WO2015170907A1 - L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 - Google Patents

L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 Download PDF

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WO2015170907A1
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이베드로
문준옥
김형준
유송기
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씨제이제일제당(주)
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism with improved L-lysine production capacity and a method for producing L-lysine using the same.
  • L-lysine is used in animal feed, human medicine and cosmetics industries, and is produced by fermentation using strains of Corynebacterium or strains of Escherichia. Recently, various studies have been conducted to develop high efficiency production strain and fermentation process technology.
  • Bubbles generated during the cultivation of yeast occur through a series of processes as follows. First, mannose protein (mannoprotein) is mixed with the fine gas bubble generated during fermentation. At this time, the inside of the gas bubble occupies a hydrophobic portion, and the outside of the gas bubble occupies a hydrophilic portion. As a result, the viscosity of the culture medium is increased and bubbles are generated by mixing not only various proteins but also cells (Swart CW. Et al., FEMS Yeast Res. 2012, 12: 867-69).
  • mannose protein mannoprotein
  • the present inventors confirmed that the L-lysine production capacity is increased by effectively controlling the generation of bubbles in the genetic aspect by selecting genes affecting the generation of excess bubbles in Corynebacterium strains, and completed the present invention. It was.
  • An object of the present invention is to provide a microorganism of the genus Corynebacterium with improved L-lysine production capacity.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing L-lysine using the microorganism of the genus Corynebacterium.
  • one aspect of the present invention provides a microorganism of the genus Corynebacterium inactivated at least one secreted protein selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 7, and 13.
  • Another aspect of the present invention provides a method of producing L-lysine by culturing the microorganism of the genus Corynebacterium.
  • the microorganism according to the present invention is a strain in which the secreted protein involved in bubble generation is inactivated and L-lysine production ability is improved.
  • the use of this strain reduces the incidence of bubbles and can increase the amount of production that can be cultured without the addition of additional process equipment or the addition of an additional amount of antifoam.
  • the industrial convenience can be expected to produce effects such as production convenience and cost reduction, and can efficiently produce L-lysine.
  • the present invention provides a microorganism of the genus Corynebacterium in which at least one secreted protein selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 7, and 13 is inactivated.
  • Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (The microorganism is disclosed as KFCC10881) in order to screen the major secreted proteins that cause unnecessary bubbles in lysine production to improve L-lysine production fermentation process After being re-deposited by the International Depository under the Treaty of Budapest, which was given an accession number by KCCM11016P, and incubated with Korean Patent No. 10-0159812), only the bubbles generated during the fermentation process were separated to obtain peptides.
  • the peptides thus obtained were analyzed to select three proteins with the highest detectable amounts, and peptides encoded by the NCBI clearance numbers NCgl0336, NCgl0717 and NCgl2912 genes for Corynebacterium glutamicum ATCC13032 were selected.
  • the peptide encoded by the NCgl0336 gene is an esterase that is inherently present in a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • the peptide may include the amino acid of SEQ ID NO: 1, 80% or more relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, as long as it is a protein having esterase activity as the secretory protein proposed in the present invention.
  • amino acid sequences having at least 90%, more preferably at least 95% and particularly preferably at least 97% homology are included in the invention.
  • sequence having homology with the sequence and having an amino acid sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, even if some of the sequence has an amino acid sequence of deletion, modification, substitution or addition It is obvious that it is included in the category of.
  • the NCgl0336 gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, particularly preferably relative to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • Nucleotide sequences having at least 97% homology are also included in the present invention. Also included in the invention are variants of those sequences that encode the same amino acid sequence due to genetic code degeneracy.
  • polynucleotide encoding NCgl0336 of the present invention may be hybridized under stringent conditions with a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a probe derived from the nucleotide sequence, and a mutation encoding a normally functioning NCgl0336. It may be a brother.
  • the peptide encoded by the NCgl0717 gene is an esterase that is inherently present in the microorganism of the genus Corynebacterium.
  • the peptide may include the amino acid of SEQ ID NO: 7, 80% or more relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, as long as it is a protein having an esterase activity as a secretion protein proposed in the present invention
  • amino acid sequences having at least 90%, more preferably at least 95% and particularly preferably at least 97% homology are included in the invention.
  • sequence having homology with the sequence and having an amino acid sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, even if some of the sequence has an amino acid sequence of deletion, modification, substitution or addition It is obvious that it is included in the category of.
  • the NCgl0717 gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, particularly preferably relative to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8
  • Nucleotide sequences having at least 97% homology are also included in the present invention. Also included in the invention are variants of those sequences that encode the same amino acid sequence due to genetic code degeneracy.
  • polynucleotide encoding NCgl0717 of the present invention may be hybridized under stringent conditions with a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 or a probe derived from the nucleotide sequence, and a mutation encoding a normally functioning NCgl0717. It may be a brother.
  • the peptide encoded by the NCgl2912 gene is an esterase that is inherently present in the microorganism of the genus Corynebacterium.
  • the peptide may include the amino acid of SEQ ID NO: 13, 80% or more relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, as long as it is a protein having an esterase activity as the secretory protein of the present invention.
  • amino acid sequences having at least 90%, more preferably at least 95% and particularly preferably at least 97% homology are included in the invention.
  • sequence having homology with the sequence and having an amino acid sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, even if some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added It is obvious that it is included in the category of.
  • the NCgl2912 gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably, relative to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14
  • Nucleotide sequences having at least 97% homology are also included in the present invention. Also included in the invention are variants of those sequences that encode the same amino acid sequence due to genetic code degeneracy.
  • the polynucleotide encoding NCgl2912 of the present invention may be hybridized under stringent conditions with a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 or a probe derived from the nucleotide sequence, and may encode a normally functioning NCgl2912. It may be a brother.
  • homology means the degree of coincidence with a given amino acid sequence or base sequence and may be expressed as a percentage.
  • homologous sequences thereof having the same or similar activity as a given amino acid sequence or base sequence are designated as "% homology”.
  • Homology to the amino acid sequence is described, for example, in the algorithm BLAST by Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] or FASTA by Pearson (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Based on this algorithm BLAST, a program called BLASTN or BLASTX has been developed (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).
  • stringent conditions refers to conditions that enable specific hybridization between polynucleotides.
  • stringent conditions can be found in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York.
  • inactivation in the present invention may be made by any method of inactivation known in the art.
  • inactivation means that the expression of the endogenous gene is reduced to a low level or not expressed at all as compared with the wild strain, and even if the expression is not generated or a gene having no activity or reduced expression is generated, All or part of the nucleotide sequence of the gene, or all or part of its expression control sequence may be mutated by deletion, substitution, insertion, or a combination thereof.
