WO2015088204A1 - L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신을 생산하는 방법 - Google Patents

L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신을 생산하는 방법 Download PDF

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WO2015088204A1
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ftsb
corynebacterium
gene
microorganism
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문준옥
박상희
허란
이광호
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • It relates to a microorganism of the genus Corynebacterium with improved production capacity of L- lysine and a method for producing L- lysine using the same.
  • Microorganisms of the genus Corynebacterium are Gram-positive microorganisms that are widely used for L-amino acid production.
  • L-amino acids particularly L-lysine, are used in the animal feed, human pharmaceutical and cosmetic industries and are produced by fermentation with Corynebacterium strains.
  • One aspect provides coryneform microorganisms with improved L-lysine production.
  • Another aspect provides a method of producing L-lysine using the microorganism.
  • One aspect provides coryneform microorganisms with enhanced L-lysine production capacity, in which septum formation initiator proteins are inactivated.
  • septum formation initiator refers to a factor necessary for initiating the formation of a membranous structure, ie, a septum, that distinguishes the interior of cells formed during cell division of coryneform microorganisms.
  • cell division may occur in the presence of the diaphragm initiation factor.
  • the septum In the presence of a septum initiation factor, the septum can be incorporated at the periphery near the center of the cell to divide the cytoplasm into two. Cell division may then occur with the synthesis of the extracellular membrane.
  • the diaphragm initiation factor protein may be one of the proteins shown in Tables 1 and 2.
  • Diaphragm formation initiators may include Filamentous Temperature Sensitive (Fts) proteins.
  • the filamentous temperature sensitive protein is a protein involved in the formation of divisom, and may be necessary for the cell division process of the microorganism.
  • the filamentous temperature sensitive protein may comprise FtsB, FtsA, FtsZ, FtsEX, FtsK, FtsQ, FtsW, FtsI, or a combination thereof, preferably FtsB.
  • FtsB may be one having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 70% homology thereof, preferably 80% homology thereof, more preferably 90% homology thereof, and most preferably 95% homology thereof.
  • the term “homology” refers to identity between two amino acid sequences and is well known to those skilled in the art using BLAST 2.0 to calculate parameters such as score, identity, similarity, etc. Can be determined.
  • the gene encoding the filamentous temperature sensitive protein may be a nucleic acid encoding ftsA, ftsB, ftsZ, ftsEX, ftsK, ftsQ, ftsW, ftsI, or a combination thereof.
  • the ftsB gene is a gene involved in cell division of coryneform microorganisms and may form a disome together with ftsZ, ftsEX, ftsK, FtsQ, ftsW, and class B HMW-PBPs.
  • the ftsB gene may be a nucleic acid encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the ftsB gene may be, for example, the NCBI grant number NCg10936 gene.
  • NCBI granting number NCg10936 gene is a gene present in microorganisms belonging to the genus Corynebacterium, as well as having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from Corynebacterium glutamicum strains. Refers to a gene that expresses a product that is substantially the same as the product. In the present invention, “substantially the same” refers to having the same kind of activity and regulatory mechanisms as the NCBI Grant No. NCg10936 gene product.
  • inactivation may mean that the cell or enzyme does not exhibit an activity level measured in cells of the same species or comparable original enzymes thereof.
  • Cells of the same species that are comparable may be cells that have not undergone manipulations such as recombination or modification.
  • inactivation of a septum formation initiator protein may mean that the activity of the polypeptide encoding the septum formation initiator is removed.
  • the microorganisms inactivate the activity of the diaphragm initiation factor protein to a degree sufficient to produce L-lysine.
  • the inactivation may be caused by a recombinant method.
  • the recombination method may comprise homologous recombination.
  • the homologous recombination method may cause homologous recombination with a partial sequence of the gene and an endogenous gene in the microorganism when the vector including the partial sequence of the gene is transformed into the microorganism and cultured in the presence of a selection marker product.
  • the vector may be a pDZ- ⁇ ftsB comprising the NCBI granting number NCg10936 gene fragment of SEQ ID NO: 4 or a pDZ-ftsB W140 * vector comprising the NCBI granting number NCg10936 gene fragment of SEQ ID NO: 6.
  • the endogenous gene in the microorganism is recombined by the homologous recombination, and only a recombinant including the marker among the recombinant genes may be selected by a selection marker.
  • the homologous recombination method it is possible to obtain a microorganism of the genus Corynebacterium in which the endogenous NCBI grant No. NCg10936 gene is inactivated.
  • inactivation of protein activity may be caused by deletion, substitution, addition, reversal, or combination of bases, nucleosides, nucleotides, or a combination thereof.
