａｄｉｎｇｆｒａｍ・）を考慮し
結合することが可能なはずである。を九所望の遺ｉ子の
塩基配列が不明な場合でも、消化酵素（例えばＢＡＬ３
１）などで種々の長さに断片を消化して結合し、形質転
換後に所望の形質の発現を選択することによシ読み取）
枠の合ったものを捜し出すこと−できる。

■所望の遺伝子をそのコードするペプチドのＮ末端近く
で切シ出せない場合、あるいは金〈余分のアずノ酸をＮ
末端に添加したり、本来有するアミノ酸を欠くことなし
に所望のペプチドを生産し丸い場合には、所望の遺伝子
のＮ末端附近の配列を合成して、シグナル配列と所望の
遺伝子内の最も上流にある好適な結合部位（例えば制限
部位）との間を連結して、一つのアミノ酸の過不足もな
く所望のペプチドが生産されるよう造成することもでき
る。

以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１゜ ｐｈＯＡのｆａモモ−−、８Ｄ配列、シグナル配列を含
むプラスミドｐＹＫ１９０の造成（１）ｐｈｏＡ形質導
入７アージの調製ＡＰ＆＠＠の構造遺伝子ｐｈＯＡは遺
伝子地図上＆７分に存在する。ｐｈｏＡりシーン化の第
１段階として本遺伝子の濃縮を行表う九め％混合溶菌液
（Ｍｉｘ＠ｄ　１ｙｓａｔｅ）法〔シェレンク等（ｗ。

Ｊ、　８ｃｈｒ＠ｎｋ　ａｔ　ａｌ　）　、モレキ具う
−−７ンド・ヂエネラル・ヂエネテイクス（Ｍｏ１．　
Ｇｅｎ。

Ｇｅｎ＠ｔ、　）　１３７巻、１０１頁（１１７５年）
〕Ｋより特殊形質導入ファージを作成し丸、拠合溶薗液
法とは、島田らの開発し友形質導入ファージの攻得法（
５ｓｃｏｎａａｒｙ　ａｔｔａｏｈｍｅｎｔ　５ｉｔｅ
法）ｔｈｉ　ｍｅｔ　Ａ　ｇａｌ　−ｂｉｏ　）　（同
上文献参照）にλｂｓ１８ｂ５１・ｘｉｓ６ａＩＩ５７
８γｎｉｎ　Ｎファージを感染させ先後、ファージλａ
ｈｌｌｏｌ・１９（８ｈｉｍａｄａ　　＠ｔａ１．．Ｊ
、Ｍｏ１．Ｂｉｏｘ、＠　３　　４８３一５ｏｓ、（ｘ
ｅｙｚ））（λ耐性菌にも感染し非溶製曹を殺すが、自
らは溶原化で自ない）ファージを盪〈塗布した肉汁寒天
にプレートしてｓ。

℃、３０時間インチェベートして溶製薗のコ■ニーを作
らせた。この場合ａｔｔλが欠失している丸め、溶製１
のλファージは染色体上の類似し九ＤＮ人塩基配列部位
（８ｅｃｏｎ４ａｒｙ　ａｔｔａｏｈ−鳳・ｎｔ・１ｔ
・）Ｋはぼランダムに組込まれている。