  • microorganisms in which the activity of the endogenous gene is inactivated by transforming a microorganism of Corynebacterium with a recombinant vector comprising a gene fragment in which the open reading frame of the endogenous gene is internally lost, thereby deleting or mutating the endogenous gene.
  • a microorganism of Corynebacterium with a recombinant vector comprising a gene fragment in which the open reading frame of the endogenous gene is internally lost, thereby deleting or mutating the endogenous gene.
  • Insertion of the gene into the chromosome can be made by any method known in the art.
  • endogenous enzymes and activities means enzymes in their natural state and their activities that are inherently present in the microorganism or cell. That is, it means the enzyme and its activity before the enzyme and the activity is mutated.
  • the term "recombinant vector” refers to a DNA preparation containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding said target protein operably linked to a suitable regulatory sequence to enable expression of the target protein in a suitable host.
  • the regulatory sequence includes a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • Vectors used in the preparation of the recombinant vector may be natural or recombinant plasmid, cosmid, virus and bacteriophage.
  • pWE15, M13, ⁇ MBL3, ⁇ MBL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, Charon21A, etc. can be used as a phage vector or cosmid vector, and pDZ vectors, pBRs, and pUCs as plasmid vectors.
  • pBluescriptII system, pGEM system, pTZ system, pCL system and pET system can be used.
  • the vector which can be used is not specifically limited, A well-known expression vector can be used.
  • the term “transformation” means introducing a vector comprising a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the introduced polynucleotide can be located in the chromosome of the host cell or located outside the chromosome as long as it can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide also includes DNA and RNA encoding the target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced into and expressed in a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a polynucleotide construct containing all the elements necessary for self expression.
  • the expression cassette typically includes a promoter, transcription termination signal, ribosomal binding site, and translation termination signal operably linked to an open reading frame of the gene (abbreviated as "ORF").
  • ORF open reading frame of the gene
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of replicating itself.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked with a sequence required for expression in the host cell.
  • any microorganism capable of producing L-lysine may be used without limitation, and specifically, a microorganism of genus Corynebacterium or Brevibacterium may be used, and more specifically, corey Nebacterium glutamicum microorganisms can be used.
  • microorganism capable of producing L-lysine may be a microorganism obtained by manipulating a commonly known gene to produce L-lysine, for example, coryne involved in the production of L-amino acid.
  • AspB (gene encoding aspartate aminotransferase), lysC (gene encoding aspartate kinase), asd (gene encoding aspartate semialdehyde dehydrogenase), dapA (endogenous bacteria in bacteria of the bacterium)
  • a gene selected from the group consisting of dihydrodipicolinate synthase), dapB (gene encoding dihydrodipicolinate reductase) and lysA (gene encoding diaminodipimelate decarboxylase) N-methyl-N'- was obtained by inserting one or more of the above strains or into a strain that introduced L-leucine nutrient composition.
  • Trojan -N- may be a nitroso microorganisms obtained by treating guanidine (NTG).
  • Corynebacterium glutamicum KCCM11016P as the microorganism of the genus Corynebacterium (The microorganism was disclosed as KFCC10881, re-deposited by the International Depository under the Treaty of Budapest, and received the accession number as KCCM11016P, Korean Patent No. 10-0159812), Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Korean Patent No. 10-0924065), Corynebacterium glutamicum L-lysine producing strain KCCM11347P (The microorganism was disclosed as KFCC10750) Has been re-entrusted to the International Depository under the Budapest Treaty and has been granted KCCM11347P, Korean Patent No. 10-0073610) and the Corynebacterium glutamicum CJ3P strain (Binder et al., Genome Biology 2012, 13: R40). Although used, it is not limited thereto.
  • the microorganism transformed according to the present invention may be Corynebacterium glutamicum (KCCM11502P, KCCM11481P, KCCM11482P).
  • the present invention also provides a method for producing L-lysine using the transformed microorganism. More specifically, culturing the microorganism of the present invention to produce L- lysine in culture or cells; And it provides a method for producing L- lysine, comprising the step of recovering L- lysine from the culture.
  • the culture of the genus Corynebacterium may be used any culture conditions and culture methods known in the art.
  • a medium which can be used for culturing the microorganism of the genus Corynebacterium for example, a medium disclosed in Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) can be used.
  • Sugar sources that may be used in the medium include glucose and saccharose, lactose, fructose, maltose, starch, sugars and carbohydrates such as cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil and the like, palmitic acid, stearic acid Fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials can be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. Nitrogen sources can also be used individually or as a mixture.
  • Personnel that may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or salts containing the corresponding sodium.
  • the culture medium should contain metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • suitable precursors to the culture medium may be used. The above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously in a manner appropriate to the culture during the culturing process.
  • the pH of the culture can be adjusted by using a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or an acid compound such as phosphoric acid or sulfuric acid in an appropriate manner.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • inject oxygen or oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C. Incubation time may continue until the desired amount of L-amino acid is obtained, but is preferably 10 to 160 hours.
  • the culturing may be continuous or batchwise, such as batch processes, infusion batches and repeated infusion batch processes. Such cultures are well known in the art, and any method may be used.
  • the experiment was conducted by the following method for the purpose of selecting the secreted protein that causes the bubbles.
  • Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (the microorganism was published as KFCC10881, re-deposited by the International Depository under the Treaty of Budapest, and received the accession number as KCCM11016P, Korea Registered Patent No. 10-0159812) After incubation, only the bubbles produced during the fermentation process was separated and transferred to a 15 ml test tube and concentrated.
  • the analyzed peptides were identified as genes in the Corynebacterium microorganisms through a blast search provided by the National Biological Information Center (NCBI). Among the identified peptides, three species with the highest detection amount were selected and the genes of the corresponding proteins were finally selected, and the selected genes were NCBI license numbers NCgl0336, NCgl0717 and NCgl2912.
  • Corynebacterium glutamicum ATCC13032 genomic DNA as a template using SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 as primers [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories].
  • PCR conditions were denatured 95 °C, 30 seconds; Annealing 50 ° C., 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 30 times at 72 °C, 1 minute.
  • NCgl0336-A and NCgl0336-B containing the 342 bp and 315 bp NCgl0336 gene regions were obtained.
  • the DNA fragments amplified by PCR were conjugated to pDZ plasmid (Korean Patent No. 10-0924065) using an Infusion Cloning Kit (Invitrogen), transformed into E. coli DH5 ⁇ , and LB containing 25 mg / L kanamycin. It was plated on a solid medium.
  • the plasmid was obtained by using a commonly known plasmid extraction method, and this plasmid was named pDZ- ⁇ NCgl0336.
