KR20140132093A - 코리네박테리움 속 균주를 이용한 글루코스로부터 글루타릭산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루코스로부터 글루타릭산을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 당에서 L-라이신을 생합성하는 경로를 가지는 미생물에 라이신-2-모노옥시게나아제 효소를 코딩하는 유전자, 델타-아미노발레르아미다아제를 코딩하는 유전자, 5-아미노발레르산 아미노전이 효소를 코딩하는 유전자 및 탈수소 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글루타릭산 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 글루타릭산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 나일론 5의 모노머인 글루타릭산을 저가의 원료인 글루코스로부터 생산할 수 있는 효과가 있다.

Description

코리네박테리움 속 균주를 이용한 글루코스로부터 글루타릭산의 제조방법{Preparing Method of Glutarate from Glucose Using Corynebacterium sp．}

본 발명은 글루코스로부터 글루타릭산을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 당에서 L-라이신을 생합성하는 경로를 가지는 미생물에 라이신-2-모노옥시게나아제 효소를 코딩하는 유전자, 델타-아미노발레르아미다아제를 코딩하는 유전자, 5-아미노발레르산 아미노전이 효소를 코딩하는 유전자 및 탈수소 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글루타릭산 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 글루타릭산의 제조방법에 관한 것이다.

최근 전 세계적인 석유수급 불안과 석유자원 고갈에 대한 위기의식으로 최근에 산업 바이오 기술을 이용하여 바이오매스에서 유래한 대체 생산 방법이나 대체 화합물을 생산하기 위한 전 인류적인 노력이 바이오에너지, 바이오플라스틱, 바이오화합물 등의 다양한 분야에서 가시화되고 있다. 바이오매스를 활용하여 생산되는 바이오 플라스틱 시장의 경우 2002년 Natureworks사에 의해 상업화된 폴리유산 (Poly Lactic acid)이 연 14만 톤 규모로 생산되어 최근 시장이 급속히 확대되고 있다. PHA계 바이오플라스틱인 폴리-(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레레이트{poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalarate)}(P(3HB-co-3HV))도 Metabolix와 ADM의 합작회사인 Telles에 의해 5만 톤 규모의 공장이 2010년 완공되어 제품이 시판되고 있다. 또한, 듀폰사가 생산하고 있는 바이오매스 기반의 1,3-프로판디올을 이용하여 PTT 고분자 제품이 현재 상용화되어 있다. 이외에도 숙신산 기반의 PBS 등도 활발히 개발되고 있다. 상기 예로 든 바이오매스 유래 고분자의 단점 중의 하나는 낮은 내열성을 들 수 있다. 높은 내열성을 보유한 고분자의 대표적인 예는 나일론이다. 나일론 6과 나일론 6,6이 나일론 시장의 대부분을 차지하고 있지만 최근 생분해성 특성과 내열성을 동시에 지닌 나일론 4에 대한 관심이 높아지고 있다.

나일론 4의 원료물질인 2-피롤리돈은 감마 부티로락톤(gamma butyrolactone)으로부터 생산될 수 있으며 4-아미노부틸산의 탈수 고리반응에 의해 생산될 수 있다. 4-아미노부틸산의 경우 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)이라고도 하는데, 체내에서는 신경전달물질 억제효과에 의한 저혈압 및 진통효과가 있다고 알려져, 현재 식품 및 의약품 소재로 활용되고 있다(Erlander et al., Neurochem Res. 16: 215-226, 1991). 이러한 GABA는 글루타메이트를 원료로 글루타메이트 디카르복실라아제(Glutamate decarboxylase)에 의해 제조될 수 있는데, 현재까지 다양한 글루타메이트 디카르복실라아제가 보고되어 있으며(Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8491-8495, 1990; De Biase D et al., Protein Expression and Purification 8: 430-438, 1996; Kato Y et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 66: 2600-2605, 2002), 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하여 GABA를 생산하는 공정이 개발된바 있다. 나일론 4 이외에 최근에 나일론 5에 관한 관심 또한 높아지고 있다. 나일론 5의 모노머는 현재 라이신으로부터 유래된 다이아민인 카다베린(cadaverine)이 사용되고 있다.

본 발명자들은 L-라이신을 출발물질로하여 5-아미노발레르산을 제조하는 방법(대한민국 특허공개 10-2012-0103959호)을 개발하였다. 그러나, 상기 방법은 글루코스에 비하여 상대적으로 고가인 L-라이신을 배양배지에 출발물질로 첨가하여야 하였다.

