JPH04500754A - 異種遺伝子発現のための改良細菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 艮攬濃伝ヱ凡四９人偽凶改只震再斥 肘凶■ 技血分野 本発明は新規細菌株、およびそのような新規様の生産および使用法に間する。

特に、本発明は異種遺伝子発現（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ）のために改良された特性を持つように遺伝子的に改変されてい る株に関する。

従来技術 過去２０年間に開発された組換えＤＮＡ技術は研究または商業価値を持つ遺伝子 の同定、単離および発現のための多くの方法と提供してきた８原核生物および特 に真核生物における遺伝子構造および機能の理解により、細菌株のごとき種々の 系においての単一タンパク質の過剰生産のための遺伝子発現戦略の計画的設計お よび履行が可能になった。

最も広く使用される細菌遺伝子発現系は大腸菌が宿主として使用され、異種遺伝 子発現がプラスミドまたはバクテリオファージクローニングベクター上に運ばれ る遺伝子のｍＲＮＡからの転写および続いての翻訳により起こるような系である 。大腸菌遺伝子発現宿主は望よ！−＜は、異種タンパク質の最適な生産のための いくつかの遺伝子的および生化学的基準を１つまたはそれ以上満足させている。

これらの基準には、発現運搬体内に挿入された異種ＤＮＡのためのＨ整可能な様 式での異種遺伝子発現を制御する準備１組換え不能表現型の必要性、異種ｍＲＮ Ａの安定化、および異種タンパク質生産物の安定化などが含まれる。そのような 基準は宿主株により産生される異種タンパク質の収率を最適にするのを可能にす 大腸菌での異種遺伝子の転写は適切な表現ベクター上の異種ＤＮＡの前に１かれ た種々の遺伝子プロモーター要素により制御されてきた。この点で、プロモータ ー要素の評判の良い選択はバクテリオファージラムダ左方プロモーターＰＬであ った［参照、　Ｒ，Ｍ、Ｈｅｎｄｒｉｘ、　Ｊ、Ｍ、Ｒｏｂｅｒｔｓ、　ＦＪ、 ５ｔａｈｌ　およびＲ１＾Ｊｅｉｓｂｅｒｇ（＄ｉ）、ラムダ１１コールドスプ リングハーバ−ラボラトリ−（１９８３）　］　、この１０モーターはラムダ立 ユ遺伝子のタンパク質産物により抑制できる；このタンパク質はＰＬプロモータ ーに結合し、細菌ＲＮＡポリメラーゼの転写開始を阻害する。

いくつかの調整系に対しｄ旦！突然変異によるｃエタンバク質の熱不安定性望［ （Ｈ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ７肢鉦、１０１巻、ＲＪｕ ら（編）　、　ｐｐ１２３−１３８（アカデミツクプレス、　１９８３）　］は 細菌培養の温度を変化させることにより、Ｐ１プロモーターからの発現を十分制 御できる１本発明の範囲の為には、通常の９されたい０代表的なベクターはＰ７ 、プロモーターを含んでおり、それはブラスミＬａｎｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、　 Ｇｅｎｅ　２３．ｐｐ７５−８４（１９８３）］上に見られるものを含む１μ汀 遺伝子を使用する制御された発現と合致する：また丁、Ｓ、Ｐａ、ｐａｓらによ り１９８３年７月く反復したＤＮＡ配列を持つ遺伝子のクローニングおよび発現 については特定的Ｌａｕｔｅｎｂｅｒｇｅｒらは市販品として購入可能で、ぴ９ 穎遺伝子型を持つ働くであろう、この過程はそれ故クローン化配列の一部を改変 および／または欠宿主中の遺伝子発現操作の実施から得られた必要性または好適 な性質なほとんど２つの重なり合う合成オリゴデオキシヌクレオチドから調製さ れ、それらはｐＪＬ６（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）をコードしている遺伝子配列 の約３３の反復が続いている。この歌合タンパク質はここにコラーゲン類似ペプ チドとして具体的に示される本発明の説明の次の節において好適である。このコ ラーゲン類似ペプチドのような遺伝子改変により得られるであろう優れた質につ いての議論は本出願のプロテアーゼの１つであり、↓立旦遺伝子の生産物である 。　Ｃ，Ｈ，Ｃｈｕｎｇおよび＾、Ｌ。

ＴＰ−依存プロテアーゼではない。［Ｎ、Ｒ，阿ａｕｒｉｚｉら、　Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、１８４．ｐｐＨ２４−ロブリンのようなより大きなタンパク質に 対しては活性を示さない。［概説とし後になって、プロテアーゼＬａはその発現 が温度により変えられるタンパク質の種類の１つであることが発見された：これ らのタンパク質は集合的に熱シヨツクタンパク質として知られている。　Ｆ、Ｎ ｅ１ｃｌｈａｒｄｔら＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、１８．ｐｐ２９５−３３０ （１９８４）を参照されたい、これらのタンパク質をコードしている遺伝子の転 写はｈｊＡ　Ｑ２坦）遺伝子の生産物により整合的に制御されている。　Ｔ、Ｙ ａｍａｍｏｒｉおよびＴ、Ｙｕｒａ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃｉｄ、ｓｃｉ、 υ、ｓ、＾、７９．ｐｐ８６０−８６４（１９８２）およびＦ、Ｎｅ１ｄｈａｒ ｄ狽轣B Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、１５３．ｐｐ５９７−６０３（１９８３）を参照さ れたい、しかしながらタンパク質の中で他のプロテアーゼがＩ匪座位により整合 的に制御されているのかどぅがは明らかでない、これらの結果は異常タンパク質 の分解は１突然変異株においては著しく減少されるべきであるという仮説な導（ 、Ｔ、Ａ、Ｂａｋｅｒら、　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

針ｉ、Ｕ、ｓ、＾、８１　、ｐｐ６７７９−６７８３（１９８４）　、は７…狙 と称される上述座位中の突然変異を記述している。この対立遺伝は通常細菌タン パク質分解の研究に使用されており、匡（Ｔｓ）宿主株中に維持されてきた。こ れらの２つの突然変異がひそむ細胞は３０℃では生きていけるが４２℃では結局 死んでしまう、Ｂａｋｅｒらはその分解がＩ〆…狙対立遺伝の存在でほとんど完 全に阻害される（タンパク質の半減期が６０分より長い）２つの不安定細菌タン パク質を示した。類似の観察がＪ、Ｆ、Ｋａｎｅおよびり、Ｌ、Ｈａｒｔｌｅｙ によるＴｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　６．ｐｐ９５−１０１（ １９８８）の表■に要約されている。特に、に、Ｂｕｅｌｌらは、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．ｐｐ１９２３−１９３８（１９８５）、Ｉｏｎ および／またはＩ己に欠損がある宿主中、ラムダＰＬｅＩ８５７プロモータ−レ ブレツサー系を利用してのソマトメジン−Ｃ（ＩＧＦ−１）をコードしている合 成遺伝子の増大した発現について記載している。プロテアーゼＬａ−欠損株にお けるソマトメジン−〇のこの増大した発現は構造的に類似し同じような大きさの タンパク質インシュリンに対するプロテアーゼＬａ活性の報告されている欠除と よい対照をなしている（ＣｏｌｄｂｅｒｇおよびＧｏｆｆおよびその引用文献） 、さらに、ＢａｋｅｒらはＷ…臣対立遺伝子はすべての不安定タンパク質の分解 を阻害するわけではない１例えば、ｕ述μ羽は不安定ラムダｃＩ■遺伝子生産物 の分解速度に影響を及ぼさない、それ故、大腸菌のラムダＰＬプロモーターから 発現される異種またはハイブリッドタンパク質がいｉ…匝対立遺伝子により安定 化されるであろうかどうか、また異種遺伝子発現のために大腸菌遺伝子発現宿主 中にＩゲ…戸対立遺伝子を含ませるような遺伝子改変、即ち旦およびラムダＰ　 、　−ｃ　１８５７プロモーターーレプレツサー系の利用が異種タンパク質の安 定化された生産または蓄積を導くであろうかどうかは予測できない。

見咀Ｏ！わ 本発明は異種遺伝子発現のための新規細菌株に関する。特に、本発明はａ、繰返 しアミノ酸配列または組換えによって生成されるＤＮＡ領域を含む単数もしくは 複数の異種遺伝子によりコードされている独特なアミノ酸配列から構成されるポ リペプチドの生産をコードしている１つまたはそれ以上の異種遺伝子； ｂ、前記ポリペ７チド生産遺伝子の活性を制御するためのＭｆ１１手段；Ｃ０前 記異種遺伝子により生産されるポリペプチドのタンパク質分解を遅らせるための 細菌タンパク質分解遅延手段；およびｄ、異種遺伝子を安定化するための遺伝子 安定化手段を含む新規細菌株に関する。