約１０’個のコ四ニーを混合して培養後、４２℃、ｌｓ
分熱誘発して約ＨＸ　１０”グラーク形成単位（ｐｌａ
ｑｕ＠ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ　）　（Ｕ／ｍ）（
λａｈ１０ａｓ１９をｌ！ｌＸｌ０・ｐ、　ｔ、　ｕ／
ａｄ會む）の混合溶菌液（ｍｉｘ＠ａ　１ｙｓａｔｅ　
）を得九、仁の溶菌液（１７ｇ＆ｔ・）は、かつてｆ！
！原化していえ場所の近傍のＤ）ｉＡを非正統的組換え
（１１１・ｇｉ−ｔｉｍａｔ＠ｒ＠ｃｏｍｂｔｎａｔｉ
ｏｎ　）でファージ染色体上に持ち込んだ形質導入ファ
ージを含み、種々の遺伝マーカーを導入することができ
る０本溶解物（１ｙｓｌｔ＠　）を感染多重度（ｍｕｌ
ｔｉｐｌｉｏｉｔｙｏｆ　ｉｎｆ＠ｃｔｉｏｎ）　１０
〜１００で大腸菌ｐｈｏ人欠失株Ｙ　Ｋ　Ｉ　１４　（
Ｆ−、ｔｈｉ　ｌｅｕ　１ａｃＹ　ｇａｌＫｒｐｓＬ　
ｐｈｏＡ畠ｒｋ−ｍｋ−）に感染させ、５−プルモー４
−り四ロー３−インドーリルーリン駿−Ｐ−）ルイジン
（以下、ｘｐという）４ｏｗ／ｊを含む培地１！１（Ｉ
Ｉ中に庫天１８　Ｆ、ダルコース４Ｆ、塩化ナトリウ五
表６畠ｔ、塩化カリウムＬｉｔ、塩化アンモニウム１０
８２％硫１２／−メａｓｓｒ、塩化！ダネシウムａ！ｆ
。

塩化カルシウムαＯ雪Ｉｆ、塩化第二鉄ａｓｑ、塩化亜
鉛（Ｌ鵞７■、トリスとドロキシメチルアミノメタｙｘ
ｚｔを會み、塩［ｆｐＨｖ、５Ｋ１１４整しえもの〕グ
レートに塗布してｓｏ℃で２日埼養すると、１０”に数
１の割合で背い）ｈＯＡ”；嚢ニーが生じた。

なお、大腸１１１ＹＫＩｓ１４は、大腸菌ｍｘｓ（ａｍ
１１ｕｋｉ島Ｇａｒ＠ｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
、　４　Ｓ、　Ｓ　４　＠　−ｓｓｇ（ｔ＊５ｅ））と
大゛腸曹ＲＲＩ　（Ｂｏｌｉｖａｒｓｔａｂ、、　Ｇ＠
ｎ＠２．　Ｉ！！−１１３（１會１７）〕をかけあわせ
て作つ九ｐｈｏＡ久失株である。

ついで純化した約ＳＯ株のｐｈｏ　Ａ＋形形質導入管、
４２℃％ＩＳ分熱誘発して高鎖度導入溶曹液（ｈｉｇｈ
　ｆｒ＠ｑｕ＠ｎｏｙ−ｔｒａｎｓｌｕｏｉｎｇｌｙｓ
ａｔ・）を得た。仁の内から、グッーク形成能のある７
アージ（ｐｌａｑｕ＊　−ｆｏｒｍｉｎｇ　ｐｈａｇ＊
　）を検索したが城得できず、すべて欠損ファージであ
った。

次に形質導入タイターの高い１株から溶菌液を大量調製
し、０．５ＭＮ＊Ｃ１，１０％ポリエチレングリコール
で沈ｌＩｉ濃縮後、遠心分離にかけた。ヘルパー・ファ
ージであるλ１）Ｓｌｉｔ）５１９ｘｉｓ６ｏ１１５７
８７ｎｉｎ５（Ｉα４優λＤＮＡ）よ）比重の大きい位
置に形質導入ファージ（１０７，３−２ＤＮ人）のバン
ドが認められたので、分離精製し、λｄｐｈｏ−１と命
名した。

精製λ改ｐｈｏ−１７７−＆ジから７エノール法でＤＮ
Ａを抽出し、制限酵素ＢａｍＨ１，ＩＥａｏＲ）および
Ｈｔｎａｌ［（以上の制限酵素は宝酒造社製、以下同じ
）の組み合せで切断地図を作成した。

