JP6493926B2 - L−リシンの産生能が向上した微生物及びこれを用いたl−リシンの産生方法 - Google Patents
L−リシンの産生能が向上した微生物及びこれを用いたl−リシンの産生方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6493926B2 JP6493926B2 JP2016566983A JP2016566983A JP6493926B2 JP 6493926 B2 JP6493926 B2 JP 6493926B2 JP 2016566983 A JP2016566983 A JP 2016566983A JP 2016566983 A JP2016566983 A JP 2016566983A JP 6493926 B2 JP6493926 B2 JP 6493926B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lysine
- seq
- microorganism
- gene
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims description 125
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 title claims description 74
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 54
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 title claims description 50
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 109
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 44
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 39
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 37
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 26
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 description 25
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 7
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 2
- ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N calcium;3-[[(2r)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound [Ca].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- -1 linoleic acid, alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010014468 Dihydrodipicolinate Reductase Proteins 0.000 description 1
- 102100028778 Endonuclease 8-like 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102220466851 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 4 chain_V59A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100024023 Histone PARylation factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101001123824 Homo sapiens Endonuclease 8-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001047783 Homo sapiens Histone PARylation factor 1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101100004037 Saccharomyces cerevisiae (strain Kyokai no. 7 / NBRC 101557) AWA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- JGGLZQUGOKVDGS-VYTIMWRQSA-N aspartate semialdehyde Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)CO[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]4[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O4)O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O)O2)O)[C@H](CO)O1 JGGLZQUGOKVDGS-VYTIMWRQSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 235000013882 gravy Nutrition 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
この理由から、本発明者らは、コリネバクテリウム属菌株を対象として過量の気泡の発生に影響を及ぼす遺伝子を選別して、遺伝的な側面からみて気泡の発生を有効に抑えることにより、L−リシンの産生能が増加することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の他の目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を用いてL−リシンを産生する方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記コリネバクテリウム属微生物を培養してL−リシンを産生する方法を提供する。
一つの態様によれば、本発明においては、配列番号1、7、及び13のアミノ酸配列よりなる群から選ばれた少なくとも一つ以上の分泌タンパク質が不活性化されたコリネバクテリウム属微生物を提供する。
コリネバクテリウム属微生物の培養のために使用可能な培地としては、例えば、Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)に開示されている培地が挙げられる。