  • pDZ- ⁇ NCgl0336 lost the gene 503bp of NCgl0336.
  • SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 of NCgl0717 based on the nucleotide sequence reported to the National Institutes of Health (NIH Genbank) for the production of a recombinant plasmid capable of inactivating the NCgl0717 gene on the Corynebacterium chromosome A sequence of nucleotides was obtained, and primers of SEQ ID NOs: 9 to 12 were prepared based on SEQ ID NO: 8 to make gene fragments in which the open reading frame of NCgl0717 was lost internally.
  • NIH Genbank National Institutes of Health
  • PCR was performed using Corynebacterium glutamicum ATCC13032 genomic DNA as a template, using SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12 as primers. PCR conditions were denatured 95 °C, 30 seconds; Annealing 50 ° C., 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 30 times at 72 °C, 1 minute.
  • NCgl0717-A and NCgl0717-B which were two pairs of DNA fragments containing the NCgl0717 gene region of 493bp and 491bp, were obtained.
  • the DNA fragments amplified by PCR were conjugated to pDZ plasmid using an Infusion cloning kit (Invtirogen), transformed into E. coli DH5 ⁇ , and plated in LB solid medium containing 25 mg / L kanamycin. Colonies transformed with the plasmid into which the target gene was inserted by PCR were selected, and plasmids were obtained by using a commonly known plasmid extraction method, and the plasmid was named pDZ- ⁇ NCgl0717.
  • pDZ- ⁇ NCgl0717 lost 786bp of gene of NCgl0717.
  • NIH Genbank National Institutes of Health
  • PCR was performed using Corynebacterium glutamicum ATCC13032 genomic DNA as a template, using SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, and SEQ ID NO: 18 as primers. PCR conditions were denatured 95 °C, 30 seconds; Annealing 50 ° C., 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 30 times at 72 °C, 1 minute.
  • NCgl2912-A and NCgl2912-B containing 444bp and 636bp NCgl2912 gene sites were obtained.
  • the DNA fragments amplified by PCR were conjugated to pDZ plasmid using Infusion Cloning Kit (Invitrogen), transformed into E. coli DH5 ⁇ , and plated in LB solid medium containing 25 mg / L kanamycin. After the colonies transformed with the plasmid into which the target gene was inserted by PCR, plasmids were obtained by using a commonly known plasmid extraction method, and this plasmid was named pDZ- ⁇ NCgl2912. pDZ- ⁇ NCgl2912 lost 128bp of gene of NCgl2912.
  • Example 5 Production and evaluation of lysine producing strain KCCM11016P-derived secreted protein gene inactivated strain
  • Three recombinant plasmids (pDZ- ⁇ NCgl0336, pDZ- ⁇ NCgl0717 and pDZ- ⁇ NCgl2912) prepared in Examples 2, 3, and 4 were transformed into Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, respectively, using an electropulse method.
  • Strains in which the target gene was inactivated on the chromosome by homologous recombination were prepared by PCR method, and named KCCM11016P- ⁇ NCgl0336, KCCM11016P- ⁇ NCgl0717, and KCCM11016P- ⁇ NCgl2912, respectively.
  • the three strains and the control were inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the following seed medium and shake-cultured at 200 rpm for 20 hours at 30 ° C. Thereafter, 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the following production medium, followed by shaking culture at 200 rpm for 96 hours at 37 ° C.
  • the composition of the seed medium and the production medium is as follows.
  • Glucose 20 g (NH 4 ) 2 SO 4 10 g, peptone 10 g, yeast extract 5 g, urea 1.5 g, KH 2 PO 4 4 g, K 2 HPO 4 8 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, 100 ⁇ g biotin, 1000 ⁇ g thiamine HCl, 2000 ⁇ g calcium-pantothenic acid, 2000 ⁇ g nicotinamide (based on 1 liter of distilled water)
  • lysine production was increased by about 6% in the strains in which NCgl0336, NCgl0717 and NCgl2912 genes were inactivated from the parent strain KCCM11016P.
  • bubble generation was shown to be reduced by about 6-15% in the strains inactivated NCgl0336, NCgl0717 and NCgl2912 gene relative to the parent strain, respectively.
  • lysine production was increased by about 4% in the strains in which NCgl0336, NCgl0717, NCgl2085, and NCgl2912 genes were inactivated from the parent strain KCCM10770P, respectively.
  • bubble generation was reduced by about 4-18% in the strains inactivated genes NCgl0336, NCgl0717, NCgl2085, NCgl2912, respectively.
  • Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Korean Patent No. 10-0924065) also can effectively control the bubbles generated during the culture by inactivating the major secretion proteins unnecessary for lysine production similarly to Example 6 It was confirmed that this can improve the production capacity of L-lysine.
  • Example 7 Preparation and evaluation of secretory protein inactivating strains derived from L-lysine producing strain KCCM11347P
  • Corynebacterium glutamicum L-lysine producing strain KCCM11347P produced by artificial mutant method The microorganism was released as KFCC10750 and re-deposited by the International Depository under the Treaty of Budapest, and was granted KCCM11347P.) -0073610) in order to confirm the effect of inactivation of secretion proteins were prepared in the same manner as the three secreted proteins secreted in the same manner as in Examples 5, 6 KCCM11347P- ⁇ NCgl0336, KCCM11347P- ⁇ NCgl0717, KCCM11347P- ⁇ NCgl2912 It was named as, L- lysine production capacity was compared with the bubble generation amount.
  • lysine production was increased by about 5% in the strains in which NCgl0336, NCgl0717 and NCgl2912 genes were inactivated from the parent strain KCCM11347P.
  • bubble generation was shown to be reduced by about 4-15% in the strains inactivated NCgl0336, NCgl0717 and NCgl2912 genes relative to the parent strain, respectively.
  • Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (Republic of Korea Patent No. 94-0001307) also can effectively control the bubbles generated during the culture by inactivating the major secreted proteins unnecessary for lysine production similarly to Examples 5 and 6. It was confirmed that through this, it is possible to improve the production capacity of L-lysine.
  • Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012), which has L-lysine production capacity by introducing three mutations (pyc (P458S), hom (V59A), lysC (T311I)) in wild strains , 13: R40) in the same manner as in Examples 5, 6, and 7 in the same manner as in Examples 5, 6, and 7 in order to determine the effect of inactivation of the secreted proteins three kinds of secreted proteins
  • the preparation was named CJ3P- ⁇ NCgl0336, CJ3P- ⁇ NCgl0717, CJ3P- ⁇ NCgl2912, and L-lysine production capacity was compared with the bubble generation amount.
  • lysine production was increased by about 8% in strains in which NCgl0336, NCgl0717, and NCgl2912 genes were inactivated from the parent strain CJ3P.
