JP2504723B2 - 組換体ｄｎａとこれを含むプラスミドベクタ―とこのような組換体ｄｎａを保持する大腸菌 - Google Patents

組換体ｄｎａとこれを含むプラスミドベクタ―とこのような組換体ｄｎａを保持する大腸菌

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換体ＤＮＡ技術の使用
に及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，略
称Ｅ．ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性菌を用いてこのよ
うな微生物の増殖培地に遺伝子生成物を発現輸送する方
法の場合に関する。
【０００２】かくして、本発明はその細胞外分泌をもた
らすため蛋白質を大腸菌のようなグラム陰性菌中に発現
させる方法の場合に関する。本発明は組換体ＤＮＡとプ
ラスミドベクターとこのような組換体ＤＮＡを含む大腸
菌のようなグラム陰性菌を提供する。本発明はまた前記
方法により得られた蛋白質の場合にも関する。
【０００３】
【従来の技術】それにより新規な組換体ＤＮＡが構成さ
れ原子核ないし成熟核宿主細胞中に導入されうる比較的
新しい組換体ＤＮＡ技術は非常に多数の蛋白質の製造を
論理的に可能にした。異型遺伝子生成物を製造するため
の細菌の使用はさもなければ天然源からかなりの費用で
得ることしかできない蛋白質の取得を可能にした。細菌
中で製造されたヒトに由来するポリペプチド類のよく知
られた例はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インシュリ
ン、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ソ
マトスタチン及びソマトメジン類（インシュリン様発育
因子）である。
【０００４】外来遺伝子を発現させるための細菌の使用
は蛋白質分解によるポリペプチドの安定性、発現の程
度、誤った折重ね（ｆｏｌｄｉｎｇ）に相関する蛋白質
生成物の精製及び精製後の蛋白質の生物学的活性の欠除
も含めた多くの実際的及び生物学的問題に直面した。こ
れらの問題を解くため、任意の遺伝子生成物を発現させ
るため充分特徴付けられている腸細菌である大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用できるよう各種の技術が開発さ
れた。
【０００５】これらの方法には発現の程度を調整できる
様々なプロモーターの使用、細胞内では通常不安定な蛋
白質を安定化するための遺伝子融合、及び還元性環境が
その形成を困難にしている細胞質とは対照的に二硫化物
橋が形成されうる細胞質周囲空間へ細胞質から蛋白質を
転座させるためのシグナルペプチド類の使用が含まれ
る。
【０００６】大腸菌の細胞質中に発現された構造中のシ
スティン橋を有する蛋白質はこれらの橋が形成されにく
いために普通正確な三次構造を有さない。このことは潜
在的に生産過剰時のポリペプチドの沈澱、もし細胞中に
沈澱しなかった場合の急速な蛋白質分解劣化及び発現さ
れ精製されたポリペプチドの生物学的活性の不在に至り
うる。このことはプロインシュリン、インシュリンＡ
鎖、インシュリンＢ鎖、インシュリン様発育因子及び組
織特異性プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を発現
させる場合の大腸菌中に観察されてきた。この問題を克
服するため、ポリペプチドは精製後再生されるか正確な
折重ねが潜在的に達成されうる大腸菌の細胞質周囲空間
へ分泌させる必要があった。
【０００７】折重ね及び安定性について言及したものと
は別の細菌遺伝子発現及び分泌の一つの他の観点はグラ
ム陽性菌の使用である。これらの微生物はグラム陰性対
応体と比較して細胞の細胞質を取り囲む膜構造の異なる
機構を有する。グラム陽性原子核細胞は単に一つの細胞
膜を有するのみであり、分泌された蛋白質は増殖培地へ
輸送されるが、グラム陰性大腸菌における分泌は細胞の
細胞質を取り囲む二重膜層のため蛋白質を細胞質周囲空
間に位置させる。グラム陽性菌を使用することにより、
分泌された遺伝子生成物は生成物のダウンストリームプ
ロセッシングを促進するであろう増殖培地から集められ
うる。
【０００８】かくして、工業的プロセスにおけるグラム
陽性菌の使用の重要性はこの分泌プロセスに相関してい
るが、他の観点から、発現系が大腸菌についてより開発
されているという単なる理由から充分特徴付けられた大
腸菌を大規模遺伝子生成物生産において使用することが
優先するであろう。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は工業的プロセ
スにおける大腸菌の使用の適用における制限に対する解
決方法に関する。この方法は遺伝子生成物が大腸菌から
増殖培地に定量的に分泌させることを可能にする。グラ
ム陰性菌における蛋白質の輸送を得るためのこの遺伝学
的手段は所望の遺伝子生成物の発現が熱衝撃応答による
繊維状増殖の誘発及びこの応答が細胞質周囲に位置する
蛋白質の増殖培地への定量的な漏出を与えることに基づ
いている。本発明の基礎につき以下説明する。
【００１０】シグナルペプチド類が原子核細胞及び成熟
核細胞いずれにおいても膜を通して分泌されるはずの発
現された蛋白質のＮ末端中に存在することがよく知られ
ている。このシグナルペプチドは２０〜４０個のアミノ
酸からなり、転座プロセス中に開裂される。多くの蛋白
質因子はこの分泌プロセスに相関しているが、分子機構
は完全な詳細まで分かっていない。良好なモデルが無理
なく現実に近づいて提供されてはいる。
【００１１】前記方法をブドウ球菌性蛋白質Ａを引用し
て以下に説明する。この蛋白質は病原性細菌黄色ブドウ
球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ，略称Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分として知られ
ており、ヒトも含めたほとんどの哺乳動物からの特定な
群の抗体の一定領域とそれが特異的に結合することによ
りよく知られている。蛋白質Ａはまたその構造において
非常に反復性があることが知られており、連結した反復
中に位置する各領域中に約５８個のアミノ酸からなる５
個の領域は全て個別に免疫グロブリン類（例えばヒトＩ
ｇＧ）と結合する機能を有する。
【００１２】ＤＮＡ水準において、蛋白質Ａの細胞質か
らの転座を行う役割のあるシグナル配列はこれら５種の
ＩｇＧ結合領域の前に存在することが示された。このシ
グナル配列はまた大腸菌中でも機能することが見出され
ており、かくして蛋白質Ａは蛋白質Ａの遺伝子の導入後
細胞質周囲空間中に見出される。
【００１３】前記方法の基礎をなす研究において、蛋白
質ＡのフラグメントＢを遮断された分泌をもたらすシグ
ナル配列のすぐ後に置いた。明白な結論はフラグメント
Ｂ及びＥ間のアミノ酸配列における差異は分泌プロセス
に重要であることである。蛋白質Ａのこのフラグメント
Ｂを発現させる大腸菌は不完全な細胞分裂のため繊維状
に増殖する。このことは以前細胞内に沈澱する、大腸菌
で発現された蛋白質について観察された。
【００１４】前記方法において、本発明者らはβ−ラク
タマーゼのように細胞質周囲空間に位置した蛋白質が増