培地中において使用可能な糖源としては、葡萄糖、サッカロース、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツオイルなどの油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセロール、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆・麦及びよう素又は無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源もまた、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
使用可能なリン源としては、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又はこれに対応するナトリウムを含有する塩が挙げられる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム又は硫酸鉄などの金属塩を含有しなければならない。最後に、前記物質に加えて、 アミノ酸及びビタミンなどの必須性物質が使用可能である。なお、培養培地に適した前駆体が使用可能である。前記原料は、培養過程において培養物に適切な方式により回分式又は連続式により添加可能である。
前記微生物の培養中に、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの基礎化合物又はリン酸又は硫酸などの酸化合物を適切な方式を用いて培養物のpHを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡の生成を抑えてもよい。好気状態を保つために、培養物内に酸素又は酸素含有ガス(例えば、空気)を注入する。培養物の温度は、通常、20℃〜45℃、好ましくは、25℃〜40℃である。培養時間は、所望のL−アミノ酸の生成量が得られるまで持続可能であるが、好ましくは、10〜160時間である。
本発明の方法において、培養は、バッチ工程、注入バッチ及び繰り返し注入バッチ工程などの連続式又は回分式により行われてもよい。このような培養方法は、当業界において周知であり、任意の方法が使用可能である。
本実施例においては、気泡の発生原因となる分泌タンパク質を選別するために、下記の方法を用いて実験を行った。
まず、コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016P(前記微生物は、KFCC10881で公開されていて、ブタペスト条約下である国際寄託機関に再寄託されてKCCM11016Pという寄託番号が与えられた。大韓民国登録特許第10−0159812号)菌株を1Lの発酵槽を用いて培養した後、発酵過程において生成された気泡のみを分離して15mlの試験管に移して濃縮させた。
気泡濃縮試料中に含まれているタンパク質の同定のために、界面活性剤入り適量の染色剤を試料に混合した後、8%のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、電気泳動の終わったドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルは、クマシーブルー染色法を用いて染色した。次いで、染色されたタンパク質バンド部位を切開し、トリプシンを処理してペプチドを確保し、LC−MS/MS方法を用いて確保されたペプチドのアミノ酸配列を分析した。
分析されたペプチドを米国国立生物情報センター(NCBI)が提供するブラスト検索を通じてコリネバクテリウム属微生物にある遺伝子として同定した。同定されたペプチドの内から相対的に検出量が最も多い3種を選んで当該タンパク質の遺伝子を最終的に選り抜き、選り抜かれた遺伝子は、NCBI許可番号NCgl0336、NCgl0717及びNCgl2912である。
コリネバクテリウム染色体上においてNCgl0336遺伝子を不活性化させる組換えプラスミドの製作のために、米国国立保健院の遺伝子銀行(NIH Genbank)に報告された塩基配列に基づいて、NCgl0336の配列番号1のアミノ酸及び配列番号2のヌクレオチドの配列を確保した。NCgl0336のオープンリーディングフレームが内部的に失われた遺伝子断片を製造するために、前記配列番号2に基づいてそれぞれ配列番号3〜6のプライマーを製作した。
配列番号4:5'−TATAGTTCGGTTCCGCGTCTCCAACGCATCCGGCC−3'
配列番号5:5'−CGGAACCGAACTATACCACCGAGGGACGCATTCTC−3'
配列番号6:5'−atgcctgcaggtcgacGCTCAAACGCACGAGCGAAG−3'
その結果、342bp及び315bpのNCgl0336遺伝子部位が含まれている2対のDNA断片である、NCgl0336−A及びNCgl0336−Bを得た。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅された前記DNA断片は、インフュージョンクローニングキット(インビトロジェン社製)を用いてpDZプラスミド(大韓民国登録特許第10−0924065号)に接合した後、大腸菌DH5αに形質転換し、25mg/Lのカナマイシンが含まれているLB固体培地に塗抹した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて目的とする遺伝子が挿入されたプラスミドに形質転換されたコロニーを選別した後、通常的に知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得、このプラスミドをpDZ−ΔNCgl0336と命名した。pDZ−ΔNCgl0336は、NCgl0336の遺伝子503bpが失われていた。
コリネバクテリウム染色体上においてNCgl0717遺伝子を不活性化させる組換えプラスミドの製作のために、米国国立保健院の遺伝子銀行(NIH Genbank)に報告された塩基配列に基づいて、NCgl0717の配列番号7のアミノ酸及び配列番号8のヌクレオチドの配列を確保し、NCgl0717のオープンリーディングフレームが内部的に失われた遺伝子断片を製造するために、前記配列番号8に基づいてそれぞれ配列番号9〜12のプライマーを製作した。
配列番号10:5'−CACGTGAAATTCAGGTCGCGTGGTTCACCTCCGAAG−3'
配列番号11:5'−CTTCGGAGGTGAACCACGCGACCTGAATTTCACGTG−3'
配列番号12:5'−GCAGGTCGACTCTAGAGGTCCCATGATTGTTCTG−3'
その結果、493bp及び491bpのNCgl0717遺伝子部位が含まれている2対のDNA断片である、NCgl0717−A及びNCgl0717−Bを得た。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅された前記DNA断片は、インフュージョンクローニングキット(インビトロジェン社製)を用いてpDZプラスミドに接合した後、大腸菌DH5αに形質転換し、25mg/Lのカナマイシンが含まれているLB固体培地に塗抹した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて目的とする遺伝子が挿入されたプラスミドに形質転換されたコロニーを選別した後、通常的に知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得、このプラスミドをpDZ−ΔNCgl0717と命名した。pDZ−ΔNCgl0717は、NCgl0717の遺伝子786bpが失われていた。