  • the method of inactivating protein activity may use, for example, a gene knockout approach, an antisense technique, or an RNAi technique. It may also include a method of deleting the initial copy of each gene, replacing the initial copy with a mutant, or expressing the initial copy from a weak promoter. It is also possible to substitute a promoter of a gene encoding the protein, introduce a mutation by random or target mutagenesis, or destroy or knock out the gene. It may also include a method of introducing a destabilizing element into an mRNA or introducing a genetic modification to alter the ribosomal binding site (RBS) of RNA.
  • RBS ribosomal binding site
  • Inactivation of the gene can be achieved by transforming a vector comprising a portion of the NCBI Grant No. NCg10936 gene and a selection marker to a microorganism of the genus Corynebacterium and culturing in the presence of antibiotics for selection.
  • the selection marker may be implemented to select cells transformed with the vector.
  • the selection marker may be a marker that confers a selectable phenotype, such as drug resistance, nutritional requirements, resistance to cytotoxic agents or expression of surface proteins.
  • Coryneform microorganism is Corynebacterium glutamicum (C.glutamicum), Corynebacterium ammoniagenes to Ness (C.ammoniagenes), Corynebacterium pseudo-to-cool suberic tuberculosis (C.pseudotuberculosis), Corynebacterium epi Chien's (C.efficiens), Corynebacterium, Pseudomonas Jenny de Solarium (C.pseudogenitalium), Corynebacterium Jenny de Solarium (C.genitalium), Corynebacterium Acre lances (C.accolens), Corynebacterium C.
  • Corynebacterium glutamicum may be an accession number KCCM11016P, KCCM10770P, KCCM11347P or CJ3P.
  • the term "coryneform microorganism” may be a Corynebacterium (Corynebacterium) in the microorganism having an L- lysine-producing ability.
  • the microorganism may be improved in L-lysine production ability by introducing a mutation to inactivate a gene encoding a diaphragm initiation factor protein in a microorganism of the genus Corynebacterium having L-lysine production capacity.
  • the term “having L-lysine production capacity” means that when the microorganism is cultured in the medium, it has the ability to produce and secrete L-lysine in the medium.
  • the microorganism may be a microorganism capable of producing and accumulating L-lysine in the culture medium in a larger amount than the wild type or parent strain.
  • Coryneform microorganisms in which the gene encoding the diaphragm initiation factor protein according to one embodiment is inactivated the activity of FtsB, one of filamentous temperature-sensitive proteins, thereby inhibiting cell division of the coryneform microorganism, while relatively L -Lysine production can be improved.
  • Another aspect includes culturing the microorganism of the present invention to produce L-lysine in culture; And recovering L-lysine from the culture.
  • the microorganism is as described above.
  • Cultivation of the microorganism may be made in accordance with a suitable medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used according to the microorganism selected.
  • the method of culturing may comprise one or more cultures selected from the group consisting of batch, continuous, and fed-batch cultures.
  • the medium used for the culture may be a medium that can satisfy the requirements of specific microorganisms.
  • the medium may be a medium selected from the group consisting of carbon sources, nitrogen sources, trace element components, and combinations thereof.
  • the carbon source may be a carbon source selected from the group consisting of carbohydrates, fats, fatty acids, alcohols, organic acids, and combinations thereof.
  • the carbohydrate may be glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, and combinations thereof.
  • the fat may be soybean oil, sunflower oil, pajama oil, coconut oil, and combinations thereof.
  • the fatty acid may be palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, or a combination thereof.
  • the alcohol may be glycero or ethanol.
  • the organic acid may comprise acetic acid.
  • the nitrogen source may include an organic nitrogen source, an inorganic nitrogen source, or a combination thereof.
  • the organic nitrogen source may be selected from the group consisting of peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor (CSL), soybean wheat, and combinations thereof.
  • the inorganic nitrogen source may be selected from the group consisting of urea, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, ammonium nitrate, and combinations thereof.
  • the medium may include one selected from the group consisting of phosphorus, metal salts, amino acids, vitamins, precursors, and combinations thereof.
  • the source of phosphorus may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • the metal salt may be magnesium sulfate or iron sulfate.
  • the medium or individual components thereof may be added in batch, continuous, or fed-batch culture.
  • the pH of the culture can be adjusted.
  • the pH can be adjusted by adding ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, or sulfuric acid to the culture.
  • the culture method may include bubble generation inhibition.
  • the foam production inhibition can be achieved through the use of antifoaming agents.
  • the antifoaming agent may comprise a fatty acid polyglycol ester.
  • the culture method may include the injection of gas into the culture.
  • the gas may include any gas for maintaining an aerobic state of the culture.
  • the gas may be oxygen or an oxygen containing gas.
  • the oxygen containing gas includes air.
  • the temperature of the culture may be 20 to 45 °C, for example 22 to 42 °C, or 25 to 40 °C.
  • the incubation period can last until the desired amount of L-lysine is obtained.
  • the culturing may be continuous or batchwise, such as batch processes, infusion batches and repeated infusion batch processes. Such cultures are well known in the art, and any method may be used.
