JP2024511329A - Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたｌ－リシン生産方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたＬ－リシン生産方法に関し、前記変異株は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現を増加又は強化することにより、親株に比べてＬ－リシンの生産収率を向上させることができる。【選択図】図３
Description
本発明は、Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたＬ－リシン生産方法に関する。
Ｌ－リシンは、ヒトや動物の体内で合成されない必須アミノ酸であるので外部から供給されなければならず、一般に細菌や酵母などの微生物を用いた発酵により生産される。Ｌ－リシンの生産には、自然状態で得られた野生型菌株や、そのＬ－リシン生産能が向上するように改変された変異株が用いられる。最近は、Ｌ－リシンの生産効率を改善するために、Ｌ－アミノ酸及びその他の有用物質の生産に多く用いられる大腸菌、コリネバクテリウムなどの微生物を対象に遺伝子組換え技術を適用することにより、優れたＬ－リシン生産能を有する様々な組換え菌株又は変異株及びそれらを用いたＬ－リシン生産方法が開発されている。
特許文献１及び２によれば、Ｌ－リシンの生産に関与する酵素を含むタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列又はアミノ酸配列を変更してその遺伝子の発現を増加させるか、不要な遺伝子を欠失させることにより、Ｌ－リシン生産能を向上させることができる。また、特許文献３には、Ｌ－リシンの生産に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させるために、遺伝子の既存のプロモーターを活性の強いプロモーターに変更する方法が開示されている。
このように、Ｌ－リシン生産能を向上させる様々な方法が開発されているが、Ｌ－リシンの生産に直接、間接的に関与する酵素、転写因子、輸送タンパク質などのタンパク質の種類が数十種に及ぶので、このようなタンパク質の活性変化によりＬ－リシン生産能が向上するか否かに関して依然として多くの研究が求められている現状である。
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本発明は、Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）変異株を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記変異株を用いたＬ－リシン生産方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株を用いてＬ－リシン生産能が向上した新たな変異株を開発すべく研究を重ねた結果、Ｌ－リシン生合成経路の最後のステップに作用するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするｌｙｓＡ遺伝子のプロモーター中の特定位置の塩基配列を置換すると、Ｌ－リシン生産量が増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の一態様は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性が強化されてＬ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を提供する。
本発明における「ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate decarboxylase）」とは、Ｌ－リシン生合成経路の最後のステップにおいて、メソ－ジアミノヘプタンジオアート（meso-diaminoheptanedioate, mDAP）の炭素結合を分解して二酸化炭素とＬ－リシンを生成する反応を触媒する酵素を意味する。
本発明の一具体例によれば、前記ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼは、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属菌株に由来するものであってもよい。具体的には、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・スラナレアエ（Corynebacterium suranareeae）、コリネバクテリウム・ルブリカンティス（Corynebacterium lubricantis）、コリネバクテリウム・ドサネンス（Corynebacterium doosanense）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・ウテレキ（Corynebacterium uterequi）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・パカエンセ（Corynebacterium pacaense）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ヒュミレデュセンス（Corynebacterium humireducens）、コリネバクテリウム・マリヌム（Corynebacterium marinum）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・スフェニスコルム（Corynebacterium spheniscorum）、コリネバクテリウム・フレイブルゲンス（Corynebacterium freiburgense）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・カニス（Corynebacterium canis）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・レナーレ（Corynebacterium renale）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウム・カスピウム（Corynebacterium caspium）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）、コリネバクテリウム・シュードペラーギ（Corynebacterium pseudopelargi）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であるが、これらに限定されるものではない。
