ES2796960T3

ES2796960T3 - Microorganismo que tiene una productividad aumentada de l-lisina y método para producir l-lisina mediante el uso del mismo

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Publication number: ES2796960T3
Application number: ES15789069T
Authority: ES
Inventors: Peter Lee; Jun Ok Moon; Hyung Joon Kim; Song Gi Ryu
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2015-05-08
Publication date: 2020-11-30
Anticipated expiration: 2035-05-08
Also published as: JP2017514510A; PL3141597T3; CN106414715A; MY175423A; EP3141597B1; RU2663135C2; RU2016147962A3; US10208325B2; US20170204439A1; KR101530819B1; WO2015170907A1; CN106414715B; JP6493926B2; EP3141597A4; BR112016025999B1; EP3141597A1; HUE048901T2; RU2016147962A; BR112016025999A2

Abstract

Un microorganismo productor de L-lisina del género Corynebacterium en el que al menos una proteína secretora seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7 y 13 se inactiva.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismo que tiene una productividad aumentada de l-lisina y método para producir l-lisina mediante el uso del mismo

Campo técnico

La presente descripción se refiere a un microorganismo que tiene una capacidad aumentada para producir L-lisina y un método para producir L-lisina mediante el uso del mismo.

Técnica Anterior

La L-lisina se usa en las industrias de alimentación animal, cosmética y farmacéutica humana, y se produce por fermentación mediante el uso de un microorganismo del género Corynebacterium o del género Escherichia. En años recientes, se han realizado estudios sobre el desarrollo de cepas de producción altamente eficientes y técnicas del proceso de fermentación.

Se han realizado muchos estudios para controlar la formación de espuma durante la fermentación de levaduras que se usan en la producción de cerveza y vino, y en estudios recientes, se han identificado genes (AWA1, FPG1 y CFG1) que tienen un efecto sobre la formación de espuma (Shimoi H. y otros, 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 2018-25; Blasco L. y otros, Yeast. 2011, 28: 437-51; Blasco L. y otros, J. Agric. Food Chem. 2012, 60: 10796-07). En la presente descripción, se encontró que, en el caso de una cepa con estos genes inactivados, la formación de espuma disminuyó significativamente en comparación con el caso de una cepa original, mientras que en el caso de una cepa que sobreexpresa estos genes, la formación de espuma aumentó.

La formación de espuma durante el cultivo de la levadura se produce a través de una serie de procesos de la siguiente manera. Primero, la manoproteína se mezcla con finas burbujas de gas generadas durante la fermentación. En este momento, el interior de las burbujas de gas se vuelve hidrófobo, y el exterior de las burbujas de gas se vuelve hidrófilo. Por esta razón, la viscosidad del medio de cultivo aumenta de manera que no solo se mezclan varias proteínas, sino también células, lo que produce espuma (Swart CW. y otros, FEMS Yeast Res. 2012, 12: 867-69).

En la producción de cerveza mediante el uso de levadura, se requiere un nivel adecuado de formación de espuma, pero en la fermentación de microorganismos que se usan para producir grandes cantidades de productos útiles como aminoácidos, se requiere la inhibición de la formación de espuma. Si se genera una cantidad excesivamente grande de espuma durante el cultivo, la viscosidad del medio de cultivo aumentará y, por lo tanto, la velocidad de transferencia de oxígeno (OTR) en el medio de cultivo disminuirá y, en casos graves, se producirá la lisis de las células. El uso de una gran cantidad de un agente antiespumante para inhibir la formación de espuma puede aumentar los costos de producción en términos industriales y puede tener un efecto adverso sobre el crecimiento celular.

En consecuencia, los presentes inventores han seleccionado genes de un microorganismo del género Corynebacterium, que tienen un efecto sobre una gran cantidad de formación de espuma, y han descubierto que, cuando dichos genes se inactivan, la formación de espuma se controla eficazmente, de manera tal que la capacidad de la cepa de producir L-lisina se incrementa, por consiguiente, se completa la presente descripción.

Brand S. y otros, Arch. Microbiol. 2003, 180: 33-44, describe una cepa de Corynebacterium glutamicum en la que se elimina el gen cmtl. El gen cm tl codifica una micoliltransferasa que tiene un dominio esterasa. El producto del gen cm tl tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 1 de la presente descripción.

El documento WO 2011/158975 describe un método para producir L-lisina mediante el uso de una cepa genéticamente modificada de Corynebacterium glutamicum.

Descripción

Problema Técnico

Es un objetivo de la presente descripción proporcionar un microorganismo del género Corynebacterium que tenga una capacidad aumentada para producir L-lisina.

Otro objetivo de la presente descripción es proporcionar un método para producir L-lisina mediante el uso del microorganismo del género Corynebacterium.

Solución Técnica

Para lograr los objetivos anteriores, un aspecto de la presente descripción proporciona un microorganismo del género Corynebacterium en donde al menos una proteína secretora seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, 7 y 13 se inactiva.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un método para producir L-lisina mediante el cultivo de un microorganismo del género Corynebacterium.

El alcance de la invención se define por las reivindicaciones.

Efectos Ventajosos

El microorganismo de acuerdo con la presente descripción es un microorganismo en donde las proteínas secretoras que participan en la formación de espuma se inactivan de manera que aumenta la capacidad de la cepa para producir L-lisina. Cuando se usa esta cepa, se reduce la formación de espuma, puede cultivarse sin tener que aumentar o sin tener que adicionar una gran cantidad de un agente antiespumante, y puede aumentarse la capacidad de la cepa de producir L-lisina. Además, en términos industriales, pueden obtenerse efectos tales como la conveniencia de la producción y una reducción en el costo de producción, y puede producirse eficientemente L-lisina.

Descripción detallada

En lo sucesivo, la presente descripción se describirá en detalle.

En un aspecto, la presente descripción proporciona un microorganismo del género Corynebacterium en donde al menos una proteína secretora que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, 7 y 13 se inactiva. Si se genera una cantidad excesivamente grande de espuma durante el cultivo en masa para producir L-lisina, la viscosidad del medio de cultivo aumentará de modo que la tasa de transferencia de oxígeno (OTR) en el medio de cultivo disminuirá, y en casos graves, la lisis de las células también ocurrirá. En otras palabras, se pensó que inactivar las proteínas secretoras, que causan la formación de espuma, en términos de controlar la formación de espuma, sería ventajoso para la producción de lisina.

Por lo tanto, en una modalidad de la presente descripción, con el fin de mejorar un proceso de fermentación para producir L-lisina y para seleccionar proteínas secretoras principales que causan la formación de espuma innecesaria para la producción de lisina, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (este microorganismo se describió como KFCC10881, y se redepositó con una Autoridad Depositaria Internacional bajo el Tratado de Budapest con el núm. de orden KCCM11016P; Patente coreana núm. 10-0159812) se cultivó, y después se aisló la espuma producida durante el proceso de fermentación, por consiguiente se obtuvieron péptidos. Se analizaron los péptidos obtenidos, y se seleccionaron tres proteínas detectadas en mayores cantidades, por consiguiente, se seleccionaron los péptidos codificados por los genes de NCBI núms. de acceso NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912 para Corynebacterium glutamicum ATCC13032.