その結果、λ１ｌｐｈｏ−１はλｇａｌｌｉｎＩＩの欠
損ファージで、右端よＪ）　４７　Ｋｔ＋の位置にλフ
ァージ内来のＢａｍＨ１部位をもち、Ｒ＊Ｋｂの位置に
新友なｇｏｏｕＩ部位を持つことから、１７〜２暴Ｋｂ
の大腸＃ｌＤＮＡを有すると考えられる。λｄｐｈｏ−
１はλＳ原性の大腸菌ｐｈｏＡＩｒｅａ人１（Ｙｏ６＊
　　＠ｔａ１．．Ａｇｒｉｏ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｗ、４
８．５４９−器・＠（１９８０））株をＰｈｏＡ＋に形
質導入でき、形質導入株はリン酸制限下１（ＡＰａ・・
を誘導合成することから、ｐｈｏＡ遺伝子金体をもち、
自らのプ四モーターて発現していると考えられる。

（２１ｐｈｏＡおよびその発現調節部位を含むＤＮＡ断
片のｐＢＲ，＄２２へのり四−ン化 λｄｐｈｏ−ＩＤＮ人を切断地図作成に使用した３種の
１１１１１酵素ＢａｍＨ１，１ｏｏＲ１およびＨｔｎａ
ｌ（単独および組合せ）で切断して生ずる断片を、同じ
酵素で切断したプラスオドｐＢＲ３！２と’ｆ’４リガ
ーゼで連結後、大腸菌ｐｈｏＡＩＩｒＩａ人１株をｐｈ
ＯＡ＋ＡｐＨに形質転換する人ニブラス２ドを検策した
。

堆得されたプラスオドの内で最小のものは、Ｈｌｎｌｌ
とＢａｍＨｌ　により切り出されるｔ２にｂの大腸菌Ｄ
ＮＡをクローン化し九１３１に’ｂのプラスミドで、ｐ
ＫＩ−意と命名した（第１図参照）、形質転換株は１１
ｍ　Ｍ　１７ン酸含有の培地１２１プレー）（ＸＰを含
む）でも中中背色のコロニーを生じ、低レベルのＡＰａ
＠＠活性が発現していることを示し九。これはコピー数
上昇の丸めレプレッサー（ｒ＠ｐｒ・−ｎｏｖ　）によ
る抑−率が低下しているためと思われる（１ａｏＺで４
認められるレプレッサーのタイトレージ冒ン・アウト（
ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　ｏｕｔ　）＠象〕。人Ｐａ５ｓ活
性はリン酸餉隈で顕著に誘導され、ｐｈＯＡ遺伝子全体
がクローン化されていると考えられる。

ｐＫｌ−２のｔ！Ｋｂ断片はＸｈＯｌ（宝酒造社製）（
人マａｌの切断配列の１つＣ↓Ｔ（：’ＧＡＧを切る）
により２つに切断されて２γｘｂ＋ｔｓＫｌ）になるが
、！７に１）断片をクローン化したプラスミドもｐｈＯ
Ａ　　形質転換活性を示し、形質転換株のＡＰａｇｅは
リン酸による制御を受けていた。従って％ξのｉｙｘ’
ｂ断片にｐｈＯＡ遺伝子全体が含まれている。

（３）　　ｐ　ｈ　ＯＡ　ニア’四モーター領域のクロ
ー二ンダｐｈｏＡを含むプラスオドｐＫ！−２よ炒ｐｈ
。

Ａプ四モーター領域のクローニングを以下のように行な
つ九＊ｐＫＩ−２とプｖ１毫−ターターニング用ベクタ
ーｐＭＣ１４０３（Ｊ、　Ｂａ０ｔ＠ｒｉｏ１１４Ｌ　
９７１−１１８０（１’１ｌｌＯ）参照〕を混合して制
限酵素ｇｃｏＲＩで３γ℃１時間消化し、次い”ｔ’Ｔ
４リガーゼ（宝酒造社ＩＩ）で１５℃２４時間処理し、
連結（ライゲート）した、この混合物で常法（８，Ｎ、
　Ｃｏｈ＠ｎ　＠ｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏａ。

