BR112016025999B1 - Microorganismo que produz l-lisina e seu método de produção - Google Patents
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Abstract
MICRO-ORGANISMO TENDO PRODUTIVIDADE DE L-LISINA APERFEIÇOADA E MÉTODO PAR A PRODUÇÃO DE L-LISINA USANDO O MESMO. A presente invenção refere-se a micro-organismos da espécie Corynebacterium tendo produtividade de L-lisina aperfeiçoada através da desativação de uma proteína secretora e um método para produção de L-lisina usando os micro-organismos.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a um micro-organismo tendo habilidade aumentada em produzir L-lisina e um método para produção de L-lisina usando o mesmo.
[0002] L-lisina é usada nas indústrias de ração animal, fármaco e cosmético humanos e é produzida através de fermentação usando um micro-organismo do gênero Corynebacterium ou do gênero Escherichia. Nos últimos anos, estudos sobre o desenvolvimento de cepas de produção altamente eficiente e técnicas de processo de fermentação têm sido conduzidos.
[0003] Muitos estudos têm sido conduzidos para controlar a espumação durante fermentação de leveduras que são usadas em produção de cerveja e vinho e, em estudos recentes, genes (AWA1, FPG1 e CFG1) tendo um efeito sobre espumação foram identificados (Shimoi H. e outros, 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68:2018-25; Blasco L. e outros, Yeast. 2011, 28:437-51; Blasco L. e outros, J. Agric. Food Chem. 2012, 60:10796-07). Aqui, foi constatado que, no caso de uma cepa com esses genes inativados, a espumação diminuiu significantemente comparado com aquela no caso de uma cepa parental, enquanto que no caso de uma cepa que superexpressa esses genes, espumação aumentou.
[0004] Espumação durante cultura de levedura ocorre através de uma série de processos como segue. Primeiro, manoproteína se mistura com bolhas de gás fino geradas durante a fermentação. Neste momento, o interior das bolhas de gás se torna hidrofóbico, e o exterior das bolhas de gás se torna hidrofílico. Por esta razão, a viscosidade do meio de cultura é aumentada de maneira que não apenas várias proteínas, mas também células, se misturam, resultando em espumação, (Swart CW. e outros, FEMS Yeast Res. 2012, 12:867-69).
[0005] Na produção de cerveja usando levedura, um nível adequado de espumação é requerido, mas em fermentação de micro-organismos que são usados para produzir grandes quantidades de produtos úteis tais como aminoácidos, a inibição de espumação é requerida. Se uma quantidade excessivamente grande de espuma for gerada durante a cultura, a viscosidade do meio de cultura será aumentada, e então a taxa de transferência de oxigênio (OTR) no meio de cultura diminuirá e, em casos graves, lise das células ocorrerá. O uso de uma grande quantidade de um agente antiespumante para inibição de espumação pode aumentar os custos de produção em termos industriais e pode ter um efeito adverso sobre crescimento celular.
[0006] Desta maneira, os presentes inventores avaliaram genes de um micro-organismo do gênero Corynebacterium, que têm um efeito sobre uma grande quantidade de espumação, e constataram que, quando tais genes são inativados, espumação é controlada de modo eficaz de maneira que uma habilidade em produzir L-lisina da cepa é aumentada, desta maneira terminando a presente invenção.
[0007] É um objetivo da presente invenção prover um micro organismo do gênero Corynebacterium tendo uma habilidade aumentada em produzir L-lisina.
[0008] Um outro objetivo da presente invenção é prover um método para produção de L-lisina usando o micro-organismo do gênero Corynebacterium.
[0009] A fim de atingir os objetivos acima, um aspecto da presente invenção provê um micro-organismo do gênero Corynebacterium onde pelo menos uma proteína secretora selecionado do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 1, 7 e 13 é inativada.
[0010] Um outro aspecto da presente invenção provê um método de produção de L-lisina através de cultura de um micro-organismo do gênero Corynebacterium.
[0011] O micro-organismo de acordo com a presente invenção é um micro-organismo onde proteínas secretoras que estão envolvidas em espumação são inativadas de maneira que uma habilidade da cepa em produzir L-lisina é aumentada. Quando esta cepa é usada, espumação é reduzida, ela pode ser culturada sem ter que aumentar ou sem ter que adicionar uma grande quantidade de um agente antiespumante, e a habilidade da cepa em produzir L-lisina pode ser aumentada. Ainda, em termos industriais, efeitos tal como a conveniência de produção e uma redução no custo de produção podem ser obtidos, e L-lisina pode ser eficientemente produzida.
[0012] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em detalhes.
[0013] Em um aspecto, a presente invenção provê um micro organismo do gênero Corynebacterium onde pelo menos uma proteína secretora tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 1, 7 e 13 é inativada. Se uma quantidade excessivamente grande de espuma for gerada durante cultura da massa para produção de L-lisina, a viscosidade do meio de cultura será aumentada de maneira que a taxa de transferência de oxigênio (OTR) no meio de cultura diminuirá, e em casos graves, lise das células também ocorrerá. Em outras palavras, foi pensado que inativação de proteínas secretoras, que causam espumação, em termos de controle de espumação, seria vantajosa para a produção de lisina.
[0014] Desta maneira, em uma modalidade da presente invenção, a fim de aperfeiçoar um processo de fermentação para produção de L- lisina e avaliar proteínas secretoras principais que causam espumação desnecessária para produção de lisina, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (este micro-organismo foi revelado como KFCC10881 e novamente depositado com uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste sob No. de acesso KCCM11016P; Patente Coreana No. 10-0159812) foi culturada e então espuma produzida durante o processo de fermentação foi isolada, desta maneira obtendo peptídeo. Os peptídeos obtidos foram analisados e três proteínas detectadas nas quantidades maiores foram selecionadas, desta maneira selecionando peptídeos codificados por genes de Nos. de acesso NCBI NCgl0336, NCgl0717 e NCgl2912 para Corynebacterium glutamicum ATCC13032.