  • bubble generation was reduced by about 5 ⁇ 17% in the strains inactivated NCgl0336, NCgl0717, NCgl2912 genes compared to the parent strain.
  • lysine production was increased by about 5% in the strains in which NCgl0336 / NCgl0717, NCgl0336 / NCgl2912, NCgl0717 / NCgl2912 genes were simultaneously inactivated from the parent strain KCCM11016P.
  • bubble generation was reduced by about 10-14% in the strains in which NCgl0336 / NCgl0717, NCgl0336 / NCgl2912, and NCgl0717 / NCgl2912 genes were inactivated at the same time.
  • Example 5 In order to compare the lysine production capacity of the strain incubated in the same manner as in Example 5, 6, 7, 8, 9 with the control, and after the incubation of the bubble generation amount is Example 5, 6, 7, 8, 9 Measured in the same manner as in, L-lysine concentration analyzed using HPLC is shown in Table 6 below. The results in Table 6 are the results of three repeated experiments, and the productivity was evaluated as an average value.
  • lysine production was increased by about 7% in the strains in which NCgl0336, NCgl0717 and NCgl2912 genes were inactivated from the parent strain KCCM11016P.
  • the strain was reduced by about 17%.
  • the strain , KCCM11016P- ⁇ NCgl0336, KCCM11016P- ⁇ NCgl0717, and KCCM11016P- ⁇ NCgl2912 are named CA01-2281, CA01-2279, and CA01-2280, respectively, and CA01-2279 and CA01-2280 are dated November 22, 2013, CA01-2281 was deposited internationally with the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM) on December 13, 2013 and was assigned accession numbers to KCCM11481P (CA01-2279), KCCM11482P (CA01-2280), and KCCM11502P (CA01-2281), respectively.

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Abstract

분비단백질을 불활성화하여 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법을 제공한다.

Description

L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법
본 발명은 L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법에 관한 것이다.
L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며, 코리네박테리움 속 균주나 에세케리키아 속 균주를 이용한 발효에 의해 생산되고 있다. 근래 고효율 생산균주 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다.
맥주와 와인 생산에 사용되는 효모에서 발효과정 동안의 기포 발생을 조절하기 위한 많은 연구가 진행되어 오던 중 최근 연구에서 기포 발생에 영향을 미치는 유전자들(AWA1, FPG1, CFG1)이 밝혀졌다(Shimoi H. et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68:2018-25; Blasco L. et al., Yeast. 2011, 28:437-51; Blasco L. et al., J. Agric. Food Chem. 2012, 60:10796-07). 여기에서, 이들 유전자가 불활성화된 균주에서는 기포의 발생이 모균주 대비 현저하게 감소된 반면, 이들 유전자가 과발현된 균주에서는 기포의 발생이 증가함이 규명되었다.
효모의 배양시 발생되는 기포는 다음과 같은 일련의 과정에 통해 일어난다. 먼저 발효 중에 발생되는 미세 가스버블에 만노오스단백질(mannoprotein)이 섞이게 된다. 이때, 가스버블 내부는 소수성 부위가, 가스버블 외부는 친수성 부위가 차지한다. 이러한 결과로 인해 배양액의 점성이 증가되어 다양한 단백질들뿐만 아니라 세포들까지 섞이게 되면서 기포가 발생하게 된다(Swart CW. et al., FEMS Yeast Res. 2012, 12:867-69).
효모를 이용한 맥주 생산에서는 적절한 수준의 기포의 발생이 요구되고 있지만, 아미노산 등 유용 산물의 대량생산에 사용되는 미생물의 발효에서는 기포 발생의 억제가 필요하다. 배양 중 과량의 기포가 발생할 경우 배양액의 점성이 증가되어 배양액 내 산소가스의 전달 효율(Oxygen Transfer Rate, OTR)이 감소하게 되며, 심한 경우에는 균체의 용해(lysis)를 유발하기도 한다. 또한, 기포 발생 억제를 위한 과량의 소포제 사용은 산업적 측면에서 제조원가를 상승시키는 부담요인으로 작용할 수 있고, 균체의 생장을 저해하는 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
이에, 본 발명자들은 코리네박테리움 속 균주를 대상으로 과량의 기포 발생에 영향을 미치는 유전자들을 선별함으로써 유전적 측면에서 기포 발생을 효과적으로 제어함으로써 L-라이신 생산능이 증가함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 양태는 서열번호 1, 7, 및 13의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 분비단백질이 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 미생물은 기포 발생에 관여하는 분비단백질이 불활성화되어 L-라이신 생산능이 향상된 균주이다. 이 균주를 이용하면 기포 발생이 감소함으로써 공정 설비의 증설 또는, 추가적인 다량의 소포제 투입 없이 배양할 수 있는 생산량이 증가할 수 있다. 또한, 산업적인 측면에서 생산 편의성 및 제조원가 절감 등의 효과를 기대할 수 있으며, L-라이신을 효율적으로 생산할 수 있다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명에서는 서열번호 1, 7, 및 13의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 분비단백질이 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
L-라이신을 생산하기 위한 대량배양 중 과량의 기포가 발생할 경우, 배양액의 점성이 증가되어 배양액 내 산소가스의 전달 효율(Oxygen Transfer Rate, OTR)이 감소하게 되며, 심한 경우에는 균체의 용해(lysis)를 유발하기도 한다. 즉, 기포 발생을 제어한다는 측면에서 기포 발생의 원인이 되는 분비단백질을 불활성화시키는 것은 라이신의 생산에 유리하게 작용될 것으로 생각되었다.
따라서, 본 발명의 일 구현에서는, L-라이신 생산 발효공정을 개선하고자 라이신 생산에 불필요한 기포 발생의 원인이 되는 주요 분비단백질들을 선별하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P(상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11016P로 기탁번호를 부여받음, 한국 등록특허 제10-0159812호)을 배양한 후, 발효과정 중 생성된 기포만을 분리하여 펩타이드들을 확보하였다. 이렇게 확보된 펩타이드들을 분석하여 상대적으로 검출량이 가장 많은 단백질 3종을 선택하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 대한 NCBI 허가번호 NCgl0336, NCgl0717 및 NCgl2912 유전자로 암호화되는 펩타이드들을 선발하였다.