本発明における「活性の強化」とは、目的とする酵素、転写因子、輸送タンパク質などのタンパク質をコードする遺伝子の発現を新たに導入又は増大することにより、野生型菌株又は改変前の菌株に比べて発現量を増加させることを意味する。このような活性の強化には、遺伝子をコードするヌクレオチドの置換、挿入、欠失又はそれらの組み合わせにより本来の微生物が有するタンパク質の活性よりタンパク質自体の活性が向上することや、それをコードする遺伝子の発現の増加や翻訳の増加などにより細胞内で全体的な酵素活性の程度が野生型菌株又は改変前の菌株に比べて上昇することや、それらの組み合わせが含まれる。
本発明の一具体例によれば、前記ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性強化は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターに位置特異的変異を誘発することであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターは、配列番号１の塩基配列で表されるものであってもよい。
本発明における「プロモーター」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写を開始し、ＲＮＡポリメラーゼ（polymerase）に対する結合部位を含み、遺伝子の転写を調節するＤＮＡの特定部位を意味し、一般に転写開始点より上流（upstream）に位置する。原核生物におけるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合する転写開始点付近の部位と定義され、一般に転写開始点の上流の－１０領域及び－３５領域に位置する塩基対が、離れた２つの短い塩基配列で構成される。本発明におけるプロモーター変異は、野生型プロモーターに比べて活性が向上するように改良するものであり、転写開始点の上流に位置するプロモーター領域内で変異を誘発することにより、下流（downstream）に位置する遺伝子の発現を増加させることができる。
本発明の一具体例によれば、前記ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性強化は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーター配列中の転写開始点の上流の－２５～－１０領域の少なくとも１つの塩基が置換されることであってもよい。
より具体的には、本発明におけるプロモーター変異は、－２５～－１０領域の少なくとも１つの塩基、好ましくは－２０～－１５領域、－１９～－１６領域、又は－１８及び－１７領域の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの塩基が連続的又は非連続的に置換されることであってもよい。
本発明の一実施例によれば、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするｌｙｓＡ遺伝子は、アルギニルｔＲＮＡシンターゼ（arginyl-tRNA synthetase）をコードするａｒｇＳ遺伝子とオペロン（operon）を構成し、ａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンは、１つのプロモーターにより調節される。よって、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーター配列において－１７及び－１８領域の塩基配列をＣＧからＣＴに置換することにより、ｌｙｓＡ遺伝子の新たなプロモーター配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を得た。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号２の塩基配列で表されるｌｙｓＡ遺伝子の変異したプロモーター配列を含むものであってもよい。
また、本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーター配列において－１７及び－１８領域の塩基配列をＣＧからＧＡに置換することにより、ｌｙｓＡ遺伝子の新たなプロモーター配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を得た。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号３の塩基配列で表されるｌｙｓＡ遺伝子の変異したプロモーター配列を含むものであってもよい。
本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーター配列において－１７及び－１８領域の塩基配列をＣＧからＧＴに置換することにより、ｌｙｓＡ遺伝子の新たなプロモーター配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を得た。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号４の塩基配列で表されるｌｙｓＡ遺伝子の変異したプロモーター配列を含むものであってもよい。
本発明における「生産能が向上した」ものとは、親株に比べてＬ－リシンの生産性が向上したものを意味する。前記親株とは、変異の対象となる野生型又は変異株を意味し、直接変異の対象となるものや、組換えベクターなどにより形質転換される対象となるものが含まれる。本発明において、親株は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株、又は野生型から変異した菌株であってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記親株は、リシンの生産に関与する遺伝子（例えば、ｌｙｓＣ、ｚｗｆ及びｈｏｍ遺伝子）の配列に変異が誘発された変異株であって、韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms）に２０２１年４月２日付けで受託番号ＫＣＣＭ１２９６９Ｐとして寄託したコリネバクテリウム・グルタミカム菌株（以下「コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株」という）であってもよい。
