KR102251948B1 - mdfA 유전자 불활성 및 yicL 유전자 도입에 의해 방향족 아미노산 생산능력이 향상된 균주 - Google Patents
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Abstract
mdfA(multidrug transporter A) 유전자에 의해 발현되는 다약제 수송체 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화됨으로써 방향족 아미노산 생산능이 향상된 변이 균주가 개시된다.
Description
본 발명은 mdfA 유전자 불활성 및 yicL 유전자 도입에 의해 방향족 아미노산 생산능력이 향상된 균주에 관한 것이다.
방향족 아미노산, 특히 L-트립토판과 L-페닐알라닌은 사료용 아미노산의 핵심품목으로서 전 세계에서 연간 3000억 달러 규모의 시장을 형성하고 있는 고부가가치 산업이다.
방향족 아미노산은 재조합 균주를 이용해 생산하고 있으며, 이의 생산량을 늘리기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 코리스미산(Chorismate)은 방향족 아미노산 생합성 경로에서 필요한 전구체로서, 이를 생산하기 위해서는 PEP(phosphoenolpyruvate), E4P(erythrose-4-phosphate), 부기질인 PRPP(phosphoribosyl pyrophosphate), 세린(Serine), 글루타민(Glutamine) 등이 필요하다. 따라서, 기존에는 L-트립토판 생산능력을 향상시키기 위해 E4P, PEP, 또는 PRPP의 생합성 경로를 강화하기 위한 연구가 진행되었다.
그러나 다약제 수송체(multidrug transporter) 단백질의 발현을 조절하거나, 다약제 수송체 단백질을 내막 단백질(inner membrane protein)로 치환함으로써 방향족 아미노산의 생산을 향상시킬 수 있다는 점은 알려진 바가 없다.
일 구체예에 따르면, mdfA 유전자의 발현을 억제시킴으로써 방향족 아미노산의 생산능력이 향상된 균주를 제공한다.
일 구체예에 따르면, mdfA 유전자를 yicL 유전자로 치환함으로써 방향족 아미노산 생산능력이 향상된 균주를 제공한다.
일 양상은 mdfA(multidrug transporter A) 유전자에 의해 발현되는 다약제 수송체 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화됨으로써 방향족 아미노산 생산능이 향상된 변이 균주를 제공한다.
mdfA 유전자가 발현하는 다약제 수송체 단백질(multidrug transporter protein)은 약물을 외부로 배출하는 역할을 하며 박테리아의 약물 내성에 관여하는 단백질이다. mdfA 유전자의 트립토판 경로와 같은 방향족 아미노산 생산경로와의 관련성, 또는 이에 미치는 영향은 알려진 바가 없다. 그럼에도 불구하고 본 발명자는 다약제 수송체를 발현하는 mdfA를 결실시킴으로서, 막 안전성이 향상되고 방향족 아미노산의 배출이 증가하여 균주의 아미노산 생산성이 향상됨을 확인하였다.
상기 mdfA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "활성이 약화"는 객체인 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 감소되는 것을 의미한다. 이러한 활성의 약화는 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "불활성화"는 효소 등 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현이 증가"는 객체인 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 증가되는 것을 의미한다. 변이 전 균주에 발현을 증가시키고자 하는 유전자가 존재하지 않는 경우에는 하나 이상의 유전자를 상기 균주의 염색체에 도입하여 발현을 증가시킬 수 있고, 변이 전 균주에 발현을 증가시키고자 하는 유전자가 존재하는 경우에는 하나 이상의 유전자를 상기 균주에 추가로 도입하거나 기존 유전자의 발현량이 증가하도록 유전공학적으로 조작할 수 있다.
