JP6750005B2 - Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ−リジン生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたＬ−リシンを生産する方法に関する。

Ｌ−リジンは必須アミノ酸の一種であり、動物飼料、人間の医薬品及び化粧品産業に使用されており、コリネバクテリウム属菌株やエスケリキア属菌株を用いた発酵によって生産されている。

コリネバクテリウム属菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特にコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）は、Ｌ−アミノ酸生産に多く用いられているグラム陽性の微生物である。Ｌ−リジンの生産のために、コリネバクテリウム属菌株において主にＬ−リジン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させるか、またはＬ−リジンの生合成に不要な遺伝子を除去するような目的物質の特異的な接近方法が主に用いられている。しかし、このような方法の他にも、Ｌ−リジン生産に関与しない遺伝子を除去する方法、具体的には機能が未知の遺伝子を除去する方法が用いられている。

そこで、本発明者らは、リジンの生産能を増加させ得る有効な形質を継続的に探索するために鋭意研究した結果、コリネバクテリウム属微生物の内在的遺伝子をランダムに欠損させて高濃度でＬ−リジンを生産する微生物を選別し、その微生物から、今までその機能が報告されていないタンパク質を暗号化する遺伝子が欠損した場合にＬ−リジン生産能が増加するということを確認して本発明を完成するに至った。

韓国１０−０８３８０３５Ｂ１（公告日２００８.０６.１２）

本発明の目的は、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供することである。

また、本発明の他の目的は、前記微生物を用いたＬ−リジン生産方法を提供することである。

上記目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が不活性化された、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。

また、本発明は、本発明の微生物を培地で培養するステップと；前記微生物または培地からＬ−リジンを回収するステップと；を含む、Ｌ−リジン生産方法を提供する。

本発明は、Ｌ−リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物において機能が未知の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を不活性化させてＬ−リジン生産能が増加された組換えコリネバクテリウム属微生物を提供し、前記組換えコリネバクテリウム属微生物は、Ｌ−リジンを高収率で生産することができるので、Ｌ−リジン生産において産業上有用に利用可能である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の第１の態様として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が不活性化された、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。

前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、コリネバクテリウム属微生物に内在的に存在するタンパク質や、機能が未知の推定上のタンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。

前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、特に具体的には９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含むことができる。前記配列と相同性を有する配列であって、実質的に配列番号１のアミノ酸配列と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であるならば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も本発明の範疇に含まれるということは自明である。

前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすることができるヌクレオチド配列であれば本発明の範疇に含まれるが、具体的には配列番号２のヌクレオチド配列を有することができる。また、前記配列番号２のヌクレオチド配列に対して８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、特に具体的には９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列も本発明に含まれ得る。また、遺伝暗号の縮退性（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に起因して同じアミノ酸配列をコードする前記配列の変異体も本発明に含まれ得る。

本発明において、用語「相同性」とは、与えられたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示することができる。本明細書において、与えられたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」と表される。

前記アミノ酸またはヌクレオチド配列に対する相同性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ [参照：Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）]やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ［参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている[参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ]。

本発明において、用語「不活性化」とは、前記内在的な遺伝子の発現が親菌株または変形前の菌株または野生型菌株に比べて低レベルに減少するか、または全く発現されない遺伝子、並びに発現されてもその活性がないかまたは減少している遺伝子が生成されることを意味することであり、当業界に知られている任意の不活性化方法により行われ得る。本発明において、不活性化の方法は、遺伝子内に一つ以上の塩基対の挿入による挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）突然変異、前記遺伝子内の一つ以上の塩基対の欠失を有する欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）突然変異、及び前記遺伝子内のナンセンスコドンを導入させる塩基対の遷移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）または切り換え（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ）突然変異からなる群より選択される一つ以上の突然変異によるものであるか、前記遺伝子の内在的プロモータをより弱いプロモーターに交換するか、前記遺伝子の全部または一部を欠損させる方法であってもよいが、本発明は、これらに限定されるものではない。

遺伝子を欠損させる方法としては、当業界に公知された遺伝子欠損方法を使用することができ、その方法は限定されるものではない。例えば、紫外線などの光又は化学物質を用いて突然変異を誘発し、得られた突然変異体から目的遺伝子が欠損した菌株を選別することができる。また、前記遺伝子の欠損方法は、例えば、目的遺伝子と相同性があるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を起こさせることにより得られる。また、前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターには優性選別マーカーを含むことができる。

前記ベクターは、目的タンパク質を不活性化させることができるが、使用可能であれば、天然の状態であるか組換えされた状態であるプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージであり得る。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺベクター、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを使用することができる。使用可能なベクターは、特に限定されるものではなく公知の発現ベクターを使用することができる。