本発明は繰返しアミノ酸を持つポリペプチドの生産をコードしている内部反復ま たは凝反復ＤＮＡ配列を持つ１つまたはそれ以上の異種遺伝子の組合せ、並びに そのような異種遺伝子の発現を特に好む３つの宿主特質を含む大腸菌の新規様を 提供した。これらの３つの要素は（１）所望の条件下ポリペプチドをコードして いるＤＮＡ配列の転写を高めるための制御手段、（２）ペプチドタンパク質分解 を遅らせるための細菌タンパク質分解遅延手段および（３）異種遺伝子安定化手 段から成っている。

その結果、この株は反復または凝反復アミノ酸配列を持つポリペプチドの生産ま たは独特のタンパク質配列をコードするある種の異種遺伝子（ここで前記遺伝子 は組換えにより生成されたＤＮＡ配列を含んでいる）をコードしている厳密なま たは厳密ではないが相同の内部反復ＤＮＡ配列を持つ異種遺伝子、特に天然、合 成または半合成遺伝子の発現に特に適している。

図血例固単ｌ説朋 図１は大腸菌１に１１０（ＮＲＲＬ番号Ｂ−１８３５２）におけるコラーゲン類 似ペプチドの合成を示している。細胞タンパク質は［”Ｃ］プロリンで標識され ており、１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。コラ ーゲン類似ペプチドを表わしているバンドは矢印で示されており、２２キロダル トン（ＫＤａ）の見掛けの分子量を持っている０分子量マーカーはアルブミン（ Ｍｒ　６９，０００）、オボアルブミン（Ｍｒ、４８，０００＞、炭酸脱水酵素 （Ｍｒ　３０，０００＞、ラクトグロブリンＡ（Ｍｒ　１８，３６７）およびチ トクロームＣ（Ｍｒ　１２，３００）であった。

区２は大腸菌ＩＣ１０９（ρ＾Ｃ１）および大腸菌ＩＣ，１１０（ＮＲＲＬ番号 Ｂ−１８３５２＞　（ｐＡｃｌ）におけるコラーゲン類似ペプチドの運命を例示 している。細胞は５μＣｉの［”ＣＩプロリンで３分間パルス標識され、１ｍｇ の非標識プロリンにより種々の時間間隔で追跡された。細胞は比較実施例１で記 載されているような方法により処理され、一部が１２．５％５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル上電気泳動された。各々の時間点での２２ＫＤａコラーゲン類似ペ プチドに対応するバンドの強度がデンシトメトリーにより決定された０両方の株 に対し、追跡時間５分後に観察されたコラーゲン類似ペプチドの量を１００％タ ンパク質残量と呼んだ。

奸適皇実施億凶説朋 本発明は独特の特性を持つ細菌宿主微生物の新規様に関する。細菌宿主微生物は 広範囲に変わってもよい、有用な細菌株の例としては大腸菌、＞ｘ二上天丈ｚｑ 　（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　７）　、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ ｌｉｓ）、バシラス困デ１旦デ止天２工匹Ｘ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ畦懸正止肛慇 述■憇）、ネズミチフス菌（Ｓｓｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｍユ明）などがある、好適 な細菌微生物は大腸菌である。

本発明の新規様の１つの特色は、反復または凝反復アミノ酸単位から成るポリペ プチドの生産をコードしている１つまたはそれ以上の異種遺伝子である。ポリペ プチドをコードしている遺伝子の性質は広い範囲に変わり得るが、唯一の必要条 件は反復または凝反復アミノ酸配列から成るポリペプチドの生産をコードしてい るＤＮＡ配列および遺伝子が同一または実質的に同一な内部反復ＤＮＡ配列を含 んでいることである。ここに記載された本発明の目的のためには、内部反復ＤＮ Ａ配列が約６５％から約７０％と等しいまたはそれ以上の相同性を共有している 。反復性の程度は分子生物学の種々の理論的技術を用いてＤＮＡまたはタンパク 質配列相同性により判断できる０例えばＳ、Ｂ、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＣ， ＤＪｕｎｓｃｈ。

、扱！」土」工Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　４８．ｐｐ４４３−４５３（ １９７０）、＾、Ｄ、ＨｃＬａｃｈｌａｎ、Ｊｏｕｒｎｌ　盾■ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　６１．ｐｐ４０９−４２４（１９７１）およ びり、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、　Ｒｒｏｅ　Ｎａｔｌ、＾Ｃ奄пB 録しくＬ鉦醇）針、ｐｐ１４０−１４４　（１９８４）を参照されたい。

本発明の好適な実施態様において、選択されたポリペプチド生産遺伝子は、α− へリックス、ポリプロリンヘリックス、β−シートおよび／またはβ−ターンに 特有の２次構造を与える１次アミノ酸配列の生産をコードするものである。

本発明の実施に有用であるポリペプチド生産遺伝子の例としては、コラーゲン、 吸虫類卵殻ドーパータンパク質［例えば２１スンオラ　さだ工左（Ｆｉｓｅｉｏ ｌａ　ｈｇ！１力１）およびシストソーマ　マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ 　ｍａｎｓｏ＋■）］、昆虫唾液腺生糸／接着タンパク質、え±す２　盈旦ヱＷ ＜敷ぢ土罰封吋ｉｓ）　、Ｈ，左旦土歩ニアｌ：ｌ　（ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｎ ｕｓ）≦Ｌ←ｈＺンＩ　デミュサ（Ｇｅｕｋｅｎｓｉａ　ｄｅｍｉｓｓａ）のご とき海生甲殻類からの生物接着性タンパク質、エラスチン、ケラチン、トロボニ ンＣ１他の中間体フィラメントタンパク質［Ｅ、Ｌａｚａｒｉｄｅｓ、Ｎａｔｕ ｒｅ　２８３．ｐｐ２４９−２５６（１９８０）参照］または生糸フィブロイン およびタンパク質配列内にある程度の反復性を示すほとんどまたはすべてのアミ ノ酸配列を含むタンパク質の任意の形または単離物の一部または全部をコードし ているような天然に存在している遺伝子または遺伝子断片である。

有用な天然遺伝子および遺伝子断片には逆転写から生じる相補ＤＮＡおよびコラ ーゲン、ミ±Ｕ　工上皇Ｕ区（町ｊ↓を吋１ｎ）、杜、〃グ主歩三１区２（４上 ４ｏｒｎｉａｎｕｓ）　、ブ不欠之之１　デミュ並（（：ｅｕｋｅｎｓｉａ白植 直競）のごとき海生甲殻類からの生物接着性タンパク質、エラスチン、ケラチン 、トロボニンＣ１他の中間体フィラメントまたは生糸フィブロインのごときタン パク質をコードしている遺伝一過程によりメツセンジャーＲＮＡからコピーされ るＤＮＡ鎖が含まれる０本発明の実施に有用なこれらの実例となる天然遺伝子お よび遺伝子断片は代表的なものであるが、すべての有用な天然に存在する遺伝子 が含まれていることを意味していない１本発明に使用するための天然遺伝子は、 他のＤＮＡ断片上の付着末端と一致する付着末端を天然ＤＮＡ断片上に残すＢａ ｍＨＩ、Ｂｇｌｌｌ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｘｂａｌなどのごとき制限 酵素を使用して、単離のために好適に調製されるであろう、もしくは、好適には ＤＮＡリンカ−またはリンカ一群（天然ＤＮＡＩＩ？ｉ片への付着が伴われる） で修正または改変されるであろう任意の天然ＤＮＡ断片の末端は１つまたはそれ 以上の制限酵素で特異的に切断できるかまたは１つまたはそれ以上の別のＤＮＡ 断片の付着末端と一致する】つまたはそれ以上の付着末端を本質的に持っている 。

また、本発明の実施に有用なポリペプチド生産遺伝子は合成配列である。適した 合成遺伝子は望まれる反復ポリペプチドに依存して広範囲に変化するであろう。

有用な合成遺伝子の例には式−（にＩＦ）−、−（ＡＩａ）−、−（にｌｙ−Ａ Ｉａ）−、−（＾Ｉａ−Ｌｙｓ）−、−（ｆ’；１ｙ−＾１ａ−Ｇ！ｙ−＾１ａ −Ｇ！ｙ−Ｓｅｒ）−、−（Ｇｌｙ−＾１ａ−ｔ’ｒｏ＞−、−（Ｇｌｙ−Ｐｒ ｏ−ＡＩａ）−、−（Ｇｌｙ−oｒｏ−Ｐｒｏ）−。