Ｎａｔｌ、　Ａａａｄ、　８ａｉ、、　ＵＳＡ、　＠９
．２１１０〜２１１４（１・７２）〕通多大腸曹ＩＪｃ
１０ｊ１株（ΔｘａｃＺ）（Ｃａｓａａａｂａｎ　　ａ
ｔ　＆１．．Ｊ、Ｂａｅｔ＠ｒｉｏ１．　１４３゜會１
１−１＠０（１１１８・）〕を形質転換し、アンピシリ
ンに耐性で低す４ン酸濃度でＬａｃ　　になる形質転換
株を５−プ四モ、４−りａ＊％３−インドーリルーＤ−
ガ２クトシドを含む培地１２１を用い選択し丸、得られ
九形質転換株の有するプラｘ（）”ｐｙｘｘｙｘ（第ｔ
ａｉ！参照）は、その１．１０ＫｂのｇｃｏＲＩ挿入断
片上に４つの制限酵素Ｈ１ｎｆ　１部位を有する。これ
を一つだけ切断するような条件、すなわち４０μｆＤＮ
ＡおよヒＨ１ｎｆ　ｌ　（ペセスダ・リサーチ・ツボラ
ドリーズ社１１）１単位を７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＪ、７
ｍＭＭ炉ＣＩＢ、　　７ｍＭメルカプトエタノールおよ
び１０　ｍＭＮａｃｊ　からなる緩衝液（ＩＩＨ７，４
）中３７℃６０分処理する条件で部分分解し繊状化し九
１ＩＹＫ１７１の粘着末端を、４種のデオキシリボヌク
レオチド−３−リン酸とＤＮＡポリメツーゼＩ（Ｎ＠ｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いてうめ
九（ｆｌｌｌ　ｉｎ）。この操作は、デオキシリボヌク
レオチド−３−リン酸各１２ｓμＭおよびＤＮＡポリメ
ラーゼ７０４単位を用い、６ｍＭ　ＭｙＣＩｇと１ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含む４０ｘｎＭポタシウム
リン酸緩衛液（ｐＨ７，５）ＳＯｐｌ中で３０℃６０分
行なった。さらに制限酵素Ｓｍａ　ｌで処１Ｉ（１０μ
ｆＤＮＡと１０単位８ｍｍ　ｌ　　を同−緩衝液中で３
７℃６０分廻珊）し、ｐｈｏ人プロモーター活性を有し
、もとのｐＹＫ１７１よシ短かくなっ九幾つかのプラス
ミドを造成した。その内の一つｐＹＫ１９０（第１図参
照）はＨｔｎａ　ＩとＢａｗｌ（ｉ部位の間が！＄２０
ｂｐで、低リン酸濃度下でＬａｃ”の浅溝形質を持つ形
質転換株を与えた。

ｐＹＫ１９０を有する形質転換株は大腸菌（Ｒａａｋ＠
ｒｉｏｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　Ｙ　Ｋ　７３４黴工研曹
寄第６１８４号として工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。

実施例１゛ ｐｈＯＡのプロモーター、ＳＤ配列、シグナル配列を會
むＢ！Ｏｂｐの大きさのＤＮＡ断片の塩基配列の決定 ）ＹＫｌｌｌｏの有する５！０ｂｐ（Ｆ）ＤＮ−Ａ断片
の塩基配列の決定を以下のように行なつ九。

ｐＹＫｌｌｌＧをＨｌＭｌ、：ＢａｍＨｌの２重消化を
行い、５２（Ｊ’ｂｐの大１ｉ７Ｉｉの断片をポリアク
リルアイドゲル電気泳動法〔前記マキサムとギルバート
の文献参照〕で単離・精製した。この断片のｓ１末端を
〔ｒ″″”ｐ）Ａ’！’Ｐ　Ｖｔ用いリン酸化し、前記
マキサムとギルバートの方法に従って塩基配列を決定し
た。その配列を第２図に示す。

