KR20210042207A - 카다베린 흡수 시스템을 이용한 글루타릭산의 생산방법 - Google Patents

카다베린 흡수 시스템을 이용한 글루타릭산의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 배지내 카다베린을 흡수하고, 흡수된 카다베린을 이용하여 글루타릭산을 생산할 수 있도록 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 patA 유전자, patD 유전자, puuP 유전자, davT 유전자 및 davD 유전자가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 글루타릭산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환체를 사용하면, 카다베린의 형성을 통한 리신의 손실을 방지할 수 있으므로, 글루타릭산의 효율적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

카다베린 흡수 시스템을 이용한 글루타릭산의 생산방법{Process for preparing glutaric acid using cadaverine uptake system}
본 발명은 카다베린 흡수 시스템을 이용한 글루타릭산의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 배지내 카다베린을 흡수하고, 흡수된 카다베린을 이용하여 글루타릭산을 생산할 수 있도록 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 patA 유전자, patD 유전자, puuP 유전자, davT 유전자 및 davD 유전자가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 글루타릭산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
전 세계적인 석유수급 불안과 석유자원 고갈, 지구 온난화에 대한 위기의식으로 최근 산업 바이오 기술을 이용하여 바이오매스에서 유래한 대체 생산 방법이나 대체 화합물을 생산하기 위한 전 인류적인 노력이 바이오에너지, 바이오플라스틱, 바이오화합물 등의 다양한 분야에서 가시화되고 있다.
바이오매스를 활용하여 생산되는 바이오 플라스틱 시장의 경우 2002년 Natureworks사에 의해 상업화된 폴리유산 (Poly Lactic acid)이 연 14만 톤 규모로 생산되어 최근 시장이 급속히 확대되고 있다. PHA계 바이오플라스틱인 폴리-(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레레이트 {poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalarate) }(P(3HB-co-3HV))도 Metabolix와 ADM의 합작회사인 Telles에 의해 5만 톤 규모의 공장이 2010년 완공되어 제품이 시판되고 있다. 또한, 듀폰사가 생산하고 있는 바이오매스 기반의 1,3-프로판디올을 이용하여 PTT 고분자 제품이 현재 상용화되어 있다. 이외에도 숙신산 기반의 PBS 등도 활발히 개발되고 있다.
나일론 55와 나일론 45의 제조시 사용되는 C5의 글루타릭산(glutaric acid)은 주로 화학적 방법에 의해 생산하나, 바이오매스를 기반으로 제조하는 것도 가능하며, 미생물에서 자연적으로 생산되는 글루타릭산은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주에서 L-라이신의 이화작용 경로 중 중간체로서 생성됨이 보고된 바 있다.
슈도모나스 푸티다 균주에서 L-라이신(L-lysine)은 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB) 효소에 의해 5-아미노발레르아미드(5-aminovaleramide)로 전환되며, 상기 5-아미노발레르아미드는 델타-아미노발레르아미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소에 의해 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)으로 전환되고, 상기 5-아미노발레르산은 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT) 효소에 의해 글루타레이트 세미알데하이드(glutarate semialdehyde)로 전환되며, 상기 글루타레이트 세미알데하이드는 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소에 의해 글루타릭산(glutaric acid)으로 전환된다. 그러나 슈도모나스 푸티다 균주에서는 상기 과정에 의해 생산된 글루타릭산을 아세틸-CoA(acetyl-CoA)로 변환하는 과정을 더 포함한다.
재조합 균주를 이용하여 글루타릭산을 생산하는 종래 선행기술로서, 한국등록특허 제10-1271160호 및 선행논문 [Park, S. J. et al., Metab Eng., 42-47, 2013]에는 재조합 대장균 균주로부터 글루타릭산을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0132093호 및 선행논문 [Shin, J. H. et al., Microb Cell Fact., 15(1), 174, 2016]에는 재조합 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주로부터 글루타릭산을 제조하는 방법이 개시된 바 있다.
그러나, 글루타릭산의 원료가 되는 리신은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 발현되는 ldcC에 의해 카다베린으로 전환되는데, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 상기 카다베린을 이용하지 않기 때문에, 카다베린의 생성으로 인해 글루타릭산의 수율이 감소된다는 문제점이 해결되지 않고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 카다베린의 형태로 손실되는 리신의 손실을 방지할 수 있는 글루타릭산의 생산방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 카다베린의 흡수를 유도하는 puuP 유전자, 카다베린을 5-AVA로 전환시키는 patA 유전자 및 patD 유전자를 도입한 형질전환체를 이용할 경우, 배지내 카다베린을 흡수하여 이를 글루타릭산으로 전환시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2014-0132093호, 코리네박테리움 속 균주를 이용한 글루코스로부터 글루타릭산의 제조방법, 2014년 11월 17일, 공개. 한국등록특허 제10-1766964호, L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법, 2017년 08월 03일, 등록. 한국등록특허 제10-1271160호, 재조합 미생물을 이용한 글루타릭산의 제조 방법, 2013년05월 29일, 등록.