コリネバクテリウム染色体上においてNCgl2912遺伝子を不活性化させる組換えプラスミドの製作のために、米国国立保健院の遺伝子銀行(NIH Genbank)に報告された塩基配列に基づいて、NCgl2912の配列番号13のアミノ酸及び配列番号14のヌクレオチドの配列を確保し、NCgl2912のオープンリーディングフレームが内部的に失われた遺伝子断片を製造するために、前記配列番号14に基づいてそれぞれ配列番号15〜18のプライマーを製作した。
配列番号16:5'−CTCGTAGTCGCTAGCACCTATTACGGGAGGTC−3'
配列番号17:5'−GACCTCCCGTAATAGGTGCTAGCGACTACGAG−3'
配列番号18:5'−GCAGGTCGACTCTAGACCCGAGCTATCTAACAC−3'
その結果、444bp及び636bpのNCgl2912遺伝子部位が含まれている2対のDNA断片である、NCgl2912−A及びNCgl2912−Bを得た。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅された前記DNA断片は、インフュージョンクローニングキット(インビトロジェン社製)を用いてpDZプラスミドに接合した後、大腸菌DH5αに形質転換し、25mg/Lのカナマイシンが含まれているLB固体培地に塗抹した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて目的とする遺伝子が挿入されたプラスミドに形質転換されたコロニーを選別した後、通常的に知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得、このプラスミドをpDZ−ΔNCgl2912と命名した。pDZ−ΔNCgl2912は、NCgl2912の遺伝子128bpが失われていた。
前記実施例2、3及び4において製作した3種の組換えプラスミド(pDZ−ΔNCgl0336、pDZ−ΔNCgl0717及びpDZ−ΔNCgl2912)を電気パルス法を用いてコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pにそれぞれ形質転換し、相同組換えにより染色体上において目的遺伝子が不活性化された菌株をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法を用いて製造し、それぞれKCCM11016P−ΔNCgl0336、KCCM11016P−ΔNCgl0717、KCCM11016P−ΔNCgl2912と命名した。
前記3種の菌株及び対照群を下記の種培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに接種し、30℃において20時間かけて200rpmにて振とう培養した。次いで、1mlの種培養液を下記の産生培地24mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに接種し、37℃において96時間かけて200rpmにて振とう培養した。前記種培地及び産生培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
葡萄糖20g、(NH4)2SO410g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、ヨウ素1.5g、KH2PO44g、K2HPO48g、MgSO4・7H2O0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl1000μg、カリシウム−パントテン酸2000μg、ニコチンアミド2000μg(蒸留水1lを基準とする)
<産生培地(pH7.0)>
葡萄糖100g、(NH4)2SO440g、大豆タンパク質2.5g、コーンスティープ固形分5g、ヨウ素3g、K2HPO41g、MgSO4・7H2O0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、カリシウム−パントテン酸2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO330g(蒸留水1lを基準とする)
培養を終えた後、培養液をマスシリンダに移して生成された気泡の高さを測定し、HPLCを用いて分析したL−リシンの濃度を下記表1に示す。表1の結果は、3回繰り返し実験した結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。
したがって、コリネバクテリウム属微生物においてリシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質を不活性化させることにより、培養中に発生する気泡が有効に制御することができ、これにより、L−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
リシン生合成経路が強化されたL−リシンの産生菌株コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM10770P(大韓民国登録特許第10−0924065号)において分泌タンパク質の不活性化効果が前記実施例5の実験結果と略同じであるか否かを比較するために、3種の分泌タンパク質が不活性化された菌株を前記実施例5の方法と同様にして製造して、KCCM10770P−ΔNCgl0336、KCCM10770P−ΔNCgl0717、KCCM10770P−ΔNCgl2912と命名し、L−リシンの産生能とともに気泡の発生量を比較した。
前記菌株のリシンの産生能を比較するために、各対照群とともに実施例6の方法と同様にして培養し、培養を終えた後、気泡の発生量は実施例6の方法と同様にして測定し、HPLCを用いて分析したL−リシンの濃度は、下記表2に示す。表2の結果は、3回繰り返し実験結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。
したがって、コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM10770P(大韓民国登録特許第10−0924065号)においても、前記実施例6と同様に、リシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質を不活性化させることにより、培養中に発生する気泡を有効に制御することができ、これにより、L−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
人工変異法により製作されたコリネバクテリウム・グルタミクムL−リシンの産生菌株KCCM11347P(前記微生物は、KFCC10750で公開されていて、ブタペスト条約下の国際寄託機関に再寄託されて、KCCM11347Pが与えられた。大韓民国登録特許第10−0073610号)においても分泌タンパク質の不活性化の効果を確認するために、3種の分泌タンパク質が不活性化された菌株を前記実施例5、6の方法と同様にして製造してKCCM11347P−ΔNCgl0336、KCCM11347P−ΔNCgl0717、KCCM11347P−ΔNCgl2912と命名し、L−リシンの産生能とともに気泡の発生量を比較した。