본 발명에서, 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성이 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 방향족 아미노산은 L-티로신(L-tyrosine), L-트립토판(L-tryptophan, 및 L-페닐알라닌(L-phenylalanine)일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이 균주는 mdfA 유전자의 전부 또는 일부가 삽입, 치환, 또는 결실된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이 균주는 mdfA 유전자의 전부가 yicL 유전자로 치환된 것일 수 있다. 본 발명자는 다약제 내성 수송체(multidrug transporter) 단백질을 발현하는 mdfA를 내막 단백질(inner membrane protein)을 발현하는 yicL로 치환하면 균주의 막 안전성이 증가하고 방향족 아미노산의 배출이 원활해짐으로써 생산성이 향상됨을 확인하였다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이 균주는 에스케리키아(Escherichia)속 균주일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 에스케리키아 속 균주는 대장균(Escherichia coli)일 수 있고, 예를 들면 KFCC11660P 및 KCCM10016 기탁 균주일 수 있다.
다른 양상에 따르면, 상기 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 배양된 균주 및 배양 배지에서 방향족 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 방향족 아미노산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 이용되는 균주는 당업계에 공지된 배양 방법을 통해 배양될 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다.
배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가 될 수 있다.
배양물의 온도는 27 내지 40℃ 보다 바람직하게는 30 내지 37℃일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
방향족 아미노산을 회수하는 단계는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 회수할 수 있으며, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 방향족 아미노산은 L-트립토판 및 L-페닐알라닌일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 균주의 mdfA 유전자에 의해 발현되는 다약제 수송체 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화시킴으로써 방향족 아미노산의 생산량을 증가시킬 수 있다.
일 구체예에 따르면, 균주의 mdfA 유전자를 yicL 유전자로 치환함으로써 방향족 아미노산의 생산량을 증가시킬 수 있다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: mdfA 유전자가 결실된 균주 제작
모균주(수탁번호: KFCC11660P 및 KCCM10016)에 원스텝 불활성화 방법(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6;97(12):6640-5)을 이용하여 mdfA 유전자가 불활성화된 변이 균주를 제작하였다.
KFCC11660P 균주 및 KCCM10016 균주는 대장균(Escherichia coli) 균주로서, 제 4 단편의 상동재조합을 위해 Red recombinase 플라스미드인 pKD46(GenBank 접근번호 AY048746)를 도입하고, pCP20 도입 전에는 pKD46을 제거한다.
mdfA 유전자 및 항생제 유전자가 포함된 DNA 단편을 상동재조합시켜 mdfA 유전자를 결실시키고, 다시 재조합된 DNA 단편으로부터 항생제 내성 유전자를 제거하는 과정을 거침으로써 mdfA 유전자를 불활성화시켰다. 구체적인 과정은 다음과 같다.
(1) 제 1 단편 제작
하기 표 1에서의 mdfA 유전자 일부 서열과 pKD13 플라스미드 일부 서열을 가지는 mdfA_PF, mdfA_PR 프라이머 쌍과 pKD13 플라스미드(Genbank 접근번호 AY048744)를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 1.4kb 의 증폭된 제 1 단편을 얻었다. 제 1 단편은 pKD13 플라스미드에서 유래한 카나마이신 내성 유전자를 포함하고 있다.
| 프라이머 | 서열번호 | 염기서열 (5’-3’) |
| mdfA | 1 |
 |
| mdfA_HF1 | 2 | TCTGGCGTCGCGTTAATAAG |
| mdfA_HR1 | 3 | GCAATTTCTTCGCCAATAATAATCGCGCAGAG |
| mdfA_PF | 4 | ATTATTGGCGAAGAAATTGCgtgtaggctggagctgcttc |
| mdfA_PR | 5 | CAAAGCAGTCAGGCATTTTTctgtcaaacatgagaattaa |
| mdfA_HF2 | 6 | AAAAATGCCTGACTGCTTTGTGCG |
| mdfA_HR2 | 7 | AATTGTCTACTGTTGGGCGC |
| mdfA_CF | 8 | CGCATCATCGGCATCCAGG |
| mdfA_CR | 9 | TGCCTGAATGAAGGCTGCAT |
(2) 제 2 단편 제작
mdfA 유전자의 앞쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹(genomic) DNA를 주형으로 하고 표 1의 프라이머 mdfA_HF1 및 mdfA_HR1를 이용하여 PCR (총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 0.3 kb 증폭된 제 2 단편을 얻었다.