  • L-amino acids can be separated and analyzed by anion exchange chromatography and subsequent ninhydrin derivatization.
  • the ability of the microorganism to produce L-lysine can be improved.
  • Example 1 ftsB gene inactivation recombinant vector construction by deletion
  • the nucleotide sequence of the ftsB gene was obtained based on the nucleotide sequence reported to the National Institutes of Health (NIH Genbank) (SEQ ID NO: 2).
  • Primers 0936F1, 09369R1, 0936F2, and 0936R2 were prepared based on SEQ ID NO: 2, respectively, to generate a gene fragment in which the open reading frame of ftsB was lost internally. Indicated.
  • pDZ vector (see Korean Patent No. 0924065) was used to prepare an inactivated recombinant vector by ftsB gene deletion, and thereafter, a nucleic acid molecule having a modified sequence of ftsB gene, which was produced to be inactivated as described above.
  • a vector pDZ- ⁇ ftsB vector comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 encodes an amino acid having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • PCR was performed using primers 0936F1-0936R1 and 0936F2-0936R2 with Corynebacterium glutamicum ATCC13032 genomic DNA as a template.
  • the polymerase was PfuUltraTM high-trust DNA polymerase (Stratagene), and PCR conditions were denatured 96 ° C., 30 seconds; Annealing 53 ° C., 30 seconds; And 30 degreeC of the polymerization reaction 72 degreeC and 2 minutes was repeated.
  • pDZ- ⁇ ftsB includes both ends of XbaI of 135 bp ftsB and includes fragments in which 408 bp of the internal gene of ftsB is lost.
  • the pDZ vector was used to construct a ftsB gene inactivation recombinant vector by introducing a stop codon mutation.
  • a primer was prepared to replace the 140-th amino acid tryptophan counterpart codon in the gene open reading frame with a stop codon.
  • the primers paired with 0936 F1 and 0936 R3 and primers paired with 0936 F3 and 0936 R2 were amplified by PCR in the same manner as in Example 1, and conjugated to the pDZ vector to prepare a vector pDZ-ftsB W140 *.
  • the sequences of the 0936F3 and 0936R3 primers are represented by SEQ ID NOs: 11 and 12, respectively.
  • the amino acid of the fts gene conjugated to the production vector has a sequence of SEQ ID NO: 5, and the nucleic acid has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the primary chromosome-inserted strain was shaken in nutrient medium (30 ° C., 8 hours), and then diluted from 10 ⁇ 4 to 10 ⁇ 10 , respectively, and plated on a solid medium containing X-gal. While most colonies showed blue color, white colonies appearing at a low rate, so that the strains in which ftsB gene was inactivated by the second crossover were selected.
  • PCR was performed using 0936F1-0936R2 of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10 as a primer to select ftsB gene inactivation mutants due to deletion. Finally, KCCM11016P- ⁇ ftsB was inactivated by the deletion of the ftsB gene.
  • PCR was performed using primers paired with 0936F1-0936R2 of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10 to select the ftsB gene inactivating mutant strain by introducing stop codon mutations.
  • Final identification of the target site by sequencing the ftsB gene inactivation mutant strain by introduction of the stop codon mutation KCCM11016P-ftsB W140 * was produced.
  • Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-ftsB W140 *, KCCM10770P-ftsB W140 *, KCCM10770P-ftsB W140 *, KCCM11347P-ftftsB, KCCM11 W140 * , CJ3P-ftftsB, and CJ3P-ftsB W140 * were incubated in the following manner for L-lysine production.
  • Each of the cultured 1 ml seed cultures was then inoculated in a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the following production medium and shaken at 200 rpm for 120 hours at 30 ° C.
  • the composition of the seed medium and the production medium is as follows.
  • the lysine production was increased by about 4% in all cases where the ftsB gene was deleted or the stop codon was introduced from the parent strain KCCM11016P.
  • the lysine concentration increased not by the structural change of the ftsB gene itself but by the deletion of the FtsB protein, which is a diaphragm initiation factor.
  • the FtsB-inactivated strains increased the average lysine concentration by 4% compared to the wild-type FtsB-activated strains.
  • KCCM11016P-ftsB W140 * (CA01-2274) was deposited on September 27, 2013 at the Korea Microorganism Conservation Center (Yurim Building, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea) under the accession number KCCM11454P.

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Abstract

격막 형성 개시 인자 단백질이 불활성화된 라이신 생산능이 향상된 코리네형 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신을 생산하는 방법
L-라이신의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산, 특히 L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며 코리네박테리움 균주를 이용한 발효에 의해 생성되고 있다.
코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제조방법을 개선하기 위하여 많은 시도가 행해지고 있다. 그 중에서 재조합 DNA 기술을 이용하여 특정유전자를 파괴시키거나 감쇠 발현시킴으로써 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 있었다. 또한, 각각의 L-아미노산 생합성에 관련된 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생성에 미치는 효과를 연구하고 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 많이 있어 왔다. 또한, 다른 박테리아 유래의 외래 유전자를 도입하는 경우도 있다.　