殖培地に漏出していることを見出した。フラグメントＳ
Ｅを発現させる場合、このＥフラグメントがほぼ全量大
腸菌の増殖培地へ輸送されることが驚くべきことに発見
された。このことはまた細胞の繊維状増殖にも相関性が
ある。（程度に差はあるが）繊維状増殖を誘発すること
が見出された他のフラグメントはフラグメントＳＥＥ及
びＳＥＢである。蛋白質Ａの全てのこれらのより小さな
フラグメントは細胞質周囲蛋白質の増殖培地への輸送に
至る細胞分裂の欠陥をなぜか誘発する。
【００１５】ヒトインシュリン様発育因子１（ＩＧＦ−
１）、すなわち、７０種のアミノ酸からなる発育因子を
コード化する遺伝子にＳＥＥを融合させてＳＥＥ−ＩＧ
Ｆ−１を生じさせる際、遺伝子生成物を増殖培地から回
収させうることが見出された。またこの実験において、
細胞の繊維状形態が観察できた。
【００１６】全ての上述の実験は図９に示したようなＡ
型ベクター中で行った。Ａ型ベクターはβ−ラクタマー
ゼ（ｂｌａ）遺伝子に対向する蛋白質Ａ誘導遺伝子転写
を有するｐＲＩＴ４に基づく。ＳＥＥ−ＩＧＦ−１をＢ
型ベクター中に入れる際、発現水準はＡ型配向に比較し
て２０〜４０倍高い。Ｂ型ベクターはβ−ラクタマーゼ
遺伝子（ｂｌａ）と同一方向において蛋白質Ａ誘導遺伝
子転写を有するｐＥＭＢＬに基づく。これらの細胞にお
ける繊維状増殖は非常に顕著である。増殖培地への輸送
は非常に困難である。
【００１７】今回の結果は前記方法の遺伝子生成物の増
殖培地への輸送は大腸菌細胞の繊維状増殖に相関し、ま
た発現水準はこの誘発に相関させうることを示してい
る。
【００１８】Ａ型ベクター中のＳＥＤＡＢＣからなる蛋
白質Ａ遺伝子は３０〜４２℃で増殖させた。熱衝撃応答
を得るのに充分高い。より高温では、発現水準は２０〜
４０倍高く、増殖培地への輸送は効率的である。
【００１９】前記方法に至る研究から引き出された結論
は大腸菌の繊維状増殖は増殖培地への細胞質周囲蛋白質
の輸送を与えることである。繊維状増殖が蛋白質Ａプロ
モーター及びシグナル配列を保持する大腸菌細胞中で誘
発され、プラスミドベクター中のフラグメントの配向に
より、あるいは発現された蛋白質Ａ部分の大きさによ
り、前記方法では細胞質周囲蛋白質の増殖培地への様々
異なる水準の輸送が得られる。
【００２０】前記方法の基本的概念はこの分野において
重要な進展をなすものである。なぜならば、大腸菌中の
繊維状増殖の誘発は蛋白質Ａシグナル配列及びプロモー
ターの後に置かれたとき高い発現及び効率的な分泌を持
たらすからである。
【００２１】前記方法はこの発現−分泌系の挙動におけ
る観察に関する生物学的説明に基づくわけではないこと
に留意ありたい。
【００２２】前記方法は何ら特定の理論に制約されるわ
けではないが、本発明者らはなされた観察に関する合理
的な説明を有する。
【００２３】蛋白質Ａ遺伝子は大腸菌においてそれ自体
熱衝撃遺伝子である。このことは蛋白質Ａは発育性非熱
衝撃応答中よりも熱衝撃応答中により転写されることを
意味する。この現象の理由はシグマ３２様プロモーター
が見出される蛋白質Ａ遺伝子中の先に報告した大腸菌様
プロモーターの上流で見出される。このことはシグマ３
２プロモーター配列は熱衝撃遺伝子について示唆された
意見一致配列と相同であることを示唆した。熱衝撃応答
を引き受けるシグマ３２因子は一緒に通常大腸菌中で１
７個の遺伝子を転写している。
【００２４】熱衝撃応答は大腸菌細胞がストレスを受け
るとき誘引される。誤って折重られた蛋白質が主要誘引
作用でありかつこの誘発は熱、４％ＥｔＯＨ、酸化性
剤、解読誤りまたは適切な三次構造を得ることができな
い外来蛋白質の生産を持たらす化学薬品により行ないう
ることが示唆される。
【００２５】前記方法の場合において、蛋白質Ａの小さ
なフラグメントまたは最初からの大量生産は熱衝撃応答
を誘引している。この応答が誘引されるとき、蛋白質Ａ
遺伝子は更に転写され、より顕著な誘引となる。この熱
衝撃応答はまた細胞分裂の欠陥、すなわちいわゆる繊維
状増殖も与えている。この開示において、またこのタイ
プの増殖も増殖培地への細胞質周囲生成物の輸送を与え
ることが示されている。
【００２６】３０℃または４２℃でＡ型ベクター中で蛋
白質Ａ遺伝子を有する大腸菌株を増殖させることによ
り、本明細書中ではこの温度の誘発が高い発現と輸送を
与えることが示されており、このことは生物学的説明を
支持し、優れた誘発系を与えている。このことは菌株は
低温で増殖させることができ低水準で生産し、そして細
胞塊が生成されてしまった後で温度を４２℃に移し、そ
の後生成物の生産が起き、そして生成物もまた分泌され
ることを意味している。
【００２７】熱衝撃またはＬａと命名したＡＴＰ依存性
プロテアーゼも誘引している。従って、生産はその遺伝
子中の突然変異としてＬａプロテアーゼに欠けた菌株中
で優先的に起きるであろう。
【００２８】
【問題を解決するための手段】従って、本発明は、大腸
菌のようなグラム陰性菌中に蛋白質を発現させ、その細
胞外分泌を与える方法において、このグラム（−）菌中
に導入されるところの、プロモーター、シグナル配列及
び開裂領域を含有する構造遺伝子を含む組換体ＤＮＡで
あって、該構造遺伝子が式化４
【００２９】
【化４】（Ｅ）ｎ（Ｂ）ｍ−Ｙ
【００３０】（式中、ｎは１以上の整数であり、ｍは整
数であり、Ｙは所望の蛋白質をコード化するＤＮＡ配列
であり、そしてＥ及びＢは蛋白質Ａ領域Ｅ及びＢに対応
する遺伝子である）で表され、但し、構造遺伝子は天然
蛋白質Ａをコード化するものとは異なることを前提とす
る組換体ＤＮＡを提供するものである。
【００３１】そして該方法は
【００３２】ａ）プロモーター、転座及びプロセッシン
グを可能とするシグナル配列及び発現させるべき所望の
蛋白質をコード化する構造遺伝子を含む組換体ＤＮＡを
グラム（−）菌中に導入、
【００３３】ｂ）細胞を繊維状増殖が生じるような条件
下で培養し、そして
【００３４】ｃ）細胞外分泌された蛋白質を回収する
【００３５】工程を含む。このような方法において、所
望の蛋白質の発現は好ましくは繊維状増殖のものと同一
の転写調節下にある。該方法の一つの実施態様におい
て、転写調節はシグマ−３２蛋白質因子を発現させるｈ
ｔｐＲの誘発に基づく。
【００３６】本発明はまた前記組換体ＤＮＡを含むプラ
スミドベクターを提供するものである。
【００３７】本発明はまた前記組換体ＤＮＡをその染色
体中に保持するかまたは同じものを含有するプラスミド
ベクターを保持する大腸菌を提供するものである。
【００３８】
【作用】先に指摘した通り、本発明の概念は繊維状増殖
をもたらす条件下で大腸菌のようなグラム陰性菌を増殖
させる方法に基づく。このような繊維状増殖は組換体Ｄ
ＮＡの性質及びそれから発現される蛋白質による。繊維
状増殖はまた外部誘発にもまたは両者の組み合わせによ
ってもよい。かくして、繊維状増殖は熱衝撃応答を誘発
する培養におけ温度上昇により起こされうるが、これら
はまたエタノールのような培養培地変性剤中に導入する
ことによっても起こされる。
【００３９】宿主細胞中で上で定義したように組換体Ｄ
ＮＡにより発現された蛋白質は外来または誤って折重ら
れたと細胞により認められるという事実により、これは
細菌中でｌｏｎ反応を誘発できる。
【００４０】組換体ＤＮＡは様々な方法で細菌中に導入
されうる。かくして、それは細菌の染色体ＤＮＡ中に導
入されうる。あるいはプラスミドベクター中に導入され