이에, 본 발명자들은 글루코스를 출발물질로 하여 나일론 5의 또 다른 모노머로서 글루타릭산(Glutarate)을 생산하는 공정을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 글루코스로부터 L-lysine을 생산할 수 있는 대장균에서 lysine을 5-아미노발레르아미드로 전환하는 lysine 2-monooxygenase(DavB) 효소, 5-아미노발레르아미드를 5-아미노발레르산로 전환하는 delta-aminovaleramidase(DavA) 효소, α-ketoglutarate를 사용하여 5-아미노발레르산을 글루타릭산 세미알데히드(Glutarate semialdehyde)로 전환하는 5-aminovalic acid 아미노전이(GabT) 효소 및 글루타릭산 세미알데히드를 글루타릭산으로 전환하는 글루타릭산 세미알데히드 탈수소(GabD) 효소를 증폭시키는 경우, 글루코스로부터 글루타릭산이 생산되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 글루코스로부터 글루타릭산을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 글루코스로부터 글루타릭산의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라이신 생성능을 가지는 코리네박테리움 속 균주에서 라이신-2-모노옥시게나아제 효소를 코딩하는 유전자, 델타-아미노발레르아미다아제를 코딩하는 유전자가, 5-아미노발레르산 아미노전이 효소를 코딩하는 유전자 및 글루타릭산 세미알데히드 탈수소 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글루타릭산 생성능을 가지는 재조합 코리네박테리움을 제공한다.

본 발명은 또한, 라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 균주에서 L-lysine monooxygenase(DavB 유전자), 5-aminovaleramide amidase (DavA 유전자), 5-aminovalerate aminotrasnferase (GabT 유전자) 및 glutarate semialdehyde dehydrogenase (GabD 유전자)가 도입되어 있고, 글루타릭산 생성능을 가지는 재조합 코리네박테리움을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 코리네박테리움을 글루코스 함유하는 배지에서 배양하여 글루타릭산을 생산하는 단계; 및

(b) 상기 배양액으로부터 글루타릭산을 수득하는 단계를 포함하는 글루코스로부터 글루타릭산의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 나일론 5의 모노머인 글루타릭산을 저가의 원료인 글루코스로부터 생산할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 L-라이신으로부터 글루타릭산을 합성하는 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 DavA 유전자, DavB 유전자, GabT 유전자 및 GabD 유전자의 발현을 위한 발현벡터 pEKEx1_davABgabTD의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 재조합 미생물을 이용하여 글루코스로부터 글루타릭산을 합성하는 경로를 나타낸 것이다.

본 발명에서 “약화”란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시켜 해당유전자에 의해 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로의 일부 또는 상당부분을 차단하는 모든 것을 포함한다.

본 발명에서 “결실”이란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.

본 발명에서 “증폭”이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념이다.

도 1은 L-라이신으로부터 글루타릭산의 합성경로를 나타낸 모식도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, L-라이신으로부터 글루타릭산을 생합성하기 위하여는 L-라이신을 5-아미노발레르아미드로 전환하는 효소, 5-아미노발레르아미드를 5-아미노발레르산으로 전환하는 효소, 5-아미노발레르산을 글루타릭 세미알데히드로 전환하는 효소 및 글루타릭 세미알데히드를 글루타릭산으로 전화하는 효소가 필요하다.

따라서, 본 발명은 일관점에서, 당에서 L-라이신을 생합성하는 경로를 가지는 코리네박테리움 속 균주에서 라이신-2-모노옥시게나아제 효소를 코딩하는 유전자, 델타-아미노발레르아미다아제를 코딩하는 유전자, 5-아미노발레르산 아미노전이 효소를 코딩하는 유전자 및 글루타릭산 세미알데히드 탈수소 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글루타릭산 생성능을 가지는 재조합 코리네박테리움에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 코리네박테리움은 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium diptheriae, Corynebacterium granulosum, Corynebacterium haemolyticum, Corynebacterium minutissimun, Corynebacterium pyrogenes, Corynebacterium renale, Corynebacteriumrenailis Corynebacteriumulcerans 및 Corynebacterium ammoniagenes 으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 글루코스로부터 라이신을 생산하는 코리네박테리움 균주로 코리네박테리움 BE 를 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니며, 글루코스로부터 라이신을 생산할 수 있는 코리네박테리움 균주라면 어느 것이든 숙주세포로 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 도입은 라이신-2-모노옥시게나아제 효소를 코딩하는 유전자와 델타-아미노발레르아미다아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환되는 것을 특징으로 할 수 있다.

