JP2016523543A - Ｌ−リジン生産能が向上した微生物、及びそれを利用してｌ−リジンを生産する方法 - Google Patents

Abstract

ＲＮＡ重合酵素のベータプライムサブユニットの変異体と、それをコードするポリヌクレオチドとを含むコリネバクテリウム属微生物、及びそれを培養してＬ−リジンを生産する方法を提供する。

Description

本発明は、Ｌ−リジン生産能が向上した微生物、及びそれを培養してＬ−リジンを生産する方法に関する。

全世界的にアミノ酸など有用産物の量産のために、微生物を利用した多様な発酵方法が利用されており、特に、かような微生物を利用した成功に至る発酵のために、菌株開発、発酵条件確立など多様な技術が開発されてきている。有用産物の量産のための菌株開発のために、当該経路の上位段階において直間接的に関与する遺伝的要因を見い出し、適切に利用するならば、さらに高効率の菌株を開発することができる。代表的な技術としては、ＲＮＡポリメラーゼのrecruitingタンパク質にランダムな突然変異を起こすことにより、細胞内の全遺伝子の発現を調節するｇＴＭＥ（global transcription machinery engineering）がある。

微生物の転写段階で使われるＲＮＡポリメラーゼは、５個の因子から構成された巨大分子であり、アルファ２個、ベータ、ベータプライム及びシグマの因子から構成されており、ホロ酵素（holoenzyme）は、α_２ββ'σと表示される。それらのうちコア酵素（core enzyme；α^２ββ'）は、開始段階を除いた転写の全段階で使用される。微生物において転写は、ＲＮＡポリメラーゼがプローモーターに特異的に結合することによって始まり、ホロ酵素は、ＲＮＡ合成開始点からアップストリームに約４５塩基対、ダウンストリームに１０塩基対に至る部位でＤＮＡと結合する。

大腸菌のＲＮＡポリメラーゼ・ベータプライムサブユニットは、Ａ〜Ｈの進化的に高い保存配列部位を有しており、その部位に変異を与え、ＲＮＡポリメラーゼのさまざまな因子の結合を弱くしたり、菌株の成長温度敏感性を高めたりするというような多様な変化を観察した研究が多数報告された。しかし、コリネバクテリウム属菌株のｇＴＭＥ技術適用、及び変異による特性変化についての研究はほとんど進められていない。

コリネバクテリウム属菌株のＲＮＡポリメラーゼの構成要素のうち、ベータとベータプライムとの因子をコードする遺伝子、すなわち、ｒｐｏＢ及びｒｐｏＣのそれぞれは、互いにオペロンをなしており、それぞれ３．５ｋｂ、４．０ｋｂのヌクレオチドから構成されている。

本発明者らは、前記コリネバクテリウム属菌株由来のｒｐｏＣにランダムな変異を取り入れ、Ｌ−リジン生産性向上に寄与した変異体をスクリーニングし、大腸菌由来のｒｐｏＣのＧとＨとの領域に該当する部位に変異が導入された場合、リジン生産能が大きく向上するということを確認することにより、本発明を完成した。

一態様は、Ｌ−リジンの生産を増加させることができるＲＮＡ重合酵素のベータプライムサブユニット変異体を提供する。

他の態様は、Ｌ−リジンの生産を増加させることができるＲＮＡ重合酵素のベータプライムサブユニット変異体をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。

他の態様は、Ｌ−リジンの生産を増加させることができるＲＮＡ重合酵素のベータプライムサブユニット変異体をコードするヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

他の態様は、前記ベータプライムサブユニット変異体を含む微生物を提供する。

他の態様は、前記微生物を培養してＬ−リジンを生産する方法を提供する。

一態様は、配列番号１のアミノ酸配列において、第９７５ないし第１２８４におけるアミノ酸において、１個ないし５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット（β'−subunit）を提供する。