En la presente descripción, el péptido codificado por el gen NCgl0336 es una esterasa que existe endógenamente en Corynebacterium glutamicum. Específicamente, el péptido puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80 %, específicamente al menos el 90 %, más específicamente al menos el 95 %, particularmente específicamente al menos el 97 %, a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, también se incluye en el alcance de la proteína secretora de acuerdo con la presente descripción, siempre que sea una proteína que tenga actividad esterasa. Sin embargo, la proteína secretora que se usa en la presente descripción no se limita a esto, porque la secuencia de aminoácidos de la proteína que muestra actividad esterasa puede diferir en dependencia de la especie o cepa de microorganismos. Además, es obvio que una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una eliminación, modificación, sustitución o eliminación de uno o varios aminoácidos en una o más posiciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 también se incluye en el alcance de la presente descripción, siempre que tenga una secuencia que tenga homología a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y tenga una actividad biológica sustancialmente igual o similar a la de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

En la presente descripción, el gen NCgl0336 tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos el 80 %, específicamente al menos el 90 %, más específicamente el 95 %, particularmente específicamente el 97 %, a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, también se incluye en el alcance de la presente descripción. Además, las variantes de la secuencia, que codifican el mismo aminoácido debido a la degeneración del código genético, también se incluyen en el alcance de la presente descripción. Además, un polinucleótido que codifica NCgl0336 de acuerdo con la presente descripción puede ser una variante que codifica NCgl0336, que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que normalmente funciona.

En la presente descripción, el péptido codificado por el gen NCgl0717 es una esterasa que existe endógenamente en Corynebacterium glutamicum. Específicamente, el péptido puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80 %, específicamente al menos el 90 %, más específicamente al menos el 95 %, particularmente específicamente al menos el 97 %, a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, también se incluye en el alcance de la proteína secretora de acuerdo con la presente descripción, siempre que sea una proteína que tenga actividad esterasa. Sin embargo, la proteína secretora que se usa en la presente descripción no se limita a esto, porque la secuencia de aminoácidos de la proteína que muestra actividad esterasa puede diferir en dependencia de la especie o cepa de microorganismos. Además, es obvio que una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una eliminación, modificación, sustitución o eliminación de uno o varios aminoácidos en una o más posiciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 también se incluye en el alcance de la presente descripción, siempre que tenga una secuencia que tenga homología a la secuencia de SEQ ID NO: 7 y tenga una actividad biológica sustancialmente igual o similar a la de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

En la presente descripción, el gen NCgl0717 tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8, y una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos el 80 %, específicamente al menos el 90 %, más específicamente el 95 %, particularmente específicamente el 97 %, a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8, también se incluye en el alcance de la presente descripción. Además, las variantes de la secuencia, que codifican el mismo aminoácido debido a la degeneración del código genético, también se incluyen en el alcance de la presente descripción. Además, un polinucleótido que codifica a NCgl0717 de acuerdo con la presente descripción puede ser una variante que codifica a NCgl0717, que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que normalmente funciona.

En la presente descripción, el péptido codificado por el gen NCgl2912 es una esterasa que existe endógenamente en Corynebacterium glutamicum. Específicamente, el péptido puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, y una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80 %, específicamente al menos el 90 %, más específicamente al menos el 95 %, particularmente específicamente al menos el 97 %, a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, también se incluye en el alcance de la proteína secretora de acuerdo con la presente descripción, siempre que sea una proteína que tenga actividad esterasa. Sin embargo, la proteína secretora que se usa en la presente descripción no se limita a esto, porque la secuencia de aminoácidos de la proteína que muestra actividad esterasa puede diferir en dependencia de la especie o cepa de microorganismos. Además, es obvio que una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una eliminación, modificación, sustitución o eliminación de uno o varios aminoácidos en una o más posiciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 también se incluye en el alcance de la presente descripción, siempre que tenga una secuencia que tenga homología con la secuencia de SEQ ID NO: 13 y tenga una actividad biológica sustancialmente igual o similar a la de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

En la presente descripción, el gen NCgl2912 tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14, y una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos 80%, específicamente al menos 90%, más específicamente 95%, particularmente específicamente 97%, a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14 también se incluye en el alcance de la presente descripción. Además, las variantes de la secuencia, que codifican el mismo aminoácido debido a la degeneración del código genético, también se incluyen en el alcance de la presente descripción. Además, un polinucleótido que codifica a NCgl2912 de acuerdo con la presente descripción puede ser una variante que codifica a NCgl2912, que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14 o una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que normalmente funciona.

Como se usa en la presente descripción, el término "homología" se refiere a la identidad de una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos dada y puede expresarse como porcentaje. En la especificación, una secuencia homóloga que tiene una actividad igual o similar a una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos dada se expresa como "% de homología". La homología de la secuencia de aminoácidos puede determinarse mediante el uso de, por ejemplo, el algoritmo BLAST (véase Karlin y Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) o FASTA por Pearson (véase Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Los programas llamados BLASTN y BLASTX se han desarrollado sobre la base de este algoritmo BLAST (véase www.ncbi.nlm.nih.gov).

Como se usa en la presente descripción, el término "condiciones rigurosas" significa condiciones que permiten la hibridación específica entre polinucleótidos. Por ejemplo, tales condiciones rigurosas se describen en detalle en J. Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York.

Como se usa en la presente descripción, la "inactivación" puede lograrse mediante cualquier método de inactivación conocido en la técnica. En la presente descripción, "inactivación" significa que la expresión de un gen endógeno se reduce en comparación con la de una cepa de tipo salvaje, o el gen no se expresa, o el gen no tiene actividad o actividad reducida, aunque se exprese. La activación puede lograrse al mutar toda o parte de la secuencia de nucleótidos o toda o parte de la secuencia reguladora de la expresión de esta mediante eliminación, sustitución, inserción o una combinación de estas.

Como ejemplo específico, un microorganismo con el gen endógeno inactivado puede prepararse mediante la transformación de un microorganismo del género Corynebacterium con un vector recombinante que comprende un fragmento de gen obtenido por eliminación del marco de lectura abierto del gen endógeno, por consiguiente por eliminación o mutación del gen endógeno. La inserción del gen en el cromosoma puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica.

Como se usa en la presente descripción, el término enzima y actividad "endógena" se refiere a una enzima presente originalmente en un microorganismo o una célula y la actividad de la enzima. Por ejemplo, el término significa una enzima y su actividad antes de que la enzima y la actividad se modifiquen.

Como se usa en la presente descripción, el término "vector recombinante" se refiere a una construcción de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica la proteína diana unida operativamente a una secuencia reguladora adecuada para poder expresar el gen objetivo en una célula huésped adecuada. La secuencia reguladora incluye un promotor capaz de iniciar la transcripción, cualquier operador para regular esta transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión adecuado del ribosoma del ARNm y una secuencia para regular la terminación de la transcripción y la traducción. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector puede replicarse o funcionar independientemente del genoma del huésped, o puede integrarse en el propio genoma. El vector que se usa en la presente descripción no se limita específicamente y puede ser cualquier vector conocido en la técnica, siempre que pueda replicarse en un huésped.