うる。
【００４１】前記方法の好ましい実施態様において、組
換体ＤＮＡは単一配列として蛋白質のものを含有してい
る。シグナル配列に隣接して構造遺伝子は回収されるべ
き成熟蛋白質のＮ末端アミノ酸残基をコード化する開裂
領域を含有している。このような開裂領域は少なくとも
６個のアミノ酸残基をコード化するよう構成されうる。
該残基は好ましくはＡｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ａｌａである。
【００４２】前記方法において、構造遺伝子は蛋白質Ａ
のＥ，ＥＥ及びＥＢ領域から選択された遺伝子を含むこ
とができる。構造遺伝子はまた生産遺伝子、例えばイン
シュリン様発育因子（ＩＧＦ−１）をコード化するもの
も含むことができる。
【００４３】本発明はプロモーター、シグナル配列及び
開裂領域を含有する構造遺伝子を含む組換体ＤＮＡであ
って、該構造遺伝子が式化５
【００４４】
【化５】（Ｅ）ｎ（Ｂ）ｍ−Ｙ
【００４５】（式中、ｎは１以上の整数であり、ｍは整
数であり、Ｙは所望の蛋白質をコード化するＤＮＡ配列
であり、そしてＥ及びＢは蛋白質Ａ領域Ａ領域Ｅ及びＢ
に対応する遺伝子である）で表され、但し天然蛋白質Ａ
をコード化するものから構造遺伝子を除外する組換体Ｄ
ＮＡを提供する。このような構造において、ｎは１であ
ってよく、ｍは０であってよく、あるいはｎが２であっ
てｍが０であってもよい。特定な実施態様において、ｎ
及びｍはいずれも１であってもよい。
【００４６】本発明の好ましい実施態様において、組換
体ＤＮＡはｎが２であり、ｍが０であり、そしてＹがＩ
ＧＦ−１またはＩＧＦ−２をコード化する遺伝子である
ものである。
【００４７】本発明はまた上と同一の意義を有する組換
体ＤＮＡを含むプラスミドベクターも包含する。このよ
うなプラスミドベクターはｐＥＭＢＬ９から発生するも
のであってもよい。
【００４８】本発明の他の観点によると、それはそのよ
うな構造をその染色体中に保持するかまたは同じものを
含有するプラスミドベクターを保持するこのような組換
体ＤＮＡを含有するグラム陰性菌を包含する。この発明
を使用する好ましい細菌は大腸菌、例えば大腸菌ＨＢ１
０１である。
【００４９】前記本発明の更に別の観点によれば、本発
明の概念を用いて製造された蛋白質が提供される。
【００５０】本発明を添付図面を参照にして特定な実施
例により更に例示する。
【００５１】図１はその異なるコード化領域を示す蛋白
質Ａ遺伝子の模式図である。Ｓはシグナル配列であり、
Ａ〜ＥはＩｇＧ結合領域であり、そしてＸはＩｇＧ結合
活性に欠けるＣ末端部である。
【００５２】図２は蛋白質Ａ遺伝子を含有するプラスミ
ドベクターｐＲＩＴ４を例示している。ｍｐ９多重制限
酵素リンカーが遺伝子融合に関連したその実際的解読ワ
クと共に示されている。ＣＭＬはクロルアンフエニコー
ルアシルトランスフエラーゼ遺伝子であり、Ｓａは黄色
ブドウ球菌を複製する原型であり、Ｅｃは大腸菌を複製
する原型であり、ＡＭＰはβ−ラクタマーゼ遺伝子であ
り、そしてＰｒｏｔＡは蛋白質Ａ遺伝子のＩｇＧ結合部
分を示す。
【００５３】図３は第１部にて記載したように構成した
異なるｐＡＳ及びｐＡＳＥベクターである。ＣＭＬはク
ロルアンフエニコールアシルトランスフエラーゼ遺伝子
であり、ｏｒｉ Ｂｓは枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）及び黄色ブドウ球菌を複製する原型であり、ｏｒｉ
Ｅｃは大腸菌を複製する原型であり、ＡＭＰはβ−ラ
クタマーゼ遺伝子であり、Ｓはシグナル配列であり、そ
してＥは蛋白質ＡからのＥ領域である。
【００５４】図４は蛋白質Ａ遺伝子続いて多重制限酵素
リンカーを保持するプラスミドベクターを示す。Ｐｒｏ
ｔ Ａは蛋白質ＡのＩｇＧ結合領域をコード化する遺伝
子である。ＴＣはテトラサイクリン抵抗性をコード化す
る遺伝子であり、そしてｏｒｉは大腸菌を複製する原型
である。
【００５５】図５は蛋白質ＡのＢ領域をコード化する異
なる遺伝子フラグメントを示している。左への矢印は得
られた異なるＢａｌ ３１クローンを示している。異な
るＢａｌ ３１構成体に結合されたＥｃｏＲＩリンカー
が示されている。Ｂ−０，Ｂ−１及びＢ−２構成体とし
てＥｃｏＲＩ領域を超えてＢ領域に入ったアミノ酸配列
が示されている。右側はＢフラグメントの３′末端にお
けるＢｉｍＨＩの位置が示されている。また２種の可能
な配向におけるストップリンカー（図６）の翻訳停止も
示されている。
【００５６】図６はストップリンカーの配向とは独立し
て即時の翻訳停止を生じさせるストップリンカーを示し
ている。各配向に応じた３種の異なる解読ワクが示され
ている。
【００５７】図７は天然蛋白質Ａにおける結合と比較し
たシグナルペプチド及び異なるｐＡＳＢ構成体間の結合
のアミノ酸配列を示している。各アミノ酸配列上の矢印
は大腸菌ＨＢ１０１から発現されたフラグメントのアミ
ノ酸配列化により分析されたプロセツシングの位置を示
している。
【００５８】図８は合成ＩＧＦ−１遺伝子のヌクレオチ
ド配列を示している。合成フラグメント側面を固めるＥ
ｃｏＲＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位が推論されたアミ
ノ酸配列と共に示されている。
【００５９】図９は異なる蛋白質Ａ誘導構成体を発現さ
せるのに用いられた２種のタイプのプラスミドベクター
を示している。ＣＭＬはクロルアンフエニコールアシル
トランスフエラーゼ遺伝子であり、Ｓ．ａ．は黄色ブド
ウ球菌を複製する原型であり、Ｅｃは大腸菌を複製する
原型であり、ＡＭＰはβ−ラクタマーゼ遺伝子であり、
そしてＰｒｏｔ Ａは線状図に示したように異なる蛋白
質Ａ構成体を示す。
【００６０】
【実施例】以下、本発明を特定な実施例により更に例示
するが、これら実施例は本発明を限定するものではな
い。実施例はヒトインシュリン様発育因子１（ＩＧＦ−
１）をコード化する合成遺伝子に適用されかつＳＥＥに
融合されてＳＥＥ−ＩＧＦ−Ｉを形成する系の適用を示
す。この蛋白質はまた蛋白質Ａ遺伝子の少部分と同じ方
法により分泌されかつＢ型ベクターにおいて、発現水準
が非常に高いことが見出された。
【００６１】ベクターｐＡＳＥＥはドイツ連邦共和国、
ゲッチンゲン（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）のＤｃｕｔｔｃ
ｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ ＭｉＲｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に寄託番号大腸菌ＲＲ１ΔＭ１
５において３５９３番として寄託された。
【００６２】
【出発物質】細菌宿主 大腸菌Ｋ１２の２種の異なる菌
株を実施例中で用いた。
【００６３】ＨＢ１０１（Ｂｏｙｅｒ，Ｈ．Ｗ．ｅｔａ
ｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４１，４５９−４７２
（１９６９））及び
【００６４】ＪＭ１０３（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１，２０−７９（１
９８３））
【００６５】（これらの菌株はスウェーデン，ストック
ホルムのｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｒｏｙａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙで入手できる。
【００６６】
【クローン化ベクター】実施例中で使用したクローン化
ベクターはｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｌ，Ｆ．ｅｔａ
ｌ，Ｇｅｎｅ ２，９３−１１３（１９７７），ｐＥＭ
ＢＬ８（Ｄｅｎｔｅ ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ．Ｒｅｓ．１１，１６４５（１９８３）），ｐＥＭＢ
Ｌ９（Ｄｅｎｔｅ ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ．Ｒｅｓ．１１，１６４５（１９８３）），ｐＲＩＴ
４（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ，ｅｔａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．
４，１０７５（１９８５）），ｐＳＰＡ １１（Ｕｈｌ
ｅｎＭ．ｅｔａｌ，Ｇｅｎｅ ２３，３６９，（１９８
３）），及びｐＳＰＡ １６（Ｕｈｌｅｎ Ｍ．ｅｔａ
ｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，７１３（１９
８４））であった。ＩＧＦ−１をコード化する合成遺伝
子は別の個所（Ｅｌｍｂｌａｄ，Ａ．ｅｔａｌ，Ｔｈｉ
ｒｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｇｒｅｓｓｏｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＩＩ，２８７−２９６，Ｖ
ｅｒｌａｇＣｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８
４））に記載されている。実施中で構成されるプラスミ
ドベクターｐＡＳＥＥはドイツ連邦共和国、ゲッティン
ゲンのＤｅｕｔｔｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に寄託番号
ＤＳＭとして寄託された。
【００６７】
【緩衝液及び培地】コーティング用緩衝液：１．５９ｇ
のＮａ２ＣＯ３，２．９３ｇのＮａＨＣＯ３及び０．２
ｇのＮａＮ３を蒸留水で１リットルに調製。
【００６８】ＰＢＳＴ：８．０ｇのＮａＣｌ，０．２ｇ
のＫＨ２ＰＯ４，２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４×１２Ｈ２
Ｏ，０．２ｇのＫＣｌ，０．２ｍｌのＴｗｅｅｎ（登録
商標）２０及び０．２ｇＮａＮ３を蒸留水で１リットル
に調製（ｐＨ７．４）。
【００６９】ＴＳＢ：３０ｇのトリプシン系大豆汁を１
リットルに調製し、オートクレーブにかけた。
【００７０】ＴＢＡＢ：３０ｇのトリプシン系血液寒天
基質を１リットルに調製し、オートクレープにかけた。
【００７１】ＯＮＰＧ緩衝液：１５ｍＭ２−メルカプト
エタノール及び１ｍＭＭｇＣｌ２を含有する０．１Ｍ燐
酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．３中の２ｍＭｏ−ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ，シグマ製品
Ｎｏ．Ｎ−１１２７）。
【００７２】通常方法 操作方法のうちあるものは実施例中で繰り返し行った。
他に特記しない限り、それらはそれらを行う毎に全く下
記と同じように行った。
【００７３】分子生物学において通常用いられる方法は
記載されていない（例えば、市販の制限酵素、ＤＮＡ結
紮、Ｂａｌ ３１エキソヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアー
ゼ及びＫｌｅｎｏｗポリメラーゼの使用）。
【００７４】転換：プラスミドＤＮＡによる大腸菌Ｋ１
２の転換は記載の通りに行なった（Ｍｏｒｒｉｓｍ，
Ｄ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ６８，３２６−３
３１（１９７１））。転換体は７０ｍｇ／ｌアンビシリ
ンを含有するプレート（ＴＢＡＢ）上で常法により選択
した。
【００７５】プラスミドＤＮＡの単離：プラスミドＤＮ
ＡをＢｉｒｎｂｃｉｍ，Ｈ．Ｃ．ｅｔａｌ，Ｎｕｃｌ，
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７，１５１３（１９７３）に記載
されたように単離した。多数の転換体をスクリーニング
するため小規模製剤をＫｉｅｓｅｒ，Ｔ．，Ｐｌａｓｍ
ｉｄ １２，１９−３６（１９８４）により記載された
のと全く同じように作成した。
【００７６】セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ
クロマトグラフィー：Ｂａｌ ３１またはＳ１処理のた
め使用すべきプラスミドＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，
１ｍＭ ＥＤＴＡ及び５００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中の
セファロース６Ｂゲル濾過にかけた。この方法により、
ＤＮＡはＲＮＡから分離される。
【００７７】ＤＮＡフラグメントの溶離：ＤＮＡフラグ
メントのアガロースまたはポリアクリルアミドゲル片か
らの溶離をＭａｘａｍ ｅｔａｌ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．
（ＵＳＡ），７４，５６０−５６４（１９７７）により
記載されたのと全く同じように行った。
【００７８】ＤＮＡ配列化：ＤＮＡ配列分析をＳａｎｇ
ｅｒ，Ｆ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４
３，１６１（１９８０）により記載されたのと全く同じ
ように行った。
【００７９】蛋白質Ａの検出及び定量：蛋白質Ａを定量
するためＥＬＩＳＡ試験（すなわち酵素結合免疫吸着剤
分析）を用いた。この試験は正味電荷（ｎｃｔｃｈａｒ
ｇｅ）を有さない特別ミクロ滴定プレート（Ｔｉｔｅｒ
ｔｅｋ，オランダ，アムステルスタッド）を使用する。
溜めをコーチング緩衝液中のヒトＩｇＧ（Ｋａｈ，Ａ
Ｂ，スウェーデン）でコーチングする。試料を添加し、
蛋白質Ａを溜め中に吸着されたＩｇＧのＦｃ部分に結合
させる。次いで、蛋白質Ａを、β−ガラクトシダーゼ
（Ｐｈａｒｍａｓｉａ ＡＢ，スウェーデン，ウプサラ
から）に接合された抗蛋白質Ａ（ラビットから）により
分析する。
【００８０】分析：ミクロ滴定プレートの溜めをコーチ
ング緩衝液中１６ｎｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ溶液７５μリ
ットルで満たし、プレートを室温で少なくとも１時間培
養する。溜めを１００μリットルのＰＢＳＴで３回洗浄
し、５０μリットルの試料を各溜めに添加する。定量の
ため、２倍希釈液を調製する。１時間温置後、溜めを１
００μリットルのＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで５０μ