ベータプライムサブユニットは、ＲｐｏＣアミノ酸でもある。前記ＲｐｏＣアミノ酸は、保存配列領域（conserved region）を含んでもよい。前記保存領域は、進化的に高く保存される領域でもある。前記ＲｐｏＣアミノ酸は、複数のドメインを含んでもよい。前記複数のドメインは、ＡドメインないしＨドメインでもある。前記ベータプライムサブユニットは、コリネバクテリウム属微生物から由来する。前記コリネバクテリウム属微生物由来ベータプライムサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１、または前記配列番号１に対して約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上の配列相同性を有するものでもある。コリネバクテリウム属微生物由来ベータプライムサブユニットのアミノ酸配列、すなわち、ＲｐｏＣアミノ酸配列の９７５番目ないし１２８４番目のアミノ酸と相同性のある配列は、大腸菌由来ＲｐｏＣアミノ酸配列でもある。前記大腸菌由来ＲｐｏＣアミノ酸配列は、配列番号４のＧドメイン及びＨドメインでもある。

前記配列番号１のベータプライムサブユニットのＧドメイン及びＨドメインのアミノ酸配列のうち１個ないし５個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換される。望ましくは、前記配列番号１のアミノ酸配列において、９７５番目ないし１２８４番目のアミノ酸配列のうち１個ないし５個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換される。さらに望ましくは、前記配列番号１のアミノ酸配列において、１０１４番目ないし１０３４番目のアミノ酸、または１２３０番目ないし１２５５番目のアミノ酸のうち１個ないし５個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換される。配列番号８、９、１１、１４、１５、２０、２３、２４または２５は、前記配列番号１のアミノ酸配列において、第１０１４ないし第１０３４におけるアミノ酸において、１個ないし５個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列でもある。配列番号１０、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２１、２２または２７は、前記配列番号１のアミノ酸配列において、第１２３０ないし第１２５５におけるアミノ酸において、１個ないし５個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列でもある。配列番号２６は、前記配列番号１のアミノ酸配列において、第１０１４ないし第１０３４におけるアミノ酸、及び第１２３０ないし第１２５５におけるアミノ酸において、１個ないし５個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列でもある。

一具体例は、配列番号１と記載されたアミノ酸配列において、第９７５ないし第１２８４におけるアミノ酸において、１個ないし５個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット変異体をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。

他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。前記ポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能に連結される。前記調節配列は、プローモーター、ターミネーターまたはエンハンサーを含んでもよい。また、前記プローモーターは、遺伝子をコードする配列と作動的に結合される。本明細書において用語「作動可能に連結された」は、核酸発現調節配列と異なるヌクレオチド配列間の機能的な結合を意味する。それにより、前記調節配列は、前記遺伝子をコードするヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を調節することができる。

他の態様は、配列番号１と記載されたアミノ酸配列において、第９７５ないし第１２８４におけるアミノ酸において、１個ないし５個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット変異体を発現する微生物を提供する。

配列番号１と記載されたアミノ酸配列において、第９７５ないし第１２８４におけるアミノ酸において、１個ないし５個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット変異体をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む微生物を提供する。また、配列番号１と記載されたアミノ酸配列において、第９７５ないし第１２８４におけるアミノ酸において、１個ないし５個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット変異体をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むベクターが導入された微生物を提供する。前記導入された微生物は、形質転換された微生物でもある。

前記遺伝子の導入は、いかなる形態、例えば、発現カセット（expression cassette）の形態での導入、前記遺伝子自体の導入、またはポリヌクレオチド構造体形態での導入でもある。前記発現カセットは、前記遺伝子が自主的に発現されるのに必要な全ての要素を含んでもよい。前記発現カセットは、ポリヌクレオチドの構造体でもある。前記発現カセットは、前記遺伝子に作動可能に連結されたプローモーター、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体複製が可能な発現ベクター形態でもある。前記遺伝子自体の導入またはポリヌクレオチド構造体形態での導入は、導入された宿主細胞において、発現に必要な配列と作動可能に連結されているものでもある。

本明細書において使われた用語「形質転換」は、遺伝子を宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で発現させるものを意味する。形質転換された遺伝子は、宿主細胞の染色体内に挿入され、あるいは／かつ前記染色体外に位置することができる。前記遺伝子は、ポリペプチドをコードすることができるポリヌクレオチドでもある。前記遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。

前記微生物は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物でもある。前記コリネバクテリウム属微生物は、例えば、コリネバクテリウムグルタミクム、コリネバクテリウムエフィシエンス、コリネバクテリウムジフテリアまたはコリネバクテリウムアンモニアゲネスを含んでもよく、望ましくは、コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）でもある。具体的に実施するコリネバクテリウム属微生物は、受託番号ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（ＫＦＣＣ１０７５０の国際寄託転換）、ＫＣＣＭ１０７７０、またはＣＪ３Ｐであるコリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）でもある。他の態様は、配列番号１と記載されたアミノ酸配列において、第９７５ないし第１２８４におけるアミノ酸において、１個ないし５個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット変異体を発現する微生物を培養し、培養物中にＬ−リジンを生産する段階と、培養物からＬ−リジンを回収する段階と、を含む、Ｌ−リジンを生産する方法を提供する。前記微生物については、前記の通りである。

前記微生物の培養は、当業界に公知の適切な培地及び培養条件によってなされる。かような培養過程は、選択される微生物によって、容易に調整して使用することができる。前記培養の方法は、回分式、連続式、及び流加式の培養からなる群から選択される１以上の培養を含んでもよい。

前記培養に使用される培地は、特定の微生物の要求条件を満足させることができる培地でもある。前記培地は、炭素源、窒素源、微量元素成分、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される培地でもある。

前記炭素源は、炭水化物、脂肪、脂肪酸、アルコール、有機酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される炭素源でもある。前記炭水化物は、ブドウ糖、蔗糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロース、及びそれらの組み合わせでもある。前記脂肪は、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油、及びそれらの組み合わせでもある。前記脂肪酸は、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、またはそれらの組み合わせでもある。前記アルコールは、グリセロールまたはエタノールでもある。前記有機酸は、酢酸を含んでもよい。

前記窒素源は、有機窒素源、無機窒素源、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記有機窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液（ＣＳＬ）、大豆ミール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。前記無機窒素源は、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

前記培地は、リン、金属塩、アミノ酸、ビタミン、前駆体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものを含んでもよい。前記リンの供給源は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、またはそれらに相応するナトリウム含有塩を含んでもよい。前記金属塩は、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄でもある。

前記培地、またはそれをなす個別成分は、回分式、連続式、または流加式の培養で添加される。

前記培養方法において、培養物のｐＨを調整することができる。前記ｐＨの調整は、前記培養物に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸または硫酸を添加してなされる。また、前記培養方法は、気泡生成抑制を含んでもよい。前記気泡生成抑制は、消泡剤の使用を介して行われる。前記消泡剤は、脂肪酸ポリグリコールエステルを含んでもよい。また、前記培養方法は、培養物内への気体注入を含んでもよい。前記気体は、培養物の好気状態を維持するためのいかなる気体も含んでもよい。前記気体は、酸素または酸素含有気体でもある。前記酸素含有気体は、空気を含む。前記培養において、培養物の温度は、２０℃ないし４５℃、例えば、２２℃ないし４２℃、または２５℃ないし４０℃でもある。培養期間は、所望のＬ−リジンの生成量を獲得するまで持続することができる。

前記Ｌ−リジンを生産する方法において、前記Ｌ−リジンは、Ｌ−リジンの塩を含んでもよい。

一態様によるＲＮＡ重合酵素のベータプライムサブユニット、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター及び微生物を利用すれば、Ｌ−リジンの生産を増加させることができる。

一態様によるＬ−リジンを生産する方法によれば、Ｌ−リジンの生産を増加させることができる。

大腸菌ＲｐｏＣアミノ酸の保存配列構造、及び予測されたコリネバクテリウムＲｐｏＣアミノ酸の保存配列構造を示す図面である。 大腸菌ＲｐｏＣアミノ酸の保存配列構造、及び予測されたコリネバクテリウムＲｐｏＣアミノ酸の保存配列構造を示す図面である。 大腸菌ＲｐｏＣとコリネバクテリウムＲｐｏＣとのＧ及びＨの保存部位の予想アミノ酸配列を比較した図面である。 大腸菌ＲｐｏＣとコリネバクテリウムＲｐｏＣとのＧ及びＨの保存部位の予想アミノ酸配列を比較した図面である。

以下、本発明について実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。

実施例１：人工突然変異法を利用したｒｐｏＣ変異体ライブラリー製作
ｒｐｏＣ遺伝子変異体を獲得するために、以下の方法でベクターライブラリーを製作した。コリネバクテリウム由来ｒｐｏＣ遺伝子（配列番号５）のアップストリーム塩基配列（３００ｂｐ）と、ｒｐｏＣ（４００２ｂｐ）遺伝子を含む塩基配列（４３０２ｂｐ）とをＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（韓国公開特許ＫＲ２００７−００５７０９３のＫＦＣＣ１０８８１の国際寄託転換）の染色体をテンプレートにし、プライマー配列番号６及び７をエラープローン（error-prone）ＰＣＲを利用して増幅させた。増幅された遺伝子内変異ｋｂ当たり０〜４．５個を導入するための目的で、GenemorphII Random Mutagenesis Kit（Stratagene）を使用した。５００ｎｇのＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株の染色体、１２５ｎｇのプライマー１及び２のそれぞれ、１×Mutazyme ＩＩ reactionバッファ、４０ｍＭのｄＮＴＰ（deoxyNucleotide-Triphosphate）mix、２．５ＵのMutazyme ＩＩＤＮＡポリメラーゼを含む５０μＬの反応液を９４℃で２分間変性させた後、９４℃で１分変性、５６℃で１分アニーリング、７２℃で４分重合を２５回反復した後、７２℃で１０分間重合反応を行った。

増幅された遺伝子断片は、ｐＴＯＰＯ ＴＡ Cloning Kit（Invitrogen）を利用して、ｐＴＯＰＯベクターに連結させた。その後、前記ベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンが含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニー２０種を選別した後、プラスミドを獲得し、塩基配列を分析した結果、０．５突然変異／ｋｂの頻度で、互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約１０，０００個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、それをｐＴＯＰＯ−ｒｐｏＣ（Ｍ）ライブラリーと命名した。対照群として使用するためのｒｐｏＣ野生型の遺伝子を有したｐＴＯＰＯ−ｒｐｏＣ（Ｗ）プラスミドも共に製作した。配列番号６及び７のプライマーを利用して、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体をテンプレートにしたＰＣＲを介して、ｒｐｏＣ遺伝子断片を増幅した後、同じ方法で、ｐＴＯＰＯ−ｒｐｏＣ（Ｗ）プラスミドを製作した。

実施例２：リジン生成能を基にしてｒｐｏＣ変異株をスクリーニング
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株を親菌株にして、ｐＴＯＰＯ−ｒｐｏＣ（Ｍ）ライブラリーを形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれた複合平板培地に塗抹し、約２１，５００個のコロニーを確保した。

＜複合平板培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ビーフ抽出物５ｇ、酵母抽出物５ｇ、ブレインハートインフュージョン１８．５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、尿素２ｇ、ソルビトール９１ｇ、寒天２０ｇ（蒸溜水１リットル基準）

＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２，０００μｇ、ニコチンアミド２，０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）

確保された約２１，５００個のコロニーを、それぞれ３００μＬの選別培地に接種し、９６ウェルプレートで３２℃、１，０００ｒｐｍで約２４時間培養した。培養物に生産されたＬ−リジンの生産量を分析するために、ニンヒドリン方法を利用した。培養が完了した後、培養上層液１０μｌと、ニンヒドリン反応溶液１９０μｌとを６５℃で３０分間反応させた後、波長５７０ｎｍで、分光光度計で吸光度を測定し、野生型ｒｐｏＣを有した対照群ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｗ）と比較し、高い吸光度を示す変異菌株約２，０００個のコロニーを選別した。それ以外のコロニーは、対照群に利用されたＫＣＣＭ１１０１６ＰあるいはＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｗ）の菌株と類似した吸光度を示した。選別された２，０００個の菌株は、同じ方法で、ニンヒドリン反応を介して、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｗ）菌株対比でＬ−リジン生産能が向上した菌株として上位１８３種を選別した。

＜選別培地（ｐＨ８．０）＞
ブドウ糖１０ｇ、硫酸アンモニウム５．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １．２ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．８ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ １６．４ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １，０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２，０００μｇ、ニコチンアミド２，０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）

実施例３：ｒｐｏＣ人工突然変異ライブラリー選別株の遺伝子変異確認
実施例２で選別された菌株の特性を確認するために、塩基配列を分析した。突然変異を探索するために、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｍ）のｒｐｏＣ染色体部位の塩基配列を決定し、米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）を基にして確認した。

図１ｂは、大腸菌ＲｐｏＣアミノ酸の保存配列構造、及び予測されたコリネバクテリウムＲｐｏＣアミノ酸の保存配列構造を示す図面である。図１ｂによれば、選別された変異型ｒｐｏＣの塩基配列相同性の分析の結果、１８３種の９１％に該当する１６６種において、前記ｒｐｏＣによってコードされる配列番号１のアミノ酸の９７５番目ないし１２８４番目のアミノ酸に変異が集中的に存在するということを確認した。前記１６６種菌株のうち約７０％に該当する１１６種において、１０１４番目ないし１０３４番目のアミノ酸、及び１２３０番目ないし１２５５番目のアミノ酸の短い部位に変異が集中的に存在するということを確認した。

変異が集中した部位の特性を調べるために、コリネバクテリウムＲｐｏＣと、既存に活発に研究された大腸菌のＲＮＡポリメラーゼベータプライム因子とのアミノ酸配列比較を行った。図２は、大腸菌ＲｐｏＣとコリネバクテリウムＲｐｏＣとのＧ及びＨの保存部位の予想アミノ酸配列を比較した図面である。図２によれば、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼベータプライム因子の進化的に高い保存配列部位として知られた８個のドメインのうちＧ及びＨのドメイン部位と、それぞれ６８．４％、７７．８％の相同性を有するということを確認した。図１は、大腸菌ＲｐｏＣアミノ酸の保存配列構造、及び予測されたコリネバクテリウムＲｐｏＣアミノ酸の保存配列構造を示す図面である。図１によれば、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼベータプライム、ｒｐｏＣのＧドメイン及びＨドメインと高い相同性を示すコリネバクテリウムＲｐｏＣアミノ酸の９７５番目アミノ酸から１２８４番目までのアミノ酸部位に変異が集中するということを確認した。１１６種の菌株のうち、ニンヒドリン反応時に吸光度が高かった上位２０個の菌株を、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｍ２０）と命名した。

実施例４：ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｍ）のリジン生成能及びその分析
実施例３で選別した２０種の菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｍ２０）の特性を調べるために、以下のような方法で培養してリジン生成能を比較して培養液成分を分析した。

種培地２５ｍｌを含む２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含む２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。前記種培地と生産培地との組成は、それぞれ下記の通りである。

＜培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １，０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２，０００μｇ、ニコチンアミド２，０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）

＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、とうもろこし浸漬固形粉（corn steep solids）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ、ＭｇＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１，０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２，０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ_３ ３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）。

ＨＰＬＣを利用して分析したＬ−リジンの濃度を表１に示した。

（表１）ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｍ）のＬ−リジン生産濃度

表１に示されているように、Ｌ−リジン生産菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｗ）に比べ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｍ）は、Ｌ−リジンの平均濃度が１３％まで増加するということを確認した。配列番号８ないし２７に、ｒｐｏＣ変異株２０種のアミノ酸配列変化を示した。前記２０種のアミノ酸配列を分析した結果、ＲＮＡポリメラーゼベータプライムの大腸菌のｒｐｏＣのＧドメイン及びＨドメインと高い相同性を示す９７５番目のアミノ酸から１２８４番目のアミノ酸までの部位に変異が導入された場合、リジン生産能が大きく向上するということを確認した。

（表２）ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）のｒｐｏＣアミノ酸変異

実施例５：高濃度Ｌ−リジン生産株のｒｐｏＣ変異の染色体導入用ベクター製作
塩基配列が置換されたｒｐｏＣ変異菌株の、実施例２で確認した変異のうち、大腸菌ｒｐｏＣのＧドメイン及びＨドメインと高い相同性を示す領域の変異効果を確認するために、それを染色体上に導入することができるベクターを製作した。

報告された塩基配列に基づいて、５'末端にＥｃｏＲ Ｉ制限酵素部位を挿入した配列番号２９及び２９のプライマー、及び３'末端にＳａｌ Ｉ制限酵素部位を挿入した配列番号３０のプライマーを合成した。それらのうち、配列番号２８及び３０のプライマーを利用して、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣのＭ１、Ｍ２、Ｍ４、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ１３、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、及びＭ１９、すなわち、１０種の染色体をテンプレートにしたＰＣＲを介して、約２，０００ｂｐのｒｐｏＣ（ｍｔ）１０種の遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性させた後、９４℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で２分の重合を３０回反復した後、７２℃で７分間の重合反応を行った。また、配列番号２９及び３０であるプライマーを利用して、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣのＭ３、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１５、及びＭ２０、すなわち、１０種の染色体をテンプレートにしたＰＣＲを介して、約６００ｂｐの１０種のｒｐｏＣ（ｍｔ）遺伝子断片を増幅した。ここに使用したプライマーは、配列番号２８ないし３０として示した。

ＰＣＲで増幅された２０種の遺伝子断片を、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＳａｌ Ｉで処理し、それぞれのＤＮＡ切片を獲得した後、それを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＳａｌ Ｉの末端を有する染色体導入用ｐＤＺベクター（大韓民国特許第２００９−００９４４３３号）に連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲを介して、目的とした遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、一般的に知られたプラスミド抽出法を利用して、プラスミドを獲得し、そのプラスミドをテンプレートとして使用した菌株の番号によって、それぞれｐＤＺ−ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）と命名した。

実施例６：高濃度Ｌ−リジン生産株のＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来ｒｐｏＣ変異の染色体導入菌株の製作及びリジン生成能比較
実施例５で製造したベクターｐＤＺ−ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）を、相同染色体組み換えによって、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換した。その後、染色体上のｒｐｏＣ変異が導入された菌株を、塩基配列分析によって選別し、実施例３と同一の方法で培養した。そこからＬ−リジンの濃度を分析し、その結果を表３に示した。前記ｒｐｏＣ変異が導入された菌株を、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）と命名した。

（表３）

表３から確認されるように、野生型ｒｐｏＣ遺伝子を有する対照群ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べ、１個または２個の塩基置換変異を有するｒｐｏＣ遺伝子が導入されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）の場合、Ｌ−リジンの平均濃度がおよそ６〜１５％上昇するということを確認し、それらのうち上位２０％代表菌株として、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１５）、上位４０％代表菌株として、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１０）、上位６０％代表菌株として、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１９）を、それぞれＣＡ０１−２２６７、ＣＡ０１−２２６８、及びＣＡ０１−２２６６で２０１３年６月１２日に韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、それぞれ受託番号第ＫＣＣＭ１１４２８Ｐ号、ＫＣＣＭ１１４２９Ｐ号、及びＫＣＣＭ１１４２７Ｐ号を受けた。

実施例７：高濃度Ｌ−リジン生産株のＫＣＣＭ１１３４７Ｐ由来ｒｐｏＣ変異の染色体導入菌株の製作及びリジン生成能比較
コリネバクテリウムグルタミクムに属する他の菌株での効果も確認するために、実施例６のような方法で、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（大韓民国登録特許第１９９４−０００１３０７号、ＫＦＣＣ１０７５０の国際寄託転換微生物）に、ｒｐｏＣ変異が導入された菌株を製作し、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）と命名した。実施例３と同一の方法で培養し、そこからＬ−リジンの濃度を分析し、その結果を表４に示した。

（表４）ＫＦＣＣ１０７５０：：ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）のＬ−リジン生産濃度

表４から確認されるように、野生型ｒｐｏＣ遺伝子を有する対照群ＫＣＣＭ１１３４７Ｐに比べ、１個または２個の塩基置換変異を有するｒｐｏＣ遺伝子が導入されたＫＣＣＭ１１３４７Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）の場合、すなわち、実験群１〜２０の場合、Ｌ−リジンの平均濃度が約８〜１６％増加するということを確認した。

実施例８：高濃度Ｌ−リジン生産株のＫＣＣＭ１０７７０Ｐ由来ｒｐｏＣ変異の染色体導入菌株の製作及びリジン生成能比較
コリネバクテリウムグルタミクムに属する他の菌株での効果も確認するために、実施例６のような方法で、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（大韓民国登録特許第０９２４０６５号）にｒｐｏＣ変異が導入された菌株を製作し、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）と命名した。前記ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ菌株は、リジン生合成経路構成遺伝子のうち、ａｓｐＢ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子）、ｌｙｓＣ（アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子）、ａｓｄ（アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）、ｄａｐＡ（ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子）、ｄａｐＢ（ジヒドロジピコリン酸リダクターゼをコードする遺伝子）、及びｌｙｓＡ（ジアミノジピメリン酸ジカルボキシラーゼをコードする遺伝子）、すなわち、６種の遺伝子を染色体上に１コピー以上ずつ保有したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来のＬ−リジン生産菌株である。実施例３と同一の方法で培養し、そこからＬ−リジンの濃度を分析し、その結果を表５に示した。

（表５）ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）のＬ−リジン生産濃度

表５から確認されるように、野生型ｒｐｏＣ遺伝子を有する対照群ＫＣＣＭ１０７７０Ｐに比べ、１個または２個の塩基置換変異を有するｒｐｏＣ遺伝子が導入されたＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）の場合、すなわち、実験群１〜２０の場合、Ｌ−リジンの平均濃度が約３〜１０％上昇するということを確認した。

実施例９：高濃度Ｌ−リジン生産株のＣＪ３Ｐ由来ｒｐｏＣ変異の染色体導入菌株の製作及びリジン生成能比較
コリネバクテリウムグルタミクムに属する他の菌株での効果も確認するために、実施例６のような方法で、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＣＪ３Ｐ（Binder et al., Genome Biology 2012, 13: R40)にrpoC変異が導入された菌株を製作し、ＣＪ３Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）と命名した。ＣＪ３Ｐ菌株は、公知の技術を基に、野生株に３種の変異（ｐｙｃ（Ｐｒｏ４５８Ｓｅｒ）、ｈｏｍ（Ｖａｌ５９Ａｌａ）、ｌｙｓＣ（Ｔｈｒ３１１Ｉｌｅ））を導入し、Ｌ−リジン生成能を有するようになったコリネバクテリウムグルタミクム菌株である。実施例３と同一の方法で培養し、そこからＬ−リジンの濃度を分析し、その結果を表６に示した。

（表６）ＣＪ３Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）のＬ−リジン生産濃度

表６から確認されるように、野生型ｒｐｏＣ遺伝子を有する対照群ＣＪ３Ｐに比べ、１個または２個の塩基置換変異を有するｒｐｏＣ遺伝子が導入されたＣＪ３Ｐ：：ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜（Ｍ２０）の場合、すなわち、実験群１〜２０の場合、Ｌ−リジンの平均濃度が最大５７％上昇するということを確認した。従って、ＲＮＡポリメラーゼベータプライムの大腸菌のｒｐｏＣのＧドメイン及びＨドメインと高い相同性を示す９７５番目のアミノ酸から１２８４番目のアミノ酸までの部位に変異を導入する場合、リジン生産量を大幅に増加させることができた。

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１４２７Ｐ
受託日：２０１３０６１２

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１４２８Ｐ
受託日：２０１３０６１２

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１４２９Ｐ
受託日：２０１３０６１２

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ
受託日：１９９５１２１８

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ
受託日：１９９１１２１０

本出願は、Ｌ−リジン生産能が向上した微生物、及びそれを培養してＬ−リジンを生産する方法に関する。

本発明者らは、前記コリネバクテリウム属菌株由来のｒｐｏＣにランダムな変異を取り入れ、Ｌ−リジン生産性向上に寄与した変異体をスクリーニングし、大腸菌由来のｒｐｏＣのＧとＨとの領域に該当する部位に変異が導入された場合、リジン生産能が大きく向上するということを確認することにより、本出願を完成した。

ベータプライムサブユニットは、ＲｐｏＣタンパク質でもある。前記ＲｐｏＣタンパク質は、保存配列領域（conserved region）を含んでもよい。前記保存領域は、進化的に高く保存される領域でもある。前記ＲｐｏＣタンパク質は、複数のドメインを含んでもよい。前記複数のドメインは、ＡドメインないしＨドメインでもある。前記ベータプライムサブユニットは、コリネバクテリウム属微生物から由来する。前記コリネバクテリウム属微生物由来ベータプライムサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１、または前記配列番号１に対して約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上の配列相同性を有するものでもある。コリネバクテリウム属微生物由来ベータプライムサブユニットのアミノ酸配列、すなわち、ＲｐｏＣアミノ酸配列の９７５番目ないし１２８４番目のアミノ酸と相同性のある配列は、大腸菌由来ＲｐｏＣアミノ酸配列でもある。Ｇドメイン及びＨドメインを含む大腸菌由来ＲｐｏＣアミノ酸配列は、配列番号４によって示される。

前記Ｌ−リジンを生産する方法において、前記Ｌ−リジンは、Ｌ−リジンの塩を含んでもよい。
[本発明1001]
配列番号1のアミノ酸配列において、第975ないし第1284におけるアミノ酸において、1個ないし5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、ＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット変異体。
[本発明1002]
前記配列番号1のアミノ酸配列において、第975ないし第1284におけるアミノ酸が、第1014ないし第1034におけるアミノ酸及び第1230ないし第1255におけるアミノ酸のうち1以上であることを特徴とする、本発明1001のＲＮＡポリメラーゼ・ベータプライムサブユニット変異体。
[本発明1003]
本発明1001のＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット変異体をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
[本発明1004]
調節配列と作動可能に連結された本発明1003のポリヌクレオチドを含むベクター。
[本発明1005]
本発明1001のＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット変異体を発現するコリネバクテリウム微生物。
[本発明1006]
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウムグルタミクムであることを特徴とする、本発明1005の微生物。
[本発明1007]
本発明1005の微生物を培養し、培養物中にＬ−リジンを生産する段階と、
培養物からＬ−リジンを回収する段階と
を含む、Ｌ−リジンを生産する方法。

大腸菌ＲｐｏＣタンパク質の保存配列構造、及び予測されたコリネバクテリウムＲｐｏＣタンパク質の保存配列構造を示す図面である。 大腸菌ＲｐｏＣタンパク質の保存配列構造、及び予測されたコリネバクテリウムＲｐｏＣタンパク質の保存配列構造を示す図面である。 大腸菌ＲｐｏＣとコリネバクテリウムＲｐｏＣとのＧ及びＨの保存部位の予想アミノ酸配列を比較した図面である。 大腸菌ＲｐｏＣとコリネバクテリウムＲｐｏＣとのＧ及びＨの保存部位の予想アミノ酸配列を比較した図面である。

以下、本出願について実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本出願について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。

図１ｂは、大腸菌ＲｐｏＣタンパク質の保存配列構造、及び予測されたコリネバクテリウムＲｐｏＣタンパク質の保存配列構造を示す図面である。図１ｂによれば、選別された変異型ｒｐｏＣの塩基配列相同性の分析の結果、１８３種の９１％に該当する１６６種において、前記ｒｐｏＣによってコードされる配列番号１のアミノ酸の９７５番目ないし１２８４番目のアミノ酸に変異が集中的に存在するということを確認した。前記１６６種菌株のうち約７０％に該当する１１６種において、１０１４番目ないし１０３４番目のアミノ酸、及び１２３０番目ないし１２５５番目のアミノ酸の短い部位に変異が集中的に存在するということを確認した。

変異が集中した部位の特性を調べるために、コリネバクテリウムＲｐｏＣと、既存に活発に研究された大腸菌のＲＮＡポリメラーゼベータプライム因子とのアミノ酸配列比較を行った。図２は、大腸菌ＲｐｏＣとコリネバクテリウムＲｐｏＣとのＧ及びＨの保存部位の予想アミノ酸配列を比較した図面である。図２によれば、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼベータプライム因子の進化的に高い保存配列部位として知られた８個のドメインのうちＧ及びＨのドメイン部位と、それぞれ６８．４％、７７．８％の相同性を有するということを確認した。図１は、大腸菌ＲｐｏＣタンパク質の保存配列構造、及び予測されたコリネバクテリウムＲｐｏＣタンパク質の保存配列構造を示す図面である。図１によれば、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼベータプライム、ｒｐｏＣのＧドメイン及びＨドメインと高い相同性を示すコリネバクテリウムＲｐｏＣタンパク質の９７５番目アミノ酸から１２８４番目までのアミノ酸部位に変異が集中するということを確認した。１１６種の菌株のうち、ニンヒドリン反応時に吸光度が高かった上位２０個の菌株を、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｍ１）〜ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｒｐｏＣ（Ｍ２０）と命名した。

Claims (7)

1. 配列番号１のアミノ酸配列において、第９７５ないし第１２８４におけるアミノ酸において、１個ないし５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、ＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット変異体。
2. 前記配列番号１のアミノ酸配列において、第９７５ないし第１２８４におけるアミノ酸が、第１０１４ないし第１０３４におけるアミノ酸及び第１２３０ないし第１２５５におけるアミノ酸のうち１以上であることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼ・ベータプライムサブユニット変異体。
3. 請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット変異体をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
4. 調節配列と作動可能に連結された請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
5. 請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼのベータプライムサブユニット変異体を発現するコリネバクテリウム微生物。
6. 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウムグルタミクムであることを特徴とする、請求項５に記載の微生物。
7. 請求項５に記載の微生物を培養し、培養物中にＬ−リジンを生産する段階と、
   培養物からＬ−リジンを回収する段階と
   を含む、Ｌ−リジンを生産する方法。

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