−（Ｇｌｙ−Ｖａｔ−（：Ｉｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ）−、（ＧＩｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅ ｕ−Ｇｌｕ−Δ１ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）−、−（＾Ｉａ−Ｌ凾刀|Ｐｒｏ−Ｔｂ ｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）−、−（＾Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒ ｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）−など（式中アミ、j 酸残基はＬ−アミノ酸コンホメーションを持っている）の繰り返し単位の１つま たはそれ以にのブロックからなるポリペプチドの生産をコードしているものが挙 げられる。これらの配列のヒドロキシル化形もまた本発明のある種の実施態様に おいて好適である。

本発明の好適な実施態様において、選択される合成ポリペプチド生産遺伝子はポ リ（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）　、ポリ（’ＩＰ−Ｐｒｏ−χ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｐ ｒｏ）　、ポリ（Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｉｙ−Ｙ−Ｇｌｙ）　。

ポリ（Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（：Ｉｙ−）　、ボ１バＸ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ −Ｇｌｙ−Ｙ）　、ポリ［（ＡＩａ）４−Ｌｙｓ−＾１ａ−`ｌａ−Ｌ ｙｓ（Ｐｈｅ／Ｔｙｒ）−Ｇｌｙ−＾１ａコ９ポリ［〈ＡＩａ）　２−ｌｙ３− 　（ＡＩａ）：＋−ｉ、ｙｓ−（＾１１Ｉ）、］、ポリ（Ｃ{、−＾１ａ−Ｇｌ ｙ −＾Ｉａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ＞およびポリ（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔ ｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）　（式中w およびＹは同じかまたは異なっており、各々がアミノ酸である）の生産をコード しているものである。特に好適な実施Ｂ様において選択された合成ポリペプチド 生産遺伝子はポリ（Ｃ１ｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）　、ポリ（Ｇｌｙ−Ｖａｉ（：１ ｙ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ）　、ポリ（＾１ａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐ ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）およびその結果としての顕列の生産を コードしているものである。

半合成遺伝子もまた本発明の実行に使用できる。半合成遺伝子では天然遺伝子ま たは遺伝子断片が合成遺伝子に連結され、反復才たは凝反復アミノ酸のブロック をコードしているキメラ遺伝子を与えている。例えば、コラーゲン、吸虫類卵殻 ドーパータンパク質、昆虫唾液腺生糸／接着性タンパク質、海生甲殻類からの生 物接着性タンパク質エラスチン、ケラチン、トロボニンＣ１他の中間体フィラメ ントタンパク質または生糸フィブロインの任意の形または単離タンパク質の一部 または全部をコードしているような天然に存在する遺伝子断片は直接的またはＤ ＮＡリンカ−またはアダプターを使用して、ポリ（Ｃ１ｙ）、ポリ（ＡＩａ）　 、ポリ（（：ｌｙ〜＾１ａ）、ポリ〈＾１８佳ｙｓ）　、ポリ（Ｇｌｙ−Δｌａ −［；ｌｙ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）　、ポリ（Ｇｌ、−＾１ｍ−Ｐｒｏ）　 Aポリ （Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＩａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）　、ポリ（Ｇｌ ｙ−％’ａｌ−［：１ｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ）　、ポリ（にＩ凵|Ｌｙｓ− Ｌｅｕ（：！ｔｒ−八！ａへＬｅｕ−（：ｌｕ）、ポリ（＾１ａ−Ｌｙｓ−Ｐｒ ｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−ｉ、ｙｓ）　、ポリ（＾ｔａ、−ｉ、凾刀|Ｐｒ＊−５ｅ ｒ− Ｔｙｒ−１’ｒｏ−ＰｒｏＴｈｒ−Ｔｙｒ−ｉ、ｙａ）などの生産をツー　ドし ているような合成遺伝子に連結できる。半合成遺伝子の構成は種々の天然および 合成遺伝子または遺伝子［ｉμｍ成分の間に適当な読みわくを維持するという必 要染件が強いられており、この必要染件を満足させるにはＤＮＡアダプター！た けリンカ・・を使用する必要があるであろう、有用なりＮＡリンカ−またはアダ ブクー配列は通常約３０ｈｐ未満の長さで　結合されるペプチドに対して同様の １次または２次タンパク質構造のペプチドをコードしていてもいなくてもよい。

本発明の好適な実施態様において、選択される半合成ポリペプチド生産遺伝子は 、ポリ（（：Ｉｙ−Ｘ−Ｙ）　、ポリ（ＣＩｙ−Ｐｒｏ−Ｘ）　、ポリ（にＩｙ −ＸＰｒｏ）　、ポリ（Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｙ−Ｇｌｙj　。

ポリ（Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｉｙ−Ｇｌｙ−）　、ポリ（Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ −Ｇｉｙ−Ｙ）　、ポリ［（ＡＩａ）、−１、ｙｓ−＾１ａ|八１ａ−Ｌ ｙｓ−（Ｐｈｅ／Ｔｙｒ）−にｌｙ−＾１ａ〕、ポリ［（ＡＩａ）、−Ｌｙｓ− （ＡＩａ）ｓ４ｙｓ−＜Ａｌｔ）ｚ］、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌ煤|（：１ ｙ−＾ｌ１−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）およびポリ（＾Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｔ− Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）　（■■A ＸおよびＹは同じかまたは異なっており、各々アミノ酸である）からなる群より 選択される１つまたはそれ以上のき成ブロックを持っている、およびコラーゲン 、エラスチン、吸虫類卵殻ドーパータンパク質、生糸フィブロイン、昆虫唾液腺 生糸／接着性タンパク質および生物接着性タンパク質からなる群より選択される １つまたはそれ以上の天然に存在するブロックを持っているポリペプチドの生産 をコードしているものである。

特に好適な実施Ｒ様において、選択される半合成ポリペプチド生産遺伝子は、ポ リ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）　、ポリ（Ｇｌｙ−Ｖａｌ−に１ｙ−Ｖａｔ−Ｐ ｒｏ＞、ポリ（ＡＩａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｙｒ|Ｐｒ ｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）およびその結果としての順列（ｓｅｑｕ ｅｎｔｉａｌ　ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ）から成る群より選択される１つまた はそれ以上のブロックを持っている、および上にリストした天然に存在するポリ ペプチドから選択される１つまたはそれ以上のブロックを持つポリペプチドの生 産をコードしているものである。

ポリペプチド生産遺伝子の大きさは望まれるポリペプチドの分子量に依存して広 範囲に変化するであろう。本発明の好適な実施態様においてはポリペプチド生産 遺伝子の長さは少くとも約７５ｂｐの長さであり、特に好適な実施態様において は、遺伝子は少くとも約１００ｂｐの長さである０本発明の最も好適な実施官様 においては、ポリペプチド生産遺伝子の大きさは少くとも約５００ｂｐの長さで ある。

第２の本質的特色として、本発明により提供される大腸菌の新規株は異種遺伝子 の活性を開始させるための制御系を含んでいる。本発明の実施に有用な制御系は 広範囲に変わるであろう、有用な制御系の実例としては温度変化、栄養変化、異 種のＲＮＡポリメラーゼの添加抗生物質の存在または不在、中間段階の代謝に含 まれる細胞内化合物のレベルの変化などに応答性のあるものである０例えば、温 度感受性レプレッサーをコードしているｄμ汀に連結されたラムダＩＬＬ（λｐ ＋、）プロモーターは温度の変化に応答性である遺伝子スイッチを形成するのに 使用できる。ラムダｐＬは通常複製のＣｏ１Ｅ］またはＲ１起点な含む発現ベク ター上に存在している。そのようなプラスミドはλｐＬプロモーターに続く都合 のよい制限部位を持っており、そこへ、普通の遺伝子工学技術を用いて異種遺伝 子が挿入できる。　Ｃ，Ｄ、Ｓｔｏｒｍｏ、Ｔ、Ｄ、５ｅｈｅｉｄｅｒおよびり 、Ｎ、（：ｏｌｄ、Ｎｕｅｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　P０．ｐ ｐ ２９７１−２９９６（１９８２）　、＾、Ｓｈａｔｚｍａｎ、Ｙ、Ｓ、Ｈｏおよ びＨ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒ８．遺伝！１（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐ ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅ３ｓｉｏｎ）、Ｍ、Ｉｎｏｕｙｅ （編）、ｐｐｌ−P４（アカ デミツクプレス、１９８３）；＾、Ｒａｔｔｒａｙ、Ｓ、ＡＩｔｕｖｉａ　、Ｇ 、Ｈａｈａｇｎａ　、Ａ、ｆｔ、０ｐｐｅｎｈｅｉｓおよびＨ，Ｇｏｔｔｃｓｍ ａｎジｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｅｔｅｒｉｏｊｇ＞□、ｐｐ２３８−２４２（ １９８４ンを参照されたい。リポソーム結合部位およびＡＵＧ開始コドンがｐＬ プロモーターに続いているであろうし、それは異種遺伝子の翻訳の正確な開始を 可能にしている。制御系およびプラスミドは通常の遺伝子工学技術を使用して大 腸菌内へ導入できる。Ｊ。