リットルの抗蛋白質Ａ−β−ガラクトシダーゼを添加す
る（各溜めに添加された蛋白質Ａ結合能力の量は過剰の
蛋白質Ａによる滴定により検出された各溜めに添加され
たＩｇＧのモル量に対応する）。４５分間温置した後、
溜めを１００μリットルのＰＢＳＴで３回洗浄し、次い
で１２５μリットルのＯＮＰＧ緩衝液を添加する。２０
〜３０分間温置した後、１５０μリットルの０．１ＭＮ
ａＯＨを添加して反応を停止させる。定量は既知濃度の
蛋白質Ａ標準溶液の２倍希釈液を試料の２倍希釈液と平
行して流すことにより行う。４０５ｎｍにおける吸収を
光度計により各溜めについて測定する。
【００８１】β−ガラクトシダーゼ分析：β−ガラクト
シダーゼの定量をＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．（Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７２）により記載された
ように基質としてｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トシド（ＯＮＰＧ，Ｓｉｇｍａ製品Ｎｏ．Ｎ−１１２
７）を用いる比色法により分析した。反応は４０５ｎｍ
において分光光度計で追跡した。
【００８２】β−ラクタマーゼ分析：β−ラクタマーゼ
活性の量をＯ′Ｃａｌｌａｇｈａｎｅｔ ａｌ，Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，
５７，（１９６８）により記載されたのと全く同じよう
に分光光度測定により決定した。
【００８３】浸透衝撃：細胞質周囲に位置する蛋白質を
Ｎｏｓｓａｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２４１，３０５５（１９６５）に記載されたのと全く同
じように浸透衝撃により放出させた。
【００８４】
【実施例】Ｉ．蛋白質Ａヌクレオチド配列の分析 蛋白質Ａ遺伝子は１個のＩｇＧ結合領域（領域Ｅ，Ｄ，
Ａ，Ｂ，Ｃ）及び１個の細胞壁結合領域（領域Ｘ）を含
む（図１）。これら２種の領域の前にシグナル配列があ
る。
【００８５】シグナル配列の後及び領域Ｅの後各々に融
合点を含有する融合ベクターを作るためには、融合点の
周囲のヌクレオチド配列を知ることが望ましい。
【００８６】蛋白質Ａのヌクレオチド配列が知られてい
る（Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２５９，１６９５−１７０２（１９８４））。
【００８７】シグナル配列（以下Ｓと称する）の後の融
合点において、Ｍｓｔ Ｉ制限酵素部位がある。領域Ｅ
の後、またＭｓｔ Ｉ制限酵素部位がある。以下に記載
するように、Ｍｓｔ Ｉにより適当なプラスミドベクタ
ー中で蛋白質Ａ遺伝子を消化させ、次いでリンカーを挿
入することにより、一般的な使用可能なベクターが得ら
れる。
【００８８】ＩＩ．ｐＡＳ，ｐＡＳＥ及びｐＡＳＥＥの
構成 次の工程において、独特なＥｃｏＲＩ部位がＳ及びＳＥ
各々に置かれたプラスミドベクターの構成を記載してい
る。また、ＳＥＥがＥＦ領域の間にかつＳＥＥ構成体の
後にＥｃｏＲＩ部位を有するように構成されるかを記載
している。
【００８９】Ａ．ｐＡＳ，ｐＡＳＥ及びｐＡＳＥＥプラ
スミドベクターの構成 ５０μｇのｐＲＩＴ４（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａ
ｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．４，１０７５（１９８５））（図
２）を５Ｕの制限酵素を用いてＭｓｔ Ｉで消化させ、
３７℃で２時間温置した。６５℃で３０分間温置した
後、反応混合物を３種の別個の反応に分けた。異なる長
さのＥｃｏＲＩリンカーを各反応に各々添加した。第一
の試験管に、８量体リンカーを添加し（ＧＧＡＡＴＴＣ
Ｃ）、第二の試験官に１０量体リンカーを添加し（ＣＣ
ＧＡＡＴＴＣＧＧ）、そして第三の試験官に１２量体リ
ンカーを添加した（ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧ）。（通
常方法に記載したように）結紮後、結紮混合物を各々Ｅ
ｃｏＲＩで消化させ、次いで２μｇ／ｍｌまで希釈し、
結紮した。通常方法に記載したように転換を行い、アン
ピシリン抵抗性被転換体を選択した。各反応において、
２種の主要な型のベクターが見出された。一方の型はシ
グナル配列、その後にＥｃｏＲＩリンカー及びｍｐ９マ
ルチリンカーを含有している。ベクトルの他方の型は領
域Ｅの後でＥｃｏＲＩリンカー、その後にｍｐ９リンカ
ーを含有している。異なる長さでＥｃｏＲＩを添加する
ことにより、各型の構成体について３種の解読ワクにお
いてｍｐ９リンカー制限部位が入手できる（図３）。
【００９０】図３に示したこれら２種の型のベクターと
は別に、１２量体ＥｃｏＲＩリンカーを含有する実験に
おいて、もう１種の型のプラスミドベクターが回収でき
た。この構成体はＳＥ−１２量体リンカー−Ｅ−ｍｐ９
リンカーを含有する。このようにして、４種のアミノ酸
が２種のＥ領域間にＥｃｏＲＩ制限部位と同様に導入さ
れる。このベクターはｐＡＳＥＥと命名され、３型解読
ワク中でｍｐ９リンカーを有している（図３）。すべて
の構成体はＤＮＡ配列化を用いてリンカー領域上に確認
できた。
【００９１】ＩＩＩ．Ｂ遺伝子フラグメントの構成 以下の実験はブドウ球菌性蛋白質Ａの領域Ｂをコード化
する遺伝子フラグメントのサブクローン化を記載してい
る。
【００９２】出発物質、ブラスミドベクターｐＳＰＡ１
１は領域Ｂから下流の領域Ｃ１１７個の塩基対中に位置
するＳａｕ３ ＡＩ制限部位までの蛋白質Ａ遺伝子を有
する。ｓＳＰＡ１１の精製後、精製プラスミドを、Ｂａ
ｌ ３１処理における競合抑制剤として作用するＲＮＡ
を含有しない純粋なプラスミドを得るためセファロース
６Ｂカラムに通した。約１００μｇの精製ｐＳＰＡ１１
（図４）をＥｃｏＲＩで消化させ領域Ｂから下流の１１
７個の塩基を開裂した。エクソヌクレアーゼＢａｌ ３
１を通常方法に記載したように製造した。Ｂａｌ ３１
消化の後、反応混合物をＥｔＯＨで沈澱させ、０．５ｍ
Ｍ ｄＮＴＰｓの存在下で１０Ｕ Ｋｌｅｎｏｗポリメ
ラーゼで処理することにより鈍末端を確実にした。異型
長のＤＮＡをプールしたものをＢａｍＨＩ８量体リンカ
ー（ＣＧＧＡＴＣＣＧ）で結紮した。結紮後、反応混合
物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで開裂した。Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩ部位は領域Ｂの７９個の塩基対上流に位置
している。反応混合物を５％ポリアクリルアミドゲル電
気流動にかけることにより異型長のフラグメントを分離
した。２５０個の塩基対付近のフラグメントをゲルから
切り出し、電気溶離させ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで既に開裂させたｐＥＭＢＬ９に結紮させた。大腸
菌に転換後、ＪＭ１０３白色コロニーをＸ−ｇａｌ及び
１ＰＴＧを含有するＴＢＡＢプレート上で分離した。領
域Ｂから除去した４種のヌクレオチドを有するクローン
を更に仕上げるために選択した（図５）。
