RU2663135C2 - Микроорганизм, обладающий улучшенной способностью к продуцированию l-лизина, и способ производства l-лизина с использованием данного микроорганизма - Google Patents
Микроорганизм, обладающий улучшенной способностью к продуцированию l-лизина, и способ производства l-лизина с использованием данного микроорганизма Download PDFInfo
- Publication number
- RU2663135C2 RU2663135C2 RU2016147962A RU2016147962A RU2663135C2 RU 2663135 C2 RU2663135 C2 RU 2663135C2 RU 2016147962 A RU2016147962 A RU 2016147962A RU 2016147962 A RU2016147962 A RU 2016147962A RU 2663135 C2 RU2663135 C2 RU 2663135C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lysine
- microorganism
- seq
- strain
- production
- Prior art date
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 139
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 74
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 49
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 81
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 55
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 41
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims abstract description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 13
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 24
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 96
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 41
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 41
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 108030003594 Diaminopimelate decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010014468 Dihydrodipicolinate Reductase Proteins 0.000 description 1
- 102100028778 Endonuclease 8-like 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101100337176 Escherichia coli (strain K12) gltB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100505027 Escherichia coli (strain K12) gltD gene Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102220466851 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 4 chain_V59A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100024023 Histone PARylation factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101001123824 Homo sapiens Endonuclease 8-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001047783 Homo sapiens Histone PARylation factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101100004037 Saccharomyces cerevisiae (strain Kyokai no. 7 / NBRC 101557) AWA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 101100057034 Talaromyces wortmannii astB gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 101150070145 aspB gene Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150100742 dapL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- -1 fatty acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к продуцирующему L-лизин микроорганизму рода Corynebacterium. Указанный микроорганизм отличается тем, что в нем инактивирован по меньшей мере один секреторный белок, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs: 1, 7 и 13. Изобретение также относится к способу производства L-лизина. Настоящий способ включает культивирование указанного микроорганизма для продуцирования L-лизина в культуральную среду или клетку микроорганизма и извлечение L-лизина из культуральной среды или клетки. Настоящее изобретение позволяет осуществлять производство L-лизина с повышенной эффективностью. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 табл., 10 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к микроорганизму, обладающему повышенной способностью продуцировать L-лизин, и к способу производства L-лизина с использованием данного микроорганизма.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
L-лизин используют в производстве кормов для животных, лекарственных средств и косметических товаров для человека, и его получают ферментацией с использованием микроорганизмов рода Corynebacterium или рода Escherichia. В последние годы были проведены исследования для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов и методов ферментации.
Было проведено множество исследований с целью контролирования пенообразования в процессе ферментации дрожжей, которые используют в производстве пива и вина, и в недавних исследованиях были идентифицированы гены (AWA1, FPG1 и CFG1), влияющие на пенообразование (Shimoi H. et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 2018-25; Blasco L. et al., Yeast. 2011, 28: 437-51; Blasco L. et al., J. Agric. Food Chem. 2012, 60: 10796-07). В данных исследованиях было установлено, что при использовании штамма, в котором эти гены инактивированы, пенообразование значительно уменьшается по сравнению с использованием исходного штамма, в то время как при использовании штамма, избыточно экспрессирующего данные гены, пенообразование увеличивается.
Пенообразование при культивировании дрожжей включает ряд следующих процессов. Во-первых, маннопротеин смешивается с мелкими пузырьками газа, возникающими в процессе ферментации. В это время пузырьки газа изнутри становятся гидрофобными, а снаружи пузырьки газа становятся гидрофильными. Вследствие этого, вязкость культуральной среды увеличивается, так что не только различные белки, но и клетки смешиваются, что приводит к образованию пены (Swart C. W. et al., FEMS Yeast Res. 2012, 12: 867-69).
При производстве пива с использованием дрожжей соответствующая степень пенообразования необходима, однако при ферментации микроорганизмов, используемых для производства больших количеств полезных продуктов, таких как аминокислоты, пенообразование следует подавлять. Если при культивировании образуется избыточное количество пены, вязкость культуральной среды будет увеличиваться и, следовательно, скорость переноса кислорода (СПК) в культуральной среде будет снижаться, и в серьезных случаях будет происходить лизис клеток. Использование большого количества антивспенивателя для подавления пенообразования может увеличивать производственные затраты в промышленных условиях и может оказывать неблагоприятный эффект на рост клеток.
Соответственно, авторы настоящего изобретения провели скрининг генов микроорганизмов рода Corynebacterium, связанных с повышенным пенообразованием, и обнаружили, что при инактивации таких генов пенообразование эффективно контролируется, так что способность к продуцированию L-лизина у штамма возрастает, что и составило настоящее изобретение.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
Целью настоящего изобретения является предоставление микроорганизма рода Corynebacterium, обладающего повышенной способностью к продуцированию L-лизина.
Другой целью настоящего изобретения является предложение способа производства L-лизина с использованием микроорганизма рода Corynebacterium.
Техническое решение
Для достижения вышеуказанных целей в одном аспекте нестоящего изобретения предложен микроорганизм рода Corynebacterium, в котором инактивирован по меньшей мере один секреторный белок, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs: 1, 7 и 13.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу производства L-лизина путем культивирования микроорганизма рода Corynebacterium.
Полезные эффекты
Микроорганизм по настоящему изобретению представляет собой микроорганизм, в котором секреторные белки, вовлеченные в пенообразование, инактивированы, так что способность данного штамма к продуцированию L-лизина возрастает. При использовании данного штамма пенообразование уменьшается, его можно культивировать без необходимости увеличения или без необходимости добавления большого количества антивспенивателя, и при этом способность штамма к продуцированию L-лизина может возрастать. Кроме того, в условиях промышленного производства могут быть достигнуты такие эффекты, как упрощение производственного процесса и снижение производственных затрат, а также эффективное производство L-лизина.
Способ по изобретению
Далее настоящее изобретение описано более подробно.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к микроорганизму рода Corynebacterium, в котором инактивирован по меньшей мере один секреторный белок, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs: 1, 7 и 13. Если при массовом культивировании микроорганизмов с целью производства L-лизина образуется избыточное количество пены, вязкость культуральной среды будет увеличиваться, так что скорость переноса кислорода (СПК) в культуральной среде будет снижаться, и в серьезных случаях также будет происходить лизис клеток. Иными словами, считалось, что инактивация секреторных белков, являющихся причиной пенообразования, с целью контроля пенообразования будет оказывать благоприятный эффект на производство лизина.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения для усовершенствования процесса ферментации при производстве L-лизина и для проведения скрининга основных секреторных белков, являющихся причиной пенообразования, которые не важны для продуцирования лизина, проводили культивирование Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (данный микроорганизм был описан как KFCC10881 и повторно депонирован в Международном органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором под учетным № KCCM11016P; корейский патент № 10-0159812) и затем выделяли пену, образующуюся в процессе ферментации, получая пептиды. Полученные пептиды анализировали и выбирали три белка, обнаруженные в наибольших количествах, таким образом, отбирая пептиды, кодируемые генами с учетными номерами NCBI NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 для Corynebacterium glutamicum ATCC13032.
