KR101821401B1 - 비산화 펜토오스 인산 경로 관련 효소의 불활성화에 의한 히스티딘 생산능 변이 균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 히스티딘(histidine) 생산능 변이 균주, 상기 변이 균주의 제조방법 및 히스티딘 제조방법을 제공한다. 본 발명은 히스티딘 생산능을 갖는 균주에서 비산화 펜토오스 인산 경로(non-oxidative pentose phosphate pathway)-관련 효소를 불활성화시킴으로써 히스티딘의 생산능을 증가시킨다. 본 발명에 따르면, 상기 히스티딘 생산능 변이 균주는 야생형 균주와 비교하여 5-50% 증가된 히스티딘 생산능을 나타낸다.
Description
본 발명은 비산화 펜토오스 인산 경로 관련 효소의 불활성화에 의한 히스티딘 생산능 변이 균주에 관한 것이다.
히스티딘(Histidine)은 단백질에 존재하는 스무 개의 표준 아미노산들 가운데 하나이다. 인간에게 있어서 필수 아미노산인 히스티딘은 순환기계의 모세혈관투과성을 항진하는 히스타민 합성의 필수성분이다. 히스타민의 전구체로서 히스티딘은 성기능 강화작용과 저산증에 위산 분비를 촉진하여 소화능을 증강시키며, 혈압을 올리고 폐 기관지의 근육을 강화한다. 그리고 조직의 성장과 수복에 필수적이므로 유아의 성장에 반드시 필요하다. 그리고 회복기의 환자에게도 면역력 증강을 위해 히스티딘은 필요한 아미노산이므로, 다른 필수 아미노산들과 같이 아미노산 보충제로서도 충분한 가치가 있다.
현재 히스티딘의 대량 생산을 위한 대장균의 개발에 대해서 많은 연구가 수행되고 있지만, 1) 히스티딘의 전구체인 포스포리보실피로인산 (phosphoribosylpyrophosphate; PRPP) 생산하는 오탄당 인산 회로를 통한 생산량 증가에 대한 연구 부족, 2) 히스티딘을 생합성하는 유전자에서의 중요 효소에 대한 정보부족, 3) 히스티딘을 대량생산 할 수 있도록 개발된 균주에 대한 2차 돌연변이 유발법 및 스크리닝 방법에 대한 정보 부족, 4) 외래 숙주에서 유래하는 히스티딘 합성 대사 회로에서의 대사흐름 최적화 부재 등으로 발효로 인한 생산에 어려움이 많다. 히스티딘의 생산은 일본의 경우 발효공법으로 생산하고 있으며 중국 등에서 추출법으로 생산하고 있고, 히스티딘을 과생산하는 연구(4.9 g/L)와 특허(14 g/L)(US 7067289 B1)로 발표된 상태이다.
히스티딘 생산균주를 개발하기 위해 종래의 기술에서는 가장 일반적으로 돌연변이법(주로 chemical mutagen: NTG)을 이용한 균주 개발방법을 사용하였다. 이것은 중간대사산물 또는 최종산물에 대한 내성주 선별법으로 돌연변이 유도 후, 히스티딘의 유사 구조체에 대한 내성을 가지는 변이주를 선별하는 방법이다. 그러나 이러한 돌연변이법은 균주에 원하지 않는 돌연변이도 수반할 수 있고, 변이로 인해 과생산된 산물들이 세포내 축적 되면서 세포 생육이 저하되는 등의 결과를 가져올 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 히스티딘 생합성 경로 중 전구체인 포스포리보실피로인산(phosphoribosylpyrophosphate; PRPP)의 증가를 통해 히스티딘의 생산성을 증가시킨 히스티딘(histidine) 생산능 변이 균주를 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 비산화 펜토오스 인산 경로(non-oxidative pentose phosphate pathway)-관련 효소를 불활성화 시켜 제조한 히스티딘의 생산능 변이 균주의 증가된 히스티딘 생산능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 히스티딘 생산능 변이 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 히스티딘 생산능 변이 균주의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 히스티딘 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 불활성화된 비산화 펜토오스 인산 경로(non-oxidative pentose phosphate pathway)-관련 효소를 포함하는 히스티딘(histidine) 생산능 변이 균주를 제공한다.
본 발명자들은 히스티딘 생합성 경로 중 전구체인 포스포리보실피로인산(phosphoribosylpyrophosphate; PRPP)의 증가를 통해 히스티딘의 생산성을 증가시킨 히스티딘생산능 변이 균주를 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 불활성화 시켜 제조한 히스티딘의생산능 변이 균주의 증가된 히스티딘생산능을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 "비산화 펜토오스 인산 경로"는 펜토오스 인산 경로는 환원 당량인(reducing equivalent)인 NADPH및 뉴클레오타이드의 필수 성분인 펜토오스를 생성하는 글루코오스 순환 과정 중 하나이다. 비산화 펜토오스 인산 경로는 인산화 당이 자일룰로오스-5-인산(xylulose-5-phosphate), 리불로오스-5-인산(ribulose-5-phosphate) 및 리보오스-5-인산(ribose-5-phosphate)로 상호전환되는 가역적 경로이다. 리보오스-5-인산으로부터 형성된 포스포리보실피로인산(phosphoribosylpyrophosphate; PRPP)는 히스티딘 및 퓨린/피리미딘 뉴클레오타이드의 생합성에 이용되는 활성 화합물이다(참조: http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?map00030 및 https://en.wikipedia.org/wiki/Pentose_phosphate_pathway).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소는 포스포글루코오스이성화효소(pgi. phosphoglucoseisomerase), 트랜스케톨라아제(transketolase)A(tktA), 트랜스케톨라아제 B(tktB), 트랜스알돌라아제(transaldolase) A(talA) 및 트랜스알돌라아제 B(talB)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소이다.