実施例１ 大腸１１ＡＰＩＬ−・のプ胃毫−ター、８Ｄ配列、シグ
ナル配列を含むＤＮＡ断片を用いた、β−ラクタマーゼ
を含む融含蛋白（ｆｕａ＠ｌ　ｐｒｏｔ・ｉｎ）の発現
と分泌 （１）プラス之ドｐＹＫ２鵞５の造成 プラスミドｐＫＩ−１からｐｈｏ人のプロモーター、８
Ｄ配列、シグナル配列を含むＬＩＫＩ）νの大１１さの
ＤＮＡ断片をＨ１ｎ＋ｌ　ｌ−１１ｃｃｏＲｌの２重消
化で得え、即ち、ｐＫｌ−４ＤＮＡ　１０ｆｉｆｔ２０
単位のＨ口１１と２０単位のＩＣａｏＲｌで３７℃１時
間処理し丸０反応１１ｓＯｐｌのＨ１ｎ４璽用緩衝液（
１０ａＭ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）、７Ｗ
ｂＭＭｙＣ１意、＠ＯｍＭＮａＣｊ）中で行ない、加熱
（７０″ｃＳ分）により反応を停止した。

反応液をアガレース電気泳動にかけｔｔｘｂｐの大きさ
に相幽する断片を単離した。すなわち１、０９１　Ｆ）
　７　カａ　−ｘゲ、ｖ（ｚｏｘｔｉｘａｉｍ）を通常
の条件下で操作した。ゲルは１５０ボルトで２時間電気
原動〔緩衝液：　４ｏｍｎ’ｒｒｔ、＊、＝ａａ＠ｔａ
ｔｓ　（ｐ　Ｈ７，８）　）にかけ、次いでα６μｆ／
ｄのエチ゛ジクムプロマイドで５〜１０分間染色する。

染色後、紫外線照射下で崗誼ＬＩＫｂｐ部分を切）出し
、内＠１　！＄　ｗｍのパイレックス管に入れ、下面に
透析膜をつけ、電気泳動（５１１Ｍ／管％１時間、同上
緩衝液）して抽出し九。

得られたＬ　Ｉ　Ｋ’ｂ’ｐｌＦ）Ｈｌｔｕｌｌ−１ｏ
ｏＲＩ断片と、同様に処理したｐＢＲ３１！をＴ４リガ
ーゼ（宝酒造社製）を用い連結し友、上記反応は１ｏｐ
ｅのｐＢＲ３２２と１声ｆＯＬＩＫｂｐの断片を用い連
結用緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＪ（ｐａｙ、ｓ）
、１０　ｍＭ　ＭｙＣｊｌ、　１０ｍＭジチオスレイト
ール、０．５ｍＭ＠ＩＡＴＰ）２０ｐｉ中で５単位のＴ
纏りガーゼを用い、１！’Ｃで２４時間行なり九− 上記反応で得られ九プツスξドをｐＫｌ−４と称する０
次にこのｐＫ　ｌ−４をＨｌｎｌ　ｌとＢａｍＨｌで２
１消化した。緩衝液はＨｌｎｌ　ｌ用緩衝液を用いえ。

一方ファ゛−ジλｅｌｌｌｓ７ｒｅｘ：：　’ｔ’ｎ５
０ａｍ　２・Ｂａ鵬　８０　　ｂ２２１　（Ｆｕｌｔｏ
ｎ　＠ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌ、　１４
２．、　！２１−２！ＩＩ（１９８０））を大腸菌ｘ−
ｔ＊ｎ５ｉｓ４（同上文献＞　に感染ｔ＜、ヒれを常法
により増殖させ溶菌液を得た。＊菌液にクロロホルムを
加えて完全に菌体を溶解し九の？）１０−ポリエチレン
グリコール４ｏｏ。