Ｇ、５ｕｔｅ１ｉｆｆｅおよびＦ、Ｍ、＾ｕｓｕｂｅｌｌｌｉ子工ｉ（Ｃ：ｅｎ ｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、＾、Ｍ、Ｃｈａｋｒ≠ｂ■ ｒｔｙ（＄ｉ＞　、ｐｐ８３−１．１１（ＣＲＣブレス、１９７８）およびＲ， Ｗｕ、Ｌ、−Ｈ，ＧｕｏおよびＲ，Ｃ，５ｃａｒｐｅｌｌａ）１１伝子ｇ（Ｇｅ ｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　、Ｐ、Ｃ，Ｈ ｕａｎｇB Ｔ、Ｔ、ＫｕｏおよびＲ−Ｎｕ（ｉＪｉ＞ｐｐ３−２１（アカデミツクプレス、 　１９８２．）　ｌ参照されたい。温度−感受性１μＪ突然変異体は種々の方法 で適した大腸菌宿主へ導入できる。例えば、突然変異は合致するプラスミドまた はエビソーム（λＩ）Ｌプロモーター３運んでいるＣｏ１Ｅ１またはＲ１−誘導 プラスミドに対しＰ１５Ａ−誘導プラスミドのごとき〉上に導入させるかまたは 直接クローニングベクター上に存在させてもよい。

もしくは、温度感受性ｃ１８５７突然変異は例えば溶原性ラムダファージにより 細菌染色体上に供給できる。良好な発現系の確立のため、このファージは以下の ような性質を持っていなければならない。それは自発的にまたは高温で細菌染色 体がら切り出すことはできず、十分なｃＩレブｌ／ツサーを産生すべきで（その 濃度がプラスミド上に運ばれるλＩＬＬプロモーターにより滴定されなくてはな らないように）、および誘導条件下有意な量のファージ関連タンパク質を合成し てはならない（異種タンパク質の収率を減少させないように）、転写終結信号が 異種遺伝子配列に存在する場合、ファージに対しては機能性Ｎタンパク質を発現 し、１ラスミドに対しては、Ｎ利用配列をＩＬＬプロモーターおよび異種遺伝子 間Ｃご含んでいることが望まれるであろう、この配置を用いると、Ｎの非終結機 能により、異種タンパク質（類）の著しく高い発現につながる。　Ｈ，Ｒｏｓｅ ｎｂｅｒｇらの上記文献を参照されたい。

誘発物質の存在に依存する制御系の例はプラスミドｐＫＫ２３３−２［Ｅ、＾ｍ ａｎｎおよび、■７Ｂｒｏｓｉｕｓ、Ｃｅｎｅ４０．ｐｐ１８３−１９０（１９ ８５）］である、４：の制御系は非融合状態において異種タンパク質の高レベル での生産を可能にする９プラスミドｐＫＫ２３３−２はｍ−上且旦融会プロモー ターであり、共通１７−ｂｐ間隔に到達するために−】０および一３５領域の間 に】ｂりを加えたことによりｔａｃプロモーターと異なっている１匹プロモータ ーを含んでいる。１ニー９−プロモーターに続いて一１五ｌリポソーム−結合部 位および（ＡＴＧ）翻訳開始コドンがある。１ρＫＫ２３３−２７ラスミドは普 通を工Ｓ−プロモーターの強固な抑制のためにＩａｃＩ”株中に維持されている 。高温のかわりに、このプロモーターは細菌培地への一イソプロピルチオガラク トビラノジド（ＩＰＴＧ）のごときガラクトピラノシドの添加により誘導される 。この制御系は標準的形質転換技術により適当な大腸菌宿主内へ導入できる、例 えばり、１Ｔａｎａｈａｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６６、ｐｐ５５７−５８ ０（１９８３＞ｔたはエレクトロポレーションにより。

異種遺伝子の制御のために、培地中の栄養の消耗に頼っているスイッチの実例は プラスミドｐＷ７１２１である。　［Ｍ、Ｔ、Ｄｏｅｌら、　Ｎｕｅｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８．ｐｐ４５７４−４５９２（１９８０）］、 このプラスミドはトリプトファンの不在に応答する。この遺伝子スイッチは培養 培地からのトリプトファンの消耗またはβ−インドールアクリル酸の添加により 活性化される。この遺伝子スイッチは上に示したものと同一の形質転換技術によ り適した大腸菌宿主に導入できる。

異種ＲＮＡポリメラーゼの利用可能性に依存する制御系の例はＴ７発現系である ［＾、１１．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、　Ｇｅｎｅ　５６．ｐｐ１２５−１３５（ １９８７）］、大腸菌およびＴ７プロモーターを決めているＤＮＡ配列は全く異 なっており、Ｔ７プロモーターは大腸菌ＲＮＡポリメラーゼにより認識されない 、それ故ベクターはｐＥＴ−３ｍ同様に異種遺伝子がＴ７プロモーターの制御下 に置くように構成されている。遺伝子はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼが供給されな いかぎり転写されないであろう、これは一般に３つの方法により達成される：Ｔ ７プロモーターのための遺伝子は調整可能大腸菌プロモーターの制御下宿主染色 体上に存在できる；調整可能大腸菌プロモーターの制御下一致するプラスミド上 に残ることができる；λＤＮＡ中のプロモーターの制御下Ｔ７ＲＮＡポリメラー ゼのための遺伝子を運ぶファージλ誘導体上へ導入できる。

本発明の実施において、好適な制御系には上に議論したものが含まれるがしかし それに制限されるわけではない。

第３の本質的特色としては、本発明の大腸菌株は細菌タンパク質分解遅延手段を 含んでいる。そのような手段の性質は広範囲に変わるであろう、適したタンパク 質分解−遅延手段の例は、プロテアーゼをコードしている、および／またはこれ らのプロテアーゼの生成、活性または分解の制御に関与する適切な座位での突然 変異によって１つまたはそれ以上のプロテアーゼの生産が欠損した株を利用する ことである。そのような方法は＾几、ＧｏｌｄｂｅｒｇらによりＰＣＴ出願第８ ５０３９４９号および米国特許出願第４，７５８，５１２号に記載されており、 そこでは発現された異種タンパク質の分解を防ぐため、Ｉｏｎ、ｈｔ述または両 方の組合せの突然変異対立遺伝子を含む大腸菌株の使用が記載されている。

タンパク質分解を遅らせる他の手段は宿主細胞内に１０テアーゼの拮抗剤または 阻害剤またはそれらの特異的形成または活性化のための手段を産生ずることであ る。この型のタンパク質分解遅延の例はり、Ｄ、ＳｉｍｏｎおよびＲ，Ｂ、Ｆａ ｙにより１９８３年３月２日に出願された欧州特許第７２９２５号に記載されて いる。記載されているのは大腸菌のプロテアーゼ活性を阻害するためのバクテリ オファージＴ４からのクローン化ＩＬｆＬ遺伝子の使用であり、ヒト線維芽細胞 インターフェロンのごときある種の発現された異種タンパク質を安定化している 。

これらの一般法の両方とも好適なタンパク質分解−遅延手段である。

本発明の最も好適な実施態様においては、タンパク質分解−遅延手段はタンパク 質分解に関与する酵素を制御する遺伝子中に突然変異を導入することにより提供 される。主たる細菌プロテアーゼの１つはプロテアーゼＬａである（ＬＱｆｌ遺 伝子の生産物）、この遺伝子は熱−ショック系の一部であり、それ故肛餅（葎」 ）陽性調整遺伝子の制御下である。それ故、タンパク質分解の減少は励または■ 述座位内へ突然変異を導入することにより達成されるであろう、ｆａｎ遺伝子中 の突然変異は入手可能である、例えばｂ可萎およびＩｏｎｊ山曵突然変異、Ｓ、 ＾、ＧｏｆｆらＰｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｅｉ、Ｕ、ｓ、Ａ、８１　、 ｐｐ６６４７−６６５１＜１９８１）を参照されたい、壇遺伝子中の突然変異は バクテリオファージＰ１形質導入のごとき標準分子遺伝子技術により大腸菌宿主 内へ都合よく導入できる。