상기 pgi를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열이다.
상기 tktB를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열이다.
상기 tktA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제3서열이다.
상기 talA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제4서열이다.
상기 talB를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제5서열이다.
본 발명에서 히스티딘생산능 변이 균주를 표현하면서 사용하는 용어 "불활성화"는 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합에 의하여 단백질의 발현 및/또는 활성을 억제하거나 약화시키는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 불활성화는 pgi, tktA, tktB, talA 및 talB로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 코딩하는뉴클레오타이드 서열의 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합에 의한 불활성화이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 불활성화는 pgi, tktA, tktB, talA 및 talB로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의효소를 코딩하는뉴클레오타이드 서열의 완전 또는 부분 결실에 의한 비산화 펜토오스 인산 경로 관련 효소의 불활성화이다. 본 발명의 특정 구현예에 르면, 본 발명의 불활성화는 pgi, tktA, tktB, talA 및 talB로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 부분 결실에 의한 비산화 펜토오스인산 경로-관련 효소의 불활성화이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 히스티딘 생산능 변이 균주는 불활성화된 포스포글루코오스 이성화효소, 트랜스케톨라아제 B 또는 이의 조합을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 히스티딘 생산능 변이 균주는 불활성화된 트랜스케톨라아제 A, 트랜스알돌라아제 A, 트랜스알돌라아제 B 또는 이의 조합을 포함한다.
불활성화 대상이 되는 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소는 다양한 균주에서 발견되고 동정되었다. 하기의 실시예에서는 서열목록 제1서열 내지 제5서열의 이스케리치아 콜라이의 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소가 예시되어 있으나, 이외에도 다양한 효소가 본 발명에 포함된다.
본 발명의 변이 균주는 야생형(wild type) 또는 활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 균주를 모균주로 하여 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 불활성화 시킨 균주이며, 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 발현하거나 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소의 효소 활성을 포함하고 있는 균주라면 모균주로 제한 없이 이용이 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 히스티딘 생산능 변이균주의 모균주는 에스케리치아 콜라이 DS9H KCTC18430P이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 히스티딘 생산능 변이 균주는 에스케리치아(Escherichia) 속 균주이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 히스티딘 생산능 변이 균주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헤르마니(Escherichia hermannii) 또는 에스케리치아 불네리스(Escherichia vulneris) 균주이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 히스티딘 생산능 변이 균주는 에스케리치아 콜라이이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 불활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능변이 균주는 야생형 또는 활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 변이 균주와 비교하여 히스티딘의 생산능이 5-50%, 5-45%, 5-40%, 10-40% 증가된 균주이다.
하기 본 발명의 실시예를 통해 입증하듯이, 본 발명의 히스티딘 생산능 변이 균주는 불활성화 pgi를 포함하는 경우에 야생형 또는 활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 변이 균주와 비교하여 히스티딘의 생산능이 5-30%, 5-25%, 5-20%, 10-20% 또는 15-20% 증가된 균주이다.
본 발명의 히스티딘 생산능 변이 균주는 불활성화 tktB를 포함하는 경우에 야생형 또는 활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 변이 균주와 비교하여 히스티딘의 생산능이 10-40%, 10-35%, 10-30%, 15-30% 또는 20-30% 증가된 균주이다.
본 발명의 히스티딘 생산능 변이 균주는 불활성화 pgi및 tktB를 포함하는 경우에 야생형 또는 활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 변이 균주와 비교하여 히스티딘의 생산능이 20-50%, 20-45%, 20-40%, 25-40% 또는 30-40% 증가된 균주이다.
본 발명의 히스티딘 생산능 변이 균주는 불활성화 tktA를 포함하는 경우에 야생형 또는 활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 변이 균주와 비교하여 히스티딘의 생산능이 2-20%, 2-18%, 2-15%, 5-15% 또는 8-15% 증가된 균주이다.
본 발명의 히스티딘 생산능 변이 균주는 불활성화 talA를 포함하는 경우에 야생형 또는 활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 변이 균주와 비교하여 히스티딘의 생산능이 5-30%, 5-25%, 5-20%, 10-20% 또는 15-20% 증가된 균주이다.
본 발명의 히스티딘 생산능 변이 균주는 불활성화 talB를 포함하는 경우에 야생형 또는 활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 변이 균주와 비교하여 히스티딘의 생산능이 2-20%, 2-18%, 2-15%, 5-15% 또는 8-15% 증가된 균주이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 불활성화 시키는 단계를 포함하는 히스티딘(histidine) 생산능 변이 균주의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 야생형 또는 활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 변이 균주를 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 불활성화 시키는 것이 가능하다.
히스티딘 생합성에 관련된 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 암호화 하는 유전자 pgi, tktA, tktB, talA 및 talB로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의유전자를 염색체상에서 결실시키기 위하여 원스텝 불활성화 방법(one step inactivation: Warner et al., PNAS, 6:6640-6645)을 이용한다.
본 발명에서 야생형 또는 활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 균주에 형질전환 시키는 단계는 공지된 방법을 통하여 실시될 수 있다. 예컨대, 전기 천공 방법(van der Rest et al., Appl. Microbiol.Biotechnol., 52, 541-545, 1999) 등에 의해 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 형질전환이 되지 않은 야생형 또는 활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 균주로부터 형질 전환된 변이 균주를 분리 및 수득하는 단계를 포함한다.
상기 본 발명에서 형질전환이 되지 않은 균주로부터 형질전환된 히스티딘 생산능 변이 균주를 분리 및 수득하는 단계를 실시하는데 있어서 선택 표지된 벡터를 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 이용하는 벡터는 플라스미드 또는 파지(phage)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 이용하는 선택 표지는 당업계에서 통상적으로 이용되는 카나마이신, 앰피실린 같은 항생제 내성 유전자와 고초균유래 SacB 유전자의 산물인 레반슈크라제(levansucrase)를 포함한다.