（牛丼化学社製）ヒａ５ＭＮａｃｊ　の温液に懸濁し、
４℃に２０時間インキュベートした。生じ九沈殿を１へ
ＯＯＯｒｐｍｌＯ分遠心分離にかけて回収し、フェノー
ル法でＤＮＡ画分を採堆しえ。

ヒのＤＮＡを同様にＨｌｎｌｌ−ＢａｍＨｉ　　で２重
消化し、同様に処通し九ｐＫｌ−４と混合し、Ｔ纏りガ
ーゼで連結し、大腸ａＩＭｃＩＩ）６１株を形質転換し
、カナ１イシン２０ｐｆ〆ｄを含むブイ曹ン培地（栄研
化学社Ｍ）でカナマイシン抵抗性株を選択した。そのう
ちの１株の有するプラスミドをｐｙｘｚｚｓと命名し友
、上記ｐＹＫ２２１＄の造成は積大的に第３図に示した
。

（２）　ｐｈＯＡ’−’ｂｌａ融合プツスミドの造成ｐ
ＹＫ２２人１０１１１ｆをＲａｏＲｌ　２　＠単位を用
い、５ｏｐｓのｇｃｏＲ１用緩衝液（１００ｍＭＴｒａ
ｍ　−ＨＣｊ　（ｐ　Ｈ７，４）、！ｉ　ＩＩＭ　Ｍｙ
Ｃｊ禽、！ＩＯｍＭＮａｃｊ）中で３７℃、２時間処理
し、ＤＮＡを一層エタノール沈殿として回収した。

エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１（べ七スダ・リサーチ・
ツボ２トリース社製）！単位で約８μｆの鎖状化（リニ
アーライズ）し九ｐＹＫ２２ｓＤＮＡを３０℃３〜７分
間、１：鳳Ｍ　ＭｙＣＩＢ。

１ｍａＭＫＤＴＡおよび！００ｍＭＮａＣｊを含む２０
ｍＭ　’！’ｒｉｍ　−Ｈｅｎ　（ｐＨ１１，）緩ｔｒ
液中で処理し九。

反応は１・℃Ｓ分処運で停止し九。

冷却後％Ｔ４リガー（で連結・穣化し、大腸菌ＭＣ’ｌ
Ｏ＠１株を形質転換し、カナマイシン２０　）ｉｆ／ｄ
を會むブイ冒ン培地（栄研化学社製）プレート上でカナ
マイシン抵抗性株を選択した。

次に、生じ九コロニーをアンピシリン５ｏｐｙ／ｄと１
００．ｓｒ／ｄ　を會む同一培地にレプリカ・ブレーテ
ィングし、ＳＯμｆ／ａＪのアンドシリこのようにして
遺ん友１１株にり龜、リン酸−限時に大量にβ−ツクタ
マーゼ（分子量２９．０００ダルトン）より大魚な蛋白
を合成する株を以下のようにして横型した。＃株を、培
地１２１に１ｍＭのリン酸を加え培養し、菌体を回収し
、さらに培地１２１に移して培養した。

ＯＤ　０．７１で培養し、菌体を回収し、音波破砕後８
Ｄ８（ソジウム・ドデシル・サルフェート）１−を加え
、１・０℃５０秒加熱して、ＩＩＭ饅のポリアクリルア
ンドゲル電気泳動にかけた。

泳動後、蛋白はクマジープリリアントプル−（Ｃｏｏｍ
ａｓｓｉ・Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕ・、牛丼化学社
製）で染色し九、４株がβ−ラクタマーゼとの融合蛋白
と思われる原著なバンドを示し喪。

さらにこれらがｐｈｏＡのプロモーターに依存して合成
されることを一層明らかＫするため、各棟につ亀リン酸
の添加（１ｍＭ）、無添加時に合成される蛋白を比較鱗
析し九（第４ｗＡ参照）。