В настоящем изобретении пептид, кодируемый геном NCgl0336, представляет собой эстеразу, эндогенно существующую в Corynebacterium glutamicum. В частности, пептид может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и белок с аминокислотной последовательностью, имеющей гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, особенно предпочтительно по меньшей мере 97% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, также охвачен понятием «секреторный белок по настоящему изобретению» при условии, что он представляет собой белок, имеющий эстеразную активность. Однако секреторный белок, используемый по настоящему изобретению, не ограничивается ими, поскольку аминокислотная последовательность белка, проявляющего эстеразную активность, может отличаться в зависимости от вида или штамма микроорганизмов. Кроме того, очевидно, что белок с аминокислотной последовательностью, содержащей делецию, модификацию, замену или делецию одной или нескольких аминокислот в одном или более положениях аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, также входит в объем настоящего изобретения при условии, что он обладает последовательностью, имеющей гомологию с последовательностью SEQ ID NO: 1, и обладает биологической активностью, практически равной или сходной с активностью белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
В настоящем изобретении ген NCgl0336 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и нуклеотидная последовательность, имеющая гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно 95%, особенно предпочтительно 97% с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, также входит в объем настоящего изобретения. Кроме того, варианты последовательности, которые кодируют ту же аминокислоту вследствие вырожденности генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Более того, полинуклеотид, кодирующий NCgl0336 по настоящему изобретению, может представлять собой вариант, кодирующий NCgl0336, который может гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2 или зондом, полученным из нуклеотидной последовательности, в строгих условиях и который нормально функционирует.
В настоящем изобретении пептид, кодируемый геном NCgl0717, представляет собой эстеразу, эндогенно существующую в Corynebacterium glutamicum. В частности, пептид может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и белок с аминокислотной последовательностью, имеющей гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, особенно предпочтительно по меньшей мере 97% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, также охвачен понятием «секреторный белок по настоящему изобретению» при условии, что он представляет собой белок, имеющий эстеразную активность. Однако секреторный белок, используемый по настоящему изобретению, не ограничивается ими, поскольку аминокислотная последовательность белка, проявляющего эстеразную активность, может отличаться в зависимости от вида или штамма микроорганизмов. Кроме того, очевидно, что белок с аминокислотной последовательностью, содержащей делецию, модификацию, замену или делецию одной или нескольких аминокислот в одном или более положениях аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, также входит в объем настоящего изобретения при условии, что он обладает последовательностью, имеющей гомологию с последовательностью SEQ ID NO: 7, и обладает биологической активностью, практически равной или сходной с активностью белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.
В настоящем изобретении ген NCgl0717 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8, и нуклеотидная последовательность, имеющая гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно 95%, особенно предпочтительно 97% с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, также входит в объем настоящего изобретения. Кроме того, варианты последовательности, которые кодируют ту же аминокислоту вследствие вырожденности генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Более того, полинуклеотид, кодирующий NCgl0717 по настоящему изобретению, может представлять собой вариант, кодирующий NCgl0717, который может гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8 или зондом, полученным из нуклеотидной последовательности, в строгих условиях и который нормально функционирует.
В настоящем изобретении пептид, кодируемый геном NCgl2912, представляет собой эстеразу, эндогенно существующую в Corynebacterium glutamicum. В частности, пептид может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и белок с аминокислотной последовательностью, имеющей гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, особенно предпочтительно по меньшей мере 97% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, также охвачен понятием «секреторный белок по настоящему изобретению» при условии, что он представляет собой белок, имеющий эстеразную активность. Однако секреторный белок, используемый по настоящему изобретению, не ограничивается ими, поскольку аминокислотная последовательность белка, проявляющего эстеразную активность, может отличаться в зависимости от вида или штамма микроорганизмов. Кроме того, очевидно, что белок с аминокислотной последовательностью, содержащей делецию, модификацию, замену или делецию одной или нескольких аминокислот в одном или более положениях аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, также входит в объем настоящего изобретения при условии, что он обладает последовательностью, имеющей гомологию с последовательностью SEQ ID NO: 13, и обладает биологической активностью, практически равной или сходной с активностью белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
В настоящем изобретении ген NCgl2912 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, и нуклеотидная последовательность, имеющая гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно 95%, особенно предпочтительно 97% с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 14, также входит в объем настоящего изобретения. Кроме того, варианты последовательности, которые кодируют ту же аминокислоту вследствие вырожденности генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Более того, полинуклеотид, кодирующий NCgl2912 по настоящему изобретению, может представлять собой вариант, кодирующий NCgl2912, который может гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 14 или зондом, полученным из нуклеотидной последовательности, в строгих условиях и который нормально функционирует.
Используемый в настоящем документе термин «гомология» означает идентичность с конкретной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью, и она может быть выражена в процентах. В спецификации гомологичная последовательность, имеющая активность, равную или аналогичную активности конкретной аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, характеризуется «% гомологии». Гомологию аминокислотной последовательности можно определять с использованием, например, алгоритма BLAST (смотри Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) или FASTA, описанного Pearson (смотри Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Программы, называемые BLASTN и BLASTX, были разработаны на основе данного алгоритма BLAST (смотри www.ncbi.nlm.nih.gov).
Используемый в настоящем документе термин «строгие условия» означает условия, допускающие специфическую гибридизацию между полинуклеотидами. Например, такие строгие условия описаны подробно в сборниках J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2е издание, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York.
Описанную в настоящем документе «инактивацию» можно осуществлять любыми способами инактивации, известными в данной области. В настоящем документе «инактивация» означает, что экспрессия эндогенного гена снижена по сравнению с экспрессией в штамме дикого типа или ген не экспрессируется, либо ген неактивен или имеет сниженную активность, даже если он экспрессируется. Инактивацию можно осуществлять за счет мутации всей или части нуклеотидной последовательности, либо всей или части последовательности, регулирующей ее экспрессию, путем делеции, замены, вставки или их сочетания.
В качестве конкретного примера, микроорганизм с инактивированным эндогенным геном можно получать путем трансформации микроорганизма рода Corynebacterium рекомбинантным вектором, содержащим фрагмент гена, полученный в результате удаления открытой рамки считывания эндогенного гена, тем самым внося делецию или мутацию в эндогенный ген. Вставку гена в хромосому можно осуществлять любым способом, известным в данной области.
Используемый в настоящем документе термин «эндогенные» фермент и активность относится к ферменту, исходно присутствующему в микроорганизме или клетке, и к активности данного фермента. А именно, термин означает фермент и его активность до того, как фермент и активность были модифицированы.
Используемый в настоящем документе термин «рекомбинантный вектор» означает конструкт ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность гена, кодирующего целевой белок, функционально связанную с соответствующей регуляторной последовательностью таким образом, чтобы была возможной экспрессия целевого гена в соответствующей клетке-хозяине. Регуляторная последовательность включает промотор, способный инициировать транскрипцию, любой оператор для регуляции этой транскрипции, последовательность, кодирующую соответствующий сайт связывания рибосомы на мРНК, и последовательность для регулирования терминации транскрипции и трансляции. После введения трансформацией в соответствующего хозяина вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или сам может встраиваться в геном. Вектор, используемый по настоящему изобретению, не имеет конкретных ограничений и может быть любым вектором, известным в данной области, при условии, что он способен реплицироваться в хозяине.
Примеры вектора, используемого в конструировании рекомбинантного вектора, включают природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, фаговый вектор или космидный вектор, используемый по настоящему изобретению, может представлять собой pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, Charon21A или тому подобное, и плазмидный вектор, используемый по настоящему изобретению, может быть pDZ типа, pBR типа, pUC типа, pBluescriptII типа, pGEM типа, pTZ типа, pCL типа, pET типа или тому подобным. Вектор, который можно использовать по настоящему изобретению, не имеет конкретных ограничений, и любой известный экспрессионный вектор можно использовать по настоящему изобретению.