그러나, 상기한 종래 방법에 의하더라도 여전히 L-라이신의 생산능이 향상된 균주는 여전히 요구되고 있다.
일 양상은 L-라이신 생산능이 향상된 코리네형 미생물을 제공한다.
다른 양상은 상기 미생물을 이용한 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상은 격막 형성 개시 인자 (septum formation initiator) 단백질이 불활성화된, L-라이신 생산능이 향상된 코리네형 미생물을 제공한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "격막 형성 개시 인자 (septum formation initiator)"는 코리네형 미생물의 세포 분열 과정에 있어서 형성되는 세포 내부를 구분하는 막상 구조물, 즉 격막의 형성을 개시하는데 필요한 인자를 지칭한다. 따라서 세포분열은 상기 격막 형성 개시 인자의 존재하에서 일어날 수 있다. 격막 형성 개시 인자의 존재 하에, 격막은 세포 중앙 부근의 주변부에서 함입되어 세포질을 둘로 나눌 수 있다. 그 후 세포 외막의 합성이 수반되어 세포 분열이 일어날 수 있다. 상기 격막 형성 개시 인자 단백질은 표 1 및 2에 표시된 단백질 중 하나일 수 있다.
표 1
기입(Entry) 이름 기입 항목(Entry name) 단백질명 유전자명 생물체(organism)
Q8NRS0 Q8NRS0_CORGL 격막 형성 인자, 분비 단백질 cg1112 Cgl0975 코리네박테리움 글루타미쿰(strain ATCC 13032 / DSM 20300 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025)
G4QXS0 G4QXS0_CORPS 격막 형성 인자 단백질 Cp4202_0705 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스 42/02-A
I3QWJ7 I3QWJ7_CORPS 격막 형성 인자 단백질 Cp258_0720 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 258
I0DJM4 I0DJM4_CORPS 격막 형성 인자 단백질 Cp31_0721 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 31
H2FRL0 H2FRL0_CORPS 격막 형성 인자 단백질 Cp3995_0727 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 3/99-5
I4ASY7 I4ASY7_CORPS 격막 형성 인자 단백질 Cp162_0714 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 Cp162
I0ARP4 I0ARP4_CORPS 격막 형성 인자 단백질 Cp267_0749 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 267
G4QUP8 G4QUP8_CORPS 격막 형성 인자 단백질 CpCIP5297_0731 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 CIP 52.97
G7U3I0 G7U3I0_CORPS 격막 형성 인자 단백질 Cp106_0699 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 1/06-A
G0I2E0 G0I2E0_CORPS 격막 형성 인자 단백질 CpPAT10_0713 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 PAT10
H6M3W9 H6M3W9_CORPS 격막 형성 인자 단백질 Cp316_0740 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 316
H8LRF5 H8LRF5_CORPS 격막 형성 인자 단백질 CpP54B96_0726 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 P54B96
D9Q9H0 D9Q9H0_CORP2 격막 형성 인자 단백질 CpC231_0714 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 (strain C231)
E3F8E0 E3F8E0_CORP9 격막 형성 인자 단백질 CpI19_0714 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 (strain I19)
D9Q7G1 D9Q7G1_CORP1 격막 형성 인자 단백질 Cp1002_0715 코리네박테리움슈도투베르쿨로시스 (strain 1002)
표 2
기입(Entry) 이름 기입 항목(Entry name) 단백질명 유전자명 생물체(organism)
C8NN43 C8NN43_COREF 격막 형성 인자, 분비 단백질 HMPREF0290_1418 코리네박테리움 에피시엔스 (strain DSM 44549 / YS-314 / AJ 12310 / JCM 11189 / NBRC 100395)
Q8FQS4 Q8FQS4_COREF 격막 형성 인자 패밀리 단백질 HMPREF0290_1417 코리네박테리움 에피시엔스 (strain DSM 44549 / YS-314 / AJ 12310 / JCM 11189 / NBRC 100395)
E2S4T1 E2S4T1_9CORY 격막 형성 인자 HMPREF0305_11533 코리네박테리움 슈도제니탈리움 ATCC 33035
E2S4T0 E2S4T0_9CORY 격막 형성 인자 패밀리 단백질 HMPREF0305_11532 코리네박테리움 슈도제니탈리움 ATCC 33035
D7WEC6 D7WEC6_9CORY 격막 형성 인자 HMPREF0291_11160 코리네박테리움 제니탈리움 ATCC 33030
D7WEC7 D7WEC7_9CORY 격막 형성 인자 패밀리 단백질 HMPREF0291_11161 코리네박테리움 제니탈리움 ATCC 33030
E0MWT7 E0MWT7_9CORY 격막 형성 인자 HMPREF0277_0971 코리네박테리움 아코렌스 ATCC 49726
E0MWT8 E0MWT8_9CORY 격막 형성 인자 패밀리 단백질 HMPREF0277_0972 코리네박테리움 아코렌스 ATCC 49726