多数の肛岨突然変異が単離されているけれども［＾、Ｄ、ＧｒｏｓｓｍａｎらＪ 、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１１６１、ｐｐ９３９−９４３（１９８５）］、石ｉ…場の みが働きうる突然変異であるべきことがそれ自身証明されている（　Ｂａｋｅｒ ら、上記文献）、■居■臣対立遺伝子はアンバーナンセンスコドンを含んでいる 。ｌノ」瓜対立遺伝子を含む株を３０℃（４１℃ではない）で生存可能にするた めに、一般的に温度感受性アンバーサプレッサーｍ（Ｔｓ）と連結して維持され る。

突然変異は大腸菌のタンパク質分解に対し深い影響を持っている。ある種の条件 下、匹メ…匝突然変異は壇突然変異よりもタンパク質分解のより大きな減少を導 く、それ故、ただ１つの突然変異が使用されるなら、牡正申臣が好適な突然変異 であろう、肛ハ突然変異のみを含む大腸菌株を使用する他の利点が特許請求され ており（にｏｌｄｂｅｒｇら、前記文献）、ポリサッカライドの過剰生産がない こと、欠陥細胞分割がないこと、およびＵＶ光に対しての異常感受性がないこと などが含まれている。それ故、発酵条件下、ｈＷ…臣突然変異は（支）傍熱変異 体を含む株よりもより増殖しうる株である。しかしながら、別の場合においては Ｉｏｎ　巳貝迂亜二重突然変異体がタンパク質分解の最も遅い速度を示している （Ｇｏｌｄｂｅｒｇら。

上記文献）、それ故ある種の不安定タンパク質の発現研究のためには二重突然変 異体の構成が望まれるであろう、励メ…匝突然変異は標準遺伝子技術を用いて細 菌株間を移すことができ、肥匹豆蛙突然変異がすでに隠れている受容体株が提供 される。突然変異を移す１つの方法は、Ｉ述および鮭は約５％リンクしているの で懸ｕでの突然変異と同時のＰ１形質導入である。

本発明の第４の本質的特色は、異種ポリペプチド生産遺伝子の自然の欠損を防止 する手段である。遺伝子配列それ自身、それが残っているプラスミドレプリコン および種々の宿主因子などの多数の因子が異種ペプチド−生産遺伝子の安定性に 影響できる。異種遺伝子の安定性に影響する宿主因子としてはＤＮＡの複製、修 復および組換え（一般的相同体および部位特異的組換えの両方）に含まれる遺伝 子生産物が含まれるが、しかし、それらに限定されるわけではない。

ＲｅｃＢ　、ＲｅｅＣ、ＲｅｃＤおよび特にＲｅｃ＾のごとき遺伝子産物はＤＮ Ａ基質のほとんどの型の一般的同種組換えに目立った役割を通常果たしている１ 本発明の好適な実施態様において、ｒｅｃＡ突然変異が一般的同種組換えを経る 高度反復異種遺伝子の自然の欠損を阻害するために使用された。μ値対立遺伝子 はそれがただ安定であるばかりではなく、Ｒｅｅ＾タンパク質の組換え機能を部 分的というよりもむしろ完全に不活性化するので好適である。これらの基準を満 たすｒｅｅＡ遺伝子の対立遺伝子は一般に入手可能でｒｅｃＡ遺伝子の欠損なら びにトランスポゾン挿入物を含んでいる。　［Ｄ、に、Ｎｉ１ｌｉｓら、上記文 献］、他の一般の使用される２値対立遺伝子はμ値１およびｒｅｃＡ１３であり 、それらは市販品として入手可能な株中に存在している。

株間でのこれらの突然変異の移動は選択可能マーカーにより容易にわかる。この マーカーは一般に抗生物質耐性かまたは代謝マーカーである。抗生物質テトラサ イクリンへの耐性がひそむＴｎｌＯのごときトランスポゾンがしばしば使用され る。

各々カナマイシンおよびクロラムフェニコールへの耐性がひそんでいるＴｎ５お よびＴ９のごとき他のトランスポゾンもアンピシリンへの耐性がひそんでいるＭ ｕｄファージの中にある状態で入手可能である。もしくは、ソルビトール利用の ための遺伝子、１は大腸菌遺伝子地図上のｒｅｃＡの近くに位置しており、この 座位における突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）もまた入手可能である。マーカー はトランスポゾン挿入物のごとく匹ψ遺伝子中に直接位置していてもまた遺伝子 のそばに位置していてｒｅｃＡ中の非選択可能突然変異と連結して使用されても よい。

これらの突然変異は種々の標準遺伝子技術により林間で授受される。最も普通の ものの１つはＰ１形質導入である。２つの入手可能なＰ１突然変異の１つがしば しば使用される、ＰｌｖｉｒまたはＰ１ｃｅ＋ｌ　、ｃｌｒｌｏＯ，両方とも野 生型Ｐ１ファージよりもいくつかの技術上の利点を持っている。Ｐｉｖｉｒの使 用は受容体株において偶然的なＰ１リソゲンの確立を防げる。　Ｐｌｅｍｌ、　 ｃｌ工１００は宿主株においてクロラムフェニコール耐性で選択されることによ り容易にリソゲンとして貯蔵できる。熱誘導により高力価ライセードが作られ、 形質導入は高温（リソゲン（ｌｙｓｏｇｅｎ）は形成されない）または低温（偶 然的なリソゲン、その形成はそのクロラムフェニコール耐性により同定できる） で実施できる０株間の突然変異の授受に他の遺伝子技術もまた利用できる。これ らに含まれるものはＨｆｒまたはＦｏおよぞＦ−細胞間の断続交配および特殊化 形質導入ファージの導入である。所望のｒｅｃＡ突然変異は通常株構成の最終段 階で導入されることに注目することが重要である。これらの３つのマーカー移動 技術は大腸菌染色体内へ適当な突然変異を組込むための同種組換えに一般的に依 存しているので、安定組込みは囚−欠損株では非常に困難であろう。

本発明の最も好適な実施態様の継代培養物、大腸菌株１に１１０．は北部地域リ サーチラボラトリ−５農業研究サービス、米国農務省、ビオリア、　ＩＩ＋、米 国、の永久収集物に受付番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３５２として供託されている。

この培養物の供託の永続性および一般によるそれへの容易な入手は、特許が付与 された場合には特許が効力を有する間与えられる。出願の係属中は３７Ｃ，Ｆ、 Ｒ，１，１４および３５　Ｕ、Ｓ、Ｃ，１１２のもと培養物へのアクセスが利用 できる。供託培養物の一般への利用に対するすべての制限は特許付与により取り 消せない様式で除去される本発明により提供される大腸菌の新規株は多数の有用 なポリペプチド生産物を生産する細菌を作るまたは創造する本発明の方法で使用 されるであろう、そのような生産物の例はコラーゲン、エラスチン、ゲラチン、 高等生物の厚い、中間または薄いフィラメントのタンパク質または糖タンパク質 要素、生糸フィブロイン。

トロボミオシン、トロボニンＣ，レジリン（ｒｅｓｉｌｉｎ）、卵殻タンパク質 、昆虫角皮タンパク質、または反復または凝反復１次構造を含む他の構造タンパ ク質のごとき天然に存在するタンパク質への類似体である。

この方法において、大腸菌の新規様はポリペプチドの所望の量を生産するのに十 分な時間適切な条件下で培養される。自由に生きているまたは固体化された大Ｍ ｌ菌の培養は液体および固体栄養培地の両方で２２°から３０℃の温度で実施で きるであろう、誹だ微生物の限定された量の調製には表面培養およびボトルが用 いられるであろうことを理解しなければならない、微生物は炭素源（例えば同化 可能炭化水素）および窒素源（例えば同化可能窒素化合物またはタンパク質性物 質）を含む栄養培地中で増殖させる。好適な炭素源としては　グルコース７赤砂 糖、スクロース、グリセロール、デンプン′、コーン゛スターチ、ラクトース、 デキストリン１糖蜜などが含まれる。Ｉ適な窒素源としては、コーン浸液＜ｃｏ ｒｎ　５ｔｅｅｐ　１ｉｑｕｏｒ）、酵母、自己分解されたビール酵母とミルク 固形物、大豆ミール２綿実ミール、コーンミール、ミルク固形物、カゼインの肝 臓消化物、蒸蕾酒残渣、動物ベア１−ン液、魚−ミール、肉および・臣くず、Ｎ Ｈ，ＣＩまｔ：はＮＨ４５Ｏ，のごとき無機塩などが含まれる。これらの炭素お よび窒素源の組合せが都合よく使用きれるであろう、水道水および微量金属を含 んでいる未精製成分が培地組成物として使用されるので、例えば亜鉛、マグネシ ウム、マンガン′、１バノ目・６鉄なとの微量金属は発酵培地に加える必要がな い。