Los ejemplos del vector que se usa en la construcción del vector recombinante incluyen plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos naturales o recombinantes. Por ejemplo, el vector de fago o vector cósmido que se usa en la presente descripción pueden ser pWE15, M13, AMBL3, AMBl4, AIXII, AASHII, AAPII, At10, At11, Charon4A, Charon21A o similares, y el vector plásmido que se usa en la presente descripción puede ser tipo pDZ, tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptlI, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL, tipo pET o similares. Un vector que puede usarse en la presente descripción no se limita específicamente, y cualquier expresión conocida puede usarse en la presente descripción.

Tal como se usa en la presente descripción, el término "transformación" significa introducir un vector que comprende un polinucleótido que codifica una proteína objetivo en una célula huésped para poder expresar una proteína codificada por el polinucleótido en la célula huésped. El polinucleótido introducido puede insertarse y ubicarse en el cromosoma de la célula huésped o ubicarse fuera del cromosoma, siempre que pueda expresarse en la célula huésped. Además, los polinucleótidos incluyen ADN y ARN, que codifican la proteína objetivo. Siempre que el polinucleótido pueda introducirse en la célula huésped y se exprese en ella, puede introducirse en cualquier forma. Por ejemplo, el polinucleótido puede introducirse en la célula huésped en forma de un casete de expresión que es una construcción polinucleotídica que incluye todos los elementos necesarios para la autoexpresión. El casete de expresión generalmente incluye un promotor que está operativamente unido al marco de lectura abierto (en adelante abreviado como "ORF") del gen, una señal de terminación de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma y una señal de terminación de la traducción. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión autorreplicable. Además, el polinucleótido puede introducirse en la célula huésped por sí mismo y unirse operativamente a la secuencia necesaria para la expresión en la célula huésped.

Como una cepa original en la que va a introducirse el vector recombinante, puede usarse sin limitación cualquier microorganismo que tenga la capacidad de producir la L-lisina. Específicamente, puede usarse un microorganismo del género Corynebacterium o del género Brevibacterium. Más específicamente, puede usarse un microorganismo Corynebacterium glutamicum.

Como se usa en la presente descripción, la expresión "microorganismo que tiene la capacidad de producir L-lisina" se refiere a un microorganismo obtenido mediante la manipulación de un gen generalmente conocido para que sea capaz de producir L-lisina. Por ejemplo, el microorganismo puede ser un microorganismo obtenido mediante la inserción de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en aspB (gen que codifica la aspartato aminotransferasa), lysC (gen que codifica la aspartato quinasa), asd (gen que codifica el aspartato semialdehído deshidrogenasa), dapA (gen que codifica la dihidrodipicolinato sintasa), dapB (gen que codifica la dihidrodipicolinato reductasa) y lysA (gen que codifica la diaminodipimelato descarboxilasa), que son endógenos en un microorganismo del género Corynebacterium y están involucrados en la producción de L-aminoácidos, mediante el tratamiento de una cepa mutante auxotrófica de L-leucina con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG).

Más específicamente, un microorganismo del género Corynebacterium usado en la presente descripción es Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (este microorganismo se describió como KFCC10881 y se redepositó con una Autoridad Depositaria Internacional bajo el Tratado de Budapest bajo el núm. de orden KCCM11016P; Patente coreana núm. 10 -0159812), Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente coreana núm. 10-0924065), la cepa productora de L-lisina KCCM11347P de Corynebacterium glutamicum (este microorganismo se describió como KFCC10750 y se redepositó con una Autoridad Depositaria Internacional bajo el Tratado de Budapest bajo el núm. de orden KCCM11347P; Patente coreana núm. 10-0073610), y la cepa CJ3P de Corynebacterium glutamicum (Binder y otros, Genome Biology 2012, 13:R40), pero no se limitan a los mismos.

En una modalidad preferida de la presente descripción, un microorganismo transformado de acuerdo con la presente descripción puede ser Corynebacterium glutamicum KCCM11502P, KCCM11481P o KCCM11482P.

En otro aspecto, la presente descripción también proporciona un método para producir L-lisina mediante el uso del microorganismo transformado. Más específicamente, la presente descripción proporciona un método para producir L-lisina, que comprende los pasos de: cultivar el microorganismo de la presente descripción para producir L-lisina en un cultivo o célula del microorganismo; y recuperar L-lisina del medio de cultivo.

En el método de la presente descripción, el cultivo de un microorganismo del género Corynebacterium puede realizarse mediante el uso de cualquier condición de cultivo y método de cultivo conocido en la técnica.

Por ejemplo, un medio que puede usarse para el cultivo de un microorganismo del género Corynebacterium se describe en el Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., Estados Unidos, 1981).

Las fuentes de azúcar que pueden usarse en el medio incluyen azúcares y carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón o celulosa; aceites y grasas tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino o aceite de coco; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico o ácido linoleico; alcoholes tales como glicerol o etanol; y ácidos orgánicos como el ácido acético. Estas sustancias pueden usarse individualmente o en una mezcla.

Las fuentes de nitrógeno que pueden usarse incluyen compuestos que contienen nitrógeno orgánico, como peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno también pueden usarse individualmente o como una mezcla.

Las fuentes de fósforo que pueden usarse incluyen dihidrógeno fosfato de potasio o hidrógeno fosfato de dipotasio o las sales de sodio correspondientes. El medio de cultivo además debe contener sales metálicas como sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, pueden usarse sustancias de crecimiento esenciales tales como aminoácidos y vitaminas además de las sustancias mencionadas anteriormente. Además, pueden añadirse precursores adecuados al medio de cultivo. Dichas sustancias pueden añadirse al cultivo en un lote o de manera continua a través de un método adecuado durante el cultivo.

El pH del cultivo puede controlarse mediante el uso de compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o amoníaco acuoso o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico de manera adecuada. La formación de espuma puede controlarse mediante el uso de agentes antiespumantes como los ésteres de poliglicol de ácidos grasos. Las condiciones aeróbicas se mantienen mediante la introducción de oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno (por ejemplo, aire) en el cultivo. La temperatura de cultivo es generalmente de 20 °C a 45 °C, específicamente de 25 °C a 40 °C. El cultivo puede continuar hasta que se haya producido la cantidad deseada de L-lisina. Específicamente, el tiempo de cultivo es de 10-160 horas.

En el método de la presente descripción, el cultivo puede realizarse de forma continua o en un proceso discontinuo o en un proceso discontinuo alimentado o repetido. Este cultivo puede realizarse mediante el uso de cualquier método bien conocido en la técnica.

En lo sucesivo, la presente descripción se describirá con más detalle con referencia a ejemplos. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente descripción.

Ejemplos

Ejemplo 1: Selección de proteínas secretoras relacionadas con la formación de espuma durante el cultivo

En este ejemplo, para seleccionar proteínas secretoras que causan formación de espuma, se realizó un experimento de la siguiente manera.

