JPS6283890A - ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はポリペプチド分泌発現ベクター、該ベクターで
形質転換した微生物及び該微生物によるポリペプチドの
製造法に関する。

従来の技術 遺伝子工学的手法を用いて、インターフェロン、成長ホ
ルモン等を始めとする様々なポリペプチドを大腸菌、枯
草菌、酵母等の宿主細胞の利用により製造する方法は既
に確立されている。しかしながら確立された方法といえ
ども未だ幾つかの未解決の問題点を有しており、天然品
と全く同一のポリペプチドを製造することは必ずしも容
易ではない。上記問題点の中で最も重要なもののひとつ
としては、ポリペプチドのＮ末端を、天然品と同一の構
造とするのが困難なことを挙げることができる。即ち、
之等のポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で
直接発現させるとき、遺伝子からポリペプチドへの翻訳
は、開始コドンとして通常用いられるＡＴＧから始まる
ため、発現されるポリペプチドのＮ末端は、ホルミルメ
チオニン残基となってしまう。天然型ポリペプチドのＮ
末端がホルミルメチオニンである場合は少なく、他のＮ
末端を有するポリペプチドの製造にはこの方法は利用で
きない。上記ホルミルメチオニン残塁は、シアノグンブ
ロマイドを用いた化学反応によりポリペプチドから除去
することができるが、ポリペプチドがＮ末端の他にもメ
チオニン残塁を有する場合、上記方法ではポリペプチド
鎖自体が該個所で切断されてしまい、やはり目的のポリ
ペプチドは製造できない。

また目的ポリペプチドをコードする遺伝子を、他のポリ
ペプチドをコードする遺伝子と結合させて、融合ポリペ
プチドとして発現させる方法も知られている。この方法
では、得られる融合ポリペプチドからの目的ポリペプチ
ドの分離は、トリプシン等の酵素による処理やシアノゲ
ンブロマイド等を用いた化学的処理によっている。しか
しながらこの方法においても目的のポリペプチド鎖内に
使用する酵素又は化学薬品の標的となるアミノ酸が存在
すれば、その個所でペプチド鎖が切断され、結局目的ポ
リペプチドは製造はできない。また、上記方法により融
合ポリペプチドからの目的ポリペプチドの分離が可能な
場合といえども、目的ポリペプチドの単離のためには、
通常菌体粗抽出液から融合ポリペプチドを分離する工程
及び融合ポリペプチドを切断した反応組成物から目的ポ
リペプチドを分離する工程の２回の精製操作が必要とな
り、その操作及び工程自体煩雑となり、しかも目的物の
収率の低下は避けられない。

以上のよう鵡、天然型と全く同一のポリペプチドを遺伝
子工学的手法で入手することは、°従来非常に困難でお
り、この天然型と全く同一のポリペプチドを宿主細胞か
ら直接製造できる改良された方法の研究開発が、斯界で
要望されている現状にある。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、上記斯界で要望されている天然型と全く同一
のポリペプチドを宿主細胞から直接製造できる改良され
た方法を提供することを目的とする。また本発明は、該
方法の実施のための新しいベクター及び該ベクターを保
有する微生物を提供することをもその目的としている。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、上記目的の達成手段として、シグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ塩基配列と目的ポリペプチド
をコードするＤＮＡ塩基配列とを直接連結させて目的ポ
リペプチドを分泌発現させるための、シグナルペプチド
をコードするＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とするポ
リペプチド分泌発現用ベクター、シグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡ！配列と目的ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列とが直接連結されてなる融合ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ塩基配列を含む、上記ベクター、
該ベクターで形質転換された微生物及び該微生物を培養
して分泌されるポリペプチドを採取するポリペプチドの
製造法という一連の発明を特願昭５９−２７１２０６号
により、既に開示した。

而して、本発明者は、特に枯草菌を用いて目的ポリペプ
チドを分泌発現させるべく、更に研究を続け、本発明を
完成したものである。

即ち本発明は、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩
基配列と目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
とが直接連結されてなる融合ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列、並びに枯草菌の複製開始領域であるＤ
ＮＡ塩基配列を含むことを特徴とするポリペプチド分泌
発現ベクター、該ベクターで形質転換された微生物及び
該微生物を培養して分泌されるボッペプチドＳ−採取す
るポリペプチドの製造法を提供するものである。

本明細書において、アミノ酸、核酸塩基、その他に関し
て略号で表示する場合はＩＵＰＡＣｌＩＵＢの規定或い
は当該分野における慣用記号に従うものとし、その例を
次に挙げる。

３ｅｒ；セリン　　　　１−ｅｕ；ロイシンＡｒｇ：ア
ルギニン　　ｃｙ’ｓニジスティンＧｉｎ：グルタミン
　　ｒｌｅ：イソロイシンＰ「０；プロリン　　　Ｖａ
ｔ；バリンＨｉＳ；ヒスチジン　　Ｍｅｔ：メチオニン
Ａｌミニアラニン　　　ｐｈｅ：フェニルアラニンＧＩ
Ｖニゲリシン　　　Ａｓｐ：アスパラギン酸ＡＳｎ：ア
スパラギン Ａ　；アデニン　　　Ｔ　；チミン Ｇ　；グアニン　　　Ｃ；シトシン シグナルペプチドとは、細胞内で生産されたポリペプチ
ドを細胞外に分泌する動きをするアミノ酸配列である。

一般に微生物に限らず全ての細胞の生産するポリペプチ
ドには、細胞内に留まってその動きをなすものと、細胞
外に分泌されるものとがある。この細胞外に分泌される
ポリペプチドでは、まず、そのＮ末端に士数個乃至数十
個のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドが付加され
た前駆体として細胞内に生産され、次いで該前駆体はそ
の有するシグナルペプチドの作用により該シグナルペプ
チドを介して細胞膜を通過すると同時にシグナルペプチ
ドーぜの作用によりシグナルペプチドが切り離され、そ
の結果−切の不要アミノ酸を持たない目的ポリペプチド
のみが細胞外に分泌される（以下、このように細胞外に
分泌される目的ポリペプチドを「成熟ポリペプチド」と
いう）。例えば、大腸菌のβラクタマーゼは、菌体内で
βラクタマーゼ前駆体、即ちβラクタマーゼと２３個の
アミノ酸からなるシグナルペプチドとの融合蛋白質とし
て生産された後、該シグナルペプヂドの作用により細胞
膜を通過してペリプラズム、即ち細胞膜と外膜との間の
空間に分泌され、その際、シグナルペプチドは、シグナ
ルペプチダーゼにより切断され、ペリプラズム内には成
熟ポリペプチド、即ら活性型のβラクタマーゼが蓄積さ
れルコとが知られている（Ｊ、　Ｇ、　５ｕｔｃｌｉｆ
ｆｅ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　、
７５゜３７３７−３７４１　（１９７８））。

本発明者らは、上記シグナルペプチドの特性に着目し、
該シグナルペプチドを利用して、目的とする外来蛋白質
をシグナルペプチドとの融合ポリペプチドとして宿主細
胞内で生産させ、外来蛋白質を細胞外に成熟ポリペプチ
ドとして分泌せしめ、かくして目的ポリペプチドを容易
に製造入手し得る前記特願昭５９−２７１２０６号の発
明において、宿主細胞として特に枯草菌を用いる場合に
ついて鋭意研究した。その結果、実際に枯草菌細胞内に
導入することによって、目的ポリペプチドを成熟ポリペ
プチドとして細胞外に分泌させ得る新しい発現ベクター
（プラスミド）の構築に成功すると共に、このベクター
の利用による目的ポリペプチドの製造に成功した。

本発明のポリペプチド分泌発現ベクターは、シグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ塩基配列に目的ポリペプチド
をコードするＤＮＡ塩基配列を直接連結させた融合ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列と枯草菌の複製開
始領域であるＤＮＡ塩基配列とを有しており、これを枯
草菌細胞に導入して形質転換させ、この形質転換体を培
養することによって細胞外に目的ポリペプチドを成熟ポ
リペプチドとして分泌生産させることができる。また、
本発明の発現ベクターは、更に例えば大腸菌の複製開始
領域を有していても良く、この場合は枯草菌のみならず
大腸菌をも宿主細胞とすることができ、これをこれらの
宿主細雨に導入して形質転換させることにより、該宿主
細胞の培養によって細胞外又はペリプラズムに目的ポリ
ペプチドを成熟ポリペプチドとして分泌生産させること
ができる。

尚、本発明において、枯草菌の複製開始領域とは、枯草
菌において機能する複製開始領域を意味するものでおり
、枯草菌に由来するプラスミドの該領域に限られず他の
微生物に由来するプラスミドの該領域及び化学合成され
た該領域も包含され、る。同様に大腸菌の複製開始領域
は、大腸菌において機能する複製開始領域を意味し、種
々の微生物に由来するプラスミドの該領域及び化学合成
された該領域も包含される。　　　　　　　　　　。

本発明ベクターの製造においては、まず目的ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ塩基配列を直接連結できるように
設計されたシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列を含むベクターを製造する。本明細書においては、こ
れを分泌発現用ベクターという。次いでこの分泌発現用
ベクターに目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列を直接連結させ、更に枯草菌の復製開始領域であるＤ
ＮＡ塩基配列を導入することにより製造される。

以下、本発明ベクターの製造技術につき詳述する。

本発明ベクターの必須構成要件とするシグナルペプチド
をコードするＤＮＡ塩基配列としては、従来より知られ
ているシグナルペプチドのそれをいずれも利用すること
ができる。該シグナルペプチドの代表的具体例としては
、例えば大腸菌のβラクタマーゼのそれを例示すること
ができる。該シグナルペプチドは、下記式〔１〕に示す
アミノ酸配列を有している。

Ｍｅｔ　−３ｅｒ　−１ｌｅ　−（３Ｉｎ　−＠　ｉｓ
　−ｐｈｅ　−Ａ　ｒｇ　−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ　−Ｌ　
ｅｕ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　−
Ａ　１ａ−Ａ　ｌａ　−Ｐｈｅ　−ｃｙｓ　−Ｌｅｕ　
−ｐｒｏ　−Ｖａｔ　−Ｐｈｅ−Ａ　ｌａ　　　　　　
　　　　　　　（１）また、該シグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡ塩基配列は、各アミノ酸に対応する以下の
ＤＮＡ塩基配列から任意に選択することができる。尚、
下記ＤＮＡは、メチル化等の常法に従い修飾された塩基
をも含むものとする。

Ｍｅｔ；ＡＴＧ Ｓｅｒ；ＴＣＴ、ＴＣＣ，ＴＣＡ、ＴＣＧ。

ＡＧＴ、ＡＧＣ １１ｅ：ＡＴ丁、ＡＴＣ，ＡＴＡ Ｇｌｎ；　ＣＡＡＳＣＡＧ Ｈｉｓ：ＣＡＴ、ＣＡＣ Ｐｈｅ：ＴＴＴＳＴＴＣ Ａｒ（］：ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＴ、ＣＧＣ。

ＣＧＡ、ＣＧＧ Ｖａｔ：ＧＴＴ、ＧＴＣ，ＧＴＡ、ＧＴＧＡｌａ：ＧＣ
Ｔ、ＧＣＣ，ＧＣＡ、ＧＣＧＬｅｕ；ＴＴＡ、ＴＴＧ、
ＣＴＴ、ＣＴＣ。

ＣＴＡＳＣＴＧ Ｐｒｏ；　ＣＣＴ、ＣＣＣ，ＣＣＡ、ＣＣＧＣｙｓ：　
ＴＧＴ、ＴＧＣ 上記ＤＮＡ塩基配列のうちで、特に好ましく選択された
組合せとしては、下記式〔２〕に示すものを例示できる
。

ＡＴＧＡＧ丁ＡＴ丁ＣＡＡＣＡＴＴ丁ＣＣＧＴＧＴＣＧ
ＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＴＴ
ＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＧＣＧ（２） 分泌発現用ベクターに保有されるシグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡ塩基配列は、上記のごとき具体的ＤＮＡ
塩基配列を基本として、その３′側付近、即ちこれに目
的ポリペプチドが連結される側付近、好ましくはその１
０塩基以内に、又はこれに更に１０＠Ｗ以内のＤＮＡ配
列を付加してこの付加部分に、制限酵素認識配列を含ま
せるものとする。これは上記シグナルペプチドをコード
するＤＮＡ塩基配列と、目的ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列とを直接連結させるために必須のもので
ある。しかしてこの制限酵素認識配列を認識する酵素と
しては、公知の制限酵素のいずれでもよいが、好ましく
は５塩基以上の塩基配列を認識するものがよく、この酵
素に応じて上記３′側付近のＤＮＡ塩基配列は、任意に
変化させることができる。

例えば、上記具体的例示のβラクタマーゼのシグナルペ
プチドを例にとり詳述すれば、そのＣＧＨのアミノ酸で
あるＡｌａをコードする塩基配列として、ＧＣＣを選択
した場合、更にこれにＧＧＣの塩基配列を連結させれば
、このＧＣＣＧＧＣの６塩基配列は、制限酵素Ｎａｅ工
により認識される。

該シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列は、Ｎ
ａｅｌによりその中央で切断され、かくして３′末端が
ＧＣＣ（シグナルペプチドのＣＯＮアミノｆ、Ａｌａに
対応する）であるＤＮＡが得られ、該ＤＮＡにはその直
後に目的ポリペプチドをコードする任意のＤＮＡ塩基配
列を直接連結させることができる。

また例えば、上記シグナルペプチドｌの２つのアミノ酸
配列を構成するＰｈｅ−Ａｌａをコードする塩基配列と
して、ＴＴＣＧＣＧＩＦ！：選択する場合、その３′側
に更にアデニン塩基（Ａ＞を連結させて得られるＴＴＣ
ＧＣＧＡの７塩基配列のうち、ＴＣＧＣＧＡは制限酵素
Ｎｒｕ■により認識され、この中央で切断され、これに
より得られるＤＮＡ塩基配列は、その３′末端がＴＴＣ
Ｇとなる。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列として、この塩基配列を利用するときには、これと連
結すべき目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
の５′側に、更に０丁、ＣＣ，ＣＡ又はＣＧの２塩基配
列を付加することにより、所望の融合ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ塩基配列が得られる。