【００９３】このクローンからのプラスミドＤＮＡを精
製し、セファロース６Ｂ上に流しＲＮＡを除去した。約
１００μｇのプラスミドＤＮＡを更にＨｉｎｄ ＩＩＩ
で消化させエクソヌクレアーゼＢａｌ ３１で通常方法
中に記載したように処理した。鈍末端を確実にするた
め、０．５ｍＭ ｄＮＴＰの存在下で３７℃で３０分間
Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ（１０Ｕ）で処理した後、反
応混合物をＥｃｏＲＩ１０量体リンカー（ＣＣＧＡＡＴ
ＴＣＧＧ）に結紮した。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消
化後、ＤＮＡを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
付した。１７９個の塩基対の所望の長さ付近の細片を切
り出し、電気溶離にかけた。溶離から単離したＤＮＡを
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍ ＨＩで消化させたｐＥＭＢＬ９
に結紮した。大腸菌ＪＭ１０３に転換した後、白色コロ
ニーをＸ−ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有するＴＢＡＢプレ
ート上で選択した。配列分析により、３種の興味あるク
ローン（各々０，−１及び−２と言及する）が見出さ
れ、これらを仕上げのため選択した。数字（０，−１及
び−２）は図５に示したようにＥｃｏＲＩリンカーの結
合の前に領域Ｂ中に消化されるヌクレオチドの数を示
す。
【００９４】領域Ｂ中への３種の異なる解読ワクの３種
のクローン（以下Ｂ−０，Ｂ−１及びＢ−２と称する）
をＢａｍ ＨＩで開裂した。Ｂａｍ ＨＩの粘着性末端
を通常方法中で記載したようにＳ１−ヌクレアーゼで除
去した。図６に示した翻訳ストップリンカーを各反応混
合物に結紮した。各構成対中のリジン残基は今や図６に
示したように入ってくるストップリンカーの配向に依存
してＧｌｙまたはＡｌａのいずれかで置換されよう。大
腸菌ＪＭ１０３に転換後、下流に結合されたストップリ
ンカーを有するＢフラグメントを含有する単離されたク
ローンの配列分析を行った。配列分析により、Ｂ−０は
Ｇｌｙ残基により、Ｂ−１はＡｌａ残基により、そして
Ｂ−２はＡｌａ残基により終わっていることが分かっ
た。
【００９５】これらのフラグメントは今や１に記載した
ベクターのあるものにクローン化されることになる。
【００９６】ＩＶ．ｐＡＳＥＢ，ｐＡＳＢ１及びｐＡＳ
Ｂ２の構成 ＢのフラグメントはここでｐＡＳ及びｐＡＳＥにクロー
ン化されることになった。
【００９７】約５０μｇのＢ−０，Ｂ−１及びＢ−２及
びストリップリンカーを有するベクターをＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄ ＩＩＩで各々開裂した。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
はストリップリンカーの直ちに後で開裂させる。各ベク
ターからのＢフラグメントはポリアクリルアミドゲル電
気泳動を用いて単離した。
【００９８】Ｂ−０フラグメントをＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄ ＩＩＩで開裂されたｐＡＳ２（図３）に結紮し
た。大腸菌ＨＢ１０１に転換し、個々のクローンからプ
ラスミドＤＮＡを制限分析した後、ｐＡＳＢ−１プラス
ミドベクターがシグナル配列の後に蛋白質Ａのフラグメ
ントＢを有して単離できた。
【００９９】Ｂ−１フラグメントをＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄ ＩＩＩで開裂されたｐＡＳ３（図３）に結紮し
た。大腸菌ＨＢ１０１に転換し、個々のクローンからプ
ラスミドＤＮＡを制限分析した後、ｐＡＳＢ−２プラス
ミドベクターがシグナル配列の後にフラグメントＢを有
して単離できた。
【０１００】ｐＡＳＢ−１及びｐＡＳＢ−２間の差は図
７に示したようにＥｃｏＲＩリンカーに存在する３種の
アミノ酸である。
【０１０１】Ｂ−２フラグメントをＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄ ＩＩＩで開裂されたｐＡＳＥ１（３図）に結紮し
た。大腸菌ＨＢ１０１に転換し個々のクローンからプラ
スミドＤＮＡを制限分析した後ｐＡＳＥＢプラスミドベ
クターが領域Ｅに結合された蛋白質Ａのフラグメントを
有して単離できた。
【０１０２】Ｖ．ｐＡＳＥＥ−ＩＧＦ−１の構成 この実験において、いかにしてヒトインシュリン様発育
因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）をコード化する合成遺伝子を第Ｉ
部にて記載したｐＡＳＥＥベクターにクローン化したか
を示す。
【０１０３】ＩＧＦ−Ｉをコード化する合成遺伝子（図
８）（Ｅｌｍｂｌａｄ，Ａ．ｅｔａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＩＩ，２８７−２９６，Ｖｅｒｌ
ａｇ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８４）を
ｐＵＣ８からＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで開裂し
た。ＩＧＦ−Ｉをコード化する遺伝子フラグメントをポ
リアクリルアミドゲル電気泳動次いで電気溶離により単
離した。
【０１０４】プラスミドベクターｐＡＳＥＥをＥｃｏＲ
Ｉで部分的に開裂させ、線状化させたベクターは１％ア
ガロースゲル電気泳動から単離した。電気溶離後、線状
ベクターをＨｉｎｄ ＩＩＩで消化させ、次いで１％ア
ガロースゲル電気泳動により単離した。ＩＧＦ−Ｉフラ
グメントをこのｐＡＳＥＥベクターに結紮し、そして次
いで転換後、ｐＡＳＥＥ−ＩＧＦ−ＩはｐＡＳＥ−ＩＧ
Ｆ−Ｉの背景にて単離できた。ｐＡＳＥＥ−ＩＧＦＩは
シグナル配列の後、ＩＧＦ−Ｉに融合したＥＥをコード
化している。
【０１０５】ＶＩ．ｐＥ８ＥＥ−ＩＧＦ−Ｉの構成 この部分ではいかにしてＳＥＥ−ＩＧＦ−Ｉが第Ｉ部に
て記載したｐＡＳベクターと比較してｐＥＭＢＬの他の
配向においてクローン化されるかを示している。
【０１０６】約５０μｇのｐＡＳＥＥ−ＩＧＦ−Ｉ（第
５部にて記載したように）をＴａｑＩ及びＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで開裂させた。制限エンドヌクレアーゼＴａｑＩは
蛋白質Ａ遺伝子の翻訳出発から上流の１７９個の塩基対
を開裂させ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩはＩＧＦ−Ｉ遺伝子の下
流を開裂させる。反応混合物を４％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、ＳＥＥＩＧＦＩ−Ｉフラグメント
を切り出し電気溶離させた。
【０１０７】このメラグメントをＡｃｃＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで開裂させたｐＥＭＢＬ８に結紮した。大腸菌
ＨＢ１０１に転換した後、プラスミドｐＥ８ＥＥ−ＩＧ