この実験によ）プラスイドｐｙｘｚｚＢ人）、ｐｙｘｓ
ｓｏ（Ｂ）、ｐｙｘｓｓｏ（ｃ）　ｓＰよびｐＹＫｚｓ
ｏ（ｎ）がリン酸無添加時にそれぞれｉｓキロダルトン
（以下卑にＸと称す）、　器１Ｋ、４１におよびＩＩＩ
Ｋの蛋白を顕著に合成することを確認し九、これらのプ
ラスミドのうちｐＹＫ鵞鵞７を會む大腸菌ＹＫＩＩＩＩ
株、ｐＹＫ！１０を含むＹＫ１１４株は、それぞれ黴工
研曹寄第６１８５号および同第６１８６号として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託しである。

上記融合蛋白の生成が１）ｈＯＡのプ胃モーターに依存
している仁とを盲らに明らかにするためｐｙｘｚｇｙを
有するＹＫ畠１１株をリン酸無添加培地（培地１２１）
で生冑せしめ１合成される蛋白を経時的に追跡し、２つ
の蛋白のバンドが時間とともにその量を増すことを確認
し九（第ｉｇ参照）。

次Ｋｅれらの融合蛋白がペリプラズムに分泌されている
仁とを以下のように調べえ、それぞれの菌株を培地１意
ｌで培養後、邊透圧シ璽ツクＪ６１１（０−鳳ｏｔｉｅ
　５ｈｏｃｋ、“エル・ヘラペルストラフチャー・アン
ド・ファンクション・オブ・バイオロジカル・メンブレ
ンズ２２３頁１９７１年）し、抽出液（９ｈｏａｋ＠ｄ
　ｆｌｕｉｌ。

シ冒ツクト・フルーイド）を８ＤＢ−ポリアクリルア建
ドゲルで解析したとζろ、νＹｌ！１２７、ｐＹＫ２２
＠、ｐＹＫ２２１、ｐＹ］ｌ：２８０を有する１株は、
それぞれ１５に％ＢＩＫ、４１に、３５にの融合蛋白を
ペリプラズム中に分泌していることが明らかになつ九（
第６図参照）。

これらのプラス２ドのＢＡＬ３１消化による欠失の大１
１さを消化開始点であるＫｏｏＲ１部位を挾んで存在す
るａｔｎｏ　Ｔ１部位を用いて摺電した。即ち、−限酵
素Ｈ１ｎｃｌ　（宝酒造社Ｉｌ）分解（７ＱＩ　ＭｙＣ
Ｉ意と７ｍＭ！−メルカプトエタノールを會む７ｍＭ　
Ｔｒｉｍ−ＨＣｊ　（ｐ　Ｈ７，４）緩債液中３７℃１
時間処理する〕によシ生ずるＤＮＡ断片の大１１１を常
法どおりアガ胃−スゲル電気泳動によａｍ定し九ところ
、ｐＹＫｌ鵞１は４・Ｏｂｐ、ｐＹＫ！！ＩＩは５４０
ｂｐ、ｐＹＫｓ！９は８４０ｍｊｐ、ｐｙｘｘｓｏは８
１Ｇ’ｂｐの欠失があり、特にｐｙｘｚｚｅ、ｐｙｘｓ
ｓｏではβ−２クタマーゼのシグナルペプチドが完全に
欠失していることは明らかである（　Ｊ、　Ｇ、　８ｕ
ｔ−ｃｘｉｆｆ＠、　ｐｒｏｐ、　Ｎａｔｊ、　Ａ（Ｉ
ＩＬ（１，８ｏ１．、７５．３７３７−３７４１（１・
７８）参照〕、従って、少なくともｐＹＫ２！９、ｐｙ
ｘ鵞ｓｏＫよる融合蛋白のペリプラズムへの分泌はその
生合成とともにｐｈ。