更に例えば、上記シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
塩基配列の３′側に、ＡＡＣ丁ＣＡＧＣＴＧの１０塩基
配列を連結させれば、この配列中、ＣＡＧＣＴＧの６塩
基配列は、Ｐ　ｖｕ　Ｕ　ニヨリＬＬｉＰＪｉされ、そ
の中央で切断される。がくして１ｑられるＤＮＡ塩基配
列は、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列の
３′側に、更にＡＡＣＴＣＡＧの７塩基配列が結合され
たものであり、この７塩基配列のうち、最初の３塩基配
列ＡＡＣはＡｓｎをコードしており、次の３塩基配列Ｔ
ＣＡは３ｅｒをコードしており、最俊のグアニン（Ｇ）
は、ＡＩａＳＧＩＶ、　Ｖａｔ、　ＡＳＩ）及び（３Ｉ
ｎのいずれかをコードしている。従ってこれを、シグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列として用いると
きには、例えばβウロガストロン等のようにＮ末端アミ
ノ酸がＡ　ｓｎ　−ｓ　ｅｒ　−Ａ　Ｓ＋）であるポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列からその５′側の
７塩基配列（例えばＡＡＣＴＣＡＧ＞を除いたＤＮＡ塩
基配列を結合させることによって所望の融合ポリペプチ
ド（βウロガストロンとシグナルペプチドとの融合ポリ
ペプチド）をコードするＤＮＡ塩基配列を容易に形成さ
せることができる。

従って、分泌発現用ベクターの構成要素とするシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡＪ３基配列としては、前記
に具体的に例示したＤＮＡ塩基配列の他に、例えばこれ
に更に１０個以内のＤＮＡ塩基配列を付加させたものを
も、好ましいものとして利用することができる。その−
具体例は、上記した１０塩基配列を付加させた下記式（
３〕に示すＤＮＡ塩基配列を有するものである。

ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧ
ＣＣＣ下ＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴ丁ＴＴＧＣＧＧＣＣＴＴ
ＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧ丁ＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＴＣＡ
ＧＣＴＧ　　（３）上記シグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列又はこれを含む塩基配列は、従来公知の
各種の方法、例えばこれを含有する微生物、ゼれがら単
離されたプラスミド等、好ましくは例えばｐ８Ｒ３２２
等から制限酵素等を利用して切断単離する方法、そのＤ
ＮＡ塩基配列に従い化学合成する方法、之等の方法の組
合せ等により容易に製造することができる。また上記シ
グナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列と、目的ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列との連結乃至結
合手段も、従来公知の各種方法、例えばＴａ　ＤＮＡリ
ガーゼ等を用いる酵素反応等に従うことができ、る。

上記のごとくして得られるシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ塩基配列を含む分泌発現用ベクターは、該ＤＮ
Ａ塩基配列を、例えばプラスミド、ウィルスＤＮＡ、コ
スミド〔例えばｐＪＢ８、Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ、
Ｄ　　ａｎｄ　Ｂｕｒｋｅ、　Ｊ、　Ｆ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、９．２９
８９（１９８１））等の従来より外来遺伝子のクローニ
ングに用いられている各種のベクターに組込むことによ
り得られる。

このＤＮＡ塩基配列の好適な起源ベクターの具体例とし
ては、上記したプラスミドｐＢＲ３２２の他、例えば以
下のものを例示できる。

０プラスミドｐ　ＴＵＢ４　（バチルス・ズブチリス由
来のα−アミラーゼのシグナルペプチド、ＨｌＹａｍａ
ｚａｋｉ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、、１５６゜３２７−３３７　（１９８３））、 ０プラスミドｐ　ＮＰｌ　５０　（バチルス・ズブチリ
ス由来の中性プロテアーゼのシグナルペプチド、Ｈ，Ｓ
ｈｉｍａｄａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、　　２゜０プラスミドｐＫＴＨ１０（バチ
ルス・アミロリケファシエンス由来のα−アミラーゼの
シグナルペプチド、Ｉ、　Ｐａ１ｖａ、　Ｇｅｎｅ　、
　１９．８１（１９８２））、 ＯプラスミドｐＯＧ２１６５（バチルス・リケニフオー
ミス由来のベニシリナーゼのシグナルペプチド、　Ｇｒ
ａｙ　、　Ｏ，、ａｎｄ　Ｃｈａｎ（１，Ｓ、　、　Ｊ
。

３ａｃｔｅｒｉｏ１．．１４５．４２２　（１９８１）
）０プラスミドｐ　ＨＯ２（ニジエリシア・コリ由来の
マルトース結合蛋白のシグナルペプチド、Ｈ３ｅｄｏｕ
ｅｌｌｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　、　２８
５．７８−８１　（１９８０））、 ０プラスミドｐｓＮ５１８（ニジエリシア・コリ由来の
リン酸結合蛋白のシグナルペプチド、ＫＭａｇｏｔａ　
ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５
７゜９０９−９１７　（１９８４））、 ０プラスミドＩ）ＪＰ１２（ニジエリシア・コリ由来の
リン酸制限下に誘導される外膜蛋白のシグナルペプチド
、Ｎ、０ｖｅｒｂｅｅｋｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ。

Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、、１６３，５１３−５３２（１
９８３））等。

上記クローニングに用いられている各種ベクターへのシ
グナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列の導入操作
は、従来よりこの種外来遺伝子をベクターに組込む際に
用いられている操作に従い、　　例えば各種制限酵素、
各種リガーゼ等を用いて行なうことができる。

次いで、上記のごとくして得られるシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ塩基配列を含む分泌発現用ベクターに
目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を直接連
結させ、更に枯草菌の複、　　製開始領域であるＤＮＡ
塩基配列を導入する。

本発明のポリペプチド分泌発現ベクターにおいて、シグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列と直接連結さ
れて融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とし
て保有されるポリペプチド及びそのＤＮＡ塩基配列とし
ては、任意のポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡ
塩基配列がいずれも利用できる。上記ポリペプチドの例
としては、例えば表皮細胞増殖促進因子、ソマトスタチ
ン、インシュリン、ＧＩ　Ｐ、Ｒ−ＭＳＡ、サイモシン
β４、成長ホルモン、成長ホルモン坂出因子等のホルモ
ン及び成長因子類、インターフェロン、インターロイキ
ン２、腫瘍壊死因子等のリンフ才力イン免疫調節物質類
、血清アルブミン、プラスミノーゲンアクティベーター
、アポリポプロティン等の血液構成物質、Ｂ型肝炎ウィ
ルス表面抗原等のワクチン用抗原蛋白質等を例示できる
。之等の各種ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
は、それらの起源とする細胞等から通常の方法に従い抽
出単離してもよく、２等ポリペプチドのアミノ酸配列に
従い化学合成することもできる。

、上記ポリペプチド及び／又はそのＤＮＡ配列の具体例
を次に示す。

０ソマトスタチン ＣＣＴＡＧ　　５’ Ｏプロインシュリン Ｇｌｕ　　ＡＳｎ　　Ｔｙｒ　　Ｃｙｓ　　ＡｓｎＧＡ
ＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣ （Ｎａｔｕｒｅ　，　Ｖｏｌ．　２Ｂ２，　２９．　Ｎ
ｏｖｅｍｂｅｒ　　１９７９）ＯＢ型肝炎ウイルス表面
抗原 ＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴ
丁ＴＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧ丁ＧＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＣ
ＴＣＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣ丁ＧＡＣＴＴＣＴＴＴＣ
ＣＴＴＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＧＡＴＡＣ
ＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＴＣＧＧＧＡＴＧＣＣ
ＴＴＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＴＴＣＡＣ
ＣＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＣＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡＧＣ
ＡＡＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＣＴＴＡＡＴＧ
ＡＣＴＣＴＡＧＣ丁ＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧ下ＡＣＴＡ
ＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＧＧＧＡ
ＣＣＴＡＧ丁ＡＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣＡＡＣＡＣＴ
ＡＡＴＧＴＧＧＧＣＣＴＡＡＡＧＴＴＣＡＧΔＣＡＡＴ
ＴＡＴＴＧＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴ
ＣＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＴＡ
ＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧ丁ＧＴＣＴＴＴ丁ＧＧＡＧ丁ＧＴ
ＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＴＴ，Ａ．Ｔ
ＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＴＡＴＣＣＴＡＴ
ＣΔＡＣＧＣＴ丁ＣＣＧＧＡＧＡＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴ
ＴＡＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡ
ＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣ
ＧＡＡＧＡ丁ＣＴＣＡＡＴＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧ
ＡＡＧＡＴＣ丁ＣＡＡＴＣＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＡ
ＴＧＴＴＡＧ ＯＢ型肝炎ウイルス表面抗原 ＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣ
ＴＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＣ
ＧＧＧＧ丁ＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＣＡＡＧＡＡＴＣ
ＣＴＣＡＣＡＡＴＡＣＣＧＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴ
ＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴ
ＡＧＧＧＧＧＡＡＣＴＡＣＣＧＴＧ丁ＧＴＣＴＴＧＧＣ
ＣＡＡＡＡＴＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＡ丁ＣＴＣＣＡ
ＡＴＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣ
ＡＡＣＴＴＧＴＣＣＴＧＧＴＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧ
ＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴ下ＴＴＡＴＣＡ丁ＣＴＴＣＣ
ＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴ
ＣＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴ
ＣＡＡＧＧＴＡ丁ＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＣ
ＴＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧ
ＣＡＣＧＧＧＡＴＣＣ丁ＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＧ
ＡＣＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＡＴＣＴＣＴＡＴＧＴ
ＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＣＣ
ＴＴＣＧＧＡＴＧＧＡＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＴＴ
ＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＣＧ
ＧＡＡＡＡＴＴＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＣＣＴＣ
ＡＧＣＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴ丁ＧＧＣＴＣＡＧＴ下ＴＡ
ＣＴＡＧＴＧＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＴＧＧＴＴＣＧ
ＴＡＧＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＡＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴ
ＴＴＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＡＴ
ＴＧＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＴＣＴ
ＴＧＡＧＴＣＣＣＴＴＴＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＡＣＣ
ＡＡＴＴＴＴＣＴＴ丁ＴＧＴＣ丁ＴＴＧＧＧＣＡＴＡＣ
ＡＴ丁ＴＡＡ ○表皮細胞増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　　Ｇｒｏｗ
ｔｈ　　Ｆａｃｔｏｒ　＞Ｈ−ＡＳｎ−３ｅｒ−ＴＩ／
ｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−３ｅｒ
−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−　Ｌｅｕ
−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−
Ｈｉｓ−１　１ｅ−（３１ｕ−３ｅｒ−　１ｅｕ−ＡＳ
＋）−３ｅｒ　−Ｔ’／ｒ−Ｔｈｒ−ＣＶＳ−ＡＳｎ−
Ｃｙｓ−Ｖａｌ−１　１ｅ−ＧＩＶ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−
ＧＩＶ−ＡＳＩ）−Ａｒｇ−ＣＶＳ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−
ＡｒＯ−ＡＳｐ−ＬｅＬＩ−Ａｒ！ｌｌ−Ｔｒｉ）−Ｔ
ｒｉ）−Ｇｌｕ　−　ＬｅＵ−Ａｒ！ｌ］−ＯＨｏＧＩ
Ｐ（Ｇａｓｔｒｉｃ　　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　　Ｐｏ
ｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）ト１−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ一丁ｈｒ−　Ｐｈｅ−１　１ｅ−Ｓｅｒ−ＡＳｐ
−丁ｙｒ−Ｓｅｒ−１　ｌｅ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ
−Ｌｙｓ−Ｉ　Ｉｅ−Ａｒａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ
−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ＩＪＳ−ＧＩＶ−ＬＪＳ−１
”／Ｓ−８ｅｒ−ＡＳＩ）−Ｔｒｌ）−ＬＶＳ−Ｈｉｓ
−Ａｓｎ−ｌ　Ｉｅ−Ｔｈｒ−（３Ｉｎ−ＯＨＦａｃｔ
ｏｒ　） Ｈ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ−ＬＶＳ−Ｇｌｕ　−１ａ−ＯＨ Ｏソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ　）Ｈ−
ＡＩａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐ
ｈｅ−丁ｒｐ−ＬＪＳ−Ｔｈｒ−ｐｈｅ−（ｈｒ−３ｅ
ｒ−Ｃｙｓ−ＯＨ（Ａ、　Ｖ、　５ｃｈａｌｌｙ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、　Ｆｅｄ、１）ｒｏｃ　、　Ｆｅｄ、　Ａ
ｍ　、　ＳｏｃｏＲ−ＭＳＡ　（Ａ　　Ｐｏ１ｙｐｅｐ
ｔｉｄｅ　ｗｉｔｈ　Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　
−３ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　）Ｈ
−Ａ　Ｉａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ　−Ｐｒｏ−３ｅｒ−（３
１ｕ　−Ｔ　ｈｒ−Ｌ　ｅｕ−Ｃｙｓ　−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｔ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ａｓｐ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｂｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ−，５ｅｒ−ＧＩＶ−Ａｒｃ−Ａｌａ−Ａ
Ｓｎ−Ａｒｃ−Ａｒｃ−３ｅｒ−Ａｒ（１−Ｇｌｙ−Ｉ
　１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ａｒｏ　−Ｓｅｒ　−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ａ　ｌａ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｑｌｕ　−Ｔｈｒ−
７ｙｒ−Ｑｙｓ−ＡＩａ　−７ｈｒ−１）ｒｏ−Ａｌａ
（ｙｓ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−ＯＨ （Ｈ，Ｍａｒｑｕａｒｔ　、　Ｇ、Ｊ、Ｔｏｄａｒｏ　
、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ　、　。