E2MWD5 E2MWD5_9CORY 격막 형성 인자, 분비 단백질 CORAM0001_0431 코리네박테리움 아미콜라툼 SK46
E0DIN5 E0DIN5_9CORY 격막 형성 인자 HMPREF0299_5548 코리네박테리움 마트루초티 ATCC 14266
G7HYM6 G7HYM6_9CORY 추정 격막 형성 인자(Putative septum formation initiator) CCAS_08930 코리네박테리움 카세이 UCMA 3821
C0XRQ5 C0XRQ5_9CORY 격막 형성 인자, 분비 단백질 HMPREF0298_1125 코리네박테리움 리포필로플라붐 DSM 44291
C6RB12 C6RB12_9CORY 격막 형성 인자, 분비 단백질 CORTU0001_0256 코리네박테리움 투버쿨로스테아리쿰 SK141
C8RQC2 C8RQC2_CORJE 격막 형성 인자 패밀리 단백질 HMPREF0297_0224 코리네박테리움 제이케이움 ATCC 43734
D5UVG9 D5UVG9_TSUPD 격막 형성 인자 Tpau_3164 코리네박테리움 파우로메타볼룸(strain ATCC 8368 / DSM 20162 / JCM 10117 / NBRC 16120 / NCTC 13040) (Tsukamurella paurometabola)
격막 형성 개시인자는 사상 온도 감수성 (Filamentous Temperature Sensitive: Fts) 단백질을 포함할 수 있다. 상기 사상 온도 감수성 단백질은 디비좀(divisiom) 형성에 관여하는 단백질로, 미생물의 세포 분열 과정에 있어서 필요한 것일 수 있다. 사상 온도 감수성 단백질은 FtsB, FtsA, FtsZ, FtsEX, FtsK, FtsQ, FtsW, FtsI 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 FtsB일 수 있다. FtsB는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 70% 상동성, 바람직하게는 80% 상동성, 더욱 바람직하게는 90% 상동성, 가장 바람직하게는 95% 상동성을 가지는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 용어 "상동성"은 두 아미노산 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0를 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.
사상 온도 감수성 단백질을 코딩하는 유전자는 ftsA, ftsB, ftsZ, ftsEX, ftsK, ftsQ, ftsW, ftsI 또는 이들의 조합을 코딩하는 핵산일 수 있다.
상기 ftsB 유전자는 코리네형 미생물의 세포분열에 관여하는 유전자로, ftsZ, ftsEX, ftsK, FtsQ, ftsW 및 클래스 B HMW-PBPs와 함께 디비좀 (divisome)을 형성할 수 있다. 상기 ftsB 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산일 수 있다. 상기 ftsB 유전자는 예를 들면 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자일 수 있다. 용어, "NCBI 허가번호 NCg10936 유전자"란 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 유래의 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것뿐만 아니라, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물에 존재하는 유전자로서 상기 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자 산물과 실질적으로 동일한 산물을 발현하는 유전자를 말한다. 본 발명에 있어서, "실질적으로 동일한"이란 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자 산물과 동일한 종류의 활성 및 조절 기작을 갖는 것을 말한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "불활성화 (inactivation)"는 세포 또는 효소가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 효소에서 측정되는 활성 수준을 나타내지 않는 것을 의미할 수 있다. 상기 비교 가능한 동일 종의 세포는 재조합 또는 변형과 같은 조작이 수행되지 않은 세포일 수 있다. 상기 미생물에 있어서, 격막 형성 개시 인자 (septum formation initiator) 단백질의 불활성화는 격막 형성 개시 인자를 코딩하는 폴리펩티드의 활성이 제거된 것을 의미할 수 있다. 또한, 상기 미생물은 L-라이신을 생산하는데 충분한 정도로 격막 형성 개시 인자 단백질의 활성이 불활성화되어 있다.
상기 불활성화는 재조합 방법에 의하여 야기된 것일 수 있다. 상기 재조합 방법은 상동 재조합 (homologous recombination)을 포함할 수 있다. 상기 상동 재조합 방법은 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 상기 미생물에 형질전환하고, 선별 마커 산물의 존재 하에서 배양하는 경우 상기 유전자의 일부 서열과 상기 미생물 내의 내재적 유전자와 상동 재조합을 일으킬 수 있다. 벡터는 서열번호 4의 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자 단편을 포함하는 pDZ-ㅿftsB 또는 서열번호 6의 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자 단편을 포함하는 pDZ-ftsB W140* 벡터일 수 있다. 상기 상동 재조합에 의하여 상기 미생물 내의 상기 내재적 유전자는 재조합되고, 재조합된 유전자 중에서 상기 마커를 포함하는 재조합체만이 선별 마커에 의하여 선별될 수 있다. 상기 상동 재조합 방법에 의하여, 내재적 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 얻을 수 있다.