Primero, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (este microorganismo se describió como KFCC10881 y se redepositó con una Autoridad Depositaria Internacional bajo el Tratado de Budapest bajo el núm. de orden KCCM11016P; la Patente coreana núm. 10-0159812) se cultivó mediante el uso de un fermentador de 1 L, y después solamente la espuma producida durante el proceso de fermentación se aisló y se concentró en un tubo de ensayo de 15 ml.

Para la identificación de las proteínas contenidas en la muestra de espuma concentrada, se añadió a la muestra una cantidad adecuada de un colorante de carga que contiene un tensoactivo que después se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 8 %. Después de la electroforesis, el gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio se tiñó con azul de Coomassie. Después, las bandas de proteínas teñidas se escindieron y se digirieron con tripsina para obtener péptidos, y las secuencias de aminoácidos de los péptidos obtenidos se analizaron mediante un método LC-MS/MS.

Los péptidos analizados se identificaron mediante la búsqueda de genes de un microorganismo del género Corynebacterium mediante el uso de la investigación de Blast proporcionada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Entre los péptidos identificados, se seleccionaron tres proteínas detectadas en mayores cantidades, por consiguiente, se seleccionaron finalmente los genes que codifican las proteínas. Los genes seleccionados son los núms. de acceso de NCBI NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912.

Ejemplo 2: Construcción de plásmido recombinante para la inactivación del gen NCgl0336 de la proteína secretora

Para la construcción de un plásmido recombinante capaz de inactivar el gen NCgl0336 en el cromosoma de Corynebacterium, se obtuvieron la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2) de NCgl0336 que se basan en la secuencia de nucleótidos depositada en el NIH Genbank. Con el fin de preparar un fragmento de gen mediante la eliminación del marco de lectura abierto de NCgl0336, se construyeron cebadores de las SEQ ID NO: 3 a 6 que se basan en la secuencia de SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO. 3: 5'-atcctctagagtcgacGAAGCCTCTGCACCTCGCTG-3';

SEQ ID NO. 4: 5'-TATAGTTCGGTTCCGCGTCTCCAACGCATCCGGCC-3';

SEQ ID NO. 5: 5'-CGGAACCGAACTATACCACCGAGGGACGCATTCTC-3';

SEQ ID NO. 6: 5'-atgcctgcaggtcgacGCTCAAACGCACGAGCGAAG-3'.

Mediante el uso del ADN genómico de Corynebacterium glutamicum como plantilla, la PCR se realizó mediante el uso de un conjunto de cebadores de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y un conjunto de cebadores de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 [Sambrook y otros, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]. La PCR se realizó durante 30 ciclos, cada uno de los cuales consistió en desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 1 minuto.

Como resultado, se obtuvieron NCgl0336-A y NCgl0336-B, que son fragmentos de ADN que comprenden un fragmento del gen NCgl0336 de 342 pb y un fragmento del gen NCgl0336 de 315 pb, respectivamente. El fragmento de ADN obtenido mediante amplificación por PCR se ligó a un plásmido pDZ (Patente coreana núm. 10-0924065) mediante el uso de un kit de clonación por infusión (Invitrogen), y después se transformó en E. coli DH5a y se sembró en un medio sólido LB que contenía 25 mg/l de kanamicina. Una colonia transformada con un plásmido que tenía el gen deseado insertado en el mismo se seleccionó por PCR, y después el plásmido se aisló mediante el uso de una técnica de extracción de plásmido generalmente conocida. El plásmido se denominó "pDZ-ANCgl0336". pDZ-ANCgl0336 es un plásmido en donde se eliminó un fragmento de gen de 503 pb de NCgl0336.

Ejemplo 3: Construcción del plásmido recombinante para la inactivación del gen NCgl0717 de la proteína secretora

Para la construcción de un plásmido recombinante capaz de inactivar el gen NCgl0717 en el cromosoma de Corynebacterium, se obtuvieron la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) y la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 8) de NCgl0717 que se basan en la secuencia de nucleótidos depositada en el NIH Genbank. Con el fin de preparar un fragmento de gen mediante la eliminación del marco de lectura abierto de NCgl0717, se construyeron cebadores de las SEQ ID NO: 9 a 12 que se basan en la secuencia de SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO. 9: 5'-CCGGGGATCCTCTAGAGTTCGCGGATAAATGGG-3';

SEQ ID NO. 10: 5'-CACGTGAAATTCAGGTCGCGTGGTTCACCTCCGAAG-3';

SEQ ID NO. 11: 5'-CTTCGGAGGTGAACCACGCGACCTGAATTTCACGTG-3';

SEQ ID NO. 12: 5'-GCAGGTCGACTCTAGAGGTCCCATGATTGTTCTG-3'.

Mediante el uso del ADN genómico de Corynebacterium glutamicum como plantilla, la PCR se realizó mediante el uso de un conjunto de cebadores de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 y un conjunto de cebadores de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. La PCR se realizó durante 30 ciclos, cada uno de los cuales consistió en desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 1 minuto.

Como resultado, se obtuvieron NCgl0717-A y NCgl0717-B, que son fragmentos de ADN que comprenden un fragmento del gen NCgl0717 de 493 pb y un fragmento del gen NCgl0717 de 491 pb, respectivamente. El fragmento de ADN obtenido mediante amplificación por PCR se ligó a un plásmido pDZ mediante el uso de un kit de clonación por infusión (Invitrogen), y después se transformó en E. coli DH5a y se sembró en un medio sólido LB que contenía 25 mg/l de kanamicina. Una colonia transformada con un plásmido que tenía el gen deseado insertado en el mismo se seleccionó por PCR, y después el plásmido se aisló mediante el uso de una técnica de extracción de plásmido generalmente conocida. El plásmido se denominó "pDZ-ANCgl0717". pDZ-ANCgl0717 es un plásmido en donde se eliminó un fragmento de gen de 786 pb de NCgl0717.

Ejemplo 4: Construcción de plásmido recombinante para la inactivación del gen NCgl2912 de la proteína secretora

Para la construcción de un plásmido recombinante capaz de inactivar el gen NCg2912 en el cromosoma de Corynebacterium, se obtuvieron la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) y la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 14) de NCgl2912 que se basan en la secuencia de nucleótidos depositada en el NIH Genbank. Con el fin de preparar un fragmento de gen mediante la eliminación del marco de lectura abierto de NCgl2912, se construyeron cebadores de las SEQ ID NO: 15 a 18 que se basan en la secuencia de SEQ ID NO: 14.

SEQ ID NO. 15: 5'-CCGGGGATCCTCTAGAGCTGCAAGAAGTGCGAC-3';

SEQ ID NO. 16: 5'-CTCGTAGTCGCTAGCACCTATTACGGGAGGTC-3';

SEQ ID NO. 17: 5'-GACCTCCCGTAATAGGTGCTAGCGACTACGAG-3';

SEQ ID NO. 18: 5'-GCAGGTCGACTCTAGACCCGAGCTATCTAACAC-3'.