본 발명의 제조방법은 상술한 불활성화 비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 변이 균주와 동일한 균주를 제조하는 방법이며, 불활성화의 대상이 되는 단백질(비산화 펜토오스 인산 경로-관련 효소인 포스포글루코오스 이성화효소, 트랜스케톨라아제 A, 트랜스케톨라아제 B, 트랜스알돌라아제 A 및 트랜스알돌라아제 B로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소) 및 관련 유전자(pgi, tktA, tktB, talA 및 talB로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의유전자)를 공통으로 하기 때문에, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 히스티딘 생산능변이 균주를 배양하는 단계를포함하는 히스티딘 생산방법을 제공한다.
본 발명은 히스티딘 생산능 균주 및 변이 균주의 전배양 또는 종배양 하는데 있어서 공지된 배양 방법을 통해 배양할 수 있다.
본 발명에 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있으며, 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다.
배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.
본 발명은 상기 불활성화 비산화 펜토오스인산 경로-관련 효소를 포함하는 히스티딘 생산능 변이 균주와 동일한 균주 및 균주제조 방법을 이용하여 히스티딘을 생산하는 방법이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 히스티딘(histidine) 생산능 변이 균주, 상기 변이 균주의 제조방법 및 히스티딘 제조방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 히스티딘 생산능을 갖는 균주에서 비산화 펜토오스 인산 경로(non-oxidative pentose phosphate pathway)-관련 효소를 불활성화시킴으로써 히스티딘의 생산능을 증가시킨다.
(c) 본 발명의 히스티딘 생산능 변이 균주는 야생형 균주와 비교하여 5-50% 증가된 히스티딘 생산능을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예1:
pgi
,
tktB
유전자가 결실된 변이주 제조
pgi, tktB 유전자를 결실시켰다. 결실하고자 하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열목록 제 1 서열 및 제 2 서열과 같다.
포스포글루코스 이성화효소(Phosphoglucose isomerase)를 코딩하는 유전자(pgi, 서열목록 제1서열) 및 트랜스케톨라아제 B(tktB, 서열목록 제2서열) 결실 균주를 제작하기 위해서 원스탭 불활성화 방법(one step inactivation; Warner et al., PNAS, 6:6640-6645(2000))을 이용하였다. 상세한 실험방법은 하기와 같다:
하기 표1에서의pgi경우,pgi 유전자 일부서열과 pKD13 플라스미드 일부 서열을가지는 FR_F(pgi) 및, FR_R(pgi)프라이머 쌍을 이용하였고 tktB의 경우, tktB 유전자 일부서열과 pKD13 플라스미드 일부서열을 가지는 FR_F(tktB) 및 FR_R(tktB) 프라이머 쌍, 및 pKD13 플라스미드(Genbank 접근번호 AY048744)를 이용하여 PCR 반응(총부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 pgi와 상보적인 부분을 가지는 FRT 약 1.3kb, tktB와 상보적인 부분을 가지는 FRT 약 1.3kb의 증폭된 단편(1) 및 (2)를 각각 얻었다.
pgi 및 tktB 유전자의 결실 균주를 제조하기 위하여 pgi 및 tktB 유전자의 앞쪽 단편을 얻고자 대장균 MG1655의 지노믹(genomic) DNA를 주형으로 하여 pgi의 경우 표1의 pgi_HF1및 pgi_HR1 프라이머, tktB의 경우 표2의 tktB_HF1 및 tktB_HR1 프라이머를 이용하여 PCR(총부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 200bp 증폭된 단편(3) 및 (4)를 각각 얻었다.
또한 pgi 및tktB 유전자의 뒤쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 표 1의 프라이머 pgi_HF2 및 pgi_HR2, 표 2의 tktB_HF2 및 tktB_HR2를 이용하여 PCR(총부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 200 bp의 증폭된 단편(5) 및 (6)을 각각 얻었다.
위 실험에서 증폭된 각각의 단편 (1), (3) 및 (5) 세트 및 (2), (4) 및 (6) 세트는 증폭시 프라이머의 상보적 서열로 인하여 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 이 단편들을 프라이머를 제외하고 총 부피 50㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 2분 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃ 에서 10분 조건으로 PCR을 수행하여 FRT가 포함되고 양쪽 끝에 pgi 단편이 있는 약 1.7kb, FRT가 포함되고 양쪽 끝에 tktB 단편이 있는 약 1.7kb 크기를 가지는 하나의 증폭된 단편을 각각 얻었다.
이렇게 획득한 DNA 단편을 pKD46(GenBank No. AY048746)을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이 DS9H(Escherichia coli, DS9H; KCTC 18430P) 세포에 전기천공하였다. 이후 카나마이신 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 pgi 및 tktB 유전자의 결실 여부를 확인하였다. 반응은 표 1의 pgi_CF 및 pgi_CR 프라이머, 표 2의 tktB_CF, tktB_CR 프라이머를 이용하여 총 부피 20 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서2분 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분 조건으로 수행하였다. 염색체 내에 단편이 삽입된 경우 원래 pgi 유전자가 있을 경우 생성되는 1.6 kb와 비교하여 약 2.0 kb가 생성됨을 확인하였다. 또한 tktB의 유전자가 있을 경우 생성되는 2.0 kb 와 비교하여 약 2.4 kb가 생성됨을 확인하였다.
pgi 및 tktB 결실이 확인된 균주들을 이용하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하는 과정을 수행하였다. pgi 및tktB 유전자 결실주에 pCP20 플라스미드를 도입하여 FLP 재조합을 유도한 후, 항생제(카나마이신) 첨가 및 미첨가 LB 평판에서 생장 여부를 통해 항생제 제거 여부를 확인하였다. 항생제가 제거된 균주들은 LB평판에서 생장을 하나, 항생제(카나마이신)가 첨가된 LB 평판에서는 생장하지 못함을 확인하였다.
