KR102269642B1 - 피리독살 키나아제 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주 - Google Patents

피리독살 키나아제 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주 Download PDF

Info

Publication number
KR102269642B1
KR102269642B1 KR1020190138235A KR20190138235A KR102269642B1 KR 102269642 B1 KR102269642 B1 KR 102269642B1 KR 1020190138235 A KR1020190138235 A KR 1020190138235A KR 20190138235 A KR20190138235 A KR 20190138235A KR 102269642 B1 KR102269642 B1 KR 102269642B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pdxk
gene
pdxy
strain
aromatic amino
Prior art date
Application number
KR1020190138235A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210052111A (ko
Inventor
신원주
조영일
이선희
김현영
김용수
양철민
Original Assignee
대상 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대상 주식회사 filed Critical 대상 주식회사
Priority to KR1020190138235A priority Critical patent/KR102269642B1/ko
Publication of KR20210052111A publication Critical patent/KR20210052111A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102269642B1 publication Critical patent/KR102269642B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/222—Phenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01035—Pyridoxal kinase (2.7.1.35)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

pdxK(pyridoxal kinase K) 또는 pdxY(pyridoxal kinase Y) 유전자에 의해 발현되는 피리독살 키나아제(pyridoxal kinase)의 활성이 약화 또는 불활성화됨으로써 방향족 아미노산 생산능이 향상된 변이 균주가 개시된다.

Description

피리독살 키나아제 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주{Strain with Improved Aromatic Amino Acid Production Capacity by Pyridoxal Kinase Gene Inactivation}
본 발명은 피리독살 키나아제 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주에 관한 것이다.
방향족 아미노산, 특히 L-트립토판과 L-페닐알라닌은 사료용 아미노산의 핵심품목으로서 전 세계에서 연간 3000억 달러 규모의 시장을 형성하고 있는 고부가가치 산업이다.
방향족 아미노산은 재조합 균주를 이용해 생산하고 있으며, 이의 생산량을 늘리기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 코리스미산(Chorismate)은 방향족 아미노산 생합성 경로에서 필요한 전구체로서, 이를 생산하기 위해서는 PEP(phosphoenolpyruvate), E4P(erythrose-4-phosphate), 부기질인 PRPP(phosphoribosyl pyrophosphate), 세린(Serine), 글루타민(Glutamine) 등이 필요하다. 따라서, 기존에는 L-트립토판 생산능력을 향상시키기 위해 E4P, PEP, 또는 PRPP의 생합성 경로를 강화하기 위한 연구가 진행되었다.
그러나, 균주의 피리독살 키나아제를 불활성화시켜 방향족 아미노산의 생산이 증가되었다고 보고된 바는 없다.
대한민국 등록공보 제10-1830002호(2018.02.09)
일 구체예에 따르면, 피리독살 키나아제 유전자의 발현을 억제시킴으로써 방향족 아미노산의 생산능력이 향상된 균주를 제공한다.
일 양상은 pdxK(pyridoxal kinase K) 또는 pdxY(pyridoxal kinase Y) 유전자에 의해 발현되는 피리독살 키나아제(pyridoxal kinase)의 활성이 약화 또는 불활성화됨으로써 방향족 아미노산 생산능이 향상된 변이 균주를 제공한다.
상기 변이 균주는 pdxK(pyridoxal kinase K) 및 pdxY(pyridoxal kinase Y) 유전자에 의해 발현되는 피리독살 키나아제(pyridoxal kinase)의 활성이 모두 약화 또는 불활성화된 것일 수 있다.