Ｆ−Ｉは制限分析により分析されたように単離できた。
【０１０８】ＶＩＩ．ｐＥ９ＥＤＡＢＣの構成 この部ではいかにして逆配向において蛋白質ＡのＩｇＧ
結合部分を得るためにＳＥＤＡＢＣをｐＥＭＢＬ９にク
ローン化させるかを示している。
【０１０９】プラスミドベクターｐＲＩＴ４をＴａｑＩ
及びＥｃｏＲＩで開裂させた。制御エンドヌクレアーゼ
ＴａｑＩはＴＴＧ出発コドンから上流の１７９個の塩基
対を開裂し、ＥｃｏＲＩは蛋白質Ａの領域Ｃ中で開裂さ
せる。
【０１１０】このフラグメントはＡｃｃＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで開裂されたｐＥＭＢＬ９に結紮した。大腸菌ＨＢ１
０１に転換した後、プラスミドベクターｐＥ９ＥＤＡＢ
Ｃが単離できた。このプラスミドは複製の原型から配向
された蛋白質Ａ遺伝子を有していた。
【０１１１】ＶＩＩＩ，蛋白質Ａ誘導フラグメントの大
腸菌中の発現及び局圧化 異なる蛋白質Ａ構成体を１晩増殖させ、蛋白質Ａ、β−
ガラクトシダーゼ（細胞内マーカー）及びβ−ラクタマ
ーゼ（細胞質周囲空間マーカー）の発現水準及び局圧化
を測定した。プラスミドｐＡＳＥＥを、他の構成体と同
じ大腸菌株中に宿るように大腸菌ＨＢ１０１に転換し
た。１晩の増殖の後、細胞を遠心分離した。細胞を浸透
衝撃次いで遠心分離で（通常方法に記載したように）処
理した。ペレット中のスフエロプラストを超音波処理す
ることにより細胞内蛋白質を放出させた。
【０１１２】ベクターの型（ＡまたはＢ）はβ−ラクタ
マーゼ（ＡＭ）遺伝子に比較した蛋白質Ａ誘導構成体の
配向を言及している（図８）。β−ガラトシダーゼ、β
−ラクタマーゼ及び蛋白質Ａの分析方法を通常方法に記
載したように行った。
【０１１３】実験からの結果は表１にみられる。
【０１１４】
【表１】
【０１１５】蛋白質Ａの小さなフラグメントは繊維状増
殖並びに蛋白質Ａ誘導フラグメントを包含して細胞質周
囲に位置した蛋白質の漏出を誘発するとみている。
【０１１６】シグナル配列の直ちに後の領域Ｂを含有す
る遺伝子構成体（ｐＡＳＢ１及びｐＡＳＢ２）におい
て、蛋白質Ａフラグメントの主要部分が細胞内画分中に
見出される。結論はこの挙動はシグナルペプチドを開裂
除去するリーダーペプチダーゼの不能によるものであ
り、そして翻訳されたＢペプチドは細胞質膜に付着する
ということである。
【０１１７】ｐＡＳＢ１及びｐＡＳＢ２プラスミド各々
を保持する大腸菌培養物から精製されたＢフラグメント
の（通常のＥｄｍａｎ分解技術による）Ｎ末端配列化は
シグナル配列中へのプロセツシング部位を明らかにし、
リーダーペプチダーゼがシグナルペプチドを開裂除去し
ないことを確認した（図７）。更に、高められた発現水
準がこれらの構成体、繊維状増殖並びに通常細胞質周囲
にある蛋白質の細胞外対応体への漏出から見られる。
【０１１８】ｐＡＳＥＥ−ＩＧＦ−１構成体はまた細胞
外ハイブリッド蛋白質を与え、これは繊維状増殖と相関
がある。
【０１１９】Ｂ型ベクターを表す２種の構成体（ｐＥ８
ＥＥ−ＩＧＦ−Ｉ及びｐＥ８ＥＤＡＢＣ）は最も顕著な
繊維状増殖を示す。
【０１２０】大腸菌ＨＢ１０１中に発現されたｐＥ８Ｅ
ＤＡＢＣは高い発現水準並びに分泌を与え一方ｐＲＩＴ
４は低い発現を与えることが注目に値する。この高めら
れた発現はｐＥ９ＥＤＡＢＣ構成において上流Ｉａｃ−
プロモーターに依存することが主張できた。しかしなが
ら、この繊維状増殖及び発現水準は（Ｉａｃ−プロモー
ターから転写を誘発すると知られた）ＩＰＴＧの添加に
依存しないことが示された。
【０１２１】この分泌から結論できることは蛋白質Ａプ
ロモーター及びシクナル配列に基づく異なる構成体が繊
維状増殖、増殖培地への細胞質周囲蛋白質の輸送及び蛋
白質Ａ構成体から高められた発現を誘発することであ
る。
【０１２２】繊維状増殖は大腸菌中の熱衝撃応答に相関
しているので、次の実験は蛋白質Ａプロモーターからの
高い発現は熱衝撃応答によるのか、あるいは理由の分か
らない高い発現が熱衝撃応答を与えるのかを知るために
行った。
【０１２３】ＩＸ．熱衝撃による及びよらないＨＢ１０
１におけるｐＲＩＴ４の発現 プラスミドｐＲＩＴ４はＡ型ベクター中で蛋白質ＡのＩ
ｇＧ結合部分を保持している（図２，図９及び第ＶＩＩ
Ｉ部）、大腸菌ＨＢ１０１を１晩増殖するとき、蛋白質
Ａは増殖培地にわずかしか分泌されない（９％）。この
蛋白質Ａ構成体を、４％ＥｔＯＨ及び異なる酸化性剤が
熱衝撃応答を得るためのよく知られた他の方法ではある
が、温度上昇として熱衝撃を用いまたは用いず増殖させ
るよう選択した。
【０１２４】ｐＲＩＴ４を保持する大腸菌ＨＢ１０１を
１晩増殖させた（３０℃）。１晩の培養物を７０μｇ／
ｍｌアンピシリンを含有する１５ｍｌの新しいＴＳＢ培
地に接種し（１５０μリットル）、細胞は２個の別個の
振盪フラスコ中で２．５時間増殖させた。
【００２５】培養物の一方を１５ｍｌのＴＳＢ（３０
℃）で希釈し、３０℃で温置した。他のフラスコに５４
℃で１５ｍｌのＴＳＢを添加し、フラスコを４２℃で温
置した。
【０１２６】切替時から３時間温置した後、細胞を遠心
分離した。細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳＴで１回洗
浄し、５ｍｌのＰＢＳＴで再懸濁し、３×３０秒（ＭＳ
Ｅ超音波処理器中、ミクロチップ、出力レベル６）超音
波処理した。１０分間１６，０００ｇで遠心分離後、上
澄液を集めた。
【０１２７】蛋白質Ａを培地中及び超音波処理画分中で
定量し、細胞質周囲及び細胞質中の全量に対応する。結
果は以下の表２で示す通りであった。
【０１２８】
【表２】
【０１２９】比較的低い発現が低い光学濃度（ＯＤ５８
０）により立証される。熱衝撃細胞培養物中の発現水準
は２０倍高い。
【０１３０】これはもし蛋白質Ａ遺伝子自体の転写調節
が熱衝撃応答のものである場合のみ説明されうる。
【０１３１】本発明はわずか数種の特定な遺伝子を用い
て本明細書中に例示してきたが、本発明の基本概念はい
かなる所望の遺伝子をも発現させる遺伝子を必要とする
ものに適用できる。かくして、例えばＩＧＦ−１を発現
させるのに加え、本発明は他の有用な蛋白質、例えば他
の医薬として有用な蛋白質、例を挙げればＩＧＦ−Ｉ
Ｉ、神経発育因子（ＮＧＦ）、皮膚発育因子（ＥＧ
Ｆ）、血小板発育因子（ＰＤＧＦ）のような他のソマト
メジン類の製造に使用できる。本発明の技術はまたアル
ファー、ベーター及びガンマーインターフェロン類、イ
ンターロイシン類、インシュリン、ノイロペプチド類、
胃腸ペプチド類、または他の興味あるペプチド類の製造
に使用できる。
【０１３２】更に、本発明は宿主細胞として大腸菌の使
用に限定されるわけではなく、他の細菌性宿主細胞を用
いても同様に適用されることが観察される。更に、蛋白
質Ａから発したもの以外のシグナル配列が使用できる。
【０１３３】
【発明の効果】本発明を用いて準備した又は本発明のグ
ラム（−）菌を用いて前記グラム陰性菌中に蛋白質を発
現させ、その細胞外分泌を与える方法を効果的に行うこ
とが出来る。
【０１３４】
【図面の簡単な説明】
【図１】その異なるコード化領域を示す蛋白質Ａ遺伝子
の模式図である。
【図２】蛋白質Ａ遺伝子を含有するプラスミドベクター
ｐＲＩＴ４を例示している。
【図３】発明の詳細な説明の実施例第１部に記載したよ
うなｐＡＳ及びｐＡＳＥベクターである。