[0015] Na presente invenção, o peptídeo codificado pelo gene NCg10336 é uma esterase existindo exogenamente no Corynebacterium glutamicum. Especificamente, o peptídeo pode ter uma sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 1 e uma proteína tendo uma sequência de aminoácido tendo uma homologia de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 90%, mais especificamente pelo menos 95%, particularmente especificamente pelo menos 97%, com a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 1 está também incluída no escopo da proteína secretora de acordo com a presente invenção, contanto que ela seja uma proteína tendo atividade de esterase. No entanto, a proteína secretora que é usada na presente invenção não é limitada a esta, porque a sequência de aminoácido da proteína mostrando atividade de esterase pode diferir dependendo da espécie ou cepa de micro-organismo. Ainda, é óbvio que uma proteína tendo uma sequência de aminoácido compreendendo uma deleção, modificação, substituição ou deleção de um ou vários aminoácidos em uma ou mais posições da sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 1 está também incluída no escopo da presente invenção, contanto que ela tenha uma sequência tendo homologia com a sequência de SEQ ID N°: 1 e tenha atividade biológica substancialmente igual ou similar àquela da proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 1.
[0016] Na presente invenção, o gene NCg10336 tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 2 e uma sequência de nucleotídeo tendo uma homologia de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 90%, mais especificamente 95%, particularmente especificamente 97%, com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 2, e está também incluída no escopo da presente invenção. Ainda, variantes, da sequência, que codificam o mesmo aminoácido devido à degeneração do código genético, estão também incluídas no escopo da presente invenção. Ainda, um polinucleotídeo codificando NCg10336 de acordo com a presente invenção pode ser uma variante codificando NCg10336, que pode hibridizar para a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 2 ou uma sonda derivada da sequência de nucleotídeo sob condições adstringentes e que normalmente funciona.
[0017] Na presente invenção, o peptídeo codificado pelo gene NCg10717 é uma esterase existindo endogenamente na Corynebacterium glutamicum. Especificamente, o peptídeo pode ter uma sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 7 e uma proteína tendo sequência de aminoácido tendo uma homologia de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 90%, mais especificamente pelo menos 95%, particularmente especificamente pelo menos 97%, com a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 7, e está também incluída no escopo da proteína secretora de acordo com a presente invenção, contanto que ela seja uma proteína tendo atividade de esterase. No entanto, a proteína secretora que é usada na presente invenção não é limitada a esta, porque a sequência de aminoácido da proteína mostrando atividade de esterase pode diferir dependendo da espécie ou cepa de micro-organismo. Ainda, é óbvio que uma proteína tendo uma sequência de aminoácido compreendendo uma deleção, modificação, substituição ou deleção de um ou vários aminoácidos em uma ou mais posições da sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 7 está também incluída no escopo da presente invenção, contanto que ela tenha uma sequência tendo homologia com a sequência de SEQ ID N°: 7 e tenha atividade biológica substancialmente igual ou similar àquela da proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 7.
[0018] Na presente invenção, o gene NCg0337 tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 8 e uma sequência de nucleotídeo tendo uma homologia de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 90%, mais especificamente 95%, particularmente especificamente 97%, com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 8 e está também incluída no escopo da presente invenção. Ainda, variantes da sequência, que codificam o mesmo aminoácido devido à degeneração do código genético, estão também incluídas no escopo da presente invenção. Ainda, um polinucleotídeo codificando NCg10337 de acordo com a presente invenção pode ser uma variante codificando NCg10337, que pode hibridizar para a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 8 ou uma sonda derivada da sequência de nucleotídeo sob condições adstringentes e que normalmente funciona.
[0019] Na presente invenção, o peptídeo codificado pelo gene NCg12912 é uma esterase existindo endogenamente na Corynebacterium glutamicum. Especificamente, o peptídeo pode ter uma sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 13 e uma proteína tendo sequência de aminoácido tendo uma homologia de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 90%, mais especificamente pelo menos 95%, particularmente especificamente pelo menos 97%, com a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 13, e está também incluída no escopo da proteína secretora de acordo com a presente invenção, contanto que ela seja uma proteína tendo atividade de esterase. No entanto, a proteína secretora que é usada na presente invenção não é limitada a esta, porque a sequência de aminoácido da proteína mostrando atividade de esterase pode diferir dependendo da espécie ou cepa de micro-organismos. Ainda, é óbvio que uma proteína tendo uma sequência de aminoácido compreendendo uma deleção, modificação, substituição ou deleção de um ou vários aminoácidos em uma ou mais posições da sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 13 está também incluída no escopo da presente invenção, contanto que ela tenha uma sequência tendo homologia com a sequência de SEQ ID N°: 13 e tenha atividade biológica substancialmente igual ou similar àquela da proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 13.
[0020] Na presente invenção, o gene NCg12912 tem uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 14, e uma sequência de nucleotídeo tendo uma homologia de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 90%, mais especificamente 95%, particularmente especificamente 97%, com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 14, está incluída no escopo da presente invenção. Ainda, variantes da sequência, que codificam o mesmo aminoácido devido à degeneração do código genético, estão também incluídas no escopo da presente invenção. Ainda, um polinucleotídeo codificando NCg12912 de acordo com a presente invenção pode ser uma variante codificando NCg12912, que pode hibridizar para a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 14 ou uma sonda derivada da sequência de nucleotídeo sob condições adstringentes e que normalmente funciona.