(3) 제 3 단편 제작
또한 mdfA 유전자의 뒤쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 표 1의 프라이머 mdfA_HF2와 mdfA_HR2를 이용하여 PCR 반응(총부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30 사이클 이후 72℃분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 0.3 kb 의 증폭된 제 3 단편을 얻었다.
(4) 제 4 단편 제작
위 실험에서 증폭된 각각의 제 1 단편, 제 2 단편, 및 제 3 단편은 증폭시 프라이머의 상보적 서열로 인하여 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 이 단편들을 프라이머를 제외하고 총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃ 2분 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃ 에서 10분 조건으로 PCR을 수행하여 약 2 kb 크기를 가지는 하나의 증폭된 제 4 단편을 얻었다. 제 4 단편은 mdfA 유전자 일부와 kanamycin 항생제 저항 유전자를 포함하고 있으며, 구체적으로 mdfA 유전자의 5' 방향의 일부 단편, kanamycin 항생제 내성 유전자, 그리고 mdfA 유전자의 3' 방향의 일부 단편으로 구성되어 있다.
(5) 제 4 단편 주입 및 mdfA 결실
Red recombinase 플라스미드인 pKD46(GenBank 접근번호 AY048746)을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주인 KFCC11660P 와 KCCM10016 균주에 각각 획득한 제 4 단편을 전기천공법(electroporation)으로 주입하였다. 제 4 단편은 람다 레드 재조합 시스템(Lambda Red recombination)에 의해 mdfA와 상동재조합으로 교체됨으로써 mdfA가 결실된다.
이후 카나마이신(kanamycin) 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 mdfA 유전자의 결실 여부를 확인하였다. 반응은 표 1의 mdfA_CF 및 mdfA_CR 프라이머를 이용하여 총 부피 20 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 3분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분 조건으로 PCR을 수행하였다. 염색체 내에 단편이 삽입된 경우 원래 mdfA 유전자가 있을 경우 생성되는 약 2 kb와 비교하여 약 2.2 kb가 생성됨을 확인하였다.
(6) 항생제 저항 유전자 제거 및 선별
mdfA 유전자 결실이 확인된 균주로부터 항생제 내성 표식 유전자를 제거하기 위해 pCP20 플라스미드를 도입하여 FLP 재조합을 유도하였다. 이후 항생제 첨가 혹은 무첨가 LB 평판배지에서 mdfA 결실 균주를 배양하여 항생제 내성 표식 유전자가 제거된 것을 확인하였다.
실시예 2: mdfA 결실 균주의 배양 및 방향족 아미노산 생산량 평가
상기 실시예 1의 방법으로 제작된 대장균 KFCC11660PΔmdfA 및 KFCC11660P을 하기 표 2의 트립토판 생산용 배지에서 배양하였다.
또한 상기 실시예 1의 방법으로 제작된 대장균 KCCM10016ΔmdfA 및 KCCM10016을 하기 표 2의 페닐알라닌 생산용 배지에서 배양하였다.
배양은 하기 표 2와 같은 조성의 트립토판 생산용 배지 또는 페닐 알라닌 생산용 배지가 각각 10 mL이 담긴 플라스크에 상기 KFCC11660PΔmdfA, KFCC11660P KCCM10016ΔmdfA, KCCM10016 균주를 각각 부피를 기준으로 1%씩 접종하여 37℃에서 200 rpm으로 70시간 동안 진탕 배양하고, 그로부터 수득한 L-아미노산의 농도를 비교하였다.
상기 실험 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이 mdfA 유전자를 불활성화 시킨 경우 트립토판과 페닐알라닌의 생산량이 증가하는 것을 확인하였다.
하기 표 3에 따르면 KFCC11660P 균주는 mdfA 유전자가 불활성화되면 L-트립토판의 생산량이 10% 이상 향상되었으며, KCCM10016 균주는 mdfA 유전자가 불활성화되면 L-페닐알라닌의 생산량이 15% 이상 향상됨을 확인하였다.