前記菌株のリシンの産生能を比較するために、各対照群とともに実施例5、6の方法と同様にして培養し、培養を終えた後、気泡の発生量は実施例5、6の方法と同様にして測定し、HPLCを用いて分析したL−リシンの濃度は、下記表3に示す。表3の結果は、3回繰り返し実験結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。
したがって、コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11347P(大韓民国登録特許第94−0001307号)においても前記実施例5、6と同様にリシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質を不活性化させることにより、培養中に発生する気泡を有効に制御することができ、これにより、L−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
野生株に3種の変異[pyc(P458S)、hom(V59A)、lysC(T311I)]を組み込んでL−リシンの産生能を有するコリネバクテリウム・グルタミクムCJ3P(Binder et al.Genome Biology 2012,13:R40)においても前記実施例5、6、7と同様に分泌タンパク質の不活性化の効果を調べるために、3種の分泌タンパク質が不活性化された菌株を前記実施例5、6、7の方法と同様にして製造してCJ3P−ΔNCgl0336、CJ3P−ΔNCgl0717、CJ3P−ΔNCgl2912と命名し、L−リシンの産生能とともに気泡の発生量を比較した。
前記菌株のリシンの産生能を比較するために、各対照群とともに実施例5、6、7の方法と同様にして培養し、培養を終えた後、気泡の発生量は実施例5、6、7の方法と同様にして測定し、HPLCを用いて分析したL−リシンの濃度は、下記表4に示す。表4の結果は、3回繰り返し実験結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。
したがって、コリネバクテリウム・グルタミクムCJ3Pにおいても、前記実施例5、6、7の実験結果と同様に、リシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質を不活性化させることにより、培養中に発生する気泡を有効に制御することができ、これにより、L−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
L−リシンの産生菌株コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pにおける分泌タンパク質の同時不活性化による効果を確認するために、分泌タンパク質遺伝子が同時に不活性化された3種の菌株を前記実施例5、6、7、8の方法と同様にして製造して、各遺伝子を組み合わせて不活性化させた菌株をKCCM11016P−ΔNCgl0336/ΔNCgl0717、KCCM11016P−ΔNCgl0336/ΔNCgl2912、KCCM11016P−ΔNCgl0717/ΔNCgl2912と命名し、L−リシンの産生能とともに気泡の発生量を比較した。
前記菌株のリシンの産生能を比較するために、対照群とともに実施例5、6、7、8の方法と同様にして培養し、培養を終えた後、気泡の発生量は、実施例5、6、7、8の方法と同様にして測定し、HPLCを用いて分析したL−リシンの濃度は、下記表5に示す。表5の結果は、3回繰り返し実験結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。
したがって、コリネバクテリウム属微生物においてリシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質を同時に不活性化させることにより、培養中に発生する気泡を有効に制御することができ、これにより、L−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
L−リシンの産生菌株コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pにおける分泌タンパク質の不活性化による統合効果を確認するために、3種の分泌タンパク質がいずれも不活性化された菌株を前記実施例5、6、7、8、9の方法と同様にして選別してKCCM11016P−ΔNCgl0336/ΔNCgl0717/ΔNCgl2912と命名し、L−リシンの産生能とともに気泡の発生量を比較した。
前記菌株のリシンの産生能を比較するために、対照群とともに実施例5、6、7、8、9の方法と同様にして培養し、培養を終えた後、気泡の発生量は、実施例5、6、7、8、9の方法と同様にして測定し、HPLCを用いて分析したL−リシンの濃度は、下記表6に示す。表6の結果は、3回繰り返し実験結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。
したがって、コリネバクテリウム属微生物においてリシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質をいずれも不活性化させることにより、培養中に発生する気泡を有効に制御することができ、これにより、L−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
上記の結果から、L−リシンの産生菌株における主たる分泌タンパク質の不活性化は、発酵中に過剰に生成される気泡を制御することにより、菌体の生長とともにL−リシンの産生能を増加させるのに効果があるということを確認し、前記菌株、KCCM11016P−ΔNCgl0336、KCCM11016P−ΔNCgl0717、及びKCCM11016P−ΔNCgl2912をそれぞれCA01−2281、CA01−2279、及びCA01−2280と命名し、CA01−2279及びCA01−2280は2013年11月22日付けで、CA01−2281は2013年12月13日付けで韓国微生物保存センター(KCCM)に国際寄託してそれぞれKCCM11481P(CA01−2279)、KCCM11482P(CA01−2280)、及びKCCM11502P(CA01−2281)という寄託番号が与えられた。
Claims (3)
- 配列番号7及び13のアミノ酸配列よりなる群から選ばれた少なくとも一つ以上の分泌タンパク質が不活性化された、L−リシンを産生するコリネバクテリウム・グルタミクム。
- 微生物を培養して培養物又は細胞中にL−リシンを産生するステップと、培養物からL−リシンを回収するステップと、を含む、L−リシンを産生する方法であって、
該微生物が、 配列番号1、7及び13のアミノ酸配列よりなる群から選ばれた少なくとも一つ以上の分泌タンパク質が不活性化された、L−リシン産生能を有するコリネバクテリウム属である、方法。 - L−リシンを産生するための、L−リシンを産生するコリネバクテリウム属微生物の使用であって、ここで微生物は、配列番号1、7及び13のアミノ酸配列よりなる群から選ばれた少なくとも一つ以上の不活性化された分泌タンパク質を含む、使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2014-0055102 | 2014-05-08 | ||
KR1020140055102A KR101530819B1 (ko) | 2014-05-08 | 2014-05-08 | L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 |