[0021] Como aqui usado, o termo "homologia" refere-se à identidade para uma dada sequência de aminoácido ou sequência de nucleotídeo e pode ser expressa como porcentagem. No relatório descritivo, uma sequência homóloga tendo atividade igual ou similar a uma dada sequência de aminoácido ou sequência de nucleotídeo é expressa como "homologia %". A homologia da sequência de aminoácido pode ser determinada usando, por exemplo, algoritmo BLAST (vide Karlin e Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) ou FASTA de Pearson (vide Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Programas chamados BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos com base neste algoritmo BLAST (vide www.ncbi.nlm.nih.gov).
[0022] Como aqui usado, o termo "condições adstringentes" significa condições que permitem hibridização específica entre polinucleotídeos. Por exemplo, tais condições adstringentes são descritas em detalhes em J. Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York.
[0023] Como aqui usado, "inativação" pode ser obtida através de qualquer método de inativação conhecido na técnica. Na presente invenção, "inativação" significa que a expressão de um gene endógeno é reduzida comparado com aquela em uma cepa do tipo selvagem ou o gene não é expresso ou o gene não tem nenhuma atividade ou atividade reduzida embora ele seja expresso. A ativação pode ser obtida através de mutação de toda ou parte da sequência de nucleotídeo ou toda ou parte da sequência de regulagem de expressão do mesmo através de deleção, substituição, inserção ou uma combinação das mesmas.
[0024] Como um exemplo específico, um micro-organismo com o gene endógeno inativado pode ser preparado através de transformação de um micro-organismo do gênero Corynebacterium com um vetor recombinante compreendendo um fragmento de gene obtido através de deleção da estrutura de leitura aberta do gene endógeno, desta maneira deletando ou mutando o gene endógeno. Inserção do gene no cromossomo pode ser realizada através de qualquer método conhecido na técnica.
[0025] Como aqui usado, o termo enzima "endógena" e atividade se refere a uma enzima presente originalmente em um micro-organismo ou uma célula e a atividade da enzima. A saber, o termo significa uma enzima e sua atividade antes da enzima e da atividade serem modificadas.
[0026] Conforme aqui usado, o termo "vetor recombinante" se refere a um construto de DNA contendo a sequência de nucleotídeo de um gene de codificação de proteína operavelmente ligada a uma sequência reguladora adequada de maneira a ser capaz de expressar o gene alvo em uma célula hospedeiro adequada. A sequência reguladora inclui um promotor capaz de iniciar transcrição, qualquer operador para regulagem desta transcrição, uma sequência codificando um sítio de ligação de ribossomo de mRNA adequado e uma sequência para regulagem do término de transcrição e tradução. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode integrar ao próprio genoma. O vetor que é usado na presente invenção não é especificamente limitado e pode ser qualquer vetor conhecido na técnica, contanto que ele possa replicar em um hospedeiro.
[0027] Exemplos do vetor que é usado em construção do vetor recombinante incluem plasmídeos, cosmídeo, vírus e bacteriófagos naturais ou recombinantes. Por exemplo, o vetor de fago ou vetor de cosmídeo que é usado na presente invenção pode ser pWE15, M13, ÀMBL3, ÀMBL4, AIXII, ÀASHII, AAPII, At10, At11, Charon4A, Charon21A ou similar e o vetor de plasmídeo que é usado na presente invenção pode ser do tipo pBr, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL, tipo pET ou similar. Um vetor que pode ser usado na presente invenção não é especificamente limitado, e qualquer expressão conhecida pode ser usada na presente invenção.
[0028] Como aqui usado, o termo "transformação" significa introdução de um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína alvo em uma célula hospedeiro de modo a ser capaz de expressar uma proteína codificada pelo polinucleotídeo na célula hospedeiro. O polinucleotídeo introduzido pode ser inserido e localizado no cromossomo da célula hospedeiro ou localizado fora do cromossomo, contanto que ele possa ser expresso na célula hospedeiro. Ainda, os polinucleotídeos incluem DNA e RNA, que codificam a proteína alvo. Contanto que o polinucleotídeo possa ser introduzido na célula hospedeiro e expresso nela, ele pode ser introduzido em qualquer forma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeiro na forma de um cassete de expressão que é um construto de polinucleotídeo incluindo todos os elementos necessários para autoexpressão. O cassete de expressão inclui geralmente um promotor que é operavelmente ligado à estrutura de leitura aberta (daqui em diante abreviada como "ORF") do gene, um sinal de término de transcrição, um sítio de ligação de ribossomo e um sinal de término de tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Ainda, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeiro sozinho e operavelmente ligado à sequência necessária para expressão na célula hospedeiro.
[0029] Como uma cepa parental na qual o vetor recombinante deve ser introduzido, qualquer micro-organismo tendo uma habilidade em produzir L-lisina pode ser usado sem limitação. Especificamente, um micro-organismo do gênero Corynebacterium ou do gênero Brevibacterium pode ser usado. Mais especificamente, um micro- organismo Corynebacterium glutamicum pode ser usado.
[0030] Como aqui usado, a expressão "micro-organismo tendo uma habilidade em produzir L-lisina" se refere a um micro-organismo obtido através da manipulação de um gene geralmente conhecido de modo a ser capaz de produzir L-lisina. Por exemplo, o micro-organismo pode ser um micro-organismo obtido ou através de inserção de um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em aspB (gene de codificação de aspartato aminotransferase), lysC (gene de codificação de aspartato cinase) e asd (gene de codificação de aspartato semialdeído desidrogenase), dapA (gene de codificação de di-hidropicolinato sintase), dapB (gene de codificação de di-hidropicolinato redutase) e lysA (gene de codificação de diaminodipimelato descarboxilase), que são endógenos em um micro-organismo do gênero Corynebacterium e estão envolvidos na produção de L-aminoácidos ou através de tratamento de uma cepa mutante auxotrófica de L-leucina com N-metil- N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG).