前記ベクターの導入は、 当業界の通常の方法により容易に行うことができる。一般に、ＣａＣｌ_２沈殿法、ＣａＣｌ_２方法にジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）という還元物質を使用することにより効率を高めたＨａｎａｈａｎ法、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた形質転換法、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介された形質転換法などがある。

本発明において、用語「形質転換」とは、目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドが発現するか不活性化させることができるようにすることを意味する。前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質を暗号化するＤＮＡ及びＲＮＡまたは標的タンパク質の発現を減少させるプロモーターまたは標的タンパク質の発現を不活性化させることができるマーカー遺伝子などを含むことができる。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できさえすれば、どのような形で導入されてもよい。

前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が不活性になる親菌株としてはＬ−リジンを生産し得る微生物であれば制限なく使用できる。このような微生物としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属及びプロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属に属する微生物が挙げられる。具体的にはコリネバクテリウム属微生物、より具体的にはコリネバクテリウム・グルタミクムを使用することができる。

本発明において、用語「Ｌ−リジン生産能を有する微生物」とは、Ｌ−リジンを生産できるように一般的に公知された遺伝子を操作して得られた微生物であり得、例えば、Ｌ−アミノ酸の生産に関与するコリネバクテリウム属微生物に内在するａｓｐＢ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを暗号化する遺伝子）、ｌｙｓＣ（アスパラギン酸キナーゼを暗号化する遺伝子）、ａｓｄ（アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化する遺伝子）、ｄａｐＡ（ジヒドロジピコリン酸シンターゼを暗号化する遺伝子）、ｄａｐＢ（ジヒドロピコリン酸リダクターゼを暗号化する遺伝子）およびｌｙｓＡ（ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを暗号化する遺伝子）などのＬ−リジン生合成構成遺伝子からなる群より選択された遺伝子のうちのいずれか一つまたはそれ以上の発現を強化するようにして得られる微生物であり得る。また、突然変異処理、例えば、Ｌ−ロイシン栄養要求を導入した変異菌株にＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を処理して得られる微生物であり得る。

本発明の第二の様態として、本発明は、前記本発明の微生物を培地で培養するステップと；前記微生物または培地からＬ−リジンを回収するステップと；を含むＬ−リジン生産方法を提供する。

前記本発明の微生物は、前述した通りである。

本発明の方法において、コリネバクテリウム属微生物の培養は、当業界で知られている任意の培養条件及び培養方法が使用できる。

コリネバクテリウム属菌株培養のために使用できる培地としては、例えば、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）に開示された培地が使用できる。
培地に使用可能な糖源としては、ブドウ糖、サッカロース、乳糖、果糖、麦芽糖、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油油、ココナッツ油のようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、及び酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別にあるいは混合物の形態で使用できるが、本発明は、これらに限定されるものではない。

使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び窒酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別または混合物の形態で使用できるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

使用可能な燐源としては、燐酸二水素カリウムまたは燐酸水素二カリウムまたは相応するナトリウムを含有する塩が含まれ得る。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有し得る。最後に、前記物質に加えてアミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用されうる。また、培養培地に適切な前駆体が使用されうる。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方式により回分式または連続式で添加されうる。

前記微生物の培養中、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物または燐酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用して培養物のｐＨを調節できる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制できる。好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有の気体（例えば、空気）を注入できる。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、具体的には２５℃〜４０℃であり得る。培養時間は、所望のＬ−アミノ酸の生成量が得られるまで続けられるが、具体的には１０時間〜１６０時間であり得る。

本発明の方法において、培養の方法としては、バッチ工程、注入バッチ及び反復注入バッチ工程のような連続式または回分式が含まれる。このような培養方法は、当業者に周知であり、当業者によって選択される任意の方法が使用されうる。

Ｌ−リジンは、陰イオン交換クロマトグラフィ及び後続でニンヒドリン誘導体化によって分離且つ分析され得る。また、本発明の方法は、Ｌ−リジンを回収するステップを含む。微生物または培養培地からＬ−リジンを回収する方法は、当業界に広く知られている。前記Ｌ−リジン回収方法には、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィ、結晶化およびＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などが使用され得るが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

[実施例]
実施例１：トランスポゾンを用いたランダム突然変異ライブラリの作製
リジン生産能が増加された菌株を得るために下記の方法によりベクターライブラリを作製した。

まず、ＥＺ−Ｔｎ５（登録商標）＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して得られたプラスミドを、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（大韓民国登録特許番号第１０−０１５９８１２号；前記微生物はＫＦＣＣ１０８８１の番号で公開されたが、ブダペスト条約上の国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１０１６Ｐの寄託番号が与えられた）を親菌株として電気パルス法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｈｃｅｎｏｌ（１９９９）５２：５４１−５４５）により形質転換し、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンが含まれた複合平板培地に塗抹して約２０,０００個のコロニーを確保した。