본 발명에 있어서, 상기 NCgl0336 유전자로 암호화되는 펩타이드는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 에스터라아제이다. 구체적으로는, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산을 포함할 수 있으며, 본 발명에서 제시한 분비단백질로서 에스터라아제 활성을 가지는 단백질인 한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열 또한 본 발명에 포함된다. 또한, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다. 상기 서열과 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 NCgl0336 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 상기 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열 또한 본 발명에 포함된다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상기 서열들의 변이체 또한 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명의 NCgl0336을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 프로브(probe)와 엄격한 조건(stringent conditions)에서 혼성화될 수 있고, 정상적으로 기능하는 NCgl0336을 코딩하는 변이형일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 NCgl0717 유전자로 암호화되는 펩타이드는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 에스터라아제이다. 구체적으로는, 상기 펩타이드는 서열번호 7의 아미노산을 포함할 수 있으며, 본 발명에서 제시한 분비단백질로서 에스터라아제 활성을 가지는 단백질인 한, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열 또한 본 발명에 포함된다. 또한, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다. 상기 서열과 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 7의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 NCgl0717 유전자는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 상기 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열 또한 본 발명에 포함된다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상기 서열들의 변이체 또한 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명의 NCgl0717을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 프로브(probe)와 엄격한 조건(stringent conditions)에서 혼성화될 수 있고, 정상적으로 기능하는 NCgl0717을 코딩하는 변이형일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 NCgl2912 유전자로 암호화되는 펩타이드는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 에스터라아제이다. 구체적으로는, 상기 펩타이드는 서열번호 13의 아미노산을 포함할 수 있으며, 본 발명에서 제시한 분비단백질로서 에스터라아제 활성을 가지는 단백질인 한, 상기 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열 또한 본 발명에 포함된다. 또한, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다. 상기 서열과 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 13의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 NCgl2912 유전자는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 상기 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열 또한 본 발명에 포함된다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상기 서열들의 변이체 또한 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명의 NCgl2912를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 프로브(probe)와 엄격한 조건(stringent conditions)에서 혼성화될 수 있고, 정상적으로 기능하는 NCgl2912를 코딩하는 변이형일 수 있다.
본 발명에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 상기 아미노산 서열에 대한 상동성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]이나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov].
본 발명에서 용어 "엄격한 조건"은 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 엄격한 조건은 문헌(J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 발명에서 용어 "불활성화"는 당업계에 알려진 임의의 불활성화 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 불활성화란 상기 내재적 유전자의 발현이 야생 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소되거나 전혀 발현이 되지 않는 유전자 및 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소되어 있는 유전자가 생성되는 것을 의미하는 것으로써, 유전자의 염기서열 전체, 일부, 또는 그의 발현 조절 서열의 전체 또는 일부를 결실, 치환, 삽입에 의해 변이시키거나, 또는 이의 조합에 의한 것일 수 있다.
구체적인 예로는 상기 내재적 유전자의 오픈 리딩 프레임이 내부적으로 소실된 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터로 코리네박테리움 속 미생물을 형질전환하여 내재적 유전자를 결손 또는 돌연변이시킴으로써 상기 내재적 유전자의 활성이 불활성화된 미생물을 제조할 수 있다. 상기 유전자의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "내재적" 효소 및 활성은 미생물 또는 세포에 본래 존재하는 천연 상태의 효소 및 그의 활성을 의미한다. 즉, 당해 효소 및 활성이 변이되기 전의 효소 및 그의 활성을 의미하는 것이다.
본 발명에서, 용어 "재조합 벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다.
상기 재조합 벡터의 제작에 사용된 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며, 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현카세트는 통상 상기 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, 이하 "ORF"라 약칭함)에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
상기 재조합 벡터를 도입하는 모균주로는 L-라이신을 생산할 수 있는 미생물이라면 제한없이 사용할 수 있으나, 구체적으로는 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 속 미생물을 사용할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "L-라이신을 생산할 수 있는 미생물"은 L-라이신을 생산할 수 있도록 통상적으로 공지된 유전자를 조작하여 얻어진 미생물일 수 있으며, 예를 들어, L-아미노산의 생산에 관여하는 코리네박테리움 속 미생물에 내재하는 aspB (아스파테이트 아미노트란스퍼라제를 암호화하는 유전자), lysC (아스파테이트 키나제를 암호화하는 유전자), asd (아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화하는 유전자), dapA (디히드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 유전자), dapB (디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 암호화하는 유전자) 및 lysA (디아미노디피멜레이트 디카르복실라제를 암호화하는 유전자)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 중 하나 또는 그 이상을 삽입하여 얻어지거나, L-루이신 영양요구성을 도입한 변이균주에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)를 처리하여 얻어지는 미생물일 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명에서는 코리네박테리움 속 미생물로서 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P(상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11016P로 기탁번호를 부여받음, 한국 등록특허 제10-0159812호), 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(한국 등록특허 제10-0924065호), 코리네박테리움 글루타미쿰 L-라이신 생산균주 KCCM11347P(상기 미생물은 KFCC10750으로 공개되었다가 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11347P를 부여받았음. 한국 등록특허 제10-0073610호) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P 균주(Binder et al., Genome Biology 2012, 13:R40)를 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현에서, 본 발명에 따라 형질전환된 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (KCCM11502P, KCCM11481P, KCCM11482P)일 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명에서는 또한 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명의 미생물을 배양하여 배양물 또는 세포 중에 L-라이신을 생산하는 단계; 및 상기 배양물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하여 이루어진, L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물의 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다.
코리네박테리움 속 미생물의 배양을 위하여 사용될 수 있는 배지로는 예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)에 개시된 배지가 사용될 수 있다.
배지 중에서 사용될 수 있는 당원으로는 포도당, 사카로즈, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨을 함유하는 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
상기 미생물의 배양 중 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다. 배양 시간은 원하는 L-아미노산의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으나, 바람직하게는, 10 내지 160 시간이다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양은 배치 공정, 주입 배치 및 반복 주입 배치 공정과 같은 연속식 또는 회분식으로 이루어질 수 있다. 이러한 배양은 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 임의의 방법이 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 배양 중 기포 발생에 관련된 분비단백질 선별
본 실시예에서는 기포 발생 원인이 되는 분비 단백질을 선별하기 위한 목적으로 아래의 방법으로 실험을 진행하였다.
먼저 코리네박테리움 글루타미쿰KCCM11016P(상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11016P로 기탁번호를 부여받음, 한국 등록특허 제10-0159812호)균주를 1L 발효조를 이용하여 배양한 다음, 발효과정에서 생성된 기포만을 분리하여 15 ml 시험관에 옮겨 농축하였다.
기포 농축시료 중에 포함된 단백질들의 동정을 위해 계면활성제가 포함된 적당량의 염색제(loading dye)를 시료에 혼합한 후, 8% 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드겔을 이용하여 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)을 진행하고, 전기영동이 완료된 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드겔은 쿠마시 블루 염색법(coomassie blue staining)을 통해 염색하였다. 그 다음 염색된 단백질 밴드(band) 부위들을 절개하고 트립신을 처리하여 펩타이드들을 확보하였으며, LC-MS/MS 방법으로 확보된 펩타이드들의 아미노산 서열을 분석하였다.