상기 미생물에 있어서, 단백질 활성의 불활성화는 유전자의 염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합의 결실, 치환, 부가, 역전 또는 이들의 조합에 의하여 야기된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질 활성의 불활성화 방법은 예를 들면, 유전자 넉아웃 접근법, 안티센스 기술, 또는 RNAi 기술을 이용할 수 있다. 또한 각 유전자의 초기 카피를 결실시킬 수 있거나, 돌연변이체로 초기 카피를 치환시키거나, 약한 프로모터로부터 초기 카피를 발현시키는 방법을 포함할 수 있다. 또한 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터를 치환하거나, 무작위 또는 표적 돌연변이 유발법에 의해 돌연변이를 도입하거나, 상기 유전자를 파괴 또는 넉아웃시킬 수 있다. 또한, 불안정화 요소를 mRNA로 도입하거나, 또는 유전자 변형을 도입하여 RNA의 리보솜 결합 부위(RBS)를 변이시키는 방법을 포함할 수 있다.
유전자의 불활성화가 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자의 일부분과 선별 마커를 포함하는 벡터를 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환시키고, 항생제의 존재하에서 배양하여 선별함으로써 달성될 수 있다.
상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위하여 구현된 것일 수 있다. 상기 선별 마커는 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커일 수 있다.　
코리네형 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (C.glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (C.ammoniagenes), 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스 (C.pseudotuberculosis), 코리네박테리움 에피시엔스 (C.efficiens), 코리네박테리움 슈도제니탈리움 (C.pseudogenitalium), 코리네박테리움 제니탈리움 (C.genitalium), 코리네박테리움 아코렌스 (C.accolens), 코리네박테리움 아미콜라툼 (C. amycolatum), 코리네박테리움 마트루초티 (C.matruchotii), 코리네박테리움 카세이 (C.casei), 코리네박테리움 리보필로플라봄 (C.lipophiloflavum), 코리네박테리움 투버쿨로스테아리쿰 (C.tuberculostearicum), 코리네박테리움 제이케이움 (C.jeikeium), 코리네박테리움 파우로메타볼룸 (C. paurometabolum) 및 이들의 야생형으로부터 제조된 L-라이신 생산 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 수탁번호 KCCM11016P, KCCM10770P, KCCM11347P 또는 CJ3P일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 "코리네형 미생물"은 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속의 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 예를 들면, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물에서 격막 형성 개시 인자 단백질을 코딩하는 유전자를 불활성화 시키도록 돌연변이를 도입하여 L-라이신 생산능이 향상된 것일 수 있다. 상기 "L-라이신 생산능을 갖는"은 상기 미생물이 배지에서 배양되는 경우, 배지 내에 L-라이신을 생산하고 분비하는 능력을 갖는 것을 의미한다. 상기 미생물은 야생형 또는 모균주보다 대량으로 배양 배지에 L-라이신을 생산하고 축적시킬 수 있는 미생물일 수 있다.
일 구체예에 따른 격막 형성 개시 인자 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네형 미생물은 사상 온도 감수성 단백질 중 하나인 FtsB의 활성이 불활성되어, 상기 코리네형 미생물의 세포분열이 저해되는 반면 상대적으로 L-라이신 생산능이 향상될 수 있다.
다른 양상은 본 발명의 미생물을 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생산하는 단계; 및 배양물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양의 방법은 회분식, 연속식, 및 유가식 배양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양을 포함할 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 탄소원은 탄수화물, 지방, 지방산, 알코올, 유기산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원일 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방은 대두유, 해바라기유, 파자마유, 코코넛유, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방산은 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 알코올은 글리셀로 또는 에탄올일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산을 포함할 수 있다.
상기 질소원은 유기 질소원, 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유기 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 무기 질소원은 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 배지는 인, 금속염, 아미노산, 비타민, 전구체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 인의 공급원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 또는 이들에 상응하는 소듐-함유염을 포함할 수 있다. 상기 금속염은 황산마그네슘 또는 황산철일 수 있다.
상기 배지 또는 이를 이루는 개별 성분은 회분식, 연속식, 또는 유가식 배양으로 첨가될 수 있다.