２互旦、６８５９（１９８１＞） ０ソマトスタチン−２８（３ａｍａｔｏｓｔａｔ　ｉｎ
　−２８＞Ｈ−３ｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏ−Ａ　Ｉａ−Ｍｅｔ−Ａ　ｌａ−ｐｒｏ−
Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒ（］−］Ｌ’／５−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−ｃｙｓＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ−Ｔｒｌ
）−１’／５−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−ＣＶ
Ｓ　−ＯＨ ０サイモシンβ４　　（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ　　β４）Ａ
Ｃ−３ｅｒ−ＡＳＩ）−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＡＳＩ）−Ｍ
ｅｔ−、Ａｌａ−（３１ｕ−１１ｅ−Ｇ　ｌｕ　−Ｌｙ
ｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｌｙｓ　−Ｌ
　ｅｕ　−Ｌ　ｙｓ　−ＬＶＳ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌ　
ｅｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ　−Ｉ
　Ｉｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−
Ａ　１ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−ＯＨ（Ｔ、　Ｌ、
　Ｋ、　Ｌｏｗ　ｅｔ　　ａｌ　　、　Ｐｒｏｃ　、Ｎ
ａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、ヱ旦、１１６２　（１９８１））
上記ポリペプチドのＤＮＡ塩基配列と、シグナルペプチ
ドのＤＮＡ塩基配列との連結は、例えばシグナルペプチ
ドのＤＮＡ塩基配列を保有する前記分泌発現用ベクター
に、上記ポリペプチドのＤＮＡ塩基配列を、前述した方
法に従い制限酵素を用いる酵素反応及び例えばＴ４リガ
ーゼを用いる酵素反応を利用して導入することにより実
施できる。また、予め上記ポリペプチドとシグナルペプ
チドとの融合ポリペプチドのＤＮＡ塩基配列を化学合成
した後、このＤＮＡ塩基配列を、前記シグナルペプチド
のＤＮＡ塩基配列の導入と同様にして、適当なりローニ
ング用ベクターに導入することによっても行なうことが
できる。

次に、かくして得られた融合ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列を保有するベクターに更に枯草菌の複製
開始領域であるＤＮＡ塩基配列を導入することにより本
発明のポリペプチド分泌発現ベクターを得ることができ
る。この導入操作は、例えば上記融合ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ塩基配列を有するベクターと枯草菌の複
製開始領域であるＤＮＡ塩基配列を有するベクターとを
用い、それぞれのベクターの必要部分を連結するこによ
り行なうことができる。この操作は、常法例えば各種制
限酵素、各種リガーゼ等を用いて行なうことができる。

枯草菌の複製開始領域であるＤＮＡ塩基配列を有するベ
クターとしては、公知のものをいずれも使用でき、例え
ばプラスミドｐＵＢ１１０（Ｔ。

Ｊ、　Ｇｒｙｃｚａｎ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、　、　１３４゜３１８〜３２９　（１９７
８））、ｐｓＡ２１００　−（ｉｂｉｄ＞　、Ｉ）　５
ＡＯ５０１（１ｂｉｄ＞、１）０Ｍ１９４　（ｉｂｉｄ
＞　、ｐＥ１９４　（Ｓ。

Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ　　ａｎｄ　　Ｂ、　Ｗｅｉｓｂ
ｌｕｍ　、　Ｊ。

３ａｃｔｅｒｉｏ１．　、１５０．８０４　（１９Ｂ２
）　）、ｐ　Ｃ１９４（Ｓ、　Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ　
ａｎｄ　Ｂ。

Ｗｅｉｓｂｌｕｍ　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　
１５０．８１５（１９８２））等を挙げることができる
。これらのベクターは、そのまま用いても良いが、より
好ましくは更に例えば大腸菌の複製開始領域でめるＤＮ
Ａ塩基配列を導入して得られるいわゆるシャトルベクタ
ーとして用いるのが良い。前記融合ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ塩基配列をシャトルベクターに組み込むこ
とにより遺伝子操作が容易になるばかりでなく、発現の
際に複数の種類の宿主細胞を用い得るという利点も得ら
れる。

上記シャトルベクターの具体例としてはｒｉ　ＫＫＯＩ
を例示できる。Ｉ）ＫＫＯｌは、枯草菌と大腸菌のそれ
ぞれの複製開始領域を有しておりいずれの菌においても
複製が可能である。該ベクター（プラスミド）ｐＫＫＯ
ｌを保持する枯草菌ＲＭ１２５株は通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所にｒＲＭｌ　２５　（ｐ　ＫＫ
Ｏｌ　）Ｊなる表示で、微工研条奇第９０１号（ＦＥＲ
ＭＢＰ−９０１＞として寄託されている。

かくして本発明のポリペプチド分泌発現ベクターが得ら
れるが、これを実際に宿主細胞に導入して目的ポリペプ
チドを分泌発現させるためには、該ベクターが他にプロ
モーター、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転
写終結因子等の転写調節因子や翻訳調節因子等を含んで
いることが好ましい。これらの各因子は、既に起源ベク
ターや上記シャトルベクター等に含まれている゛場合が
あり、この場合には例えばｐ８Ｒ３２２由来のβラクタ
マーゼの調節因子等をそのまま用いることができる。ま
た、これに限定されることなく、従来公知の他の微生物
又はウィルス由来の各種ＤＮＡもまた通常これらの調節
因子を含んでおり、従ってこれらを用いることもできる
。その例としては、例えば大腸菌ラクトースオペロン、
トリプトファンオペロン、λファージのＰＬ等のプロモ
ーター、βガラクトシダーゼのＳＤ配列等のりボゾーム
結合部位、λファージのｔＬｌ等の転写終結因子等を例
示できる。また翻訳停止シグナルとしては、ＴＡＡ、Ｔ
ＡＧ及びＴＧＡの３通の塩基配列を利用できる。更に上
記調節因子は、これらを含むＤＮＡより常法に従い取り
出した１麦、必要なものを適当なベクターに通常の方法
に従い導入することもできる。

本発明の発現ベクターにおいては、リボゾーム結合部位
（即ちＳＤ配列）として特に枯草菌で良く機能するＳＤ
配列を用いることが好ましく、その様なＳＤ配列として
は、下記第１表に示すものを例示できる（Ｃ０ｐ、１ｖ
ｌｏｒａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、　１ｖｌｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　１８６　：　３３９−３
４６（１９８２＞　＞。

これらのＳＤ配列は、いずれも本発明において目的ポリ
ペプチドを枯草菌で発現させるために用いることができ
るが、更に好ましい一例として本発明者が設計した式 ％式％（４） の塩基配列からなるＳＤ配列を挙げることができる。本
発明者は、このＳＤ配列及び開始コドンを含む式 ％式％ に示されるように枯草菌リボゾーム１６Ｓ　ＲＮＡの３
′末端部分と極めてよく対合するＳＤ配列を含み、好適
な塩基配列である。

上記式〔５〕の塩基配列は、化学合成法等により容易に
作成することができる。更にこの塩基配列は、（５’　
＞ＡＡＧＧＡＧＧＴ　（３’　）の配列を含むので、大
腸菌用ＳＤ配列としても好ましく用いることができる。

リボゾーム結合部位の導入は、枯草菌複製開始領域の導
入後に行なっても良いし、それに先立って行なっても良
い。例えば、βラクタマーゼのシグナルペプチドのＤＮ
Ａ塩基配列、βウロガストロン（目的ポリペプチド）の
ＤＮＡ塩基配列及びその翻訳停止シグナルが正確にこの
順序で配列されたＤＮＡ塩基配列を有している後記 ｐｔＪＧ２０１に、式〔５〕の塩基配列を含む後記オリ
ゴヌクレオチドＢ５−１及びＢ５−２を組み込むことに
よって、Ｉ）ＵＧ２０１の該シグナルペプチドのＤＮＡ
塩基配列の前にリボゾーム結合部位が導入されたベクタ
ー（プラスミド）ｐＫＫ１３が得られる。該ベクターＤ
ＫＫ１３を保持する大腸菌ＭＣ１０６０株はｒＭｃ１０
６０（ｐＫＫ１３）Ｊなる表示で、微工研条奇第９０４
号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−９０４＞として寄託されている
。

次いで、ベクターｐＫＫ１３のＥ　ＣＯＲＩ　／ｐｓｔ
■断片をシャトルベクターｐ　ＫＫＯｌに組み込むこと
により、本発明の発現ベクターの一例であるベクター（
プラスミド）ｌ）ＫＫＯ６が得られる。ベクターｐ　Ｋ
ＫＯ６は、式〔５〕で示されるリボゾーム結合部位と開
始コドン、βラクタマーゼのシグナルペプチドのＤＮＡ
塩基配列、βウロガストロン（目的ポリペプチド）のＤ
ＮＡｍ基配列及びその翻訳停止シグナルが正確にこの順
序で配列されたＤＮＡ塩基配列を有し、更にその後に１
）ＢＲ３２２に由来する転写終結因子を有している。該
ベクターｐＫＫＯ６を保持する枯草菌ＭＴ２株はｒＭＴ
２　（ｐ　ＫＫＯ６）Ｊなる表示で、微工研条奇第９０
２号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−９０２）として寄託されてい
る。

また、本発明の発現ベクターにおいては、プロモーター
として枯草菌に好適なものを用いることが好ましく、そ
の様なプロモーターとしては、枯草菌ファージ５ｐＯ２
の５ｐｏ２プロモーター、枯草菌α−アミラーゼ遺伝子
及びＶＥＧ遺伝子のプロモーター、バチルス・アミロリ
ケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ　）　ａ−アミラーゼ遺伝子のプロ
モーター、バチルス・リケニフオーミス（Ｂ、　Ｉｉｃ
ｋｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）ペニシリナーゼ遺伝子のプロ
モーター、プラスミドｐＣ１９４のＣＡＴ遺伝子のプロ
モーター、プラスミド１）Ｅ１９４のＭＬＳ耐性遺伝子
のプロモーター等を例示できる。しかし、これらに限定
されるものではなく、枯草菌において機能するプロモー
ターであれば、いかなるものも好適に用いることができ
る。これらのプロモーターは、大腸菌用のプロモーター
の標準配列（−３５領域ＴＴＧＡＣＡ、−１０領域ＴＡ
ＴＡＡＴ＞ときわめて類似しており、大腸菌中でも機能
し得ると考えられる。

プロモーターとして例えば５ｐｏ２プロモーターを選択
し、これをベクター１）ＫＫＯ６のリボゾーム結合部位
の前に導入することにより、本発明の発現ベクターの好
ましい一例であるベクター（プラスミド）ｐＫＫＯ７が
得られる。ベクター１）ＫＫＯ７は、ベクターｐＫＫＯ
６のリボゾーム結合部位の前に更に５ｐＯ２プロモータ
ーを有するものである。該ベクターｐ　ＫＫＯ７を保持
する枯草菌ＭＴ２株はｒＭＴ２　（ｐ　ＫＫＯ７）、Ｊ
なる表示で、微工朗条奇第９０３＠　（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−９０３）として寄託されている。

シグナルペプチドと目的ポリペプチドとの融合ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ塩基配列の前にプロモーター及
びリボゾーム結合部位を有し、且つ上記塩基配列を構成
する目的ポリペプチドのＤＮＡ塩基配列の直後に翻訳停
止シグナルを有し、更にその後に転写終結因子を有する
本発明の分泌発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入す
ることにより、該細胞を形質転換してポリペプチド分泌
発現型とすることができる。

本発明のポリペプチド分泌発現ベクターの宿主細胞への
導入は、公知の各種方法に従って行なうことができる。

宿主細胞としては、通常枯草菌を好適に使用できるが、
これに限定されるものではない。例えば前記シャトルベ
クターを用いて作成された本発明ベクターの宿主細胞と
しては、枯草菌のみならず大腸菌をも好適に使用できる
。之等の宿主細胞はいずれも菌体外分泌成分、外膜構成
成分等の、細胞の正常な機能維持に必要゛なポリペ、プ
チドの分泌のための機構としてシグナルペプチダーゼを
有しており、また各種微生物由来のシグナルペプチダー
ゼの基質特異性には殆んど差のないことが知られている
（Ｄ、　Ｐｅｒｌｍａｎ　　ａｎｄ　＠。

０、　Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ
ｌ、、　　１６７、３９１　（１９８３））。

上記宿主細胞への導入方法の具体例としては、枯草菌に
おいては、例えば宿主細胞のプロトプラス１へ懸濁液に
ベクターを添加後、ポリエチレングリコールを処理する
方法（Ｓ、　Ｃｈａｎｇａｎｄ　Ｓ。

Ｎ、　　Ｃｏｈｅｎ、　Ｍｏ１ｅｃ、　　Ｇｅｎ、　　
Ｇｅｎｅｔ、　　、　　１６Ｂ。

１１１　（１９７９））、大腸菌においては、例えば宿
主細胞を低温で塩化カルシウムを含む水溶液中で処理し
、該溶液中にベクターを添加する方法（Ｅ、　ｌ−ｅｄ
ｅｒｂｅｒｇ、　３．　Ｑｏｈｅｎ、　Ｊ。

３ａｃｔｅｒｉｏｌ、、１１９．１０７２　（１９７４
））を例示できる。

上記のようにして本発明ベクターを導入して形質転換し
た細胞を培養するときには、細胞内で融合ポリペプチド
が生産され、続いて細胞外又はペリプラズムに成熟ポリ
ペプチドが分泌蓄積される。

即ち、まず、ベクター中の融合ポリペプチドをコードす
る遺伝子から、ベクター中の転写調節因子並びに宿主細
胞中の諸因子の作用でｍ　ＲＮＡが生産される。次いで
、ｍ　ＲＮＡから翻訳調節因子並びに宿主細胞中の諸々
因子の作用で融合ポリペプチドが生産される。更にここ
で生産される融合ポリペプチドは、シグナルペプチドの
作用により、細胞外又はペリプラズムに分泌され、同時
にシグナルペプチダーゼの作用により、融合ポリペプチ
ドからシグナルペプチドが切り離されるのである。