Mediante el uso del ADN genómico de Corynebacterium glutamicum como plantilla, la PCR se realizó mediante el uso de un conjunto de cebadores de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 y un conjunto de cebadores de SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. La PCR se realizó durante 30 ciclos, cada uno de los cuales consistió en desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 1 minuto.

Como resultado, se obtuvieron NCgl2912-A y NCgl2912-B, que son fragmentos de ADN que comprenden un fragmento del gen NCgl2912 de 444 pb y un fragmento del gen NCgl2912 de 636 pb, respectivamente. El fragmento de ADN obtenido mediante amplificación por PCR se ligó a un plásmido pDZ mediante el uso de un kit de clonación por infusión (Invitrogen), y después se transformó en E. coli DH5a y se sembró en un medio sólido LB que contenía 25 mg/l de kanamicina. Una colonia transformada con un plásmido que tenía el gen deseado insertado en el mismo se seleccionó por PCR, y después el plásmido se aisló mediante el uso de una técnica de extracción de plásmido generalmente conocida. El plásmido se denominó "pDZ-ANCgl2912". pDZ-ANCgl2912 es un plásmido en donde se eliminó un fragmento de gen de 128 pb de NCgl2912.

Ejemplo 5: Construcción y evaluación de la cepa inactivada por el gen de la proteína secretora a partir de la cepa productora de lisina KCCM11016P

Cada uno de los tres plásmidos recombinantes (pDZ-ANCgl0336, pDZ-ANCgl0717 y pDZ-ANCgl2912) construidos en los Ejemplos 2, 3 y 4 se transformó en Corynebacterium glutamicum KCCM11016P mediante un método de pulso eléctrico y las cepas en donde el gen objetivo se inactivó mediante recombinación homóloga se prepararon por un método de PCR. Las cepas preparadas se denominaron "KCCM11016P-ANCgl0336", "KCCM11016P-ANCgl0717" y "KCCM11016P-ANCgl2912", respectivamente.

Se inoculó cada una de las tres cepas y una cepa control en un matraz con deflector de 25 ml que contenía 25 ml del siguiente medio de cultivo, y se cultivó con agitación a 200 rpm y 30 °C durante 20 horas. A continuación, se inoculó 1 ml del cultivo de siembra en un matraz con deflector de 250 ml que contenía 24 ml del siguiente medio de producción, y se cultivó con agitación a 200 rpm y 37 °C durante 96 horas. La composición de cada uno de los medios de cultivo y el medio de producción es la siguiente.

Medio de cultivo (pH 7,0)

20 g de glucosa, 10 g de (NH4)2SO4, 10 g de peptona, 5 g de extracto de levadura, 1,5 g de urea, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO47H20, 100 |jg de biotina, 1000 |jg de tiamina HCl, 2000 |jg de pantotenato de calcio y 2000 |jg de nicotinamida (por litro de agua destilada).

Medio de producción (pH 7,0)

100 g de glucosa, 40 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de sólido de maíz escarpado, 3 g de urea, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO47 H2O, 100 g de biotina, 1000 g de tiamina HCl, 2000 g de pantotenato de calcio, 3000 g de nicotinamida, y 30 g de CaCO3 (por litro de agua destilada).

Después de completar el proceso de cultivo, el cultivo se transfirió a una probeta graduada, y se midió la altura de la espuma producida en el cultivo, y también se midió la concentración de L-lisina en el cultivo por HPLC. Los resultados de la medición se muestran en la Tabla 1 a continuación. Los resultados en la Tabla 1 son los resultados de tres experimentos repetidos, y la producción de L-lisina se evaluó basada en el valor promedio.

Tabla 1

Como se muestra en la Tabla 1 anterior, la producción de L-lisina de la cepa en donde se inactivó cada uno de los genes NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912 aumentó aproximadamente un 6 % en comparación con la cepa original KCCM11016P. Además, la espuma en el cultivo de la cepa en donde se inactivó cada uno de los genes NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912 disminuyó aproximadamente un 6-15 % en comparación con la del cultivo de la cepa original.

Por lo tanto, se encontró que, cuando las principales proteínas secretoras del microorganismo Corynebacterium sp., que son innecesarias para la producción de lisina, se inactivan, la generación de espuma durante el cultivo del microorganismo puede controlarse eficazmente, por consiguiente, aumenta la producción de L-lisina.

Ejemplo 6: Construcción y evaluación de cepas con proteína secretora inactivada a partir de la cepa productora de L-lisina KCCM10770P

Con el fin de examinar si los efectos de la inactivación de proteínas secretoras en la cepa productora de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente coreana núm. 10-0924065) que tiene una vía biosintética de lisina mejorada son similares a los resultados experimentales del Ejemplo 5, las cepas en que cada una de las tres proteínas secretoras estaba inactivada se construyeron de la misma manera que se describe en el Ejemplo 5. Las cepas construidas se denominaron "KCCM10770P-ANCgl0336", "KCCM10770P-ANCgl0717" y "KCCM10770P-ANCgl2912". Se examinó la cantidad de producción de L-lisina de cada una de las cepas construidas junto con la cantidad de espuma generada.

Para examinar la producción de lisina de las cepas, cada una de las cepas junto con la cepa control se cultivó de la misma manera que se describe en el Ejemplo 5. Después de completar el cultivo, la cantidad de espuma generada se midió de la misma manera que se describe en el Ejemplo 5, y la concentración de L-lisina se midió por HPLC. Los resultados de la medición se muestran en la Tabla 2 a continuación. Los resultados en la Tabla 2 son los resultados de tres experimentos repetidos, y la producción de L-lisina se evaluó basada en el valor promedio.

Tabla 2

Como se muestra en la Tabla 2 anterior, la producción de lisina de la cepa en donde se inactivó cada uno de los genes NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912 aumentó aproximadamente un 4 % en comparación con la cepa original KCCM10770P. Además, la espuma en el cultivo de la cepa en donde se inactivó cada uno de los genes NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912 disminuyó aproximadamente de 4-18 % en comparación con el de la cepa original.

Por lo tanto, se encontró que, cuando las principales proteínas secretoras de Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente coreana núm. 10-0924065), que son innecesarias para la producción de lisina, se inactivan, la generación de espuma durante el cultivo de los microorganismos puede controlarse eficazmente, por consiguiente, aumenta la producción de L-lisina, similar a los resultados del Ejemplo 6.

Ejemplo 7: Construcción y evaluación de cepas con proteína secretora inactivada a partir de la cepa productora de L-lisina KCCM11347P

Con el fin de examinar los efectos de la inactivación de las proteínas secretoras en la cepa productora de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (este microorganismo se describió como KFCC10750, y se redepositó con una Autoridad Depositaria Internacional bajo el Tratado de Budapest bajo el núm. de orden KCCM11347P; Patente coreana núm. 10-0073610) construida por mutación artificial, las cepas en las que cada una de las tres proteínas secretoras se inactivaron se construyeron de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5 o 6. Las cepas construidas se denominaron "KCCM11347P-ANCgl0336", "KCCM11347P-ANCgl0717" y "KCCM11347P-ANCgl2912". Se examinó la cantidad de producción de L-lisina de cada una de las cepas construidas junto con la cantidad de espuma generada.