十分なポリベグチドカ；生産されフ、材麦、生成物は当業名には既知の通常の精 製技術を使用１〜で増殖培地から単離できる４、−二の技術は特定のタンパク質 への応用に対して広範囲に変化しうるが、非分泌性タンパク質に対しては通常濃 縮および続いての微生物細胞の破壊、続いて以下の操作の１つまたは組合せが用 いられる：沈殿、相分配、ゲルｒ過、・イオン交換クロマトグラフィー、アフイ ニテイまたは免疫アフィニディクロマト・グラフィー、Ｆｌ、Ｃ，１（ＰＬＣ、 グル電気泳動およびその他（多数で書ききれない）。この問題の総説どしては下 記の文献を参照されたい：Ｒ，５ｅｏｐｅｓ、タンパク質精製；原理および実際 、スブリンガーーーーフエルラーグ　ニューヨーク、　Ｉｎｃ、（１９８２）； Ｆ＾、０　、Ｍａｒｓｔｏｎ　、　Ｂｉｏｅｈｅｍ　、　Ｊ　、２４０　、　ｐ ｐｌ−１２（１９８６j　；Ｍ、Ｒａｔａｆ　ｉａ および１．Ｋｅｅｎａｎ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｑｔｅｃｈｒ４ｏｊｇｙ−山 坤視ユ■４．ｐｐ４０−４７（１９８６）。

以下に発酵培養物からのタンパク質精製に用いられた方法の一般的例示を記載す る０組換え体ヒトインターフェロン−αＡの精製のための方法はに、Ｋｉｔａｎ ｏおよびＦ、Ｓｈｉｇｅｒｕにより米国特許第４，６５６，１３１号（１９８７ ）に記載されており、そこでは大腸菌培養液が遠心分離により集められ、超音波 処理により破壊され、続いて大腸菌ベレットはプロテアーゼ阻害剤およびリゾデ ームを含む緩衝液に溶解され、遠心分離するとベレットおよび上澄液相を与える 。上澄液相に存在するインターフェロン−αＡ活性は、希釈上澄相を抗イツク〜 ７ＸロンーαＡ免疫アフィニティ力ラムに適用することにより精製される。１− のｉ％合、所望のヒ１イご・ターフェ！コン−α、へ組換え体タンパク質生成物 は遠心分離に続いての細胞溶菌液のＥ澄液中（こ残っている。しか１７ながら、 多くの組換え体タンパク質生成物か細胞溶＠液の遠心分断後のベレ・・ｊｉ−に 勾配されている。この、ことは組換え体クンバＪ′７霧の光屈折小体、土ｌコは 封入体内への濃縮または凝集が寄与しでいるであろう（封入体の形成に閏年する 因子に関する総説としではＫａｎｅおよびＮａｒｔ　ｌｅｙ　Ｕ：：Ｅ２献を参 照されたイ）、この場合の例はＮ、１１．Ｋｏｒｒｒａｄおよびり、Ｓ、１．ｉ ｎに９Ｌり米国特許第・１．・３５０゜１０３号（１９８４）に記載さノｔてい る大腸菌のｉ８養渣からｆｌｉ；ｌ換え体ヒ１−インターフ１０ンーβの１ｌｌ ｌ製である、この１１７トコールにおいＣは大腸菌が交差流動Ｊコ過により集め らｉｌ、マ〉トンーガウリンホモゲナイザーを通Ａさせること（、こより破壊さ れ、次に遠心分離されるとベレットおＪ：び」、澄液分画き勺える、封入体はＳ ＤＳに可溶化され、ヒ（−イユ・ターフエロンーβは２−ブタ／−）ＬにＪ：る 抽出により相分配される。ヒトインターフェロン−βは次に酸性ｐＨで水性緩衝 液を加えることによりブタ−７−ルから沈殿させられる。沈殿は水性Ｓ　Ｄ　Ｓ 溶液に溶解し、モレキュラージーグ力うム史のクロマ）・り゛ラフイーにより精 製されｙ、。

いくつかの応用に対！７では、大規模な精製を・行−）てないタンパク質の使用 か射適て′あろう。８１えばＰ、Ｊ、Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、セファロースおよび炭 化水素からの単一・細胞タンパクダ１、ノイエスデータコーポレーション（１９ ７６）を参照されたい。

本発明の細菌株は種々の有用なポリペプチドの製造に使用されるであろう１例え ば、ポリペプチドは繊維製品、合成皮革および化粧品への添加物の製造い使用さ れるであろつコラーゲン１、゛Ｌテラスン、昆虫唾液腺生糸タンパク質、生糸フ ィブロイン、トロボニンＣ５１−・ロボミイシンなどのごとき天然に存在する繊 維性タンパク質の合成類似品であろう。同様に本発明の細菌株は昆虫唾液腺接着 性タンパク質、−ミ」トヅヌ　エ」シミ３０年り上値９白上ｉσ、Ｈ，Ｌ太ホ匹 ｊど乙乙ス（９すｊト皿ｉａｎ＋胆）およびＪ不欠之に１　デュ１ｊ（賄吐μ狙 ｉ仮峠押）のごとき海生甲殻類からの生物接着性タンパク質、吸虫類卵殻ドーパ ータンパク質など（接着剤の製造に使用できる）のごとき天然に存在する接着剤 の合成類似品の製造に使用できる、同様に、本発明の細菌株は部品の製作に使用 できる卵殻タンパク質、昆虫角皮夕〉・バク質などのごとき天然に存在する建築 タンパク質の合成類似品の製造に使用て′きる。

以下の実施例は本発明のより特別な例示のために与えられるものであり、それに 制限されるごとき意味に取ってはならない８」阿よ りＮＡ史と此Ｊ旦プーゲ之類似体を人や」滅】伝子ｌバ２スラ洛ま工２Ａ℃」！ 」 下記の相補的およびオーパーラ・・ノビングオリゴデオキシヌクレオチドはＳ、 Ｌ。

ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓにより、Ｔｅｔｒａｈｅｄ ｒｏｎＬｅ±ｔｅｒ旦　、ｎｕ：ｐｐ、１８５９−１８６２（１９８１）に記載 されているごとき固相ホスホラミダイト化学？用いて、アプライドバイオシスア ムスモデル３８０ＤＮＡ合成機により調製さｉまた：＾、５’−（：Ｇ　ににＴ 　ＣＣに　ＣＣに　にＣＴ　ＣＣＧ　Ｃ−３”８、３“−ＧＧＣＣＣＡ　Ｃ，Ｇ Ｃ（：にＣＣＣＡ　ＧＧＣ−５”各々のオリゴデオキシヌクレオチドは８Ｍ尿素 を含む２０？Ｊポリアクリルアミドゲル」−の電気泳動４′：：より溶出される ショーターチェイン−伸長失敗生成物から単離された０分析ゲル電気泳動により 分離された末端標識オリゴデオキシヌクレオチド生成物から調製されたオー斗う ジオダラムのデンシトメトリーにより決定されるごとく最終生成物は９５９６よ り高い純度であった。オリゴデオキシヌクレオチドＡおよびＢの５′末端へ、８ ．６μｍｏｌオリゴデオキシヌクレオチドおよび２Ｏ単位Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼと溶解した３５−４５．１の緩衝液（６６ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７ ，６，１ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ　ＭｇＣ１，，１５ｍＭジチオスレイトー ル、２００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン〈ＢＳＡ）および１ｍＭ　［ｒ　”Ｐ ］ＡＴＰ、比活性０．２Ｃｉ／ｍｍｏＩ　）から成る反応液で別々にリン酸基を 添加した。これらの反応混合物は３７℃にて２時間インキュベートした後金併し 、］、４℃にて一夜インキユベートした。この間、オリゴデオキシヌクレオチド ＡおよびＢはアニール化され、多分、１塩基対の張出Ｌ３’末端を持つ１７塩基 対異種二連体または８塩基対張出し７５゛末端を持つｊＯ塩基対異種二連体が形 成されるであろう。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（・１Ｏ単位）が添加され、トリペプチ ド（Ｃ１ｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）の多数繰返しをコー　ドする多反復異種二連体１ ’）ＮＡまでアニール化オリゴデオキシヌクレオチドを重合させるため１４℃に て３０間インキコベーションを続けた。、：れらの創成遺伝子はＴＥ緩衝液＜１ ０ｒｎＭ）リス−ＨＣｌ、　Ｆ）Ｈ７，５゜１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に対して透析し て非取込みオリゴデオキシヌクレオチドおよび緩衝液成分を除去した６合成遺伝 子の末端は６００μＭの各々のｄｃＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＡＴＰおよびＴＴＰ；５ ０ｍＭ）リス−ＨＣ！。