상기 pdxK 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 pdxY 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명자는 pdxK(pyridoxal kinase K) 및/또는 pdxY(pyridoxal kinase Y) 유전자의 발현을 저하시킴으로서 피리독살 키나아제 활성을 억제한 결과, 피리독살 인산(pyridoxal phosphate, PLP) 생산에 사용되는 에너지가 감소하고, 대신 방향족 아미노산 생산성을 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "활성이 약화"는 객체인 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 감소되는 것을 의미한다. 이러한 활성의 약화는 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "불활성화"는 효소 등 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현이 증가"는 객체인 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 증가되는 것을 의미한다. 변이 전 균주에 발현을 증가시키고자 하는 유전자가 존재하지 않는 경우에는 하나 이상의 유전자를 상기 균주의 염색체에 도입하여 발현을 증가시킬 수 있고, 변이 전 균주에 발현을 증가시키고자 하는 유전자가 존재하는 경우에는 하나 이상의 유전자를 상기 균주에 추가로 도입하거나 기존 유전자의 발현량이 증가하도록 유전공학적으로 조작할 수 있다.
본 발명에서, 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성이 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 방향족 아미노산은 L-티로신(L-tyrosine), L-트립토판(L-tryptophan, 및 L-페닐알라닌(L-phenylalanine)일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이 균주는 pdxK 유전자 및 pdxY 유전자 중에서 어느 하나 또는 전부의 서열의 전부 또는 일부가 삽입, 치환, 또는 결실되어 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이 균주는 에스케리키아(Escherichia)속 균주일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 에스케리키아 속 균주는 대장균(Escherichia coli)일 수 있고, 예를 들면 KFCC11660P 및 KCCM10016 기탁 균주일 수 있다.
다른 양상에 따르면, 상기 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 배양된 균주 및 배양 배지에서 방향족 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 방향족 아미노산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 이용되는 균주는 당업계에 공지된 배양 방법을 통해 배양될 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다.
배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가 될 수 있다.
배양물의 온도는 27 내지 40℃ 보다 바람직하게는 30내지 37℃일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
방향족 아미노산을 회수하는 단계는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 회수할 수 있으며, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 배지는 피리독살 5'-인산염(Pyridoxal 5'-phosphate)를 첨가한 배지일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 방향족 아미노산은 L-트립토판 및 L-페닐알라닌일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 균주의 pdxK 및/또는 pdxY 유전자를 약화 또는 불활성화 시킴으로써 균주의 방향족 아미노산의 생산량이 증가할 수 있다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1-2: pdxK 유전자가 결실된 변이주 제조
모균주(수탁번호: KFCC11660P 및 KCCM10016)에 원스텝 불활성화 방법(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6;97(12):6640-5)을 이용하여 pdxK 유전자가 불활성화된 변이 균주를 제작하였다.
KFCC11660P 균주 및 KCCM10016 균주는 대장균(Escherichia coli) 균주로서, 제 4 단편의 상동재조합을 위해 Red recombinase 플라스미드인 pKD46(GenBank 접근번호 AY048746)를 도입하고, pCP20 도입 전에는 pKD46을 제거한다.
pdxK 유전자 및 항생제 유전자가 포함된 DNA 단편을 상동재조합시켜 pdxK 유전자를 결실시키고, 다시 재조합된 DNA 단편으로부터 항생제 내성 유전자를 제거하는 과정을 거침으로써 pdxK 유전자를 불활성화시켰다. 구체적인 과정은 다음과 같다.
(1) 제 1 단편 제작
하기 표 1에서의 pdxK 유전자 일부 서열과 pKD13 플라스미드 일부 서열을 가지는 pdxK_PF, pdxK_PR 프라이머 쌍과 pKD13 플라스미드(Genbank 접근번호 AY048744)를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 1.4kb 의 증폭된 제 1 단편을 얻었다. 제 1 단편은 pKD13 플라스미드에서 유래한 카나마이신 내성 유전자를 포함하고 있다.