[0031] Mais especificamente, um micro-organismo do gênero Corynebacterium usado na presente invenção é Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (este micro-organismo foi revelado como KFCC10881 e novamente depositado com uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste sob N°. de acesso KCCM11016P; Patente Coreana N°. 10-0159812), Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente Coreana N°. 10-0924065), cepa de produção de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (este micro-organismo foi revelado como KFCC10750 e novamente depositado com uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste sob N°. de acesso KCCM11347P; Patente Coreana No. 10-0073610) e uma cepa de Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder e outros, Genome Biology 2012, 13:R40), mas não são limitadas a elas.
[0032] Em uma modalidade preferida da presente invenção, um micro-organismo transformado de acordo com a presente invenção pode ser Corynebacterium glutamicum KCCM11502P, KCCM11481P ou KCCM11482P.
[0033] Em um outro aspecto, a presente invenção também provê um método de produção de L-lisina usando o micro-organismo transformado. Mais especificamente, a presente invenção provê um método para produção de L-lisina compreendendo as etapas de: cultura do micro-organismo da presente invenção para produzir L-lisina em uma cultura ou célula do micro-organismo; e recuperação de L-lisina a partir do meio de cultura.
[0034] No método da presente invenção, cultura de um micro organismo do gênero Corynebacterium pode ser realizada usando quaisquer condições de cultura e método de cultura conhecidos na técnica.
[0035] Por exemplo, um meio que pode ser usado para cultura de um micro-organismo do gênero Corynebacterium é revelado no Manual of Methods for General Bacteriology da American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).
[0036] Fontes de açúcar que podem ser usadas no meio incluem açucares e carboidratos tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido ou celulose; óleos e gorduras tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino ou óleo de coco; ácidos graxos tal como ácido palmítico, ácido esteárico ou ácido linoleico; álcoois tal como glicerol ou etanol; e ácidos orgânicos tal como ácido acético. Essas substâncias podem ser usadas individualmente ou em uma mistura.
[0037] Fontes de nitrogênio que podem ser usadas incluem compostos contendo nitrogênio orgânico tais como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, água de maceração de milho, farinha de soja e ureia ou compostos inorgânicos tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio podem ser também usadas individualmente ou como uma mistura.
[0038] Fontes de fósforo que podem ser usadas incluem di- hidrogeno fosfato de potássio ou hidrogeno fosfato de potássio ou os sais de sódio correspondentes. O meio de cultura deve conter ainda sais de metal tal como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são requeridos para crescimento. Finalmente, as substâncias de crescimento essenciais tais como aminoácidos e vitaminas podem ser usadas em adição às substâncias mencionadas acima. Além disso, precursores adequados podem ser adicionados ao meio de cultura. As ditas substâncias podem ser adicionadas à cultura de uma maneira em batelada ou contínua através de um método adequado durante cultura.
[0039] O pH da cultura pode ser controlado usando compostos básicos tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa ou compostos ácidos tal como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico de uma maneira adequada. Espumação pode ser controlada usando agentes antiespumantes tais como ésteres de poliglicol de ácido graxo. Condições aeróbicas são mantidas através da introdução de oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) na cultura. A temperatura da cultura é geralmente de a partir de 20°C a 45°C, especificamente de a partir de 25°C a 40°C. Cultura pode ser continuada até uma quantidade desejada de L-lisina ter sido produzida. Especificamente, o tempo de cultura é 10-160 horas.
[0040] No método da presente invenção, a cultura pode ser realizada continuamente ou em um processo em batelada ou em um processo em batelada alimentada ou batelada alimentada repetida. Esta cultura pode ser realizada usando qualquer método bem conhecido na técnica.
[0041] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência a exemplos. Deve ser compreendido, no entanto, que esses exemplos são para propósitos ilustrativos apenas e não pretendem limitar o escopo da presente invenção.
[0042] Neste Exemplo, a fim de avaliar proteínas secretoras que causam espumação, foi realizado um experimento da maneira que segue.
[0043] Primeiro, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (este micro-organismo foi revelado como KFCC10881 e novamente depositado com uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste sob No. de acesso KCCM11016P; Patente Coreana No. 10-0159812) foi culturado usando um fermentador de 1L e então apenas espuma produzida durante o processo de fermentação foi isolada e concentrada em um tubo de teste de 15 ml.
[0044] Para identificação de proteínas contidas na amostra de espuma concentrada, uma quantidade adequada de um corante de carregamento contendo um tensoativo foi adicionada à amostra que então sofreu eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio 8%. Após eletroforese, o gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio foi tingido através de tingimento com azul Coomassie. Então, as faixas de proteína tingida foram excisadas e digeridas com tripsina para obter peptídeos, e as sequências de aminoácido dos peptídeos obtidos foram analisadas através de um método LC-MS/MS.
[0045] Os peptídeos analisados foram identificados através de pesquisa por genes de um micro-organismo do gênero Corynebacterium usando a pesquisa BLAST provida pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI). Dentre os peptídeos identificados, três proteínas detectadas nas quantidades maiores foram selecionadas, desta maneira finalmente selecionando genes codificando as proteínas. Os genes selecionados são Nos. de acesso NCBI NCg10336, NCg10717 e NCg12912. Exemplo 2: Construção de Plasmídeo Recombinante para Inativação de Gene NCg10336 de Proteína Secretora
[0046] Para construção de um plasmídeo recombinante capaz de inativar o gene NCg10336 no cromossomo de Corynebacterium, a sequência de aminoácido (SEQ ID N°: 1) e a sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 2) de NCg10336 foram obtidas com base na sequência de nucleotídeo depositada no NIH Genbank. A fim de preparar um fragmento de gene através de deleção da estrutura de leitura aberta de NCg10336, iniciadores de SEQ ID NOs: 3 a 6 foram construídos com base na sequência de SEQ ID N°: 2. SEQ ID N°. 3: 5'-atcctctagagtcgacGAAGCCTCTGCACCTCGCTG-3‘; SEQ ID N° 4: 5'-TATAGTTCGGTTCCGCGTCTCCAACGCATCCGGCC-3'; SEQ ID N° 5: 5'-CGGAACCGAACTATACCACCGAGGGACGCATTCTC-3'; SEQ ID N°. 6: 5'-atgcctgcaggtcgacGCTCAAACGCACGAGCGAAG-3'.