실시예 3: mdfA 유전자가 yicL 유전자로 치환된 균주의 배양 및 방향족 아미노산 생산량 평가
mdfA 유전자 불활성화 및 yicL 유전자 활성화를 동시에 달성하여 세포 외로 L-트립토판 배출을 강화하고자 하였다. 원스텝 불활성화 방법(one step inactivation; Warner et al., PNAS, 6:6640-6645(2000))을 통해 mdfA 유전자를 yicL 유전자로 치환하였다.
실시예 1의 방법과 마찬가지로 폴리뉴클레오티드 단편과 mdfA 유전자를 상동재조합 시킴으로써 mdfA 유전자를 결실시키되, 상기 폴리뉴클레오티드 단편은 yicL 유전자가 포함된 것을 사용하였다. 도입하고자 하는 yicL 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13의 염기 서열과 같다.
(1) 제 1 단편 제작
상기 표 1의 mdfA_PF, 하기 표 4의 mdfA_PR2 쌍과 pKD13 플라스미드(Genbank 접근번호 AY048744)를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 1.4kb의 증폭된 제 1 단편을 얻었다. mdfA_PR2는 pKD13 일부서열과 yicL 유전자 발현강화를 위해 사용한 Trc 프로모터 일부 서열을 포함하고 있다. 제작된 제 1 단편은 pKD13 플라스미드에서 유래한 카나마이신 내성 유전자를 포함하고 있다.
(2) 제 2 단편 제작
Trc 프로모터 서열과 yicL 유전자 서열이 포함된 제 2 단편을 제작하였다. pTrc99A::yicL 플라스미드 DNA(출원번호:10-2018-0169847)를 주형으로 하고 상기 표 4의 프라이머 Trc_pro_F 및 yicL_R 를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 1 kb의 증폭된 제 2 단편을 얻었다.
(3) 제 3 단편 제작
mdfA 유전자의 앞쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹 DNA를 주형으로 하고 상기 표 1의 프라이머 mdfA_HF1 및 mdfA_HR1를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 0.3 kb 증폭된 제 3 단편을 얻었다.
(4) 제 4 단편 제작
mdfA 유전자의 뒤쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655 균주의 지노믹 DNA를 주형으로 하고 상기 표 1의 프라이머 mdfA_HF2 와 mdfA_HR2를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 0.3 kb 의 증폭된 제 4 단편을 얻었다.
(5) 제 5 단편 제작
앞서 제작한 제 1 단편 내지 제 4 단편은 증폭 시 프라이머의 상보적 서열로 인하여 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 4개의 단편을 총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃ 4분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃ 에서 10분 조건으로 PCR을 수행하여 약 3 kb 크기를 가지는 하나의 증폭된 제 5 단편을 얻었다. 제 5 단편은 카나마이신 내성 유전자, Trc 프로모터, yicL 유전자를 포함하고 있으며, 균주에 도입하면 상동재조합에 의해 mdfA 유전자와 치환될 수 있다.
(6) 제 5 단편 도입 및 유전자 치환 확인
제 5 단편을 pKD46(GeneBank No. AY048746)을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주인 KFCC11660P 와 KCCM10016에 전기천공법으로 도입하였다. 이후 카나마이신 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 mdfA 유전자의 결실 및 yicL 유전자의 도입여부를 확인하였다.
유전자 도입 확인은 표 1의 mdfA_CF 및 mdfA_CR 프라이머를 이용하여 총 부피 20 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃분에서 4분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분 조건으로 수행하였다.
mdfA 유전자가 존재하는 경우 약 2 kb의 증폭산물이 검출되며, 이와 비교하여 제 5 단편이 도입된 경우는 약 3.2 kb가 생성됨을 확인하였다. 제 5 단편의 도입이 확인된 균주는 pCP20 플라스미드를 도입하고 FLP 재조합을 유도하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하였다. 이후 항생제 첨가 혹은 무첨가 LB 평판배지에서 mdfA 결실 및 yicL 도입 균주를 배양하여 항생제 내성 표식 유전자가 제거된 것을 확인 하였다. mdfA 유전자가 yicL 유전자로 치환된 균주는 KFCC11660PΔmdfA OX:yicL 및 KCCM10016ΔmdfA OX:yicL로 명명하였다.