프라이머 서열번호 염기서열 (5’-3’)
pdxK 1
Figure 112019111942349-pat00001
pdxK_HF1 2 GTTACGGGTATTGCCGAGCT
pdxK_HR1 3 TTAATTTTTTCTCCTTGCCG
pdxK_PF 4 CGGCAAGGAGAAAAAATTAAgtgtaggctggagctgcttc
pdxK_PR 5 CGCCCATCGGCGCCATTTTTctgtcaaacatgagaattaa
pdxK_HF2 6 AAAAATGGCGCCGATGGGCG
pdxK_HR2 7 GGCGTTGAACTGTTCGTCCA
pdxK_CF 8 GCTCTTACCGGGGATCTTCA
pdxK_CR 9 GCTATCAAACCAACGGGTAA
(2) 제 2 단편 제작
pdxK 유전자의 앞쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹(genomic) DNA를 주형으로 하고 표 1의 프라이머 pdxK_HF1 및 pdxK_HR1를 이용하여 PCR (총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 0.3 kb 증폭된 제 2 단편을 얻었다.
(3) 제 3 단편 제작
또한 pdxK 유전자의 뒤쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 표 1의 프라이머 pdxK_HF2와 pdxK_HR2를 이용하여 PCR 반응(총부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30 사이클 이후 72℃분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 0.3 kb 의 증폭된 제 3 단편을 얻었다.
(4) 제 4 단편 제작
위 실험에서 증폭된 각각의 제 1 단편, 제 2 단편, 및 제 3 단편은 증폭시 프라이머의 상보적 서열로 인하여 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 이 단편들을 프라이머를 제외하고 총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃ 2분 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃ 에서 10분 조건으로 PCR을 수행하여 약 2 kb 크기를 가지는 하나의 증폭된 제 4 단편을 얻었다. 제 4 단편은 pdxK 유전자 일부와 kanamycin 항생제 저항 유전자를 포함하고 있으며, 구체적으로 pdxK 유전자의 5' 방향의 일부 단편, kanamycin 항생제 저항 유전자, 그리고 pdxK 유전자의 3' 방향의 일부 단편으로 구성되어 있다.
(5) 제 4 단편 주입 및 pdxK 결실
Red recombinase 플라스미드인 pKD46(GenBank 접근번호 AY048746)을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주인 KFCC11660P 와 KCCM10016 균주에 각각 획득한 제 4 단편을 전기천공법(electroporation)으로 주입하였다. 제 4 단편은 람다 레드 재조합 시스템(Lambda Red recombination)에 의해 pdxK와 상동재조합으로 교체됨으로써 pdxK가 결실된다.
이후 카나마이신(kanamycin) 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 pdxK 유전자의 결실 여부를 확인하였다. 반응은 표 1의 pdxK_CF 및 pdxK_CR 프라이머를 이용하여 총 부피 20 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 3분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분 조건으로 PCR을 수행하였다. 원래 pdxK 유전자가 있을 경우 약 1.6 kb(결실 전)가 생성되는 것과 비교하여 염색체 내에 단편이 삽입된 경우 길이가 더 증가한 약 2.2 kb(항생제 유전자 포함)가 생성됨을 확인하였다.
(6) 항생제 저항 유전자 제거 및 선별
pdxK 유전자 결실이 확인된 균주로부터 항생제 내성 표식 유전자를 제거하기 위해 pCP20 플라스미드를 도입하여 FLP 재조합을 유도하였다. 이후 항생제 첨가 혹은 무첨가 LB 평판배지에서 pdxK 결실 균주를 배양하여 항생제 내성 표식 유전자가 제거된 것을 확인하였다.
실시예 1-2: pdxK 유전자가 결실 균주의 방향족 아미노산 생산량 평가
상기 실시예 1-1의 방법으로 제작된 대장균 KFCC11660PΔpdxK 및 KFCC11660P을 하기 표 2의 트립토판 생산용 배지에서 배양하였다.
또한 상기 실시예 1-1의 방법으로 제작된 대장균 KCCM10016ΔpdxK 및 KCCM10016을 하기 표 2의 페닐알라닌 생산용 배지에서 배양하였다.