L-라이신을 5-아미노발레르아미드(5-aminovaleramide)로 전환하는 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase, DavB) 효소를 코딩하는 유전자와 5-aminovaleramide를 5-아미노발레르산로 전환하는 delta-aminovaleramidase(DavA) 효소를 코딩하는 유전자는 Pseudomonas putida ATCC12633의 염색체 유래 유전자를 사용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 라이신-2-모노옥시게나아제 효소를 코딩하는 유전자는 DavB, 델타-아미노발레르아미다아제를 코딩하는 유전자는 DavA, 5-아미노발레르산 아미노전이 효소를 코딩하는 유전자는 GabT 및 글루타릭산 세미알데히드 탈수소 효소를 코딩하는 유전자는 GabD 인 것을 균주의 염색체에 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 당에서 L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 균주에서 DavB 유전자, DavA 유전자, GabT 유전자 및 GabD 유전자가 도입되어 있고, 글루타릭산 생성능을 가지는 재조합 코리네박테리움에 관한 것이다.

용어 “벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.

“발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로,“작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어“형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어“형질감염”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다.

단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다.

본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 비바이러스 전달 방법은 전지천공법, 리포펙션, 미세주사, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가 양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론 및 화학물질 촉진 DNA 유입을 포함한다. 소소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있으며, 다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다. 리포펙션 방법은 미국특허 제5,049,386호, 미국특허 제4,946,787호 및 미국특허 제4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있으며, 예를 들어, Transfectam^TM 및 Lipofectin^TM 이 있다. 폴리뉴클레오티드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 Felgner의 지질을 포함하며 (WO91/17424 및 WO91/16024), 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다. 면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다 (Crystal, Science., 270:404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2:291-297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5:382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5:647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy., 2:710-722, 1995; Ahmad et al., Cancer Res., 52:4817-4820, 1992; 미국특허 제4,186,183호; 미국특허 제4,217,344호; 미국특허 제4,235,871호; 미국특허 제4,261,975호; 미국특허 제4,485,054호; 미국특허 제4,501,728호; 미국특허 제4,774,085호; 미국특허 제4,837,028호; 미국특허 제4,946,787호).

레트로바이러스의 친화성은 외부 외피 단백질과 일체화함으로써 변할 수 있어 표적 세포의 종류를 확대시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 형질도입 또는 감염시켜서 고바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 표적 조직에 따라 레트로바이러스 유전자 잔달 시스템이 결정된다. 레트로바이러스 벡터는 6-10kb 외부 서열을 포장할 수 있는 시스 액팅 긴 말단 반복을 포함한다. 벡터의 복제와 포장을 위해 충분한 최소의 시스 액팅 LTR은 영구적인 트랜스젠 발현을 위해 치료 유전자가 표적 세포로 통합되도록 사용할 수 있다.

또다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 미생물을 글루코스 함유하는 배지에서 배양하여 글루타릭산을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 배양액으로부터 글루타릭산을 수득하는 단계를 포함하는 글루코스로부터 글루타릭산의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 배양은 48 내지 96시간인 것이 바람직하고, 배양온도는 20 내지 40℃인 것이 바람직하고, 37℃인 것이 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 (b) 단계의 글루타릭산의 수득은 배양액을 분무 건조하여 저농도의 글루타릭산-함유 분말을 대량으로 얻을 수 있고, 배양액을 감압 증발기를 이용하여 농축한 후 동결건조를 진행하여 고농도의 글루타릭산 수득도 가능하며, 또한 이온교환수지를 이용한 정제방법을 사용한 후 농축 및 건조 공정을 수행하여 고순도의 글루타릭산의 수득할 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 상기 글루타릭산은 온도 및 pH의 변화에 크게 영향을 받지 않고, 공정 안정성이 있기 때문에 회수 공정상의 제한이 없다.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 글루코스로부터 L-라이신을 생합성능을 가지는 코리네박테리움 균주를 ysine 2-monooxygenase(DavB) 효소와 5-aminovaleramide를 5-aminovaleric acid로 전환하는 delta-aminovaleramidase(DavA) 효소를 코딩하는 유전자를 함유한 재조합 벡터로 형질전환하여 형질전환된 코리네박테리움 균주를 글루코스 및 글루코스와 라이신이 포함된 배지에서 배양한 후 글루타릭산 전환 생산능을 확인한 결과, 글루타릭산의 유의적인 전환 생산능을 확인하였다(표 1 및 표 2 참조).