실시예 4: mdfA 결실 균주의 배양 및 방향족 아미노산 생산량 평가
상기 대장균 KFCC11660PΔmdfA OX:yicL을 상기 표 2의 트립토판 생산용 배지에서 배양하였다. 또한 상기 대장균 KCCM10016ΔmdfA OX:yicL 및 KCCM10016을 하기 표 2의 페닐알라닌 생산용 배지에서 배양하였다. 배양방법은 상기 실시예 2와 동일하다.
실험 결과, 하기 표 5에 나타난 바와 같이 mdfA 유전자가 yicL 유전자로 치환된 균주는 트립토판과 페닐알라닌의 생산량이 증가하였으며, 단지 mdfA 유전자를 결실시킨 균주보다 더욱 증가한 것을 확인하였다. 이는 mdfA 불활성화 및 yicL 유전자 발현 강화에 의해 트립토판과 페닐알라닌의 배출능이 더욱 향상되었기 때문으로 생각된다.
<110> DAESANG CORPORATION
<120> Strain with Improved Aromatic Amino Acid Production Capacity by
mdfA Gene Inactivation and yicL Gene Introduction
<130> PN190269
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1233
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdfA "CMR-MONOMER" 883673..884905 Escherichia coli K-12 substr.
MG1655
<400> 1
atgcaaaata aattagcttc cggtgccagg cttggacgtc aggcgttact tttccctctc 60
tgtctggtgc tttacgaatt ttcaacctat atcggcaacg atatgattca acccggtatg 120
ttggccgtgg tggaacaata tcaggcgggc attgattggg ttcctacttc gatgaccgcg 180
tatctggcgg gcgggatgtt tttacaatgg ctgctggggc cgctgtcgga tcgtattggt 240
cgccgtccgg tgatgctggc gggagtggtg tggtttatcg tcacctgtct ggcaatattg 300
ctggcgcaaa acattgaaca attcaccctg ttgcgcttct tgcagggcat aagcctctgt 360
ttcattggcg ctgtgggata cgccgcaatt caggaatcct tcgaagaggc ggtttgtatc 420
aagatcaccg cgctgatggc gaacgtggcg ctgattgctc cgctacttgg tccgctggtg 480
ggcgcggcgt ggatccatgt gctgccctgg gaggggatgt ttgttttgtt tgccgcattg 540
gcagcgatct cctttttcgg tctgcaacga gccatgcctg aaaccgccac gcgtataggc 600
gagaaactgt cactgaaaga actcggtcgt gactataagc tggtgctgaa gaacggccgc 660
tttgtggcgg gggcgctggc gctgggattc gttagtctgc cgttgctggc gtggatcgcc 720
cagtcgccga ttatcatcat taccggcgag cagttgagca gctatgaata tggcttgctg 780
caagtgccta ttttcggggc gttaattgcg ggtaacttgc tgttagcgcg tctgacctcg 840
cgccgcaccg tacgttcgct gattattatg ggcggctggc cgattatgat tggtctattg 900
gtcgctgctg cggcaacggt tatctcatcg cacgcgtatt tatggatgac tgccgggtta 960
agtatttatg ctttcggtat tggtctggcg aatgcgggac tggtgcgatt aaccctgttt 1020
gccagcgata tgagtaaagg tacggtttct gccgcgatgg gaatgctgca aatgctgatc 1080
tttaccgttg gtattgaaat cagcaaacat gcctggctga acgggggcaa cggactgttt 1140
aatctcttca accttgtcaa cggaattttg tggctgtcgc tgatggttat ctttttaaaa 1200
gataaacaga tgggaaattc tcacgaaggg taa 1233
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdfA_HF1
<400> 2
tctggcgtcg cgttaataag 20
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdfA_HR1
<400> 3
gcaatttctt cgccaataat aatcgcgcag ag 32
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdfA_PF
<400> 4
attattggcg aagaaattgc gtgtaggctg gagctgcttc 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdfA_PR
<400> 5
caaagcagtc aggcattttt ctgtcaaaca tgagaattaa 40
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdfA_HF2
<400> 6
aaaaatgcct gactgctttg tgcg 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdfA_HR2
<400> 7