배양은 하기 표 2와 같은 조성의 트립토판 생산용 배지 또는 페닐 알라닌 생산용 배지가 각각 10 mL이 담긴 플라스크에 상기 KFCC11660PΔpdxK, KFCC11660P KCCM10016ΔpdxK, KCCM10016 균주를 각각 부피를 기준으로 1%씩 접종하여 37℃에서 200 rpm으로 70시간 동안 진탕 배양하고, 그로부터 수득한 L-아미노산의 농도를 비교하였다.
Figure 112019111942349-pat00002
실험 결과, pdxK 유전자를 불활성화 시킨 경우 배양시간이 길어졌으나 하기 표 3에 나타난 바와 같이 트립토판과 페닐알라닌의 생산량이 증가함을 확인하였다. 하기 표 3에 따르면 KFCC11660P 균주는 pdxK 유전자가 불활성화되면 L-트립토판의 생산량이 4% 이상 향상되었으며, KCCM10016 균주는 pdxK 유전자가 불활성화되면 L-페닐알라닌의 생산량이 5% 이상 향상됨을 확인하였다(하기 표 3의 A 참조).
또한 배지에 Pyridoxal 5′-phosphate를 첨가하여 배양한 결과, 배양시간이 감소함과 동시에 방향족 아미노산 생산량이 증가하는 것을 확인하였다(하기 표 3의 B 참조).
Figure 112019111942349-pat00003
실시예 2-1: pdxY 유전자가 결실된 변이주 제조
pdxK 대신 pdxY를 불활성화하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 같은 방법으로 pdxY 유전자가 결실된 변이 균주를 제작하였다.
pdxY 유전자 및 항생제 유전자가 포함된 DNA 단편을 상동재조합시켜 pdxY 유전자를 결실시키고, 다시 재조합된 DNA 단편으로부터 항생제 내성 유전자를 제거하는 과정을 거침으로써 pdxY 유전자를 불활성화시켰다.
pdxY 결실 균주 제작에는 하기 표 4의 프라이머를 이용하였다.
프라이머 서열번호 염기서열 (5’-3’)
pdxY 10
Figure 112019111942349-pat00004
pdxY_HF1 11 GTACCGATGGTTGAGATGGA
pdxY_HR1 12 GTTCCCTGTATAAAAACCAGGGGG
pdxY_PF 13 CTGGTTTTTATACAGGGAACgtgtaggctggagctgcttc
pdxY_PR 14 GTGGGCCGAAATGAGATATTctgtcaaacatgagaattaa
pdxY_HF2 15 AATATCTCATTTCGGCCCACAACG
pdxY_HR2 16 GGAAGAGTACAAACCGACAG
pdxY_CF 17 CAGGTGACTCGTCTGGTTCA
pdxY_CR 18 ATGCAGTATCTTGCCGACAG
실시예 2-2: pdxY 유전자가 결실 균주의 방향족 아미노산 생산량 평가
상기 실시예 1-2 방법과 배지와 배양조건을 동일하게 배양하고, 방향족 아미노산 생산량을 평가하였다.
실험 결과, pdxY 유전자를 불활성화 시킨 경우 배양시간이 길어졌으나 하기 표 5에 나타난 바와 같이 트립토판과 페닐알라닌의 생산량이 증가함을 확인하였다. 하기 표 5에 따르면 KFCC11660P 균주는 pdxY 유전자가 불활성화되면 L-트립토판의 생산량이 약 10% 향상되었으며, KCCM10016 균주는 pdxY 유전자가 불활성화되면 L-페닐알라닌의 생산량이 약 10% 향상됨을 확인하였다(하기 표 5의 A 참조).
또한 배지에 Pyridoxal 5′-phosphate를 첨가하여 배양한 결과, 배양시간이 감소함과 동시에 방향족 아미노산 생산량이 증가하는 것을 확인하였다(하기 표 5의 B 참조).