본 발명의 재조합 벡터를 글루코스 함유 배지에서 배양하였을 때, 글루코스로부터 글루타릭산을 생합성하는 과정을 도 3에 나타내었다.

따라서, 본 발명의 재조합 코리네박테리움 균주는 글루타릭산을 저가로 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업게에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

하기 실시예에서는 글루코스로부터 L-라이신을 생산하는 균주로 E.coli XQ56만을 사용하였으나, 글루코스로부터 L-라이신을 생산하는 균주라면 제한없이 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

실시예 1: DavA, DavB, GabT 및 GabD 유전자 발현을 위한 발현 벡터의 제조

글루코스로부터 라이신을 생산하는 코리네박테리움속 균주로는 코리네박테리움 BE(KCTC 12390BP)를 사용하였다.

L-라이신을 5-아미노발레르아미드(5-aminovaleramide)로 전환하는 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase, DavB) 효소를 코딩하는 유전자, 5-aminovaleramide를 5-아미노발레르산으로 전환하는 delta-aminovaleramidase(DavA) 효소, 5-아미노발레르산을 글루타릭산 세미알데히드로 전환하는 5-aminovalic acid 아미노전이(GabT)효소 및 글루타릭산 세미알데히드를 글루타릭산으로 전환하는 글루타릭산 세미알데히드 탈수소(GabD) 효소를 코딩하는 유전자를 증폭한 재조합 Corynebacterium 을 배양하여 글루코스로부터 글루타릭산(Glutarate) 생산능을 확인하기 위하여, DavA, DavB, GabT 및 GabD 유전자를 발현하는 벡터를 제작하였다.

pEKEx1 (Eikmanns et al. Gene. 102, 93-98, 1991) 에 Corynebacterium BE에서 최적상태로 발현되도록 코돈 최전화한 Pseudomonas putida ATCC12633 의 DavA 유전자(서열번호 1) 및 DavB(서열번호 2) 유전자를 EcoRI/BamHI으로 삽입하여 pJS38를 제조하고, 　pJS38에 Pseudomonas putida KT2440 유래의 GabT유전자(서열번호 3)와 GabD 유전자(서열번호 4)를 각각 BamHI/SbfI 과 SbfI/HindIII로 삽입하여 pEKEx1DavABGabTD를 제조하여 상기 플라스미드로 형질전환된 Corynebacterium BE (pEKEx1DavABGabTD)를 제조하였다(도 2).

실시예 2: 글루코스로부터 글루타릭산(Glutarate) 생산능 확인

실시예 1에서 제작한 Corynebacterium BE (pKE112DavABGabTD)를 이용하여 5-아미노발레르산 생산능을 확인하기 위하여, 글루코스 80 g/L가 함유된 Lysine배지 플라스크 배양하였고, Lysine 배지(pH 7.2)의 조성은 1L를 기준으로 다음과 같다.

80g glucose, 1.0 g KH₂PO₄, 1.0g KHPO₄, 1.0g Urea, 20 g (NH₄)₂SO₄, 1.0 g MgSO₄, 10.0g Yeast extract, 1.0mg pyridoxal phosphate, 100μg biotin, 10mg β-alanine, 10mg thiamine, 10mg nicotinic acid, 1.3mg (NH₄)₆Mo₇O₂₄, 40mg CaCl₂, 10mg FeSO₄, 10mg MnSO₄, CuSO₄, and ZnSO₄, and 5mg NiCl₂.

그 결과, 글루코스로부터 글루타릭산이 유의적으로 생산되는 것을 확인하였다.

실시예 3: 유가식 배양을 통한 글루타릭산(Glutarate) 생산능 확인

5 L jar 발효기에서 Corynebacterium BE (pEKEx1DavABGabTD)를 글루코스 80 g/L 가 함유된 Lysine 배지에서 배양하였다. 첨가용액(Feeding solution)은 577 g/L 글루코스로 구성되었다.