Para examinar la producción de lisina de las cepas, cada una de las cepas junto con la cepa control se cultivó de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5 o 6. Después de completar el cultivo, la cantidad de espuma generada se midió de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5 o 6, y la concentración de L-lisina se midió por HPLC. Los resultados de la medición se muestran en la Tabla 3 a continuación. Los resultados en la Tabla 3 son los resultados de tres experimentos repetidos, y la producción de L-lisina se evaluó en función del valor promedio.

Tabla 3

Como se muestra en la Tabla 3 anterior, la producción de lisina de la cepa en donde se inactivó cada uno de los genes NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912 aumentó aproximadamente un 5 % en comparación con la cepa original KCCM11347P. Además, la espuma en el cultivo de la cepa en donde se inactivó cada uno de los genes NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912 disminuyó aproximadamente del 4-15 % en comparación con el de la cepa original.

Por lo tanto, se encontró que, cuando las principales proteínas secretoras de Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (Patente coreana núm. 94-0001307), que son innecesarias para la producción de lisina, se inactivan, la generación de espuma durante el cultivo de los microorganismos puede controlarse eficazmente, por consiguiente, aumenta la producción de L-lisina, similar a los resultados de los Ejemplos 5 y 6.

Ejemplo 8: Construcción y evaluación de cepas con proteína secretora inactivada a partir de la cepa productora de L-lisina CJ3P

Para examinar los efectos de la inactivación de proteínas secretoras en Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder y otros Genome Biology 2012, 13: R40) que tienen la capacidad de producir L-lisina, construida mediante la introducción de tres mutaciones [pyc(P458S), hom(V59A) y lysC(T311I)] en una cepa de tipo salvaje, como en los Ejemplos 5, 6 y 7, las cepas en las que cada una de las tres proteínas secretoras se inactivaron se construyeron de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5, 6 o 7. Las cepas construidas se denominaron "CJ3P-ANCgl0336", "CJ3P-ANCgl07l7" y "CJ3P-ANCgl2912". Se examinó la cantidad de producción de L-lisina de cada una de las cepas construidas junto con la cantidad de espuma generada.

Para examinar la producción de lisina de las cepas, cada una de las cepas junto con la cepa control se cultivó de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5, 6 o 7. Después de completar el cultivo, la cantidad de espuma generada se midió de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5, 6 o 7, y la concentración de L-lisina se midió por HPLC. Los resultados de la medición se muestran en la Tabla 4 a continuación. Los resultados en la Tabla 4 son los resultados de tres experimentos repetidos, y la producción de L-lisina se evaluó basada en el valor promedio.

Tabla 4

Como se muestra en la Tabla 4 anterior, la producción de lisina de la cepa en donde se inactivó cada uno de los genes NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912 aumentó aproximadamente un 8 % en comparación con la cepa original CJ3P. Además, la espuma en el cultivo de la cepa en donde se inactivó cada uno de los genes NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912 disminuyó aproximadamente de 5-17 % en comparación con el de la cepa original.

Por lo tanto, se encontró que, cuando las principales proteínas secretoras de Corynebacterium glutamicum CJ3P, que son innecesarias para la producción de lisina, se inactivan, la generación de espuma durante el cultivo del microorganismo puede controlarse eficazmente, por consiguiente, aumenta la producción de L-lisina, similar a los resultados de los Ejemplos 5, 6 y 7.

Ejemplo 9: Construcción y evaluación de cepas con proteína secretora inactivada a partir de la cepa productora de L-lisina KCCM11016P

Para examinar los efectos de la inactivación conjunta de proteínas secretoras en la cepa productora de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, se construyeron tres cepas en las que los genes de la proteína secretora se inactivaron conjuntamente de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5, 6, 7 y 8. Las cepas construidas en las que se inactivó una combinación de los genes se denominaron "KCCM11016P-ANCgl0336/ANCgl0717", "KCCM11016P-ANCgl0336/ANCgl2912", y "KCCM11016P-ANCgl0717/ANCgl2912", y se examinó la cantidad de producción de L-lisina de cada una de las cepas construidas junto con la cantidad de espuma generada.

Para comparar la producción de lisina de las cepas, cada una de las cepas junto con la cepa control se cultivó de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5, 6, 7 u 8. Después de completar el cultivo, la cantidad de espuma generada se midió de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5, 6, 7 u 8, y la concentración de L-lisina se midió por HPLC. Los resultados de la medición se muestran en la Tabla 5 a continuación. Los resultados en la Tabla 5 son los resultados de tres experimentos repetidos, y la producción de L-lisina se evaluó basada en el valor promedio.

Tabla 5

Como se muestra en la Tabla 5 anterior, la producción de lisina de la cepa en la que los genes NCgl0336/NCgl0717, NCgl0336/NCgl2912 o NCgl0717/NCgl2912 se inactivaron conjuntamente aumentó aproximadamente un 5 % en comparación con la cepa original KCCM11016P. Además, la espuma en el cultivo de la cepa en la que los genes NCgl0336/NCgl0717, NCgl0336/NCgl2912 o NCgl0717/NCgl2912 se inactivaron conjuntamente disminuyó aproximadamente de 10-14 % en comparación con la cepa original.

Por lo tanto, se encontró que, cuando las principales proteínas secretoras de un microorganismo del género Corynebacterium, que son innecesarias para la producción de lisina, se inactivan, la generación de espuma durante el cultivo del microorganismo puede controlarse eficazmente, por consiguiente, aumenta la producción de L-lisina.

Ejemplo 10: Construcción y evaluación de la cepa, en la que se inactivaron todas las proteínas secretoras, de la cepa productora de L-lisina KCCM11016P

Para examinar los efectos de la inactivación de todas las proteínas secretoras en la cepa productora de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, se construyó una cepa en la que las tres proteínas secretoras se inactivaron de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5, 6, 7, 8 o 9. La cepa se denominó "KCCM11016P-ANCgl0336/ANCgl0717/ANCgl2912". Se examinó la cantidad de producción de L-lisina de la cepa construida junto con la cantidad de espuma generada.

Para examinar la producción de lisina de la cepa, la cepa junto con la cepa control se cultivó de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5, 6, 7, 8 o 9. Después de completar el cultivo, la cantidad de espuma generada se midió de la misma manera que se describe en los Ejemplos 5, 6, 7, 8 o 9, y la concentración de L-lisina se midió por HPLC. Los resultados de la medición se muestran en la Tabla 6 a continuación. Los resultados en la Tabla 6 son los resultados de tres experimentos repetidos, y la producción de L-lisina se evaluó basada en el valor promedio.

Tabla 6

Como se muestra en la Tabla 6 anterior, la producción de L-lisina de la cepa en la que se inactivaron los genes NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912 aumentó aproximadamente un 7 % en comparación con la cepa original KCCM11016P. Además, la espuma en el cultivo de la cepa en la que se inactivaron los genes NCgl0336, NCgl0717 y NCgl2912 disminuyó aproximadamente un 17 % en comparación con la cepa original.