その結果、シグナルペプチドも、また他の如何なる不要
なアミノ酸配列をも含まない成熟ポリペプチドが細胞外
又はペリプラズムに分泌、蓄積される。

かくして分泌、蓄積された成熟ポリペプチドは、これを
常法に従い分離することができ、また精製することがで
きる。この分離、精製操作としては例えば培養上澄又は
浸透圧ショック法により調整したペリプラズム画分から
、ゲルｊ濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適
宜組合せた方法を採用することができる。特に本発明に
従い得られる目的ポリペプチドは、成熟ポリペプチドし
て分泌されるものであるため、その分離、精製が比較的
容易である利点がある。

実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため参考例及び実施
例を挙げる。

尚、８例において用いられている各方法及び操作は、特
に明記しない限り、以下の通り行なわれたものである。

１、制限酵素によるＤＮＡの切断操作 ＤＮＡの水溶液（又はＴＥＦｔ衝液（１０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７，５＞、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ＞溶液）或いは
粉末に、下記第２表に示した各緩衝液の濃縮液及び水を
混和し、次いで制限酵素を加え、３７°Ｃの水浴中で３
時間静置して反応させる。

制限酵素の標準的使用量は、ＤＮＡ１μｑに対して１ユ
ニツトであり、最終液量は１０μＱとなるようにする。

第２表 組　　成　　　低塩濃度　生塩濃度　高塩濃度（ｍＭ）
　　　　緩衝液　　緩衝液　　緩衝液塩化ナトリウム　
　　　０　　　５０　　１００トリス塩酸 （ｐＨ７，５）　　　　　１０　　　１０　　　５０塩
化マグネシウム　　１０　　　１０　　　１０ジチオス
レイトール　　１　　　　１　　　１２、フェノール抽
出法 醇索反応の終了後、酵素を失活させ反応を停止させるた
めにこの抽出法を行なった。即ち、反応液に、その液量
の半量となるＴＥ飽和フェノール（１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
を含む１０ｍＭトリス塩酸（ｐ　Ｈ８，０）緩衝液をフ
ェノールに飽和させたもの〉を加えて充分混和した後、
同じく半量のクロロホルムを加えて更に混和し、次いで
遠心分離してＤＮＡを含む緩衝液層を取る。更に０．１
倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（りＨ５，Ｏ）と２倍
量の冷エタノールとを加えて混和して１、−２０℃で１
時間以上放置してＤＮＡを沈澱として回収することによ
りフェノールを完全に除去する。

３、ＤＮＡポリメラーゼエ（クレノー断片〉によるＤＮ
Ａのプラントエンド化方法 ４０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７，４＞、６ｍＭ塩化マ
グネシウム、１ｍＭβ−メルカプトエタノール、１ｍＭ
　　ＡＴＰ及び各１ｍＭのｄ　ＡＴＰ、ｄ　ＣＴＰ、ｄ
　ＧＴＰ及びｄＴＴｌ〕を含む水溶液中に、ＤＮＡを溶
かし、ＤＮＡ１μｇに対して１ユニツトとなる量のＤＮ
Ａポリメラーゼ■（クレノー断片、宝酒造Ｗ旧を加え、
１２°Ｃで３０分間反応させる。

４、Ｔａ　ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ断片の結合（環
状化）操作 ６６ｍＭトリス塩Ｍ（ｐ　Ｈ７，５＞、６．６ｍＭ塩化
マグネシウム、１０ｍ　Ｍジチオスレイトール及び１ｍ
Ｍ　　ＡＴＰに０．０１％の牛血清アルブミンを添加し
た水溶液中で、ＤＮＡ断片と、その１μｑ当り３ユニツ
トとなる量のＴａＤＮＡリガーゼ（宝酒造Ｕ製）とを、
１２°Ｃで５時間以上反応させることによりＤＮＡを結
合（環状化）させる。

５、形質転換方法　　　　。

形質転換には、大腸菌としてＨ８１０１株（３ｏｙｅｒ
、　＠、Ｗ、ａｎｄ　Ｄ、Ｒｏｕｌｌａｎｄ　−［）ｕ
ｓｓｏｉｘ、　Ｊ、　ＭＯｌ、１３ｉｏｌ　、　、　４
ユ、４５９（１９６９））及びＭＣ１０６０株（Ｍ、Ｊ
。

Ｃａ５ａｄａｂａｎ　　ａｎｄ　Ｓ、　　Ｎ、　　Ｃｏ
ｈｅｎ、　　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ　、、１３８．１７９　（１９８０））を、枯
草菌としてはＲＭ’１２５株（Ｔ、　Ｕｏｚｕｍｉ　ｅ
ｔ　ａｔ　。

Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　１５２．
６５（１９７７））及びＭＴ−２株（Ｍ、　Ｆｕｊｉｉ
　ｅｔａｌ、Ｊ、３ａｃｔｅｒｉｏ１．　、１５４．８
３１（１９８３））をそれぞれ使用した。

（１）大腸菌の形質転換 大腸菌Ｈ８１０１株又はＭＴ−２株を、ＬＢ培地（１％
バクトドリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、０
．５％塩化ナトリウム）で、３７°Ｃ下、６１０ｎｍの
吸光度が０．２５になるまで増殖させる。この培養液４
０ｍＱを遠心分離（６０００回転／分Ｘ１０分）して菌
体を回収し、次いで氷冷する。これを０．１Ｍ塩化マグ
ネシウム２０ｍＧで洗浄し、続いて氷冷した０、１Ｍ塩
化カルシウム及び０．０５Ｍ塩化マグネシウム溶液２０
ｍｆ２に懸濁させ、１時間氷冷する。遠心弁１（６００
０回転／分Ｘ１０分）後、菌体を氷冷した０、１Ｍ塩化
カルシウム及び０．０５Ｍ塩化マグネシウム溶液２鵬に
再懸濁させる。この懸濁液０．２ｎ１２に、ＴＡ　ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させたＤＮＡ断片の反応組成液
０．０１ｍ２を加え、１時間氷冷する。次いで４２．５
°Ｃの水浴で９０秒間加温し、ＬＢ培地２．３ｍ１２を
加え、これを３７℃の水浴中で１時間静置する。

次に、得られる形質転換株を以下の抗生物質耐性で選択
する。即ち、１．５％寒天を含むＬＢ培地にアンピシリ
ン５０μ（Ｊ／ｍＱ、テトラサイクリン２０μｇ／ｍＱ
又はカナマイシン１０μＱ／ｍＱを添加して調整した平
板培地に、上記で得た反応組成液の溶液台０．３１１１
１２ずつを拡げ、これを３７°Ｃで一晩培養し、生育す
る大腸菌コロニーを分離する。

（２）枯草菌の形質転換法 枯草菌ＲＭ１２５株又はＭＴ−２株を、ＩＢ培地中で３
０’Ｃ，１夜前培養する。５０ｍ１２のＬＢ培地に前培
養１ｍ１２を接種し、３０’Ｃ，３時間壁どう培養する
。遠心分離（７０００回転／分×５分）により集菌し、
これを５ｍ１２のＳＭＭＰ溶液１：０．５Ｍショ糖、２
０ｍＭ’？レイン酸ナト’）つＬ　（ｐＨ６，５）　、
２０ｍＭ塩化マグネシウム、０．３５％ペンアッセイブ
ロース（Ｓｉｇｍａ社製）〕に懸濁する。これに１０ｍ
ｇのりゾチームを加え、４２°Ｃ１１時間インキュベー
トする。９９％以上の細胞がプロトプラスト化したこと
を顕微鏡下（Ｘ４００）で確認した後、遠心分離（３０
００回転／分Ｘ１５分）により集菌する。５ＴＩＩＱの
Ｓ　Ｍ　Ｍ　Ｐ溶液で１回洗浄した後、５ｍＱのＳＭＶ
Ｐ溶液に懸濁する。この懸濁液０．５ｍＧと１〜１００
ｇのＤＮＡを含む水溶液０．１ｍ１２を混合後、１．４
ｍ１２のポリエチレングリコール溶液（４０％ポリエチ
レングリコール６０００　（和光純薬味製）、０．５Ｍ
ショ糖、２０ｍＭマレイン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）
、　２０ｍＭ塩化マグネシウム）を加え、２分間インキ
ュベートする。これに５ｍ１２のＳＭＭＰを加え遠心分
離（３０００回転／分×１５分）して得たプロトプラス
トを１　ｍＱのＳＭＭＰ溶液に懸濁し、３０’Ｃ１９０
分間静置する。懸濁液をＳＭＭＰ溶液で１０〜１０００
倍希釈した後、０．２ｍＱを第３表に示ず組成のＤＭ３
倍地上に拡げ、２５°Ｃで３〜４日間培養し、生育した
枯草菌コロニーを分離する。形質転換体の選択に用いる
カナマイシンは３００ＤＤｍという高濃度で供試する。

これは、ＤＭ３培地に含まれる高濃度のコハク酸ナトリ
ウムのため、カナマイシンの効力が現われにくいためで
ある（Ｓ、　Ｃｈａｎｇａｍｄ　　Ｓ、　Ｎ、Ｃｈｏｅ
ｎ。

Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　、　１６８．１１１
−１１５（１９７９））。

第　　　３　　　表 コハク酸ナトリウム　　　　１３５．１ｇ／Ｑカザミノ
酸　　　　　　　　　　　５．Ｏ〃バクトイーストエキ
ス　　　　　５．Ｏｒ！ブドウ糖　　　　　　　　　　
　５．Ｏ〃リン酸−カリウム　　　　　　　１．５ｒｌ
リン酸二カリウム　　　　　　　３．５　〃塩化マグネ
シウム　　　　　　　４．１　ｌノウシ血清アルブミン
　　　　　　０．１　〃寒　　　天　　　　　　　　　
　　　　　　　８．Ｏ〃６、プラスミドの単離 プラスミドを保有する大腸菌株を、アンピシリン（５０
μＱ／ｍＱ）、テトラサイクリン（１５μＱ／噌）又は
カナマイシン（１０μｇ／　ｍＱ　＞を添加した５００
ｍＱのＬＢ培地で３７℃、−夜振どう培養する。菌体を
遠心分離（７０００回転／分Ｘ５分）で集め、リゾチー
ム用緩衝液（（５０ｍＭブドウ糖、１０ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ、２５ｍＭトリス塩１　（１１８，０＞）で１回洗浄
した後、同一緩衝液１０ｍ１２に懸濁し、リゾチーム１
０ｍｏを添加する。これを水冷下に３０分間放置した後
、アルカリＳＤＳ溶液（０，２Ｎ水酸化ナトリウム、１
％ラウリル硫酸ナトリウム＞２０ｍＧを加え、静かに１
党；”ｊモした後、水冷下に５分間放置する。次に３Ｍ
１ｌ！ｒ￥酸ナトリウム溶液（ｌｆ４．８＞を１５ｍＱ
加え、静かに撹拌した後、水冷下に６０分間放置する。

反応液を遠心分離（９０００回転／分×２０分）し、得
られた上清に冷エタノール（−２０’Ｃ）１００ｍ１２
ｅ加え、−７０″Ｃｋ：３０分間以上放置する。遠心分
離（９０００回転／分Ｘ３０分）によって得られた沈澱
を、減圧下でエタノールを除いた復、０．１Ｍ１Ｍナト
リウム−５０ｍＭト１．／ス塩酸緩衝液（ｐｌ−１８，
０＞１０ｍ１に溶解する。これに冷エタノール（−２０
℃＞４０ｍＱを加え、−７０’Ｃに３０分間以上放置す
る。

遠心分離（１２０００回転／分Ｘ３０分）にょって１ｑ
られた沈澱から、減圧下でエタノールを除いた後、沈澱
を８ｍＱのＴＥ緩衝液に溶解し、これに塩化セシウム９
．２４０及びエチジウムプロミド溶液（５ｍＭｍ＋２＞
０．８４ｍＱを加える。塩化セシウムを完全に溶解させ
た後、これを２本のクイックシールチューブ（ベックマ
ン社製、１／２Ｘ２インチ）に充填し、ＶＴｉ６５０−
ター（ベックマン社製）を用いて、１５℃、５００００
回転／分で１２時間以上超遠心を行なう。かくして分離
されるプラスミドを含むバンドをチューブから（友取り
、ついで５Ｍ塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液で飽和し
たイソプロパツールを用いてエチジウムプロミドを除去
する。最後に、バイオゲルＡ３０ｍカラムクロマトグラ
フィーにより、プラスミドをＲＮＡ、塩化セシウム等か
ら分Ｎｌ・精製する。

なお、枯草菌からのプラスミドの単離は、リゾチーム緩
衝液として５ＥＴＩ街液Ｃ２０％ショ゛糖、５０ｍＭ　
　ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス塩ｍ　（ｐＨ７，６）〕を
用い、リゾチーム濃度を２倍とした以外は、大腸菌の場
合と同様でめる。

７、オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドの合成は、下記に示す同相合成法（
同相リン酸トリエステル法）により行なった（Ｈ，Ｉｔ
ｏ　　ｅｔ　　ａｌ、　Ｎｅｃｌｅｉｃ　　ＡＣｉｄＳ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０．１７５５−１７６９（１９Ｂ
２＞）。

即ち、まず１％架橋ポリスチレン樹脂５−Ｘｌ（２００
〜４００メツシユ、バイオラドラボラトリーズ社製）を
アミノメチル化したものと、５′−０−ジメトキシトリ
チルヌクレオシドのモノコハク酸エステルとを反応させ
て、ヌクレオシド担持樹脂を得る。次に、バーチエム社
！ｕＤＮＡ合成機を用いて以下の操作を行なう。

上記樹脂４０ｍ（Ｉｔを反応管に入れ、１Ｍ臭化亜鉛の
ジクロロメタン−イソプロパツール（８５：１５）溶液
を用いて５′位のジメトキシトリチル基を脱離させる。

次に完全に保護されたジスクレー／１チト（Ｃ１［３ｒ
ｏｋａ　　ｅｔ　　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１
ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、旦、５４６１−５４７１　（１
９８０）の方法により調製した〕のトリエチルアンモニ
ウム塩５０ｍｇを加え、縮合剤（メシチレンスルホニル
−５−ニトロトリアゾール）を用いて縮合させる。以上
の操作を繰返して、順次鎖長をのばして、保護されたオ
リゴヌクレオチドを担持した樹脂を得る。尚、最後の縮
合工程では、必要に応じてジヌクレオチドの代りに、前
記文献に記載の方法により調製されるモノヌクレオチド
のトリエチルアンモニウム塩２５ｍｃ＋を使用する。