本発明の一実施例によれば、前記Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするｌｙｓＡ遺伝子のプロモーター変異を含むことにより、親株より向上したＬ－リシン生産能を示し、特に親株に比べてＬ－リシン生産量が２％以上、具体的には２～４０％、より具体的には３～３０％増加するので、菌株培養液１リットル当たり６０～８０ｇ、好ましくは６５～７５ｇのＬ－リシンを生産することができる。
本発明の一具体例によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、親株にジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーター配列が一部置換された変異体を含む組換えベクターにより実現される。
本発明における「一部」とは、塩基配列又はポリヌクレオチド配列の全部ではないことを意味し、１～３００個、好ましくは１～１００個、より好ましくは１～５０個であるが、これらに限定されるものではない。
本発明における「変異体」とは、Ｌ－リシンの生合成に関与するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター配列中の－２５～－１０領域の少なくとも１つの塩基が置換されたプロモーター変異体を意味する。
本発明の一具体例によれば、前記ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター配列中の－１７及び－１８領域の塩基配列がＣＴに置換された変異体は配列番号２の塩基配列を有するものであってもよく、ＧＡに置換された変異体は配列番号３の塩基配列を有するものであってもよく、ＧＴに置換された変異体は配列番号４の塩基配列を有するものであってもよい。
本発明における「ベクター」とは、好適な宿主細胞において標的タンパク質を発現する発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された（operably linked）必須の調節因子を含む遺伝子構築物を意味する。ここで、「作動可能に連結された」ものとは、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに機能的に結合されて遺伝子発現を可能にする方法により連結されたものを意味し、「調節因子」には、転写を行うためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。このようなベクターには、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明における「組換えベクター」は、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主細胞のゲノムに関係なく複製されるか、又はゲノム自体に組み込まれる。ここで、前記「好適な宿主細胞」は、ベクターが複製可能なものであって、複製が開始される特定塩基配列である複製起点を含むものであってもよい。
前記形質転換は、宿主細胞に応じて好適なベクター導入技術を選択することにより、目的とする遺伝子を宿主細胞内で発現させることができる。例えば、ベクター導入は、エレクトロポレーション（electroporation）、熱ショック（heat-shock）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法又はそれらの組み合わせにより行うことができる。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。
前記宿主細胞には、生体内又は試験管内で本発明の組換えベクター又はポリヌクレオチドでトランスフェクション、形質転換又は感染された細胞が含まれる。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞又は組換え微生物である。
また、本発明による組換えベクターは、選択マーカー（selection marker）を含んでもよい。前記選択マーカーはベクターで形質転換された形質転換体（宿主細胞）を選択するためのものであり、前記選択マーカーで処理した培地では選択マーカーを発現する細胞のみ生存するので、形質転換された細胞を選択することができる。前記選択マーカーの代表的な例としては、カナマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコールなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の形質転換用組換えベクターに挿入された遺伝子は、相同組換え交差によりコリネバクテリウム属微生物などの宿主細胞内に置換される。
本発明の一具体例によれば、前記宿主細胞は、コリネバクテリウム属菌株であってもよく、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株であってもよい。
また、本発明の他の態様は、ａ）前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株を培地で培養するステップと、ｂ）前記変異株又は変異株を培養した培地からＬ－リシンを回収するステップとを含むＬ－リシン生産方法を提供する。
前記培養は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができ、通常の技術者であれば培地及び培養条件を容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培地は液体培地であるが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば回分培養（batch culture）、連続培養（continuous culture）、流加培養（fed-batch culture）又はその組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、前記培地は、好適な方法で特定菌株の要件を満たすものでなければならず、通常の技術者により適宜変更されるものである。コリネバクテリウム属菌株の培養培地は、公知の文献（非特許文献１）に開示されているが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、培地に様々な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含んでもよい。用いることのできる炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできるが、これらに限定されるものではない。