PCT/KR2015/004588 WO2015170907A1 (ko) | 2014-05-08 | 2015-05-08 | L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017514510A JP2017514510A (ja) | 2017-06-08 |
JP6493926B2 true JP6493926B2 (ja) | 2019-04-03 |
Family
ID=53519596
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016566983A Active JP6493926B2 (ja) | 2014-05-08 | 2015-05-08 | L−リシンの産生能が向上した微生物及びこれを用いたl−リシンの産生方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10208325B2 (ja) |
EP (1) | EP3141597B1 (ja) |
JP (1) | JP6493926B2 (ja) |
KR (1) | KR101530819B1 (ja) |
CN (1) | CN106414715B (ja) |
BR (1) | BR112016025999B1 (ja) |
ES (1) | ES2796960T3 (ja) |
HU (1) | HUE048901T2 (ja) |
MY (1) | MY175423A (ja) |
PL (1) | PL3141597T3 (ja) |
RU (1) | RU2663135C2 (ja) |
WO (1) | WO2015170907A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101740807B1 (ko) | 2015-08-27 | 2017-05-26 | 씨제이제일제당 (주) | L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 |
KR101766964B1 (ko) | 2015-08-27 | 2017-08-09 | 씨제이제일제당 (주) | L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 |
EP3456833A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-20 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
KR101947945B1 (ko) * | 2018-01-25 | 2019-02-13 | 씨제이제일제당 (주) | L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법 |
RU2019128538A (ru) | 2018-09-26 | 2021-03-11 | Эвоник Оперейшенс ГмбХ | Способ ферментативного получения l-лизина |
CN112063571B (zh) * | 2020-08-14 | 2022-05-06 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 高产l-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用 |
CN113801211B (zh) * | 2021-08-17 | 2023-07-18 | 华南理工大学 | 谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl0717及其表面展示系统和构建方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6962989B1 (en) * | 1999-07-08 | 2005-11-08 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding novel proteins |
FI108863B (fi) * | 1999-08-20 | 2002-04-15 | Valtion Teknillinen | Parannettu biotekninen tuotantomenetelmä |
JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
US20040063184A1 (en) | 2002-09-26 | 2004-04-01 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
KR100789270B1 (ko) | 2005-11-30 | 2008-01-02 | 씨제이 주식회사 | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용하여 l-라이신을 생산하는 방법 |
KR100838038B1 (ko) * | 2006-12-29 | 2008-06-12 | 씨제이제일제당 (주) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 l-라이신 생산 방법 |
KR100838035B1 (ko) * | 2006-12-29 | 2008-06-12 | 씨제이제일제당 (주) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 l-라이신 생산 방법 |
CN102753692A (zh) * | 2010-06-15 | 2012-10-24 | 白光产业株式会社 | 使用微生物生产天冬氨酸族氨基酸的方法 |
KR101285945B1 (ko) | 2011-05-23 | 2013-07-12 | 씨제이제일제당 (주) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 제조방법 |
-
2014
- 2014-05-08 KR KR1020140055102A patent/KR101530819B1/ko active IP Right Grant
-
2015
- 2015-05-08 CN CN201580024138.8A patent/CN106414715B/zh active Active
- 2015-05-08 BR BR112016025999-8A patent/BR112016025999B1/pt active IP Right Grant
- 2015-05-08 MY MYPI2016001955A patent/MY175423A/en unknown
- 2015-05-08 RU RU2016147962A patent/RU2663135C2/ru active
- 2015-05-08 PL PL15789069T patent/PL3141597T3/pl unknown
- 2015-05-08 US US15/309,387 patent/US10208325B2/en active Active
- 2015-05-08 EP EP15789069.0A patent/EP3141597B1/en active Active