＜複合平板培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１０ｇ、ペプトン１０ｇ、牛肉抽出物５ｇ、酵母抽出物５ｇ、脳心臓浸出液（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）１８.５ｇ、生理的食塩水（ＮａＣｌ）２.５ｇ、尿素２ｇ、ソルビトール９１ｇ、寒天２０ｇ（蒸留水１リットル基準）

実施例２：トランスポゾンを用いたランダム突然変異ライブラリスクリーニング
前記実施例１で確保された約２０,０００個のコロニーをそれぞれ３００μLの下記の選別培地に接種して９６ディープウェルプレート（９６−ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）で３２℃、１０００ｒｐｍで約２４時間培養した。

＜選別培地（ｐＨ８．０）＞
ブドウ糖１０ｇ、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）５.５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １.２ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０.８ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ １６.４ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣＬ １０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル基準）

培養液に生産されたＬ−リジンの生産量を分析するためにニンヒドリン方法を用いた（Ｍｏｏｒｅ，Ｓ.，Ｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.１９４８，１７６，３６７−３８８）。

培養が完了した後、培養上清１０μlとニンヒドリン反応溶液１９０μlとを６５℃で３０分間反応させた後、波長５７０ｎｍで分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて吸光度を測定し、対照群であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株と比較し、高い吸光度を示す変異菌株約６０種のコロニーを選別した。それ以外のコロニーは、対照群として用いられたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株と類似または減少した吸光度を示した。

前記選別された６０種の菌株を前記と同じ方法で再培養した後、ニンヒドリンの反応を繰り返し行い、その結果、親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐの菌株対比でＬ−リジン生産能の向上した上位１０種の突然変異株を選別した。

実施例３：選別されたランダム突然変異株のＬ−リジン生産能の分析
前記実施例２で選別された１０種の突然変異株を対象としてＬ−リジン生産能が再現性よく増加された菌株を最終選別するために、下記の培地を用いたフラスコ培養を実施した。培養が完了した後、ＨＰＬＣを用いて培養液内のＬ−リジン濃度を分析し、各突然変異株のＬ−リジン生産濃度を表１に示した。

＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）

＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形粉（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ、ＭｇＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ_３ ３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）。

前記選別された１０種の突然変異株のうちＬ−リジン生産能がある意味向上した菌株としてＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ｍｔ−１０が最終選別された。

実施例４：最終選別株におけるのＬ−リジン生産能増加の原因究明
本実施例では、前記実施例３で最終選別された変異体株を対象としてトランスポゾンのランダムな挿入により欠損した遺伝子を同定した。

ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ｍｔ−１０のＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを抽出して切断した後、連結して大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンが含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニーの２０種を選別した後、未知の遺伝子の一部が含まれているプラスミドを取得し、ＥＺ−Ｔｎ５（登録商標）＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ ＫＡＮ−２＞ Ｔｎｐ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ（登録商標）Ｋｉｔのプライマー１（配列番号３）及びプライマー２（配列番号４）を使用して塩基配列を分析した結果、 米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）に報告された塩基配列に基づいて、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が不活性化されていることが確認された。

プライマー１（配列番号３）：ＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣＣ
プライマー２（配列番号４）：ＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴ

実施例５：配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子欠損のための組換えベクター作製
コリネバクテリウム属菌株の染色体上で前記実施例４で確認された配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させることができる組換えベクターを作製するために、前記遺伝子の欠損のための断片を作製するためにプライマー３〜６を合成し、それを表２に示した。

配列番号２に基づいてＯＲＦ部分を欠損するために、５'末端にＥｃｏＲ Ｉ制限酵素部位を、３'末端にＳａｌ Ｉ制限酵素部位をそれぞれ有するようにプライマー３（配列番号５）、プライマー４（配列番号６）、プライマー５（配列番号７）、プライマー６（配列番号８）（表２）を合成し、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ [Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ]を行った。その結果、配列番号２のヌクレオチド配列にコードされるタンパク質を暗号化する部分の上部５００ｂｐと下部５００ｂｐとが連結されたＤＮＡ断片を取得した。このとき、ＰＣＲの条件、すなわち、９５℃で３０秒の変性、５０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分の重合反応を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応させることにより、ＰＣＲを行った。コリネバクテリウム・グルタミクム内で複製が不可能なｐＤＺベクター（大韓民国特許登録番号第１０−０９２４０６５号）とＰＣＲで増幅された前記断片を染色体導入用の制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＳａｌ Ｉで処理し、ＤＮＡ接合酵素を用いて連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンが含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。