Figure 112019111942349-pat00005
실시예 3-1: pdxK와 pdxY 유전자가 동시에 결실된 균주 제조
상기 실시예 1-1 및 실시예 2-1의 방법과 동일하게, pdxK 유전자를 불활성화 시킨 후, pdxY 유전자를 불활성화시킴으로써 pdxK 및 pdxY가 모두 결실된 변이 균주를 제작하였다.
pdxK 및 pdxY 유전자를 항생제 유전자가 포함된 DNA 단편과 순차적으로 상동재조합시켜 pdxK 및 pdxY 유전자를 결실시키고, 다시 재조합된 DNA 단편으로부터 항생제 내성 유전자를 제거하는 과정을 거침으로써 pdxK 및 pdxY 유전자를 불활성화시켰다.
pdxK 및 pdxY 결실 균주 제작에 사용된 프라이머는 앞선 실시예 1-1 및 실시예 2-1에 사용된 프라이머와 동일하다.
실시예 3-2: pdxK와 pdxY 유전자가 동시 결실된 균주의 방향족 아미노산 생산량 평가
상기 실시예 1-2 및 실시예 2-2의 방법과 배지 및 배양조건을 동일하게 배양하고, 방향족 아미노산 생산량을 평가하였다.
실험 결과, pdxK 및 pdxY 유전자를 불활성화 시킨 경우 배양시간이 지연되었으나 하기 표 6에 나타난 바와 같이 트립토판과 페닐알라닌의 생산량이 증가함을 확인하였다. 하기 표 6에 따르면 KFCC11660P 균주는 pdxK 및 pdxY 유전자가 동시에 불활성화되면 L-트립토판의 생산량이 약 13% 향상되었으며, KCCM10016 균주는 pdxK 및 pdxY 유전자가 동시에 불활성화되면 L-페닐알라닌의 생산량이 약 12% 향상됨을 확인하였다(하기 표 6의 A 참조).
또한 배지에 Pyridoxal 5′-phosphate를 첨가하여 배양한 결과, 배양시간이 감소함과 동시에 방향족 아미노산 생산량이 더욱 증가하는 것을 확인하였다(하기 표 6의 B 참조).
Figure 112019111942349-pat00006
<110> Daesang Corporation <120> Strain with Improved Aromatic Amino Acid Production Capacity by Pyridoxal Kinase Gene Inactivation <130> PN190274 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 852 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxK "PDXK-MONOMER" (complement(2536386..2537237)) Escherichia coli K-12 substr. MG1655 <400> 1 atgagtagtt tgttgttgtt taacgataag agtagggcac tgcaggcgga tatcgtcgcc 60 gtgcagtcgc aggtggttta cggcagcgtg ggcaacagca ttgccgtgcc tgctatcaaa 120 cagaacggcc tgaatgtctt tgccgtgccg acggtattgc tgagcaatac gccgcattat 180 gacactttct acggtggtgc gattccggac gaatggttta gcggctattt gcgtgcgctt 240 caggagcgtg atgcgctgcg ccaacttcgt gctgtaacca cgggctatat gggaacggca 300 tcgcaaatca aaatccttgc cgagtggctg actgcgctac gcaaagacca tcctgaccta 360 ttgatcatgg tcgatccggt gattggcgat attgatagcg gaatttatgt caaacctgac 420 cttcccgaag cgtatcgaca atatttactg ccgctggcgc agggaattac ccccaatatc 480 tttgagttgg aaatcctgac cggtaaaaat tgccgcgatc tcgacagtgc cattgctgcc 540 gcaaaaagtc tgctttcaga cacattaaaa tgggtggtgg ttaccagcgc ctccggtaat 600 gaagaaaatc aggagatgca ggttgtggtg gtcactgccg acagcgtgaa tgtcatttcc 660 cattcacggg taaaaaccga cctgaaaggg actggcgacc tgttttgtgc tcagctcatc 720 agtggcttgc tgaaagggaa ggcgttaacc gatgcagtgc accgagcggg gttgcgcgta 780 ctggaagtga tgcgctacac ccagcagcat gagagcgatg aattgatttt gccgccgctg 840 gcggaagcat aa 852 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxK_HF1 <400> 2 gttacgggta ttgccgagct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxK_HR1 <400> 3 ttaatttttt ctccttgccg 20 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxK_PF <400> 4 cggcaaggag aaaaaattaa gtgtaggctg gagctgcttc 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxK_PR <400> 5 cgcccatcgg cgccattttt ctgtcaaaca tgagaattaa 40 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxK_HF2 <400> 6 aaaaatggcg ccgatgggcg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxK_HR2 <400> 7 ggcgttgaac tgttcgtcca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxK_CF <400> 8 gctcttaccg