人に依存していると考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１ＩＩは、本発明ＤＮ＾遺伝子の造成方法を示す、Ｂ
ａ中、Ｂ％Ｈ，Ｘ、Ｂ、８によびｆはそれぞれ１１ａｏ
Ｒ）、　Ｈｌｎｄｌ、Ｘｈｏ　Ｉ％Ｂａｗｌ　ｌ、Ｂａ
ｍ１シよびａｔｎｒ　Ｉの制限酵素部位を示す。 第３図は、本発明ＤＮＡ遺伝子の塩基配列を示す０図中
、Ｈ１ｎ＋ｌ　Ｉ％Ａｌｕ　ｌ、Ｈｈ＆　ｆ％ＢａＩＩ
。 Ｍｂｏ　ｌ、Ｈａｓ　ｌ、Ｐｕｖ　ｌ、Ｘｍａｌ、Ｈａ
ｅｌ。 Ｈｐａ　１．　Ｈｌｎｆ　ｌおよびＢａ１ＩＨ１はそれ
ぞれ各制限酵素による切断部位を、ＰＢはグリブノー・
ボックス配列を、８Ｄはシャイン・ダルガーノ配列を、
１ｓｏ−１および１ｓｏ−１はイソ酵素１および３をそ
れぞれ示す。を九、図中Ａ、Ｔ。 Ｇ、Ｃはそれぞれアデニン、チミン、ダアニン、シトシ
ンを示す。 第３図は、ｐＹＫ２２ｓの造成を示す、図中、ｂｌａ　
ｉｊβ−ラクタマーゼ遺伝子を示すａｈ　Ｘａ釦紘カナ
ゴイシど耐性遺伝子を示す、その他は上記と同じ。 第４１１は、リン酸制限時に誘導されるｐｈＯＡ−〇ｂ
１曙金蛋白の存在を示す電気泳動図を示す。 図中、＋は１ｍＭリン酸添加培養、−はリン酸無添加培
養を示す。墓は分子量！−カー蛋白を示す、にはキロダ
ルト／を示す。 第Ｓ図は、リン酸−限時にＹＫ８１１−ｃＷＩＩ導され
るｐｈｏ人’　−”ｂ１ｍ重合量白量の経時変化を示す
電気泳動図である。 第６図は、リン酸制限下で生成されるペリプラズム蛋白
を示す電気泳動図である。図中Ａはｐｙｘｚｚｙ、Ｂは
ｐＹｘ！！Ｉ、ＣはｐＹＫ２２９、Ｄはｐｙｘ＊ｓｏ％
ｈは宿主大腸菌ＭＣｌ０＠１．Ｔｌはｐｙｘｚｚｓを示
す。 箋＋口 第５″図 手続補正書（自発） １．事件の表示 昭和５６年特許願第１６６３６−７号 、２発明の名称 ＤＮＡ遺伝子 １補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　　東京都大田区山王２丁目１７−１！氏名　田
村季造 表代　理　人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）大腸菌のアルカリ性フォスファターゼ遺伝子（ｐ
   ｈｏＡ）に由来し、少なくともプロモーター配列、シャ
   イン・メルガーノ配列（８Ｄ配列）またはシグナル配列
   を有するＤＮＡ邊伝子。 （２）線配列が第２図に示される配列であることを４１
   １１とする特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ遺伝子。 ＋３）　　４１許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ遺伝子
   を會んだ組換え体ＤＮＡを有する大腸薗薗株。 （４＞特許請求の範囲第１項記載のＤ）ｉＡ遺伝子と所
   望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡとを有する組換え体
   ＤＮＡ。 （５）諌所望の蛋白質がβ−ラクタマーゼである特許請
   求の範囲第４項記載の組換え体ＤＮＡ。 （６ン　　特許請求の範囲Ｍ４項項記載組換え体ＤＮＡ
   を含んだ大腸曹曹株。