[0047] Usando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum como um modelo, PCR foi realizada usando um conjunto de iniciador de SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4 e um conjunto de iniciador de SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N°: 6 [Sambrook e outros, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]. A PCR foi realizada por 30 ciclos, cada um consistindo em desnaturação a 95°C por 30 seg, anelamento a 50°C por 30 seg e polimerização a 72°C por 1 min.
[0048] Como resultado, NCg10336-A e NCg10336-B, que são fragmentos de DNA compreendendo um fragmento de gene NCg10336 de 342 pb e um fragmento de gene NCg10336 de 315 pb, respectivamente, foram obtidos. O fragmento de DNA obtido através de amplificação por PCR foi ligado a um plasmídeo pDZ (Patente Coreana N°. 10-0924065) através do uso de um Estojo de clonagem por infusão (Invitrogen) e então transformado em DH5α de E. coli e plaqueado em um meio sólido LB contendo 25 mg/mL de canamicina. Uma colônia transformada com um plasmídeo tendo o gene desejado inserido nela foi selecionada através de PCR e então o plasmídeo foi isolado usando uma técnica de extração de plasmídeo geralmente conhecida. O plasmídeo foi chamado "pDZ-ΔNCgl0336". pDZ-ΔNCgl0336 é um plasmídeo onde um fragmento de gene de 503 pb de NCg10336 foi deletado. Exemplo 3: Construção de Plasmídeo Recombinante para Inativação de Gene NCg10717 de Proteína Secretora
[0049] Para construção de um plasmídeo recombinante capaz de inativação do gene NCg10717 no cromossomo de Corynebacterium, a sequência de aminoácido (SEQ ID N°: 7) e a sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 8) de NCg10717 foram obtidas com base na sequência de nucleotídeo depositada no NIH Genbank. A fim de preparar um fragmento de gene através de deleção da estrutura de leitura aberta de NCg10717, iniciadores de SEQ ID N°s: 9 a 12 foram construídos com base na sequência de SEQ ID N°: 8. SEQ ID N°. 9: 5'-CCGGGGATCCTCTAGAGTTCGCGGATAAATGGG-3'; SEQ ID N° 10: 5'-CACGTGAAATTCAGGTCGCGTGGTTCACCTCCGAAG-3'; SEQ ID N. 11: 5'-CTTCGGAGGTGAACCACGCGACCTGAATTTCACGTG-3'; SEQ ID N°. 12: 5'-GCAGGTCGACTCTAGAGGTCCCATGATTGTTCTG-3'.
[0050] Usando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum como um modelo, PCR foi realizada usando um conjunto de iniciador de SEQ ID N°: 9 e SEQ ID N°: 10 e um conjunto de iniciador de SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12. O PCR foi realizado por 30 ciclos, cada um consistindo em desnaturação a 95°C por 30 seg, anelamento a 50°C por 30 seg e polimerização a 72°C por 1 min.
[0051] Como resultado, NCg10717-A e NCg10717-B, que são fragmentos de DNA compreendendo um fragmento de gene NCg10717 de 493 pb e um fragmento de gene NCg10717 de 491 pb, respectivamente, foram obtidos. O fragmento de DNA obtido através de amplificação por PCR foi ligado a um plasmídeo de pDZ através do uso de um estojo de clonagem por infusão (Invitrogen), e então transformado em DH5α de E. coli e plaqueado em um meio sólido de LB contendo 25 mg/L de canamicina. Uma colônia transformada com um plasmídeo tendo o gene desejado inserido nela foi selecionada através de PCR, e então o plasmídeo foi isolado usando uma técnica de extração de plasmídeo geralmente conhecida. O plasmídeo foi chamado "pDZ-ΔNCgl0717". pDZ-ΔNCgl0717 é um plasmídeo onde um fragmento de gene de 786 pb de NCg10717 foi deletado. Exemplo 4: Construção de Plasmídeo Recombinante para Inativação de Gene NCg12912 de Proteína Secretora
[0052] Para construção de um plasmídeo recombinante capaz de inativação do gene NCg2912 no cromossomo de Corynebacterium, a sequência de aminoácido (SEQ ID N°: 13) e sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 14) de NCg12912 foram obtidas com base na sequência de nucleotídeo depositada no NIH Genbank. A fim de preparar um fragmento de gene através de deleção da estrutura de leitura aberta de NCg12912, iniciadores de SEQ ID Nos: 15 a 18 foram construídos com base na sequência de SEQ ID N°: 14. SEQ ID N° 15: 5'-CCGGGGATCCTCTAGAGCTGCAAGAAGTGCGAC-3‘; SEQ ID NO. 16: 5'-CTCGTAGTCGCTAGCACCTATTACGGGAGGTC-3'; SEQ ID N°. 17: 5'-GACCTCCCGTAATAGGTGCTAGCGACTACGAG-3'; SEQ ID N°. 18: 5'-GCAGGTCGACTCTAGACCCGAGCTATCTAACAC-3'.