Park, S. J. et al., Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 5-aminovalerate and glutarate as C5 platform chemicals, Metab Eng., 42-47, 2013. Shin, J. H. et al., Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for enhanced production of 5-aminovaleric acid, Microb Cell Fact., 15(1), 174, 2016.
본 발명의 주된 목적은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 patA 유전자, patD 유전자, puuP 유전자, davT 유전자 및 davD 유전자가 도입된 글루타릭산 생산용 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 글루타릭산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 글루타릭산 생산용 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 글루타릭산 생산용 형질전환체는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 patA 유전자, patD 유전자, puuP 유전자, davT 유전자 및 davD 유전자가 도입된 형질전환체이다.
지금까지 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하여 글루타릭산을 생산하는 방법은 상기 균주에서 내재적으로 발현되는 davA, davB, davD 및 davT를 이용한 경로를 사용한다고 알려져 있다(도 1).
도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하여 글루타릭산(GTA)을 생산하는 경로를 나타내는 개략도이다.
도 1에서 보듯이, 배지에 포함된 리신은 davB에 의해 5-아미노발러아미드로 전환되고, 상기 5-아미노발러아미드는 davA에 의해 5-아미노발러레이트(5-AVA)로 전환되며, 상기 5-AVA는 davT 및 davD에 의해 글루타릭산(GTA)으로 전환된다.
한편, 배지에 포함된 리신은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 발현되는 ldcC에 의해 카다베린으로 전환되는데, 상기 카다베린은 patA 및 patD에 의해 5-AVA로 전환될 수 있으나, 상기 patA 및 patD는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 발현되지 않을 뿐만 아니라, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 상기 카다베린을 흡수하지 않는 것으로 알려져 있다.
상술한 바와 같이, 배지에서 생성되는 카다베린은 리신에 의해 생성되기 때문에, 카다베린의 생성으로 인하여 GTA의 생산성이 저하된다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 카다베린의 흡수를 유도하는 puuP 유전자, 카다베린을 5-AVA로 전환시키는 patA 유전자 및 patD 유전자를 도입한 형질전환체(patADpuup)를 제작하였다.
상기 제작된 형질전환체(patADpuup)는 puuP에 의해 배지에서 생성된 카다베린을 흡수할 수 있고, patA 및 patD에 의해 흡수된 카다베린을 5-AVA로 전환시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 형질전환체(patADpuup)에 의해 전환된 5-AVA로부터 GTA를 생산하기 위하여, davD 유전자 및 davT 유전자를 추가로 도입한 형질전환체(patADpuup+TD)를 제작하였다. 상기 제작된 형질전환체(patADpuup+TD)는 배지내 카다베린을 이용하여 GTA를 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
한편, GTA의 생산성을 향상시키기 위하여, 상기 형질전환체에 5-AVA 트랜스포터 유전자를 추가로 도입할 수 있다.
또한, 배지내 리신의 생산성을 향상시키기 위하여, aspartate-semialdehyde dehydrogenase를 코딩하는 asd 유전자를 상기 형질전환체에 추가로 도입하여, NADPH 의존 효소반응을 NADH 의존 효소반응으로 전환시킬 수 있다.
아울러, patA의 효소반응에 사용되는 α-ketoglutarate(AKG)의 손실을 방지하기 위하여, 상기 형질전환체에서 glutamate dehydrogenase를 코딩하는 gdh 유전자를 추가로 넉아웃시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태는, 상기 글루타릭산 생산용 형질전환체를 이용하여, 글루타릭산을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 글루타릭산 생산방법은 구체적으로, (a) 상기 글루타릭산 생산용 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 배양물로부터 글루타릭산을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미하며 플라스크배양(flask culture), 회분배양(batch culture)등이 포함되나 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 탄산 칼슘을 사용하여 적정 pH 를 유지할 수 있고, 쉐이킹 속도를 조절하여 호기성 조건을 유지할 수 있다. 또한, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있으며, 10 내지 160시간 동안 배양함이 바람직하다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 코리네박테리움 글루타미컴 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당 원으로는 글루코스, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인의 원료로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
본 발명의 형질전환체를 사용하면, 카다베린의 형성을 통한 리신의 손실을 방지할 수 있으므로, 글루타릭산의 효율적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하여 글루타릭산(GTA)을 생산하는 경로를 나타내는 개략도이다.
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 puuP 유전자의 도입여부에 따른, 카다베린과 5-아미노발러레이트(5-AVA)의 배지내 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 puuP 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 davTD 유전자의 도입여부에 따른, 리신, 카다베린, 5-AVA 및 GTA의 배지내 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: puuP 유전자가 도입된 형질전환체
먼저, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 patA 유전자, patD 유전자 및 puuP 유전자를 도입하여, 형질전환체(patADpuup)를 제작하였다.