프라이머 | 염기서열 (5’-3’) |
pgi-HF1 | TCAACCGCACTGAAAACCGC |
pgi-HR1 | GAAGCAGCTCCAGCCTACACGATCCCGATGTTCACTACGT |
FR-F(pgi) | GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC |
FR-R(pgi) | CTGTCAAACATGAGAATTAA |
pgi-HF2 | TTAATTCTCATGTTTGACAGGCAGGAATATCGTGATCAGG |
pgi-HR2 | ACCTGCTGGTAACGGCTGAC |
pgi-CF | AAGTTCTCCGCAACCTTCGA |
pgi-CR | GCCACGCTTTATAGCGGTTA |
tktB-HF1 | GACCTTGCCAATGCGATTCG |
tktB-HR1 | GAAGCAGCTCCAGCCTACAC CGGTCAGATGTAGCAAACTG |
FR-F(tktB) | GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC |
FR-R(tktB) | CTGTCAAACATGAGAATTAA |
tktB-HF2 | TTAATTCTCATGTTTGACAG CAGGATGAGGAATATCGGGA |
tktB-HR2 | CAGCACCTTATGCGCTTTTG |
tktB-CF | CTGTCTGAAGGCATTCGTCT |
tktB-CR | GTTAAACAAAATGGCGGGAC |
실시예 2: pgi, tktB 유전자 결실 균주의 L-히스티딘 생산량 평가
실시예 1에서 얻어진 pgi, tktB 유전자결실 균주의 L-히스티딘의 생성량을 확인하기 위하여 모주인 에스케리치아 콜라이 DS9H(Escherichia coli, DS9H KCTC 18430P)와 pgi 및 tktB 결실 균주인 DS9H△pgi, DS9H△tktB 및 DS9H△pgi△tktB 균주의 L-히스티딘 생성량을 비교하였다.
상기 균주를 표 3의 배지조성으로 플라스크에서 배양하였다.
성분 | 농도 |
포도당 | 8% |
황산마그네슘 | 0.1% |
황산암모늄 | 2.0% |
MSG | 0.1% |
일인산칼륨 | 0.1% |
효모추출물 | 0.1% |
황산칼륨 | 0.02% |
티아민-HCl | 20 ppm |
니코틴산 | 10 ppm |
황산철 | 5 ppm |
황산아연 | 5 ppm |
황산망간 | 5 ppm |
탄산칼슘(별도멸균) | 5.0% |
상기 배지 조건(pH7.0)으로 시작 액량 10 ㎖로 수행하였고, 배양은 온도 34℃, 교반속도 200 rpm의 물리적 조건으로 배양하였다. 그 결과 표 4에서와 같이 L-히스티딘의 생산량이 증가하는 것을 확인하였다.
균주명 | L-히스티딘(%) | 배양시간(hr) |
DS9H | 0.77 | 72 |
DS9H△pgi | 0.91 | 72 |
DS9H△tktB | 0.96 | 72 |
DS9H△pgi,△tktB | 1.04 | 72 |
pgi 및 tktB를 함께 결실시킨 균주(DS9H△pgi,△ktB) 플라스크에서 배양한 결과 모주인 에스케리치아 콜라이 DS9H(Escherichia coli, DS9H KCTC 18430P) 대비 L-히스티딘이 약 35% 증가하는 것을 확인하였다. pgi 및 tktB를 각각 결실시킨 균주도 각각18% 및 24%의 히스티딘 생성 증가를 나타냈다. 비산화(Non-oxidative)PPP 경로 관련 유전자인 pgi, tktB를 약화시켜 산화 PPP 경로가 강화되어 L-히스티딘 전구체인 PRPP가 증가한 것임을 확인할 수 있다.
실시예3:
tktA
,
talA
또는
talB
유전자가 결실된 변이주 제조
실시예 1 및 2의 결과를 바탕으로 L-히스티딘 생산능을 향상시키기 위하여 pgi 및 tktB 이외의 비산화 PPP 경로 관련 유전자인 트랜스케톨라아제(transketolase, tkt) A, 트랜스알돌라아제(transaldolase, tal) A 또는 트랜스알돌라아제B의 파쇄를 원스탭 불활성화 방법(one step inactivation; Warner et al., PNAS, 6:6640-6645(2000))을 통해 결실하였다. 불활성화고자 하는 tktA, talA 및 talB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 3 서열, 제 4 서열 및 제 5 서열과 같다.
트랜스케톨라아제 A를 코딩하는 유전자인 tktA와 트랜스알돌라아제A를 코딩하는 유전자인 talA, 트랜스알돌라아제 B를 코딩하는 유전자인 talB의 결실 균주를 제작하기 위해서 다음과 같이 실험을 수행하였다:
하기 표 7, 8 및 9에서의 tktA, talA 또는 talB 유전자 일부서열과 pKD13 플라스미드 일부 서열을 가지는 프라이머, 예컨대, tktA경우 FR_F(tktA) 및 FR_R(tktA)프라이머 쌍, talA의 경우 FR_F(talA) 및 FR_R(talA) 프라이머 쌍, talB의 경우 FR_F(talB) 및 FR_R(talB) 프라이머 쌍,및 pKD13 플라스미드(Genbank 접근번호 AY048744)를 이용하여 PCR 반응(총부피 50㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 tktA와 상보적인 부분을 가지는 FRT 약 1.3kb, talA와 상보적인 부분을 가지는 FRT 1.3kb 및, talB와 상보적인 부분을 가지는 FRT 약 1.3kb 의 증폭된 단편(7) 내지 (9)를 각각 얻었다.
tktA, talA 및 talB 유전자의 결실 균주를 각각 제조하기 위하여 tktA, talA 및 talB 유전자의 앞쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 tktA의 경우 표 7의 tktA_HF1 및 tktA_HR1 프라이머, talA의 경우 표 8의 talA_HF1 및 talA_HR1 프라이머, talB의 경우 표 9의 talB_HF1 및 talB_HR1 프라이머를 이용하여 PCR(총부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 200 bp 증폭된 단편(10) 내지 (12)을 각각 얻었다.
또한 tktA, talA 및 talB 유전자의 뒤쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 표 7의 프라이머 tktA_HF2 및 tktA_HR2, 표 8의 프라이머 talA_HF2 및 talA2, 표9의 프라이머 talB_HF2 및 talB_HR2를 이용하여 PCR(총부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 200 bp의 증폭된 단편(13) 내지 (15)을 각각 얻었다.
위 실험에서 증폭된 각각의 단편(7), (10) 및 (13) 세트, 단편(8), (11) 및 (14) 세트, 및 단편(9), (12) 및 (15) 세트는 증폭시 프라이머의 상보적 서열로 인하여 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 이 단편들을 프라이머를 제외하고 총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃ 에서 10분 조건으로 PCR을 수행하여 FRT의 양쪽 끝에 tktA 단편이 포함되어 있는 약 1.7kb, FRT의 양쪽 끝에 talA 단편이 포함되어 있는 약 1.7kb, FRT의 양쪽 끝에 talB 단편이 포함되어 있는 약 1.7kb 크기를 가지는 하나의 증폭된 단편을 각각 얻었다.
이렇게 획득한 DNA 단편을 pKD46(GenBank No. AY048746)을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이 DS9H (Escherichia coli, DS9H; KCTC 18430P) 세포에 전기침공하였다. 이후 카나마이신 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 tktA, talA 또는 talB 유전자의 결실 여부를 확인하였다. 반응은 표 7의 tktA_CF 및 tktA_CR 프라이머, 표 8의 talA_CF 및 talA_CR 프라이머, 표 9의 talB_CF 및 talB_CR 프라이머를 이용하여 총 부피 20 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분 조건으로 수행하였다. 염색체 내에 단편이 삽입된 경우 원래 tktA 유전자가 있을 경우 생성되는 2.0 kb 와 비교하여 약 2.4 kb가 생성됨을 확인하였다. 또한 talA 유전자가 있을 경우 생성되는 0.9 kb 와 비교하여 약 1.3 kb가 생성됨을 확인하였다. 그리고 talB 유전자가 있을 경우 생성되는 0.9 kb 와 비교하여 약 1.3 kb가 생성됨을 확인하였다.
tktA, talA 또는 talB 결실이 확인된 균주들을 이용하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하는 과정을 수행하였다. tktA, talA 또는 talB 유전자 결실 균주에 pCP20 프라스미드를 도입하여 FLP 재조합을 유도한 후, 항생제(카나마이신) 첨가 및 미첨가 LB 평판에서 생장 여부를 통해 항생제 제거 여부를 확인하였다. 항생제가 제거된 균주들은 LB평판에서 생장을 하나, 항생제(카나마이신)가 첨가된 LB 평판에서는 생장하지 못함을 확인 하였다.
프라이머 | 염기서열 (5’-3’) |
tktA-HF1 | CGTAAAGAGCTTGCCAATGC |
tktA-HR1 | GAAGCAGCTCCAGCCTACACGGTGCAGCAGGCTGTAGATC |
FR-F(tktA) | GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC |
FR-R(tktA) | CTGTCAAACATGAGAATTAA |
tktA-HF2 | TTAATTCTCATGTTTGACAGGTCTACCGACGCATTTGACA |
tktA-HR2 | CGCAACAACGTTATCAACAG |
tktA-CF | GGCTTGCGGTAAATTGTTGG |
tktA-CR | GTGATCTACAACACGCCTTA |
프라이머 | 염기서열 (5’-3’) |
talA-HF1 | CGAGTTAGACGGCATCAAAC |
talA-HR1 | GAAGCAGCTCCAGCCTACACCAGTTTGTCACACGCTGCGA |
FR-F(talA) | GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC |
FR-R(talA) | CTGTCAAACATGAGAATTAA |
talA-HF2 | TTAATTCTCATGTTTGACAGCGCACCGAATTTACTGAAGG |
talA-HR2 | GTTTGGCGGCAAGAAGATCT |
talA-CF | ATGCCTGTCTGCTATGCTTT |
talA-CR | GGATGACCAGAGTTGGCTTT |
프라이머 | 염기서열 (5’-3’) |
talB-HF1 | CAAATTGACCTCCCTTCGTC |
talB-HR1 | GAAGCAGCTCCAGCCTACACCCAGACCAATATTTACTGCC |
FR-F(talB) | GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC |
FR-R(talB) | CTGTCAAACATGAGAATTAA |
talB-HF2 | TTAATTCTCATGTTTGACAGCGTAAACTGTCTTACACCGG |
talB-HR2 | CAGCAGATCGCCGATCATTT |
talB-CF | GCTGACGTTGCGTCGTGATA |
talB-CR | CAGAATGATACACTGCGAAG |
실시예4:
tktA
,
talA
또는
talB
유전자 결실 균주의 L-히스티딘 생산량 평가
실시예 3에서 얻어진 tktA, talA 또는 talB 유전자 결실 균주의 L-히스티딘 생성량을 확인하기 위하여 모주인 에스케리치아 콜라이 DS9H(Escherichia coli, DS9H; KCTC 18430P)와 tktA, talA 또는 talB가 각각 결실 균주인 DS9H△tktA, DS9H△talA 및 DS9H△talB의 L-히스티딘 생성량을 비교하였다.
상기 균주를 실시예 2와 동일한 배지 조성 및 배양조건을 이용하여 배양하였다.
균주명 | L-히스티딘(%) | 배양시간(hr) |
DS9H | 0.77 | 72 |
DS9H△tktA | 0.86 | 72 |
DS9H△talA | 0.89 | 72 |
DS9H△talB | 0.87 | 72 |
표 10의 결과와 같이 본 발명에 의해 모균주에 비해 L-히스티딘 생산성이 약 11~15% 향상되는 것을 확인할 수 있었다. DS9H△tktA, DS9H△talA 및 DS9H△talB는 각각 모균주와 비교하여 약 18%, 24%, 35% L-히스티딘 생산성이 증가하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> DAESANG CORPORATION
<120> Mutant Strain with Improved Histidine Production by Inactivating
Non-oxidative Pentose Phosphate Pathway-related Enzyme
<130> PN150580
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1650
<212> DNA
<213> phosphoglucose isomerase(pgi)
<400> 1
atgaaaaaca tcaatccaac gcagaccgct gcctggcagg cactacagaa acacttcgat 60
gaaatgaaag acgttacgat cgccgatctt tttgctaaag acggcgatcg tttttctaag 120
ttctccgcaa ccttcgacga tcagatgctg gtggattact ccaaaaaccg catcactgaa 180
gagacgctgg cgaaattaca ggatctggcg aaagagtgcg atctggcggg cgcgattaag 240
tcgatgttct ctggcgagaa gatcaaccgc actgaaaacc gcgccgtgct gcacgtagcg 300
ctgcgtaacc gtagcaatac cccgattttg gttgatggca aagacgtaat gccggaagtc 360
aacgcggtgc tggagaagat gaaaaccttc tcagaagcga ttatttccgg tgagtggaaa 420
ggttataccg gcaaagcaat cactgacgta gtgaacatcg ggatcggcgg ttctgacctc 480
ggcccataca tggtgaccga agctctgcgt ccgtacaaaa accacctgaa catgcacttt 540
gtttctaacg tcgatgggac tcacatcgcg gaagtgctga aaaaagtaaa cccggaaacc 600
acgctgttct tggtagcatc taaaaccttc accactcagg aaactatgac caacgcccat 660
agcgcgcgtg actggttcct gaaagcggca ggtgatgaaa aacacgttgc aaaacacttt 720
gcggcgcttt ccaccaatgc caaagccgtt ggcgagtttg gtattgatac tgccaacatg 780
ttcgagttct gggactgggt tggcggccgt tactctttgt ggtcagcgat tggcctgtcg 840
attgttctct ccatcggctt tgataacttc gttgaactgc tttccggcgc acacgcgatg 900
gacaagcatt tctccaccac gcctgccgag aaaaacctgc ctgtactgct ggcgctgatt 960
ggcatctggt acaacaattt ctttggtgcg gaaactgaag cgattctgcc gtatgaccag 1020
tatatgcacc gtttcgcggc gtacttccag cagggcaata tggagtccaa cggtaagtat 1080
gttgaccgta acggtaacgt tgtggattac cagactggcc cgattatctg gggtgaacca 1140
ggcactaacg gtcagcacgc gttctaccag ctgatccacc agggaaccaa aatggtaccg 1200
tgcgatttca tcgctccggc tatcacccat aacccgctct ctgatcatca ccagaaactg 1260
ctgtctaact tcttcgccca gaccgaagcg ctggcgtttg gtaaatcccg cgaagtggtt 1320
gagcaggaat atcgtgatca gggtaaagat ccggcaacgc ttgactacgt ggtgccgttc 1380
aaagtattcg aaggtaaccg cccgaccaac tccatcctgc tgcgtgaaat cactccgttc 1440
agcctgggtg cgttgattgc gctgtatgag cacaaaatct ttactcaggg cgtgatcctg 1500
aacatcttca ccttcgacca gtggggcgtg gaactgggta aacagctggc gaaccgtatt 1560
ctgccagagc tgaaagatga taaagaaatc agcagccacg atagctcgac caatggtctg 1620
attaaccgct ataaagcgtg gcgcggttaa 1650
<210> 2
<211> 2004
<212> DNA
<213> transketolase B
<400> 2
atgtcccgaa aagaccttgc caatgcgatt cgcgcactca gtatggatgc ggtacaaaaa 60
gccaactctg gtcatcccgg cgcgccgatg ggcatggctg atattgccga agtgctgtgg 120
aacgattttc ttaaacataa ccctaccgac ccaacctggt atgatcgcga ccgctttatt 180
ctttccaacg gtcacgcgtc gatgctgctc tacagtttgc tacatctgac cggttacgac 240
ctgccgctgg aagaactgaa gaacttccgt cagttgcatt cgaaaacccc aggccacccg 300
gagattggct atacgccagg cgttgaaacc accaccggcc cgcttggaca aggtttggcg 360
aacgccgtcg ggctggcgat agcagagcgt acactggcgg cgcagtttaa ccagccagac 420
catgagatcg tcgatcactt cacctatgtg tttatgggcg acggctgcct gatggaaggt 480
atttcccacg aagtctgttc gctggcaggc acgctgggac tgggcaagct gattggtttt 540
tacgatcaca acggtatttc catcgacggt gaaacagaag gctggtttac cgacgatacg 600
gcaaaacgtt ttgaagccta tcactggcat gtgatccatg aaatcgacgg tcacgatccg 660
caggcggtga aggaagcgat ccttgaagcg caaagcgtga aagataagcc gtcgctgatt 720
atctgccgta cggtgattgg ctttggttcg ccgaataaag caggtaagga agaggcgcac 780
ggcgcaccac tgggggaaga agaagtggcg ctggcacggc aaaaactggg ctggcaccat 840
ccgccatttg agatccctaa agagatttat cacgcctggg atgcccgtga aaaaggcgaa 900
aaagcgcagc agagctggaa tgagaagttt gccgcctata aaaaggctca tccgcaactg 960
gcagaagagt ttacccgacg gatgagcggt ggtttaccga aggactggga gaaaacgact 1020
cagaaatata tcaatgagtt acaggcaaat ccggcgaaaa tcgctacccg taaggcttcg 1080
caaaatacgc ttaacgctta cgggccgatg ctgcctgagt tgctcggcgg ttcggcggat 1140
ctggctccca gcaacctgac catctggaaa ggttctgttt cgctgaagga agatccagcg 1200
ggcaactaca ttcactacgg ggtgcgtgaa tttggcatga ccgctatcgc caacggcatc 1260
gcgcaccacg gcggctttgt gccgtatacc gcgacgttcc tgatgtttgt tgaatacgcc 1320
cgtaacgccg cgcggatggc ggcactgatg aaagcgcggc agattatggt ttatacccac 1380
gactcaattg gcctgggcga agatggtccg acgcaccagg ctgttgagca actggccagc 1440
ctgcgcttaa cgccaaattt cagcacctgg cgaccgtgcg atcaggtgga agcggcggtg 1500
ggctggaagc tggcggttga gcgccacaac ggaccgacgg cactgatcct ctcaaggcag 1560
aatctggccc aggtggaacg tacgccggat caggttaaag agattgctcg tggcggttat 1620
gtgctgaaag acagcggcgg taagccagat attattctga ttgccaccgg ttcagagatg 1680
gaaattaccc tgcaagcggc agagaaatta gcaggagaag gtcgcaatgt acgcgtagtt 1740
tccctgccct cgaccgatat tttcgacgcc caggatgagg aatatcggga gtcggtgttg 1800
ccttctaacg ttgcggctcg cgtggcggtg gaagcaggta ttgccgatta ctggtacaag 1860
tatgttggtc tgaaaggggc aattgtcggg atgacgggtt acggggaatc tgctccggcg 1920
gataagctgt tcccgttctt tggctttacc gccgagaata ttgtggcaaa agcgcataag 1980
gtgctgggag tgaaaggtgc ctga 2004
<210> 3
<211> 1992
<212> DNA
<213> transketolase A
<400> 3
atgtcctcac gtaaagagct tgccaatgct attcgtgcgc tgagcatgga cgcagtacag 60
aaagccaaat ccggtcaccc gggtgcccct atgggtatgg ctgacattgc cgaagtcctg 120
tggcgtgatt tcctgaaaca caacccgcag aatccgtcct gggctgaccg tgaccgcttc 180
gtgctgtcca acggccacgg ctccatgctg atctacagcc tgctgcacct caccggttac 240
gatctgccga tggaagaact gaaaaacttc cgtcagctgc actctaaaac tccgggtcac 300
ccggaagtgg gttacaccgc tggtgtggaa accaccaccg gtccgctggg tcagggtatt 360
gccaacgcag tcggtatggc gattgcagaa aaaacgctgg cggcgcagtt taaccgtccg 420
ggccacgaca ttgtcgacca ctacacctac gccttcatgg gcgacggctg catgatggaa 480
ggcatctccc acgaagtttg ctctctggcg ggtacgctga agctgggtaa actgattgca 540
ttctacgatg acaacggtat ttctatcgat ggtcacgttg aaggctggtt caccgacgac 600
accgcaatgc gtttcgaagc ttacggctgg cacgttattc gcgacatcga cggtcatgac 660
gcggcatcta tcaaacgcgc agtagaagaa gcgcgcgcag tgactgacaa accttccctg 720
ctgatgtgca aaaccatcat cggtttcggt tccccgaaca aagccggtac ccacgactcc 780
cacggtgcgc cgctgggcga cgctgaaatt gccctgaccc gcgaacaact gggctggaaa 840
tatgcgccgt tcgaaatccc gtctgaaatc tatgctcagt gggatgcgaa agaagcaggc 900
caggcgaaag aatccgcatg gaacgagaaa ttcgctgctt acgcgaaagc ttatccgcag 960
gaagccgctg aatttacccg ccgtatgaaa ggcgaaatgc cgtctgactt cgacgctaaa 1020
gcgaaagagt tcatcgctaa actgcaggct aatccggcga aaatcgccag ccgtaaagcg 1080
tctcagaatg ctatcgaagc gttcggtccg ctgttgccgg aattcctcgg cggttctgct 1140
gacctggcgc cgtctaacct gaccctgtgg tctggttcta aagcaatcaa cgaagatgct 1200
gcgggtaact acatccacta cggtgttcgc gagttcggta tgaccgcgat tgctaacggt 1260
atctccctgc acggtggctt cctgccgtac acctccacct tcctgatgtt cgtggaatac 1320
gcacgtaacg ccgtacgtat ggctgcgctg atgaaacagc gtcaggtgat ggtttacacc 1380
cacgactcca tcggtctggg cgaagacggc ccgactcacc agccggttga gcaggtcgct 1440
tctctgcgcg taaccccgaa catgtctaca tggcgtccgt gtgaccaggt tgaatccgcg 1500
gtcgcgtgga aatacggtgt tgagcgtcag gacggcccga ccgcactgat cctctcccgt 1560
cagaacctgg cgcagcagga acgaactgaa gagcaactgg caaacatcgc gcgcggtggt 1620
tatgtgctga aagactgcgc cggtcagccg gaactgattt tcatcgctac cggttcagaa 1680
gttgaactgg ctgttgctgc ctacgaaaaa ctgactgccg aaggcgtgaa agcgcgcgtg 1740
gtgtccatgc cgtctaccga cgcatttgac aagcaggatg ctgcttaccg tgaatccgta 1800
ctgccgaaag cggttactgc acgcgttgct gtagaagcgg gtattgctga ctactggtac 1860
aagtatgttg gcctgaacgg tgctatcgtc ggtatgacca ccttcggtga atctgctccg 1920
gcagagctgc tgtttgaaga gttcggcttc actgttgata acgttgttgc gaaagcaaaa 1980
gaactgctgt aa 1992
<210> 4
<211> 951
<212> DNA
<213> transaldolase A
<400> 4
atgaacgagt tagacggcat caaacagttc accactgtcg tggcagacag cggcgatatt 60
gagtccattc gccattatca tccccaggat gccaccacca atccttcgct gttactcaaa 120
gctgccggat tatcacaata tgagcattta atagacgatg ctatcgcctg gggtaaaaaa 180
aatggcaaga cccaggaaca acaggtggtc gcagcgtgtg acaaactggc ggtcaatttc 240