분석된 펩타이드들을 미국국립생물정보센터(NCBI)에서 제공하는 블라스트 검색을 통해 코리네박테리움 속 미생물에 있는 유전자들로서 동정하였다. 동정된 펩타이드들 중에서 상대적으로 검출량이 가장 많은 3종을 선택하여 해당 단백질들의 유전자를 최종 선발하였으며, 선발된 유전자들은 NCBI 허가번호 NCgl0336, NCgl0717 및 NCgl2912 이다.
실시예 2: 분비단백질 NCgl0336 유전자 불활성화를 위한 재조합 플라스미드 제작
코리네박테리움 염색체 상에서 NCgl0336 유전자를 불활성화시킬 수 있는 재조합 플라스미드의 제작을 위해 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 NCgl0336의 서열번호 1의 아미노산 및 서열번호 2의 뉴클레오티드의 서열을 확보하였다. NCgl0336의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 내부적으로 소실된 유전자 단편을 만들기 위해, 상기 서열번호 2를 바탕으로 각각 서열번호 3 내지 6의 프라이머를 제작하였다.
서열번호 3: 5'-atcctctagagtcgacGAAGCCTCTGCACCTCGCTG-3'
서열번호 4: 5'-TATAGTTCGGTTCCGCGTCTCCAACGCATCCGGCC-3'
서열번호 5: 5'-CGGAACCGAACTATACCACCGAGGGACGCATTCTC-3'
서열번호 6: 5'-atgcctgcaggtcgacGCTCAAACGCACGAGCGAAG-3'
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6을 프라이머로 이용하여 PCR[Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 30회 반복하였다.
그 결과, 342bp와 315bp 의 NCgl0336 유전자 부위가 포함된 두 쌍의 DNA 단편인, NCgl0336-A 및 NCgl0336-B를 얻었다. PCR로 증폭된 상기 DNA 단편은 Infusion 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 pDZ플라스미드(대한민국 등록특허 제10-0924065호)에 접합한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 플라스미드로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-ΔNCgl0336이라 명명하였다. pDZ-ΔNCgl0336는 NCgl0336의 유전자 503bp가 소실되었다.
실시예 3: 분비단백질 NCgl0717 유전자 불활성화를 위한 재조합 플라스미드 제작
코리네박테리움 염색체 상에서 NCgl0717 유전자를 불활성화시킬 수 있는 재조합 플라스미드의 제작을 위해 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 NCgl0717의 서열번호 7의 아미노산 및 서열번호 8의 뉴클레오티드의 서열을 확보하였고, NCgl0717의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 내부적으로 소실된 유전자 단편을 만들기 위해, 상기 서열번호 8을 바탕으로 각각 서열번호 9 내지 12의 프라이머를 제작하였다.
서열번호 9: 5'-CCGGGGATCCTCTAGAGTTCGCGGATAAATGGG-3'
서열번호 10: 5'-CACGTGAAATTCAGGTCGCGTGGTTCACCTCCGAAG-3'
서열번호 11: 5'-CTTCGGAGGTGAACCACGCGACCTGAATTTCACGTG-3'
서열번호 12: 5'-GCAGGTCGACTCTAGAGGTCCCATGATTGTTCTG-3'
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 9 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 30회 반복하였다.
그 결과, 493bp와 491bp 의 NCgl0717 유전자 부위가 포함된 두 쌍의 DNA 단편인, NCgl0717-A 및 NCgl0717-B를 얻었다. PCR로 증폭된 상기 DNA 단편은 Infusion 클로닝 키트(Invtirogen)를 사용하여 pDZ플라스미드에 접합한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 플라스미드로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZ-ΔNCgl0717이라 명명하였다. pDZ-ΔNCgl0717은 NCgl0717의 유전자 786bp가 소실되었다.
실시예 4 : 분비단백질NCgl2912 유전자 불활성화를 위한 재조합 플라스미드 제작
코리네박테리움 염색체 상에서 NCgl2912 유전자를 불활성화시킬 수 있는 재조합 플라스미드의 제작을 위해 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 NCgl2912의 서열번호 13의 아미노산 및 서열번호 14의 뉴클레오티드의 서열을 확보하였고, NCgl2912의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 내부적으로 소실된 유전자 단편을 만들기 위해, 상기 서열번호 14를 바탕으로 각각 서열번호 15 내지 18의 프라이머를 제작하였다.
서열번호 15: 5'-CCGGGGATCCTCTAGAGCTGCAAGAAGTGCGAC-3'
서열번호 16: 5'-CTCGTAGTCGCTAGCACCTATTACGGGAGGTC-3'
서열번호 17: 5'-GACCTCCCGTAATAGGTGCTAGCGACTACGAG-3'
서열번호 18: 5'-GCAGGTCGACTCTAGACCCGAGCTATCTAACAC-3'
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 30회 반복하였다.
그 결과, 444bp와 636bp 의 NCgl2912 유전자 부위가 포함된 두 쌍의 DNA 단편인, NCgl2912-A 및 NCgl2912-B를 얻었다. PCR로 증폭된 상기 DNA 단편은 Infusion 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 pDZ플라스미드에 접합한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 플라스미드로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-ΔNCgl2912라 명명하였다. pDZ-ΔNCgl2912는 NCgl2912의 유전자 128bp가 소실되었다.
실시예 5: 라이신 생산균주 KCCM11016P유래 분비단백질 유전자 불활성화 균주 제작 및 평가
상기 실시예 2, 3 및 4에서 제작한 3 종의 재조합 플라스미드(pDZ-ΔNCgl0336, pDZ-ΔNCgl0717 및 pDZ-ΔNCgl2912)들을 전기펄스법을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 각각 형질전환시키고, 상동 재조합에 의해 염색체상에서 목적 유전자가 불활성화된 균주들을 PCR 방법으로 제조하였고, 각각 KCCM11016P-ΔNCgl0336, KCCM11016P-ΔNCgl0717, KCCM11016P-ΔNCgl2912 라 명명하였다.
상기 3 종의 균주들과 대조군을 하기의 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후, 1 ㎖의 종배양액을 하기의 생산배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 37℃에서 96시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, (NH4)2SO4 10 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍(증류수 1리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (cornsteep solid) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
배양을 종료한 후 배양액을 메스실린더에 옮겨 생성된 기포의 높이를 측정하였고, HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1의 결과는 3회 반복 실험 결과값이며, 평균치로 생산능을 평가하였다.