aattgtctac tgttgggcgc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdfA_CF
<400> 8
caacggcacc acggtaatca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdfA_CR
<400> 9
tgcctgaatg aaggctgcat 20
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdfA_PR2
<400> 10
gccggatgat taattgtcaa ctgtcaaaca tgagaattaa 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Trc_pro_F
<400> 11
ttaattctca tgtttgacag ttgacaatta atcatccggc 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yicL_R
<400> 12
acaaagcagt caggcatttt ttcacttatg ccgcgccgga 40
<210> 13
<211> 924
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yicL "EG11688-MONOMER" 3838248..3839171 Escherichia coli K-12
substr. MG1655
<400> 13
atgggttcca ccagaaaggg gatgctgaac gttctgattg ccgccgtgtt gtggggaagt 60
tcaggggtct gcgcgcaata catcatggag caaagccaga tgtcgtcgca gtttttgact 120
atgacgcgtt tgatattcgc cggtttgatt ctactgacgc tgtcatttgt tcatggcgat 180
aaaatctttt ctattattaa caatcataaa gatgccatta gcctgctgat tttttccgtg 240
gttggcgcgc taactgtaca gctcactttt ttgctaacca tcgaaaaatc gaacgcagcc 300
acggcaacgg tgctgcaatt cctctcaccg acgattatcg tcgcctggtt ctcactggtg 360
cgtaaatcgc gcccgggcat tctggttttc tgcgctattt tgacatcgct ggtcgggact 420
tttttattgg tgacacacgg taatccgacg tcattatcga tctctcctgc cgcgttgttc 480
tggggcattg cctcggcatt tgctgctgca ttctatacca cctatccctc aacgctaatt 540
gcccgctatg gcacgttacc agtcgtcggc tggagtatgc tgattggcgg tctgattctg 600
ttgccttttt atgccagaca aggaacaaac tttgtcgtta acggcagttt gattctggcg 660
tttttttatt tggtggtcat tggtacgtcc ctgacattta gtctgtacct gaaaggagca 720
caattaattg gcggtccaaa agccagcatt ttgagctgtg cagaaccatt aagtagcgcg 780
ctactctctt tgctgttgct ggggatcacg ttcacattac cggactggct gggaacgctg 840
ctgattctgt catcggtgat tttgatttca atggattccc gtcgccgcgc cagaaaaata 900
aatcgtccgg cgcggcataa gtga 924
Claims (10)
- mdfA 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화됨으로써 L-페닐알라닌 및 L-트립토판 생산능이 향상된 대장균 변이 균주.
- 제 1 항에 있어서,
상기 mdfA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인,
변이 균주. - 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 변이 균주는 mdfA 유전자의 전부 또는 일부가 삽입, 치환, 또는 결실된 것인,
변이 균주. - 제 1항에 있어서,
상기 변이 균주는 mdfA 유전자의 전부가 yicL 유전자로 치환된 것인,
변이 균주. - 제 5항에 있어서,
상기 yicL 유전자는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 것인,
변이 균주. - 삭제
- 삭제
- 제 1 항의 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 배양된 변이 균주 및 배양 배지에서 L-페닐알라닌 및 L-트립토판으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는,
방향족 아미노산의 제조 방법.
- 삭제
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Family Cites Families (2)
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| KR101830002B1 (ko) | 2016-10-11 | 2018-02-19 | 대상 주식회사 | 부기질의 공급 강화를 통한 l-트립토판이 과발현되는 균주 및 이를 이용하는 l-트립토판의 제조 방법 |
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2019
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