gggatcttca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxK_CR <400> 9 gctatcaaac caacgggtaa 20 <210> 10 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxY "PDXY-MONOMER" (complement(1715026..1715889)) Escherichia coli K-12 substr. MG1655 <400> 10 atgatgaaaa atattctcgc tatccagtct cacgttgttt atggtcatgc gggtaacagt 60 gcggcagagt ttccgatgcg ccgcctgggc gcgaacgtct ggccgctgaa caccgttcaa 120 ttttctaatc acacccaata cggcaaatgg actggctgcg tgatgccgcc cagccattta 180 accgaaattg tgcaaggcat tgccgccatt gataaattac acacctgtga tgccgtatta 240 agtggctatc tgggatcggc ggagcagggt gaacatatcc tcggtatcgt ccgtcaggtg 300 aaagccgcga atccgcaggc gaaatatttt tgcgatccgg taatgggtca tccggaaaaa 360 ggctgtatcg ttgcaccggg tgtcgcagag tttcatgtgc ggcacggttt gcctgccagc 420 gatatcattg cgccaaatct ggttgagctg gaaatactct gtgagcatgc ggtaaataac 480 gtcgaagaag cggttctggc agcgcgcgaa ctcattgcgc aagggccaca aattgtgttg 540 gttaaacacc tggcgcgagc tggctacagc cgtgaccgtt ttgaaatgct gctggtcacc 600 gccgatgaag cctggcatat cagccgtccg ctggtggatt ttggtatgcg ccagccggta 660 ggtgttggtg atgtgacgag cggtttactg ctggtgaaac tgcttcaggg ggcaacgctg 720 caggaggcgc tggaacatgt gaccgctgca gtctacgaaa tcatggtgac caccaaagca 780 atgcaggaat atgagctgca agtggtggct gctcaggatc gtattgccaa accagaacat 840 tacttcagcg caacaaagct ctga 864 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxY_HF1 <400> 11 gtaccgatgg ttgagatgga 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxY_HR1 <400> 12 gttccctgta taaaaaccag gggg 24 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxY_PF <400> 13 ctggttttta tacagggaac gtgtaggctg gagctgcttc 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxY_PR <400> 14 gtgggccgaa atgagatatt ctgtcaaaca tgagaattaa 40 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxY_HF2 <400> 15 aatatctcat ttcggcccac aacg 24 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxY_HR2 <400> 16 ggaagagtac aaaccgacag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxY_CF <400> 17 caggtgactc gtctggttca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdxY_CR <400> 18 atgcagtatc ttgccgacag 20

Claims (10)

  1. pdxK(pyridoxal kinase K) 및 pdxY(pyridoxal kinase Y) 중 적어도 하나의 유전자의 활성이 약화 또는 불활성화된 대장균 변이 균주를 포함하는 L-트립토판 및 L-페닐알라닌 생산용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 pdxK 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고,
    상기 pdxY 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것인,
    L-트립토판 및 L-페닐알라닌 생산용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 약화 또는 불활성화는 유전자 서열의 전부 또는 일부가 삽입, 치환, 또는 결실되어 이루어진 것인,
    L-트립토판 및 L-페닐알라닌 생산용 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. pdxK(pyridoxal kinase K) 및 pdxY(pyridoxal kinase Y) 중 적어도 하나의 유전자의 활성이 약화 또는 불활성화된 대장균 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 변이 균주 및 배양 배지에서 L-트립토판 및 L-페닐알라닌을 회수하는 단계를 포함하는,
    방향족 아미노산의 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 배지는 피리독살 5'-인산염(Pyridoxal 5'-phosphate)를 첨가한 배지인,
    방향족 아미노산의 제조 방법.