ＰＣＲを介して、前記目的とした遺伝子が挿入されたプラスミドで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を用いてプラスミドを取得し、そのプラスミドをｐＤＺ−△ＭＴ８ＥＨと命名した。

実施例６：コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来の配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が欠損した菌株の作製及びＬ−リジン生産能の評価
前記実施例５で作製した組換えプラスミドｐＤＺ−△ＭＴ８ＥＨを、染色体上における相同組換えによって、Ｌ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１−５４５，１９９９）。

その後、４％のスクロースを含む固体平板培地で２次組換えを行った。２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミクム形質転換株を対象として、プライマー３及びプライマー６を用いてＰＣＲ法により染色体上で配列番号２の遺伝子が欠損した菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ＭＴ８ＥＨと命名した。

前記作製されたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ＭＴ８ＥＨ菌株のＬ−リジン生産能を分析するために、親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株と共に以下のような方法により培養した。

下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに、親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐと実施例６で作製された菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ＭＴ８ＥＨとを接種し、 ３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。前記種培地と生産培地との組成は、それぞれ下記の通りである。

＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０g、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、 Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣＬ１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル基準）

＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形粉（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ、ＭｇＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ_３ ３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）。

培養終了後、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ２４７８）によりＬ−リジンの生産量を測定し、分析したＬ−リジンの濃度を表３に示した。

上記結果に示すように、Ｌ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐから配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させた場合、親菌株に比べてＬ−リジン生産能が平均３２％増加したことが確認された。

したがって、コリネバクテリウム属微生物から配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させることによりＬ−リジン生産能を向上させることができるということが確認された。

上記結果から、Ｌ−リジン生産菌株から配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させて機能が未知の推定上のタンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）を不活性化させることによりＬ−リジン生産能を増加させるという効果が確認され、前記菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ＭＴ８ＥＨをＣＡ０１−２２９５と命名し、２０１５年５月１５日に韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託してそれぞれＫＣＣＭ１１６９７Ｐの寄託番号が与えられた。

実施例７：コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ由来の配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が欠損した菌株の作製及びＬ−リジン生産能評価
Ｌ−リシンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミクムに属する菌株においても上述した効果と同様の効果が得られるかを確認するために、前記実施例６と同様の方法でＬ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（上記微生物は、ＫＦＣＣ１０７５０の番号で公開されたが、ブダペスト条約上の国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１３４７Ｐの番号が与えられた。韓国登録特許第１０−００７３６１０号公報）を対象として、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が欠損した菌株を作製してＫＣＣＭ１１３４７Ｐ−ＭＴ８ＥＨと命名した。

前記実施例６と同様の方法で培養し、培養終了後にＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ２４７８）によりＬ−リジンの生産量を測定し、分析したＬ−リジンの濃度を下記表４に示した。

上記結果に示すように、Ｌ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３４７Ｐを対象として、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させた場合、Ｌ−リジン生産能が平均２５％増加したことが確認された。

したがって、実施例６の結果と同様に、コリネバクテリウム属微生物から、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させることによりＬ−リジン生産能を向上させることができるということが確認された。

実施例８：コリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ由来の配列番号２のヌクレオチドティード配列を含む遺伝子が欠損した菌株の作製及びＬ−リジン生産能の評価

Ｌ−リシンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミクムに属する菌株においても上述した効果と同様の効果が得られるかを確認するために、前記実施例６と同様の方法で 野生株に３種の変異［ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ）、ｈｏｍ（Ｖｌ５９Ａ）、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１１Ｉ）］を導入し、Ｌ−リジン生成能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１３：Ｒ４０）を対象として、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が欠損した菌株を作製してＣＪ３Ｐ−ＭＴ８ＥＨと命名した。

前記実施例６と同様の方法で培養し、培養終了後にＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ２４７８）によりＬ−リジンの生産量を測定し、分析したＬ−リジンの濃度を下記表５に示した。

上記結果に示すように、Ｌ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐを対象として、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させた場合、Ｌ−リジン生産能が平均２３％増加したことが確認された。

したがって、実施例６及び実施例７の結果と同様に、コリネバクテリウム属微生物から、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させることによりＬ−リジン生産能を向上させることができるということが確認された。

［受託番号］
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１６９７Ｐ
受託日：２０１５０５１５

Claims (3)

1. 配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が不活性化された、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクム微生物。
2. 前記タンパク質は、配列番号２の塩基配列を有する遺伝子によってコードされる、請求項１に記載のＬ−リジン生産能を有する微生物。
3. 請求項１又は２による微生物を培地で培養するステップと；
   前記微生物または培地からＬ−リジンを回収するステップと；を含む、
   Ｌ−リジンを生産する方法。