用いることのできる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、黄粉及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源も、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできるが、これらに限定されるものではない。用いることのできるリン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、又はそれらに相当するナトリウム含有塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム、硫酸鉄などの金属塩を含有してもよいが、これらに限定されるものではない。その他に、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に好適な前駆体が用いられてもよい。前記培地又は個別成分は、培養過程において培養液に好適な方法でバッチ毎に又は継続して添加されるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を微生物培養液に好適な方法で添加して培養液のｐＨを調整してもよい。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。さらに、培養液の好気状態を維持するために、培養液中に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。培養液の温度は、通常２０℃～４５℃、例えば２５℃～４０℃である。培養期間は、有用物質の所望の生産量が得られるまで続けられ、例えば１０～１６０時間であってもよい。
本発明の一具体例によれば、前述したように培養した変異株及び変異株を培養した培地からＬ－リシンを回収するステップは、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地から生産されたＬ－リシンを収集又は回収するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性及びサイズ排除）などの方法が用いられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、リシンを回収するステップは、培養培地を低速で遠心分離することによりバイオマスを除去し、得られた上清をイオン交換クロマトグラフィーにより分離するものであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記Ｌ－リシンを回収するステップは、Ｌ－リシンを精製する工程を含んでもよい。
本発明によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現を増加又は強化することにより、親株に比べてＬ－リシンの生産収率を向上させることができる。
以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの説明は本発明の理解を助けるために例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の作製
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を作製するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株及びＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ（HIT Competent cellsTM, Cat No. RH618）を用いた。
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を作製するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株及びＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ（HIT Competent cellsTM, Cat No. RH618）を用いた。
前記コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株は、蒸留水１Ｌにグルコース５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ウレア（urea）１．０ｇ、ポリペプトン１０．０ｇ及びビーフ（beef）抽出物５．０ｇの組成のＣＭ－ｂｒｏｔｈ培地（ｐＨ６．８）において温度３０℃で培養した。
前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａは、蒸留水１Ｌにトリプトン１０．０ｇ、ＮａＣｌ １０．０ｇ及び酵母抽出物５．０ｇの組成のＬＢ培地において温度３７℃で培養した。
抗生剤カナマイシン（kanamycin）及びストレプトマイシン（streptomycin）は、シグマ（Sigma）社の製品を用いた。ｔＤＮＡシーケンシング分析は、マクロジェン（株）に依頼して分析した。
１－１．組換えベクターの作製
菌株のリシン生産性を向上させるために、リシン生合成経路の最後のステップに作用するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの強化を導入した。本実施例において用いた方法は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするｌｙｓＡ遺伝子の発現を増加させるために、ａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーターに特異的な変異を誘発するものであった。ａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーターの－１７及び－１８領域の塩基配列をＣＧからＣＴに置換し、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムにおけるａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンの中央を中心として左アーム５１０ｂｐ領域と右アーム４８０ｂｐ領域をＰＣＲで増幅し、オーバーラップＰＣＲ（overlap PCR）法で連結し、その後組換えベクターであるｐＣＧＩ（非特許文献２参照）にクローニングした。前記プラスミドをｐＣＧＩ（Ｐｍ１－ａｒｇＳ＋ｌｙｓＡ）と命名した（図１参照）。前記プラスミドを作製するために、各遺伝子断片の増幅に表１のプライマーを用いた。