배양 시작 후 OD600 이 5 가 되었을 때 IPTG 1 mM로 단백질 발현을 유도하였다. 그 결과, 글루코스로부터 글루타릭산이 유의적으로 생산되는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Daesang Co., Ltd <120> Preparing Method of Glutarate from Glucose Using Corynebacterium sp. <130> P13-B006 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 795 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 1 atgcgcatcg ctctgtacca gggcgcaccc aagccactgg atgtgcccgg caacctgcaa 60 cggctgcgcc accaggcgca gctggcagcc gaacgcggcg cacagttgct ggtgtgcccg 120 gagatgttcc tgaccggcta caacatcggc ctggcccagg tcgagcgcct ggccgaggcc 180 gccgatggcc cggcagccat gaccgtggta gagatcgccc aggcgcaccg catcgccatt 240 gtctatggct acccggagcg cggtgacgac ggggcgatct acaacagcgt gcagttgatc 300 gatgcgcatg gccgcagcct gagcaattac cgcaagacgc acctgttcgg tgaactggac 360 cgctcgatgt tcagccctgg tgcggaccac ttcccggtgg tggaactgga aggctggaag 420 gttggcctgc tgatctgcta cgacatcgag ttcccggaga acgcccgacg cctagcgctg 480 gacggcgccg agctgatcct ggtgccgacg gcgaacatga cgccgtacga ctttacctgc 540 caggtgaccg tgagagcgag ggcacaggaa aaccagtgct acctggtata tgccaactac 600 tgcggtgcgg aagacgagat tgagtattgc gggcagagca gcatcatcgg cccggatggc 660 agcttgctgg ccatggccgg gcgggatgag tgccagttgt tggcagagct tgaacatgag 720 cgggtggtgc aggggcgcac ggcgtttccc tacctgaccg atttgcgcca ggagctgcac 780 ctgcgtaaag gctga 795 <210> 2 <211> 1683 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 2 atgaacaaga agaaccgcca ccccgccgac ggcaagaagc cgatcaccat tttcggcccg 60 gacttccctt ttgctttcga cgactggctg gaacacccgg caggcctggg cagcattccg 120 gctgagcgcc atggggaaga ggtggccatt gtcggtgccg gtatcgccgg cctggtagcg 180 gcctacgagc tgatgaagct gggcctcaag ccggtggtgt acgaggcttc caagctgggc 240 ggccggctgc gctcgcaagc cttcaatggc actgacggga tcgttgccga actgggtggc 300 atgcgcttcc cggtgtcgtc caccgccttc taccactacg tcgacaagct gggcctggaa 360 accaagccct tccccaaccc gctgaccccg gcttcgggca gcacggtgat cgacctggaa 420 ggccagacct actacgccga gaagcccacc gacctgccac aactgtttca tgaggtagcc 480 gacgcctggg ccgatgcgct ggagagcggt gcgcagttcg ccgatatcca gcaggccatc 540 cgcgaccgtg atgtaccgcg cctgaaggaa ctttggaaca agctggtgcc gctgtgggac 600 gaccgcacct tctacgactt cgtcgccacc tcgcgctctt ttgccaagct gagcttccag 660 caccgcgaag tgttcggcca ggtcggtttc ggcaccggcg gttgggactc ggacttcccc 720 aactcgatgc tggaaatctt ccgcgtggtg atgaccaact gcgacgacca ccagcacctg 780 gtggtcgggg gcgtggaaca agtgccacaa ggcatctggc gccacgtacc ggaacgctgc 840 gtgcattggc cagagggcac cagcctgagc acgctgcatg gcggcgcacc gcgtaccggt 900 gtcaagcgca ttgcccgcgc ctccgatggc cgcctggcgg tcaccgacaa ctggggcgat 960 acccgccact acagcgcagt actcgccacc tgccagacct ggttgctgac cacccagatc 1020 gactgcgaag aatcgctgtt ctcgcaaaag atgtggatgg ccctggaccg tacccgctac 1080 atgcagtcgt cgaaaacctt cgtcatggtc gaccgcccgt tctggaagga caaggacccg 1140 gaaaccggcc gtgacctgct gagcatgacc ctcaccgatc gcctcacccg cggcacttac 1200 ctgttcgaca acggcaacga