표 1
　 라이신 g/L 거품 cm/L
배치 1 배치 2 배치 3 배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 43.5 43.1 43.4 4.5 5.0 4.7
KCCM11016P-ΔNCgl0336 46.1 45.8 45.7 4.1 4.6 4.3
KCCM11016P-ΔNCgl0717 45.9 46.4 46.1 3.9 4.4 4.0
KCCM11016P-ΔNCgl2912 45.8 46.0 45.8 4.2 4.7 4.4
표 1에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM11016P로부터 NCgl0336, NCgl0717 및 NCgl2912 유전자가 불활성화된 균주에서 라이신 생산능이 약 6% 증가하였다. 이와 더불어 기포 발생은 모균주 대비 NCgl0336, NCgl0717 및 NCgl2912 유전자가 각각 불활성화된 균주들에서 약 6 ~ 15% 가량 감소됨을 보였다.
따라서, 코리네박테리움 속 미생물에서 라이신 생산에 불필요한 주요 분비단백질들을 불활성화시킴으로써 배양 중 발생되는 기포를 효과적으로 제어할 수 있으며, 이를 통해 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 6: L-라이신 생산균주 KCCM10770P 유래 분비단백질 불활성화 균주들의 제작 및 평가
라이신 생합성경로가 강화된 L-라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(한국 등록특허 제10-0924065호)에서 분비단백질의 불활성화 효과가 상기 실시예 5의 실험결과와 유사한지 비교하기 위하여 3 종의 분비단백질들이 불활성화된 균주들을 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 제조하여 KCCM10770P-ΔNCgl0336, KCCM10770P-ΔNCgl0717, KCCM10770P-ΔNCgl2912라 명명하였고, L-라이신 생산능과 함께 기포 발생량을 비교하였다.
상기 균주들의 라이신 생산능을 비교하기 위하여 각 대조군과 함께 실시예 6과 동일한 방법으로 배양하고, 배양을 종료한 후 기포 발생량은 실시예 6과 동일한 방법으로 측정하였으며, HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도는 하기 표 2에 나타내었다. 표 2의 결과는 3회 반복 실험결과값이며, 평균치로 생산능을 평가하였다.
표 2
　 라이신 g/L 거품 cm/L
배치 1 배치 2 배치 3 배치 1 배치 2 배치 3
KCCM10770P 46.1 46 46.3 5.1 5.6 5.2
KCCM10770P-ΔNCgl0336 47.9 48.2 47.7 4.6 4.9 4.5
KCCM10770P-ΔNCgl0717 48.3 47.7 48.1 4.6 4.6 4.3
KCCM10770P-ΔNCgl2912 47.9 48.5 48.2 4.9 5.4 5.0
표 2에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM10770P로부터 NCgl0336, NCgl0717, NCgl2085, NCgl2912 유전자가 각각 불활성화된 균주에서 라이신 생산능이 약 4% 증가하였다. 이와 더불어 기포 발생은 모균주 대비 NCgl0336, NCgl0717, NCgl2085, NCgl2912 유전자가 각각 불활성화된 균주들에서 약 4 ~ 18% 가량 감소됨을 보였다.
따라서, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(대한민국 등록특허 제10-0924065호)에서도 상기 실시예 6과 유사하게 라이신 생산에 불필요한 주요 분비단백질들을 불활성화시킴으로써 배양 중 발생되는 기포를 효과적으로 제어할 수 있고, 이를 통해 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 7: L-라이신 생산균주 KCCM11347P 유래 분비단백질 불활성화 균주들의 제작 및 평가
인공변이법에 의하여 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 L-라이신 생산균주 KCCM11347P(상기 미생물은 KFCC10750으로 공개되었다가 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11347P를 부여받았음. 한국 등록특허 제10-0073610호)에서도 분비단백질의 불활성화의 효과를 확인하기 위하여 3 종의 분비단백질들이 불활성화된 균주들을 상기 실시예 5, 6과 동일한 방법으로 제조하여 KCCM11347P-ΔNCgl0336, KCCM11347P-ΔNCgl0717, KCCM11347P-ΔNCgl2912라 명명하였고, L-라이신 생산능과 함께 기포 발생량을 비교하였다.
상기 균주들의 라이신 생산능을 비교하기 위하여 각 대조군과 함께 실시예 5, 6과 동일한 방법으로 배양하고, 배양을 종료한 후 기포 발생량은 실시예 5, 6과 동일한 방법으로 측정하였으며, HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도는 하기 표 3에 나타내었다. 표 3의 결과는 3회 반복 실험결과값이며, 평균치로 생산능을 평가하였다.
표 3
　 라이신 g/L 거품 cm/L
배치 1 배치 2 배치 3 배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11347P 38.6 38.2 38.3 5.4 6.0 5.7
KCCM11347P-ΔNCgl0336 40.1 40.2 40.1 5.1 5.1 5.3
KCCM11347P-ΔNCgl0717 40.1 39.7 40.5 4.7 5.1 5.0
KCCM11347P-ΔNCgl2912 39.8 40.3 40.3 5.1 5.6 5.4
표 3에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM11347P로부터 NCgl0336, NCgl0717 및 NCgl2912 유전자가 불활성화된 균주에서 라이신 생산능이 약 5% 증가하였다. 이와 더불어 기포 발생은 모균주 대비 NCgl0336, NCgl0717 및 NCgl2912 유전자가 각각 불활성화된 균주들에서 약 4 ~ 15% 가량 감소됨을 보였다.
따라서, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P(대한민국 등록특허 제94-0001307호)에서도 상기 실시예 5, 6과 유사하게 라이신 생산에 불필요한 주요 분비 단백질들을 불활성화시킴으로써 배양 중 발생되는 기포를 효과적으로 제어할 수 있고, 이를 통해 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 8: L-라이신 생산균주 CJ3P 유래 분비단백질 불활성화 균주들의 제작 및 평가
야생주에 3종의 변이[pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I)]를 도입하여 L-라이신 생산능을 갖게된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)에서도 상기 실시예 5, 6, 7과 마찬가지로 분비단백질의 불활성화의 효과를 알아보기 위하여 3 종의 분비단백질들이 불활성화된 균주들을 상기 실시예 5, 6, 7과 동일한 방법으로 제조하여 CJ3P-ΔNCgl0336, CJ3P-ΔNCgl0717, CJ3P-ΔNCgl2912라 명명하였고, L-라이신 생산능과 함께 기포 발생량을 비교하였다.
상기 균주들의 라이신 생산능을 비교하기 위하여 각 대조군과 함께 실시예 5, 6, 7과 동일한 방법으로 배양하고, 배양을 종료한 후 기포 발생량은 실시예 5, 6, 7과 동일한 방법으로 측정하였으며, HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도는 하기 표 4에 나타내었다. 표 4의 결과는 3회 반복 실험결과값이며, 평균치로 생산능을 평가하였다.