ｐＨ７，８＋９ｍＭ　ＭｇＣｌ、；１０ｍＭ２−メルカプトエタノール；および ５０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡを含む反応液（総量で５０ｕｌ＞中、３単位の大腸菌Ｄ ＮＡポリメラーゼのクレノー断片を使用して平滑断端化した。この反応混合物は １４℃にて３０分間インキュベートした後、１０ｍＭまでＮ　ａ　３Ｅ　Ｄ　Ｔ 　Ａを加え、１５０μｍのＴＥ緩衝液もまた添加された０合成遺伝子はＤＥ−５ ２カラムで精製された後エタノール沈殿された。これらの合成遺伝子は本質的に 同じ方法で調製され、セファロース６Ｂ（ファルマシア）カラムを通しである別 のバッチの合成遺伝子の排除分画といつしＪにされた０合併合成遺伝子はセファ ロース４Ｂ（ファルマシア）カラム上で大きさで分画された０合成遺伝子の大き さ分布は５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により決定された。

高度に重合された合成遺伝子に富む分画の相対分子量分布は変性（即ち８Ｍ尿素 を含む）および非変性５％ポリアクリルアミドゲル上で比較された。これらのゲ ルは単鎖合成遺伝子の分子量分布が異種二連体合成遺伝子の分子量分布から期待 されるものより小さいことを示しており、二重鎖異種二連体ＤＮＡ中に切れ目お よび／または間隙が存在したことを示唆している。１．２μｇの合成遺伝子中の 切れ目および／または間隙は歪ン　旦）０で１６７μＭの各々のｄＣＴＰ、ｄＧ ＴＰ、ｄ＾ＴＰおよびＴＴＰ存在下（前記平滑断端反応液中に記載したごとき他 の緩衝液成分と）１０℃で２０分−１単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエを用い てニック−トランスレーションを行った（総量で１５ｕｌ）。

合成遺伝子（０，５μｇ異種二連体ＤＮＡ）は更なる取扱いをせずに前記リン酸 化および結合反応のために記述した緩衝液中（総ｊｉｌｏμｍ）５単位のＴ４Ｄ ＮＡリガーゼを用いてＣＩａＩ−消化および平滑断端化ｐ　Ｊ　Ｔ−６ブラスミ ドＤＮＡ＜２．０μｇ）に結合された９反応混合物は１４℃にて一夜インキユベ ートされ、ＴＥＩＩ衝液で２００１１１まで希釈し、Ｈａｎａｈａｎ　（１９８ ３）法に従って直接大腸菌株ＭＨＯＩの形質転換に使用された。

自戒遺伝子挿入片を運んでいるプラスミドを含むコロニーは、放射性標識化オリ ゴデオキシヌクレオチドＡをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーシ ョンにより同定された。挿入片を運ぶプラスミドは単離され、挿入片を測るため 制限酵素地図作製による物理分析にかけられた。２００から３５０塩基のコラー ゲンｉ似遺伝子挿入片で１ラスミドを選択し、挿入片および隣接するプラスミド 領域は化学およびダイデオキシ法（＾、Ｍ、Ｍａｘａｍおよび−、Ｇｉ　Ｉｂｅ ｒｔ　、％ｉ、６５．ｐｐ４９９−５６０．１９８０）　（Ｒ，Ｊ　、Ｚａｇｕ ｒｓｋｙら、　Ｇｅｎｅ　Ａｎａ上ｔｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ@２．ｐ ｐ２８９− ２９４．１９Ｓ５）の組合わせにより配列決定された。５′および３′両方のプ ラスミド／挿入片結合での適切な読み枠および正しいコードづけ情報に基づき、 これらのプラスミドの１つがｐＡＣｌと名付けられ、ポリ（Ｃ１ｙ−Ｐｒｏ−Ｐ ｒｏ）発現の分析に使用された。

犬旌河１ ＩＧＩＩＯの この構成（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）の親株はＣＡＧ４５６　（ＩａｃＺ（＾ 翔）」（八−）酎（＾−）兇司田狙肛匹（Ｔｓ）ｍａｌ　己ｐｊＢ　ｒｅｌ）で あり、Ｔ、Ａ、Ｂａｋｅｒ、Ａ、Ｄ、ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＣ，Ａ、Ｇｒｏｓ ｓにより、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

旦旦ユ、Ｕ、Ｓ、Ａ、旦ｌ、　ｐ　ｐ６７７９−６７８３　（１９８４）に記載 されている。この株は３０℃にて徐々に増殖し、４２℃では増殖できない。ＣＡ Ｇ４５６は欠損ラムダファージλ　ΔＢａｍｒｅｘ：：Ｋｍ’　ｃＩ８５７Δ（ ｃ　ｒｏ−ｂ　ｉ　ｏＢ）を導入したＴ、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎから入手した。処 理中株はＢｉｏ−となり、ＴＡＰ１３０と名付けられている。この工程で使用さ れたλｄｅｆファージは新しい構成物であり、文献にはまだ記載されていない。

ＴＡＰ１３０は我々に送られてきており、安定なｒｅｃＡ突然変異はバクテリオ ファージＰ１形質導入により導入された。ｒｅｃＡ対立遺伝子の供与体は大腸菌 株ＤＣ１１３８［ｒ”ｍ１工Ａ　土旦旦（Δ５ｒｌＲ−ｒｅｃＡ＞３０６：：Ｔ ｎ（１０）（λ）］であり、それはＴ、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎから入手され、Ｊ。

１、Ｗｉ　１１　ｉａｍｓらにより１９８７年１月７日に出願された米国特許出 願第００１．２９２号に記載されている。この株のｒｅｃＡ突然変異はＴｅｔ’ 表現型により１００％共形質導入可能であり、自然に逆戻りすることは知られて いない。

Ｐ１形質導入を実施するため、Ｊ、Ｈ，Ｍｉ　Ｉ　Ｊｅｒ、分子遺伝宇去鳳法（ コールドスプリングハーバ−，１９７２）の方法が使用された。この場合一般化 された形質導入ファージＰｌｖｉｒが選択された、なぜならそれは実験の過程の 閏偶然的なリソグンを形成することができないからである。ＤＣ１１３８上で増 殖したＰ１溶菌液は以下のごとく調製された＋ＤＣ１１３８の一夜培養液の一滴 を５　Ｘ　１０−’Ｍ　ＣａＣ＋　２を含む５ｍｌのＬＢグロスに移した。細胞 に続いて２×１０”ｍ胞／ｍ　ｌの密度に到達するまでインキュベートされた。

ＰＩファージは１麹１のこの培養液に１０７フアージを加え、３７℃で２０分イ ンキュベートすることにより前もって細胞へ吸着させた。この時間の終りに、３ −１のＲ−上面寒天がチューブに添加され、内容物はＬＢプレート上に置かれた 。３７°で一夜インキュベーション後ファージを採取した。軟い寒天層を５ｍｌ のＬＢで希釈し、遠心分離管に移した。５滴のクロロホルムが添加され、懸濁液 を激しくかきまぜて細胞を溶菌させ、すべてのファージ粒子を放出させた。１０ ．ＯＯＯｒｐｍで１０分遠心分離した後、Ｐ１溶菌液を含む上澄液が保存された 。

この溶菌液がＴＡＰ１３０内へｒｅｃＡ突然変異を形質導入するために使用され た。５−１の新鮮なＴＡＰ１３０の一夜培養物が等量のＭＣ緩衝液（０，１ＭＭ ｇ５Ｏ，，５ｍＭ　ＣａＣ＋２）に再懸濁された。次に細胞に３０℃にて２０分 間通気した。細胞液の一部０．１ｍｌをＰ１溶菌液の１０−１および１０−２希 釈液０゜１論１へ加えた。ファージは３０℃にて３０分間インキュベートするこ とにより前もって吸着させた０次に、更なるファージ付着を防ぐため各々のチュ ーブに０゜２−１の１Ｍクエン酸ナトリウムが添加された。内容物を３＋ａｌの Ｒ−上面寒天を用いて１２．５μｇ／醜１のテトラサイクリンを含むＬＢプレー ト上へ置き、プレートは３０℃で４８時間インキュベートされた。いくつかのテ トラサイクリン耐性コロニーが得られた。