  10. 삭제
KR1020190138235A 2019-10-31 2019-10-31 피리독살 키나아제 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주 KR102269642B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190138235A KR102269642B1 (ko) 2019-10-31 2019-10-31 피리독살 키나아제 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190138235A KR102269642B1 (ko) 2019-10-31 2019-10-31 피리독살 키나아제 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210052111A KR20210052111A (ko) 2021-05-10
KR102269642B1 true KR102269642B1 (ko) 2021-06-25

Family

ID=75917974

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190138235A KR102269642B1 (ko) 2019-10-31 2019-10-31 피리독살 키나아제 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102269642B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230103229A (ko) * 2021-12-31 2023-07-07 씨제이제일제당 (주) O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101599802B1 (ko) * 2014-05-23 2016-03-04 씨제이제일제당 주식회사 세포내 에너지 수준이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 l-아미노산을 생산하는 방법
KR101830002B1 (ko) 2016-10-11 2018-02-19 대상 주식회사 부기질의 공급 강화를 통한 l-트립토판이 과발현되는 균주 및 이를 이용하는 l-트립토판의 제조 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210052111A (ko) 2021-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102269634B1 (ko) ansB 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주
KR101830001B1 (ko) Prpp 합성 경로 개선을 통한 l-트립토판이 과발현되는 균주 및 이를 이용하는 l-트립토판의 제조 방법
KR102269642B1 (ko) 피리독살 키나아제 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주
KR102283626B1 (ko) glsB 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주 및 이의 제조방법
KR20180111680A (ko) CRISPR/Cas 시스템과 재조합 효소 및 단일가닥 올리고디옥시리보핵산을 이용한 코리네박테리움 변이균주 제조방법
CN114630896B (zh) 由于yeeo基因失活而具有提高的芳香族氨基酸产生能力的菌株
KR101751967B1 (ko) 부산물의 생성이 감소된 이소루이신 생산능 변이 균주
KR102283628B1 (ko) 바이러스 감염 관련 유전자 불활성에 의해 방향족 아미노산 생산능력이 향상된 균주
KR102251947B1 (ko) mdtK 유전자 불활성에 의해 방향족 아미노산 생산능력이 향상된 균주
KR102251948B1 (ko) mdfA 유전자 불활성 및 yicL 유전자 도입에 의해 방향족 아미노산 생산능력이 향상된 균주
US20240043885A1 (en) Strain with improved aromatic amino acid production capacity by ansb gene inactivation
KR102668767B1 (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
KR101233666B1 (ko) 박테리아 변이 균주를 이용한 이소루신 생산
KR101821401B1 (ko) 비산화 펜토오스 인산 경로 관련 효소의 불활성화에 의한 히스티딘 생산능 변이 균주
CN116745412A (zh) 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株
CN116783290A (zh) 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株
CN116802283A (zh) 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株
KR20130070302A (ko) 발린 생산능을 향상시키는 방법
CN116829705A (zh) 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株
KR20220148694A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
JP2024511393A (ja) Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたｌ－シトルリンの生産方法
KR20240086803A (ko) 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법
KR20240000169A (ko) L-히스티딘 배출 단백질 및 이를 이용한 l-히스티딘 생산 방법
CN116724113A (zh) 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株
KR20090092438A (ko) Ｌ-트립토판을 생산하는 미생물 및 이를 이용한ｌ-트립토판 생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant