JP6263641B2 - L−リジン生産能が向上したコリネバクテリウム微生物、及びそれを利用したl−リジン生産方法 - Google Patents
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Description
米国国立保健院の遺伝子銀行(NIHGenbank)に報告された塩基配列に基づいて、ftsB遺伝子のヌクレオチド配列を確保した(配列番号2)。ftsBの開放解読ツール(open reading frame)が内部的に消失した遺伝子断片を作るために、前記配列番号2を基に、それぞれプライマー0936F1,09369R1,0936F2及び0936R2を作製した、それぞれを配列番号7ないし10と示した。
終結コドン変異導入によるftsB遺伝子不活性化組み換えベクターを作製するために、前記pDZベクターを使用し、ftsB遺伝子開放解読ツールにおいて140番目のアミノ酸であるトリプトファン対応コドンを終結コドンで置換させるためのプライマーを作製した。0936F1と0936R3とを対にするプライマーと、0936F3と0936R2とを対にするプライマーとを使用し、実施例1と同一方法のPCRで増幅してpDZベクターに接合し、ベクターpDZ−ftsB W140*を作製した。前記0936F3及び0936R3のプライマー配列は、配列番号11及び12とそれぞれ示した。前記作製ベクターに接合されたfts遺伝子のアミノ酸は、配列番号5の配列を有し、核酸は、配列番号6のヌクレオチド配列を有する。
前記実施例1,2で作製した組み換えベクターを、それぞれ電気パルス法を利用して、L−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムKCCM11016P(旧寄託番号KFCC10881、韓国登録特許0159812号、韓国登録特許0397322号参照)に形質転換させた(Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999)52: 541-545による形質転換法を利用)。カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含んだ選別培地において、染色体上の同遺伝子と、相同性によって、挿入された菌株を選別した。ベクターの、首尾よく行われた染色体挿入は、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガルラクトシド)を含んだ固体培地で、青色を示すか否かということを確認することによって可能であった。一次染色体挿入された菌株を、栄養培地で振盪培養(30℃、8時間)した後、それぞれ10−4から10−10まで希釈し、X−galを含んでいる固体培地に塗抹した。ほとんどのコロニーが青色を示すのに反し、低い比率で示される白色のコロニーを選別することにより、二次交差(crossover)によって、ftsB遺伝子が不活性化された菌株をそれぞれ選別した。
実施例3で作製されたL−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムKCCM11016P−ftsB,KCCM11016P−ftsBW140*,KCCM10770P−ftsB,KCCM10770P−ftsBW140*,KCCM11347P−ftsB,KCCM11347P−ftsBW140,CJ3P−ftsB及びCJ3P−ftsBW140*を、L−リジン生産のために、下記のような方法で培養した。
原糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO44g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1,000μg、カルシウム−パントテン酸2,000μg、ニコチンアミド2,000μg(蒸溜水1リットル基準)
生産培地(pH7.0)
ブドウ糖100g、(NH4)2SO440g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形粉(corn steep solids)5g、尿素3g、KH2PO41g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1,000μg、カルシウム−パントテン酸2,000μg、ニコチンアミド3,000μg、CaCO330g(蒸溜水1リットル基準)。
Claims (4)
- 隔膜形成開始因子タンパク質が不活性化されたことを特徴とするL−リジン生産能が向上したコリネ型微生物であって、前記隔膜形成開始因子タンパク質は、糸状温度感受性B(FtsB)タンパク質である、微生物。
- 前記隔膜形成開始因子タンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項1に記載の微生物。
- 前記コリネ型微生物はコリネバクテリウムグルタミクム(C.glutamicum)であることを特徴とする請求項1に記載の微生物。
- 請求項1に記載の微生物を培養し、培養物内にL−リジンを生産する段階と、
培養物からL−リジンを回収する段階とを含むことを特徴とするL−リジンを生産する方法。
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