次に０．５Ｍピリジンカルドキシメートのピリジン−水
（１：１）溶液を用いて、保護されたオリゴヌクレオチ
ドを樹脂から脱離させる。これをセファデックスＧ−５
０カラム（ファルマシア社製、２Ｘ１００ｃｍ）で、更
に高速液体クロマトグラフィー（ポンプ：ウォーターズ
社製６０００Ａ型、検出器：４４０型デイテクター、カ
ラム；マイクロボンダーパック０１８、溶出溶媒；（５
→４０％）アセトニトリル−０，１Ｍ酢酸トリエチルア
ンモニウム水溶液）で精製する。次に８０％酢酸により
脱保護反応を行ない、再度高速液体クロマトグラフィー
により単一ピークになるまで精製する。この高速液体ク
ロマトグラフィーの条件は、溶出溶媒として（５→２５
％）アセトニ１〜リルー０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモ
ニウム水溶液を用いる以外は、上記と同一とする。

８、ＤＮＡ塩基配列の分析 ＤＮＡ塩基配列の分析は、メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ＞
の方法〔Ｍ２Ｓ法、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、、　１０１　。

２０　（１９８３））に従い、以下のように行なった。

即ち、まずＤＮＡ断片を制限酵素により切り出し、１％
アガロースゲル電気泳動により分離する。このＤＮＡ断
片をＭ１３ｍｌ）８ＲＦ（アマ−ジャム社製）をベクタ
ーとしてクローニングする。

得られる組換えファージＤＮＡをマンデル（Ｍａｎｄｅ
ｌ　）とヒガ（Ｈｉｇａ＞の方法（Ｊ。

１ｖｌｏｌ、Ｂｉｏｌ、、５３，１５４　（１９７０）
）により、大腸菌ＪＭ１０７株へ形質導入する。この菌
体懸濁液０．２ｍＱに、２５ｍｇ／ｍｉ２のイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトシド２５μＱ及び２０ｍ（１
／ｍＱの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトシド４０μＱを加え、次いで加熱溶解さ
せた後、５０’Ｃで保温したＨ−トップアガー液（１％
バクトドリプシン、０．８％塩化ナトリウム及び０．５
％寒天＞３ｍ１２を加え、１．５％寒天を加えて固化さ
せた２ＸＴＹ培地（１，６％バタトトリプトン、１％ｕ
ｆｍエキス及び０．５％塩化ナトリウム）の平板に重層
し、３７℃で一晩培養する。ＤＮＡ断片の挿入された組
換えファージは無色のプラークを生じるのに対し、親株
のＭ１３ｍｌ）８は青色のプラークを生じるので、目的
の組換えファージは容易に選別できる。

次に単一の無色プラークをパスツールピペットにて取り
出し、これとＪＭ１０３株の培養液０．０１ｍＱとを２
ＸＴＹ培地１　ｒｎＱに加え、約５時間、３７℃で振盪
培養して組換えファージを増殖させる。培養後、遠心に
て菌体を除き、上清に２０％ポリエチレングリコール６
０００の０．２噌を混合し、室温で１５分以上静置した
後、遠心にて沈澱するファージを集め、フェノール抽出
によって、ファージから一本ＩＮ　Ｄ　Ｎ　Ａを抽出し
、これを鋳型−重鎖ＤＮＡとして用いる。

鋳型−重鎖ＤＮＡとプライマー（宝酒造■製、Ｍｌ３の
１５塩基プライマー）とのそれぞれ０．５ｐｍｏｌずつ
を混合し、６０℃で２０分間熱処理後、徐冷する。次に
この混合液にα３２Ｐ−ｄ　ＣＴＰ　（アマジャム社製
、４００Ｃｉ　／ｍ　ｍｏｌ　）２μＱとＤＮＡポリメ
ラーゼ■（クレノー、宝酒造■製）２ユニツトとを加え
、充分に混合した後、その３．２μＱずつを、下記第４
表に示した４種のｄ　ＮＴＰ−ｄｄＮＴＰ混合液のそれ
ぞれ２μＱを含む反応管に加える。室温で２０分間反応
させた後、チェース反応液（ｄ　ＡＴＰ、ｄ　ＣＴＰ、
ｄ　ＧＴＰ及びｄＴＴＰの各１ｍ　Ｍ＞（７）１μＱを
それぞれに加え、更に２０分間反応させる。ホルムアミ
ド停止液（９５％Ｖ／Ｖホルムアミド、０．１％キシレ
ンシアツール及び０．１％ブロムフェノールブルー）を
６μＱずつ加え、９５°Ｃで３分間加熱した後、急冷す
る。次にサンプル２μＱずつを６％又は８％ポリアクリ
ルアミドゲルに重層し、電気泳動（１８００Ｖ、３０ｍ
Ａ、２〜３時間）を行なう。泳動後、ゲルを２戸紙（ワ
ットマン３ＭＭ＞に移し、ゲル乾燥器にて乾燥し、オー
トラジオグラムをとり、ＤＮＡ塩基配列を解読する。

第　　４　　表 ｄ　ＮＴＰ−ｄｄＮＴＰ混合液組成　（μＱ）但し第４
表中、ｄｄＡはジデオキシアデノシンを、ｄｄｅはジデ
オキシシチジンを、ｄｄＧはジデオキシグアノシンを、
またｄＣＩＴはジデオキシチミジンをそれぞれ示す。

９、アガロースゲル電気泳動 シュライフ（Ｓｃｈｌｅｉｆ）とウエンシンク（Ｗｅｎ
ｓｉｎｋ）の手引書（”Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ”　（１９８１）。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ｐｐ１１４−１２
５）に記載の方法に従って、アガロースゲル電気泳動及
び泳動後のゲルからのＤＮＡ断片の分離を行なう。

泳動用電源としては、アトー社製コンスターパワー５Ｊ
１０６５型を、泳動槽としては１２Ｘ１５ｃｍのプラス
チック製水槽（白金電極イ」）を、アガロースとしては
アガロースエ（同転化学研究所製）を、また泳動用緩衝
液としては４０ｍＭトリス塩ｍ　（５ｍ　Ｍｌ、ナトリ
ウム及び１ｍＭ　　ＥＤ丁Ａ含有、ｐＨ７，９＞をそれ
ぞれ用いる。

１０、ポリアクリルアミドゲル電気泳動上記手引書の第
７８−８７頁及び第１１４−１２５真に記載の方法に従
い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び泳動後のゲル
からのＤＮＡ断片の分離を行なう。泳動用電源としては
、アトー社製コンスターパワー５Ｊ１０６５型を、泳動
漕としてはアト−社製５Ｊ１０６０ＳＤ型を用いる。

アクリルアミド溶液として、アクリルアミドとＮ。

Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド（２９：１”）との
水溶液を、重合促進剤としてＮ、Ｎ、Ｎ’　。

Ｎ′−テトラメヂレンエチレンジアミンを、重合１ｉ７
１！煤として過硫酸アンモンをそれぞれ用いる。また泳
動用緩衝液として９０ｍＭトリスｊ甚酸（９０ｍ　　Ｍ
ｌ酸、　　２．　　５ｍＭ　　　　ＥＤＴＡ　含イ■、
　ｐ　　Ｈ８，３）を用いる。

参考例１ 分泌発現用ベクターｏ　ＧＨ５４及びｐＧＨ５５の構築 （Ａ＞　　中間体プラスミド１）ＧＨ５３の構築プラス
ミドｐＧＨ５３を１ｑる工程を第１図に示した。

■　大腸菌のβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドの一
部をコートづるＤＮＡ塩早配列を有するオリゴヌクレオ
チドの合成のために、以下の塩基配列を有する４種のオ
リゴヌクレオチドのそれぞれを、前記した固相リン酸ト
リエステル法により合成した。

＜１＞　　　（５’　　）ＣＧＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＧ
ＣＣＴＴＣＣ丁ＧＴＣ（３’） 〈２〉　　　　　丁丁ＣＧＣＧＡＡＣＴＣＡＧＣＧＣＡ ＜３＞　　　　　　　　ＧＣＴＧＡＧＴＴＣＧＣＧＡＡ
ＡＣＡＧ ＜４＞　　　　　　ＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣ
ＧＡＴ 上記オリゴヌクレオチド〈２〉及び〈４〉の５′端をそ
れぞれＴ４ボリヌクレオチジルキナーゼ（ＢＲＬ社製）
を用いてリン酸化した。即ち、各々１０μ９のオリゴヌ
クレオチドを５０ｍＭトリス塩酸水溶液（１０ｍＭ塩化
マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　　
ＡＴＰを含む、Ｄ　Ｈ９，５＞５０μＱに）容かし、こ
れに丁４ボリヌクレオチジルキナービ５ユニットを加え
、３７°Ｃで３０分間反応さけ、フェノール抽出により
反応を停止させた。

■　クローニングベクターとして、プラスミドｐＢＲ３
２２（Ｂｏｌｉｖａｒ　　ｅｔ　　ａｌ、　Ｑｅｎｅ　
、　２゜９５−１１３　（１９７７））を利用した。

該プラスミド１）ＢＲ３２２の１０μｑを、制限酵素Ｐ
ｓｔＩ（宝酒造（体製）とＰｖｕ工（ＮＥ８社製）とを
用いて高塩濃度緩衝液中で切断し、１．０％アガロース
ゲル電気泳動を行ない、約４．２４ＫｂのＤＮＡ断片を
分離した。

■　上記■で得たＤＮＡ断片を、上記■で調製されたリ
ン酸化したオリゴヌクレオチドく２〉及びく４〉並びに
リン酸化していないオリゴヌクレオチド〈１〉及び〈３
〉のそれぞれ約１μ０ずつと合せて、Ｔ４　ＤＮＡリガ
ーゼで結合反応させた。

反応終了後、この反応組成液で大腸菌に一１２株由来の
Ｈ８１０１株を形質転換させた。得られたテトラサイク
リン耐性を示す形質転換株の中から１株を選び、これか
らプラスミドを単離し、目的のｐＧＨ５３を得た。

得られたｐ　ＧＨ５３は、１．０％アガロースゲル電気
泳動の結果、４．３Ｋｂの大きざを有しており、そのＤ
ＮＡ塩基配列をＨ１３法により分析した結果、ｆ）ＢＲ
３２２のＰｓｔＩ及びＰＶｕ■の両１１ｉ１Ｊ限サイト
間が欠失し、代りに下記式〔７〕に示すように、オリゴ
ヌクレオチドく１〉、〈２〉、〈３〉及びく４〉が挿入
されていることが確認された。

該１）ＧＨ５３は、通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所にｒＨＢｌｏｌ　（ｐ　ＧＨ５３）Ｊなる表示
で微工研条奇第６７８号（ＦＥＲＭＢＰ−６７８＞とし
て寄託されている。

（Ｂ）　　分泌発現用ベクター１）ＧＨ５４の構築ベク
ターｐＧＨ５４を得る工程を第２図に示した。

■　上記（Ａ＞で得たｐＧＨ５３の１０μｑを制限酵素
ＮａｅＩ（ＮＥＢ社製）及びＡｖａ■（宝酒造■製）を
用いて生塩濃度緩衝液中で切断し、次いで１．０％アガ
ロースゲル電気泳動を行なって、約２．２２ＫｂのＤＮ
Ａ断片（△）を分離した。

この断片は、合成オリゴヌクレオチド由来のＤＮＡ配列
の大部分とプラスミドの複製開始領域を含んでいる。

■　ｐＢＲ３２２を制限酵素Ａ　ｖａ、Ｉ及びト１ｉｎ
ｄＩＩＩ（いずれも宝酒造■製）で、生塩濃度緩衝液を
用いて切断し、１．０％アガロースゲル電気泳動を行な
って、約１．４０ＫｂのＤＮＡ断片ＣＢ＞を得た。

この断片には、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ターの一部とテトラサイクリン耐性の構造遺伝子の全て
が含まれている。

■　ｐ　ＢＲ３２２の２０ｕｇを制限酵素ＦｎｔＪ４Ｈ
１（ＮＥＢ社製）で低塩濃度緩衝液を用いて切断し、次
いでＳ１ヌクレアーゼによりＤＮＡ断片末端の突出塩基
を分解除去した。これはフェノール抽出後のＤＮＡを６
ｍＭ酢酸ナトリウム、４０ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍ
Ｍ硫酸亜鉛緩衝液（１）Ｈ４，５＞１ｍｆ２に溶かし、
これに２０００ユニツトの８１ヌクレアーゼ（ＢＲＬ社
製）を加えて２０’Ｃで３０分間反応させることにより
行なった。次いで、フェノール抽出後の、ＤＮＡを制限
酵素Ｈｉｎｄ■で生塩濃度緩衝液を用いて切断し、６％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、約０．２８
ＫｂのＤＮＡ断片＜Ｃ＞を得た。

この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リボ
ゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードする遺伝子
の一部の他、デ１〜ラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ターの一部が含まれている。

■　上記で１ｑだ３つの断片（Ａ）、＜８＞及び（Ｃ）
を、Ｔａ　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応後
、この反応組成液でＨ８１０１株を形質転換した。得ら
れたテトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中から１
株を選びプラスミドを単離した。かくしてＩ）ＧＨ５４
を１ｑた。

ｐＧＨ５４は、Ｍ１３法による塩基配列分析の結果、β
ラクタマーゼのプロモーター及びリボゾーム結合部位に
続いてシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を
有し、この塩基配列の３′末端の上流側にＮｒｕ■及び
下流側にｐｖｕ［のそれぞれの制限酵素認識配列を有し
ていることが確認された。