상기 제작된 형질전환체(patADpuup)를 배양용 배지(50 g/L Glucose, 15 g/L Yeast Extract, 15 g/L (NH4)2SO4, 0.5 g/L KH2PO4, 0.5 g/L MgSO4·7H20, 0.01 g/L MnSO4·7H20, 0.01 g/L FeSO4)에 접종하고, 30℃ 및 250 rpm 조건에서 120시간 동안 배양하였다.
배양이 종료된 후, 배양 상등액을 대상으로 HPLC 분석을 수행하여 배양 상등액에 포함된 카다베린과 5-아미노발러레이트(5-AVA)의 농도를 측정하였다(도 2). 이때, 대조군으로는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 사용하고, 비교군으로는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 patA 유전자 및 patAD 유전자가 도입된 형질전환체(patAD)를 사용하였다.
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 puuP 유전자의 도입여부에 따른, 카다베린과 5-아미노발러레이트(5-AVA)의 배지내 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2에서 보듯이, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양할 경우에는, 배지에서 높은 수준의 카다베린과 극소량의 5-AVA가 검출된 반면; patA 유전자 및 patAD 유전자가 도입된 형질전환체(patAD)를 배양할 경우에는, 배지에서 낮은 수준의 카다베린과 높은 수준의 5-AVA가 검출되었으며; patA 유전자, patD 유전자 및 puuP 유전자가 도입된 형질전환체(patADpuup)를 배양할 경우에는, 배지에서 카다베린이 검출되지 않았고, 가장 높은 수준의 5-AVA가 검출됨을 확인하였다.
실시예 2: davTD 유전자가 추가로 도입된 형질전환체
상기 실시예 1에서 제작한 형질전환체(patADpuup)에, 5-AVA로부터 글루타릭산(GTA)의 합성에 이용되는 davT 유전자 및 davD 유전자를 추가로 도입한 형질전환체(patADpuup+TD)를 제작하였다.
상기 제작된 형질전환체(patADpuup+TD)를 실시예 1과 동일한 조건에서 배양하고, 배양이 종료된 후, 배양 상등액을 대상으로 HPLC 분석을 수행하여 배양 상등액에 포함된 리신, 카다베린, 5-AVA 및 GTA의 농도를 측정하였다(도 3). 이때, 비교군으로는 형질전환체(patADpuup)를 사용하였다.
도 3은 puuP 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 davTD 유전자의 도입여부에 따른, 리신, 카다베린, 5-AVA 및 GTA의 배지내 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3에서 보듯이, 비교군으로 사용된 형질전환체(patADpuup)에 비하여, davTD 유전자가 도입된 형질전환체(patADpuup+TD)에서는 5-AVA의 농도가 감소되고, GTA의 농도가 현저히 증가됨을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 patA 유전자, patD 유전자, puuP 유전자, davT 유전자 및 davD 유전자가 도입된 글루타릭산 생산용 형질전환체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 puuP 유전자는 배지내 카다베린의 흡수를 매개하는 것인, 글루타릭산 생산용 형질전환체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 patA 유전자 및 patD 유전자는 카다베린의 5-아미노발러레이트(5-AVA)로의 전환을 매개하는 것인, 글루타릭산 생산용 형질전환체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 davT 유전자 및 davD 유전자는 5-아미노발러레이트(5-AVA)의 글루타릭산(GTA)으로의 전환을 매개하는 것인, 글루타릭산 생산용 형질전환체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 형질전환체는 5-AVA 트랜스포터 유전자가 추가로 도입된 것인, 글루타릭산 생산용 형질전환체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 형질전환체는 asd 유전자가 추가로 도입된 것인, 글루타릭산 생산용 형질전환체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 형질전환체는 gdh 유전자가 추가로 넉아웃된 것인, 글루타릭산 생산용 형질전환체.
  8. (a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 글루타릭산 생산용 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 수득한 배양물로부터 글루타릭산을 회수하는 단계를 포함하는, 글루타릭산의 생산방법.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101271160B1 (ko) 2011-11-24 2013-06-04 한국화학연구원 재조합 미생물을 이용한 글루타릭산의 제조 방법
KR20140132093A (ko) 2013-05-07 2014-11-17 한국과학기술원 코리네박테리움 속 균주를 이용한 글루코스로부터 글루타릭산의 제조방법
KR101766964B1 (ko) 2015-08-27 2017-08-09 씨제이제일제당 (주) L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101271160B1 (ko) 2011-11-24 2013-06-04 한국화학연구원 재조합 미생물을 이용한 글루타릭산의 제조 방법
KR20140132093A (ko) 2013-05-07 2014-11-17 한국과학기술원 코리네박테리움 속 균주를 이용한 글루코스로부터 글루타릭산의 제조방법
KR101766964B1 (ko) 2015-08-27 2017-08-09 씨제이제일제당 (주) L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Park, S. J. et al., Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 5-aminovalerate and glutarate as C5 platform chemicals, Metab Eng., 42-47, 2013.
Shin, J. H. et al., Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for enhanced production of 5-aminovaleric acid, Microb Cell Fact., 15(1), 174, 2016.

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