A partir de los resultados descritos anteriormente, se encontró que la inactivación de las principales proteínas secretoras en la cepa productora de L-lisina tiene el efecto de controlar la espuma que se produce en exceso durante el cultivo, que aumenta por consiguiente la capacidad de producir L-lisina junto con el crecimiento de las células. Las cepas KCCM11016P-ANCgl0336, KCCM11016P-ANCgl0717 y KCCM11016P-ANCgl2912 se denominaron "CA01-2281", "CA01-2279" y "CA01-2280", respectivamente. CA01-2279 y CA01-2280 se depositaron internacionalmente con Korean Culture Center of Microorganisms el 22 de noviembre de 2013 bajo los núms. de orden KCCM11481P (CA01-2279) y KCCM11482P (CA01-2280), respectivamente, y CA01-2281 se depositó internacionalmente con Korean Culture Center of Microorganisms el 13 de diciembre de 2013 bajo el núm. de orden KCCM11502P (CA01-2281).

Números de orden

Autoridad depositaria: Korean Culture Center of Microorganisms;

Núm. de orden: KCCM11481P;

Fecha de depósito: 22 de noviembre de 2013.

Autoridad depositaria: Korean Culture Center of Microorganisms;

Núm. de orden: KCCM11482P;

Fecha de depósito: 22 de noviembre de 2013.

Autoridad depositaría: Korean Culture Center of Microorganisms;

Núm. de orden: KCCM11502P;

Fecha de depósito: 13 de diciembre de 2013.

<110> Corporación CJ Cheiljedang

<120> Un microorganismo que ha aumentado la productividad de la L-lisina y el método de producción de la L-lisina utilizando la misma

<130> PA13-0400

<160> 18

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 365

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> PEPTIDO

<222> (1)..(365)

<223> Esterasa codificada por el gen NCgl0336

<400> 1

Met Lys Leu Leu Arg Arg lie Ala Ala Pro Ala lie Ala Leu Gly lie

1 5 10 15

Ala Met Ser Thr lie Val Thr Pro Ser Thr Ala Gly Ala Ala Glu Val

20 25 30

Thr Pro Ala Asp Val Ala Gly Asp Thr Ala Leu Ser Thr lie Ser Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Asp Glu Ala Ser Ala Pro Arg Trp Arg Ala His Val

50 55 60

Asn Ala Ala Asp Glu Arg Val Lys Glu Met Trp Ala Tyr Ser Pro Ser

65 70 75 80

Met Asp Arg Asn Val Pro Leu Val Val lie Thr Ala Asp Glu Ser Ala 85 90 95

Gly Pro Arg Pro Val lie Tyr Leu Leu Asn Gly Gly Asp Gly Gly Glu

100 105 110

Gly Ala Ala Asn Trp val Met Gln Thr Asp Val Leu Asp Phe Tyr Leu

115 120 125

Glu Lys Asn val Asn Val Val lie Pro Met Glu Gly Lys Phe Ser Tyr

130 135 140

Tyr Thr Asp Trp Val Glu Glu Asn Ala Ser Leu Gly Gly Lys Gln Met

145 150 155 160

Trp Glu Thr Phe Leu Val Lys Glu Leu Pro Gly Pro Leu Glu Glu Lys

165 170 175

Leu Asn Thr Asp Gly Gln Arg Ala lie Ala Gly Met Ser Met Ser Ala

180 185 190

Thr Thr Ser Leu Leu Phe Pro Gln His Phe Pro Gly Phe Tyr Asp Ala

195 200 205

Ala Ala Ser Phe Ser Gly Cys Ala Ala Thr Ser Ser Leu Leu Pro Trp

210 215 220

Glu Tyr Leu Lys Leu Thr Leu Asp Arg Gly Asn Ala Thr Pro Glu Gln

225 230 235 240

Met Trp Gly Pro Arg Gly Gly Glu Tyr Asn lie Tyr Asn Asp Ala Leu

245 250 255

lie Asn Ser Asp Lys Leu Arg Gly Thr Glu Leu Tyr Val Ser Asn Ala

260 265 270

Ser Gly Leu Ala Gly Glu Trp Glu Ser Val Asp Ser Pro Arg Phe Glu

275 280 285

Gly Leu Asn Gln Gln Val Gln Ser lie Ala Met Ala Glu Thr Val Val 290 295 300

Thr Gly Gly lie lie Glu Ala Ala Thr Asn Lys Cys Thr His Asp Leu

305 310 315 320

Lys Ala Lys Leu Asp Ser Ala Gly lie Pro Ala Asp Trp Asn Leu Arg

325 330 335

Pro Thr Gly Thr His Ser Trp Gly Trp Trp Gln Asp Asp Leu Arg Gly

340 345 350

Ser Trp Thr Thr Phe Ala Arg Ala Phe Glu Leu Glu Ala

355 360 365

<210>2

<211>1098

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> gen

<222> (1)..(1098)

<223> gen NCgl0336

<400>2

atgaagcttc ttcgccgcat cgctgcacca gccatcgcgc tgggaattgc gatgtccacc 60 attgtcacgc catccaccgc aggcgctgcc gaagtaaccc cagcagacgt tgctggcgat 120 actgcactat ccaccatctc cgatagtgct cctgcagatg aagcctctgc acctcgctgg 180 cgcgcacacg tcaacgcagc agacgagcgc gtcaaagaaa tgtgggcata ctccccttcc 240 atggaccgca atgtgccact ggtagttata actgccgatg agtccgcagg tcctcgtcct 300 gtgatttacc ttcttaacgg tggcgacggt ggcgaaggtg ccgctaactg ggttatgcag 360 actgacgttc tggatttcta cctagaaaag aacgttaacg ttgttattcc aatggaaggc 420 aagttttcct actacaccga ctgggtagaa gagaatgcgt ccctcggtgg caagcaaatg 480 tgggaaacct tcctggtgaa ggaacttcca ggaccattgg aagaaaagct caacactgac 540 ggtcagcgtg caattgctgg catgtccatg tccgcaacta cttccctact cttcccacaa 600 cacttcccag gcttctacga cgcagcagca tccttctcag gatgcgcagc aacctcaagc 660

ctgctcccat gggaatacct caaactcacc cttgaccgcg gcaacgcaac cccagaacaa 720 atgtggggac cacgtggtgg cgaatacaac atctacaacg acgcactgat caactccgac 780 oaoctocgcg gaoccgaoct otocgtctcc oacgcatccg gccttgctgg tgaatgggaa 040 tccgtcgaca gcccacgctt cgaaggactc aaccaacaag ttcagtccat cgcaatggca 900 gaaactgtgg taaccggcgg catcatcgaa gctgcaacca acaagtgcac ccacgacctc 960 aaggcaaaac ttgactccgc cggcatccca gccgactgga acctccgccc aaccggcacc 1020 cactcatggg gctggtggca agatgacctc cgcggatctt ggaccacctt cgctcgtgcg 1080 tttgagctag aggcctag 1098 <210>3