菌株のリシン生産性を向上させるために、リシン生合成経路の最後のステップに作用するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの強化を導入した。本実施例において用いた方法は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするｌｙｓＡ遺伝子の発現を増加させるために、ａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーターに特異的な変異を誘発するものであった。ａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーターの－１７及び－１８領域の塩基配列をＣＧからＣＴに置換し、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムにおけるａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンの中央を中心として左アーム５１０ｂｐ領域と右アーム４８０ｂｐ領域をＰＣＲで増幅し、オーバーラップＰＣＲ（overlap PCR）法で連結し、その後組換えベクターであるｐＣＧＩ（非特許文献２参照）にクローニングした。前記プラスミドをｐＣＧＩ（Ｐｍ１－ａｒｇＳ＋ｌｙｓＡ）と命名した（図１参照）。前記プラスミドを作製するために、各遺伝子断片の増幅に表１のプライマーを用いた。
これらのプライマーを用いて、次の条件下にてＰＣＲを行った。Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（TP600, TAKARA BIO Inc., 日本）を用いて、各デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）１００μＭを添加した反応液に、オリゴヌクレオチド１ｐＭ、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株の染色体ＤＮＡ １０ｎｇを鋳型（template）とし、ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Solgent）１ユニットの存在下で２５～３０サイクル（cycle）行った。ＰＣＲ条件は、（ｉ）変性（denaturation）ステップ：９４℃で３０秒間、（ｉｉ）アニーリング（annealing）ステップ：５８℃で３０秒間、及び（ｉｉｉ）伸長（extension）ステップ：７２℃で１～２分間（１ｋｂ当たり２分間の重合時間を付与する）とした。
このように作製した遺伝子断片をｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇによりｐＣＧＩベクターにクローニングした。前記ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上に塗抹し、３７℃で２４時間培養した。最終的に形成されたコロニーを分離してインサート（insert）が正確にベクターに存在するか否かを確認し、その後そのベクターを分離してコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の組換えに用いた。
上記方法において共通して行う過程である当該遺伝子の増幅は、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからＰＣＲ法で増幅し、戦略に応じてｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ法でｐＣＧＩベクターに挿入してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａから選択した。染色体の遺伝子塩基置換（Chromosomal base substitution）は、各断片の遺伝子を個別に増幅し、オーバーラップＰＣＲで目的とするＤＮＡ断片を作製した。遺伝子操作時のＰＣＲ増幅酵素としてＥｘ Ｔａｑポリメラーゼ（Takara）、Ｐｆｕポリメラーゼ（Solgent）を用い、各種制限酵素及びＤＮＡ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ酵素としてＮＥＢ製品を用い、供給されるバッファ及びプロトコルに従って用いた。
１－２．変異株の作製
前記ｐＣＧＩ（Ｐｍ１－ａｒｇＳ＋ｌｙｓＡ）ベクターを用いて、変異菌株であるＤＳ３菌株を作製した。前記ベクターの最終濃度が１μｇ／μｌ以上になるように準備し、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株にエレクトロポレーション（非特許文献３参照）により１次組換えを誘導した。ここで、カナマイシンを２０μｇ／μｌ含有するＣＭ寒天プレートにエレクトロポレーションした菌株を塗抹してコロニーを分離し、その後ゲノムにおける誘導位置に好適に挿入されたか否かをＰＣＲ及び塩基配列分析により確認した。このように分離した菌株にさらに２次組換えを誘導するために、ストレプトマイシンを含有するＣＭ寒天液体培地に接種して一晩以上培養し、同一濃度のストレプトマイシンを含有する寒天培地に塗抹してコロニーを分離した。最終的に分離したコロニーにおけるカナマイシンに対する耐性の有無を確認し、その後抗生剤に対して耐性のない菌株のうちｌｙｓＡ遺伝子に変異が導入されたか否かを塩基配列分析により確認した（非特許文献４参照）。最終的に、変異ｌｙｓＡ遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＤＳ３）を得た。
前記ｐＣＧＩ（Ｐｍ１－ａｒｇＳ＋ｌｙｓＡ）ベクターを用いて、変異菌株であるＤＳ３菌株を作製した。前記ベクターの最終濃度が１μｇ／μｌ以上になるように準備し、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株にエレクトロポレーション（非特許文献３参照）により１次組換えを誘導した。ここで、カナマイシンを２０μｇ／μｌ含有するＣＭ寒天プレートにエレクトロポレーションした菌株を塗抹してコロニーを分離し、その後ゲノムにおける誘導位置に好適に挿入されたか否かをＰＣＲ及び塩基配列分析により確認した。このように分離した菌株にさらに２次組換えを誘導するために、ストレプトマイシンを含有するＣＭ寒天液体培地に接種して一晩以上培養し、同一濃度のストレプトマイシンを含有する寒天培地に塗抹してコロニーを分離した。最終的に分離したコロニーにおけるカナマイシンに対する耐性の有無を確認し、その後抗生剤に対して耐性のない菌株のうちｌｙｓＡ遺伝子に変異が導入されたか否かを塩基配列分析により確認した（非特許文献４参照）。最終的に、変異ｌｙｓＡ遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＤＳ３）を得た。
コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の作製
ａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーターの－１７及び－１８領域の塩基配列をＣＧからＧＡに置換したことを除いて、実施例１と同様にコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を作製した。
ａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーターの－１７及び－１８領域の塩基配列をＣＧからＧＡに置換したことを除いて、実施例１と同様にコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を作製した。
ここで、プラスミドを作製するために、各遺伝子断片の増幅に表２のプライマーを用い、作製したプラスミドｐＣＧＩ（Ｐｍ２－ａｒｇＳ＋ｌｙｓＡ）ベクター（図２参照）を用いて変異菌株であるＤＳ３－１菌株を作製した。最終的に、変異ｌｙｓＡ遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＤＳ３－１）を得た。
コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の作製
ａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーターの－１７及び－１８領域の塩基配列をＣＧからＧＴに置換したことを除いて、実施例１と同様にコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を作製した。
ａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーターの－１７及び－１８領域の塩基配列をＣＧからＧＴに置換したことを除いて、実施例１と同様にコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を作製した。
ここで、プラスミドを作製するために、各遺伝子断片の増幅に表３のプライマーを用い、作製したプラスミドｐＣＧＩ（Ｐｍ３－ａｒｇＳ＋ｌｙｓＡ）ベクターを用いて変異菌株であるＤＳ３－２菌株を作製した。最終的に、変異ｌｙｓＡ遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＤＳ３－２）を得た。
実験例１．変異株のＬ－リシン生産性の比較
親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株と、実施例１～３で作製したリシン生産変異株であるＤＳ２菌株、ＤＳ２－１菌株及びＤＳ２－２菌株のＬ－リシン生産性を比較した。
親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株と、実施例１～３で作製したリシン生産変異株であるＤＳ２菌株、ＤＳ２－１菌株及びＤＳ２－２菌株のＬ－リシン生産性を比較した。
表４に示す組成のリシン培地１０ｍｌを含む１００ｍｌフラスコに菌株をそれぞれ接種し、３０℃、１８０ｒｐｍの条件で４８時間振盪培養した。培養終了後に、リシンの分析として、ＨＰＬＣ（Shimazu, 日本）によりＬ－リシンの生産量を測定した。その結果を表５に示す。
表５に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株であるＤＳ３、ＤＳ３－１及びＤＳ３－２は、リシン生合成経路の強化のためにａｒｇＳ－ｌｙｓＡオペロンのプロモーター配列の特定位置（－１７及び－１８領域）が最適の塩基配列（ＣＴ、ＧＡ又はＧＴ）に置換されることにより、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株に比べてＬ－リシンの生産性がそれぞれ約４．７％、６．３％、１２．５％向上することが確認された。これらの結果により、ｌｙｓＡ遺伝子の発現強化は、リシン前駆体の炭素結合分解を促進することにより、菌株のＬ－リシン生産能を向上させることが分かる。
以上、本発明の好ましい実施例を挙げて説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明がその本質的な特性から逸脱しない範囲で変形が可能であることを理解するであろう。よって、開示された実施例は本発明を説明するものであり、本発明を限定するものではない。本発明の範囲は、これらの説明ではなく、請求の範囲により規定されるものであり、その均等な範囲内にあるあらゆる相違点は本発明に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (5)
- ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性が強化されてＬ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）変異株。
- 前記ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性強化は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターに位置特異的変異を誘発することである、請求項１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株。
- 前記ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表されるものである、請求項２に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株。
- 前記変異株は、配列番号２～４で表される塩基配列のいずれかを含むものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株。
- ａ）請求項１に記載の変異株を培地で培養するステップと、
ｂ）前記変異株又は変異株を培養した培地からＬ－リシンを回収するステップとを含むＬ－リシン生産方法。
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