Используемый в настоящем документе термин «трансформация» означает введение вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина для создания возможности экспрессии белка, кодируемого полинуклеотидом, в клетке-хозяине. Введенный полинуклеотид может быть вставлен и расположен в хромосоме клетки-хозяина или расположен вне хромосомы при условии, что он может быть экспрессирован в клетке-хозяине. Кроме того, полинуклеотиды включают ДНК и РНК, которые кодируют целевой белок. При условии, что полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней, он может быть введен в любой форме. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой полинуклеотидный конструкт, содержащий все элементы, необходимые для самоэкспрессии. Экспрессионная кассета, как правило, содержит промотор, который функционально связан с открытой рамкой считывания (далее в настоящем документе сокращенно называемой «ОРС») гена, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме самореплицирующегося экспрессионного вектора. Кроме того, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина сам по себе и быть функционально связан с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине.
В качестве исходного штамма, в который будет введен рекомбинантный вектор, можно использовать любой микроорганизм, обладающий способностью к продуцированию L-лизина, без ограничений. В частности, можно использовать микроорганизм рода Corynebacterium или рода Brevibacterium. Более конкретно, можно использовать микроорганизм Corynebacterium glutamicum.
Используемое в настоящем документе выражение «микроорганизм, обладающий способностью к продуцированию L-лизина» относится к микроорганизму, полученному путем манипуляций, как правило, с известным геном для того, чтобы сделать возможным продуцирование L-лизина. Например, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, полученный либо путем вставки одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из aspB (ген, кодирующий аспартат-аминотрансферазу), lysC (ген, кодирующий аспартат-киназу), asd (ген, кодирующий аспартат-полуальдегид-дегидрогеназу), dapA (ген, кодирующий дигидродипиколинат-синтазу), dapB (ген, кодирующий дигидродипиколинат-редуктазу) и lysA (ген, кодирующий диаминопимелат-декарбоксилазу), которые являются эндогенными в микроорганизме рода Corynebacterium и участвуют в продуцировании L-аминокислот, либо путем воздействия на ауксотрофный по L-лейцину мутантный штамм N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (NTG).
Более конкретно, микроорганизмы рода Corynebacterium, используемые по настоящему изобретению, представляют собой Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (данный микроорганизм был описан как KFCC10881 и повторно депонирован в Международном органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором под учетным № KCCM11016P; корейский патент № 10-0159812), Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (корейский патент № 10-0924065), Corynebacterium glutamicum L-лизин-продуцирующий штамм KCCM11347P (данный микроорганизм был описан как KFCC10750 и повторно депонирован в Международном органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором под учетным № KCCM11347P; корейский патент № 10-0073610) и Corynebacterium glutamicum штамм CJ3P (Binder et al., Genome Biology 2012, 13: R40), но не ограничиваются ими.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизм, трансформированный в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой Corynebacterium glutamicum KCCM11502P, KCCM11481P или KCCM11482P.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу производства L-лизина с использованием трансформированного микроорганизма. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу производства L-лизина, включающему этапы: культивирования микроорганизма по настоящему изобретению для продуцирования L-лизина в культуре или клетке микроорганизма; и извлечения L-лизина из культуральной среды.
В способе по настоящему изобретению культивирование микроорганизма рода Corynebacterium можно проводить с использованием любых условий культивирования и метода культивирования, которые известны в данной области.
Например, среда, которую можно использовать для культивирования микроорганизма рода Corynebacterium, описана в сборнике Manual of Methods for General Bacteriology, выпущенном Американским обществом бактериологов (Washington D.C., USA, 1981).
Источники сахаров, которые можно использовать в среде, включают сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал или целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло или кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота или линолевая кислота; спирты, такие как глицерин или этанол, а также органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти вещества можно использовать отдельно или в смеси.
Источники азота, которые можно использовать, включают соединения, содержащие органический азот, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, кукурузный экстракт, соевая мука и мочевина, или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота также можно использовать отдельно или в виде смеси.
Источники фосфора, которые можно использовать, включают дигидрофосфат калия или гидрофосфат дикалия, либо соответствующие соли натрия. Кроме того, культуральная среда должна содержать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, которые необходимы для роста. И наконец, в дополнение к вышеуказанным веществам можно использовать такие необходимые для роста вещества, как аминокислоты и витамины. Более того, в культуральную среду можно добавлять соответствующие предшественники. Указанные вещества можно добавлять в культуру отдельными порциями или непрерывно в процессе культивирования, используя подходящий метод.
pH культуры можно контролировать соответствующим образом, используя щелочные соединения, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак или водный раствор аммиака, либо кислые соединения, такие как фосфорная кислота или серная кислота. Пенообразование можно контролировать с помощью антивспенивателей, таких как сложные эфиры жирных кислот и полигликолей. Аэробные условия поддерживают за счет подачи в культуру кислорода или кислородсодержащих газовых смесей (например, воздуха). Температура культуры, как правило, составляет от 20°C до 45°C, предпочтительно от 25°C до 40°C. Культивирование можно продолжать до того, как будет произведено нужное количество L-лизина. В частности, время культивирования составляет 10-160 часов.
В способе по настоящему изобретению культивирование можно выполнять непрерывным или периодическим методом, либо путем периодической подпитки или повторяющейся периодической подпитки культуры. Такое культивирование можно осуществлять любым методом, хорошо известным в данной области.
Далее настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако следует понимать, что эти примеры предназначены исключительно для иллюстративных целей и не должны ограничивать объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1: Скрининг секреторных белков, связанных с пенообразованием в процессе культивирования
В данном примере для скрининга секреторных белков, являющихся причиной пенообразования, проводили эксперимент следующим образом.
Во-первых, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (данный микроорганизм был описан как KFCC10881 и повторно депонирован в Международном органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором под учетным № KCCM11016P; корейский патент № 10-0159812) культивировали, используя 1-л ферментер, и затем только пену, образовавшуюся в процессе ферментации, выделяли и концентрировали в 15-мл пробирке.
Для идентификации белков, содержащихся в концентрированном образце пены, соответствующее количество красителя-«свидетеля», содержащего сурфактант, добавляли к образцу, который затем подвергали электрофорезу в 8% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия окрашивали красителем Кумасси голубым. Затем окрашенные полосы белка вырезали, проводили расщепление трипсином для получения пептидов и аминокислотные последовательности полученных пептидов анализировали методом ЖХ-МС/МС.
Анализируемые пептиды идентифицировали путем поиска генов микроорганизма рода Corynebacterium, используя исследовательский алгоритм Blast, предоставленный Национальным центром биотехнологической информации (NCBI). Среди идентифицированных пептидов были выбраны три белка, обнаруженные в наибольших количествах, и в конечном итоге были выбраны гены, кодирующие данные белки. Выбранные гены имели учетные номера NCBI NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912.