ｒｅｃＡ突然変異の存在はＵＶ光に対する感受性を試験して確認された。各々の 可能性のある細菌形質導入体、ならびに親株ＴＡＰ１３０はＬＢプレートを横ぎ る画線培養され、画線培養の異った部分が各々０．５または１０秒ＵＶ光が露光 された。プレートは続いて３０°にて一夜インキユベートされた。その親株に比 較して非常にＵｖ感受性であった１つの株（ＴＡＰ１３０はすべてのＵＶ露光で 増殖したのに対し、画線培養のゼロ露光部分のみの増殖により示された）が選択 され、１Ｇ１１０と称された。

爽旌透旦 ＪＧＩＩＯい７プースミ゛　ＡＣＩに　まれ７ム　コラーゲン公五Ｏ冬ズ±上凡 現 ｐＡｃｌによりコードされているコラーゲン類似ペプチドの±Ｚ　Ｋず発現が全 細胞標識プロトコールを用いて示された。激しく通気しながら２５℃にてｌＧ１ １０（ｐＡｃｌ＞培養物を一夜増殖させた０次の朝、１輸１の一夜培養物を５０ μｇ　／ｓ　ｌのアンピシリンを含む２０１のＬＢブロス内へ接種した。培養物 は２５℃にて０ＤＳＳＯ＝０．４５まで増殖させた。１−１の試料を取り、Ｍ６ ３塩溶液で２度洗浄した。ベレットと０．２％グルコース、１μｇ／輸１のビタ ミンＢ１および１００μｇ／曽１のプロリンを除いた全アミノ酸を含む１蒙１の Ｍ６３培地に再懸濁した。培養液は４２℃で２０分間前もってインキュベートさ れた０次に１０μＣｉの［１４Ｃ］プロリンを添加し、インキュベーションを３ 分間続けた。約１ｍｇの非標識プロリンを次に加え、インキュベーションを更に ３分間実施した。

細胞をベレット化することにより追跡期間を終止させた。細胞ベレットは１度１ 睦！のＭ６３塩溶液で洗浄して残っている未取り込み［”Ｃ］プロリンを除去し た。

最終細胞ベレットは５０ｐ１のＳＤＳ充填緩衝液（８０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ６，８，１００ｍＭジチオスレイトール、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール。

１００μｇ　／ｗｈ　Ｉのブロモフェノールブルー）に再懸濁し、直ちに沸煮水 浴中で５分間加熱した。その２０μ■は１２，５％５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル上で電気泳動を行った。ゲルはＥｎ’Ｈａｎｃｅ　にュー　イングランド　 ヌクレア）で処理され、Ｘ−線フィルムへ一夜暴露された。得られたオートラジ オグラムは２２ＫＤａの分子量をもつ強いタンパク質バンドを示した。この実験 は株ｌＧ１１０中でコラーゲン類似ペプチドが効率よく発現されていることを示 している（図１参照）。

比較鍔１ ［”Ｃ］プロリンで細胞性タンパク質を原識する方法は事実上実施例３で記載し たごとくである。各々の株の６つの１ｍｌの試料を調製し５μＣｉの［”ＣＩプ ロリンで３分間標識した。各々の培養液に１ｍｇの非標識プロリンを添加し、４ ２℃でインキュベーションを続けた。追跡時間は５，１０，２０，４０．６０ま たは１２０分で終了させ試料は実施例３のごとく処理された。２０ｕｌが１２゜ ５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上電気泳動された。フルオログラフィーに 続いて、ゲルはＸ線フィルムに一夜暴露された。

２２ＫＤａコラーゲン類似ペプチドに対応するバンドがすべての場合に観察され た。各々のレーンのコラーゲンペプチドの相対的量は最初にオートラジオグラム をデンシトメーターでスキャンし続いてトレーシングの切り出された対応するピ ークの重さを測ることにより定量された。追跡開始後５分で得られたピークの重 量を独断的に１００％タンパク質残存を表わすものとし、すべての他のピークは それと比較して分析された（図２参照）。結果は、株ｌＧ１０９　（臓ケヒ）に おいては非標識ブロワ〉′添加後２０分で４０％のコラーゲン類似ペプチドが分 解された。４０分ではコラーゲン類似ペプチドの最初の量の２０％だけが残って いた。

しかしながらＩＧＩＩＯの場合では、実験の１２０分に渡ってコラーゲン類似ペ プチドの量の減少はなかった。それ故回メ１１６５突然変異の存在は大腸直にお けるこの異種タンパク質の安定性を非常に増加させている。

浄書（内容に変更なし） 図１ １Ｇ１１０（ρＡＣＩ） 一←２２．０００ ゴ 図２ 追跡後の時間（分） 手続補正書 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０３８３９ 平成１年特許願第５１０５４４号 ２、発明の名称 異種遺伝子発現のための改良細菌株 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　アライド−シグナル・インコーホレーテッド４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 電話３２７０−６６４１〜６６４６ ｇ。補正の対象 （１）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文（２）図面翻訳 文 Ｃ９補正の内容 国際調査報告 −ｈ−輔１＾−―−Ｎ−、ＰＣ？／ＵＳ　８９１０３８３９国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ．繰返しアミノ酸配列から成るポリペプチドの生産をコードしている１つ またはそれ以上の異種遺伝子； ｂ．前記ポリペプチド生産遺伝子の活性を開始させるための制御手段；ｃ．前記 異種遺伝子により生産されるポリペプチドのタンパク質分解を遅らせるための細 菌タンパク質分解遅延手段；ｄ．前記異種遺伝子を安定化するための遺伝子安定 化手段を含むことを特徴とする細菌宿主微生物の新規株。
2. ２．前記遺伝子が天然に存在する遺伝子である請求の範囲第１項記載の株。
3. ３．前記遺伝子が合成遺伝子または半合成遺伝子である請求の範囲第１項記載の 株。
4. ４．前記制御手段が温度変化、栄養変化、抗生物質の存在または不在および中間 代謝に含まれる細胞内化合物のレベルの変化に応答する手段から成る群より選択 される請求の範囲第１項記載の株。
5. ５．前記細菌タンパク質分解遅延手段がプロテアーゼの生成、活性または分解を 制御するための欠損プロテアーゼコード遺伝子手段、およびプロテアーゼに対し て拮抗的もしくは阻害的またはプロテアーゼの生成または活性化のための手段に 対して拮抗的または阻害的である手段から成る群より選択される請求の範囲第１ 項記載の株。
6. ６．前記細菌タンパク質分解手段がタンパク質分解に関与する１つまたはそれ以 上の酵素を制御する１つまたはそれ以上の遺伝子中への突然変異の導入により生 じる単数もしくは複数の欠損プロテアーゼコード遺伝子である請求の範囲第１項 記載の株。
7. ７．前記遺伝子安定化手段がｒｅｃＡ突然変異である請求の範囲第１項記載の株 。
8. ８．ａ．繰返しアミノ酸配列から成るポリペプチドの生産をコードしている１つ またはそれ以上の異種遺伝子； ｂ．ｃＩ８５７突然変異と結合されたラムダＰＬプロモーター、ｔｒｃプロモー ター、ｔｒｃプロモーターおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼと結合されたＴ７プロ モーターから成る群より選択される前記遺伝子の活性化を開始させるための制御 手段； ｃ．突然変異を受けたｌｏｎ遺伝子、突然変異を受けたｈｔｐＲ遺伝子またはそ の組合せから成る群より選択される細菌タンパク質分解遅延手段；およびｄ．ｒ ｅｃＡから成る群より選択される前記遺伝子を安定化するための遺伝子安定化手 段、 を含むことを特徴とし、請求の範囲第１項に従った大腸菌の新規株。
9. ９．大腸菌株ＮＲＲＬΔＢ−１８３５２。
10. １０．ａ．繰返しアミノ酸配列から成るポリペプチドの生産をコードしている１ つまたはそれ以上の異種遺伝子； ｂ．前記ポリペプチド生産遺伝子の活性を開始させるための制御手段；ｃ．前記 異種遺伝子により生産されるポリペプチドのタンパク質分解を遅らせるための細 菌タンパク質分解遅延手段；およびｄ．前記異種遺伝子を安定化するための遺伝 子安定化手段を含むことを特徴とする細菌株を培養することからなる繰返しアミ ノ酸配列を持つポリペプチドの生産方法。