ｐＧＨ５４は、前記した通り約３．９Ｋｂの大きざ及び
第２図に示す制限酵素開裂地図により特、ｙｉ付けられ
、またＭ１３法による塩基配列分析の結果、前記式（３
）に示した塩基配列によりコードされるβラクタマーゼ
シグナルペプチドの遺伝子を有することが確認された。

このプラスミド１）ＧＨ５４を保有する大腸菌Ｈ８１０
１株は、ｒＨＢｌｏｌ　（ｐＧＨ５４）Ｊなる表示で、
微工研条奇第６７９号（ＦＥＲＭＢＰ−６７９＞として
寄託されている。

（Ｃ）　　分泌発現用ベクターｐＧＨ５５の構築ベクタ
ーｐＧＨ５５を１７る工程を第３図に示した。

■　１）ＢＲ３２２のＡＶａＩ及びｐｖｕ［制限サイト
間の塩基配列を欠失ざＶたプラスミドで必るＩ）ＢＲＩ
−４０２を次の操作により作成した。即ちｐ　ＢＲ３２
２の５μＱを、生塩濃度緩衝液中で、制限酵素△ｖａ■
及びＰＶｕＩＩ（いずれも宝酒造■製）で切断し、フェ
ノール抽出後、ＤＮＡポリメラーセ■（クレノー断片、
宝酒造■製）で切断断片をプラントエンド化した。次に
１．０％アガロースゲル電気泳動で約３．７２ＫｂのＤ
ＮＡ断片を分離し、この断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで環
状化させた。反応終了後、この反応組成液でＨ８１０１
株を形質転換し、得られるアンピシリン耐性及びテトラ
サイクリン耐性を示す形質転換株の中から一株を選択し
てプラスミドを単離し１）ＢＲＨＯ２を得た。１ｑられ
たｒ：）ＢＲＨＯ２はｐＢＲ３２２とは異なって、ＡＶ
ａＩでもｐｖｕＩ［でも切断されなかつた。

■　上記■で得たｐ　ＢＲＨＯ２の５μｇを制限酵素ｐ
ＳｔＩ及びＢａｍＨＩ（いずれも宝酒造（体製）を用い
て生塩濃度緩衝液中で切断し、次いで１．０％アガロー
スゲル電気泳動を行なって、約２．６０ＫｂのＤＮＡ断
片＜Ｄ＞を分離した。

この断片は、テトラサイクリン耐性遺伝子の一部及びプ
ラスミドの複製開始領域を含んでいる。

■　Ｉ）ＧＨ５４の１０μｇを制限酵素ＰｓｔＩ及びＢ
ａｍＨＩで生塩濃度緩衝液を用いて切断し、次いで１．
０％アガロースゲル電気泳動を行ない、約０．６６Ｋｂ
のＤＮＡ断片＜Ｅ＞を得た。

この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リボ
ゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列及びテ１〜ラサイクリン耐性遺伝子の一部が含まれ
ている。

■　上記で得た２つの断片（Ｄ）及び＜Ｅ））を、Ｔａ
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応後、この反応
組成液でＨ８１０１株を形質転換した。

得られたテトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中か
ら１株＠選びプラスミドを単離した。かくしてｐＧＨ５
５を得た。

１）ＧＨ５５は、上記第３図に示される制限酵素開裂地
図により特徴イ」けられ、１．０％アガロースゲル電気
泳動の結果、約３．３Ｋｂの大きざを有していた。また
該ｐＧＨ５５は、Ｍ１３法による塩基配列分析の結果、
ｆ）ＧＨ５４における第２のｐｖｕ［制限サイトを含む
約０．６４ＫｂのＤＮＡを欠く以外は、該ｐＧＨ５４と
同様でおり、その第１のｐｖｕ［制限サイトは、シグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列の３′末端の近
傍に存在していることが確認された。

このプラスミドｐＧＨ５５を保ＮＴｊる大腸菌１（８１
０１株は、　　［ト（８１０１（ｐＧ　ト（５５）Ｊな
る表示で、微工研条奇第６８１　（ＦＥＲＭＢＰ−６８
０＞として寄託されている。

参考例２ シグナルペプチド−βウロガストロン融合ポリペプチド
をコードするＤＮＡ塩基配列を有するベクターの構築 （Ａ）　　βウロ力ストロンをコードするＤ　Ｎ　Ａ　
ｈ＝基配列の合成 この塩基配列は、グレゴリ−（Ｈ，Ｇｒｅｃ＋ｏｒｙ）
により報告されたアミノ酸配列（Ｎａｔｕｒｅ、　２５
７　。

３２５−３２７　（１９７５））を参考にして、まずβ
ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配列の前後に開
始フトン、終止コドン及び制限酵素認識部位を付加して
なる下記第５表に示すＤＮＡ塩基配列を構築することよ
り行なった。このＤＮＡ塩基配列は、本発明者らにより
既に特願昭５９−１３７６９１号として特許出願されて
いる。

第　　５　　表 ＧＴＧ　　ＣＴＧ　　ＣＣＡ　　ＣＡＡ　　ＡＣＧ　　
丁ＡＣＡＴＧＡＴＣＧＡＡ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　
ＡＡＡ　ＴＡＣＴＡＧ　ＣＴＴ　ＣＧＡ　ＡＡＣＣＴＡ
　ＴＴＴ　ＡＴＧＧＣＧ　ＴＧＴ　ＡＡＣＴＧＴ　ＧＴ
Ａ　ＧＴＧ　ＧＧＴＣＧＣＡＣＡ　ＴＴＧ　ＡＣＡ　Ｃ
ＡＴ　ＣＡＣＣＣＡＴＡＴ　ＡＴＣＧＧＴ　ＧＡＡ　Ｃ
ＧＣＴＧＴ　ＣＡＡＡＴＡ　ＴＡＧ　ＣＣＡ　ＣＴＴ　
ＧＣＧ　ＡＣＡ　ＧＴＴＴＡＣＣＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＧ
　ＡＡＡ　ＴＧＧ　ＴＧＧＡＴＧ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　Ｇ
ＡＣＴＴＴ　ＡＣＣＡＣＣＧＡＡ　ＴＴＧ　ＣＧＴ　Ｔ
ＡＡ　ＴＡＧ　ＴＧＡ　ＡＧＡＣＴＴ　ＡＡＣＧＣＡ　
ＡＴＴ　ＡＴＣＡＣＴ　ＴＣＴＴＣＴＧ　　３’ ＡＧＡ　ＣＣＴ　ＡＧ　５’ （Ｂ）　　βウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配
列を保有するプラスミドの構築 ■　ｆ）ＢＲ３２２の１０μｇを、まず高塩濃度緩衝液
中でＥＣ０ＲＩ（宝酒造■製）と［３ａｍＨＩとで切断
し、次いで１．０％アガロースゲル電気泳動を行ない、
約３．９９ＫｂのＤＮＡ断片を単離した。

■　上記■で得たＤＮＡ断片と、上記（Ａ＞で得たβウ
ロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配列とを、ＴａＤ
ＮＡリガーゼで結合ざぜた。反応後、反応組成物でＨ８
１０１株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性を示
す形質転換株の中から一株を選びプラスミドを単離した
。かくしてβウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配
列をｐＢＲ３２２のＥＣ０ＲＩ及びＢａｍＨＩ制限サイ
ト間に挿入されたプラスミドｐＵＧ３を得た。

このプラスミドｐ　ｔＪＧ３を保有するＨ８１０１株は
、ｒＨＢｌ　０１　（１）ＵＯ３）ｊなる表示で微工研
条奇第５４３＠（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５４３＞として寄
託されている。

（Ｃ）　　ｐ　ＵＧ２０１の構築 プラスミドＩ）ｔＪＧ２０１を得る工程を第４図に示し
た。

上記（Ｂ）で得たｐ　ＵＯ３を制限酵素ト１ｉｎｔ　Ｉ
で切断して得られるＤＮＡ断片を、ｐＧＨ５５のｐｖｕ
［制限サイトに挿入して、シグナルペプチド−βウロガ
ストロン融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
を含む分泌発現ベクターで必るｐ　ｔＪＧ２０１を、以
下の方法により構築した。

■　Ｉ）ＵＯ３の１５μｇを、高塩濃度緩衝液中でＨｉ
ｎｆ　Ｉ　（宝酒造（体製）で切断し、フェノール抽出
後、ＤＮＡポリメラーゼ■（クレノー断片）で切断断片
をプラントエンド化した。次いで６％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行ない、約０．４２ＫｂのＤＮＡ断片
（Ｆ）を単離した。

この断片には、βウロガストロンをコードするＤＮＡ塩
基配列（翻訳停止コドンを含む）のうち５′端の７塩基
を除く塩基配列が含まれていた。

■　ｐＧＨ５５は、βラクタマーゼのシグナルペプチド
をコードするＤＮＡ塩基配列の後に、βウロガストロン
のＮ端領域をコードする最初の７１囚のＤＮＡ塩基配列
が直結し、且つその直後で制限酵素ｐｖｕ［により切断
されるように構成されたＤＮＡ塩基配列を有するもので
あり、該Ｉ）ＧＨ５５の５μ９を中塩ａ度＠衝液中で、
ＰＶＩＪＩ［で切断して、約３．２６ＫｂのＤＮＡ断片
（Ｇ）を得た。

この断片は、ｐＧＨ５５の全ての遺伝情報を有している
。

■　上記■で得た断片＜Ｆ＞の約１μｑと、上記■で得
た断片＜Ｇ＞の約０．５（＋とをＴａＤＮＡリガーゼで
結合させた。反応後、この反応組成液でＨ８１０１株を
形質転換し、得られるテトラサイクリン耐性の形質転換
株の中から一株を選び、プラスミドｐＵＧ２０１を単離
した。

ρＵＧ２０１は、１．０％アガロースゲル電気泳勤の結
果、約３．７Ｋｂの大きざを有していた。

これをＢａｍ）−ＩＩ又はｌ−１ｉｎｄｌｌで切断する
と、それぞれ２種類のＤＮＡ断片が得られることから、
該ｏ　ＵＧ２０１にはβウロガストロン遺伝子が含まれ
ていることが判り、また該断片の大きざを調べた結果よ
り、目的のプラスミドで必ることか判った。更に、ｌ）
ＵＧ２０１について、βラクタマービのプロモータ一部
分からβウロガストロン遺伝子までを含むＤＮＡ断片の
塩基配列を、Ｍ１３法による塩基配列分析により調べた
。その結果、該ＤＮＡ塩基配列は下記第６表の通りでお
り、１）ＵＧ２０１がβラクタマーゼのプロ［一ター、
リホゾーム結合部位並びにβラクタマーゼのシグナルペ
プチドをコードする塩基配列及びβウロガストロンをコ
ードする塩基配列（融合ポリペプチドをコードする塩基
配列〉が、正確にこの順序で配列されていることか確認
ざれた。また第６表にはＤＮＡ塩基配列に対応するアミ
ノ酸配列も併記する。

上記１）ＵＧ２０１は、これを大腸菌トＩＢ１０１に保
有ざぜ、この保有株をｒＨＢ１　０１　（１）ＧＨ２０
１）Ｊなる表示で通商産業省工業技術院微生物工業研究
所に奇託されている。その寄託番号は、微工研条奇第６
８１号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−６８１＞である。

第　　６　　表 ＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧ
Ａ丁ＡＣＧＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣＧＧ
ＡＧＣＡＣ下ＡＴＧＣＣＣＴＡＴＴＴ丁ＴＡＴＡＧＧＴ
ＴＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴ
ＡＴＣＣＡＡＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＡＴＴＡＡＡＴＧＧ
ＴＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧ丁ＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴ
ＴＴＡＣＣＡＡＡＣＡＡＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＡＣＣＧ
丁ＧＡＡＡＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧ下ＧＣＧＣＧＧＡＡ
ＣＣＣＣＴＡＴ下ＴＧＡＧＣＣＣＣ丁Ｔ丁ＡＣＡＣＧＣ
ＧＣＣ丁丁ＧＧＧＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＧ
Ａ丁ＴＴＡＴＧＴＡＡＧ丁丁丁ＡＴＡＣＡＴＡＧＧＣＧ
ＡＧＴＡＣＴＣＴＧＴＴＡＴＴＧＧＧＡＣＴＡＴ下ＴＡ
ＣＧＡＡＧＴＴＡ丁ＴＡＴＡＡＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣ
ＴＣＡＴＧＣ　　ＣＣＡ　　ＣＴＧ　　ＴＣ丁　ＣＡＣ
　　ＧＡＴ　　ＧＧＣＴＡＴ　　丁Ｇ丁　Ｃ丁Ｇ　　Ｃ
ＡＣ　　ＧＡＣ　　ＧＧＴ　　ＧＴＴＴＧＣ　　ＡＴＧ
　　ＴＡＣ　　ＡＴＣ　　ＧＡＡ　　ＧＣＴ　　Ｔ丁Ｇ
ＧＡＴ　　ＡＡＡ　　ＴＡＣ　　ＧＣＧ　　ＴＧＴ　　
ＡＡＣ　　ＴＧＴＧＴＡ　　ＧＴＧ　　ＧＧＴ　　ＴＡ
Ｔ　　ＡＴＣ　　ＧＧＴ　　ＧＡＡＣＧＣ　　工ＧＴ　
　ＣＡＡ　　ＴＡＣ　　ＣＧＴ　　ＧＡＴ　　ＣＴＧ参
考例３ １）ｔＪＧ２０１を保有する大腸菌による成熟βウロガ
ストロンの分泌発現 （Ａ）　　Ｉ）ＬＩＧ２０１を保有する１−１８１０１
株の培養 下記組成の修正Ｅ培地を用いた。