표 4
　 라이신 g/L 거품 cm/L
배치 1 배치 2 배치 3 배치 1 배치 2 배치 3
CJ3P 7.9 8 8.1 8.7 9.1 8.6
CJ3P-ΔNCgl0336 8.5 8.6 8.8 7.8 8.3 7.9
CJ3P-ΔNCgl0717 8.4 8.5 8.7 7.7 7.5 7.2
CJ3P-ΔNCgl2912 8.7 8.6 8.6 8.4 8.6 8.2
표 4에서 나타낸 바와 같이, 모균주 CJ3P로부터 NCgl0336, NCgl0717, NCgl2912 유전자가 불활성화된 균주에서 라이신 생산능이 약 8% 증가하였다. 이와 더불어 기포 발생은 모균주 대비 NCgl0336, NCgl0717, NCgl2912 유전자가 각각 불활성화된 균주들에서 약 5 ~ 17% 가량 감소됨을 보였다.
따라서, 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P에서도 상기 실시예 5, 6, 7의 실험 결과와 유사하게 라이신 생산에 불필요한 주요 분비 단백질들을 불활성화시킴으로써 배양 중 발생되는 기포를 효과적으로 제어할 수 있고, 이를 통해 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 9: L-라이신 생산균주 KCCM11016P 유래 분비단백질 동시 불활성화 균주들의 제작 및 평가
L-라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에서 분비단백질들의 동시 불활성화에 따른 효과를 확인하기 위하여, 분비단백질 유전자들이 동시에 불활성화된 3종의 균주들을 상기 실시예 5, 6, 7, 8과 동일한 방법으로 제조하여, 각 유전자를 조합하여 불활성화시킨 균주를KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717, KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl2912, KCCM11016P-ΔNCgl0717/ΔNCgl2912라 명명하였고, L-라이신 생산능과 함께 기포 발생량을 비교하였다.
상기 균주의 라이신 생산능을 비교하기 위하여 대조군과 함께 실시예 5, 6, 7, 8과 동일한 방법으로 배양하고, 배양을 종료한 후 기포 발생량은 실시예 5, 6, 7, 8과 동일한 방법으로 측정하였으며, HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도는 하기 표 5에 나타내었다. 표 5의 결과는 3회 반복 실험결과값이며, 평균치로 생산능을 평가하였다.
표 5
　 라이신 g/L 거품 cm/L
배치 1 배치 2 배치 3 배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 43.3 43.1 43.4 4.6 4.9 4.7
KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717 46.1 45.7 45.2 4.4 4 4.2
KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl2912 45.5 45.9 46.1 4.2 4.3 4.4
KCCM11016P-ΔNCgl0717/ΔNCgl2912 46 45.1 45.7 4 3.9 4.5
표 5에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM11016P로부터 NCgl0336/NCgl0717, NCgl0336/NCgl2912, NCgl0717/NCgl2912 유전자가 동시 불활성화된 균주에서 라이신 생산능이 약 5% 증가하였다. 이와 더불어 기포 발생은 모균주 대비 NCgl0336/NCgl0717, NCgl0336/NCgl2912, NCgl0717/NCgl2912 유전자가 동시에 불활성화된 균주에서 약 10~14% 가량 감소됨을 보였다.
따라서, 코리네박테리움 속 미생물에서 라이신 생산에 불필요한 주요 분비단백질들을 동시 불활성화시킴으로써 배양 중 발생되는 기포를 효과적으로 제어할 수 있으며, 이를 통해 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 10: L-라이신 생산균주 KCCM11016P 유래 분비단백질 불활성화 통합균주의 제작 및 평가
L-라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에서 분비단백질의 불활성화에 따른 통합효과를 확인하기 위하여, 3 종의 분비단백질들이 모두 불활성화된 균주를 상기 실시예 5, 6, 7, 8, 9와 동일한 방법으로 선별하여KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717/ΔNCgl2912라 명명하였고, L-라이신 생산능과 함께 기포 발생량을 비교하였다.
상기 균주의 라이신 생산능을 비교하기 위하여 대조군과 함께 실시예 5, 6, 7, 8, 9와 동일한 방법으로 배양하고, 배양을 종료한 후 기포 발생량은 실시예 5, 6, 7, 8, 9와 동일한 방법으로 측정하였으며, HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도는 하기 표 6에 나타내었다. 표 6의 결과는 3회 반복 실험결과값이며, 평균치로 생산능을 평가하였다.
표 6
　 라이신 g/L 거품 cm/L
배치 1 배치 2 배치 3 배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 43.4 43.3 43.1 4.7 4.6 5.0
KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717/ΔNCgl2912 46.4 46.3 46.7 3.9 4.1 3.8
표 6에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM11016P로부터 NCgl0336, NCgl0717 및 NCgl2912 유전자가 모두 불활성화된 균주에서 라이신 생산능이 약 7% 증가하였고, 기포 발생은 모균주 대비 NCgl0336, NCgl0717 및 NCgl2912 유전자가 모두 불활성화된 균주에서 약 17% 가량 감소됨을 보였다.
따라서, 코리네박테리움 속 미생물에서 라이신 생산에 불필요한 주요 분비단백질들을 모두 불활성화시킴으로써 배양 중 발생되는 기포를 효과적으로 제어할 수 있으며, 이를 통해 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
상기의 결과들로부터, L-라이신 생산균주에서 주요 분비단백질들의 불활성화는 발효 중 과생성되는 기포를 제어함으로써 균체의 생장과 더불어 L-라이신 생산능을 증가시키는데 효과가 있음을 확인하였고, 상기 균주, KCCM11016P-ΔNCgl0336, KCCM11016P-ΔNCgl0717, 및 KCCM11016P-ΔNCgl2912를 각각 CA01-2281, CA01-2279, 및 CA01-2280으로 명명하고, CA01-2279 및 CA01-2280는 2013년 11월 22일자로, CA01-2281은 2013년 12월 13일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 각각 KCCM11481P(CA01-2279), KCCM11482P(CA01-2280), 및 KCCM11502P(CA01-2281)로 기탁번호를 부여받았다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11481P
수탁일자 : 20131122
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11482P
수탁일자 : 20131122
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11502P
수탁일자 : 20131213
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Figure PCTKR2015004588-appb-I000002
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Claims (3)

  1. 서열번호 1, 7 및 13의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 분비단백질이 불활성화된 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움속 미생물.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하여 배양물 또는 세포 중에 L-라이신을 생산하는 단계; 및
    상기 배양물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법.
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