Пример 2: Конструирование рекомбинантной плазмиды для инактивации гена секреторного белка NCgl0336
Для конструирования рекомбинантной плазмиды, способной инактивировать ген NCgl0336 на хромосоме Corynebacterium, получали аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 1) и нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 2) NCgl0336 на основании нуклеотидной последовательности, депонированной в Genbank NIH. Для получения фрагмента гена путем удаления открытой рамки считывания NCgl0336 были сконструированы праймеры SEQ ID NOs: 3-6, исходя из последовательности SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO. 3: 5'-atcctctagagtcgacGAAGCCTCTGCACCTCGCTG-3';
SEQ ID NO. 4: 5'-TATAGTTCGGTTCCGCGTCTCCAACGCATCCGGCC-3';
SEQ ID NO. 5: 5'-CGGAACCGAACTATACCACCGAGGGACGCATTCTC-3';
SEQ ID NO. 6: 5'-atgcctgcaggtcgacGCTCAAACGCACGAGCGAAG-3'.
Используя геномную ДНК Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы, проводили ПЦР с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, и набора праймеров SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 [Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]. Проводили 30 циклов ПЦР, каждый из которых состоял из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты.
В результате были получены NCgl0336-A и NCgl0336-B, которые являются фрагментами ДНК, представляющими собой 342-п.н. фрагмент гена NCgl0336 и 315-п.н. фрагмент гена NCgl0336, соответственно. Фрагмент ДНК, полученный методом ПЦР-амплификации, лигировали в плазмиду pDZ (корейский патент № 10-0924065) с использованием набора Infusion cloning kit (Invitrogen), затем вводили трансформацией в E. coli DH5α и высевали клетки на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонию, трансформированную плазмидой, в которую был вставлен нужный ген, отбирали с помощью ПЦР и затем плазмиду выделяли с использованием общеизвестной методики выделения плазмид. Плазмида была названа «pDZ-ΔNCgl0336». pDZ-ΔNCgl0336 представляет собой плазмиду, в которой 503-п.н. фрагмент гена NCgl0336 был делетирован.
Пример 3: Конструирование рекомбинантной плазмиды для инактивации гена секреторного белка NCgl0717
Для конструирования рекомбинантной плазмиды, способной инактивировать ген NCgl0717 на хромосоме Corynebacterium, получали аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 7) и нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 8) NCgl0717 на основании нуклеотидной последовательности, депонированной в Genbank NIH. Для получения фрагмента гена путем удаления открытой рамки считывания NCgl0717 были сконструированы праймеры SEQ ID NOs: 9-12, исходя из последовательности SEQ ID NO: 8.
SEQ ID NO. 9: 5'-CCGGGGATCCTCTAGAGTTCGCGGATAAATGGG-3';
SEQ ID NO. 10: 5'-CACGTGAAATTCAGGTCGCGTGGTTCACCTCCGAAG-3';
SEQ ID NO. 11: 5'-CTTCGGAGGTGAACCACGCGACCTGAATTTCACGTG-3';
SEQ ID NO. 12: 5'-GCAGGTCGACTCTAGAGGTCCCATGATTGTTCTG-3'.
Используя геномную ДНК Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы, проводили ПЦР с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, и набора праймеров SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12. Проводили 30 циклов ПЦР, каждый из которых состоял из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты.
В результате были получены NCgl0717-A и NCgl0717-B, которые являются фрагментами ДНК, представляющими собой 493-п.н. фрагмент гена NCgl0717 и 491-п.н. фрагмент гена NCgl0717, соответственно. Фрагмент ДНК, полученный методом ПЦР-амплификации, лигировали в плазмиду pDZ с использованием набора Infusion cloning kit (Invitrogen), затем вводили трансформацией в E. coli DH5α и высевали клетки на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонию, трансформированную плазмидой, в которую был вставлен нужный ген, отбирали с помощью ПЦР и затем плазмиду выделяли с использованием общеизвестной методики выделения плазмид. Плазмида была названа «pDZ-ΔNCgl0717». pDZ-ΔNCgl0717 представляет собой плазмиду, в которой 786-п.н. фрагмент гена NCgl0717 был делетирован.
Пример 4: Конструирование рекомбинантной плазмиды для инактивации гена секреторного белка NCgl2912
Для конструирования рекомбинантной плазмиды, способной инактивировать ген NCg2912 на хромосоме Corynebacterium, получали аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 13) и нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 14) NCgl2912 на основании нуклеотидной последовательности, депонированной в Genbank NIH. Для получения фрагмента гена путем удаления открытой рамки считывания NCgl2912 были сконструированы праймеры SEQ ID NOs: 15-18, исходя из последовательности SEQ ID NO: 14.
SEQ ID NO. 15: 5'-CCGGGGATCCTCTAGAGCTGCAAGAAGTGCGAC-3';
SEQ ID NO. 16: 5'-CTCGTAGTCGCTAGCACCTATTACGGGAGGTC-3';
SEQ ID NO. 17: 5'-GACCTCCCGTAATAGGTGCTAGCGACTACGAG-3';
SEQ ID NO. 18: 5'-GCAGGTCGACTCTAGACCCGAGCTATCTAACAC-3'.
Используя геномную ДНК Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы, проводили ПЦР с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, и набора праймеров SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18. Проводили 30 циклов ПЦР, каждый из которых состоял из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты.
В результате были получены NCgl2912-A и NCgl2912-B, которые являются фрагментами ДНК, представляющими собой 444-п.н. фрагмент гена NCgl2912 и 636-п.н. фрагмент гена NCgl2912, соответственно. Фрагмент ДНК, полученный методом ПЦР-амплификации, лигировали в плазмиду pDZ с использованием набора Infusion cloning kit (Invitrogen), затем вводили трансформацией в E. coli DH5α и высевали клетки на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонию, трансформированную плазмидой, в которую был вставлен нужный ген, отбирали с помощью ПЦР и затем плазмиду выделяли с использованием общеизвестной методики выделения плазмид. Плазмида была названа «pDZ-ΔNCgl2912». pDZ-ΔNCgl2912 представляет собой плазмиду, в которой 128-п.н. фрагмент гена NCgl2912 был делетирован.
Пример 5: Конструирование и оценка штаммов с инактивированными генами секреторных белков, полученных из продуцирующего лизин штамма KCCM11016P
Каждую из трех рекомбинантных плазмид (pDZ-ΔNCgl0336, pDZ-ΔNCgl0717 и pDZ-ΔNCgl2912), сконструированных в примерах 2, 3 и 4, вводили трансформацией в Corynebacterium glutamicum KCCM11016P методом, основанным на применении электрического импульса, и штаммы, в которых целевой ген был инактивирован за счет гомологичной рекомбинации, получали методом ПЦР. Полученные штаммы были названы «KCCM11016P-ΔNCgl0336», «KCCM11016P-ΔNCgl0717» и «KCCM11016P-ΔNCgl2912», соответственно.
Каждый из трех штаммов и контрольный штамм инокулировали в 25-мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 25 мл среды для посева, приведенной ниже, и культивировали со встряхиванием при 200 об/мин и при температуре 30°C в течение 20 часов. Затем 1 мл этой культуры для посева инокулировали в 250-мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 24 мл среды для продуцирования, приведенной ниже, и культивировали со встряхиванием при 200 об/мин и при температуре 37°C в течение 96 часов. Состав среды для посева и среды для продуцирования был следующим.
Среда для посева (pH 7,0)
20 г глюкозы, 10 г (NH4)2SO4, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH2PO4, 8 г K2HPO4, 0,5 г MgSO4·7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина HCl, 2000 мкг кальция пантотената и 2000 мкг никотинамида (на литр дистиллированной воды).
Среда для продуцирования (pH 7,0)
100 г глюкозы, 40 г (NH4)2SO4, 2,5 г соевого белка, 5 г кукурузного экстракта (твердые вещества), 3 г мочевины, 1 г KH2PO4, 0,5 г MgSO4·7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина HCl, 2000 мкг кальция пантотената, 3000 мкг никотинамида и 30 г CaCO3 (на литр дистиллированной воды).
После завершения процесса культивирования культуру переносили в градуированный цилиндр и измеряли высоту образовавшейся пены в культуре, а также измеряли концентрацию L-лизина в культуре методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 1, ниже. Результаты в таблице 1 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.
Таблица 1
| Лизин (г/л) | Пена (см/л) | |||||
| Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | |
| KCCM11016P | 43,5 | 43,1 | 43,4 | 4,5 | 5,0 | 4,7 |
| KCCM11016P-ΔNCgl0336 | 46,1 | 45,8 | 45,7 | 4,1 | 4,6 | 4,3 |
| KCCM11016P-ΔNCgl0717 | 45,9 | 46,4 | 46,1 | 3,9 | 4,4 | 4,0 |
| KCCM11016P-ΔNCgl2912 | 45,8 | 46,0 | 45,8 | 4,2 | 4,7 | 4,4 |
Как показано в таблице 1, выше, продуцирование L-лизина штаммом в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, возрастало примерно на 6% по сравнению с таковым у исходного штамма KCCM11016P. Кроме того, пена в культуре штамма в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, уменьшалась примерно на 6-15% по сравнению с пеной в культуре исходного штамма.
Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков микроорганизма Corynebacterium sp., которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизма можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина.
Пример 6: Конструирование и оценка штаммов с инактивированными секреторными белками, полученных из продуцирующего лизин штамма KCCM11016P
Для изучения того, являются ли эффекты инактивации секреторных белков в продуцирующем L-лизин штамме Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (корейский патент № 10-0924065), имеющем более эффективный биосинтетический путь продуцирования лизина, аналогичными результатам эксперимента примера 5, штаммы, в которых каждый из трех секреторных белков был инактивирован, конструировали таким же образом, как описано в примере 5. Сконструированные штаммы были названы «KCCM10770P-ΔNCgl0336», «KCCM10770P-ΔNCgl0717» и «KCCM10770P-ΔNCgl2912». Для каждого из сконструированных штаммов определяли количество продуцированного L-лизина, наряду с количеством образовавшейся пены.
Для изучения продуцирования лизина штаммами каждый из штаммов, наряду с контрольным штаммом, культивировали таким же образом, как описано в примере 5. После завершения культивирования измеряли количество образовавшейся пены таким же образом, как описано в примере 5, и концентрацию L-лизина измеряли методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 2, ниже. Результаты в таблице 2 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.
Таблица 2
| Лизин (г/л) | Пена (см/л) | |||||
| Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | |
| KCCM10770P | 46,1 | 46 | 46,3 | 5,1 | 5,6 | 5,2 |
| KCCM10770P-ΔNCgl0336 | 47,9 | 48,2 | 47,7 | 4,6 | 4,9 | 4,5 |
| KCCM10770P-ΔNCgl0717 | 48,3 | 47,7 | 48,1 | 4,6 | 4,6 | 4,3 |
| KCCM10770P-ΔNCgl2912 | 47,9 | 48,5 | 48,2 | 4,9 | 5,4 | 5,0 |
Как показано в таблице 2, выше, продуцирование L-лизина штаммом в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, возрастало примерно на 4% по сравнению с таковым у исходного штамма KCCM11016P. Кроме того, пена в культуре штамма в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, уменьшалась примерно на 4-18% по сравнению с пеной в культуре исходного штамма.
Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (корейский патент № 10-0924065), которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизмов можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина, аналогично результатам примера 4.
Пример 7: Конструирование и оценка штаммов с инактивированными секреторными белками, полученных из продуцирующего L-лизин штамма KCCM11347P
Для изучения эффектов инактивации секреторных белков в продуцирующем L-лизин штамме Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (данный микроорганизм был описан как KFCC10750 и повторно депонирован в Международном органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором под учетным № KCCM11347P; корейский патент № 10-0073610), сконструированном путем искусственной мутации, были сконструированы штаммы, в которых каждый из трех секреторных белков был инактивирован, таким же образом, как описано в примере 5 или 6. Сконструированные штаммы были названы «KCCM11347P-ΔNCgl0336», «KCCM11347P-ΔNCgl0717» и «KCCM11347P-ΔNCgl2912». Для каждого из сконструированных штаммов определяли количество продуцированного L-лизина, наряду с количеством образовавшейся пены.
Для изучения продуцирования лизина штаммами каждый из штаммов, наряду с контрольным штаммом, культивировали таким же образом, как описано в примере 5 или 6. После завершения культивирования измеряли количество образовавшейся пены таким же образом, как описано в примере 5 или 6, и концентрацию L-лизина измеряли методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 3, ниже. Результаты в таблице 3 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.
Таблица 3
| Лизин (г/л) | Пена (см/л) | |||||
| Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | |
| KCCM11347P | 38,6 | 38,2 | 38,3 | 5,4 | 6,0 | 5,7 |
| KCCM11347P-ΔNCgl0336 | 40,1 | 40,2 | 40,1 | 5,1 | 5,1 | 5,3 |
| KCCM11347P-ΔNCgl0717 | 40,1 | 39,7 | 40,5 | 4,7 | 5,1 | 5,0 |
| KCCM11347P-ΔNCgl2912 | 39,8 | 40,3 | 40,3 | 5,1 | 5,6 | 5,4 |
Как показано в таблице 3, выше, продуцирование лизина штаммом в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, возрастало примерно на 5% по сравнению с таковым у исходного штамма KCCM11347P. Кроме того, пена в культуре штамма в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, уменьшалась примерно на 4-15% по сравнению с пеной у исходного штамма.
Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (корейский патент № 94-0001307), которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизмов можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина, аналогично результатам примеров 5 и 6.
Пример 8: Конструирование и оценка штаммов с инактивированными секреторными белками, полученных из продуцирующего L-лизин штамма CJ3P
Для изучения эффектов инактивации секреторных белков в штамме Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13: R40), обладающем способностью к продуцированию L-лизина, который сконструирован путем внесения трех мутаций [pyc(P458S), hom(V59A) и lysC(T311I)] в штамм дикого типа, аналогично примерам 5, 6 и 7 были сконструированы штаммы, в которых каждый из трех секреторных белков был инактивирован таким же образом, как описано в примере 5, 6 или 7. Сконструированные штаммы были названы «CJ3P-ΔNCgl0336», «CJ3P-ΔNCgl0717» и «CJ3P-ΔNCgl2912». Для каждого из сконструированных штаммов определяли количество продуцированного L-лизина, наряду с количеством образовавшейся пены.
Для изучения продуцирования лизина штаммами каждый из штаммов, наряду с контрольным штаммом, культивировали таким же образом, как описано в примере 5, 6 или 7. После завершения культивирования измеряли количество образовавшейся пены таким же образом, как описано в примере 5, 6 или 7, и концентрацию L-лизина измеряли методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 4, ниже. Результаты в таблице 4 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.
Таблица 4
| Лизин (г/л) | Пена (см/л) | |||||
| Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | |
| CJ3P | 7,9 | 8 | 8,1 | 8,7 | 9,1 | 8,6 |
| CJ3P-ΔNCgl0336 | 8,5 | 8,6 | 8,8 | 7,8 | 8,3 | 7,9 |
| CJ3P-ΔNCgl0717 | 8,4 | 8,5 | 8,7 | 7,7 | 7,5 | 7,2 |
| CJ3P-ΔNCgl2912 | 8,7 | 8,6 | 8,6 | 8,4 | 8,6 | 8,2 |
Как показано в таблице 4, выше, продуцирование лизина штаммом в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, возрастало примерно на 8% по сравнению с таковым у исходного штамма CJ3P. Кроме того, пена в культуре штамма в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, уменьшалась примерно на 5-17% по сравнению с пеной у исходного штамма.
Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков Corynebacterium glutamicum CJ3P, которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизма можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина, аналогично результатам примеров 5, 6 и 7.
Пример 9: Конструирование и оценка штаммов с инактивированными секреторными белками, полученных из продуцирующего L-лизин штамма KCCM11016P
Для изучения эффектов совместной инактивации секреторных белков в продуцирующем L-лизин штамме Corynebacterium glutamicum KCCM11016P были сконструированы три штамма, в которых гены секреторных белков были совместно инактивированы таким же образом, как описано в примерах 5, 6, 7 и 8. Сконструированные штаммы, в которых была проведена инактивация сочетания генов, были названы «KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717», «KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl2912» и «KCCM11016P-ΔNCgl0717/ΔNCgl2912», и для каждого из сконструированных штаммов было измерено количество продуцированного L-лизина, наряду с количеством образовавшейся пены.
Для сравнения продуцирования лизина штаммами каждый из штаммов, наряду с контрольным штаммом, культивировали таким же образом, как описано в примере 5, 6, 7 или 8. После завершения культивирования измеряли количество образовавшейся пены таким же образом, как описано в примере 5, 6, 7 или 8, и концентрацию L-лизина измеряли методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 5, ниже. Результаты в таблице 5 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.
Таблица 5
| Лизин (г/л) | Пена (см/л) | |||||
| Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | |
| KCCM11016P | 43,3 | 43,1 | 43,4 | 4,6 | 4,9 | 4,7 |
| KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717 | 46,1 | 45,7 | 45,2 | 4,4 | 4 | 4,2 |
| KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl2912 | 45,5 | 45,9 | 46,1 | 4,2 | 4,3 | 4,4 |
| KCCM11016P-ΔNCgl0717/ΔNCgl2912 | 46 | 45,1 | 45,7 | 4 | 3,9 | 4,5 |
Как показано в таблице 5, выше, продуцирование лизина штаммом, в котором гены NCgl0336/NCgl0717, NCgl0336/NCgl2912 или NCgl0717/NCgl2912 были совместно инактивированы, возрастало примерно на 5% по сравнению с таковым у исходного штамма KCCM11016P. Кроме того, пена в культуре штамма, в котором гены NCgl0336/NCgl0717, NCgl0336/NCgl2912 или NCgl0717/NCgl2912 были совместно инактивированы, уменьшалась примерно на 10-14% по сравнению с пеной у исходного штамма.
Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков микроорганизма рода Corynebacterium, которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизма можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина.
Пример 10: Конструирование и оценка штамма, в котором все секреторные белки инактивированы, полученного из продуцирующего L-лизин штамма KCCM11016P
Для изучения эффектов инактивации всех секреторных белков в продуцирующем L-лизин штамме Corynebacterium glutamicum KCCM11016P был сконструирован штамм, в котором все три секреторных белка были инактивированы таким же образом, как описано в примере 5, 6, 7, 8 или 9. Штамм был назван «KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717/ΔNCgl2912». Для сконструированного штамма определяли количество продуцированного L-лизина, наряду с количеством образовавшейся пены.
Для изучения продуцирования лизина штаммом данный штамм, наряду с контрольным штаммом, культивировали таким же образом, как описано в примере 5, 6, 7, 8 или 9. После завершения культивирования измеряли количество образовавшейся пены таким же образом, как описано в примере 5, 6, 7, 8 или 9, и концентрацию L-лизина измеряли методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 6, ниже. Результаты в таблице 6 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.
Таблица 6
| Лизин (г/л) | Пена (см/л) | |||||
| Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | Проба 1 | Проба 2 | Проба 3 | |
| KCCM11016P | 43,4 | 43,3 | 43,1 | 4,7 | 4,6 | 5,0 |
| KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717/ ΔNCgl2912 |
46,4 | 46,3 | 46,7 | 3,9 | 4,1 | 3,8 |
Как показано в таблице 6, выше, продуцирование лизина штаммом, в котором все гены NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 были инактивированы, возрастало примерно на 7% по сравнению с таковым у исходного штамма KCCM11016P. Кроме того, пена в культуре штамма, в котором все гены NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 были инактивированы, уменьшалась примерно на 17% по сравнению с пеной у исходного штамма.
Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков микроорганизма рода Corynebacterium, которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизма можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина.
На основании вышеописанных результатов установлено, что инактивация основных секреторных белков в продуцирующем L-лизин штамме имеет эффект контролирования пены, избыточно образующейся при культивировании, за счет этого повышается способность к продуцированию L-лизина, наряду с ростом клеток. Штаммы KCCM11016P-ΔNCgl0336, KCCM11016P-ΔNCgl0717 и KCCM11016P-ΔNCgl2912 были названы «CA01-2281», «CA01-2279» и «CA01-2280», соответственно. Штаммы CA01-2279 и CA01-2280 были депонированы по форме «международное патентное депонирование» в Корейском центре культур микроорганизмов 22 ноября 2013 г. под учетными номерами KCCM11481P (CA01-2279) и KCCM11482P (CA01-2280), соответственно, и штамм CA01-2281 был депонирован по форме «международное патентное депонирование» в Корейском центре культур микроорганизмов 13 декабря 2013 г. под учетным номером KCCM11502P (CA01-2281).
Учетные номера
Депозитарный орган: Корейский центр культур микроорганизмов;
Учетный номер: KCCM11481P;
Дата депонирования: 22 ноября 2013 г.
Депозитарный орган: Корейский центр культур микроорганизмов;
Учетный номер: KCCM11482P;
Дата депонирования: 22 ноября 2013 г.
Депозитарный орган: Корейский центр культур микроорганизмов;
Учетный номер: KCCM11502P;
Дата депонирования: 13 декабря 2013 г.
| Регистрационный номер заявителя или агента PP15-0104 | Международная заявка № |
УКАЗАНИЯ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ДЕПОНИРОВАННОМУ МИКРООРГАНИЗМУ ИЛИ ДРУГОМУ БИОЛОГИЧЕСКОМУ МАТЕРИАЛУ
(PCT Правило 13bis)
| A. Указания, приведенные ниже, относятся к депонированному микроорганизму или другому биологическому материалу, упомянутому в описании на странице 18, строка 1. | |||
| B. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДЕПОЗИТА | Дополнительные депозиты указаны на дополнительном листе □ | ||
| Название организации-депозитария Корейский центр культур микроорганизмов |
|||
| Адрес организации-депозитария (включая почтовый индекс и страну) Yurim B/D, 45 Hongjenae 2ga-gil, Seodaemun-gu, Seoul 120-861, Republic of Korea |
|||
| Дата депонирования 22 ноября 2013 г. |
Учетный номер KCCM11481P |
||
| C. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ УКАЗАНИЯ (не заполнять, если не применимо) Данная информация продолжается на дополнительном листе □ | |||
| D. УКАЗАННЫЕ ГОСУДАРСТВА, ДЛЯ КОТОРЫХ ДАНЫ УКАЗАНИЯ (если указания предназначены не для всех указанных государств) | |||
| E. РАЗДЕЛЬНОЕ ПРЕДОСТАВЛЕНИЕ УКАЗАНИЙ (не заполнять, если не применимо) | |||
| Указания, перечисленные ниже, будут поданы в Международное Бюро позже (определите общий характер указаний, например, «Учетный номер депозита») | |||
| Для служебного пользования принимающего ведомства □ Данный лист получен с международной заявкой |
Для служебного пользования Международного Бюро □ Данный лист получен Международным Бюро: |
||
| Уполномоченный сотрудник | Уполномоченный сотрудник | ||
Форма PCT/RO/134 (июль 1998 г.; репринт январь 2004 г.)
| Регистрационный номер заявителя или агента PP15-0104 | Международная заявка № |
УКАЗАНИЯ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ДЕПОНИРОВАННОМУ МИКРООРГАНИЗМУ ИЛИ ДРУГОМУ БИОЛОГИЧЕСКОМУ МАТЕРИАЛУ
(PCT Правило 13bis)
| A. Указания, приведенные ниже, относятся к депонированному микроорганизму или другому биологическому материалу, упомянутому в описании на странице 19, строка 1. | |||
| B. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДЕПОЗИТА | Дополнительные депозиты указаны на дополнительном листе □ | ||
| Название организации-депозитария Корейский центр культур микроорганизмов |
|||
| Адрес организации-депозитария (включая почтовый индекс и страну) Yurim B/D, 45 Hongjenae 2ga-gil, Seodaemun-gu, Seoul 120-861, Republic of Korea |
|||
| Дата депонирования 22 ноября 2013 г. |
Учетный номер KCCM11482P |
||
| C. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ УКАЗАНИЯ (не заполнять, если не применимо) Данная информация продолжается на дополнительном листе □ | |||
| D. УКАЗАННЫЕ ГОСУДАРСТВА, ДЛЯ КОТОРЫХ ДАНЫ УКАЗАНИЯ (если указания предназначены не для всех указанных государств) | |||
| E. РАЗДЕЛЬНОЕ ПРЕДОСТАВЛЕНИЕ УКАЗАНИЙ (не заполнять, если не применимо) | |||
| Указания, перечисленные ниже, будут поданы в Международное Бюро позже (определите общий характер указаний, например, «Учетный номер депозита») | |||
| Для служебного пользования принимающего ведомства □ Данный лист получен с международной заявкой |
Для служебного пользования Международного Бюро □ Данный лист получен Международным Бюро: |
||
| Уполномоченный сотрудник | Уполномоченный сотрудник | ||
Форма PCT/RO/134 (июль 1998 г.; репринт январь 2004 г.)
| Регистрационный номер заявителя или агента PP15-0104 | Международная заявка № |
УКАЗАНИЯ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ДЕПОНИРОВАННОМУ МИКРООРГАНИЗМУ ИЛИ ДРУГОМУ БИОЛОГИЧЕСКОМУ МАТЕРИАЛУ
(PCT Правило 13bis)
| A. Указания, приведенные ниже, относятся к депонированному микроорганизму или другому биологическому материалу, упомянутому в описании на странице 20, строка 1. | |||
| B. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДЕПОЗИТА | Дополнительные депозиты указаны на дополнительном листе □ | ||
| Название организации-депозитария Корейский центр культур микроорганизмов |
|||
| Адрес организации-депозитария (включая почтовый индекс и страну) Yurim B/D, 45 Hongjenae 2ga-gil, Seodaemun-gu, Seoul 120-861, Republic of Korea |
|||
| Дата депонирования 13 декабря 2013 г. |
Учетный номер KCCM11502P |
||
| C. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ УКАЗАНИЯ (не заполнять, если не применимо) Данная информация продолжается на дополнительном листе □ | |||
| D. УКАЗАННЫЕ ГОСУДАРСТВА, ДЛЯ КОТОРЫХ ДАНЫ УКАЗАНИЯ (если указания предназначены не для всех указанных государств) | |||
| E. РАЗДЕЛЬНОЕ ПРЕДОСТАВЛЕНИЕ УКАЗАНИЙ (не заполнять, если не применимо) | |||
| Указания, перечисленные ниже, будут поданы в Международное Бюро позже (определите общий характер указаний, например, «Учетный номер депозита») | |||
| Для служебного пользования принимающего ведомства □ Данный лист получен с международной заявкой |
Для служебного пользования Международного Бюро □ Данный лист получен Международным Бюро: |
||
| Уполномоченный сотрудник | Уполномоченный сотрудник | ||
Форма PCT/RO/134 (июль 1998 г.; репринт январь 2004 г.)
Claims (5)
1. Продуцирующий L-лизин микроорганизм рода Corynebacterium, в котором инактивирован по меньшей мере один секреторный белок, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs: 1, 7 и 13.
2. Продуцирующий L-лизин микроорганизм по п. 1, отличающийся тем, что микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.
3. Способ производства L-лизина, включающий этапы:
культивирования микроорганизма по любому из пп. 1, 2 для продуцирования L-лизина в культуральную среду или клетку микроорганизма и
извлечения L-лизина из культуральной среды или клетки.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2014-0055102 | 2014-05-08 | ||
| KR1020140055102A KR101530819B1 (ko) | 2014-05-08 | 2014-05-08 | L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 |
| PCT/KR2015/004588 WO2015170907A1 (ko) | 2014-05-08 | 2015-05-08 | L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016147962A3 RU2016147962A3 (ru) | 2018-06-09 |
| RU2016147962A RU2016147962A (ru) | 2018-06-09 |
| RU2663135C2 true RU2663135C2 (ru) | 2018-08-01 |
Family
ID=53519596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016147962A RU2663135C2 (ru) | 2014-05-08 | 2015-05-08 | Микроорганизм, обладающий улучшенной способностью к продуцированию l-лизина, и способ производства l-лизина с использованием данного микроорганизма |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10208325B2 (ru) |
| EP (1) | EP3141597B1 (ru) |
| JP (1) | JP6493926B2 (ru) |
| KR (1) | KR101530819B1 (ru) |
| CN (1) | CN106414715B (ru) |
| BR (1) | BR112016025999B1 (ru) |
| ES (1) | ES2796960T3 (ru) |
| HU (1) | HUE048901T2 (ru) |
| MY (1) | MY175423A (ru) |
| PL (1) | PL3141597T3 (ru) |
| RU (1) | RU2663135C2 (ru) |
| WO (1) | WO2015170907A1 (ru) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101740807B1 (ko) * | 2015-08-27 | 2017-05-26 | 씨제이제일제당 (주) | L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 |
| KR101766964B1 (ko) | 2015-08-27 | 2017-08-09 | 씨제이제일제당 (주) | L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 |
| EP3456833A1 (en) * | 2017-09-18 | 2019-03-20 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
| KR101947945B1 (ko) * | 2018-01-25 | 2019-02-13 | 씨제이제일제당 (주) | L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법 |
| RU2019128538A (ru) | 2018-09-26 | 2021-03-11 | Эвоник Оперейшенс ГмбХ | Способ ферментативного получения l-лизина |
| CN112063571B (zh) * | 2020-08-14 | 2022-05-06 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 高产l-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用 |
| CN113801211B (zh) * | 2021-08-17 | 2023-07-18 | 华南理工大学 | 谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl0717及其表面展示系统和构建方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6962989B1 (en) * | 1999-07-08 | 2005-11-08 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding novel proteins |
| FI108863B (fi) * | 1999-08-20 | 2002-04-15 | Valtion Teknillinen | Parannettu biotekninen tuotantomenetelmä |
| JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
| US20040063184A1 (en) * | 2002-09-26 | 2004-04-01 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
| KR100789270B1 (ko) * | 2005-11-30 | 2008-01-02 | 씨제이 주식회사 | Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법 |
| KR100838038B1 (ko) | 2006-12-29 | 2008-06-12 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법 |
| KR100838035B1 (ko) * | 2006-12-29 | 2008-06-12 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법 |
| KR101512432B1 (ko) | 2010-06-15 | 2015-04-16 | 백광산업 주식회사 | 미생물을 이용한 아스파테이트 계열 아미노산의 생산방법 |
| KR101285945B1 (ko) * | 2011-05-23 | 2013-07-12 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 제조방법 |
-
2014
- 2014-05-08 KR KR1020140055102A patent/KR101530819B1/ko active IP Right Grant
-
2015
- 2015-05-08 ES ES15789069T patent/ES2796960T3/es active Active
- 2015-05-08 CN CN201580024138.8A patent/CN106414715B/zh active Active
- 2015-05-08 EP EP15789069.0A patent/EP3141597B1/en active Active
- 2015-05-08 PL PL15789069T patent/PL3141597T3/pl unknown
- 2015-05-08 US US15/309,387 patent/US10208325B2/en active Active
- 2015-05-08 JP JP2016566983A patent/JP6493926B2/ja active Active
- 2015-05-08 WO PCT/KR2015/004588 patent/WO2015170907A1/ko active Application Filing
- 2015-05-08 BR BR112016025999-8A patent/BR112016025999B1/pt active IP Right Grant
- 2015-05-08 RU RU2016147962A patent/RU2663135C2/ru active
- 2015-05-08 HU HUE15789069A patent/HUE048901T2/hu unknown
- 2015-05-08 MY MYPI2016001955A patent/MY175423A/en unknown
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BLASCO L. et al. FPG1, a gene involved in foam formation in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 2011. BLASCO L. et al. Cloning and characterization of the beer foaming gene CFG1 from Saccharomyces pastorianus. Journal of agricultural and food chemistry, 2012. * |
| BLOMBACH B. et al. Carbohydrate metabolism in Corynebacterium glutamicum and applications for the metabolic engineering of L-lysine production strains. Applied microbiology and biotechnology, 2010. * |
| BLOMBACH B. et al. Carbohydrate metabolism in Corynebacterium glutamicum and applications for the metabolic engineering of L-lysine production strains. Applied microbiology and biotechnology, 2010. SHIMOI H. et al. The AWA1 gene is required for the foam-forming phenotype and cell surface hydrophobicity of sake yeast. Applied and environmental microbiology, 2002. BLASCO L. et al. FPG1, a gene involved in foam formation in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 2011. BLASCO L. et al. Cloning and characterization of the beer foaming gene CFG1 from Saccharomyces pastorianus. Journal of agricultural and food chemistry, 2012. СИРОТИН А.А. и др. Процесс биосинтеза лизина штаммом Corynebacterium glutamicum B-11167 на основе сред, содержащих гидролизат пшеничного глютена. Современные проблемы науки и образования: электронный научный журнал, 2012. * |
| SHIMOI H. et al. The AWA1 gene is required for the foam-forming phenotype and cell surface hydrophobicity of sake yeast. Applied and environmental microbiology, 2002. * |
| СИРОТИН А.А. и др. Процесс биосинтеза лизина штаммом Corynebacterium glutamicum B-11167 на основе сред, содержащих гидролизат пшеничного глютена. Современные проблемы науки и образования: электронный научный журнал, 2012. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106414715A (zh) | 2017-02-15 |
| JP2017514510A (ja) | 2017-06-08 |
| MY175423A (en) | 2020-06-25 |
| EP3141597A4 (en) | 2017-12-13 |
| US10208325B2 (en) | 2019-02-19 |
| JP6493926B2 (ja) | 2019-04-03 |
| ES2796960T3 (es) | 2020-11-30 |
| EP3141597B1 (en) | 2020-04-08 |
| BR112016025999A2 (pt) | 2018-02-20 |
| US20170204439A1 (en) | 2017-07-20 |
| BR112016025999B1 (pt) | 2022-05-24 |
| PL3141597T3 (pl) | 2020-11-02 |
| RU2016147962A3 (ru) | 2018-06-09 |
| CN106414715B (zh) | 2020-07-24 |
| RU2016147962A (ru) | 2018-06-09 |
| HUE048901T2 (hu) | 2020-08-28 |
| KR101530819B1 (ko) | 2015-06-22 |
| EP3141597A1 (en) | 2017-03-15 |
| WO2015170907A1 (ko) | 2015-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2663135C2 (ru) | Микроорганизм, обладающий улучшенной способностью к продуцированию l-лизина, и способ производства l-лизина с использованием данного микроорганизма | |
| EP2102337B1 (en) | A microorganism of corynebacterium genus having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same | |
| CN105392880B (zh) | 生产o-乙酰基高丝氨酸的微生物和用其生产o-乙酰基高丝氨酸的方法 | |
| KR101721722B1 (ko) | L-발린 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 l-발린 생산방법 | |
| US8058036B2 (en) | Microorganism of Corynebacterium genus having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same | |
| RU2687206C1 (ru) | Микроорганизмы corynebacterium sp., обладающие способностью продуцировать l-лизин, и способ продуцирования l-лизина с использованием этих микроорганизмов | |
| RU2667425C2 (ru) | Микроорганизм Corynebacterium sp. с повышенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с его помощью | |
| EP3109318B1 (en) | Microorganisms for producing putrescine or ornithine and process for producing putrescine or ornithine using them | |
| RU2683551C1 (ru) | Микроорганизм, обладающий продуктивностью по L-лизину, и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма | |
| KR20130082124A (ko) | 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법 | |
| RU2651505C1 (ru) | Микроорганизм Corynebacterium с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с его помощью | |
| RU2681475C1 (ru) | Вариант репрессора глюконата, микроорганизм-продуцент L-лизина, содержащий его, и способ получения L-лизина с его использованием | |
| RU2685482C1 (ru) | Микроорганизмы corynebacterium sp., обладающие способностью продуцировать l-лизин, и способ продуцирования l-лизина с использованием этих микроорганизмов | |
| RU2668830C2 (ru) | Микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования L-лизина и способ получения L-лизина с его помощью | |
| EP2806022B1 (en) | Recombinant microorganism with improved putrescine productivity, and method for producing putrescine using same | |
| JP2019535271A (ja) | Ｌ‐リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ‐リジンの生産方法 | |
| CN115044521A (zh) | L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法 | |
| RU2805078C1 (ru) | МИКРООРГАНИЗМ, СОДЕРЖАЩИЙ ВАРИАНТ LysE, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ | |
| US20240209402A1 (en) | Corynebacterium glutamicum variant having improved l-lysine production ability, and method for producing l-lysine by using same | |
| KR20220126610A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 | |
| JP2024515389A (ja) | Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたｌ－リシンの生産方法 | |
| KR20220148694A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 | |
| KR20220126609A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 | |
| CN115044490A (zh) | L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法 | |
| KR20150035931A (ko) | L-발린 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 l-발린 생산방법 |