〈修正Ｅ培地（１ｇ当りの組成）〉 硫酸マグネシウム・７水Ｗ　　　　　Ｏ，２ｇクエン酸
・１水和物　　　　　　　２．０ｇ無水リン酸２カリウ
ム　　　　　１０．００リン酸水素アンモニウム・ナト
リ ラム・４水塩　　　　　　　　　　３．５ｇブドウ糖　
　　　　　　　　　　　　２．０！Ｑカザミノ酸　　　
　　　　　　　　　１．０ｆｊＬ−プロリン　　　　　
　　　　　　０．２３ｇＬ−ロイシン　　　　　　　　
　３９．５ｍｇ塩酸チアミン　　　　　　　　　１６．
８５ｍｃ＋テトラ丈イクリン・塩酸塩　　　２０．０ｍ
ｇ１）ｔＪＧ２０１株の前培養液１ｍ１２を、修正Ｅ培
地２００　ｍＱを含むフラスコに加え、３７°Ｃで２４
時間娠撮培養した。　　　　′ （Ｂ）　　菌体からのペリプラズム画分と細胞内画分と
の抽出 上記（Ａ＞で得た培養液から遠心分離 （６０００回転／分ＸＩＯ分）で菌体を集め、培養液の
０．５倍量の洗浄緩衝液（１０ＩＩＩＭトリス塩酸及び
３０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８，０＞で菌体を洗浄し
た俊、浸透圧ショック法（Ｈ，Ｃ。

Ｎｅｕとり、Ａ、Ｈｅｐｏｅｌ、Ｊ、Ｂ、Ｃ，，２４０
゜３６８５−３６９２　（１９６５））に従い、ペリプ
ラズム画分を抽出した。この抽出操作は、まず湿重ｆｆ
ｉ　１　（］の菌体を２０％蔗糖を含む３０ｍＭトリス
塩醒緩塩液緩衝液８．０＞８０ｍＱに懸濁させ、０．２
５Ｍ　　ＥＤＴＡ水溶液（ｐ　Ｈ８，０＞の０．３２ｍ
Ｇを加え、ロータリーシェーカーで２４°Ｃにて１８０
回転／分で１０分間撹拌した後、遠心分離（９０００回
転／分Ｘ１０分）して菌体を集め、次いでこの菌体を氷
冷した水８０ｍ１２に再懸濁させ、水中に１０分間静置
して時々撹拌し、遠心力１ｉ１　（９０００回転／分Ｘ
ＩＯ分）により菌体と上澄とを分離することにより行な
ったものであり、得られた上澄がペリプラズム画分であ
る。

次いで、上記ペリプラズム画分を抽出した後の菌体を、
前記と同一の洗浄緩衝液で洗浄後、ＰＢＳ　（１５０ｍ
　Ｍ塩化ナトリウムを含む２０１１１Ｍリン駿ナトリウ
ム、ｐＨ７，０＞６ｍＧに懸濁させ、超音波破砕機（大
岳製作所製６２０２型）を用いて出力１００Ｗにて３０
秒ずつ３回超音波破砕処理し、遠心分離（１８０００回
転／分×２０分）して上澄をｊｑた。これＳ−細胞内画
分とした。

（Ｃ）　　ラジオイムノアッセイによるβウロガストロ
ンの測定 上記（Ｂ）で１ｑたそれぞれの画分につき、以下の通り
βウロガストロンの存在をβウロガストロン特異ラジオ
イムノアッセイにより検討した。ラジオイムノアッセイ
の方法は次の通りである。即ち、精製ヒトβウロガスト
ロンを抗原として、家兎を免疫し抗血清を作成した。β
ウロガストロン３００μｑを蒸留水０．２ｍｆ２に溶解
後、５０％ポリビニルピロリドン液１．５ｍＱを加え室
温で２時間撹拌した。コンプリート・フロイント・アジ
ュバント２．０＋ｎＱを加えて乳化し、家兎３匹の胸部
に皮下注射した。２週間毎に免疫を４回くり返した後、
ざらに５０μｑの抗原を静注し、３日後に全採血を行な
い、血清を分離した。

次にアッセイに用いる抗血清の希釈倍率を求めるタイト
レージョンカーブ、アッセイ条件を最適化するためイン
キュベーション時間、抗体結合標識抗原（バウンド）と
遊離標識抗原（フリー）の分離方法等の検問を加え、下
記測定条件を設定した。

即ち、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ＞、１４０
ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ二ナトツナ
トリウム１０ｍ　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）を希釈
液として用い、該希釈液４００μＱ、測定試料又は標準
ヒトβウロガストロン１００μＱ及び抗ヒトβウロガス
トロン血清１００ｕＱを加えて４℃にて２４時間インキ
ュベートした後、１２５工標識ヒトβウロガストロンＴ
ｏｏμ９　（約５０００ｃｐｍ）を加えた。更に４°Ｃ
にて４８時間インキュベートした後、第２抗体（抗家兎
γ−グロブリンヤギ血清）（１：２０＞１００’μＱ、
正常家兎血清（１：　２００）１００μＱ及び５％ポリ
エヂレングリコールを含む１０ｍＭ　　ＰＢＳ液９００
．１を加えて４℃にて３時間インキュベートした。次に
３００　Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を除き沈
澱物をカウントした。ｉＭ　’＜ｐヒトβウロガストロ
ンより得られた標準曲線より試料中のヒトβクロガス１
〜ロン免疫活性物の含１を求めた。

上記結果を下記第７表に示す。また第７表には、Ｄ　Ｕ
Ｇ２０１を保有するＨ８１０１株に代えて、同様にして
作成されたｐＧＨ５５及σｐ　ＵＯ３のそれぞれで形質
転換されたＨ８１０１株を用いて同様にした結果を併記
する。

第７表 βウロガストロン免疫 菌　　株　　　　　活性（μＱ／Ｑ培養液）ペリプラズ
ム画分　細胞内画分 Ｂ１０１ （ＤＧＨ５５）　　　　＜０．０３．　　＜０．０３Ｂ
１０１ （ｐ　ＵＯ３）　　　　　＜０．０３　　　＜０．０３
（ｐ　ＵＧ２０１　）　　　　２６３　　　　０．６２
上記第７表より、シグナルペプチドのみをコードするＤ
ＮＡ塩基配列を含むベクターを保有する大腸菌（トｌ８
１０１　（ｐＧＨ５５））及びβウロガストロンのみを
コードするＤＮＡ塩基配列を含むプラスミドを保有する
大腸菌（ＨＢｌｏｌ（ｐ　１ＪＧ３））では、それらの
培養抽出液中にβウロガストロンの免疫活性物質は実質
的に検出されないが、シグナルペプチドとβウロガスト
ロンの融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を
含み、その前にプロモーター及びリポゾーム結合部位が
連結されたベクターを保有する大腸菌（ＨＢｌｏｌ　（
ｐ　ＬＩＧ２０１））では、その培養抽出液中に顕著な
βウロガストロンの免疫活性が検出されることが明らか
である。

また上記ベクターで形質転換した上記微生物の培養では
、βウロガストロンの免疫活性物質の殆んどすべて（９
９，８％）が、ペリプラズムに分布していることも確認
される。このことから、シグナルペプチドとβウロガス
トロンとの融合ポリペプチドのＤＮＡ塩基配列を利用す
れば、βウロガストロンは細胞膜を通過してペリプラズ
ムに分泌されることが判る。

（Ｄ）　　ポリペ１チドの精製 上記ペリプラズム抽出液中のβウロガストロンの免疫活
性物質を、ブチルトヨバール（東洋曹達■製）を用いた
吸着クロマトグラフィー、ＣＭ−トヨパール（東洋曹達
株式会社製）８用いたイオン交換クロマトグラフィー、
ＰｅｐＲＰＣカラム（ファルマシア社製）を用いた高速
液体クロマトグラフィー操作により、それぞれ単一のポ
リペプチドになるまで精製した。

その結果、精製されたポリペプチドは、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動、アミノ酸分析、Ｎ末端分析のすべてにおいてヒ
ト尿より単離精製されたβウロガストロンと同一物質で
あることが確認された。

実施例１ 成熟ポリペプチド分泌発現ベクターｐ　ＫＫＯ６及び１
）ＫＫＯ７の構築 （Ａ＞枯草菌−大腸菌シャトルベクターｐＫＫＯ１の構
築 ベクターｐＫＫＯ１を得る工程を第５図に示した。

枯草菌−大腸菌シＡ７トルベクターを構築するため、プ
ラスミドｆ）ＵＢｌｌｏおよびｐＢＲ３２２を用いた。

１）ｔＪＢｌｌｏは、黄色ブドウ球菌スタフ−１’口］
’／、ｔＪスフｉ−Ｌ／ラウス　Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）由来の、サイズ４．５Ｋｂ　
（分子量３．０メガダルトン）のプラスミドで、枯草菌
内で複製し、カナマイシン耐性遺伝子を発現する、（Ｔ
、　Ｊ、　Ｇｒｙｃｚａｎ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、３ａｃ
ｔｅｒｉｏ１．。

１３４．３１８−３２９　（１９７８＞）。

ｐＢＲ３２２の１　Ｑμｃ７をＥＣ０ＲＩ及びｐｖｕ［
を用いて、それぞれ高塩濃度緩衝液中、生塩濃度緩衝液
中で切断し、１％アガロース電気泳動により約２．３０
Ｋｂの断片（Ｋ）を分離した。この断片には、Ｉ）ＢＲ
３２２に存在していた大腸菌の複製開始領域及びペニシ
リン耐性遺伝子が含まれている。

ｐＵＢｌ　１０の１０μＣ］をＥＣ０ＲＩ及びｐｖｕ［
を用いて、それぞれ高塩濃度緩衝液中、生塩濃度緩衝液
中で切断し、１％アガロース電気泳動により約３．４５
Ｋｂの断片＜Ｌ＞を分離した。この断片には、１）ＵＢ
ｌｌｏに存在していた枯草菌の複製開始領域及びカナマ
イシン耐性遺伝子が含まれている。

断片（Ｋ）及び（Ｌ）をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合反応
ざＵた。反応終了後、この反応組成液で大腸菌Ｈ８１０
１株を形質転換した。ペニシリン耐性及びカナマイシン
耐性を示す形質転換体の中から１株を選び、これよりプ
ラスミドを単離した。

その結果大ぎざ約５．７５Ｋｂの目的のプラスミドｏ　
ＫＫＯｌが得られた。次に本プラスミドを用いて枯草菌
ＲＭ１２５株を形質転換し、カナマイシン耐性を示す形
質転換体を分離した。これらの形質転換体から得られた
プラスミドはｐ　ＫＫＯｌそのものであり、更に枯草菌
から分離したｐＫＫＯｌを用いて大腸菌１−１８１０１
株又は枯草菌ＲＭ１２５株を形質転換した場合にも、同
様に形質転換体から１）ＫＫＯｌが回収された。

（Ｂ）プラスミドｐＫＫ１３の構築 プラスミドＤＫＫ１３を得る工程を第６図に示した。

ｏ　ＵＧ２０１の１０μｑをＥＣＯＲ工及びＰＳｔＩを
用いて、高塩濃度緩衝液中で切断し、１％アガロース電
気泳動により約２．９７Ｋｂの断片＜Ｈ＞を分離した。

同じ＜Ｄ　ＵＧ２０１の］ＯμΩをＰＳｔＩ及び〜１ｂ
ｏＩＩを用いて、それぞれ生塩濃度緩衝液中、低塩濃度
緩衝液中で切断し、８％アクリルアミド電気泳動により
約０．４４Ｋｂの断片＜１＞及び約０．０７Ｋｂの断片
（Ｊ）を分離した。

ＭｂｏＩＩの認識配列ＧＡＡＧＡの末尾のアデニンは、
これに続く塩基配列がＴＣとなるとき通常の大腸菌宿主
中ではｄａｍメチレイスによりメチル化を受（ブる。メ
チル化により、この配列はＭｂｏＩＩで切断されなくな
る（Ｍ、　Ｇ、　Ｍａｒｉｎｕｓ　ａｎｄ　　Ｎ。

Ｒ，Ｍｏｒｒｉｓ　、　Ｍ旧ａｔｉＯｎ　　　Ｒｅ５ｅ
ａｒ’ｃｈ　、　　２８　。

１５〜２６（１９７５））。第６図にｐ　ＵＧ２０１の
Ｍ　ｂｏ　ｎ　ａ１１識部位が示して必る。断片＜Ｉ＞
中の２個の〜１ｆ）ＯＩＩｉｂ’？＜識部位はいずれも
メチル化のために切断されなくなっている。

枯草菌内で効率よ＜　ｆｌｊ　＜　Ｓ　Ｄ配列及びその
２塩基下流に開始コドンを含むオリゴヌクレオチドＢｓ
−１及びＢ５−２を同相リン酸トリエステル法により合
成した。Ｂ５−１とＢｓ　−２は下記式［８〕に示す通
り互いに相補的でめり、ＳＤ配列ＡＡＧＧＡＧＧＴＣＧ
Ａの上流はＥＣ０ＲＩ末端をもつ。

Ｂｓ−１：上段　　　　　ＳＤ　　配　列　　　開始コ
ドン５’　ＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＧＡＧ
ＴＡＴＧＡＧＴ３’３’　ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣＣＡＧ
ＣＴＣＡＴＡＣＴＣ５’Ｂｓ−２：下段　　　　　　　
　　　　　　　　　　〔８〕断片＜Ｈ＞、＜Ｉ＞、（Ｊ
）及びオリゴヌクレオチドＢ５−１、Ｂｓ−２（各１μ
ｇ）を混合して、５０μＱの反応液中にて、Ｔ４ＤＮＡ
リカーピで連結させた。次いで、これを用いて大腸菌Ｍ
Ｃ１０６０株を形質転換し、テトラサイクリン耐性を示
す形質転換体を）ユだ。これらの形質転換体からプラス
ミドを抽出し、以下の点について調べた。即ち、プラス
ミドの大きさく約３．５Ｋｂ）　、β−ウロガストロン
遺伝子中に含まれるＭｌｕＩ認識配列等である。その結
果、期待通りのものか見出されたので、このプラスミド
をρＫＫ１３と命名した。１）ＫＫ１３は、大きざ約３
．５Ｋｂであり、テトラサイクリン耐性遺伝子とβラク
タマーゼシグナルペプチドーβウロガストロン直結遺伝
子を有し、更にこの直結遺伝子の５′末端、即ち開始コ
ドンの前後のＤＮＡ配列が合成ヌクレオチドＢｓ−１、
Ｂｓ　−２によって置きかえられている。その結果、上
記直結遺伝子の塩基配列は変わることなく、その上流に
枯草菌用ＳＤ配列が新たに導入されたのである。