<211> 36

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 3

atcctctaga gtcgacgaag cctctgcacc tcgctg 36

<210> 4

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 4

tatagttcgg ttccgcgtct ccaacgcatc cggcc 35

<210> 5

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 5

cggaaccgaa ctataccacc gagggacgca ttctc 35

<210> 6

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 6

atgcctgcag gtcgacgctc aaacgcacga gcgaag 36

<210>7

<211> 261

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> PEPTIDO

<222> (1)..(261)

<223> Esterasa codificada por el gen NCgl0717

<400> 7

Met Lys Thr Glu Thr Arg Arg Ala Leu Val Phe lie Val Ala Gly Cys

1 5 10 15

Leu Ala Ala Thr Ala Leu Gly Phe Met Val Trp Gln Met Ser Ser Pro

20 25 30

Ser Arg Pro Thr Ser Asp lie Ala Thr Ser Thr Thr Thr Ser Thr Thr

35 40 45

Gln Thr Gln Ala Arg Tyr Asp Ser Pro Gly Asn Thr Glu Thr Lys Glu

50 55 60

Ala Glu Pro Asp Leu Glu Asn Gln Thr Leu Ala Pro lie Asn Thr Glu

65 70 75 80

Asp Pro Tyr Leu Pro Pro Asn Ala Phe Val Arg Pro Asp Asn Gly Arg

85 90 95

Ser Ser Gly Leu Thr Pro Ser Gly Ser Ser Pro Thr Thr Thr Ser Arg

100 105 110

Val Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Ser Ala Ser Pro Thr Gln lie Thr

115 120 125

Ser Arg Ser Asn Glu Pro Ser Glu Pro Gly Asp Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140

Thr Gln Pro Ser Ser Pro Asp Arg Pro Thr Glu Pro Thr Asn Pro Val

145 150 155 160

Asp Pro Thr Gly Pro Ser Glu Pro Thr Glu Pro Thr Asp Pro lie Glu

165 170 175

Thr Thr Asp Pro lie Glu Thr Thr Asp Pro Val Ala Pro Ser Thr Pro

180 185 190

Pro Thr Ser Asp Asp Ser Thr Ser Thr Pro Gln Pro Asp Glu Ser Asp

195 200 205

Thr Pro Pro Thr Asp Phe Val Glu Glu Pro Thr Ala Pro Leu Asn Pro 210 215 220

Asp Gln Pro Ala Gly Ser Thr Thr Asp Ala Thr Pro Asn Ala Thr Pro

225 230 235 240

Ser Ala Pro Ala ASp Thr Thr Ser Asn Ser Val Ala Asn Ser Val Glu

245 250 255

Pro Thr Ala Thr Ser

260

<210>8

<211> 786

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> gen

<222> (1)..(786)

<223> gen NCgl0717

<400> 8

atgaaaacag aaactcgacg agccctcgtc ttcatcgtcg ccggctgttt agccgccacc 60 gccctgggtt ttatggtctg gcagatgtcc agcccaagco gaccoacctc tgatattgcc 120 acgtctacta ctacgtctac cacccaaacc caggctaggt acgattcccc aggtaataca 180 gagaccaaag aggcggaacc tgacctagaa aaccaaactt tggcgcccat caacaccgaa 240 gatccatato ttccaccgaa tgcttttgtg cgtccagaca atggccgaag ctccggttta 300 accccttctg gcagttctcc aactaccacc tctcgggtga gttctccctc ctcagcagga 360 tcggcaagcc cgactcaaat cacctccagg tcaaacgagc ctagtgaacc tggtgatgag 420 tcaactgctg ctacacaacc gtcgagccca gacaggccaa ccgaacctac aaatccggta 480 gacccaactg gaccttctga acctacggaa cccaccgatc cgattgagac aaccgatccg 540 attgagacaa ccgatccggt agctccgtcc accccgccaa cgagcgatga ttcaacaagc 600 actccccaac cagatgagtc tgatacgcca cctaccgatt tcgtagagga acctactgct 660 cctctcaatc cggatcagcc agccggttca actactgatg cgacgcoaaa cgcaacacca 720 agcgcaccag ctgacacaac atccaattct gtagctaact ctgtggaacc aactgccacg 780 agctaa 786 <210>9

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 9

ccggggatcc tctagagttc gcggataaat ggg 33

<210> 10

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 10

cacgtgaaat tcaggtcgcg tggttcacct ccgaag 36

<210> 11

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 11

cttcggaggt gaaccacgcg acctgaattt cacgtg 36

<210> 12

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 12

gcaggtcgac tctagaggtc ccatgattgt tctg 34

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> PEPTIDO

<222> (1)..(107)

<223> Esterasa codificada por el gen NCgl2912

<400> 13

Met Arg Lys Leu Arg Thr Ala Ser Val Ala Leu Leu Thr Ala Gly Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Thr Ala Thr Pro Ala Met Ala Gln Ser Thr Thr Gly Ser

20 25 30

Ser Ala Ser Ser Gln Val Gly Asp Ala Leu Gly Ala Ser Asp Tyr Glu

35 40 45

Arg Asp lie Trp Gly Ser Ser Lys Asp Phe Asp Asp Val Thr Pro Phe 50 55 60

Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Tyr Thr Leu Ala Ala Thr Ala Val Ala lie

65 70 75 80

Ser Gly Leu Val Tyr Ala Asn Leu Pro Ala lie Glu Gln Ala Ala Ala

85 90 95

Gln Ala Gly lie Lys Leu Glu lie Pro Arg Tyr

100 105

<210> 14

<211> 324

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> gen

<222> (1)..(324)

<223> gen NCgl2912

<400> 14

atgcgtaaac ttcgtactgc ttccgttgca ctgctgaccg caggtgcact tgcactgacc 60 gctactcctg caatggctca gtccaccacc ggttcttctg catcttctca ggttggcgac 120 gcactcggtg ctagcgacta cgagcgcgac atctggggtt cctctaagga cttcgacgat 180 gtooccccot tcggttccgc ttggtacggc tacoccctgg ccgcooccgc ogttgctotc 240 tccggtcttg tgtacgcaaa ccttcctgca atcgagcagg ctgctgcaca ggccggcatc 300 aagctggaga tcccacgcta ctaa 324

<210> 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 15

ccggggatcc tctagagctg caagaagtgc gac 33

<210> 16

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 16

ctcgtagtcg ctagcaccta ttacgggagg tc 32

<210> 17

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 17

gacctcccgt aataggtgct agcgactacg ag 32

<210> 18

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 18

gcaggtcgac tctagacccg agctatctaa cac 33

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo productor de L-lisina del género Corynebacterium en el que al menos una proteína secretora seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7 y 13 se inactiva.

2. El microorganismo productor de L-lisina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.

3. Un método para producir L-lisina, que comprende las etapas de:

cultivar un microorganismo para producir L-lisina en el medio de cultivo o en la célula del microorganismo; y recuperar la L-lisina del medio de cultivo o la célula,

en donde el microorganismo es un microorganismo productor de L-lisina del género Corynebacterium en el que al menos una proteína secretora seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, 7 y 13 se inactiva.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.