- 2015-05-08 HU HUE15789069A patent/HUE048901T2/hu unknown
- 2015-05-08 WO PCT/KR2015/004588 patent/WO2015170907A1/ko active Application Filing
- 2015-05-08 ES ES15789069T patent/ES2796960T3/es active Active
- 2015-05-08 JP JP2016566983A patent/JP6493926B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HUE048901T2 (hu) | 2020-08-28 |
US20170204439A1 (en) | 2017-07-20 |
BR112016025999A2 (pt) | 2018-02-20 |
PL3141597T3 (pl) | 2020-11-02 |
RU2663135C2 (ru) | 2018-08-01 |
BR112016025999B1 (pt) | 2022-05-24 |
WO2015170907A1 (ko) | 2015-11-12 |
US10208325B2 (en) | 2019-02-19 |
CN106414715B (zh) | 2020-07-24 |
RU2016147962A (ru) | 2018-06-09 |
KR101530819B1 (ko) | 2015-06-22 |
ES2796960T3 (es) | 2020-11-30 |
EP3141597A4 (en) | 2017-12-13 |
MY175423A (en) | 2020-06-25 |
EP3141597B1 (en) | 2020-04-08 |
CN106414715A (zh) | 2017-02-15 |
EP3141597A1 (en) | 2017-03-15 |
JP2017514510A (ja) | 2017-06-08 |
RU2016147962A3 (ja) | 2018-06-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6493926B2 (ja) | L−リシンの産生能が向上した微生物及びこれを用いたl−リシンの産生方法 | |
JP6359037B2 (ja) | L−バリン産生能が向上した菌株及びこれを用いたl−バリンの産生方法 | |
KR101776375B1 (ko) | 피루브산 디하이드로게나아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법 | |
JP6785303B2 (ja) | L−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いてl−イソロイシンを生産する方法 | |
JP6750005B2 (ja) | L−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたl−リジン生産方法 | |
RU2667425C2 (ru) | Микроорганизм Corynebacterium sp. с повышенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с его помощью | |
RU2651505C1 (ru) | Микроорганизм Corynebacterium с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с его помощью | |
RU2683551C1 (ru) | Микроорганизм, обладающий продуктивностью по L-лизину, и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма | |
JP6860565B2 (ja) | L−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたl−リジン生産方法 | |
KR101640711B1 (ko) | 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 | |
JP2016523543A (ja) | L−リジン生産能が向上した微生物、及びそれを利用してl−リジンを生産する方法 | |
JP2019030316A (ja) | L−リシン生産能を有する微生物及びそれを用いたl−リシンの生産方法 | |
JP6859437B2 (ja) | L‐リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたl‐リジンの生産方法 | |
JP7286758B2 (ja) | α-グルコシダーゼの活性が強化されたL-アミノ酸を生産する微生物及びそれを用いたL-アミノ酸生産方法 | |
JP2024509290A (ja) | L-リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたl-リジンの生産方法 | |
JP7475408B2 (ja) | L-アルギニンまたはl-シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたl-アルギニンまたはl-シトルリンの生産方法 | |
JP2024515389A (ja) | L-リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたl-リシンの生産方法 | |
JP2024511329A (ja) | L-リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたl-リシン生産方法 | |
KR20220126610A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 | |
KR20230053351A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170906 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171201 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180104 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180726 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181024 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190212 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190227 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6493926 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |