KR20180069057A - 향상된 단백질 발현 및 이의 방법 - Google Patents

향상된 단백질 발현 및 이의 방법 Download PDF

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KR20180069057A
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다니스코 유에스 인크.
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Abstract

일반적으로 본 발명은 관심 대상의, 증가된 양의 하나 이상의 단백질(들)을 생성하는 변형 그람(Gram) 양성 박테리아 세포, 및 증가된 유전적 수용능(genetic competency)을 갖는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 특정한 실시 양태는 관심 대상의 단백질을 발현하는 비변형 (모) 그람 양성 박테리아 세포에 비하여 증가된 양의 상기 단백질을 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이며, 여기서, 변형 박테리아 세포는 변이형 RNA-폴리머라아제 (RNAP) β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는rpoC 유전자는 변형된 세포의 염색체 내로 통합된다. 다른 실시 양태에서, 변이형 β-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 변형된 세포 내로 도입된 염색체외 플라스미드 상에 포함된다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하는 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 포함하는 수용성 바실루스 숙주 세포에 관한 것이며, 여기서, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 핵산 구축물의 도입 전에는 비-수용성었던 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드이다.

Description

향상된 단백질 발현 및 이의 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 10월 30일자로 출원된 미국 가출원 제62/248,228호의 이익을 청구하며, 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
발명의 분야
일반적으로 본 발명은 미생물학, 분자 생물학, 효소학, 단백질 공학 등의 분야에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 관심 대상의, 증가된 양의 하나 이상의 단백질(들)을 생성하는 변형 그람(Gram) 양성 박테리아 세포에 관한 것이다. 특정한 다른 실시 양태에서, 본 발명은 증가된 유전적 수용능(genetic competency)을 포함하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이다.
서열 목록의 제출
“NB40948WOPCT_SEQ.txt”로 명명된 서열 목록 텍스트 파일의 전자 제출 내용은 2016년 10월 12일자로 생성되었으며, 크기가 71 KB이고, 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
예를 들어 고전적인 주(strain) 개선 방법, 예컨대 주를 다수의 라운드로 돌연변이 유발시키고 고 생산자에 대하여 선발하는 것, 게놈 내로 삽입되는 관심 대상의 유전자(들)의 높은 카피수 또는 천연 카피수보다 더 높은 카피수를 갖는 생성주를 만들거나 유전자 조작하는 것, 다수의 카피의 적합한 발현 벡터 내로 도입하여 생성주 내로 도입하는 것, 벡터, 프로모터, 융합 발현, 분자 샤페론을 이용한 관심 대상의 단백질들의 공동 발현 등을 포함하는 다양한 기술을 개발하여 폴리펩티드의 공업 생산을 개선시켰다.
상기 방법 및 기술 중 다수는 숙주 미생물 주의 생산성의 개선에 효과적이지만, 이들은 거의 모두가 제약, 예컨대 개별 생성물을 제조하기 위한 주 구축 활동의 라운드의 노동 강도, 숙주 세포의 배양 동안 상실되게 되는, 특히 높은 카피수의 불안정한 플라스미드, 다수의 카피의 유전자가 숙주 세포의 염색체 내로 통합됨에 의해 야기되는 숙주 세포의 불안정성 등을 갖는다.
따라서, 본 기술 분야에서 관심 대상의 단일 단백질의 증가된 단백질 생성, 관심 대상의 하나 이상의 단백질의 증가된 단백질 생성, 관심 대상의 단백질의 하나 이상의 패널의 증가된 단백질 생성, 내인성 단백질의 증가된 단백질 생성 등이 가능한 개선된 숙주 및/또는 생성 주에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
RNA-폴리머라아제 (이하, “RNAP”)는 가장 중추적인 전사 조절 허브(hub) 중 하나이며, 가장 많이 연구된 박테리아 RNAP는 이. 콜라이(E. coli) RNAP로서, 이는 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 프로테우스(Proteus), 에어로박터(Aerobacter) 및 바실루스(Bacillus)를 포함하는 다수의 박테리아 속으로부터 단리된 대표적인 RNAP 효소이다 (문헌[Fukuda et al., 1977] 참조).
RNAP “코어 효소”는 각각 2:1:1의 비의 α (알파), β (베타), 및 β′ (베타′) 서브유닛으로 이루어진다. RNAP α (알파), β (베타), 및 β′ (베타′) 서브유닛은 각각 rpoA , rpoB , 및 rpoC 유전자에 의해 코딩된다.
RNAP에 영향을 주는 돌연변이는 잘 알려진 선발 프로토콜의 실행 동안 생길 수 있다 (문헌[Conrad et al., 2010]; 문헌[Cui et al., 2010]). 돌연변이 버전의 α-서브유닛 (RpoA) 단백질은 가끔 세포 표현형을 실질적으로 변경시킬 수 있다 (문헌[Klein-Marcuschamer et al., 2009]). 이와 마찬가지로, β-서브유닛 (RpoB) 단백질에서의 특정 돌연변이 (이는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 리팜핀 내성을 초래함)는 성장, 수용능, 포자 형성, 및 발아에 연루된 발현 및/또는 조절의 변경과 상관된다 (문헌[Maughan et al., 2004]).
예를 들어, 그러한 β-서브유닛 변화의 하나의 결과는 유전자 활성의 증가일 수 있지만, 다른 경우에 그러한 변화는 효과를 거의 초래하지 않거나 전혀 초래하지 않을 수 있다 (문헌[Kane et al., 1979]). 다양한 수준의 포스파타아제 활성이 리팜피신 내성 주에 대하여 보고되었다 (예를 들어, 문헌[Sharipova et al., 1994] 참조). β-서브유닛 (RpoB) 단백질에서의 적어도 하나의 돌연변이가 관심 대상의 생성물의 생성을 변경시킴이 또한 보고되었다 (국제 공개 제2003/055996호).
게다가, β′-서브유닛 (RpoC) 단백질의 돌연변이는 최소 배지에서의 최적 성장을 위한 조절적 적응을 허용하고 (문헌[Conrad et al., 2010]) 세푸록심 (CEF) 내성에 대한 저항성을 초래한다 (문헌[Lee et al., 2013])는 것이 제안되었다.
하기 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]에 개시된 바와 같이, 본 발명은 관심 대상의, 증가된 양의 하나 이상의 단백질을 발현 및 생성하는 것이 가능한 박테리아 세포에 대한 본 기술 분야에서의 충족되지 않은 필요성을 다룬다. 더 구체적으로, 본 발명은 관심 대상의 단일 단백질의 증가된 생성, 관심 대상의 하나 이상의 단백질의 증가된 생성, 관심 대상의 단백질의 하나 이상의 패널의 증가된 생성, 내인성 단백질의 증가된 생성 등이 가능한 개선된 박테리아 (숙주) 세포에 대한 본 기술 분야에서의 필요성을 다룬다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 유전적 수용능이 개선되거나 증가됨으로써 더 큰 빈도의 형질전환 세포를 초래하는 그람 양성 박테리아 세포 (예를 들어, 바실루스 sp. 숙주 세포)에 대한 본 기술 분야에서의 충족되지 않은 필요성을 다룬다.
일반적으로 본 발명은 관심 대상의, 증가된 양의 하나 이상의 단백질(들)을 생성하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이다. 따라서, 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 비변형 그람 양성 박테리아 세포에 비하여 증가된 양의 관심 대상의 단백질(protein of interest; POI)을 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이며, 여기서, 변형 박테리아 세포는 변이형 RNA-폴리머라아제 (RNAP) β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는rpoC 유전자는 변형된 세포의 염색체 내로 통합된다. 다른 실시 양태에서, 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 변형된 세포의 염색체외 플라스미드 상에 포함된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 야생형 rpoC 유전자, 또는 서열 번호 5에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체로부터 유래된다. 특정한 다른 실시 양태에서, rpoC 유전자는 서열 번호 6에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 야생형 rpoC 유전자, 또는 서열 번호 7에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체로부터 유래된다. 특정한 실시 양태에서, rpoC 유전자는 서열 번호 8에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩한다. 특정한 다른 실시 양태에서, 서열 번호 6의 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 6의 아미노산 잔기 위치 751, 784, 797, 796 및/또는 1018 내지 1020, 또는 임의의 박테리아 RNAP β′-서브유닛 패밀리 구성원에서의 등가의 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 6의 아미노산 잔기 751에서의 메티오닌의 이소류신으로의 치환 (M751I), 서열 번호 6의 아미노산 잔기 784에서의 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 (R784H), 서열 번호 6의 아미노산 잔기 797에서의 세린의 페닐알라닌으로의 치환 (S797F), 서열 번호 6의 아미노산 잔기 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환 (D796G), 및/또는 서열 번호 6의 아미노산 잔기 1,018, 1,019 및 1,020의 결실 (ΔI1018-R1020)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 서열 번호 8의 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 위치 751, 784, 797, 796 및/또는 1018 내지 1020, 또는 임의의 박테리아 RNAP β′-서브유닛 패밀리 구성원에서의 등가의 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 751에서의 메티오닌의 이소류신으로의 치환 (M751I), 서열 번호 8의 아미노산 잔기 784에서의 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 (R784H), 서열 번호 8의 아미노산 잔기 797에서의 세린의 페닐알라닌으로의 치환 (S797F),서열 번호 8의 아미노산 잔기 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환 (D796G),및/또는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 1,018, 1,019 및 1,020의 결실 (ΔI1018-R1020)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 변형된 세포는 변이형 RNAP β-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoB 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 rpoB 유전자는 야생형 rpoB 유전자, 또는 서열 번호 1에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체로부터 유래된다. 특정한 다른 실시 양태에서, rpoB 유전자는 서열 번호 2에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 변이형 RNAP β-서브유닛 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시 양태에서, 서열 번호 2의 변이형 RNAP β-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노 위치 469, 478, 482, 485, 또는 487, 또는 임의의 진정세균 RNAP β-서브유닛 패밀리 구성원에서의 등가의 위치에서의 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 변이형 RNAP β-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 잔기 478에서의 알라닌의 아스파르트산으로의 치환 (A478D), 서열 번호 2의 아미노산 잔기 482에서의 히스티딘의 아르기닌으로의 치환 (H482R), 서열 번호 2의 아미노산 잔기 482에서의 히스티딘의 타이로신으로의 치환 (H482Y), 서열 번호 2의 아미노산 잔기 482에서의 히스티딘의 프롤린으로의 치환 (H482P), 및 서열 번호 2의 아미노산 잔기 469에서의 글루타민의 라이신으로의 치환 (Q469K)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 비변형된 그람 양성 대조 세포에 비하여 발현 POI의 양의 증가는 5% 이상이다. 또 다른 실시 양태에서, 비변형된 그람 양성 대조 세포에 비하여 발현 POI의 양의 증가는 10% 이상이다.
또 다른 실시 양태에서, 그람 양성 박테리아 (숙주) 세포는 바실라세아에(Bacillaceae) 패밀리의 구성원이다. 특정 실시 양태에서, 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스 속의 구성원이다. 또 다른 실시 양태에서, 바실루스 세포는 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 렌투스(B.　 lentus), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 스테아로서모필루스(B. stearothermophilus), 비. 알칼로필루스(B. alkalophilus), 비. 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 소노렌시스(B. sonorensis), 비. 할로두란스(B.　halodurans), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 라우투스(B. lautus), 비. 파불리(B. pabuli), 비. 세레우스(B. cereus), 비. 아가라드하에렌스(B. agaradhaerens), 비. 아키바이(B akibai), 비. 클라르키이(B. clarkii), 비. 슈도피르무스(B. pseudofirmus), 비. 레헨시스(B. lehensis), 비. 메가테륨(B. megaterium), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 서큐란스(B. circulans), 비. 깁소니이(B. gibsonii), 및 비. 튜린기엔시스(B. thuringiensis)로부터 선택된다. 또 다른 실시 양태에서, 바실루스 세포는 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 리케니포르미스이다.
다른 실시 양태에서, POI는 변형된 박테리아 세포에 대하여 외인성인 유전자 또는 변형된 박테리아 세포에 대하여 내인성인 유전자에 의해 코딩된다. 다른 실시 양태에서, POI는 세포외로 분비되거나 수송된다. 특정한 다른 실시 양태에서, 세포외로 분비되거나 수송된 POI는 단리되고 정제된다.
특정한 다른 실시 양태에서, POI는 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 언하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 다른 실시 양태는 본 발명의 변형된 세포에 의해 생성된 단리된 관심 대상의 단백질 (POI)에 관한 것이다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 그람 양성 박테리아 세포에서 관심 대상의 단백질 (POI)의 발현의 증가 방법에 관한 것이며, 이는 (a) 증가된 양의 POI를 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포를 수득하는 단계 (여기서, 변형된 박테리아 세포는 변이형 RNA-폴리머라아제 (RNAP) β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함함), 및 (b) 변형된 세포를 POI가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계 (여기서, 증가된 양의 POI를 발현하는 변형된 박테리아 세포는 비변형 그람 양성 박테리아 세포에서의 POI의 발현과 대비됨)를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는rpoC 유전자는 변형된 세포의 염색체 내로 통합된다. 다른 실시 양태에서, 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 변형된 세포의 염색체외 플라스미드 상에 포함된다.
본 방법의 다른 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 야생형 rpoC 유전자, 또는 서열 번호 5에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체로부터 유래된다. 특정한 다른 실시 양태에서, rpoC 유전자는 서열 번호 6에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 변이형 RNAP β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 야생형 rpoC 유전자, 또는 서열 번호 7에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체로부터 유래된다. 또 다른 실시 양태에서, rpoC 유전자는 서열 번호 8에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩한다. 특정한 다른 실시 양태에서, 서열 번호 6의 변이형 RNAP β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 6의 아미노산 잔기 위치 751, 784, 797, 796 및/또는 1018 내지 1020, 또는 임의의 박테리아 RNAP β′-서브유닛 패밀리 구성원에서의 등가의 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
본 방법의 특정한 다른 실시 양태에서, 변이형 RNAP β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 6의 아미노산 잔기 751에서의 메티오닌의 이소류신으로의 치환 (M751I), 서열 번호 6의 아미노산 잔기 784에서의 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 (R784H), 서열 번호 6의 아미노산 잔기 797에서의 세린의 페닐알라닌으로의 치환 (S797F), 서열 번호 6의 아미노산 잔기 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환 (D796G), 및 서열 번호 6의 아미노산 잔기 1,018, 1,019 및 1,020의 결실 (ΔI1018-R1020)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 서열 번호 8의 변이형 RNAP β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 위치 751, 784, 797, 796 및/또는 1018 내지 1020, 또는 임의의 박테리아 RNAP β′-서브유닛 패밀리 구성원에서의 등가의 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특정한 다른 실시 양태에서, 변이형 RNAP β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 751에서의 메티오닌의 이소류신으로의 치환 (M751I), 서열 번호 8의 아미노산 잔기 784에서의 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 (R784H), 서열 번호 8의 아미노산 잔기 797에서의 세린의 페닐알라닌으로의 치환 (S797F), 서열 번호 8의 아미노산 잔기 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환 (D796G), 및 서열 번호 8의 아미노산 잔기 1,018, 1,019 및 1,020의 결실 (ΔI1018-R1020)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 본 방법은 변이형 RNAP β-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoB 유전자를 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 rpoB 유전자는 야생형 rpoB 유전자, 또는 서열 번호 1에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체로부터 유래된다. 특정한 다른 실시 양태에서, rpoB 유전자는 서열 번호 2에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 변이형 RNAP β-서브유닛 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시 양태에서, 서열 번호 2의 변이형 RNAP β-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노 위치 469, 478, 482, 485, 또는 487, 또는 임의의 진정세균 RNAP β-서브유닛 패밀리 구성원에서의 등가의 위치에서의 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 변이형 RNAP β-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 잔기 478에서의 알라닌의 아스파르트산으로의 치환 (A478D), 서열 번호 2의 아미노산 잔기 482에서의 히스티딘의 아르기닌으로의 치환 (H482R), 서열 번호 2의 아미노산 잔기 482에서의 히스티딘의 타이로신으로의 치환 (H482Y), 서열 번호 2의 아미노산 잔기 482에서의 히스티딘의 프롤린으로의 치환 (H482P), 및 서열 번호 2의 아미노산 잔기 469에서의 글루타민의 라이신으로의 치환 (Q469K)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
본 방법의 다른 실시 양태에서, 비변형된 그람 양성 대조 세포에 비하여 발현 POI의 양의 증가는 5% 이상이다. 또 다른 실시 양태에서, 비변형된 그람 양성 대조 세포에 비하여 발현 POI의 양의 증가는 10% 이상이다. 특정한 다른 실시 양태에서, 그람 양성 박테리아 세포는 바실라세아에 패밀리의 구성원이다. 또 다른 실시 양태에서, 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스 속의 구성원이다. 또 다른 실시 양태에서, 바실루스는 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 소노렌시스, 비. 할로두란스, 비. 푸밀루스, 비. 라우투스, 비. 파불리, 비. 세레우스, 비. 아가라드하에렌스, 비. 아키바이, 비. 클라르키이, 비. 슈도피르무스, 비. 레헨시스, 비. 메가테륨, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 깁소니이, 및 비. 튜린기엔시스로부터 선택된다. 특정한 다른 실시 양태에서, 바실루스는 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 리케니포르미스이다. 다른 실시 양태에서, POI는 변형된 박테리아 세포에 대하여 외인성인 유전자 또는 변형된 박테리아 세포에 대하여 내인성인 유전자에 의해 코딩된다. 특정한 실시 양태에서, POI는 세포외로 분비되거나 수송된다. 다른 실시 양태에서, 세포외로 분비되거나 수송된 POI는 단리된다. 또 다른 실시 양태에서, 단리된 POI는 정제된다.
또 다른 실시 양태에서, POI는 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 언하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정한 다른 실시 양태는 본 발명의 방법에 의해 생성된 단리된 관심 대상의 단백질 (POI)에 관한 것이다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 증가된 양의 POI를 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포의 수득 방법에 관한 것으로서, 이는 (a) 적어도 하나의 rpoC 유전자 변형을 모 그람 양성 박테리아 세포 내로 도입하는 단계, 및 (b) 증가된 양의 POI를 발현하는 하나 이상의 딸세포를 선발하는 단계를 포함한다.
특정한 다른 실시 양태에서, 본 발명은 변이형 RNA-폴리머라아제 (RNAP) β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 rpoC 유전자를 포함하는 통합 벡터에 관한 것이다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 통합 플라스미드를 포함하는 그러한 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이다.
특정한 다른 실시 양태에서, 본 발명은 형질전환된 바실루스 숙주 세포의 수득 방법에 관한 것이며, 이는 (a) 프로모터 영역 5’을 포함하며 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피에 의해 수용성으로 만들어지는 바실루스 숙주 세포를 외인성 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 단계 (여기서, 변형 rpoC 폴리펩티드는 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하며, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 핵산 구축물의 도입 전에는 비-수용성었던 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및 (b) 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바실루스 숙주 세포의 형질전환체를 단리하는 단계를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 수용성 바실루스 숙주 세포는 프로모터 영역 5’을 포함하고 숙주 세포가 더욱 더 수용성이 되게 만들기 위한 ComK 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제2 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 추가로 포함한다. 특정한 다른 실시 양태에서, ComK 폴리펩티드는 서열 번호 35, 또는 서열 번호 37의 ComK 폴리펩티드에 대하여 90%의 서열 동일성을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 바실루스 숙주 세포는 바실루스 리케니포르미스이다. 본 발명의 특정한 다른 실시 양태는 그러한 방법으로부터 수득되는 형질전환된 바실루스 숙주 세포에 관한 것이다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 수용성 바실루스 숙주 세포의 수득 방법에 관한 것이며, 이는 (a) 프로모터 영역 5'을 포함하며 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 비-수용성 바실루스 숙주 세포 내로 도입하는 단계 (여기서, 변형 rpoC 폴리펩티드는 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하며, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및 (b) 단계 (a)의 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 수용성 바실루스 숙주 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 수용성 바실루스 숙주 세포는 프로모터 영역 5’을 포함하고 ComK 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제2 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 추가로 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, ComK 폴리펩티드는 서열 번호 35, 또는 서열 번호 37의 ComK 폴리펩티드에 대하여 90%의 서열 동일성을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 바실루스 숙주 세포는 바실루스 리케니포르미스이다.
본 발명의 특정한 다른 실시 양태는 그러한 방법으로부터 수득되는 수용성 바실루스 숙주 세포에 관한 것이다.
특정한 다른 실시 양태에서, 본 발명은 프로모터 영역 5'을 포함하며 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하는 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 포함하는 수용성 바실루스 숙주 세포에 관한 것이며, 여기서, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 핵산 구축물의 도입 전에는 비-수용성이었던 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드이다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 형질전환된 바실루스 숙주 세포의 수득 방법에 관한 것이며, 이는 (a) 프로모터 영역 5’을 포함하며 rpoB 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피에 의해 수용성으로 만들어지는 바실루스 숙주 세포를 외인성 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 단계 (여기서, 변형 rpoB 폴리펩티드는 서열 번호 4에 대하여 90%의 서열 동일성을 포함하며, 서열 번호 4의 위치 478에서의 발린 잔기를 포함하고, rpoB 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 핵산 구축물의 도입 전에는 비-수용성이었던 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및 (b) 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바실루스 숙주 세포의 형질전환체를 단리하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 수용성 바실루스 숙주 세포의 수득 방법에 관한 것이며, 이는 (a) 프로모터 영역 5’을 포함하며 rpoB 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 비-수용성 바실루스 숙주 세포 내로 도입하는 단계 (여기서, rpoB 폴리펩티드는 서열 번호 4에 대하여 90%의 서열 동일성을 포함하며, 서열 번호 4의 위치 478에서의 발린 잔기를 포함하고, rpoB 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및 (b) 단계 (a)의 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 수용성 바실루스 숙주 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 특정한 다른 실시 양태는 그러한 방법으로부터 수득되는 형질전환된 바실루스 숙주 세포에 관한 것이다.
도 1은 표 1에 개시된, 본 발명의 예시적인 rpoC 유전자 변형 (즉, 치환 및 결실 돌연변이체)의 플라스미드 지도를 나타낸다. 표 1에 개시된 특정 아미노산 치환 또는 결실은 서열 번호 6의 야생형 RpoC (β′-서브유닛) 단백질을 코딩하는, 서열 번호 5의 모 바실루스 서브틸리스 rpoC 유전자와 관련된다. 예를 들어, 도 1에 개시된 pCZ211 플라스미드의 지도는 서열 번호 6의 아미노산 잔기 796에서의 아스파르트산 (D)의 글리신 (G) 잔기로의 아미노산 치환을 포함하는 변형 RpoC (β′-서브유닛) 단백질을 코딩한다 (도 1에서 “rpoC-D796G”로 라벨링됨). 상기 플라스미드는 “EcoRI” 제한효소 부위, “XbaI” 제한효소 부위, I-Sce 부위, 카나마이신 (“Km”) 내성 유전자, β-락타마아제 (“bla”) 유전자, cop-6 및 “repC” 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함한다.
도 2는 표 2에 개시된, 본 발명의 예시적인 rpoC 유전자 변형 (즉, 치환 및 결실 돌연변이체)의 플라스미드 지도를 나타낸다. 표 2에 개시된 특정 아미노산 치환 또는 결실은 서열 번호 8의 야생형 RpoC (β′-서브유닛) 단백질을 코딩하는, 서열 번호 7의 모 바실루스 리케니포르미스 rpoC 유전자와 관련된다. 예를 들어, 도 2에 개시된 pCZ201 플라스미드의 지도는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 796에서의 아스파르트산 (D)의 글리신 (G) 잔기로의 아미노산 치환을 포함하는 변형 RpoC (β′-서브유닛) 단백질을 코딩한다. 상기 플라스미드는 “EcoRI” 제한효소 부위, “Sal -I” 제한효소 부위, “I-Sce” 부위, 카나마이신 프로모터 (“Kan 프로모터”)에 작동가능하게 연결된 카나마이신 내성 마커 (“Kan CDS”) 코딩 서열, “람다 종결자”, 리보솜 rrnB 종결자 (“Term rrnB”) 및 pE194 감온 레플리콘(temperature sentitive replicon) (“Ts 레플리콘”)을 추가로 포함한다.
도 3은 실시예 2에서 설명된 벡터 pKB320의 플라스미드 지도이다. pK320 플라스미드는 다양한 제한 효소 부위, pE194 감온 레플리콘 (Ts 레플리콘), 카나마이신 코딩 서열 (Kan CDS), 카나마이신 프로모터 (Kan 프로모터), 리보솜 종결자 서열 (Term rrnB) 및 람다 종결자 (Lamba Term)를 포함한다.
도 4는 실시예 3에서 설명된 rpoB 구축물의 개략도이며, 여기서, rpoB 구축물은 스펙티노마이신 (SpecR) 내성 마커 및 서열 번호 2의 아미노산 위치 469에서의 글루타민 (Q)의 아르기닌 (R)으로의 치환 (즉, Q469R 치환), 서열 번호 2의 아미노산 위치 469에서의 글루타민 (Q)의 라이신 (K)으로의 치환 (즉, Q469K 치환) 또는 서열 번호 2의 아미노산 위치 482에서의 히스티딘 (H)의 타이로신 (Y)으로의 치환 (즉, H482Y 치환)을 포함한다.
도 5는 실시예 7에서 설명된 아밀라아제-4 효소의 생성량 (시간의 함수로서)을 나타내는 데이터를 제시한다. 도 5에 예시된 데이터는 rpoC 유전자 변이체 (즉, RpoC (β′-서브유닛) “D796G” 폴리펩티드 변이체를 코딩함)를 포함하는 변형된 (딸) 비. 리케니포르미스 세포에서의 아밀라아제-4 생성량에 관하여 모 (야생형) 비. 리케니포르미스 세포에서의 OD당 (도 5a) 또는 단위 부피당 (도 5b) 아밀라아제-4 효소 생성량을 비교한다.
도 6은 실시예 8에서 설명된 아밀라아제-3 효소의 생성량을 나타내는 데이터를 제시한다. 도 6에 개시된 바와 같이, rpoC 유전자 변이체 (즉, RpoC (β′-서브유닛) “D796G” 폴리펩티드 변이체를 코딩함)를 포함하는 모 (야생형) 비. 리케니포르미스 세포 및 변형된 (딸) 비. 리케니포르미스 세포로부터의 아밀라아제-3의 효소 활성 (단위/그램/OD)이 시간 (h)의 함수로서 도시되어 있다.
도 7은 pBR322 복제 원점, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 스펙티노마이신 내성 (Specr) 유전자 spc (aad9로도 칭해짐), 바실루스에서의 복제를 위한 비. 서브틸리스 (낫토(natto)) 플라스미드 pTA1060 rep 유전자, 비. 서브틸리스xylA 프로모터에 의해 제어되는 비. 리케니포르미스 comK 유전자, 및 비. 서브틸리스 xylR 유전자를 코딩하는 DNA 서열들을 포함하는 플라스미드 pBLComK의 지도를 나타낸다. 　
도 8은 아밀라아제를 코딩하는 pHPLT의 플라스미드 지도를 제시한다.
도 9는 rpoB (478V) 및 야생형 (천연) rpoC 폴리펩티드를 포함하는/코딩하는 모 (대조) 비. 리케니포르미스 숙주 세포의 비. 리케니포르미스 숙주 세포 형질전환 효율 데이터 (OD600 및 CFU)를 나타낸다.
도 10은 돌연변이형 rpoB 폴리펩티드 (V478A) 및 야생형 (천연) rpoC 폴리펩티드를 포함하는/코딩하는 딸 (변형) 비. 리케니포르미스 숙주 세포의 비. 리케니포르미스 숙주 세포 형질전환 효율 데이터 (OD600 및 CFU)를 나타낸다.
도 11은 rpoB (478V) 폴리펩티드 및 변형 rpoC 폴리펩티드 (D796G)를 포함하는/코딩하는 딸 (변형) 비. 리케니포르미스 숙주 세포의 비. 리케니포르미스 숙주 세포 형질전환 효율 데이터 (OD600 및 CFU)를 나타낸다.
생물학적 서열의 간단한 설명
하기 서열은 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825 (“뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열의 기재를 포함하는 특허 출원의 요건--서열 규정[Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures--the Sequence Rules”)를 따르며, 세계 지적 재산권 기구(World Intellectual Property Organization; WIPO) 표준 ST.25 (2009) 및 유럽 특허 조약(European Patent Convention; EPC) 및 특허 협력 조약(Patent Cooperation Treaty; PCT) 시행규칙 5.2 및 49.5(a-bis), 및 시행 세칙의 제208조 및 부칙 C의 서열 목록 요건과 일관된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용되는 부호 및 포맷은 37 C.F.R. § 1.822에 개시된 규정을 따른다.
서열 번호 1은 바실루스 서브틸리스 유래의 야생형 RpoB (β-서브유닛) 단백질을 코딩하는 핵산 서열이다.
서열 번호 2는 바실루스 서브틸리스 유래의 야생형 RpoB (β-서브유닛) 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 3은 바실루스 리케니포르미스 유래의 야생형 RpoB (β-서브유닛) 단백질을 코딩하는 핵산 서열이다.
서열 번호 4는 바실루스 리케니포르미스 유래의 야생형 RpoB (β-서브유닛) 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 5는 바실루스 서브틸리스 유래의 야생형 RpoC (β′-서브유닛) 단백질을 코딩하는 핵산 서열이다.
서열 번호 6은 바실루스 서브틸리스 유래의 야생형 RpoC (β′-서브유닛) 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 7은 바실루스 리케니포르미스 유래의 야생형 RpoC (β′-서브유닛) 단백질을 코딩하는 핵산 서열이다.
서열 번호 8은 바실루스 리케니포르미스 유래의 야생형 RpoB (β′-서브유닛) 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 9는 감온 플라스미드 pKSV7-I-Sce KM의 구축에서 사용되는 “I-SceI-1” 올리고뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 10은 감온 플라스미드 pKSV7-I-Sce KM의 구축에서 사용되는 “I-SceI-2” 올리고뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 11은 정방향 “EcoRI-rpoC” 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 12는 역방향 “SalI-rpoC” 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 13은 플라스미드 pCZ201 내지 pCZ205의 성공적인 조립을 확인하기 위한 콜로니 PCR에 사용되는 정방향 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 14는 플라스미드 pCZ201 내지 pCZ205의 성공적인 조립을 확인하기 위한 콜로니 PCR에 사용되는 역방향 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 15는 정방향 “rpoC” 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 16은 역방향 “rpoC ” 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 17은 서열결정 확인에 사용되는 정방향 “rpoC” 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 18은 아밀라아제-3 통합 카세트 수득에 사용되는 정방향 “NotI-아밀라아제-3” 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 19는 아밀라아제-3 통합 카세트의 수득에 사용되는 역방향 “NotI-아밀라아제-3” 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 20은 rpoB 유전자의 5’ 서열의 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다.
서열 번호 21은 rpoB 유전자의 5’ 서열의 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다.
서열 번호 22는 rpoB 유전자의 3’ 서열의 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다.
서열 번호 23은 rpoB 유전자의 3’ 서열의 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다.
서열 번호 24는 rpoB 유전자의 3’ 서열의 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다.
서열 번호 25는 rpoB 유전자의 5’ 서열의 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다.
서열 번호 26은 rpoB 유전자의 3’ 서열의 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다.
서열 번호 27은 rpoB 유전자의 5’ 서열의 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다.
서열 번호 28은 스펙티노마이신 내성 유전자 및 I- Sce 제한 효소의 인식 부위를 포함하는 합성 DNA 구축물이다.
서열 번호 29는 rpoB 유전자의 3’ 서열의 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다.
서열 번호 30은 rpoB 유전자의 3’ 서열의 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다.
서열 번호 31은 서열 번호 6의 RpoC 단백질의 아미노산 잔기 461 내지 500을 포함한다.
서열 번호 32는 정방향 EcoRI-RpoB 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 33은 역방향 NotI-RpoB 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 34는 바실루스 ComK 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이다.
서열 번호 35는 서열 번호 34에 의해 코딩되는 ComK 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
서열 번호 36은 바실루스 ComK 폴리펩티드를 코딩하는 대안적인 핵산 서열이다.
서열 번호 37은 서열 번호 36에 의해 코딩되는 ComK 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
상세한 설명
일반적으로 본 발명은 관심 대상의, 증가된 양의 하나 이상의 단백질(들)을 생성하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 특정한 실시 양태는 관심 대상의 단백질 (이하, “POI”)을 발현하는 비변형 (모) 그람 양성 박테리아 세포에 비하여 증가된 양의 상기 POI를 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이며, 여기서, 변형 박테리아 세포는 변이형 RNA-폴리머라아제 (RNAP) β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
I. 정의
본원에 개시된 변형 박테리아 세포, 이의 조성물 및 이의 방법을 고려하여, 하기 용어 및 어구를 정의한다. 본원에서 정의되지 않은 용어는 본 기술 분야에서 사용되는 통상적인 의미를 따를 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 조성물 및 방법이 적용되는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기술되는 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 조성물 및 방법의 실시 또는 시험에서 또한 사용될 수 있지만, 대표적인 예시적인 방법 및 재료가 이제 기술된다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 본원에 참고로 포함된다.
청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있다는 것이 또한 주지된다. 이와 같이, 이러한 서술은 청구항 요소의 설명과 관련하여 "단독의", "단지", “제외하는” 등과 같은 이러한 배타적인 용어의 사용, 또는 "부정적" 제한의 사용에 대한 선행적 근거로서의 역할을 하는 것으로 의도된다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기술되고 예시된 각각의 개별적인 실시 양태는 본원에 기술된 본 발명의 조성물 및 방법의 범주 또는 사상으로부터 벗어나지 않고서 다른 몇몇 실시 양태들 중 임의의 실시 양태의 특징과 쉽게 구별되거나 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 언급된 방법은 열거된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실시될 수 있다.
값의 범위가 제공될 경우, 그 범위의 상한치와 하한치 사이의, (문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한) 하한치의 단위의 십분의 일까지의, 각각의 개재값(intervening value) 및 그 진술된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 개재값이 본 발명의 조성물 및 방법 내에 포함된다는 것이 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 그 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 언급된 범위 내의 임의로 구체적으로 배제된 한도를 조건으로, 본 발명의 조성물 및 방법 내에 또한 포함된다. 언급된 범위가 한도들 중 하나 또는 이들 둘 다를 포함하는 경우, 이러한 포함된 한도들 중 어느 하나 또는 이들 둘 다를 배제하는 범위가 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 포함된다.
본원에서 특정 범위는 용어 "약"이 선행되는 수치 값으로 제시된다. 본원에서 용어 "약"은 뒤에 오는 정확한 수뿐만 아니라 이 용어 뒤에 오는 수에 근사하거나 대략적인 수를 문자 그대로 뒷받침하기 위하여 사용된다.
본원에서 정의되는 바와 같이, “변형된 세포”, “변경된 세포”, “변형된 박테리아 세포”, “변경된 박테리아 세포”, “변형된 숙주 세포” 또는 “변경된 숙주 세포”는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 변이형 RNA-폴리머라아제 (RNAP) β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 그람 양성 박테리아 (숙주) 세포를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 “변형된” 그람 양성 박테리아 세포는 또한 모 박테리아 세포로부터 유래된 “변형된 (숙주) 세포”로서 정의될 수 있으며, 여기서, 변형된 (딸) 세포는 변이형 RNAP β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, “비변형된 세포”, “비변경된 세포”, “비변형된 박테리아 세포”, “비변경된 박테리아 세포”, “비변형된 숙주 세포” 또는 “비변경된 숙주 세포”는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 변이형 RNAP β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않는 “비변경된” (모) 그람 양성 박테리아 세포를 나타낼 수 있다.
특정 실시 양태에서, “비변형된” 그람 양성 (모) 세포는, 특히 “변형된” 그람 양성 (딸) 세포와 비교되거나 이에 관한 것일 때, “대조 세포”로 칭해질 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “비변형된” (모) 세포 (즉, 대조 세포)에서의 POI의 발현 및/또는 생성이 “변형된” (딸) 세포에서의 상기 POI의 발현 및/또는 생성과 비교될 때, “변형된” 세포 및 “비변형된” 세포는 본질적으로 동일한 조건 (배지, 온도, pH 등과 같은 동일한 조건) 하에 성장/배양/발효된다는 것이 이해될 것이다.
마찬가지로, 본원에서 정의되는 바와 같이, 용어 “증가된 발현”, “향상된 발현”, “POI의 증가된 발현”, “증가된 생성”, “POI의 증가된 생성” 등은 변이형 RNAP β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 “변형된” (딸) 세포를 나타내며, 여기서, “증가”는 항상 동일한 POI를 발현하는 “비변형된” (모) 세포에 관한 (대한) 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “핵산”은 센스 가닥을 나타내든지 안티센스 가닥을 나타내든지 간에, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA, cDNA, 및 RNA뿐만 아니라 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 일부도 나타낸다. 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 다수의 뉴클레오티드 서열이 주어진 단백질을 코딩할 수 있음이 이해된다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 (또는 핵산 분자)는 “유전자”, “벡터” 및 “플라스미드”를 포함함이 이해된다. 따라서, 용어 “유전자”는 전부의 또는 일부의 단백질 코딩 서열을 포함하는, 아미노산의 특정 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 나타내며, 예를 들어 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 프로모터 서열과 같은 조절 (비-전사) DNA 서열을 포함할 수 있다. 유전자의 전사 영역은 코딩 서열뿐만 아니라 인트론, 5’-비번역 영역(UTR), 및 3'-UTR을 포함하는 비번역 영역(UTR)도 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “코딩 서열”은 (코딩된) 단백질 생성물의 아미노산 서열을 직접적으로 특정하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임(open reading frame) (이하, “ORF”)에 의해 결정되며, 이는 대개 ATG 시작 코돈으로 시작된다. 전형적으로 코딩 서열은 DNA, cDNA, 및 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, “오픈 리딩 프레임” (이하, “ORF”)이라는 용어는 (i) 개시 코돈, (ii) 아미노산을 나타내는 일련의 두 개 (2개) 이상의 코돈, 및 (iii) 종결 코돈으로 이루어진 연속된(uninterrupted) 리딩 프레임을 포함하는 핵산 또는 핵산 서열 (천연 발생적이든지, 비-천연 발생적이든지, 합성이든지 간에)을 의미하며, ORF는 5’에서 3’ 방향으로 판독된다 (또는 번역된다).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “프로모터”는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열을 나타낸다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대하여 3’(하류)에 위치한다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체가 유래될 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래되는 상이한 요소들로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 핵산 절편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터들은 상이한 세포 유형에서의, 또는 상이한 발달 단계에서의, 또는 상이한 환경 조건 또는 생리학적 조건에 응답하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 세포 유형에서 대부분의 시점에 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 일반적으로 “구성적 프로모터(constitutive promoter)”로 칭해진다. 또한, 대부분의 경우, 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편들이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 인식된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “작동가능하게 연결된”이라는 용어는 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받도록 된 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열들의 회합을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 코딩 서열 (예를 들어, ORF)의 발현에 영향을 줄 수 있을 때 (즉, 그 코딩 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있음) 그 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본원에서 정의되는 바와 같이, “적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 배치되고, 결부된 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱(processing) 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더(leader) 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터(effector) 결합 부위, 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다.
본원에서 정의되는 바와 같이, “적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임(ORF), 또는 이의 유전자 또는 이의 벡터를 “박테리아 세포 내로 도입하는”과 같은 어구에서 사용될 때 용어 “도입하는”은 원형질체 융합, 천연 또는 인공 형질전환 (예를 들어, 염화칼슘, 전기천공법), 형질도입, 트랜스펙션, 콘쥬게이션 등을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌, 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 본 기술 분야에 공지된 방법을 포함한다 (예를 들어, 문헌[Ferrari et al., 1989] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, “형질전환된” 또는 “형질전환”은 세포가 재조합 DNA 기술을 이용하여 형질전환되었음을 의미한다. 전형적으로 형질전환은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, ORF 또는 유전자)을 세포 내로 삽입함으로써 일어난다. 삽입되는 뉴클레오티드 서열은 이종 뉴클레오티드 서열 (즉, 형질전환될 세포에서는 천연 발생적이지 않은 서열)일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “형질전환”은 외인성 DNA를 그람 양성 숙주 세포 내로 도입하여서 상기 DNA가 염색체 통합체 또는 자가-복제성 염색체외 벡터로서 유지되게 하는 것을 나타낸다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 용어 “수용성”은 외인성 DNA가 바실루스 sp. 숙주 세포 내로 내재화되어서 형질전환 사건을 초래할 수 있는 천연적 생리학적 상태이다. 용어 “수용성”은 전기천공, 원형질, 열충격 및 CaCl2 처리를 포함하는 “인공 형질전환”과 다르다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 용어 “비-수용성”, “저조하게 형질전환가능한” 및 “낮은 형질전환성(transformability)”은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 여기서, 이러한 용어들은 DNA 1 마이크로그램(㎍)당 형질전환체의 수가, 비. 서브틸리스 또는 비. 리케니포르미스에서의 수용성-매개 형질전환 방법을 이용할 때 자연 돌연변이 빈도의 2배 미만임을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “ComK” 폴리펩티드는 수용성 발달 전에 최종 자기-조절형 제어 스위치로서 작용하는 전사 인자인 comK 유전자의 생성물로서 정의된다. ComK 폴리펩티드 (즉, 전사 인자)는 DNA-결합, 흡수 및 재조합에 연루된 후기 수용성 유전자의 발현의 활성화와 연관된다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 숙주 세포 “게놈”, 박테리아 (숙주) 세포 “게놈”, 또는 그람 양성 박테리아 (숙주) 세포 “게놈”은 염색체 유전자 및 염색체외 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “플라스미드”, “벡터” 및 “카세트”는 염색체외 요소를 나타내며, 이는 종종, 전형적으로 세포의 중추적인 대사의 일부가 아니고 대개 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태로 존재하는 유전자를 지닌다. 그러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래되는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의, 선형 또는 원형의, 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 여기서, 다수의 뉴클레오티드 서열은 선택된 유전자 생성물에 대한 DNA 서열 및 프로모터 단편을 적절한 3’ 비번역 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구축물로 연결되거나 재조합되었다.
"형질전환 카세트"는 외래 유전자를 포함하며 상기 외래 유전자에 더하여 특정한 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 요소를 갖는 특정 벡터를 나타낸다.
“발현 카세트”는 외래 유전자를 포함하며 상기 외래 유전자에 더하여 숙주 세포에서 상기 외래 (이종) 유전자의 “증가된” 발현을 허용하는 요소를 갖는 특정 벡터를 나타낸다.
많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 구매가능하며 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식 내에 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “벡터”는 핵산을 유기체들, 세포들 또는 세포 성분들 사이에서 전파하고/하거나 이전시킬 수 있는 임의의 수단이다. 벡터는 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스(pro-virus), 플라스미드, 파지미드(phagemid), 트랜스포존(transposon), 및 인공 염색체, 예컨대 YAC(효모 인공 염색체(yeast artificial chromosomes)), BAC(박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome)), 및 PLAC(식물 인공 염색체(plant artificial chromosomes)) 등 (이들은 “에피좀”으로서, 즉, 자율적으로 복제되거나 숙주 미생물의 염색체 내에 통합될 수 있음)을 포함한다.
“발현 벡터”는 이종 DNA를 외래 세포 내에 포함시켜 외래 세포에서 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 나타낸다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 구매가능하다.
“표적화 벡터”는 이것이 형질전환시키는 숙주 세포의 염색체 내의 영역에 상동성이고 그 영역에서 상동 재조합을 구동시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터이다. 표적화 벡터는 상동 재조합을 통하여 세포의 염색체 내에 돌연변이를 도입하는 데 있어서 그 용도가 발견된다. 일부 실시 양태에서, 표적화 벡터는 예를 들어 말단에 부가된 다른 비-상동성 서열(즉, 스터퍼(stuffer) 서열 또는 측면(flanking) 서열)을 포함한다. 말단들은 표적화 벡터가 예를 들어 벡터 내로의 삽입과 같이 폐쇄된 원을 형성하도록 폐쇄될 수 있다. 적절한 벡터(들)의 선택 및/또는 구축은 당업자의 지식 내에 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “플라스미드”는 클로닝 벡터로서 사용되는, 그리고 많은 박테리아 및 일부 진핵 생물에서 염색체외 자가-복제 유전 요소를 형성하는 원형 이중 가닥(ds) DNA 구축물을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 플라스미드는 숙주 세포의 게놈 내로 포함되게 된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “관심 대상의 단백질” 또는 “POI”는 변형 그람 양성 박테리아 세포 (예를 들어, “숙주” 세포)에서 발현시키기를 원하는 관심 대상의 폴리펩티드를 나타내며, 여기서, POI는 증가된 수준으로 (즉, 비변형된 (모) 그람 양성 박테리아 세포에 비해 증가된 수준으로) 발현된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, POI는 효소, 기질-결합 단백질, 표면-활성 단백질, 구조 단백질, 수용체 단백질 등일 수 있다.
이와 유사하게, 본원에서 정의되는 바와 같이, “관심 대상의 유전자(gene of interest)” 또는 “GOI”는 POI를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 오픈 리딩 프레임)을 나타낸다. “관심 대상의 단백질”을 코딩하는 “관심 대상의 유전자”는 천연 발생적인 유전자, 돌연변이된 유전자 또는 합성 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되며, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 임의의 길이의 중합체를 나타낸다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 또는 3문자 코드가 본원에서 사용된다. 폴리펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 이것은 비-아미노산이 개재될 수 있다.
폴리펩티드라는 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지(labeling) 성분과의 콘쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)뿐만 아니라 본 기술 분야에 공지된 다른 변형도 포함하는 폴리펩티드가 상기 정의 내에 또한 포함된다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명의 유전자는 관심 대상의 상업적으로 관련된 공업용 단백질, 예컨대 효소 (예를 들어, 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 언하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합)를 코딩한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, “내인성 유전자”는 유기체의 게놈 내의 그의 자연적인 위치의 유전자를 나타낸다.
본원에서 정의되는 바와 같이, “이종” 유전자, “비-내인성” 유전자 또는 “외래” 유전자는 숙주 유기체에서 정상적으로는 발견되지 않고, 유전자 전달(gene transfer)에 의해 숙주 유기체 내로 도입되는 유전자 (또는 ORF)를 나타낸다. 외래 (이종) 유전자는 비-천연 유기체 내로 삽입된 천연 유전자 (또는 ORF) 및/또는 천연 또는 비-천연 유기체 내로 삽입된 키메라 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “발현”은 본 발명의 핵산 분자로부터 유래된 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 나타낸다. 발현은 또한 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 나타낼 수 있다. 따라서, 용어 “발현”은 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 변형, 분비 등을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 폴리펩티드의 생성에 연루된 임의의 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “변이형” 폴리펩티드는, 전형적으로 재조합 DNA 기술에 의해 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가, 또는 결실에 의해 모 (또는 기준) 폴리펩티드로부터 유래되는 폴리펩티드를 나타낸다. 변이형 폴리펩티드들은 적은 수의 아미노산 잔기에 의해 모 폴리펩티드와는 상이할 수 있으며, 모 (기준) 폴리펩티드와의 일차 아미노산 서열 상동성/동일성 수준에 의해 정의될 수 있다.
바람직하게는, 변이형 폴리펩티드는 모 (기준) 폴리펩티드 서열과의 아미노산 서열 동일성이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “변이형” 폴리뉴클레오티드는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 나타내며, 여기서, “변이형 폴리뉴클레오티드”는 모 폴리뉴클레오티드와의 특정한 정도의 서열 상동성/동일성을 갖거나, 엄격한 혼성화 조건 하에 모 폴리뉴클레오티드 (또는 이의 상보체)와 혼성화된다. 바람직하게는, 변이형 폴리뉴클레오티드는 모 (기준) 폴리뉴클레오티드 서열과의 뉴클레오티드 서열 동일성이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이"는 핵산 서열에서의 임의의 변화 또는 변경을 나타낸다. 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 침묵(silent) 돌연변이, 프레임 이동 돌연변이, 스플라이싱 돌연변이 등을 포함하는 몇몇 유형의 돌연변이가 존재한다. 돌연변이는 특이적으로 (예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발을 통하여) 또는 무작위로 (예를 들어, 화학 에이전트, 복구 결핍된 박테리아 주를 통한 계대를 통하여) 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 또는 이의 서열의 맥락에서, 용어 “치환”은 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것 (즉, 치환하는 것)을 의미한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, “이종” 핵산 구축물 또는 “이종” 핵산 서열은 그 서열이 발현되는 세포에 대하여 천연적인 것이 아닌 일부분의 서열을 갖는다.
본원에서 정의되는 바와 같이, “이종성 제어 서열”은 자연에서는 관심 대상의 유전자의 발현을 조절하는 (제어하는) 기능을 하지 않는 유전자 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)을 나타낸다. 일반적으로, 이종성 핵산 서열은 이들이 존재하는 세포 또는 게놈의 일부에 대하여 내인성이 아니며 (천연이 아니며), 감염, 트랜스펙션, 형질전환, 미세주입, 전기천공 등에 의해 세포에 부가되었다. "이종성" 핵산 구축물은 천연 숙주 세포에서 발견되는 제어 서열/DNA 코딩 서열 조합과 동일하거나 이와는 상이한 제어 서열/DNA 코딩 (ORF) 서열 조합을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "신호 서열" 및 "신호 펩티드"는 성숙 단백질 또는 전구체 형태의 단백질의 분비에 참여하거나 이의 수송을 지시할 수 있는 아미노산 잔기의 서열을 나타낸다. 신호 서열은 전구체 또는 성숙 단백질 서열에 대해 전형적으로 N-말단에 위치한다. 신호 서열은 내인성 또는 외인성일 수 있다. 신호 서열은 보통 성숙 단백질에 부재한다. 신호 서열은 전형적으로 단백질이 수송된 후 신호 펩티다아제에 의해 단백질로부터 절단된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “모” 세포는 “모” 세포의 게놈이 변형된 “딸” 세포를 생성하도록 변형된 (예를 들어, 하나 이상의 돌연변이가 모 세포 내로 도입됨) 미생물의 임의의 세포 또는 주를 나타낸다.
용어 “유래된”은 용어 "기인된", "수득된", "수득가능한" 및 "생성된"을 포함하며, 일반적으로 하나의 특정된 물질 또는 조성물이 또 다른 특정된 물질 또는 조성물에서 이의 기원을 찾거나 또 다른 특정된 물질 또는 조성물과 관련하여 기술될 수 있는 특징을 가짐을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질 생성을 “증가시키는”이란 증가된 양의 단백질이 생성됨을 의미한다. 단백질은 숙주 세포 내에서 생성되거나, 또는 배양 배지 내로 분비될 (또는 수송될) 수 있다. 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 배양 배지 내로 생성된다.
증가된 단백질 생성은 예를 들어, 모 숙주와 비교하여 더 높은 최대 수준의 단백질 또는 효소 활성, 예컨대 프로테아제 활성, 아밀라아제 활성, 셀룰라아제 활성, 헤미셀룰라아제 활성 등, 또는 생성된 전체 세포외 단백질로서 탐지될 수 있다. 본원에서 정의되는 바와 같이, 박테리아 RNAP “코어 효소”는 각각 2:1:1의 비의 α (알파), β (베타), 및 β′ (베타′) 서브유닛으로 이루어진다. RNAP α (알파), β (베타), 및 β′ (베타′) 서브유닛 폴리펩티드는 각각 rpoA , rpoB , 및 rpoC 유전자에 의해 코딩된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “β-서브유닛” 또는 “β-서브유닛 폴리펩티드”는 rpoB 유전자에 의해 코딩된 RpoB 폴리펩티드를 의미하며; 용어 “β′-서브유닛” 또는 “β′-서브유닛 폴리펩티드”는 rpoC 유전자에 의해 코딩된 RpoC 폴리펩티드를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “β′-서브유닛 패밀리 구성원”은 상기 2:1:1의 비의 3개의 서브유닛 α, β, 및 β'으로 구성된 임의의 원핵 RNAP를 나타내며, 여기서, β′-서브유닛의 아미노산 서열은 사십 개(40개) 아미노산 연접 서열을 포함하는데, 상기 연접 서열은 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 위치 461로부터 500까지의 RpoC (β'-서브유닛) 단백질의 서열에 맞추어 정렬되어 적어도 75%의 상동성을 생성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “등가의 위치”는 서열 번호 6, 또는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 461로부터 500까지의 RpoC (β'-서브유닛) 폴리펩티드 서열에 맞추어 정렬한 후의 아미노산 잔기 위치를 의미한다. 서열 번호 6 (즉, 서열 번호 6의 잔기 461 내지 500) 및 서열 번호 8 (즉, 서열 번호 8의 잔기 461 내지 500)에 대하여 상기에 설명된 사십 개(40개)의 연접 아미노산 잔기 (즉, 등가의 위치)가 서열 번호 38의 아미노산 잔기로 제시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “상동성”은 상동 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련된다. 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 둘 이상의 폴리펩티드가 상동성일 경우, 이것은 상동 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 98%의 “동일성 정도”를 가짐을 의미한다. 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 본원에서 정의된 바와 같이 상동성이기에 충분히 높은 정도의 동일성을 갖는지는 본 기술 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 GCG 프로그램 패키지 (위스콘신 패키지용 프로그램 매뉴얼(Program Manual for the Wisconsin Package), 버전 8, 1994년 8월, 미국 53711 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))에 제공된 “GAP”를 이용하여 상기 두 서열을 정렬함으로써 적합하게 조사될 수 있다 (문헌[Needleman and Wunsch, (1970)]). DNA 서열 비교를 위하여 하기 설정을 갖는 GAP를 사용한다: 5.0의 GAP 생성 페널티 및 0.3의 GAP 연장 페널티.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “동일성 퍼센트 (%)”는, 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬될 때, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열들 또는 그 폴리펩티드의 아미노산 서열들 사이의 핵산 또는 아미노산 서열 동일성의 수준을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비생산성(specific productivity)"은 주어진 기간에 걸쳐 시간당 세포당 생산된 단백질의 총량이다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 용어 “정제된”, “단리된” 또는 “풍부화된”은 생체분자 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)가 자연에서 이것이 결부되어 있는 천연 발생 구성 성분의 일부 또는 이들 전부로부터 이를 분리함에 의해 그의 자연 상태로부터 변경됨을 의미한다. 그러한 단리 또는 정제는 최종 조성물에서 요망되지 않는 전 세포, 세포 잔사, 불순물, 외부 단백질 또는 효소를 제거하기 위한 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 분리, 투석, 프로테아제 처리, 황산암모늄 침전 또는 기타 단백질 염 침전, 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 여과, 미세여과, 겔 전기영동 또는 구배에서의 분리와 같은 본 기술 분야에서 인정된 분리 기술에 의해 성취될 수 있다. 그 후 추가 이득을 제공하는 구성 성분, 예를 들어 활성화제, 항-저해제, 바람직한 이온, pH를 제어하기 위한 화합물 또는 기타 효소 또는 화학물질을 정제되거나 단리된 생체분자 조성물에 첨가하는 것이 추가로 가능하다.
II. RNA - 폴리머라아제
상기에 간략하게 진술된 바와 같이, 모든 세포 유기체에서의 전사는, 주형 DNA를 안는 보존된 게 집게발-유사 형상(crab claw-like shape)을 갖는, 다중-서브유닛, DNA-의존성 RNA-폴리머라아제 (RNAP)에 의해 구동된다 (문헌[Cramer, 2002] 참조). RNAP 코어 효소는 각각 rpoA , rpoB , 및 rpoC 유전자에 의해 개별적으로 코딩되는, 2:1:1의 비의 α (알파), β (베타), 및 β′ (베타 프라임) 서브유닛으로 구성된다. 홀로효소(holoenzyme)는 대개 시그마 및 오메가 서브유닛을 포함한다. 시그마 서브유닛은 프로모터의 인식 및 결합에 책임이 있다.
그람 양성 박테리아는 약 프로모터(weak promoter) 부위에서의 RNAP 결합을 차단함으로써 전사 특이성을 향상시키는 것으로 보고된 추가 δ (델타) 서브유닛을 갖는다 (문헌[Juang & Helmann, 1994]; 문헌[Lopez de Saro et al., 1995]). 홀로효소 RNAP는 전사 시작 부위 근처에서 DNA를 용융시킴으로써 개방 복합체를 형성하며, 그 후 RNA를 합성하기 시작한다. 시그마 인자가 방출되며, 코어 효소는 mRNA의 합성을 완료한다 (문헌[Borukhov & Severinov, 2002]; 문헌[de Haseth & Helmann, 1995]). 코어 RNAP는 박테리아 종으로부터 인간까지의 범위에 걸쳐, 서열 및 구조 면에서, 특히 큰 서브유닛 (즉, 박테리아 β 및 β′ 서브유닛) 동족체들간에 고도로 보존되어 있다 (문헌[Lane & Darst, 2010]). β′ 조(jaw), β′ 클램프(clamp), β 로브(lobe), 및 β 플랩(flap)으로 공지된 4개의 구조적으로 보존된 모듈은 RNAP 및 DNA의 적당한 적응(accommodation)에 있어서 결정적인 역할을 한다 (문헌[Chakraborty et al., 2012]).
III. 박테리아 (숙주) 세포 및 사용 방법
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 관심 대상의, 증가된 양의 하나 이상의 단백질(들)을 생성하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 특정한 실시 양태는 POI를 발현하는 비변형 (모) 그람 양성 박테리아 세포에 비하여 증가된 양의 상기 POI를 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이며, 여기서, 변형 박테리아 세포는 변이형 RNA-폴리머라아제 (RNAP) β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 프로모터 영역이 변이형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것을 포함하는 발현 구축물을 숙주 세포 내로 도입함으로써 수용성으로 만들어진 그람 양성 박테리아 숙주 세포에 관한 것이다.
따라서, 특정 실시 양태에서, 본 발명은 변형된 (딸) 세포가 증가된 수준의 관심 대상 단백질을 생성하도록 박테리아 세포를 변형시키는 방법에 관한 것이다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 본 발명의 변형된 (변이형) 박테리아 세포를 발효시킴으로써 생성된 관심 대상의 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 다른 실시 양태는 그렇게 만들어진 관심 대상의 하나 이상의 단백질을 포함하는 하나 이상의 단백질성 조성물에 관한 것이다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 변형된 (돌연변이) 박테리아 세포를 이용한 관심 대상의 하나 이상의 단백질(들)의 생성 방법과, 관심 대상의 하나 이상의 단백질(들)을 포함하는 하나 이상의 단백질성 조성물의 생성 및 사용 방법에 관한 것이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 비변형된 (모) 세포와 비교하여 (상기 세포에 대하여), 증가된 수준의 관심 대상의 하나 이상의 단백질(들)을 생성하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이며, 여기서, 상기 하나 이상의 변형된 세포는 rpoC 유전자에 의해 코딩되는 RNAP (서브유닛)의 β′-서브유닛에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특정한 다른 실시 양태에서, 본 발명은 비변형된 (모) 세포와 비교하여 (상기 세포에 대하여), 증가된 수준의 관심 대상의 하나 이상의 단백질(들)을 생성하는 변형된 박테리아 세포를 제공하며, 여기서, 변형된 세포는 (a) rpoC 유전자에 의해 코딩되는 RNAP의 β′-서브유닛에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 (b) rpoB 유전자에 의해 코딩되는 RNAP (서브유닛)의 β-서브유닛에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
IV. RNAP의 RpoC (β′-서브유닛)에서의 돌연변이를 포함하는 변형된 (숙주) 세포
일부 실시 양태에서, RNAP의 β′-서브유닛에서의 상기 적어도 하나의 돌연변이는 임의의 유형의 돌연변이일 수 있으며, 단일 돌연변이일 수 있거나, 또는 예를 들어, 대체들, 삽입들, 결실들, 전자들, 종결들 (도입된 정지 코돈들), 점 돌연변이들 등을 포함하는 다수의 돌연변이의 세트일 수 있다.
돌연변이는 단일 뉴클레오티드 염기를 동일 위치에서 상이한 뉴클레오티드 염기로 치환하는 것인 단일 염기쌍 치환일 수 있으며, 이때 DNA의 다른 가닥 상에서의 상보성 염기가 이에 상응하여 치환된다. 단일 염기쌍 치환은 구상가능하며, 실제로 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 돌연변이는 단백질 코딩 영역 내에서 또는 rRAN 또는 tRNA를 코딩하는 영역 내에서 나타날 수 있다.
본 발명의 돌연변이는 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발, 합성 유전자 구축, 반합성 유전자 구축, 무작위 돌연변이 유발, 셔플링(shuffling) 등을 포함하는, 본 기술 분야에 공지된 임의의 돌연변이 유발 절차를 이용하여 준비될 수 있다.
부위 지정 돌연변이 유발은 당해 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에서의 하나 이상의 정의된 부위에 하나 이상의 (예를 들어, 몇몇의) 돌연변이가 도입되는 기술이다. 부위 지정 돌연변이 유발은 원하는 돌연변이를 포함하는 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 시험관 내에서 성취될 수 있다. 또한 부위 지정 돌연변이 유발은, 먼저 당해 유전자를 코딩하는 플라스미드에서의 지정된 부위에서의 제한 효소에 의한 절단, 및 그 후 원하는 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드 단편을 절단 부위에서 라이게이션하는 것을 포함하는 카세트 돌연변이 유발에 의해 시험관 내에서 수행될 수 있다. 전형적인 실시 양태에서, 동일 제한 효소를 이용하여 지정된 부위에서 플라스미드를 소화시키거나 절단하고 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드 단편을 제조함으로써 플라스미드 및 상기 단편의 스티키 말단들(sticky ends)이 서로 라이게이션되게 한다 (예를 들어, 문헌[Scherer and Davis, 1979] 및 문헌[Barton et al., 1990] 참조).
또한 부위 지정 돌연변이 유발은 본 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 생체 내에서 성취될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0171154호; 문헌[Storici et al., 2001]; 문헌[Kren et al., 1998] 및 문헌[Calissano and Macino, 1996]을 참조한다. 어떠한 부위 지정 돌연변이 유발 절차도 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다. 그 목적을 위해, 변이체의 제조에 사용될 수 있는 입수가능한 다수의 상업적 키트가 있다.
무작위 돌연변이 유발은 많은 공지된 수단을 통하여 성취될 수 있다. 그러한 잘 알려진 방법들 중 하나로는 특히 2-아미노퓨린 (2AP), N-메틸-N′-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG), 또는 에틸 메탄 술포네이트 (EMS)와 같은 돌연변이 유발 시약(mutagenizing reagent)의 존재 하에서의 파생(outgrowth)에 의한 화학적 돌연변이가 있다. 본원에서 적합한 대로의, 그리고 본 기술 분야에 공지된 화학적 돌연변이 유발 방법에 대한 상세한 논의는 문헌[Miller (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. 1992)]에서 발견될 수 있다.
또한 돌연변이 유발은 문헌[Selifonova et al., 2001]에 기술된 바와 같이 플라스미드에서 mutD5와 같은 돌연변이 유발 유전자를 발현시킴으로써 성취될 수 있다.
세포 게놈은 트랜스포존(transposon) 돌연변이 유발, 게놈 셔플링, 플라스미드로부터의 유전자의 과발현, 또는 기타 세포 엔지니어링 기술을 통하여 조작될 수 있다 (문헌[Kleckner et al., 1991]; 문헌[Patnaik, 2008]). 또한 돌연변이 세포는 미국 특허 제6,361,966호의 방법에서와 같이, 단순히 세포를 과다성장시키고 복제 오류가 자연적으로 발생하게 함으로써 생성될 수 있다.
점점 더 개선된 돌연변이체를 수득하기 위하여 둘 (2) 이상의 라운드의 돌연변이 유발이 적합하게 수행될 수 있으며, 각각의 라운드 동안, 동일하거나 상이한 돌연변이 유발 방법이 이용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, rpoC 유전자에 의해 코딩되는 RNAP의 β′-서브유닛은 바실루스 β′-서브유닛의 천연 발생 변이체이며, 이는 서열 번호 6, 또는 서열 번호 8의 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
특정한 실시 양태에서, RNAP의 β′-서브유닛은 상이한 박테리아 세포로부터 수득되며, 서열 번호 6, 또는 서열 번호 8의 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
V. 증가된 수준의 관심 대상의 단백질을 생성하는 변형된 (숙주) 세포
변형 그람 양성 박테리아 세포가 증가된 수준의 POI를 생성함을 확인하기 위하여, 다양한 스크리닝 방법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 표적 단백질에의 폴리펩티드 융합물을 코딩할 수 있으며, 검출가능한 표지체로서의 역할을 하거나, 또는 대안적으로, 표적 단백질 그 자체가 선발가능 또는 스크리닝가능 마커로서의 역할을 할 수 있다. 표지된 단백질은 또한 웨스턴 블로팅(Western blotting), 도트 블로팅(dot blotting) (그러한 방법의 상세한 설명은 콜드 스프링 하버 프로토콜즈(Cold Spring Harbor Protocols)의 웹사이트에서 입수가능함), ELISA, 또는, 표지체가 GFP일 경우, 전 세포 형광(whole cell fluorescence) 또는 FACS를 이용하여 검출될 수 있다.
예를 들어, 6-히스티딘 태그를 포함시켜 표적 단백질에의 융합물을 만들 수 있고, 웨스턴 블롯을 이용하여 그러한 태그를 탐지할 수 있다. 게다가, 표적 단백질이 충분히 높은 수준으로 발현될 경우, 쿠마시(Coomassie)/은 염색과 조합된 SDS-PAGE를 수행하여 야생형에 대비한 돌연변이체 발현의 증가를 적당하게 탐지할 수 있으며; 그러한 경우에, 분자의 표지는 전혀 필요하지 않다.
다른 실시 양태에서, 비변형된 (모) 세포에 대한 변형된 (숙주) 세포에서의 POI의 발현을 mRNA 전사체 수준과 상관시킨다. 예를 들어, 특정한 실시 양태는 POI를 코딩하는 유전자 또는 ORF의 분자적 특성화에 관한 것이며, 이는 대개 RNA 발현의 시간적인 그리고 공간적인 분포의 철저한 분석을 포함한다. 다수의 널리 사용되는 절차가 존재하고 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 이는 전체 또는 폴리(A) RNA 샘플에서의 특정 mRNA의 풍부도의 탐지 및 결정을 위한 것이다. 비제한적 예는 노던 블롯(Northern blot) 분석, 뉴클레아제 보호 분석법(nuclease protection assay; NPA), 원위치 혼성화, 및 역전사-폴리머라아제 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)과 같은 방법을 포함한다.
세포당 단백질의 활성 또는 양, 배지 1 밀리리터당 단백질의 활성 또는 양의 증가의 탐지 (배양 또는 발효가 더 오랜 기간 동안 효율적으로 계속되도록 함)를 비롯한, 또는 이러한 방법들의 조합을 통한 기타 방법들이 향상된 수준의 관심 대상의 단백질을 확인하기 위해 이용될 수 있다.
비생산성의 탐지는 단백질 생성의 평가에 적합한 또 다른 방법이다. 비생산성(Qp)은 다음 식을 이용하여 결정될수 있다:
Figure pct00001
여기서, "gP"는 탱크에서 생산된 단백질의 그램이고, "gDCW"는 탱크 내 건조 세포 중량(DCW)의 그램이고, "hr"은 접종 시점으로부터의 발효 시간 (h)으로서, 이는 생산 시간 및 성장 시간을 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명의 변형된 박테리아 세포는 그의 비변형 (모) 세포와 비교하여 적어도 대략, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%의 또는 이보다 더 많은 POI를 생성한다.
VI. 변형된 RpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해 수용성으로 만들어진 변형된 (숙주) 세포
본 발명의 특정한 실시 양태는 비-수용성 그람 양성 숙주 세포에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명의 특정한 실시 양태는 프로모터가 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것을 포함하는 핵산 구축물의 도입에 의해 수용성으로 만들어지는 비-수용성 그람 양성 숙주 세포 (예를 들어, 바실루스 sp. 숙주 세포)에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, “도입된” 핵산 구축물에 의해 수용성으로 만들어지는 비-수용성 숙주 세포(들)로는 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 소노렌시스, 비. 할로두란스, 비. 푸밀루스, 비. 라우투스, 비. 파불리, 비. 세레우스, 비. 아가라드하에렌스, 비. 아키바이, 비. 클라르키이, 비. 슈도피르무스, 비. 레헨시스, 비. 메가테륨, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 깁소니이, 및 비. 튜린기엔시스로부터 선택되는 바실루스 세포가 있다.
예를 들어, 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 형질전환된 바실루스 숙주 세포의 수득 방법에 관한 것이며, 이는 (a) 프로모터 영역 5’을 포함하며 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피에 의해 수용성으로 만들어지는 바실루스 숙주 세포를 외인성 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 단계 (여기서, 변형 rpoC 폴리펩티드는 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하며, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 핵산 구축물의 도입 전에는 비-수용성었던 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및 (b) 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바실루스 숙주 세포의 형질전환체를 단리하는 단계를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 상기에 개시된 수용성 바실루스 숙주 세포는 프로모터 영역 5’을 포함하고 숙주 세포가 더욱 더 수용성이 되게 만들기 위한 ComK 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제2 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, ComK 폴리펩티드는 서열 번호 35, 또는 서열 번호 37의 ComK 폴리펩티드에 대하여 적어도 75%, 80%, 90%, 95%의 서열 동일성을 포함한다. 하나의 특정 실시 양태에서, 숙주 세포는 바실루스 리케니포르미스이다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 그러한 방법으로부터 수득되는 형질전환된 바실루스 숙주 세포를 제공한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 수용성 바실루스 숙주 세포의 수득 방법에 관한 것이며, 이는 (a) 프로모터 영역 5’을 포함하며 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 비-수용성 바실루스 숙주 세포 내로 도입하는 단계 (여기서, 변형 rpoC 폴리펩티드는 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하며, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및 (b) 단계 (a)의 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 수용성 바실루스 숙주 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 특정한 다른 실시 양태에서, 수용성 바실루스 숙주 세포는 프로모터 영역 5’을 포함하고 ComK 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제2 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 추가로 포함한다. 특정한 실시 양태에서, ComK 폴리펩티드는 서열 번호 35, 또는 서열 번호 37의 ComK 폴리펩티드에 대하여 약 75% 내지 100%의 서열 동일성을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 숙주 세포는 바실루스 리케니포르미스이다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 그러한 방법으로부터 수득되는 수용성 바실루스 숙주 세포(들)에 관한 것이다.
특정한 다른 실시 양태에서, 본 발명은 프로모터 영역 5'을 포함하며 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하는 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 포함하는 수용성 바실루스 숙주 세포를 제공하며, 여기서, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 핵산 구축물의 도입 전에는 비-수용성이었던 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드이다.
VII. 박테리아 세포
특정한 실시 양태에서, 본 발명의 변형된 박테리아 세포는 바실라세아에 패밀리의 구성원이다. 다른 실시 양태에서, 본 발명의 변형된 박테리아 세포는 바실루스 속의 구성원이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명의 변형된 박테리아 세포는 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 소노렌시스, 비. 할로두란스, 비. 푸밀루스, 비. 라우투스, 비. 파불리, 비. 세레우스, 비. 아가라드하에렌스, 비. 아키바이, 비. 클라르키이, 비. 슈도피르무스, 비. 레헨시스, 비. 메가테륨, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 깁소니이, 및 비. 튜린기엔시스로부터 선택되는 바실루스 세포이다. 다른 실시 양태에서, 바실루스 세포는 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 리케니포르미스이다.
본 기술 분야에서 바실루스 속은 분류학적 재편성을 계속 겪고 있음이 인정된다. 따라서, 상기 속은 현재 “지오바실루스 스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus)”로 명명된 비. 스테아로서모필루스, 또는 현재 “파에니바실루스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)인 비. 폴리믹사와 같은 유기체를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌, 재분류된 종을 포함하는 것으로 의도된다.
VIII. 관심 대상의 단백질의 생성을 위한 변형된 세포의 배양
다른 실시 양태에서, 본 발명은 비변형된 (모) 세포와 비교하여 (즉, 상기 세포에 관하여) 변형된 박테리아 세포의 단백질 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다. 더 구체적으로, 특정한 실시 양태에서, 변형된 박테리아 세포의 단백질 생산성을 증가시키는 방법은 변형된 박테리아 세포를 적합한 발효 조건 하에 배양하는 단계를 포함하며, 여기서, 변형된 세포는 rpoC 유전자에 의해 코딩되는 RNAP의 β′-서브유닛에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
따라서, 숙주 세포 및 형질전환된 세포는 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 형질전환된 숙주 세포용 배양 배지는 프로모터의 활성화 및 형질전환체의 선발을 위하여 적절할 경우 변형될 수 있다. 특정 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현에 대하여 선발되는 숙주 세포에 이용되는 것일 수 있으며, 이는 당업자에게 명백하다. 게다가, 배양 조건은 과학 문헌, 예컨대 문헌[Sambrook (1982; 2001), Harwood et al. (1990)] 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC)에서 발견될 수 있다.
IX. 형질전환
POI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물은 숙주 세포에 의해 발현되도록 구축될 수 있다. 공지된 유전자 코드 축퇴성 때문에, 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상이한 폴리뉴클레오티드들이 본 기술 분야에서의 일상적인 기술을 이용하여 설계되고 만들어질 수 있다. 예를 들어, 코돈 최적화가 특정 숙주 세포에서의 생성을 최적화하기 위하여 적용될 수 있다.
관심 대상의 단백질을 코딩하는 핵산이 벡터 내로 포함될 수 있으며, 여기서, 벡터는 잘 알려진 형질전환 기술, 예컨대 본원에 개시된 것을 이용하여 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 마찬가지로, 특정한 실시 양태에서, 프로모터 영역이 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것을 포함하는 핵산 구축물이 벡터 내로 포함될 수 있으며, 여기서, 벡터는 잘 알려진 형질전환 기술을 이용하여 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 프로모터 영역이 ComK 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것을 포함하는 핵산 구축물이 벡터 내로 포함될 수 있으며, 여기서, 벡터는 잘 알려진 형질전환 기술을 이용하여 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
벡터는 숙주 세포 (예를 들어, 바실루스 sp. 숙주 세포)를 형질전환시켜 숙주 세포 내에서 복제될 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 예를 들어, POI를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 상기 벡터의 증식(propagating) 및 증폭의 수단으로서의 박테리아 숙주 세포를 형질전환시켜 상기 숙주 세포에서 복제될 수 있다. 상기 벡터는 또한 발현 숙주를 형질전환시킬 수도 있어서, 단백질 코딩 핵산 (즉, ORF)이 기능성 단백질로서 발현될 수 있게 한다. 발현 숙주로서의 역할을 하는 박테리아 세포 (즉, 변형된 박테리아 “숙주” 세포)는 바실라세아에 패밀리의 구성원 및 바실루스 속의 구성원을 포함한다.
POI를 코딩하는 핵산을 포함하고 발현하도록 일상적인 기술로 변형될 수 있는 대표적인 벡터로는 벡터 p2JM103BBI가 있다 (문헌[Vogtentanz, 2007] 참조).
POI를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는데, 이는 숙주 세포에서의 전사를 허용한다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 핵산 서열일 수 있으며, 숙주 세포에 대하여 동종성이거나 이종성인 단백질 코딩 유전자로부터 유래될 수 있다.
POI를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를, 특히 박테리아 숙주에서 지시하기에 적합한 프로모터의 예는 이. 콜라이의 lac 오페론의 프로모터, 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) 아가라아제 유전자 dagA 또는 celA 프로모터, 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라아제 유전자 (amyL)의 프로모터, 바실루스 스테아로서모필루스 말토게닉 아밀라아제 유전자 (amyM)의 프로모터, 바실루스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라아제 (amyQ)의 프로모터, 바실루스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자의 프로모터 등을 포함한다.
특정한 실시 양태에서, POI를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 지시하는 프로모터는 야생형 aprE 프로모터, 돌연변이 aprE 프로모터 또는 콘센서스(consensus) aprE 프로모터 (국제 공개 제2001/51643호에 개시됨)이다.
다른 실시 양태에서, POI를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 지시하는 프로모터는 리보솜 프로모터, 예컨대 리보솜 RNA 프로모터 또는 리보솜 단백질 프로모터이다. 더 구체적으로, 특정한 실시 양태에서, 리보솜 RNA 프로모터는 비. 서브틸리스로부터 유래된 rrn 프로모터이며, 더 구체적으로, rrn 프로모터는 비. 서브틸리스 유래의 rrnB, rrnI 또는 rrnE 리보솜 프로모터이다. 특정한 실시 양태에서, 리보솜 RNA 프로모터는 국제 공개 제2013/086219호에 개시된 비. 서브틸리스 유래의 P2 rrnI 프로모터이다.
POI 코딩 서열은 신호 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열은 발현될 GOI (POI를 코딩함)와 천연적으로 결부된 DNA 서열일 수 있거나, 상이한 속 또는 종 유래의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 구축물 또는 벡터에 포함되는 신호 서열 및 프로모터 서열은 박테리아 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 상기 서열들은 동일한 공급원 또는 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 특정한 실시 양태에서, 신호 서열은 국제 공개 제2001/51643호에 개시된 arpE 프로모터에 작동가능하게 연결된 arpE 신호 서열 (예를 들어, 문헌[Vogtentanz et al., 2007]; 문헌[Wang et al., 1988] 참조)이다.
발현 벡터는 또한 적합한 전사 종결자 및 진핵 생물에서, 특정한 폴리아데닐화 서열이 관심 대상의 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 것을 포함할 수 있다. 종결 및 폴리아데닐화 서열은 프로모터와 동일한 공급원으로부터 적합하게 유래될 수 있지만, 다른 실시 양태에서, 종결 및 폴리아데닐화 서열은 서로 상이한 공급원 및/또는 프로모터와는 상이한 공급원으로부터 잘 유래될 수 있다.
적합한 벡터는 벡터가 숙주 세포에서 복제되는 것을 가능하게 하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 가능하게 하는 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, pIJ702 등의 복제 원점을 포함한다.
적합한 벡터는 또한 선발가능 마커, 예를 들어, 유전자 생성물이 단리 숙주 세포에서의 결함을 보완하는 유전자, 예컨대 비. 서브틸리스 또는 비. 리케니포르미스 유래의 dal 유전자, 또는 항생제 내성, 예를 들어 암피실린 내성, 카나마이신 내성, 클로람페니콜 내성, 테트라사이클린 내성 등을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다.
적합한 발현 벡터는 전형적으로 클로닝 벡터의 구성 요소, 예를 들어, 선택된 숙주 유기체에서의 벡터의 자율 복제를 가능케 하는 요소, 및 선발 목적을 위한, 표현형에 의해 검출가능한 하나 이상의 마커를 포함한다. 전형적으로 발현 벡터는 또한 제어 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호 및 선택적으로, 리프레서 유전자, 하나 이상의 활성화 유전자(activator gene) 서열 등을 포함한다.
부가적으로, 적합한 발현 벡터는 관심 대상의 단백질을 숙주 세포 소기관, 예컨대 퍼옥시좀으로, 또는 특정 숙주 세포 구획으로 표적화할 수 있는 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 표적화 서열은 예를 들어 아미노산 서열 “SKL”일 수 있다. 제어 서열의 지시 하의 발현을 위하여, 관심 대상의 단백질의 핵산 서열은 발현이 일어나도록 하는 적합한 방식으로 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
관심 대상의 단백질을 코딩하는 DNA 구축물, 프로모터, 종결자 및/또는 기타 요소를 라이게이션하고, 이들을 복제에 필요한 정보를 포함하는 적합한 벡터 내에 삽입하는 데 사용되는, 본원에 개시된 것과 같은 프로토콜은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989, and 3rd edition 2001] 참조).
폴리뉴클레오티드 구축물 또는 발현 벡터 중 어느 하나를 포함하는 단리된 세포는 POI의 재조합적 생성에서 숙주 세포로서 유리하게 사용된다. 상기 세포는 편리하게는 POI를 코딩하는 DNA 구축물 (하나 이상의 카피)을 숙주 염색체 내로 통합시킴으로써 상기 구축물로 형질전환될 수 있다. 일반적으로 통합은 강점으로 여겨지며, 그 이유는 그렇게 도입된 DNA 서열이 세포 내에서 안정하게 유지될 가능성이 더 크기 때문이다. DNA 구축물의 숙주 염색체 내로의 통합은 통상적인 방법을 적용하여, 예를 들어 상동 재조합 또는 이종 재조합에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 세포는 상이한 유형의 숙주 세포들과 관련하여 상기에 설명한 바와 같은 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 발현 숙주로부터 유전자를 결실시키는 것이 유리하며, 여기서 유전자 결핍은 발현 벡터에 의해 큐어링될(cured) 수 있다. 공지된 방법을 이용하여 하나 이상의 불활성화 유전자를 갖는 박테리아 숙주 세포를 수득할 수 있다. 유전자 불활성화는, 유전자가 기능성 단백질을 발현하는 것이 방지되도록, 완전 또는 부분 결실에 의해, 삽입에 의한 불활성화에 의해, 또는 유전자가 그의 의도된 목적에 대하여 비기능성이 되게 하는 임의의 다른 수단에 의해 성취될 수 있다.
박테리아의 형질전환 기술 및 박테리아의 배양 기술은 표준으로서, 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 상기 기술은 관심 대상의 재조합 단백질의 생성을 위하여 본 발명의 개선된 숙주를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. DNA 구축물 또는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 형질전환; 전기천공법; 핵 미세주입법; 형질도입; 트랜스펙션, 예를 들어, 리포펙션 매개 및 DEAE-덱스트린 매개된 트랜스펙션; 인산칼슘을 이용한 인큐베이션에 의한 DNA 침전; DNA-코팅된 미세발사체(microprojectile)를 이용한 고속 충격(bombardment); 유전자 총 또는 바이오리스틱 형질전환(biolistic transformation) 및 원형질 융합 등과 같은 기술을 포함한다. 박테리아의 형질전환 및 발현 방법은 또한 문헌[Brigidi et al. (1990)]에 개시되어 있다. 프로테아제 결실된 바실루스 주에 바람직한 일반 형질전환 및 발현 프로토콜이 페라리(Ferrari) 등의 미국 특허 제5,264,366호에 제공되어 있다.
상기에 간략하게 진술된 바와 같이, 본 발명의 특정한 실시 양태는 형질전환된 바실루스 숙주 세포의 수득 방법에 관한 것이며, 이는 (a) 프로모터 영역 5’을 포함하며 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피에 의해 수용성으로 만들어지는 바실루스 숙주 세포를 외인성 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 단계 (여기서, 변형 rpoC 폴리펩티드는 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하며, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 핵산 구축물의 도입 전에는 비-수용성었던 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및 (b) 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바실루스 숙주 세포의 형질전환체를 단리하는 단계를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 수용성 바실루스 숙주 세포는 프로모터 영역 5’을 포함하고 숙주 세포가 더욱 더 수용성이 되게 만들기 위한 ComK 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제2 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 추가로 포함한다. 특정한 실시 양태에서 ComK 폴리펩티드는 서열 번호 35, 또는 서열 번호 37의 ComK 폴리펩티드에 대하여 약 75% 내지 100%의 서열 동일성을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 그러한 방법에 의해 수득되는 형질전환된 바실루스 숙주 세포에 관한 것이다.
특정한 다른 실시 양태에서, 본 발명은 수용성 바실루스 숙주 세포의 수득 방법을 제공하며, 이는 (a) 프로모터 영역 5’을 포함하며 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 "비-수용성" 바실루스 숙주 세포 내로 도입하는 단계 (여기서, 변형 rpoC 폴리펩티드는 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하며, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및 (b) 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 수용성 바실루스 숙주 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 수용성 바실루스 숙주 세포는 프로모터 영역 5’을 포함하고 ComK 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제2 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 추가로 포함한다. 특정한 실시 양태에서, ComK 폴리펩티드는 서열 번호 35, 또는 서열 번호 37의 ComK 폴리펩티드에 대하여 약 75% 내지 100%의 서열 동일성을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 바실루스 숙주 세포는 바실루스 리케니포르미스이다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 그러한 방법으로부터 수득되는 수용성 바실루스 숙주 세포에 관한 것이다.
예를 들어, 하기 실시예 9에 개시된 바와 같이, 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성을 포함하고 위치 796에서 아스파르트산의 글리신으로의 치환 (즉, 서열 번호 8에 관하여 D796G 치환)을 포함하는 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 영역을 포함하는 도입 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피를 포함하는 본 발명의 변형된 바실루스 숙주 세포는 수득된 형질전환체의 수의 유의한 증가를 보여준다 (즉, 도입 제1 핵산 구축물을 포함하지 않는 모 (대조) 바실루스 숙주 세포에 관하여). 따라서, 특정한 실시 양태에서, 도입 제1 핵산 구축물 (즉, 서열 번호 8에 대하여 90%의 서열 동일성을 포함하며 위치 796에서 아스파르트산 (D)의 글리신 (G)으로의 치환을 포함하는 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩함)을 포함하는 변형된 바실루스 숙주 세포는 형질전환체의 수를 비변형된 (대조) “비-수용성” 모 바실루스 숙주 세포에 비하여 적어도 2배만큼 증가시킨다.
X. 발효
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 변형된 박테리아 세포를 발효시키는 단계를 포함하는 POI의 생성 방법에 관한 것이며, 여기서, 변형된 세포는 POI를 배양 배지 내로 분비한다. 본 기술 분야에 잘 알려진 발효 방법을 적용하여 변형 및 비변형 박테리아 세포를 발효시킬 수 있다.
일부 실시 양태에서, 박테리아 세포는 배치식 또는 연속식 발효 조건 하에서 배양된다. 전통적인 배치식 발효는 발효 초반에 배지의 조성을 설정하고 발효 동안 변경하지 않는 폐쇄 시스템이다. 발효 초반에, 배지에 요망되는 유기체(들)가 접종된다. 이러한 방법에서, 발효는 이러한 시스템에 임의의 구성요소의 추가 없이 발생하는 것이 허용된다. 전형적으로, 배치식 발효는 탄소원의 첨가와 관련하여 "배치"로서의 자격이 있으며, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 제어하기 위한 시도가 종종 이루어진다. 배치식 시스템의 대사산물 및 바이오매스의 조성은 발효가 중단되는 시점까지 지속적으로 변한다. 전형적인 배치식 배양 내에서, 세포는 정적 지체기를 통하여 고성장 대수기까지, 그리고 마지막으로 성장 속도가 감소되거나 중지되는 정지기까지 진행할 수 있다. 비처리될 경우, 정지기에 있는 세포는 결국 사멸한다. 일반적으로, 대수기에 있는 세포는 생산물의 대량 생산의 원인이 된다.
표준 배치식 시스템에 대한 적합한 변동으로는 "유가식 발효" 시스템이 있다. 전형적인 배치식 시스템의 이러한 변동에서, 발효가 진행함에 따라 기질이 증분 첨가된다. 유가식 시스템은 이화대사산물 억제가 세포의 대사를 저해할 가능성이 있을 때, 그리고 배지 중에 제한된 양의 기질이 있는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가식 시스템에서 실제 기질 농도를 측정하는 것은 어렵고, 따라서 pH, 용존 산소 및 폐가스, 예컨대 CO2의 분압과 같은 측정가능한 인자의 변화에 기초하여 개산된다. 배치식 및 유가식 발효는 본 기술 분야에서 일반적이며 공지되어 있다.
연속식 발효는 규정 발효 배지가 생물 반응기에 연속적으로 첨가되고, 동량의 조정 배지(conditioned medium)가 프로세싱을 위하여 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속 발효는 일반적으로 일정한 고밀도에서 배양물을 유지하며, 이때, 세포는 주로 대수기 성장에 있다. 연속식 발효는 세포 성장 및/또는 생성물 농도에 영향을 미치는 하나 이상의 인자의 조절을 허용한다. 예를 들어, 일 실시 양태에서, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 비율로 유지되며 모든 다른 파라미터는 적정 수준이 되도록 한다. 다른 시스템에서, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도를 일정하게 유지하면서, 성장에 영향을 미치는 다수의 인자를 계속 변경할 수 있다. 연속식 시스템은 정상 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 배지의 배출로 인한 세포 손실은 발효에서 세포 성장 속도와 균형을 이룰 것이다. 연속식 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라, 생성물 형성 속도를 최대화하기 위한 기술도 산업 미생물학 분야에 잘 알려져 있다.
이러한 특정 실시 양태에서, 형질전환된 (변형된) 숙주 세포에 의해 생성된 POI는 숙주 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리하는 것, 또는 필요할 경우 세포를 파괴하는 것 및 상청액을 세포 분획 및 잔사로부터 제거하는 것을 포함하는 통상적인 절차에 의해 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 전형적으로, 청징화 후 상청액 또는 여과액의 단백질성 성분을 염, 예를 들어 황산암모늄에 의해 침전시킨다. 그 후, 침전된 단백질은 가용화되며, 다양한 크로마토그래피 절차, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.
XI. 변형된 (숙주) 세포에 의해 생성된 관심 대상의 단백질
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 증가된 수준의 POI의 생성 방법을 제공하며, 이는 증가된 양의 POI를 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포를 수득하는 단계 (여기서, 변형된 박테리아 세포는 변이형 RNA-폴리머라아제 (RNAP) β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함함), 및 변형된 세포를 POI가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계 (여기서, 증가된 양의 POI를 발현하는 변형된 박테리아 세포는 비변형 그람 양성 박테리아 세포에서의 POI의 발현과 대비됨)를 포함한다.
POI는 임의의 내인성 또는 이종성 단백질일 수 있으며, 이것은 그러한 POI의 변이체일 수도 있다. 상기 단백질은 하나 이상의 디술피드 가교체를 함유할 수 있거나 기능적 형태가 단량체 또는 다량체인 단백질이고, 즉, 상기 단백질은 4차 구조를 가지며 복수의 동일한(상동성) 또는 동일하지 않은(이종성) 서브유닛으로 구성되고, 여기서, POI 또는 이의 변이형 POI는 바람직하게는 관심 대상의 특성을 갖는 것이다.
특정한 실시 양태에서, POI 또는 이의 변이형 POI는 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 언하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
POI 또는 변이형 POI는 또한 펩티드, 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 리셉토스(receptos), 유착 분자, 미생물 항원 (예를 들어, HBV 표면 항원, HPV E7 등), 및 이들의 변이체 또는 이들의 단편일 수 있다.
관심 대상의 단백질 (또는 변이체)의 다른 유형은 식품 또는 작물에 영양적 가치를 제공할 수 있는 것일 수 있다. 비제한적인 예는 항-영양성 인자의 형성을 저해할 수 있는 식물성 단백질 및 더 바람직한 아미노산 조성 (예를 들어, 비-트랜스제닉(transgenic) 식물보다 더 높은 라이신 함량)을 갖는 식물성 단백질을 포함한다.
XII. 단백질성 조성물의 용도
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 관심 대상의 하나 이상의 단백질(들)을 포함하는 단백질성 조성물을 제공한다. 단백질성 조성물은 적합하게는 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성된다. 단백질성 조성물은 관심 대상의 유전자에 의해 코딩되고 본원에 기술된 방법을 사용하여 발현된 관심 대상의 단백질을 포함한다. 상기 조성물은 다양한 유용한 산업적 응용, 예컨대 바이오매스 가수분해, 세척(cleaning) 응용, 곡물 가공, 동물 영양, 식품 조성물, 직물 처리, 개인 케어(care) 제품 등에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 그렇게 생성된 단백질성 조성물은 세척 응용에서 사용될 수 있다. 효소적 세척 성분은 종래의 화학 세제로는 쉽게 제거되지 않는 오염물(soil), 얼룩 및 기타 잔사를 분해하는 능력 때문에 인기가 있다. 세척에 유용한 주지의 효소는 리파아제, 펙티나아제, 만나나아제, 심지어 특정 셀룰라아제와 같은 다른 효소와 함께 프로테아제 및 아밀라아제를 포함하며, 이들 각각은 상이한 기능성들의 세트를 제공한다. 예를 들어, 프로테아제는 단백질 기반의 얼룩에 대항하고; 아밀라아제는 탄수화물 및 전분에 작용하고; 리파아제는 지질 또는 지방을 분해한다. 본 발명은 변형된 박테리아 세포를 제공하며, 이는 세척 응용에서 이러한 사용에 관심이 있는 산업용 효소, 변이체, 및 혼합물의 생산자로서 적합하고 유리한 향상된 단백질 생산을 보여주었다.
또 다른 예에서, 그렇게 제조된 단백질성 조성물은 곡물 가공에서 사용될 수 있다. 전분은 식물에서 가장 흔한 저장 탄수화물이며, 식물 그 자신뿐만 아니라 미생물 및 고등 유기체에 의해서도 사용된다. 매우 다양한 효소가 전분 가수분해를 촉매할 수 있다. 모든 식물 공급원의 전분은 과립 형태로 나타나지만, 식물 공급원의 종에 따라, 전분은 현저하게 상이한 크기 및 물리적 특성으로 나타난다. 전분의 산 가수분해는 과거에는 광범위한 용도를 가졌지만, 이러한 공정은 현재 대부분 효소적 공정으로 대체되었으며, 이는 내-부식성이 더 적은 재료 및 다른 이익을 요구하는 것으로 알려져 있고 가열에 더 적은 에너지가 필요하고 제어가 산 공정보다 상대적으로 더 쉽다. 본 발명은 엔지니어링된, 형질전환된, 또는 유래된 진정세균 세포를 제공하며, 이는 전분 분해 및 곡물 가공에서 이러한 사용에 관심이 있는 산업용 효소, 변이체, 및 혼합물의 생산자로서 적합하고 유리한 향상된 단백질 생산을 보여주었다.
또 다른 예에서, 그렇게 제조된 단백질성 조성물은 식품 응용에서 사용될 수 있다. 박테리아, 효모 및 곰팡이에 의해 생성된 효소는 수천년 동안 빵, 치즈, 맥주 및 와인과 같은 식품의 제조를 위하여 식품 응용에서 사용되어 왔다. 오늘날 효소는 베이커리, 치즈 제조, 전분 가공 및 과일 주스 및 기타 음료의 제조에 사용되어 다양한 이익, 예컨대 개선된 질감, 외관 및 영양적 가치를 제공하며, 바람직한 풍미 및 향을 생성하는 등의 역할을 한다. 전형적으로, 식품용 효소는 일련의 유익한 미생물로부터 기원할 뿐만 아니라 동물 및 식물에서도 기원한다 (예를 들어, 전분-소화 효소, 아밀라아제는 발아 중인 보리씨로부터 수득될 수 있다). 효소는 많은 공정에서 합성 화학물질을 대체하는, 전통적인 화학-기반 기술에 대한 실행가능하고 바람직한 대안으로 여겨진다. 효소는 식품 생산 공정의 환경 성능의 개선을 도와서 에너지 소비를 감소시키고 폐기물 또는 부산물의 생분해성을 향상시킬 수 있다. 효소는 그의 작용에 있어서 합성 화학물질보다 더 특이적인 경향이 있으며, 따라서, 효소 공정은 더 적은 부반응 및 폐기물 또는 부산물을 제공하는 경향이 있고, 그 결과 더 높은 품질의 제품을 생성하고 오염 가능성을 감소시킨다. 흔히 효소 공정은 유일한 가능한 공정이기도 하다. 이의 예는 투명 사과 주스 농축액의 생성에 있는데, 이는 펙티나아제라는 효소의 사용에 의존한다. 대부분의 식품용 효소는 미생물, 예컨대 바실루스, 아스페르길루스(Aspergillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로부터 생성된다. 본 발명은 엔지니어링된, 형질전환된, 또는 유래된 진정세균 세포를 제공하며, 이는 식품 응용에서 이러한 사용에 관심이 있는 산업용 효소, 변이체, 및 혼합물의 생산자로서 적합하고 유리한 향상된 단백질 생산을 보여주었다.
또 다른 예에서, 그렇게 제조된 단백질성 조성물은 동물 사료 첨가제에서 사용될 수 있다. 셀룰라아제, 자일라나아제, β-글루카나아제, 관심 대상의 단백질, 프로테아제, 리파아제, 피타아제 및 기타 카르보하이드라아제가 동물 사료 산업에서 널리 사용되어 왔다. 많은 식물계 사료는 동물 성장을 감소시키는 항-영양 인자를 포함하는 물질을 함유하기 때문에, 그러한 사료에 첨가되는 효소는 섬유, 단백질, 전분 및 피테이트를 분해시킴으로써 이러한 항-영양 인자의 소화성을 향상시키며, 이것은 이들이 동물에 의해 더 많이 분해될 수 있게 하고, 더 저렴한 그리고 흔히 현지 생산된 사료의 사용을 가능하게 하는 한편 고기, 난류 또는 밀크의 생산성을 최대화한다. 이와 동시에, 그러한 사료에 첨가된 효소는 또한 소화기관 건강 및 향상된 동물 능력을 뒷받침하는 이득을 제공할 수 있다. 본 발명은 엔지니어링된, 형질전환된, 또는 유래된 진정세균 세포를 제공하며, 이는 동물 사료 응용에서 이러한 사용에 관심이 있는 산업용 효소, 변이체, 및 혼합물의 생산자로서 적합하고 유리한 향상된 단백질 생산을 보여주었다.
또한 추가의 예에서, 그렇게 제조된 단백질성 조성물은 직물 응용에서 사용될 수 있다. 효소는 직물 가공의 필수적인 부분이 되었다. 직물 산업에는 두 가지 잘 확립된 효소 적용이 있다. 첫째, 아밀라아제와 같은 효소는 일반적으로 발호(desizing)를 위한 예비적 마감 영역에서 사용된다. 둘째, 셀룰라아제와 같은 효소는 일반적으로 면제품의 유연화, 바이오-스토닝(bio-stoning) 및 보풀(pilling) 경향 감소를 위한 마감 영역에서 사용된다.
다른 효소, 예를 들어 펙티나아제, 리파아제, 프로테아제, 카탈라아제, 자일라나아제 등도 직물 가공에서 사용된다. 게다가, 데님 및 비-데님의 효소 포함된 색바램, 바이오-스코어링(bio-scouring), 바이오-폴리싱(bio-polishing), 울 피니싱(wool finishing), 퍼옥시드 제거, 염료의 탈색 등을 수반하는 다양한 응용이 있다. 따라서, 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 직물 응용에서 이러한 사용에 관심이 있는 산업용 효소, 변이체, 및 혼합물의 생산자로서의 변형 그람 양성 박테리아 세포 (이는 본원에서 향상된 단백질 생산을 갖는 것으로 입증됨)를 제공한다.
실시예
본 발명의 박테리아 세포, 이의 조성물 및 방법의 측면이 다음의 실시예에 비추어 더 이해될 수 있으며, 이 실시예들은 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 재료 및 방법에 대한 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1
rpoC 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 변형된 비. 서브틸리스 세포
본 실시예에서, 프로테아제 및 아밀라아제 효소의 생성을 다섯 개 (5개)의 상이한 rpoC 돌연변이 유전자 중 하나 (1개)를 포함하는 변형된 바실루스 서브틸리스 세포에서 테스트하고, 야생형 바실루스 서브틸리스 rpoC 유전자 (서열 번호 6)를 포함하는 비변형된 (모) 비. 서브틸리스 세포와 비교한다. 총 다섯 가지(5가지)의 상이한 rpoC 유전자 변화 (예를 들어, 치환 및 결실)를 설계하고, 구축하고, 테스트한다. 상기 5가지의 rpoC 유전자 변화는 하기 표 1에 열거되어 있다.
Figure pct00002
상기 표 1에 개시된 RpoC (β′-서브유닛) 단백질에서의 아미노산 변화를 달성하도록 뉴클레오티드 치환 또는 결실을 설계한다 (예를 들어, 서열 번호 5를 참조하는데, 이는 서열 번호 6의 야생형 RpoC (β′-서브유닛) 단백질을 코딩함).
예를 들어, 서열 번호 6의 아미노산 위치 751에서의 메티오닌 (M)의 이소류신 (I)로의 치환 (이하, “M751I”)은 서열 번호 5의 뉴클레오티드 2251, 2252 및 2253에서의 ATG 코돈을 그에 대하여 ATC, ATT 또는 ATA 코돈으로 대체함으로써 이루어지며; 서열 번호 6의 아미노산 위치 784에서의 아르기닌 (R)의 히스티딘 (H)으로의 치환 (이하, “R784H”)은 서열 번호 5의 뉴클레오티드 2350, 2351 및 2352에서의 CGT 코돈을 그에 대하여 CAT 또는 CAC 코돈으로 대체함으로써 이루어지며; 서열 번호 6의 아미노산 위치 797에서의 세린 (S)의 페닐알라닌 (F)으로의 치환 (이하, “S797F”)은 서열 번호 5의 뉴클레오티드 2389, 2390 및 2391에서의 TCA 코돈을 그에 대하여 TTT 또는 TTC 코돈으로 대체함으로써 이루어지며; 서열 번호 6의 아미노산 위치 796에서의 아스파르트산 (D)의 글리신 (G)로의 치환 (이하, “D796G”)은 서열 번호 5의 뉴클레오티드 2386, 2387 및 2388에서의 GAC 코돈을 그에 대하여 GGC, GGT, GGA 또는 GGG 코돈으로 대체함으로써 이루어진다. 상기 표 1에 개시된 세 개(3개) 아미노산 결실 구축물 (이하, “ΔI1018-R1020”)은 서열 번호 5의 코돈들의 결실에 의해 만들어지는데, 이는 각각 서열 번호 6의 잔기 1018, 1019 및 1020에서의 RpoC (β′-서브유닛) 단백질의 이소류신 (I), 세린 (S) 및 아르기닌 (R) 아미노산에 상응한다.
통합 플라스미드의 구축. 상기에 간략하게 진술한 바와 같이, 총 5가지의 통합 플라스미드 (표 1) (pCZ211 (예를 들어, 도 1 참조), pCZ212 pCZ213, pCZ214 및 pCZ215로 명명됨)를 본원에 설명된 바와 같이 구축한다. 5개의 변형된 rpoC 유전자는 SGI-DNA (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)에 의해 합성되거나, 또는 부위-돌연변이 유발에 의해 생성되며 이를 제한효소 절단 및 라이게이션을 이용하여 감온 플라스미드 pKSV7-I-Sce 내로 클로닝한다. 라이게이션 혼합물로 이. 콜라이 Top10 세포를 형질전환시키고, 50 μg/ml의 카르베니실린을 포함하는 LA 플레이트 상에 도말한다. 콜로니를 콜로니 PCR 및 서열결정에 의해 스크리닝하였다.
감온 플라스미드의 구축. 상기 단락에서 언급된 감온 통합 플라스미드 pKSV7-I-Sce를 다음과 같이 구축한다: 이십 (20) 피코몰의 두 가지 (2가지) 단일 가닥 올리고머, I-SceI-1: cgatTAGGGATAACAGGGTAATat (서열 번호 9), 및 I-SceI-2: cgatATTACCCTGTTATCCCTAat (서열 번호 10) (여기서, 대문자는 I-SceI 제한 효소 부위의 상동 서열임)를 98℃에서 칠 분 (7분) 동안 인큐베이션하고, 그 후 55℃에서 오 분 (5분) 동안 유지하여 상기 올리고머들을 어닐링시킨다. 어닐링된 단편을 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs); 미국 매사추세츠주 입스위치 소재)를 이용하여 포스포릴화하고, 그 후 pKSV7 통합 벡터의 ClaI 부위와 라이게이션시킨다 (문헌[Smith & Youngman, 1992]). pKSV7에 존재하는 클로람페니콜-내성 유전자를 제거하기 위하여, 상기 플라스미드를 NcoI 및 MfeI로 절단하고, T4 DNA 폴리머라아제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치 소재)를 이용하여 블런트 말단화한다. repF 및 cop-6을 포함하는 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 클로람페니콜 내성 유전자 단편으로부터 분리하고, 겔 추출 키트 (퀴아젠(Qiagen); 독일 힐덴 소재)를 이용하여 정제하고, 그 후 자가-라이게이션시켜 pKS 벡터를 생성한다. pKS 벡터를 제한 엔도뉴클레아제 HindIII으로 절단하고, HindIII 제한 엔도뉴클레아제를 이용한 절단 후 플라스미드 pDG780 (문헌[
Figure pct00003
])으로부터 유래된 카나마이신 (Km) 내성 유전자에 라이게이션시킨다. 생성된 플라스미드를 “pKSV-I-Sce Km”으로 명명한다.
돌연변이 rpoC 유전자에 의한 비. 서브틸리스 세포의 형질전환 및 rpo C 돌연변이체 스크리닝. 표 1에 개시된 돌연변이된 rpoC 유전자를 포함하는 플라스미드 각각으로 비. 서브틸리스 세포를 형질전환시키며, 여기서, 형질전환체를 30℃에서 10 μg/ml의 카나마이신을 포함하는 LB 플레이트 상에서 선발한다. 후속적으로, 콜로니를 고르고, 진탕 플라스크 내의 25 mL의 LB 내에 접종하고, 250 RPM에서 진탕시키면서 30℃에서 세 시간 (3시간) 동안 인큐베이션한다.
비. 서브틸리스의 염색체 내로의 플라스미드의 통합을 위하여, 온도를 37℃까지 바꾸고, 하룻밤 인큐베이션한다. 다음날, 연속 희석물을 10-6 및 10-7까지 만들고, 배양물을 LB 플레이트 상에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한다. rpoC 돌연변이 클론을 콜로니 PCR 및 서열결정에 의해 스크리닝한다.
변형된 (돌연변이) rpoC 유전자를 포함하는 변형된 비. 서브틸리스 세포에서의 관심 대상의 단백질의 발현. 바실루스 서브틸리스 세포 내로의 rpoC 돌연변이의 도입 후, 변형 및 비변형 바실루스 서브틸리스 세포를 두 상이한 프로테아제 효소들 중 하나 또는 두 상이한 아밀라아제 효소들 중 하나를 코딩하는 발현 카세트로 형질전환시킨다.
발현 카세트에 의해 코딩되는 상기 두 프로테아제 효소는 (1) 본원에서 “프로테아제-1”로 칭해지는, 미국 특허 제5,972,682호에 개시되고 설명된 비. 렌투스 변이형 프로테아제 및 (2) 본원에서 “프로테아제-2”로 칭해지는, 국제 공개 제2010/056635호에 개시되고 설명된 비. 클라우시이 변이형 프로테아제이다.
마찬가지로, 발현 카세트에 의해 코딩되는 상기 두 아밀라아제 효소는 (1) 본원에서 “아밀라아제-1”로 칭해지는, 국제 공개 제2014/164777호에 개시되고 설명된 파에니바실루스 쿠르다노라이티쿠스(Paenibacillus curdanolyticus) 아밀라아제 변이체 및 (2) 본원에서 “아밀라아제-2”로 칭해지는, 국제 공개 제2009/149419호 및 국제 공개 제2009/149395호에 개시되고 설명된 야생형 또는 변이형의 바실루스 서브틸리스 아밀라아제이다. 변형 및 비변형 바실루스 서브틸리스 세포에서의 각각의 효소의 생성을 진탕 플라스크에서 테스트하여 비변형 (모) 바실루스 서브틸리스 세포와 비교한다.
실시예 2
rpoC 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 변형된 비. 리케니포르미스 세포
이 실시예에서, 아밀라아제 효소의 생성을 다섯 개 (5개)의 상이한 rpoC 돌연변이 (변형) 유전자들 중 하나를 포함하는 변형된 바실루스 리케니포르미스 세포에서 테스트하고, 야생형 비. 리케니포르미스 rpoC 유전자 (서열 번호 7)를 포함하는 비변형된 (모) 비. 리케니포르미스 세포와 비교하였다. 상기 5가지의 rpoC 유전자 변화는 하기 표 2에 열거되어 있다.
Figure pct00004
따라서, 본 실시예에서, 상기 표 2에 개시된 RpoC (β′-서브유닛) 단백질에서의 아미노산 변화를 달성하도록 뉴클레오티드 치환 또는 결실을 설계한다 (예를 들어, 서열 번호 7을 참조하는데, 이는 서열 번호 8의 비. 리케니포르미스 야생형 RpoC (β′-서브유닛) 단백질을 코딩함).
예를 들어, 서열 번호 7로 개시된 야생형 rpoC 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 아미노산 위치 751에서의 메티오닌 (M)의 이소류신 (I)으로의 치환 (M751I)은 서열 번호 7의 뉴클레오티드 위치 2253에서 구아닌 (G)을 시토신 (C)으로 대체함으로써 행하며 (즉, ATG에서 ATC로); 아미노산 위치 784에서의 아르기닌 (R)의 히스티딘 (H)으로의 치환 (R784H)은 서열 번호 7의 뉴클레오티드 위치 2351에서 구아닌을 아데닌 (A)으로 대체함으로써 행하며 (즉, CGT에서 CAT로); 아미노산 위치 797에서의 세린 (S)의 페닐알라닌 (F)으로의 치환 (S797F)은 서열 번호 7의 뉴클레오티드 위치 2390 및 2391에서 시토신-아데틴 뉴클레오티드 (CA)를 티민-티민 뉴클레오티드 (TT)로 대체함으로써 행하며 (즉, TCA에서 TTT로); 아미노산 위치 796에서의 아스파르트산 (D)의 글리신 (G)으로의 치환 (D786G)은 서열 번호 7의 뉴클레오티드 위치 2387에서 아데닌 (A)을 구아닌 (G)으로 대체함으로써 행한다 (즉, GAC에서 GGC로). 상기 표 2에 개시된 세 개 (3개) 아미노산 결실 구축물 (ΔI1018-R1020)을 서열 번호 7의 코돈들의 결실에 의해 만드는데, 이는 각각 서열 번호 8의 잔기 1018, 1019 및 1020에서의 RpoC (β′-서브유닛) 단백질의 이소류신 (I), 세린 (S) 및 아르기닌 (R) 아미노산에 상응한다.
rpoC 통합 플라스미드의 구축. 상기에 간략하게 진술한 바와 같이, 총 5가지의 통합 플라스미드 (표 2) (pCZ201 (예를 들어, 도 2 참조), pCZ202, pCZ203, pCZ204 및 pCZ205로 명명됨)를 본원에 설명된 바와 같이 구축하였다. 이들 플라스미드 (즉, pCZ201 내지 pCZ205) 각각은 이. 콜라이 복제 원점, 카나마이신 (“Km”) 선발 마커, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 PE194 감온 레플리콘 (“Ts 레플리콘”), 및 상기 5가지의 전술한 아미노산 변화들 중 하나를 생성하는 코돈 변화를 갖는 rpoC 유전자 (표 2)를 포함한다.
모든 5개의 플라스미드는 제한효소 절단 및 라이게이션 방법을 이용함으로써 대략 3.2 kb의 합성 (사전 제조) 벡터 pKB320의 삽입에 의해 유래되었다 (하기 및 도 3, pKB320 플라스미드 지도 참조). 표 2에 제시된 이러한 5가지의 합성 변형 (돌연변이) rpoC 유전자는 SGI-DNA (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)에 의해 각각 개별적으로 pUC02 벡터 내로 삽입되었으며, 이를 플라스미드 제조물(preparation)로서 전달하였다. PCR을 이용하여 각각의 변형 (돌연변이) rpoC 단편을 상기 플라스미드에서 증폭시키고, 두 제한효소 부위 (즉, EcoRI 및 SalI)를 하기 프라이머를 이용하여 양 말단에 부가하였다:
EcoRI - rpoC -정방향 프라이머: tcggaattccgagccgtatgggtcttgt (서열 번호 11); 및
SalI - rpoC -역방향 프라이머: taagtcgacttattcagccggaaccatttc (서열 번호 12).
PCR 생성물을 성공적으로 수득한 후, EcoRI 및 SalI 제한 효소를 이용하여 둘 다의 PCR 생성물, 및 pKB320 플라스미드를 절단하였다. 그 후, T4 라이가아제를 이용한 표준 라이게이션을 16℃에서 하룻밤 수행하였다. 그 후, 하룻밤 라이게이션한 혼합물로 Top10 이. 콜라이 수용성 세포를 형질전환시키고, 10 ppm의 카나마이신으로 선발하면서 LB 플레이트 상에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다.
단일 이. 콜라이 콜로니가 플레이트 상에 형성된 후, 콜로니 PCR을 하기 프라이머들을 이용하여 실시하여 모든 5가지 플라스미드들의 성공적인 조립을 확인하였다:
정방향 프라이머: ctcgtgcacccaactgatcttcag (서열 번호 13); 및
역방향 프라이머: ctgcgtccgttatcgatcaatgcgtc (서열 번호 14).
성공적으로 조립된 (확인된) 클론을 LB 액체 배양물 내에 접종하고, 플라스미드 DNA를 표준 미니-프렙(Mini-Prep) 절차를 이용하여 다음날에 추출하였다. 플라스미드 샘플들을 서열결정하였으며, 각각은 올바른 것으로 확인되었다.
rpoC 통합 플라스미드를 이용한 비. 리케니포르미스 세포의 원형질체 형질전환 및 rpo C 돌연변이체의 선발. 표준 원형질체 형질전환을 이용하여, 표 2에 개시된 변형 rpoC 유전자를 포함하는 모든 5가지 플라스미드로 비. 리케니포르미스 세포를 형질전환시켰다 (국제 공개 제2005/111203호 참조). DNA 및 원형질체의 혼합물을 40 ppm의 네오마이신을 선발제로 이용하여 비. 리케니포르미스 재생 플레이트 상에 도말하였다. 재생 플레이트 상에서의 삼 일 (3일)의 성장 후, 개개의 형질전환체 콜로니로부터의 샘플을 고르고, 이를 10 ppm의 네오마이신을 포함하는 LB 플레이트 상에 재획선하였다.
다음날, 단일 콜로니를 고르고, 진탕 플라스크 내의 25 mL의 LB 배지 내에 접종하고, 37℃, 250 rpm에서 세 시간 (3시간) 동안 진탕시켰다. 그 후, 온도를 46℃까지 상승시키고, 배양물을 하룻밤 진탕시켰다. 다음날, 하룻밤 배양물들 각각을 106 및 107으로 희석시키고, 100 μL를 LB 플레이트 상에 스프레드하고(spread), 단일 콜로니가 형성될 때까지 30℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트들을 콜로니 PCR, 및 서열결정 확인을 위하여 퀸타라 바이오사이언시즈(Quintara Biosciences) (미국 캘리포니아주 알바니 소재)로 보냈다.
하기 두 가지 (2가지) 프라이머를 콜로니 PCR에 사용하였다:
rpoC 정방향 프라이머: cagctaaggatacgatccaaggcaag (서열 번호 15), 및
rpoC 역방향 프라이머: tcgctttatcttcgtcgatcagctc (서열 번호 16).
하기 프라이머를 서열결정에 사용하였다:
rpoC 정방향 프라이머: ggcaagctgatgaaatccttggatg (서열 번호 17).
변형된 비. 리케니포르미스 세포에서의 아밀라아제의 발현. 상기에 설명된 변형된 비. 리케니포르미스 세포 (즉, 5가지의 rpoC 돌연변이체 중 하나로 형질전환된 변형된 비. 리케니포르미스 세포)에서 아밀라아제 효소를 발현시키기 위하여, 아밀라아제 효소를 발현하는 통합 카세트를 제조하였다. 상기 통합 카세트는 본원에서 “아밀라아제-3”으로 칭해지는, 국제 공개 제2008/112459호에 개시되고 설명된 아밀라아제 변이체를 포함한다. 아밀라아제-3 통합 카세트를 제조하기 위하여, 비. 리케니포르미스의 게놈 DNA (gDNA)를 추출하고, 하기 두 가지 (2가지) 프라이머를 사용함에 의한 PCR용 주형으로 사용하였다:
NotI -아밀라아제-정방향: tatgcggccgcatattccgcattcgcaatgcctac (서열 번호 18), 및
NotI - 아밀라아제-역방향: tttgcggccgcaaaataaaaaaacggatttccttcagg (서열 번호 19).
그 후, 일 (1) ug의 PCR 생성물을 NotI 효소로 제한효소 절단하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 단편들을 컬럼 정제하고, 그 후 십 (10) uL의 그러한 컬럼 정제된 단편들을 삼십 (30) uL 반응물에서 오 (5) 단위의 T4 DNA 라이가아제를 사용하여 라이게이션시키고, 16℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 오 (5) uL의 상기 하룻밤 라이게이션 혼합물을 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification; RCA)용으로 취하고 (이는 오 (5) uL의 하룻밤 라이게이션 혼합물을 오 (5) uL의 샘플 완충액과 혼합함으로써 수행함), 96℃에서 삼 분 (3분) 동안 인큐베이션시키고, 이어서 0.2 uL의 효소 믹스를 포함하는 오 (5) uL의 반응 완충액을 첨가하고, 이를 30℃에서 여섯 시간 (6시간) 동안 인큐베이션하였다.
형질전환을 위하여, 모든 RCA 혼합물을 백 오십 (150) μL의, rpoC-D796G 치환을 포함하는 변형 비. 리케니포르미스 수용성 세포 및 rpoC-M751I 치환을 포함하는 변형 비. 리케니포르미스 수용성 세포에 첨가하고, 유리 튜브에서 37℃에서 1시간 동안 진탕시켰다. 그 후, 상기 형질전환 혼합물 (150 μL)을 10 ppm의 클로람페니콜을 포함하는 LB/1% 불용성 전분 플레이트 상에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 단일한 투명환(halo) 양성 형질전환체를 선발하고, 75 ppm의 원하는 수준까지의 증가하는 농도의 클로람페니콜에서 배양하여 증폭시켰다. 이러한 2가지 비. 리케니포르미스 주 (즉, rpoC-D796G 치환을 포함하거나 rpoC-M751I 치환을 포함함)의 글리세롤 스톡은 일 (1) mL의 하룻밤 배양물을 오백 (500) uL의 40% 글리세롤과 혼합함으로써 수집하였다.
실시예 3
변형된 비. 서브틸리스 세포 내로의 rpoB (β-서브유닛) 치환 돌연변이체 Q469K , Q469R 또는 H482Y의 도입
RpoB (β-서브유닛) 단백질을 코딩하는 rpoB 유전자의 세 돌연변이 (즉, 돌연변이 Q469K, Q469R 및 H482Y)를 바실루스 서브틸리스 리팜피신 내성 콜로니의 단리 및 서열결정에 의해 확인하였다 (문헌[Ingham & Furneaux, 2000]). 천연 (야생형) 바실루스 서브틸리스 RpoB (β-서브유닛) 단백질 서열이 서열 번호 2로 개시되어 있으며, 천연 RpoB 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1로 개시되어 있다. 상기 돌연변이들을 비. 서브틸리스의 rpoB 유전자 내로 도입하기 위하여, rpoB Q469K, Q469R 또는 H482Y 치환을 포함하는 3가지 구축물을 다음과 같이 제조한다.
서열 번호 1의 뉴클레오티드 위치 1405, 1406 및 1407에서 CAA 코돈을 AAA 코돈으로 변화시킴으로써 Q469K 돌연변이를 만든다. 이 돌연변이를 도입하기 위하여, rpoB 유전자의 5’ 서열을 서열 번호 20 및 서열 번호 21의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭시키고; rpoB 유전자의 3’ 부분을 서열 번호 22 및 서열 번호 23의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭시킨다. 서열 번호 20 및 서열 번호 33의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 융합 PCR을 수행한다.
서열 번호 1의 뉴클레오티드 위치 1405, 1406 및 1407에서 CAA 코돈을 CGA 코돈으로 변화시킴으로써 Q469R 돌연변이를 만든다. 이 돌연변이를 도입하기 위하여, rpoB 유전자의 5’ 서열을 서열 번호 20 및 서열 번호 25의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭시키고; 3′ 서열을 서열 번호 22 및 서열 번호 24의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭시킨다. 서열 번호 20 및 서열 번호 23의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 융합 PCR을 수행한다.
서열 번호 1의 뉴클레오티드 위치 1445, 1446 및 1447에서 CAC 코돈을 TAC 코돈으로 변화시킴으로써 H482Y 돌연변이를 만든다. 이 돌연변이를 도입하기 위하여, rpoB 유전자의 5’ 서열을 서열 번호 20 및 서열 번호 27의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭시키고; 3′ 서열을 서열 번호 23 및 서열 번호 26의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭시킨다. 서열 번호 20 및 서열 번호 23의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 융합 PCR을 수행한다.
서열 번호 28로 개시된 합성 구축물 (스펙티노마이신 내성 (SpcR) 유전자 및 I-Sce 제한 효소의 인식 서열을 포함함)을 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies) (미국 아이오와주 코랄빌 소재)로부터의 g-블록(Block)으로 합성 주문한다.
rpoB 유전자의 C-말단 부분을 서열 번호 29 및 서열 번호 30의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭시킨다.
rpoB 돌연변이를 포함하는 DNA 단편, 스펙티노마이신 내성 마커 및 부분 rpoB 서열 (도 4 참조)을 서열 번호 20 및 서열 번호 30의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 융합 PCR에 의해 조립한다.
바실루스 서브틸리스 세포의 형질전환. 정제 후, rpoB에서 Q469R, Q469K 또는 H482Y 치환을 포함하는 각각의 상기 구축물로 비. 서브틸리스 수용성 세포를 형질전환시키고, 양성 형질전환체를 100 ㎍/ml의 스펙티노마이신을 포함하는 루리아(Luria) 한천 플레이트 상에서 선발하고, 200 ㎍/ml의 리팜피신을 포함하는 루리아 한천 플레이트 상에서 재단리한다.
I- Sce 제한 엔도뉴클레아제를 발현하는 플라스미드 pKBJ233 (문헌[Janes & Stibitz, 2006]에 설명됨)으로 상기 세포를 형질전환시킨다. 양성 콜로니를 10 ㎍/ml의 테트라사이클린을 포함하는 루리아 한천 플레이트 상에서 선발한다. 재단리 후, 열두시간 (12시간)마다 신선 배지 내에 접종하고, 이어서 단일 콜로니를 단리함으로써 비. 서브틸리스 세포를 5 ㎍/ml의 테트라사이클린을 포함하는 루리아 브로스(broth)에서 연속 삼 (3)일 동안 성장시킨다.
변형된 비. 서브틸리스 세포에서의 선택된 돌연변이의 도입 및 스펙티노마이신 마커의 제거를 스펙티노마이신 민감성 및 리팜피신 내성 콜로니에 대한 선발에 의해 확인한다. 그 후, 돌연변이 Q469K, Q469R 또는 H482Y의 도입을 rpoBC 오페론의 DNA 서열결정에 의해 확인한다.
실시예 4
바실루스 서브틸리스에서의 프로테아제 발현에 대한 rpoB 또는 rpoC 유전자에서의 돌연변이의 영향
rpoB 또는 rpoC 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 변형 비. 서브틸리스 세포에서의 프로테아제-2 발현의 영향을 테스트하기 위하여, 프로테아제-2 발현 구축물을 rpoB 또는 rpoC 변형 비. 서브틸리스 세포의 aprE 유전자좌 내로 도입한다.
프로테아제-2 발현 구축물을 25 μg/ml의 클로람페니콜을 포함하는 루리아 한천 플레이트 상에서 증폭시킨다. 변형 및 야생형 비. 서브틸리스 세포를 5 mL의 루리아 브로스에서 하룻밤 성장시킨다. 일 (1) ml의 예비배양물을 이용하여 250 rpm에서 진탕 플라스크 내의 2XNB (2X 영양 브로스(Nutrient Broth), 1XSNB 염, 국제 공개 제2010/14483호에 기술됨) 25 ml에 접종하여 프로테아제 발현을 테스트한다. 20배 희석시킨 전 브로스의 세포 밀도를 스펙트라맥스(SpectraMax) 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices))를 이용하여 1시간 간격으로 600 nm에서 측정한다.
프로테아제-2 발현을 국제 공개 제2010/144283호에 기술된 바와 같이 N-suc-AAPF-pNA 기질 (시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.)로부터의 AAPF)을 이용하여 모니터링한다. 간략하게는, 전 브로스를 분석용 완충액 (100 mM 트리스(Tris), 0.005% 트윈(Tween) 80, pH 8.6)에서 40배 희석시키고, 10 μl의 희석 샘플을 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에서 배열시켰다. AAPF 스톡을 희석시키고, 분석용 완충액 (DMSO 중 100 mg/ml AAPF 스톡의 100배 희석물) 및 190 μl의 이 용액을 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고, 상기 용액의 흡광도를 스펙트라맥스 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 405 nm에서 측정한다.
실시예 5
바실루스 서브틸리스에서의 아밀라아제 발현에 대한 rpoB 또는 rpoC 유전자에서의 돌연변이의 영향
rpoB 또는 rpoC 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 변형 비. 서브틸리스 세포에서의 아밀라아제-2 발현에 대한 영향을 테스트하기 위하여, aprE 프로모터로부터의 아밀라아제-2 단백질의 발현을 구동시키는 발현 구축물을 제조한다. 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 내성 (catR) 마커 유전자를 포함하는 아밀라아제 발현 구축물을 (1) 변형된 rpoC 유전자를 포함하는 변형된 (딸) 비. 서브틸리스 세포의 aprE 유전자좌, (2) 변형된 rpoB 유전자를 포함하는 변형된 (딸) 비. 서브틸리스 세포의 aprE 유전자좌, 및 (3) 비변형된 비. 서브틸리스 (모) 세포의 aprE 유전자좌 내로 도입한다. 상기 세포를 25 μg/ml의 클로람페니콜을 포함하는 루리아 한천 플레이트 상에서 증폭시킨다. 변형 및 비변형 세포를 오 (5) mL의 루리아 브로스 배지에서 하룻밤 성장시킨다. 일 (1) ml의 예비배양물을 사용하여 37℃, 250 rpm에서 진탕 플라스크 내의 루리아 브로스 배지 25 ml에 접종하여 아밀라아제-2 단백질의 발현을 테스트한다. 세포 밀도를 스펙트라맥스 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 1시간 간격으로 600 nm에서 측정한다.
전 브로스의 아밀라아제-2 단백질 활성을 세랄파(Ceralpha) 시약 (아일랜드 위크로우 소재의 메가자임(Megazyme))을 이용하여 측정한다. 세랄파 HR 키트로부터의 세랄파 시약 믹스를 처음에 10 ml의 밀리큐(MilliQ) 물에 용해시키고, 이어서 30 ml의 50 mM 말레이트 완충액 (pH 5.6)을 첨가한다. 배양 상청액을 밀리큐 물에 40배 희석시키고, 5 μl의 희석 샘플을 55 μL의 희석시킨 표준 기질 용액(diluted working substrate solution)에 첨가한다. MTP 플레이트를 진탕 후 실온에서 4분 동안 인큐베이션한다. 반응물을 70 μl의 200 mM 보레이트 완충액 (pH 10.2) (정지 용액)의 첨가에 의해 켄칭한다. 상기 용액의 흡광도를 스펙트라맥스 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 400 nm에서 측정한다.
실시예 6
rpoB 및 rpoC 유전자 둘 다에서의 변형을 포함하는 변형 비 . 리케니포르미스
rpoB 유전자 및 rpoC 유전자 둘 다에서의 돌연변이의 영향을 테스트하기 위하여, 특정 rpoB 유전자 돌연변이 (즉, RpoB-A478V 치환을 코딩함) 및 특정 rpoC 유전자 돌연변이 (즉, RpoC-D796G 치환을 코딩함)를 포함하는 바실루스 리케니포르미스 주를 하기에 설명한 바와 같이 준비한다.
야생형 비. 리케니포르미스 RpoB (β-서브유닛) 단백질은 서열 번호 4로 개시되고, 서열 번호 3으로 개시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 야생형 바실루스 리케니포르미스 RpoC (β′-서브유닛) 단백질은 서열 번호 8로 개시되고, 서열 번호 7로 개시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
원하는 rpoB 및 rpoC 돌연변이를 비. 리케니포르미스 숙주 세포 내로 도입하는 2가지 대안적인 방법이 있으며, 이들 각각은 하기에 개시되어 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 이미 RpoB-A478V 치환을 포함하고 있는 변형 비. 리케니포르미스 세포 내로 RpoC-D796G 돌연변이를 도입하는 것, 또는 그 반대로 하는 것이다. 이러한 두 접근법을 하기 방법 1 및 방법 2로 설명한다.
방법 1: 통합 플라스미드 pCZ205의 구축. 플라스미드 pCZ201 (예를 들어, 실시예 2 참조)은 이. 콜라이 복제 원점, 카나마이신 선발 마커, 스타필로코커스 아우레우스 유래의 PE194 감온 레플리콘 및 아미노산 변화 (D796G)로 이어지는 DNA 서열 변화 (서열 번호 7의 뉴클레오티드 서열 위치 2062에서 GAC에서 GGC로)를 갖는 rpoC 유전자를 포함한다.
제한효소 절단 및 라이게이션 방법을 이용하여 대략 3.2 kb의 합성 변형 rpoC 유전자를 벡터 pKB320 내로 삽입함으로써 pCZ205 플라스미드를 제조한다. 이러한 합성 변형 rpoC 유전자를 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해 pUC02 벡터 내로 삽입하여 플라스미드 제조물을 생성한다. PCR을 이용하여, 하기 프라이머를 사용하여 상기 플라스미드에서 rpoC 단편을 증폭시키고 두 제한효소 부위 EcoRI 및 SalI을 양 말단에 부가한다:
EcoRI- rpoC FW: tcggaattccgagccgtatgggtcttgt (서열 번호 11), 및
SalI - rpoC RV: taagtcgacttattcagccggaaccatttc (서열 번호 12).
PCR 생성물을 성공적으로 수득한 후, PCR 생성물과, pKB320 플라스미드 둘 다를 EcoRI 및 SalI 제한 효소로 절단하고, 이어서 T4 라이가아제를 이용하여 16℃에서 하룻밤 동안 표준 라이게이션을 한다. 상기 하룻밤 라이게이션 혼합물로 Top10 이. 콜라이 수용성 세포를 형질전환시키고, 이를 10 ppm의 카나마이신 선발제를 포함하는 LB 플레이트 상에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한다. 단일 이. 콜라이 콜로니가 플레이트 상에 형성된 후, 콜로니 PCR을 하기 프라이머들을 이용하여 실시하여 플라스미드의 성공적인 조립을 확인한다:
정방향 프라이머: ctcgtgcacccaactgatcttcag (서열 번호 13), 및
역방향 프라이머: ctgcgtccgttatcgatcaatgcgtc (서열 번호 14).
확인된 클론을 LB 액체 배양물 내에 접종하고, 플라스미드 DNA를 표준 미니-프렙 절차를 이용하여 다음날에 추출한다. 플라스미드 샘플들을 서열결정을 위하여 내보내서 올바른 플라스미드를 수득함을 확인한다.
통합 플라스미드 pCZ205를 이용한 비. 리케니포르미스 세포의 원형질체 형질전환 및 rpo C 돌연변이체의 선발. 표준 원형질체 형질전환 (국제 공개 제2005/111203호 참조)을 이용하여 pCZ205 플라스미드로 비. 리케니포르미스 세포를 형질전환시키고, DNA 및 원형질체의 혼합물을 선발제로서 40 ppm의 네오마이신을 포함하는 비. 리케니포르미스 재생용 플레이트 상에 도말한다. 재생 플레이트 상에서의 삼일 (3일)의 성장 후, 개개의 형질전환체를 고르고, 10 ppm의 네오마이신을 포함하는 LB 플레이트 상에 재획선한다. 다음날, 단일 콜로니를 고르고, 진탕 플라스크 내의 25 mL의 LB 배지 내에 접종하고, 37℃ 및 250 rpm에서 세 시간 (3시간) 동안 진탕시키고, 그 후 온도를 46℃까지 바꾸고, 진탕을 하룻밤 계속한다. 다음날, 상기 하룻밤 배양물의 106배 및 107배 희석물을 만들고, 100 ㎕를 LB 플레이트 상에 스프레드하고, 30℃에서 하룻밤, 또는 단일 콜로니가 형성될 때까지 인큐베이션한다. 올바른 돌연변이의 존재를 콜로니 PCR 및 서열결정에 의해 확인한다. 콜로니 PCR에 사용한 두 프라이머는 하기 프라이머이다:
rpoC 정방향 프라이머: cagctaaggatacgatccaaggcaag (서열 번호 15) 및
rpoC 역방향 프라이머: tcgctttatcttcgtcgatcagctc (서열 번호 16).
서열결정에 사용한 프라이머는 하기 프라이머이다:
rpoC 서열결정용 정방향 프라이머: ggcaagctgatgaaatccttggatg (서열 번호 17).
방법 2: 통합 플라스미드 pCZ211의 구축. 플라스미드 pCZ211은 이. 콜라이 복제 원점, 카나마이신 선발 마커, 스타필로코커스 아우레우스 유래의 PE194 감온 레플리콘, 및 서열 번호 2의 아미노산 위치 478에서의 알라닌 (A)의 발린 (V)으로의 치환 (“A478V”)을 생성하는 돌연변이를 포함하는 rpoB 유전자를 포함한다.
제한효소 절단 및 라이게이션 방법을 이용하여 대략 3.5 kb의 변형 rpoB 유전자 (“A478V” 치환을 코딩함)를 벡터 pKB320 내로 삽입함으로써 플라스미드 pCZ211을 제조한다. rpoB 유전자 (DNA 서열 위치 1433에서 GCT에서 GTT로)를 포함하는 대략 3.5 kb의 DNA 단편을 수득하기 위하여, 하기 두 프라이머 및 주형으로서 비. 리케니포르미스 gDNA를 사용하여 PCR을 실시한다:
EcoRI-RpoB 정방향 프라이머:
Figure pct00005
(서열 번호 32) 및
NotI-RpoB 역방향 프라이머:
Figure pct00006
(서열 번호 33).
이러한 rpoB PCR 생성물을 pKB320 벡터 내로 삽입하기 위하여, 삽입체 및 벡터 둘 다를 EcoRI 및 NotI 제한 효소로 절단하고, 이어서 T4 라이가아제를 이용하여 16℃에서 하룻밤 동안 표준 라이게이션을 한다. 그 후, 상기 하룻밤 라이게이션 혼합물로 Top10 이. 콜라이 수용성 세포를 형질전환시키고, 이를 10 ppm의 카나마이신 선발제를 포함하는 LB 플레이트 상에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한다. 단일 이. 콜라이 콜로니를 고르고, 액체 배양물 내에 접종하고, 하룻밤 성장시키고, 그 후 플라스미드 DNA를 표준 미니-프렙 절차를 이용하여 추출한다. 그 후 플라스미드 샘플을 서열결정을 위하여 내보내서 pCZ211 플라스미드를 수득함을 확인한다.
통합 플라스미드 pCZ211을 이용한 비. 리케니포르미스 세포의 원형질체 형질전환 및 rpo B 돌연변이체의 선발. 표준 원형질체 형질전환 (국제 공개 제2005/111203호 참조)을 이용하여 pCZ211 플라스미드로 비. 리케니포르미스 세포를 형질전환시키고, 그 후 DNA 및 원형질체의 혼합물을 선발제로서 40 ppm의 네오마이신을 포함하는 비. 리케니포르미스 재생용 플레이트 상에 도말한다. 재생 플레이트 상에서의 3일의 성장 후, 개개의 형질전환체를 고르고, 10 ppm의 네오마이신을 포함하는 LB 플레이트 상에 재획선한다. 다음날, 단일 콜로니를 고르고, 진탕 플라스크 내의 25 mL의 LB 배지 내에 접종하고, 37℃ 및 250 rpm에서 세 시간 (3시간) 동안 진탕시키고, 그 후 온도를 46℃까지 바꾸고, 진탕을 하룻밤 계속한다. 다음날, 상기 하룻밤 배양물의 106배 및 107배 희석물을 만들고, 100 ㎕를 LA 플레이트 상에 스프레드하고, 30℃에서 하룻밤, 또는 단일 콜로니가 형성될 때까지 인큐베이션한다. 단일 콜로니를 고르고, 선발제를 포함하지 않는 LA 플레이트, LA 플레이트 + 1 ppm 리팜피신, 및 LA 플레이트 + 10 ppm 카나마이신 상에 패치한다(patched). 양성 클론 또는 rpoB-A478V 치환을 갖는 클론은 리팜피신에 대하여 내성이고 카나마이신에 대하여 민감성이다 (pCZ111 플라스미드의 손실로 인한 것임).
실시예 7
변형된 비. 리케니포르미스 세포에서의 아밀라아제 효소의 진탕 플라스크에 의한 생성
본 실시예에서, 실시예 2에 설명된 “rpoC-D796G” 치환을 포함하는 변형 바실루스 리케니포르미스 세포 및 야생형 (모) 비. 리케니포르미스 세포를 다수의 합성 DNA 단편들로부터 구축한 DNA 카세트로 형질전환시켰다. 더 구체적으로, DNA 단편 1은 비. 리케니포르미스 adaA 영역, cat 프로모터 영역, alr1 유전자, 및 cat 종결자 영역을 포함하며; 이는 진스크립트(Genescript) (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에 주문한다. DNA 단편 2는 비. 서브틸리스 천연 rrnI P2 프로모터 영역, 5′-aprE UTR 및 비. 리케니포르미스 lat 신호 서열을 포함하며; 이중 가닥 유전자 단편으로 제조한다 (예를 들어, IDT로부터의 G-블록, 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈; 미국 아이오와주 코랄빌 소재). DNA 단편 3은 아밀라아제 유전자 서열 및 비. 리케니포르미스 lat 종결자 영역을 포함한다. DNA 단편 3의 아밀라아제 유전자는 본원에서 “아밀라아제-4”로 칭해지는, 국제 공개 제2014/164777호에 개시되고 설명된 사이토파가(Cytophaga) sp . 유래의 아밀라아제 변이체이다.
상기 3가지 DNA 단편들을 PCR에 의해 융합시키고, 3’ 및 5’ NotI 제한효소 절단 서열을 이용하여 라이게이션시키고, 그 후 일러스트라 템플리파이 키트(Illustra Templiphi kit) (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 이용하여 증폭시키고, 마지막으로 변형 (rpoC-D796G) 비. 리케니포르미스 세포 및 야생형 (모) 비. 리케니포르미스 세포를 형질전환시켜 이들의 게놈 내로 통합시켰다. 1% 스타치 아주르(Starch Azure) (레마졸 브릴리언트 블루(Remazol Brilliant Blue) R이 공유 결합된 감자 전분; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), S7629), 및 300 mg/l의 β-클로로-D-알라닌 (CDA) (미국 일리노이주 우드 데일 소재의 켐-임펙스 인터내셔널 인크.(Chem-Impex International Inc.))이 보충된, 하트 인퓨전(Heart Infusion) (박토(Bacto)) 한천 플레이트를 이용하여 형질전환체를 선발하였다.
아밀라아제-4 발현 카세트가 통합된 콜로니 주위에서 전분 분해 활성(amylolytic activity)을 나타내는 투명대(clearing zone)가 명백하게 보였다.
CDA (300 mg/l) 내성 형질전환체는 RBB-전분 플레이트 상에서의 투명환 형성에 의해 판단되는 바와 같이 아밀라아제-4를 분비한다. 비. 리케니포르미스 세포에 의한 아밀라아제-4 효소의 생성은 MOPS 기본 배지를 이용하여 진탕 플라스크에서 상기 세포를 성장시킴으로써 실험하였다. MBD 배지는 NH4Cl2, FeSO4, 및 CaCl2를 상기 기본 배지로부터 빼고, 3 mM K2HPO4를 사용하고, 기본 배지에 60 mM 우레아, 75 g/L의 글루코스 및 1% 소이톤(soytone)을 보충한 것을 제외하고는 본질적으로 본 기술 분야에 공지된 바와 같이 제조하였다 (문헌[Neidhardt et al., 1974] 참조).
미량영양소는 100X 스톡 용액으로서 1 리터 중 400 mg FeSO4 7H2O, 100 mg MnSO4 H2O, 100 mg ZnSO4 7H2O, 50 mg CuCl2 2H2O, 100 mg CoCl2 6H2O, 100 mg NaMoO4 2H2O, 100 mg Na2B4O7 10H2O, 10 ml의 1 M CaCl2, 및 10 ml의 0.5 M 시트르산나트륨으로 이루어졌다. CaCl2를 5 mM까지 첨가하고, pH를 6.8까지 조정하였다. 인포스 인큐베이터(Infors incubator) (35℃, 280 rpm)에서의 64시간의 성장 후, 전 세포 브로스에서의 아밀라아제-4 효소의 농도를 α-아밀라아제 세랄파 분석 키트 (아일랜드 위크로우 소재의 메가자임)를 이용하여 측정하였다.
세랄파 α-아밀라아제 분석은 규정된 조건 하에서 전 배양 브로스를 기질 혼합물과 함께 인큐베이션하는 것을 포함하며, 염기 용액의 첨가에 의해 반응을 종결시킨다 (그리고 반응물은 발색된다). 기질은 규정된 올리고당 “비환원-말단 차단 p-니트로페닐 말토헵타오시드” (BPNPG7 기질) 및 과도한 수준의 글루코아밀라아제 및 β-글루코시다아제 (이들은 “차단기”의 존재로 인하여 천연 기질에 대하여 작용이 없음)의 혼합물이다. 엔도-작용 α-아밀라아제 (또는 C6 아밀라아제)에 의한 상기 올리고당의 가수분해시에, 상기 혼합물에 존재하는 과도한 양의 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제는 p-니트로페닐 말토사카라이드 단편을 글루코스 및 유리 p-니트로페놀로 즉각적으로 그리고 정량적으로 가수분해시킨다. 405 nm에서의 흡광도를 측정하며, 이것은 분석되는 샘플 중 아밀라아제의 수준과 직접적으로 관련이 있다.
이러한 분석 세트에 사용되는 장비는 바이오멕(Biomek) FX 로봇(Robot) (베크만 쿨터(Beckman Coulter)); 스펙트라맥스 MTP 판독기 (타입 340-몰레큘러 디바이시즈) 및 iEMS 인큐베이터/진탕기 (서모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 포함한다. 이러한 분석 시스템에서, 사용한 시약 및 용액은 (1) p-니트로페닐 말토헵타오시드 (BPNPG7) 기질 (메가자임 세랄파 키트); (2) 희석 완충액: 50 mM MOPS, 0.1 mM CaCl2, 0.005% 트윈® 80 완충제 (pH 7.15); 및 (3) 200 mM 붕산 / NaOH 완충제 (pH 10.2) (중지 완충액)이다.
54.5 mg의 BPNPG7 기질을 포함하는 바이알을 10 ml의 밀리큐 물에 용해시켰다. 아밀라아제 샘플 (전 세포 브로스)을 희석 완충액을 이용하여 1600배 희석시켰다. 25 ㎕의 희석시킨 아밀라아제 용액을 MTP의 웰에 첨가하고, 이어서 35 ㎕의 5.45 mg/ml의 BPNPG7 기질 용액을 첨가함으로써 분석을 수행하였다. 상기 용액들을 혼합하고, MTP를 플레이트 시일(seal)을 이용하여 밀봉하고, 인큐베이터/진탕기 (iEMS- 서모 사이언티픽) 내에 25℃에서 8분 동안 넣어 둔다. 100 ㎕의 중지 완충액을 첨가함으로써 반응을 종결시키고, 흡광도를 MTP-판독기에서 405 nm에서 판독하였다. 비-효소 대조구를 사용하여 배경 흡광도 값을 보정하였다. 아밀라아제-4 효소 농도 (mg/l)를 계산하기 위하여, 정제된 아밀라아제-4 효소 표준 대조 샘플의 희석물 시리즈를 실험에 포함시켰다. 아밀라아제-4 효소의 활성 (즉, 생산성)이 도 5a 및 도 5b에 예시되어 있다.
실시예 8
변형 및 모 비. 리케니포르미스 세포에서의 아밀라아제 효소의 1리터 생물반응기 생산
표준 비. 리케니포르미스 발효 공정을 실시하기 위하여 사중으로 설치된 1리터 생물반응기를 이용하여, 실시예 2에서 개시된 “rpoC-D796G" 치환을 포함하는 변형된 바실루스 리케니포르미스 세포 및 야생형 (모) 비. 리케니포르미스 세포에서의 아밀라아제-3 효소 발현을 비교하였다. 변형 및 비변형 (야생형; 모) 비. 리케니포르미스 세포는 추가로 실시예 2에 개시된 아밀라아제-3 발현 카세트를 포함한다. 1 L 발효를 90시간 동안 실시하였으며, 이때 표시된 시점에 샘플을 취하고(도 6 참고) OD600 및 아밀라아제-3 활성을 측정하였다.
도 6에 개시된 바와 같이, 변형된 비. 리케니포르미스 세포 (rpoC-D796G 치환을 포함함)는 모 (야생형) 비. 리케니포르미스 세포에 비하여 효소 활성의 유의한 증가를 나타냈다. 마찬가지로, 변형된 비. 리케니포르미스는 더 높은 OD600 판독값을 가졌으며, 이는 더 큰 세포 집단 (혼자서 더 높은 효소 활성을 생성할 수 있음)을 나타내는 것이었다. OD 차이를 설명하기 위하여, 도 6에 제시된 데이터를 OD600 단위당 U/g으로 표현하며, 이것은 모 비. 리케니포르미스에 비하여 변형된 비. 리케니포르미스 세포로부터의 효소 활성의 명확한 증가를 보여준다.
실시예 9
변형된 비. 리케니포르미스 숙주 세포의 형질전환 효율
본 실시예에서는, 변형된 비. 리케니포르미스 숙주 세포의 형질전환 효율을 미국 특허 제8,361,755호에 개시된 바와 같이 GC358 아밀라아제를 코딩하는 관심 대상의 유전자를 포함하는 복제 플라스미드를 받아들이는 그들의 능력에 대해 분석하였다.
더 구체적으로, 하기의 세 가지 비. 리케니포르미스 숙주 세포의 형질전환 효율을 분석하였다: 숙주 세포 1은 rpoB (478V) 폴리펩티드 (서열 번호 4) 및 야생형 (천연) rpoC 폴리펩티드 (서열 번호 8)를 코딩하는 모 (대조) 비. 리케니포르미스 숙주 세포이고; 숙주 세포 2는 변형된 rpoB 폴리펩티드 (즉, 서열 번호 4의 위치 478에서 발린에서 알라닌으로의 치환) 및 야생형 (천연) rpoC 폴리펩티드 (서열 번호 8)를 코딩하는 변형된 (딸) 비. 리케니포르미스 숙주 세포이며, 숙주 세포 3은 rpoB (V478A) 폴리펩티드 (서열 번호 4) 및 변형된 rpoC 폴리펩티드 (즉, 서열 번호 8의 위치 796에서 아스파르트산에서 글리신으로 치환)를 코딩하는 변형된 딸 비. 리케니포르미스 숙주 세포이다. 게다가, 상기 숙주 세포에서 수용능 분석을 수행하기 위하여, 각각의 숙주 세포는 자일로스 유도성 프로모터로부터 ComK를 발현하는 pBL-ComK 플라스미드를 포함한다 (예를 들어, 도 7의 플라스미드 지도 참조).
형질전환 효율 분석
상술한 모 (대조) 비. 리케니포르미스 숙주 세포 (즉, 숙주 세포 1) 및 변형된 (딸) 비. 리케니포르미스 숙주 세포 (즉, 숙주 세포 2 및 숙주 세포 3)를 100 mg/l의 스펙티노마이신을 포함하는 LB 플레이트상에 도말하고 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 100 mg/l의 스펙티노마이신을 포함하는 LB 25 ml을 포함하는 이중 예비배양용 진탕 플라스크에 단일 콜로니를 접종하고 50 ml 스로우(throw)를 이용하여 250 RPM에서 37℃에서 하룻밤 배양하였다.
이 예비배양물로부터, 본 배양물을 100 mg/l의 스펙티노마이신을 포함하는 50 ml LB에 0.7의 OD600으로 (이중으로) 접종하였다. 본 배양은 250 ml 배플 엘렌마이어(baffled Erlenmeyer) 플라스크에서 수행하였으며 50 ml 스로우를 이용하여 250 RPM에서 37℃에서 배양하였다. 총 여덟 (8) 시간 동안 한 시간에 한 번씩, OD600을 측정하였다. 처음 한 시간의 배양 후, 0.3% 자일로스를 배양 브로스에 첨가하였다. 세 시간 (3시간), 네 시간 (4시간), 다섯 시간 (5시간), 여섯 시간 (6시간), 일곱 시간 (7시간) 및 여덟 시간 (8시간)의 시점에서, 112.5 ㎕의 배양 브로스를 12.5 ㎕의 100% DMSO에 첨가하고 -80℃에서 보관하였다.
플라스미드 pHPLT-GC358 아밀라아제를 이용하여 형질전환 효율을 테스트하였다 (도 8). 이 플라스미드는 pHPLT 벡터 (문헌[Solingen et al., 2001]) 내로 클로닝된 GC358 아밀라아제의 발현을 위한 유전자 (예를 들어, 미국 특허 제8,361,755호 참조)를 포함한다. 플라스미드 DNA의 첨가 후, 세포를 한 시간 (1시간) 동안 1000 RPM에 설정된 탁상용 서모쉐이커(tabletop thermoshaker)에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 20 mg/l의 네오마이신을 포함하는 전분 플레이트 상에 도말하였다. 37℃에서 이틀 (2일) 동안 인큐베이션 후, 모든 투명환 형성 콜로니를 계수하였다.
결과
도 9에 나타낸 바와 같이, 대조 (모) 비. 리케니포르미스 숙주 세포 (즉, 숙주 세포 1; rpoB (478V), 야생형 (천연) rpoC 폴리펩티드 및 플라스미드 pBLComK를 포함/코딩함)는, 약 10 콜로니 형성 단위(CFU)의 형질전환 효율을 나타냈으며, 정점은 7시간에 15 CFU였다. 변형된 rpoB 폴리펩티드 (V478A; 도 10 참조)를 포함/코딩하는 변형된 비. 리케니포르미스 숙주 세포 (즉, 숙주 세포 2)는 모 (대조) 숙주 세포에 비하여 형질전환 효율의 감소를 나타냈으며 (도 9), CFU 평균 카운트는 3 CFU였다. 이들 결과는 rpoB (478V)가 형질전환 효율에서 3배를 넘는 증가를 야기함을 시사한다.
이와는 대조적으로, rpoB (V478A) 폴리펩티드 및 변형된 rpoC 폴리펩티드 (D796G)를 포함/코딩하는 변형된 비. 리케니포르미스 숙주 세포 (즉, 숙주 세포 3; 도 11 참조)는, 모 (대조) 숙주 세포에 비하여 형질전환 효율에서 14배를 넘는 증가 (도 9) 및 숙주 세포 2에 비하여 형질전환 효율에서 73배를 넘는 증가 (도 10)를 나타냈으며, 이는 rpoC "D796G" 돌연변이가 비. 리케니포르미스의 형질전환 효율에 대해 유의하고 긍정적인 영향을 줌을 나타낸다.
참고문헌
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국제 공개 제2010/14483호
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미국 특허 제8,361,755호
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Leu Pro Val Ile Pro Pro Glu Leu Arg Pro 225 230 235 240 Met Val Gln Leu Asp Gly Gly Arg Phe Ala Thr Ser Asp Leu Asn Asp 245 250 255 Leu Tyr Arg Arg Val Ile Asn Arg Asn Asn Arg Leu Lys Arg Leu Leu 260 265 270 Asp Leu Gly Ala Pro Ser Ile Ile Val Gln Asn Glu Lys Arg Met Leu 275 280 285 Gln Glu Ala Val Asp Ala Leu Ile Asp Asn Gly Arg Arg Gly Arg Pro 290 295 300 Val Thr Gly Pro Gly Asn Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ser His Met Leu 305 310 315 320 Lys Gly Lys Gln Gly His Phe Arg Gln Asn Leu Leu Gly Lys Arg Val 325 330 335 Asp Tyr Ser Gly Arg Ser Val Ile Val Val Gly Pro Asn Leu Lys Met 340 345 350 Tyr Gln Cys Gly Leu Pro Lys Glu Met Ala Leu Glu Leu Phe Lys Pro 355 360 365 Phe Val Met Lys Glu Leu Val Glu Lys Gly Leu Ala His Asn Ile Lys 370 375 380 Ser Ala Lys Arg Lys Ile Glu Arg Val Gln Pro Glu Val Trp Asp Val 385 390 395 400 Leu Glu Ser Val Ile Lys Glu His Pro Val Leu Leu Asn Arg Ala Pro 405 410 415 Thr Leu His Arg Leu Gly Ile Gln Ala Phe Glu Pro Thr Leu Val Glu 420 425 430 Gly Arg Ala Ile Arg Leu 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Gly Phe Lys Tyr Ser Thr Lys Ala Gly Ile 645 650 655 Thr Val Gly Val Ser Asp Ile Val Val Leu Asp Asp Lys Gln Glu Ile 660 665 670 Leu Glu Glu Ala Gln Gly Lys Val Asp Asn Val Met Lys Gln Phe Arg 675 680 685 Arg Gly Leu Ile Thr Glu Glu Glu Arg Tyr Glu Arg Val Ile Ser Ile 690 695 700 Trp Ser Ala Ala Lys Asp Thr Ile Gln Gly Lys Leu Met Lys Ser Leu 705 710 715 720 Asp Glu Ile Asn Pro Ile Tyr Met Met Ser Asp Ser Gly Ala Arg Gly 725 730 735 Asn Ala Ser Asn Phe Thr Gln Leu Ala Gly Met Arg Gly Leu Met Ala 740 745 750 Asn Pro Ala Gly Arg Ile Ile Glu Leu Pro Ile Lys Ser Ser Phe Arg 755 760 765 Glu Gly Leu Thr Val Leu Glu Tyr Phe Ile Ser Thr His Gly Ala Arg 770 775 780 Lys Gly Leu Ala Asp Thr Ala Leu Lys Thr Ala Asp Ser Gly Tyr Leu 785 790 795 800 Thr Arg Arg Leu Val Asp Val Ala Gln Asp Val Ile Ile Arg Glu Thr 805 810 815 Asp Cys Gly Thr Asp Arg Gly Ile Leu Ala Lys Ala Ile Thr Glu Gly 820 825 830 Thr Glu Val Ile Glu Arg Leu Glu Glu Arg Leu Val Gly Arg Phe Ala 835 840 845 Arg Lys Pro Val Lys His Pro Glu Thr Gly Glu Val Leu Val Asn Glu 850 855 860 Asn Glu Leu Ile Asp Glu Asp Lys Ala Ile Glu Ile Val Glu Ala Gly 865 870 875 880 Ile Glu Glu Val Trp Ile Arg Ser Ala Phe Thr Cys Asn Thr Ser His 885 890 895 Gly Val Cys Lys Arg Cys Tyr Gly Arg Asn Leu Ala Thr Gly Thr Asp 900 905 910 Val Glu Val Gly Glu Ala Val Gly Ile Ile Ala Ala Gln Ser Ile Gly 915 920 925 Glu Pro Gly Thr Gln Leu Thr Met Arg Thr Phe His Thr Gly Gly Val 930 935 940 Ala Gly Asp Asp Ile Thr Gln Gly Leu Pro Arg Ile Gln Glu Leu Phe 945 950 955 960 Glu Ala Arg Asn Pro Lys Gly Gln Ala Thr Ile Ser Glu Ile Asp Gly 965 970 975 Val Val Ala Glu Ile Asn Glu Val Arg Asp Lys Gln Gln Glu Ile Val 980 985 990 Val Gln Gly Glu Val Glu Ser Arg Ser Tyr Thr Ala Pro Tyr Asn Ala 995 1000 1005 Arg Leu Lys Val Thr Glu Gly Glu Lys Ile Ser Arg Gly Gln Val Leu 1010 1015 1020 Thr Glu Gly Ser Val Asp Pro Lys Glu Leu Leu Lys Val Thr Asp Ile 1025 1030 1035 1040 Thr Thr Val Gln Glu Tyr Leu Leu His Glu Val Gln Lys Val Tyr Arg 1045 1050 1055 Met Gln Gly Val Glu Ile Gly Asp Lys His Val Glu Val Met Val Arg 1060 1065 1070 Gln Met Leu Arg Lys Val Arg Val Ile Asp Ala Gly Asp Thr Glu Val 1075 1080 1085 Leu Pro Gly Thr Leu Leu Asp Ile His Gln Phe Thr Glu Ala Asn Lys 1090 1095 1100 Lys Val Leu Leu Glu Gly Lys Arg Pro Ala Thr Gly Arg Pro Val Leu 1105 1110 1115 1120 Leu Gly Ile Thr Lys Ala Ser Leu Glu Thr Asp Ser Phe Leu Ser Ala 1125 1130 1135 Ala Ser Phe Gln Glu Thr Thr Arg Val Leu Thr Asp Ala Ala Ile Lys 1140 1145 1150 Gly Lys Arg Asp Glu Leu Leu Gly Leu Lys Glu Asn Val Ile Ile Gly 1155 1160 1165 Lys Leu Val Pro Ala Gly Thr Gly Met Leu Asn Tyr Arg Lys Val Lys 1170 1175 1180 Pro Val Leu Gln Val Gln Ser Ser Asp Glu Met Val Pro Ala Glu 1185 1190 1195 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 9 cgattaggga taacagggta atat 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 10 cgatattacc ctgttatccc taat 24 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 11 tcggaattcc gagccgtatg ggtcttgt 28 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 12 taagtcgact tattcagccg gaaccatttc 30 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 13 ctcgtgcacc caactgatct tcag 24 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 14 ctgcgtccgt tatcgatcaa tgcgtc 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 15 cagctaagga tacgatccaa ggcaag 26 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 16 tcgctttatc ttcgtcgatc agctc 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 17 ggcaagctga tgaaatcctt ggatg 25 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 18 tatgcggccg catattccgc attcgcaatg cctac 35 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 19 tttgcggccg caaaataaaa aaacggattt ccttcagg 38 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 20 taaggcggat cctcttcagg aagaatctta gagataacac 40 <210> 21 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 21 ggttcgtctg atccatgaat ttagaaagct gtgagcttcc aaag 44 <210> 22 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 22 ctttggaagc tcacagcttt ctaaattcat ggatcagacg aacc 44 <210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 23 ctcactaatt accctgttat ccctattata actagagatt attcttttgt tactacatcg 60 60 <210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 24 ctttggaagc tcacagcttt ctcgattcat ggatcagacg aacc 44 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 25 ggttcgtctg atccatgaat cgagaaagct gtgagcttcc aaag 44 <210> 26 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 26 gacgaacccg cttgctgaat taacgtacaa gcgtcgtctg tcagcattag gac 53 <210> 27 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 27 gtcctaatgc tgacagacga cgcttgtacg ttaattcagc aagcgggttc gtc 53 <210> 28 <211> 800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide synthetic construct <400> 28 ctctagttat aatagggata acagggtaat tagtgaggag gatatatttg aatacatacg 60 aacaaattaa taaagtgaaa aaaatacttc ggaaacattt aaaaaataac cttattggta 120 cttacatgtt tggatcagga gttgagagtg gactaaaacc aaatagtgat cttgactttt 180 tagtcgtcgt atctgaacca ttgacagatc aaagtaaaga aatacttata caaaaaatta 240 gacctatttc aaaaaaaata ggagataaaa gcaacttacg atatattgaa ttaacaatta 300 ttattcagca agaaatggta ccgtggaatc atcctcccaa acaagaattt atttatggag 360 aatggttaca agagctttat gaacaaggat acattcctca gaaggaatta aattcagatt 420 taaccataat gctttaccaa gcaaaacgaa aaaataaaag aatatacgga aattatgact 480 tagaggaatt actacctgat attccatttt ctgatgtgag aagagccatt atggattcgt 540 cagaggaatt aatagataat tatcaggatg atgaaaccaa ctctatatta actttatgcc 600 gtatgatttt aactatggac acgggtaaaa tcataccaaa agatattgcg ggaaatgcag 660 tggctgaatc ttctccatta gaacataggg agagaatttt gttagcagtt cgtagttatc 720 ttggagagaa tattgaatgg actaatgaaa atgtaaattt aactataaac tatttaaata 780 acagattaaa aaaattataa 800 <210> 29 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 29 ctatttaaat aacagattaa aaaaattata aaactggtat ggaatacgta tcagg 55 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 30 gaagcaagac cgatgttcat atactc 26 <210> 31 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoC amino acid residue 461 through amino acid residue 500 of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 <400> 31 Leu Ser Ala Glu Ala Gln Ala Glu Ala Arg Ile Leu Met Leu Ala Ala 1 5 10 15 Gln Asn Ile Leu Asn Pro Lys Asp Gly Lys Pro Val Val Thr Pro Ser 20 25 30 Gln Asp Met Val Leu Gly Asn Tyr 35 40 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 32 caagaattct tgacaggtca actagttcag tatg 34 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 33 gtagcggccg ctaccctgtc acttgcgtat aaaattc 37 <210> 34 <211> 579 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 34 atgagcacag aggatatgac aaaggatacg tatgaagtaa acagttcgac aatggctgtc 60 ctgcctctgg gagaggggga gaaacccgcc tcaaaaatac ttgagaccga caggactttc 120 cgcgtcaata tgaagccgtt tcaaattatc gaaagaagct gccgctattt cggatcgagc 180 tatgcgggaa gaaaagcggg cacatatgaa gtcattaaag tttcccataa accgccgatc 240 atggtggatc actcaaacaa catttttctt ttccccacat tttcctcaac tcgtcctcag 300 tgcgggtggc tttcccatgc gcatgttcac gagttttgcg cggcaaagta tgacaacacg 360 tttgtcacgt ttgtcaacgg ggaaacgctg gagctgcccg tatccatctc atctttcgaa 420 aaccaggttt accgaacggc atggctgaga acaaaattta tcgacaggat tgaaggaaac 480 cccatgcaga agaaacagga atttatgctc tatccgaaag aagaccggaa tcagctgata 540 tacgaattca tcctcaggga gctgaaaaag cgctattga 579 <210> 35 <211> 192 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 35 Met Ser Thr Glu Asp Met Thr Lys Asp Thr Tyr Glu Val Asn Ser Ser 1 5 10 15 Thr Met Ala Val Leu Pro Leu Gly Glu Gly Glu Lys Pro Ala Ser Lys 20 25 30 Ile Leu Glu Thr Asp Arg Thr Phe Arg Val Asn Met Lys Pro Phe Gln 35 40 45 Ile Ile Glu Arg Ser Cys Arg Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Ala Gly Arg 50 55 60 Lys Ala Gly Thr Tyr Glu Val Ile Lys Val Ser His Lys Pro Pro Ile 65 70 75 80 Met Val Asp His Ser Asn Asn Ile Phe Leu Phe Pro Thr Phe Ser Ser 85 90 95 Thr Arg Pro Gln Cys Gly Trp Leu Ser His Ala His Val His Glu Phe 100 105 110 Cys Ala Ala Lys Tyr Asp Asn Thr Phe Val Thr Phe Val Asn Gly Glu 115 120 125 Thr Leu Glu Leu Pro Val Ser Ile Ser Ser Phe Glu Asn Gln Val Tyr 130 135 140 Arg Thr Ala Trp Leu Arg Thr Lys Phe Ile Asp Arg Ile Glu Gly Asn 145 150 155 160 Pro Met Gln Lys Lys Gln Glu Phe Met Leu Tyr Pro Lys Glu Asp Arg 165 170 175 Asn Gln Leu Ile Tyr Glu Phe Ile Leu Arg Glu Leu Lys Lys Arg Tyr 180 185 190 <210> 36 <211> 579 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 36 atgagcacag aggatatgac aaaggatacg tatgaagtaa acagttcgac aatggctgtc 60 ctgcctctgg gtgaggggga gaaatccgcc tcaaaaatac ttgagaccga caggactttc 120 cgcgtcaata tgaagccgtt tcaaattatc gaaagaagct gccgctattt cggatcgagc 180 tatgcgggaa gaaaagcggg cacatatgaa gtcattaaag tttcccataa accgccgatc 240 atggtggatc actcaaacaa catttttctt ttccccacat tttcctcaac tcgtcctcag 300 tgcgggtggc tttcccatgc gcatgttcac gagttttgcg cggcaaagta tgacaacacg 360 tttgtcacgt ttgtcaacgg ggaaacgctg gagctgcccg tatccatctc atctttcgaa 420 aaccaggttt accgaacggc atggctgaga acaaaattta tcgacaggat tgaaggaaac 480 cccatgcaga agaaacagga atttatgctc tatccgaaag aagaccggaa tcagctgata 540 tacgaattca tcctcaggga gctgaaaaag cgctattga 579 <210> 37 <211> 192 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 37 Met Ser Thr Glu Asp Met Thr Lys Asp Thr Tyr Glu Val Asn Ser Ser 1 5 10 15 Thr Met Ala Val Leu Pro Leu Gly Glu Gly Glu Lys Ser Ala Ser Lys 20 25 30 Ile Leu Glu Thr Asp Arg Thr Phe Arg Val Asn Met Lys Pro Phe Gln 35 40 45 Ile Ile Glu Arg Ser Cys Arg Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Ala Gly Arg 50 55 60 Lys Ala Gly Thr Tyr Glu Val Ile Lys Val Ser His Lys Pro Pro Ile 65 70 75 80 Met Val Asp His Ser Asn Asn Ile Phe Leu Phe Pro Thr Phe Ser Ser 85 90 95 Thr Arg Pro Gln Cys Gly Trp Leu Ser His Ala His Val His Glu Phe 100 105 110 Cys Ala Ala Lys Tyr Asp Asn Thr Phe Val Thr Phe Val Asn Gly Glu 115 120 125 Thr Leu Glu Leu Pro Val Ser Ile Ser Ser Phe Glu Asn Gln Val Tyr 130 135 140 Arg Thr Ala Trp Leu Arg Thr Lys Phe Ile Asp Arg Ile Glu Gly Asn 145 150 155 160 Pro Met Gln Lys Lys Gln Glu Phe Met Leu Tyr Pro Lys Glu Asp Arg 165 170 175 Asn Gln Leu Ile Tyr Glu Phe Ile Leu Arg Glu Leu Lys Lys Arg Tyr 180 185 190

Claims (37)

  1. 비변형 그람(Gram) 양성 박테리아 세포에 비하여 증가된 양의 관심 대상의 단백질(protein of interest; POI)을 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포로서, 변이형 RNA-폴리머라아제 (RNAP) β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형 세포.
  2. 제1항에 있어서, 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 변형된 세포의 염색체 내로 통합된 변형 세포.
  3. 제1항에 있어서, 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 변형 세포의 염색체외 플라스미드 상에 포함되는 변형 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 야생형 rpoC 유전자, 또는 서열 번호 5에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체로부터 유래되는 변형 세포.
  5. 제1항에 있어서, rpoC 유전자는 서열 번호 6에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 변형 세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 야생형 rpoC 유전자, 또는 서열 번호 5에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체로부터 유래되는 변형 세포.
  7. 제1항에 있어서, rpoC 유전자는 서열 번호 8에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 변형 세포.
  8. 제5항에 있어서, 서열 번호 6의 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 6의 아미노산 잔기 위치 751, 784, 797, 796 및/또는 1018 내지 1020, 또는 임의의 박테리아 RNAP β′-서브유닛 패밀리 구성원에서의 등가의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형 세포.
  9. 제1항에 있어서, 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 6의 아미노산 잔기 751에서의 메티오닌의 이소류신으로의 치환 (M751I), 서열 번호 6의 아미노산 잔기 784에서의 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 (R784H), 서열 번호 6의 아미노산 잔기 797에서의 세린의 페닐알라닌으로의 치환 (S797F), 서열 번호 6의 아미노산 잔기 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환 (D796G), 및/또는 서열 번호 6의 아미노산 잔기 1,018, 1,019 및 1,020의 결실 (ΔI1018-R1020)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형 세포.
  10. 제7항에 있어서, 서열 번호 8의 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 위치 751, 784, 797, 796 및/또는 1018 내지 1020, 또는 임의의 박테리아 RNAP β′-서브유닛 패밀리 구성원에서의 등가의 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형 세포.
  11. 제1항에 있어서, 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 751에서의 메티오닌의 이소류신으로의 치환 (M751I), 서열 번호 8의 아미노산 잔기 784에서의 아르기닌의 히스티딘으로의 치환 (R784H), 서열 번호 8의 아미노산 잔기 797에서의 세린의 페닐알라닌으로의 치환 (S797F), 서열 번호 8의 아미노산 잔기 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환 (D796G), 및/또는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 1,018, 1,019 및 1,020의 결실 (ΔI1018-R1020)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형 세포.
  12. 제1항에 있어서, 변이형 RNAP β-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoB 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 변형 세포.
  13. 제1항에 있어서, 비변형 그람 양성 대조 세포에 비하여 발현 POI의 증가된 양이 5% 이상인 변형 세포.
  14. 제1항에 있어서, 비변형 그람 양성 대조 세포에 비하여 발현 POI의 증가된 양이 10% 이상인 변형 세포.
  15. 제1항에 있어서, 바실루스(Bacillus) 세포는 비. 서브틸리스(B. subtilis), 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 렌투스(B.　 lentus), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 스테아로서모필루스(B. stearothermophilus), 비. 알칼로필루스(B. alkalophilus), 비. 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 소노렌시스(B. sonorensis), 비. 할로두란스(B.　halodurans), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 라우투스(B. lautus), 비. 파불리(B. pabuli), 비. 세레우스(B. cereus), 비. 아가라드하에렌스(B. agaradhaerens), 비. 아키바이(B akibai), 비. 클라르키이(B. clarkii), 비. 슈도피르무스(B. pseudofirmus), 비. 레헨시스(B. lehensis), 비. 메가테륨(B. megaterium), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 서큐란스(B. circulans), 비. 깁소니이(B. gibsonii), 및 비. 튜린기엔시스(B. thuringiensis)로부터 선택되는 변형 세포.
  16. 제1항에 있어서, POI는 변형된 박테리아 세포에 대하여 외인성인 유전자 또는 변형된 박테리아 세포에 대하여 내인성인 유전자에 의해 코딩되는 변형 세포.
  17. 제1항의 변형 세포에 의해 생성된 단리된 관심 대상의 단백질 (POI).
  18. 그람 양성 박테리아 세포에서 관심 대상의 단백질 (POI)의 발현을 증가시키는 방법으로서,
    (a) 증가된 양의 POI를 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포를 수득하는 단계 (여기서, 상기 변형된 박테리아 세포는 변이형 RNA-폴리머라아제 (RNAP) β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함함), 및
    (b) 상기 변형 세포를 POI가 발현되게 하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하며,
    증가된 양의 POI를 발현하는 변형 박테리아 세포는 비변형 그람 양성 박테리아 세포에서의 POI의 발현에 관한 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 야생형 rpoC 유전자, 또는 서열 번호 5에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체로부터 유래되는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이형 β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자는 야생형 rpoC 유전자, 또는 서열 번호 7에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체로부터 유래되는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 변이형 RNAP β-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoB 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 비변형 그람 양성 대조 세포에 비하여 발현 POI의 증가된 양이 5% 이상인 방법.
  23. 제18항의 방법에 의해 생성된 단리된 관심 대상의 단백질 (POI).
  24. 증가된 양의 POI를 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포를 수득하는 방법으로서,
    (a) 하나 이상의 rpoC 유전자 변형을 모 그람 양성 박테리아 세포 내로 도입하는 단계, 및
    (b) 증가된 양의 POI를 발현하는 하나 이상의 딸세포를 선발하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 변이형 RNA-폴리머라아제 (RNAP) β′-서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 rpoC 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형된 rpoC 유전자를 포함하는 통합 벡터.
  26. 제25항의 통합 플라스미드를 포함하는 그람 양성 박테리아 세포.
  27. 형질전환된 바실루스 숙주 세포를 수득하는 방법으로서,
    (a) 프로모터 영역 5’을 포함하며 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제1 핵산 구축물의 하나 이상의 카피에 의해 수용성으로 만들어지는 바실루스 숙주 세포를 외인성 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 단계 (여기서, 변형 rpoC 폴리펩티드는 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하며, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 핵산 구축물의 도입 전에는 비-수용성었던 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및
    (b) 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바실루스 숙주 세포의 형질전환체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 수용성 바실루스 숙주 세포는 프로모터 영역 5’을 포함하고 숙주 세포가 더욱 더 수용성이 되게 만들기 위한 ComK 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제2 핵산 구축물의 하나 이상의 카피를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제27항의 방법에 의해 수득된 형질전환된 바실루스 숙주 세포.
  30. 수용성 바실루스 숙주 세포를 수득하는 방법으로서,
    (a) 프로모터 영역 5'을 포함하며 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 구축물의 하나 이상의 카피를 비-수용성 바실루스 숙주 세포 내로 도입하는 단계 (여기서, 변형 rpoC 폴리펩티드는 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하며, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및
    (b) 단계 (a)의 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 수용성 바실루스 숙주 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 수용성 바실루스 숙주 세포는 프로모터 영역 5’을 포함하고 ComK 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제2 핵산 구축물의 하나 이상의 카피를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제30항의 방법에 의해 수득된 수용성 바실루스 숙주 세포.
  33. 프로모터 영역 5'을 포함하며 서열 번호 8에 대한 90%의 서열 동일성 및 서열 번호 8의 위치 796에서의 아스파르트산의 글리신으로의 치환을 포함하는 변형 rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 구축물의 하나 이상의 카피를 포함하는 수용성 바실루스 숙주 세포로서, rpoC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 핵산 구축물의 도입 전에는 비-수용성었던 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드인, 수용성 바실루스 숙주 세포.
  34. 형질전환된 바실루스 숙주 세포를 수득하는 방법으로서,
    (a) 프로모터 영역 5’을 포함하며 rpoB 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 도입 제1 핵산 구축물의 적어도 하나의 카피에 의해 수용성으로 만들어지는 바실루스 숙주 세포를 외인성 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 단계 (여기서, 변형 rpoB 폴리펩티드는 서열 번호 4에 대하여 90%의 서열 동일성을 포함하며, 서열 번호 4의 위치 478에서 발린 잔기를 포함하고, rpoB 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 핵산 구축물의 도입 전에는 비-수용성었던 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및
    (b) 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바실루스 숙주 세포의 형질전환체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항의 방법에 의해 수득된 형질전환된 바실루스 숙주 세포.
  36. 수용성 바실루스 숙주 세포를 수득하는 방법으로서,
    (a) 프로모터 영역 5'을 포함하며 rpoB 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 구축물의 하나 이상의 카피를 비-수용성 바실루스 숙주 세포 내로 도입하는 단계 (여기서, rpoB 폴리펩티드는 서열 번호 4에 대하여 90%의 서열 동일성을 포함하며, 서열 번호 4의 위치 478에서 발린 잔기를 포함하고, rpoB 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바실루스 숙주 세포에 대하여 외래 폴리뉴클레오티드임), 및
    (b) 단계 (a)의 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 수용성 바실루스 숙주 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 제36항의 방법에 의해 수득된 형질전환된 바실루스 숙주 세포.
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