상기 배양 방법에 있어서, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 상기 pH의 조정은 상기 배양물에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 또는 황산을 첨가하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 기포 생성 억제를 포함할 수 있다. 상기 기포 생성 억제는 소포제의 사용을 통하여 이루어질 수 있다. 상기 소포제는 지방산 폴리글리콜 에스테르를 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 배양물 내로 기체의 주입을 포함할 수 있다. 상기 기체는 배양물의 호기 상태를 유지하기 위한 어떤 기체도 포함할 수 있다. 상기 기체는 산소 또는 산소 함유 기체일 수 있다. 상기 산소 함유 기체는 공기를 포함한다. 상기 배양에 있어서, 배양물의 온도는 20 내지 45℃, 예를 들면, 22 내지 42℃, 또는 25 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 L-라이신의 생성량을 획득할 때까지 지속될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양은 배치 공정, 주입 배치 및 반복 주입 배치 공정과 같은 연속식 또는 회분식으로 이루어질 수 있다. 이러한 배양은 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 임의의 방법이 사용될 수 있다. L-아미노산은 음이온 교환 크로마토그래피 및 후속으로 닌히드린 유도체화에 의하여 분리되고 분석될 수 있다.
일 양상에 따른 격막 형성 개시 인자 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화된 미생물에 의하면, 상기 미생물의 L-라이신 생산 능력을 향상시킬 수 있다.
일 양상에 따른 L-라이신을 생산하는 방법에 의하면, L-라이신을 높은 생산성으로 생산할 수 있다.
이하 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 결손에 의한 ftsB 유전자 불활성화 재조합 벡터 제작
미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 ftsB 유전자의 뉴클레오티드의 서열을 확보하였다(서열번호 2). ftsB의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 소실된 유전자 단편을 만들기 위하여, 상기 서열번호 2를 바탕으로 각각 프라이머 0936F1, 09369R1, 0936F2, 및 0936R2를 제작하였고, 각각을 서열번호 7 내지 10으로 나타내었다.　
ftsB 유전자 결손에 의한 불활성화 재조합 벡터를 제작하기 위하여 pDZ 벡터(한국 등록특허 0924065호 참고)를 사용하였으며 이후, 상기에서 기술한 바와 같이 불활성화되도록 제작된, ftsB 유전자의 변형된 서열을 가지는 핵산 분자를 상기 pDZ 벡터의 멀티클로닝 사이트 부위에 삽입시켜, 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 벡터 pDZ-ΔftsB 벡터를 제조하였다. 상기 서열번호 4의 핵산 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 코딩한다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 하여 프라이머 0936F1-0936R1과 0936F2-0936R2을 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다.
그 결과, 74bp와 95bp 의 ftsB 유전자 부위를 포함한 유전자 두 쌍인, ftsB-A 및 ftsB-B를 얻었다. 증폭된 산물은 Infusion cloning kit (Invitrogen)을 사용하여 pDZ벡터에 접합하였고 pDZ-ΔftsB 벡터를 제작하였다. pDZ-ΔftsB는 135bp ftsB의 XbaI 양쪽 말단을 포함하는 것으로, ftsB의 내부적 유전자 408bp가 소실된 단편을 포함한다.
실시예 2: 종결코돈 변이 도입에 의한 ftsB 유전자 불활성화 재조합 벡터 제작
종결코돈 변이 도입에 의한 ftsB 유전자 불활성화 재조합 벡터를 제작하기 위하여 상기 pDZ 벡터를 사용하였으며, ftsB 유전자 개방해독틀에서 140번째의 아미노산인 트립토판 대응코돈을 종결코돈으로 치환시키기 위한 프라이머를 제작하였다. 0936 F1 과 0936 R3을 쌍으로 하는 프라이머와 0936 F3과 0936 R2을 쌍으로 하는 프라이머를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법의 PCR로 증폭하고 pDZ 벡터에 접합하여 벡터 pDZ-ftsB W140*를 제작하였다. 상기 0936F3 및 0936R3 프라이머의 서열은 서열번호 11 및 12으로 각각 나타내었다. 상기 제작 벡터에 접합된 fts 유전자의의 아미노산은 서열번호 5의 서열을 갖고, 핵산은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
실시예 3: ftsB 유전자 불활성화 변이주 제작
상기 실시예 1과 2에서 제작한 재조합 벡터를 각각 전기펄스법을 이용하여 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P (구 기탁번호 KFCC10881, 한국 등록특허 0159812호, 한국 등록특허 0397322호 참고)에 형질전환시켰다(Appl. Microbiol.Biotechnol.(1999) 52:541-545에 의한 형질전환법 이용). 카나마이신 (kanamycin) 25 mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 동 유전자와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체 배지에서 푸른색을 나타내는가 여부를 확인함으로써 가능하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕 배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 10-4으로부터 10-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체 배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 나타내는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차 (crossover)에 의해 ftsB 유전자가 불활성화된 균주를 각각 선별하였다.