[0053] Usando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum como um modelo, PCR foi realizada usando um conjunto de iniciador de SEQ ID N°: 15 e SEQ ID N°: 16 e um conjunto de iniciador de SEQ ID N°: 17 e SEQ ID N°: 18. A PCR foi realizada por 30 ciclos, cada um consistindo em desnaturação a 95°C por 30 seg, anelamento a 50°C por 30 seg e polimerização a 72°C por 1 min.
[0054] Como resultado, NCg12912-A e NCg12912-B, que são fragmentos de DNA compreendendo um fragmento de gene NCg12912 de 444 pb e um fragmento de gene NCb12912 de 636 pb, respectivamente, foram obtidos. O fragmento de DNA obtido através de amplificação por PCR foi ligado a um plasmídeo pDZ através do uso de um Estojo de clonagem por infusão (Invitrogen) e então transformado em DH5α de E. coli e plaqueado em um meio sólido LB contendo 25 mg/mL de canamicina. Uma colônia transformada com um plasmídeo tendo o gene desejado inserido na mesma foi selecionada através de PCR e então o plasmídeo foi isolado usando uma técnica de extração de plasmídeo geralmente conhecida. O plasmídeo foi chamado "pDZ- ΔNCgl2912". pDZ-ΔNCgl2912 é um plasmídeo onde um fragmento de gene de 128 pb de NCg12912 foi deletado. Exemplo 5: Construção e Avaliação de Cepa Inativada em Gene de Proteína Secretora de Cepa de Produção de Lisina KCCM11016P
[0055] Cada um dos três plasmídeos recombinantes (pDZ- ΔNCgl0336, pDZ-ΔNCgl0717 e pDZ-ΔNCgl2912) construídos nos Exemplos 2, 3 e 4 foi transformado em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P através de um método de pulso elétrico e as cepas onde o gene alvo foi inativado através de recombinação homóloga foram preparadas através de um método de PCR. As cepas preparadas foram chamadas "KCCM11016P-ΔNCgl0336", "KCCM11016P-ΔNCgl0717" e "KCCM11016P-ΔNCgl2912", respectivamente.
[0056] Cada uma das três cepas e uma cepa controle foram inoculadas em um frasco com defletor de canto de 25 ml contendo 25 ml do meio de semente que segue, e foram culturadas com agitação a 200 rpm e 30°C por 20 horas. Em seguida, 1 ml da cultura de semente foi inoculado em um frasco com defletor de canto de 250 ml contendo 24 ml do meio de produção que segue e foi culturado com agitação a 200 rpm e 37°C por 96 horas. A composição de cada um do meio de semente e meio de produção é como segue.
[0057] 20 g de glicose, 10 g de (NH4)2SO4, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSθ4.7H2θ, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCl de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio e 2000 μg de nicotinamida (por litro de água destilada).
[0058] 100 g de glicose, 40 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de sólido de maceração de milho, 3 g de ureia, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4.7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCl de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio, 3000 μg de nicotinamida e 30 g de CaCO3 (por litro de água destilada).
[0059] Após término do processo de cultura, a cultura foi transferida para um cilindro graduado, e a altura da espuma produzida na cultura foi medida, e também a concentração de L-lisina na cultura foi medida através de HPLC. Os resultados da medição são mostrados na Tabela 1 abaixo. Os resultados na Tabela 1 são os resultados de três experimentos repetidos, e produção de L-lisina foi avaliada com base no valor médio. Tabela 1
[0060] Como mostrado na Tabela 1 acima, a produção de L-lisina da cepa onde cada um do gene NCgl0336, NCgl0717 e NCgl2912 foi inativado aumentou cerca de 6% comparado com aquela da cepa parental KCCM11016P. Ainda, espuma na cultura da cepa onde cada um do gene NCgl0336, NCgl0717 e NCgl2912 foi inativado diminuiu cerca de 6-15% comparado com aquela na cultura da cepa parental.
[0061] Desta maneira, foi constatado que, quando as proteínas secretoras principais do micro-organismo Corynebacterium sp., que são desnecessárias para produção de lise, são inativadas, a geração de espuma durante cultura do micro-organismo pode ser efetivamente controlada, desta maneira aumentando a produção de L-lisina. Exemplo 6: Construção e Avaliação de Cepas Inativadas em Proteína Secretora de Cepa Produtora de L-lisina KCCM10770P
[0062] A fim de examinar se os efeitos de inativação de proteínas secretoras na cepa de produção de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente Coreana N°. 10-0924065) tendo uma taxa de curso biossintético de lisina aumentada são similares aos resultados experimentais do Exemplo 5, cepas onde cada uma das três proteínas secretoras foi inativada foram construídas da mesma maneira que descrito no Exemplo 5. As cepas construídas foram chamadas "KCCM10770P-ΔNCgl0336", "KCCM10770P-ΔNCgl0717" e "KCCM10770P-ΔNCgl2912". A quantidade de produção de L-lisina de cada uma das cepas construídas junto com a quantidade de espuma gerada foi examinada.
[0063] A fim de examinar a produção de lisina das cepas, cada uma das cepas junto com a cepa controle foi culturada da mesma maneira que descrito no Exemplo 5. Após término da cultura, a quantidade de espuma gerada foi medida da mesma maneira que descrito no Exemplo 5 e a concentração de L-lisina foi medida através de HPLC. Os resultados da medição são mostrados na Tabela 2 abaixo. Os resultados na Tabela 2 são os resultados de três experimentos repetidos e produção de L-lisina foi avaliada com base no valor médio. Tabela 2
[0064] Como mostrado na Tabela 2 acima, a produção de lisina da cepa onde cada um dos genes NCg10336, NCg10717 e NCg12912 foi inativado aumentou cerca de 4% comparado com aquela da cepa parental KCCM10770P. Ainda, espuma na cultura da cepa onde cada um dos genes NCg10336, NCg10717 e NCg12912 foi inativado diminuiu cerca de 4-18% comparado com aquela da cepa parental.
[0065] Desta maneira, foi constatado que quando as proteínas secretoras principais de Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente Coreana N°. 10-0924065), que eram desnecessárias para produção de lisina, são inativadas, a geração de espuma durante cultura dos micro-organismos pode ser efetivamente controlada, desta maneira aumentando a produção de L-lisina, similar aos resultados do Exemplo 6. Exemplo 7: Construção e Avaliação de Cepas Inativadas em Proteína Secretora de Cepa de Produção de L-Lisina KCCM11347P
[0066] A fim de examinar os efeitos de inativação de proteínas secretoras na cepa de produção de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (este micro-organismo foi revelado como KFCC10750 e novamente depositado com uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste sob N°. de Acesso KCCM11347P; Patente Coreana N°. 10-0073610) construída através de mutação artificial, cepas onde cada uma das três proteínas secretoras foi inativada foram construídas da mesma maneira que descrito no Exemplo 5 ou 6. As cepas construídas foram chamadas "KCCM11347P-ΔNCgl0336", "KCCM11347P-ΔNCgl0717" e "KCCM11347P-ΔNCgl2912". A quantidade de produção de L-lisina de cada uma das cepas construídas junto com a quantidade de espuma gerada foi examinada.
[0067] A fim de examinar a produção de lisina das cepas, cada uma das cepas junto com a cepa controle foi culturada da mesma maneira que descrito no Exemplo 5 ou 6. Após término de cultura, a quantidade de espuma gerada foi medida da mesma maneira que descrito no Exemplo 5 ou 6 e a concentração de L-lisina foi medida através de HPLC. Os resultados da medição são mostrados na Tabela 3 abaixo. Os resultados na Tabela 3 são os resultados de três experimentos repetidos e produção de L-lisina foi avaliada com base no valor médio. Tabela 3
[0068] Como mostrado na Tabela 3 acima, a produção de lisina da cepa onde cada um dos genes NCg10336, NCg10717 e NCg12912 foi inativado aumentou cerca de 5% comparado com aquela da cepa parental KCCM11347P. Ainda, espuma na cultura da cepa onde cada um dos genes NCg0336, NCg10717 e NCg12912 foi inativado diminuiu cerca de 4-15% comparado com aquela da cepa parental.
[0069] Desta maneira, foi constatado que, quando as proteínas secretoras principais de Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (Patente Coreana No. 94-0001307), que são desnecessárias para produção de lisina, são inativadas, a geração de espuma durante cultura dos micro-organismos pode ser efetivamente controlada, desta maneira aumentando a produção de L-lisina, similar aos resultados dos Exemplos 5 e 6. Exemplo 8: Construção e Avaliação de Cepas Inativadas em Proteína Secretora de Cepa de Produção de L-Lisina CJ3P
[0070] A fim de examinar os efeitos de inativação de proteínas secretoras em Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder e outros, Genoma Biology 2012, 13:R40) tendo uma habilidade em produzir L- lisina, construída através da introdução de três mutações [pyc(P458S), hom(V59A) e lysC(T311I)] em uma cepa do tipo selvagem, tais como Exemplos 5, 6 e 7, as cepas onde cada uma das três proteínas secretoras foi inativada foram construídas da mesma maneira que descrito no Exemplo 5, 6 ou 7. As cepas construídas foram chamadas "CJ3P-ΔNCgl0336", "CJ3P-ΔNCgl0717" e "CJ3P-ΔNCgl2912". A quantidade de produção de L-lisina de cada uma das cepas construídas junto com a quantidade de espuma gerada foi examinada.
[0071] A fim de examinar a produção de lisina das cepas, cada uma das cepas junto com a cepa controle foi culturada da mesma maneira que descrito no Exemplo 5, 6 ou 7. Após término de cultura, a quantidade de espuma gerada foi medida da mesma maneira que descrito no Exemplo 5, 6 ou 7 e a concentração de L-lisina foi medida através de HPLC. Os resultados da medição são mostrados na Tabela 4 abaixo. Os resultados na Tabela 4 são os resultados de três experimentos repetidos, e produção de L-lisina foi avaliada com base no valor médio. Tabela 4
[0072] Como mostrado na Tabela 4 acima, a produção de lisina da cepa onde cada um dos genes NCgl0336, NCgl0717 e NCgl2912 foi inativado aumentou cerca de 8% comparado com aquela da cepa parental CJ3P. Ainda, espuma na cultura da cepa onde cada um dos genes NCgl0336, NCgl0717 e NCgl2912 foi inativado diminuiu cerca de 5-17% comparado com aquela da cepa parental.
[0073] Desta maneira, foi constatado que, quando proteínas secretoras principais de Corynebacterium glutamicum CJ3P, que são desnecessárias para produção de lisina, são inativadas, a geração de espuma durante cultura do micro-organismo pode ser efetivamente controlada, desta maneira aumentando a produção de L-lisina, similar aos resultados dos Exemplos 5, 6 e 7. Exemplo 9: Construção e Avaliação de Cepas Inativadas em Proteína Secretora de Cepa de Produção de L-lisina KCCM11016P
[0074] A fim de examinar os efeitos de coinativação de proteínas secretoras na cepa de produção de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, três cepas onde os genes de proteína secretora foram coinativados foram construídas da mesma maneira que descrito nos Exemplos 5, 6, 7 e 8. As cepas construídas onde uma combinação dos genes foi inativada foram chamadas "KCCM11016P- ΔNCgl0336/ΔNCgl0717", "KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl2912" e "KCCM11016P-ΔNCgl0717/ΔNCgl2912", e a quantidade de produção de L-lisina de cada uma das cepas construídas junto com a quantidade de espuma gerada foi examinada.
[0075] A fim de comparar a produção de lisina nas cepas, cada uma das cepas junto com a cepa controle foram culturadas da mesma maneira que descrito no Exemplo 5, 6, 7 ou 8. Após término de cultura, a quantidade de espuma gerada foi medida da mesma maneira que descrito no Exemplo 5, 6, 7 ou 8 e a concentração de L-lisina foi medida através de HPLC. Os resultados da medição são mostrados na Tabela 5 abaixo. Os resultados na Tabela 5 são os resultados de três experimentos repetidos, e produção de L-lisina foi avaliada com base no valor médio. Tabela 5
[0076] Como mostrado na Tabela 5 acima, a produção de lisina da cepa onde os genes NCgl0336/NCgl0717, NCgl0336/NCgl2912 ou NCgl0717/NCgl2912 foram coinativados aumentou cerca de 5% comparado com aquela da cepa parental KCCM11016P. Ainda, espuma na cultura da cepa onde os genes NCgl0336/NCgl0717, NCgl0336/NCgl2912 ou NCgl0717/NCgl2912 foram coinativados diminuiu cerca de 10-14% comparado com a cepa parental.
[0077] Desta maneira, foi constatado que, quando as proteínas secretoras principais de um micro-organismo do gênero Corynebacterium, que são desnecessárias para produção de lisina, são inativadas, a geração de espuma durante cultura do micro-organismo pode ser efetivamente controlada, desta maneira aumentando a produção de L-lisina. Exemplo 10: Construção e Avaliação de Cepa, onde todas as Proteínas Secretoras foram Inativadas, de Cepa de Produção de L-Lisina KCCM11016P
[0078] A fim de examinar os efeitos de inativação de todas as proteínas secretoras na cepa de produção de L-lisina Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, uma cepa onde todas as três proteínas secretoras foram inativadas foi construída da mesma maneira que descrito no Exemplo 5, 6, 7, 8 ou 9. A cepa foi chamada "KCCM11016P- ΔNCgl0336/ΔNCgl0717/ΔNCgl2912". A quantidade de produção de L- lisina da cepa construída junto com a quantidade de espuma gerada foi examinada.
[0079] A fim de examinar a produção de lisina da cepa, a cepa junto com a cepa controle foram culturadas da mesma maneira que descrito no Exemplo 5, 6, 7, 8 ou 9. Após término da cultura, a quantidade de espuma gerada foi medida da mesma maneira que descrito no Exemplo 5, 6, 7, 8 ou 9 e a concentração de L-lisina foi medida através de HPLC. Os resultados da medição são mostrados na Tabela 6 abaixo. Os resultados na Tabela 6 são os resultados de três experimentos repetidos, e produção de L-lisina foi avaliada com base no valor médio. Tabela 6
[0080] Como mostrado na Tabela 6 acima, a produção de L-lisina da cepa onde os genes NCgl0336, NCgl0717 e NCgl2912 foram todos inativados aumentou cerca de 7% comparado com aquela da cepa parental KCCM11016P. Ainda, espuma na cultura da cepa onde os genes NCgl0336, NCgl0717 e NCgl2912 foram todos inativados diminuiu cerca de 17% comparado com aquela da cepa parental.
[0081] Desta maneira, foi constatado que quando as proteínas secretoras principais de um micro-organismo do gênero Corynebacterium, que são desnecessárias para produção de lise, são inativadas, a geração de espuma durante cultura do micro-organismo pode ser efetivamente controlada, desta maneira aumentando a produção de L-lisina.
[0082] A partir dos resultados descritos acima, foi constatado que inativação das proteínas secretoras principais na cepa de produção de L-lisina tem o efeito de controle de espuma que é produzida em excesso durante a cultura, desta maneira aumentando uma habilidade em produzir L-lisina junto com o crescimento de células. As cepas KCCM11016P-ΔNCgl0336, KCCM11016P-ΔNCgl0717 e KCCM11016P-ΔNCgl2912 foram chamadas "CA01-2281", "CA01- 2279" e "CA01-2280", respectivamente. CA01-2279 e CA01-2280 foram internacionalmente depositadas com o Korean Culture Center of Microorganisms em 22 de novembro de 2013 sob números de acesso KCCM11481P (CA01-2279) e KCCM11482P (CA01-2280), respectivamente, e CA01-2281 foi intencionalmente depositado com o Korean Culture Center of Microorganisms em 13 de dezembro de 2013 sob número de acesso KCCM11502P (CA01-2281). Números de acesso Autoridade depositária: Korean Culture Center of Microorganisms; Número de acesso: KCCM11481P; Data de depósito: 22 de novembro de 2013. Autoridade depositária: Korean Culture Center of Microorganisms; Número de acesso: KCCM11482P; Data de depósito: 22 de novembro de 2013. Autoridade depositária: Korean Culture Center of Microorganisms; Número de acesso: KCCM11502P; Data de depósito: 13 de dezembro de 2013. 1/1
Claims (4)
1. Micro-organismo que produz L-lisina do gênero Corynebacterium, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma proteína secretora selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 7 e 13 é inativada.
2. Micro-organismo que produz L-lisina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.
3. Método para produção de L-lisina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cultura de um micro-organismo para produzir L-lisina no meio de cultura ou na célula do micro-organismo; e recuperação de L-lisina a partir do meio de cultura ou da célula, em que o micro-organismo é um micro-organismo que produz L-lisina do gênero Corynebacterium em que pelo menos uma proteína secretora selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 1, 7 e 13 é inativada.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.
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