【図４】蛋白質Ａ遺伝子続いて多重制限酵素リンカーを
保持するプラスミドベクターを示す。
【図５】蛋白質ＡのＢ領域をコード化する異なる遺伝子
フラグメントを示している。
【図６】ストップリンカーの配向とは独立して既時の翻
訳停止を生じさせるストップリンカーを示している。
【図７】天然蛋白質Ａにおける結合と比較したシグナル
ペプチド及び異なるｐＡＳＢ構成体間の結合のアミノ酸
配列を示している。
【図８】合成ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列を示
している。
【図９】異なる蛋白質Ａ誘導体を発現させるのに用いら
れた２種のタイプのプラスミドベクターを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 マジアス・ウーレン スエーデン国，ウプサラ，エス−752 35，エーブルスロッツガータン ８アー

Claims (24)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プロモーター、シグナル配列及び開裂領
    域を含有する構造遺伝子を含む組換体ＤＮＡであって、
    該構造遺伝子が式化１ 【化１】（Ｅ）ｎ（Ｂ）ｍ−Ｙ （式中、ｎは１以上の整数であり、ｍは整数であり、Ｙ
    は所望の蛋白質をコード化するＤＮＡ配列であり、そし
    てＥ及びＢは蛋白質Ａ領域Ｅ及びＢに対応する遺伝子で
    ある）で表され、但し、構造遺伝子は天然蛋白質Ａをコ
    ード化するものとは異なることを前提とする組換体ＤＮ
    Ａ。
  2. 【請求項２】 ｎは１であり、そしてｍは０である請求
    項１記載の組換体ＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 ｎは２であり、そしてｍは０である請求
    項１記載の組換体ＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 ｎは１であり、そしてｍは１である請求
    項１記載の組換体ＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 ｎは２であり、ｍは０であり、そしてＹ
    はＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２をコード化する遺伝子であ
    る請求項１記載の組換体ＤＮＡ。
  6. 【請求項６】 開裂領域は少なくとも６個のアミノ酸残
    基をコード化するよう構成されている請求項１〜５のい
    ずれか一つの項に記載の組換体ＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 該残基は Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ である請求項６記載の組換体ＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 プロモーター、シグナル配列及び開裂領
    域を含有する構造遺伝子を含む組換体ＤＮＡであって、
    該構造遺伝子が式化２ 【化２】（Ｅ）ｎ（Ｂ）ｍ−Ｙ （式中、ｎは１以上の整数であり、ｍは整数であり、Ｙ
    は所望の蛋白質をコード化するＤＮＡ配列であり、そし
    てＥ及びＢは蛋白質Ａ領域Ｅ及びＢに対応する遺伝子で
    ある）で表され、但し、構造遺伝子は天然蛋白質Ａをコ
    ード化するものとは異なることを前提とする組換体ＤＮ
    Ａを含むプラスミドベクター。
  9. 【請求項９】 ｎは１であり、そしてｍは０である組換
    体ＤＮＡを含む請求項８記載のプラスミドベクター。
  10. 【請求項１０】 ｎは２であり、そしてｍは０である組
    換体ＤＮＡを含む請求項８記載のプラスミドベクター。
  11. 【請求項１１】 ｎは１であり、そしてｍは１である組
    換体ＤＮＡを含む請求項８記載のプラスミドベクター。
  12. 【請求項１２】 ｎは２であり、ｍは０であり、そして
    ＹはＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２をコード化する遺伝子で
    ある組換体ＤＮＡを含む請求項８記載のプラスミドベク
    ター。
  13. 【請求項１３】 開裂領域は少なくとも６個のアミノ酸
    残基をコード化するよう構成されている組換体ＤＮＡを
    含む請求項８〜１２のいずれか一つの項に記載のプラス
    ミドベクター。
  14. 【請求項１４】 該残基は Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ である組換体ＤＮＡを含む請求項１３記載のプラスミド
    ベクター。
  15. 【請求項１５】 ｐＥＭＢＬ９から発生する請求項８〜
    １４のいずれか一つの項に記載のプラスミドベクター。
  16. 【請求項１６】 プロモーター、シグナル配列及び開裂
    領域を含有する構造遺伝子を含む組換体ＤＮＡであっ
    て、該構造遺伝子が式化３ 【化３】 （Ｅ）ｎ（Ｂ）ｍ−Ｙ （式中、ｎは１以上の整数であり、ｍは整数であり、Ｙ
    は所望の蛋白質をコード化するＤＮＡ配列であり、そし
    てＥ及びＢは蛋白質Ａ領域Ｅ及びＢに対応する遺伝子で
    ある）で表され、但し、構造遺伝子は天然蛋白質Ａをコ
    ード化するものとは異なることを前提とする組換体ＤＮ
    Ａを含むプラスミドベクターを保持する大 腸菌。
  17. 【請求項１７】 ｎは１であり、そしてｍは０である組
    換体ＤＮＡを含むプラスミドベクターを保持する請求項
    １６記載の大腸菌。
  18. 【請求項１８】 ｎは２であり、そしてｍは０である組
    換体ＤＮＡを含むプラスミドベクターを保持する請求項
    １６記載の大腸菌。
  19. 【請求項１９】 ｎは１であり、そしてｍは１である組
    換体ＤＮＡを含むプラスミドベクターを保持する請求項
    １６記載の大腸菌。
  20. 【請求項２０】 ｎは２であり、ｍは０であり、そして
    ＹはＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２をコード化する遺伝子で
    ある組換体ＤＮＡを含むプラスミドベクターを保持する
    請求項１６記載の大腸菌。
  21. 【請求項２１】 開裂領域は少なくとも６個のアミノ酸
    残基をコード化するよう構成されている組換体ＤＮＡを
    含むプラスミドベクターを保持する請求項１６〜２０の
    いずれか一つの項に記載の大腸菌。
  22. 【請求項２２】 該残基は Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ である組換体ＤＮＡを含むプラスミドベクターを保持す
    る請求項２１記載の大腸菌。
  23. 【請求項２３】 ｐＥＭＢＬ９から発生するプラスミド
    ベクターを保持する請求項２１記載の大腸菌。
  24. 【請求項２４】 大腸菌ＨＢ１０１である請求項１６〜
    ２３のいずれか一つの項に記載の大腸菌。
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