ggtgctgaaa tcctcaaaat cgtacccggt cgcgtgtcaa cagaagttga tgcacgcctc 300
tcttttgata aagaaaagag tattgagaag gcgcgccatc tggtggactt gtatcagcaa 360
caaggcgttg agaaatcacg cattctgatc aagctggctt cgacctggga aggaattcgc 420
gcggcagaag agctggaaaa agaaggtatt aactgcaacc tgacgctgct gttttctttt 480
gcacaggcac gggcctgtgc ggaagcaggc gtttttctga tttcgccgtt tgtcgggcgt 540
atttatgact ggtatcaggc acgcaagccg atggacccgt atgtggtgga agaagatccg 600
ggcgttaaat cggtgcgcaa tatctacgac tactataagc aacaccacta tgaaaccatt 660
gtgatgggcg cgagcttccg tcgcaccgaa caaatcctcg ccttaaccgg ctgcgatcga 720
ctgactatcg caccgaattt actgaaggag ctgcaggaaa aagtttcgcc agtggtacgt 780
aaattaatcc caccttctca gacgttccca cgcccagctc ccatgagcga agcggagttc 840
cgttgggagc acaatcagga tgcgatggcg gtagaaaaac tgtctgaagg cattcgtctg 900
ttcgccgttg atcaacgcaa actggaagat cttcttgccg ccaaactata a 951
<210> 5
<211> 954
<212> DNA
<213> transaldolase B
<400> 5
atgacggaca aattgacctc ccttcgtcag tacaccaccg tagtggccga cactggggac 60
atcgcggcaa tgaagctgta tcaaccgcag gatgccacaa ccaacccttc tctcattctt 120
aacgcagcgc agattccgga ataccgtaag ttgattgatg atgctgtcgc ctgggcgaaa 180
cagcagagca acgatcgcgc gcagcagatc gtggacgcga ccgacaaact ggcagtaaat 240
attggtctgg aaatcctgaa actggttccg ggccgtatct caactgaagt tgatgcgcgt 300
ctttcctatg acaccgaagc gtcaattgcg aaagcaaaac gcctgatcaa actctacaac 360
gatgctggta ttagcaacga tcgtattctg atcaaactgg cttctacctg gcagggtatc 420
cgtgctgcag aacagctgga aaaagaaggc atcaactgta acctgaccct gctgttctcc 480
ttcgctcagg ctcgtgcttg tgcggaagcg ggcgtgttcc tgatctcgcc gtttgttggc 540
cgtattcttg actggtacaa agcgaatacc gataagaaag agtacgctcc ggcagaagat 600
ccgggcgtgg tttctgtatc tgaaatctac cagtactaca aagagcacgg ttatgaaacc 660
gtggttatgg gcgcaagctt ccgtaacatc ggcgaaattc tggaactggc aggctgcgac 720
cgtctgacca tcgcaccggc actgctgaaa gagctggcgg agagcgaagg ggctatcgaa 780
cgtaaactgt cttacaccgg cgaagtgaaa gcgcgtccgg cgcgtatcac tgagtccgag 840
ttcctgtggc agcacaacca ggatccaatg gcagtagata aactggcgga aggtatccgt 900
aagtttgcta ttgaccagga aaaactggaa aaaatgatcg gcgatctgct gtaa 954
Claims (10)
- 불활성화된 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 포스포글루코오스 이성화효소(phosphoglucoseisomerase) 및 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 트랜스케톨라아제(transketolase) B를 포함하는 히스티딘 생산능이 5-50% 증가된 에스케리치아(Escherichia) 속 변이 균주.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 에스케리치아 속 균주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헤르마니(Escherichia hermannii) 또는 에스케리치아 불네리스(Escherichia vulneris) 균주인 것을 특징으로 하는 변이 균주.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 포스포글루코오스 이성화효소(phosphoglucoseisomerase) 및 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 트랜스케톨라아제 (transketolase) B를 불활성화 시키는 단계를 포함하는 히스티딘 생산능이 5-50% 증가된 에스케리치아 속 변이 균주의 제조방법.
- 제 1 항 또는 제 5 항의 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 히스티딘(histidine) 제조방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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KR1020150181822A KR101821401B1 (ko) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | 비산화 펜토오스 인산 경로 관련 효소의 불활성화에 의한 히스티딘 생산능 변이 균주 |
Related Child Applications (1)
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KR20170073786A KR20170073786A (ko) | 2017-06-29 |
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ID=59280088
Family Applications (1)
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KR1020150181822A KR101821401B1 (ko) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | 비산화 펜토오스 인산 경로 관련 효소의 불활성화에 의한 히스티딘 생산능 변이 균주 |
Country Status (1)
Country | Link |
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KR (1) | KR101821401B1 (ko) |
-
2015
- 2015-12-18 KR KR1020150181822A patent/KR101821401B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
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KR20170073786A (ko) | 2017-06-29 |
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