결손에 의한 ftsB 유전자 불활성화 변이주를 선별하기 위하여 유전자 특이적 프라이머 쌍인 서열번호 7 및 서열번호 10의 0936F1-0936R2 를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하여 결손에 의한 ftsB 유전자 결손에 의한 불활성화 변이주 KCCM11016P-ΔftsB를 제작하였다. 종결코돈 변이 도입에 의한 ftsB 유전자 불활성화 변이주를 선별하기 위하여 서열번호 7 및 서열번호 10의 0936F1-0936R2 을 쌍으로 하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하여 종결코돈 변이 도입에 의한 ftsB 유전자 불활성화 변이주 KCCM11016P-ftsB W140*를 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 균주들에서의 효과도 확인하기 위하여 역시 상기와 같은 방법으로 KCCM10770P(한국 등록특허 0924065호 참고), KCCM11347P(한국 등록특허 1994-0001307 참고) 및 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)를 모균주로 하여 각각 ftsB 유전자가 결손된 균주와 종결코돈이 도입된 균주 KCCM10770P-ΔftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM11347P-ΔftsB, KCCM11347P-ftsB W140*, CJ3P-ΔftsB, CJ3P-ftsB W140* 를 제작하였다.
실시예 4: ftsB 유전자 불활성화 균주에서의 라이신 생산
실시예 3에서 제작된 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-ㅿftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM10770P-ㅿftsB, KCCM10770P-ftsB W140*, KCCM11347P-ㅿftsB, KCCM11347P-ftsB W140, CJ3P-ㅿftsB, 및 CJ3P-ftsB W140*를 L-라이신 생산을 위하여 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 종 배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 및 KCCM11016P-ㅿftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM10770P-ㅿftsB, KCCM10770P-ftsB W140*, KCCM11347P-ㅿftsB, KCCM11347P-ftsB W140*, CJ3P-ㅿftsB, 및 CJ3P-ftsB W140*를 각각 접종하고 30 ℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕배양하였다. 그 후 하기의 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 상기 배양된 1 ml의 종 배양액을 각각 접종하고 30℃에서 120 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
종배지 (pH 7.0)
원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모 추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
생산배지 (pH 7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 및 KCCM11016P-ㅿftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM10770P-ㅿftsB, KCCM10770P-ftsB W140*, KCCM11347P-ㅿftsB, KCCM11347P-ftsB W140, CJ3P-ㅿftsB, 및 CJ3P-ftsB W140*에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도는 표 3과 같다. 표 3의 결과는 반복실험한 평균치이다.
표 3
　 라이신 g/L OD 560 nm
배치 1 배치 2 배치 3 배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 43.3 44.6 43 54.7 57.5 55
KCCM11016P-ㅿftsB 44.9 45 46 53 53.4 52.5
KCCM11016P-ftsB W140* 44.5 45 46.1 51.9 52 52.6
KCCM10770P 46.9 47 47.3 50.5 51 52
KCCM10770P-ㅿftsB 48.9 48.5 48.4 48.6 49 48
KCCM10770P-ftsB W140* 48 48.2 48.9 48.1 48.5 49
KCCM11347P 38 37.7 38.5 79 80 81
KFCC10750-ㅿftsB 39.5 39 39.8 76 75 75
KCCM11347P-ftsB W140* 40 39.5 39.4 74 76 75
CJ3P 8.5 8 8 102 105 103
CJ3P-ㅿftsB 9.1 9.6 9 97 96.5 97.2
CJ3P-ftsB W140* 9.2 9 9.5 98 97.5 97.7
표 3에 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM11016P로부터 ftsB 유전자가 결손되거나 종결코돈이 도입된 경우 모두 라이신 생산이 동일하게 약 4%씩 증가하였다. 이러한 결과는 ftsB 유전자 자체의 구조적 변화에 의해서가 아니라, 격막 형성 개시 인자인 FtsB 단백질의 결손에 의해 라이신 농도가 증가했음을 의미한다. 나아가, 다른 종류의 모균주인 KCCM10770P, KCCM11347P 및 CJ3P에서도 FtsB 가 불화성화된 균주가 야생형 FtsB 활성을 가진 모균주 대비 평균 라이신 농도가 약 4% 증가하였다. 반면 균체량은 FtsB 불활성화된 균주들이 모균주대비 5% 감소함을 보였다. 상기의 결과는 라이신 생산균주의 세포분열을 억제해 균체량을 제어함으로써 라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 의미한다. KCCM11016P-ftsB W140* (CA01-2274) 를 2013년 9월 27일에 한국미생물 보존센터 (대한민국 서울 서대문구 홍제 1동 유림빌딩)에 기탁번호 KCCM11454P로 기탁하였다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM 11454P
수탁일자 : 20130927
Figure PCTKR2014011984-appb-I000001

Claims (4)

  1. 격막 형성 개시 인자 (septum formation initiator) 단백질이 불활성화된, L-라이신 생산능이 향상된 코리네형 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 격막 형성 개시 인자 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것인 미생물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 코리네형 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(C.glutamicum) 인 미생물.
  4. 청구항 1 항에 따른 미생물을 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생산하는 단계; 및
    배양물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법.
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