（Ｃ）分泌発現ベクター ベクターｐ　ＫＫＯ６を’＋％る工程を第７図に示した
。

ｐＫＫ１３のコＯμｑをＥＣ０ＲＩ及びＰＳｔＩを用い
て、高塩濃度緩衝液中で切断し、１％アノｊロース電気
泳動で約０．５２Ｋｂの断片ＣＭ＞を分離した。この断
片には、枯草菌用ＳＤ配列及び大腸菌βラクタマーピシ
グナルペプヂトに直結したβウロガストロン遺伝子が含
まれている。

ｐＫＫＯｌの１０μｑをＥＣ０ＲＩ及びＰＳｔＩを用い
て高塩濃度緩衝液中で切断し、１％アカロース電気泳動
により約５．０Ｋｂの断片（Ｎ）を分離した。この断片
には、枯草菌及び大腸菌の複製開始領域、及びカナマイ
シン耐性遺伝子が含まれている。

断片ＣＭ＞及び（Ｎ＞をＴ４ＤＮＡリガーゼて結合し、
この反応組成液で大腸菌ＭＣ１０６０株を形質転換した
。カナマイシン耐性を示す形質転換体からプラスミドを
単離し、大きさ約５．４Ｋｂの期待通りのベクターＩ）
ＫＫＯ６を得た。

ｐＫＫＯ６において、ｐＫＫ１３由来のβラクタマーゼ
シグナルペプチドーβウロガストロン遺伝子が、シャト
ルベクターｐＫＫＯ１のＥＣ０ＲＩ−ＰｓｔＩ部位間に
挿入されていることが、電気泳動の結果により確認され
た。

（Ｄ＞分泌発現ベクターｐＫＫＯ７の構築ベクターＯＫ
ＫＯ７を１ｑる工程を第８図に示した。

プラスミド１）Ｐｍ２Ｏ３は、５ｐ０２フアージから導
入したプロモーター（ＳｐＯ２プロモーター）をもつ。

本プロモーターは、枯草菌中でクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ遺伝子等を発現させるために
用いられている（Ｄ。

Ｍ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　　ａｌ、　Ｊ、　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、。

１４６．１１６２−１１６５　　（１９８１））。

１）Ｐｍ２Ｏ３の５０μｑをＥＣ０ＲＩを用い、高塩′
ａ度緩衝液中で切断し、１％アガロース電気泳動により
５ｐ０２プロモーターを含む約０．３Ｋｂの断片（Ｏ）
を分離した。１）ＫＫＯ６の１０μｑをＥＣ０ＲＩを用
い、高塩ｍ度緩衝液中で切断し線状化した。

上記で得た断片（０）及び線状化した 。　ＫＫＯ６をＴ４ＤＮＡソガーゼで結合した。反応終
了後、反応組成液で大腸菌ＭＣ１０６０株を形質転換し
、カナマイシン耐性を示す形質転換体を得た。５０株の
形質転換体よりプラスミドを分離し、大きざの確認を行
なうと共に、ＥＣＯＲ工処理により、約０．３Ｋｂの３
ｐ０２プロモーターを含む断片の検出を行なった。その
結果、１１株の形質転換体が、５ｐｏ２プロモ一ター断
片を含む大きさ約５．７Ｋｂのプラスミドを保持してい
た。

上記大腸菌形質転換体の２菌株から得たプラスミドＯＫ
ＫＯ７及びＤ　ＫＫＯ８を用い、枯草菌ＭＴ−２株を形
質転換し、カナマイシン耐性を示す形質転換体ＭＴ−２
（ｐ　ＫＫＯ７）及びＭＴ−２（ｐ　ＫＫＯ８）を得た
。これらからプラスミドを単離し、枯草菌内でプラスミ
ドが変化を受けていないことを確認した。

実施例２ ベクターＤ　ＫＫＯ７を保有する枯草菌による成熟βウ
ロガストンの分泌発現 次にＭＴ−２（ｐ　ＫＫＯ７）及びＭＴ＝２（ｐ　ＫＫ
Ｏ８）のヒトβウロガストロンの分泌生産について検討
した。両菌株を、それぞれ１０μｑ／ｍＱのカナマイシ
ンを含むＬＢ培地中で３０℃、−夜前培養した。これか
ら１　ｍＱをとり、５０噌の同培地に接種し、３０’Ｃ
で４０時間振どう培養した。培養終了後、培養液５ｍＱ
をとり、遠心分離（７０００回転／分Ｘ５分）により培
養上”ｚＭと菌体に分離した。これから上澄１　ｍＱを
とり、培養上澄画分とした。菌体は、２．５ｍ１２のＰ
ＢＳ緩衝液（２０ｍＭリン酸−ナトリウム、２０ｍＭリ
ン酸二ナトリウム、１５０ｍｆＶｌ塩化ナトリウム、ｐ
Ｈ７，０＞で洗浄後、２ｍＱのＰＢＳＩ衝液に懸濁した
。この懸濁液を水冷下、超音波破砕器で処理（１００Ｗ
、３０秒×３回）し、菌体を破砕した。この菌体破砕液
を遠心分離（１５０００回転／分Ｘ２０分〉後、上澄０
．４ｍＱをとり、細胞内画分とした。このようにして得
られた培養上澄画分及び細胞内画分につき、含まれるβ
ウロガストロンをＲＩＡ法により測定した。なお、５ｐ
Ｏ２プロモーターが導入されていないｐ　Ｋｋ０６につ
いてもＭＴ−２株を形質転換し、得られた形質転換株Ｍ
Ｔ−２’（ｐ　ＫＫＯ６）を同様に培養、抽出して、β
ウロガストロン量を測定した。結果は第８表に示される
通りである。

第　　　８　　　表 菌　株　　　　　βウロガストロン（ｎｃ＋／ｎ＋Ｑ）
培養上）σ両分　細胞内画分 ＭＴ−２（ｐ　ＫＫＯ７）　　８２１．５　　３．６Ｍ
Ｔ−２（Ｉ）ＫＫＯ８）　　２．９　　　　＜０．５Ｍ
Ｔ−２（ｐ　ＫＫＯ６）　　＜０．５　　　＜０．５Ｍ
Ｔ−２（ｐ　ＫＫＯ７）では、培養上澄画分及、び細胞
内画分で検出されたβウロガストロンは、それぞれ８２
１．５ｎＭ＋ｎＩ２．３．６ｎＭｍＱでｅ！’）、生産
されたβウロガストロンの９９％以上が培地中に分泌さ
れていた。一方、ＭＴ−２ （ｐ　ＫＫＯ８）では、培養上澄画分に検出されたβウ
ロガストロンは２．９ｎ（］／ｍ１２ときわめて低い値
を示し、細胞内画分には検出されなかった。

また、５ｐＯ２プロモーターの導入されていないベクタ
ーｐ　ＫＫＯ６を保有するＭＴ−２（ｐ　ＫＫＯ６）で
は、培養上澄画分及び細胞内画分のいずれにおいても、
βウロガストロンは殆んど検出されなかった。

これらの、結果Ｊ：す、１＼４Ｔ−２ＣｐＫＫＯ７）株
においては、５ｐｏ２プロモーターか導入されたことに
より大量のβウロガストロンか分泌生産されるようにな
ったことが明らかである。またＭＴ−２（ｐ　ＫＫＯ８
）株では、５ｐＯ２プロモーターが逆方向に挿入された
ため、生産量がＭＴ−２（ｐＫＫＯ７）に比して著しく
低くなったことが明らかになった。

実施例３ ベクターｐＫＫＯ７を保有する大腸菌による成熟βウロ
ガストロンの分泌発現 ベクターＤ　ＫＫＯ７で大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換
し、カナマイシン耐性を示す形質転換体を分離した。こ
れらの中から１菌株を選びプラスミドを単離し、ｐ　Ｋ
ＫＯ７で必ることを確認した。

ｐＫＫＯ７＠保有する大腸菌ＨＢ１０１の前培ｍ　１　
ｍＱを、Ｌ培地２００ｍＧを含むフラスコに加え、３７
°Ｃで２４時間振盪培養した。この培養液から遠心分離
（６０００回転／分Ｘ１０分）で培養上澄と菌体を得た
。この菌体を用い、参考例３の（Ｂ）と同様にしてペリ
プラズム画分及び細胞内画分を得た。

得られたペリプラズム画分、細胞内画分のβクロガス１
〜ロン量をＲＩＡ法により測定した。結果は第９表に示
す通りである。

第　　　９　　　表 面　　分　　　　βウロガストロン（１Ｍｍ１２）ペリ
プラズム画分　　　　１８９．６ 細胞内画分　　１１．４ 上記結果より、ベクターｐＫＫＯ７は、枯草菌のみなら
ず大腸菌においても、βウロガストロンを大量に分泌発
現することが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は起源ベクターｐＢＲ３２２に合成オリゴヌクレ
オチドく１〉、〈２〉、〈３〉及び〈４〉をクローニン
グしてプラスミドｐＧＨ５３を１ｑる工程及びこれによ
り得られるｐＧＨ５３の特徴を示す図であり、図中口は
合成オリゴヌクレオチド由来の塩基配列を示している。 第２図はｐＧＨ５３とＩ）ＢＲ３２２とがら本発明ポリ
ペプチド分泌発現用ベクター１）ＧＨ５４を得る工程及
び１ｑられたベクターｐ　ＧＨ５４の特性を示す図であ
り、図中■はシグナルペプチドをコードする塩基配列を
示す。 第３図は１）ＢＲ３２２からＩ）ＢＲＨＯ２を得、該Ｄ
　ＢＲＨＯ２とｐＧＨ５４とから本発明ポリペプチド分
泌発現用ベクターｐＧＨ５５を得る工程及び得られるＤ
ＧＨ５５の特性を示す図である。 第４図はＤＧＨ５５とｐ　ＵＯ３とからシグナルペプチ
ドと目的ポリペプチド（βウロガストロン）との融合ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含む本発明の
ポリペプチド分泌発現ベクター１）ＵＧ２０１を得る工
程及び得られるベクターｐＵＧ２０１の特性を示す図で
あり、図中臼ヌキの矢印はβウロガストロンの遺伝子を
示す。 第５図は、プラスミドｐｔＪＢ１１０とプラスミドｐ８
Ｒ３２２から枯草菌−大腸菌シャトルベクター１）ＫＫ
ＯＩを得る工程及び得られたベクターｐＫＫＯＩの特徴
を示す図であり、Ａｐｒ、、Ｔｃ　　、Ｋｍｒはそれぞ
れアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝
子、カナマイシン耐性遺伝子を示す。またＱｒｉＥ、０
ｒｉＢは、それぞれ大腸菌、枯草菌の複製開始領域を示
す。　　　′第６図は、プラスミド１）ＬＪＧ２０１と
合成オリゴヌクレオチドＢｓ　−１及びＢｓ　−２から
プラスミドｐＫＫ１３を得る工程及び得られたプラスミ
ド１）ＫＫ１３の特徴を示す図である。図中、マはメチ
ル化されたＭｂｏｌＩ認識部位を、はメチル化されてい
ないＭｂｏＩＩ認識部位を夫々示し、診はＢ５−１及び
Ｂ５−２の配列を示す。 第７図は、シャトルベクター１）ＫＫＯｌとプラスミド
ｐＫＫ１３からプラスミドＩ）ＫＫＯ６を得る工程及び
得られたプラスミドｐＫＫＯ６の特徴を示す図である。 第８図は、プラスミドｐ　ＫＫＯ６とプラスミドＤ　Ｐ
ｍ２Ｏ３から本発明の分泌発現ベクター１）ＫＫＯ７を
（ｑる工程及び得られたベクターｐＫＫＯ７の特徴を示
す図であり、図中→は５ｐｏ２プロモーターを示す。 （以　上） 第７図 ｔ３ｇｌｎ 第８図 ｊｇｌｕ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）ジクナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列と
   目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とが直接
   連結されてなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩
   基配列、並びに枯草菌の複製開始領域であるＤＮＡ塩基
   配列を含むことを特徴とするポリペプチド分泌発現ベク
   ター。
2. （２）更に大腸菌の複製開始領域であるＤＮＡ塩基配列
   を含む特許請求の範囲第１項に記載のベクター。
3. （３）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列の
   前にリボゾーム結合部位を有する特許請求の範囲第１項
   に記載のベクター。
4. （４）リボゾーム結合部位の前に更にプロモーターを有
   する特許請求の範囲第３項に記載のベクター。
5. （５）目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列の
   直後に翻訳停止シグナルを有する特許請求の範囲第１項
   に記載のベクター。
6. （６）翻訳停止シグナルの後に更に転写終結因子が連結
   されてなる特許請求の範囲第５項に記載のベクター。
7. （７）シグナルペプチドが大腸菌βラクタマーゼのもの
   である特許請求の範囲第１項に記載のベクター。
8. （８）目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列が
   βウロガストロンをコードするものである特許請求の範
   囲第１項に記載のベクター。
9. （９）ＰＫＫ０６である特許請求の範囲第１項に記載の
   ベクター。
10. （１０）ＰＫＫ０７である特許請求の範囲第１項に記載
    のベクター。
11. （１１）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
    と目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とが直
    接連結されてなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ
    塩基配列、並びに枯草菌の複製開始領域であるＤＮＡ塩
    基配列を含むベクターで形質転換された微生物。
12. （１２）枯草菌である特許請求の範囲第１１項に記載の
    微生物。
13. （１３）大腸菌である特許請求の範囲第１１項に記載の
    微生物。
14. （１４）ジクナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
    と目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とが直
    接連結されてなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ
    塩基配列、並びに枯草菌の複製開始領域であるＤＮＡ塩
    基配列を含むベクターで形質転換された微生物を培養し
    て分泌されるポリペプチドを採取することを特徴とする
    ポリペプチドの製造法。