caagcccggg gtgatctgcc tgtcatactc gtggatgagc 1260 gacgcgctga agatgctgcc gcacccggtg gagaagcgcg tacaactggc cctggatgcg 1320 ctgaagaaga tctacccgaa gaccgatatc gccggccaca tcatcggcga cccgatcacg 1380 gtttcctggg aggccgaccc gtacttcctc ggcgccttca aaggcgcgct tccgggccat 1440 taccgctaca accagcgcat gtacgcgcac ttcatgcagc aggacatgcc ggcagagcag 1500 cgcggtatct tcattgctgg tgacgacgtg tcatggaccc ccgcctgggt tgaaggcgcg 1560 gtgcagacgt cgctgaatgc agtgtggggt atcatgaacc actttggtgg ccacacccac 1620 cccgacaacc cgggcccggg cgatgtgttc aacgaaatcg gcccgatcgc cctggcggat 1680 tga 1683 <210> 3 <211> 1443 <212> DNA <213> Pseudomonas putida KT2440 <400> 3 atgcagctca aagacgctca gttgttccgc cagcaagcct atatcaatgg tgagtggctg 60 gatgcggaca acggccagac catcaaggtg accaacccgg ccaccggcga agtcatcggt 120 accgtgccga agatgggtac cgcggaaacc cgccgcgcca tcgaagccgc cgacaaggcc 180 ctgccggcct ggcgtgccct gactgcgaaa gagcgctcgg ccaagctgcg tcgctggttc 240 gaactgatga tcgagaacca ggacgacctg gctcgcctga tgaccaccga acagggcaag 300 ccgctggccg aagccaaggg cgaaatcgcc tacgctgcct cgttcatcga gtggttcgcc 360 gaagaagcca agcgcatcta cggtgacacc atcccgggcc accagccaga caagcgcctg 420 attgtcatca agcagccaat cggcgttacc gcggccatca ctccgtggaa cttcccggcc 480 gccatgatca cccgtaaagc cggcccggcc ctggccgctg gctgcaccat ggtcctcaag 540 ccggcttcgc aaaccccata ctccgctctg gccctggtcg agctggccca 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1440 tga 1443 <210> 4 <211> 1278 <212> DNA <213> Pseudomonas putida KT2440 <400> 4 atgagcaaaa ccaacgaatc cttgatgcaa cgtcgtgtag ctgccgtccc acgtggcgtc 60 ggccagatcc acccgatctt cgtcgacacc gcgaagaact cgaccgtgat cgacgttgaa 120 ggccgcgaac tgatcgactt cgccggcggc atcgcagtac tgaacaccgg ccacctgcac 180 ccgaaagtag ttgcagccgt gcaagagcag ctgaccaagg tcagccacac ctgcttccag 240 gtgctggctt acgagcccta tgtagagctg tgcgaaaaga tcaacaagct ggtcccaggc 300 gacttcgaca agaagaccct gctggtcacc accggctccg aagccgttga aaacgccgtc 360 aagatcgccc gtgctgccac tggccgcgct ggcgtcatcg ccttcaccgg cggttatcac 420 ggccgtacca tgatgaccct gggcctgacc ggcaaggtcg tgccgtactc cgctggcatg 480 ggcctgatgc caggcggcat cttccgcgcc ctgttcccga gcgaactgca cggtatcagc 540 gttgacgacg ccatcgcctc ggtcgagcgc atcttcaaga acgacgccga gccgcgcgac 600 atcgccgcaa tcatcctcga gccagtacaa ggcgaaggcg gcttcctgcc agcgccgaaa 660 gagctgatga agcgcctgcg cgccctgtgc gaccagcacg gcatcctgct gatcgccgac 720 gaagtacaaa ctggcgctgg ccgtaccggc accttcttcg ccatggaaca gatgggcgtt 780 gcgcctgacc tgaccacctt cgccaaatcc atcgctggcg gcttcccgct ggccggtgtg 840 tgcggcaagg ccgaatacat ggacgccatc gcgcctggcg gcctgggcgg tacctacgcc 900 ggttcgccga tcgcttgcgc cgcggccctg gccgtgatcg aagtgttcga agaagaaaaa 960 ctgctggacc gcagcaaggc tgtgggtgag cgcctgaccg ccggcctgcg cgaaatccag 1020 aagaagtacc cgatcatcgg cgacgtccgt ggtctgggct cgatgattgc cgtcgaagtc 1080 ttcgagaagg gcactcacac cccgaacgct gctgctgttg gccaggttgt cgccaaggct 1140 cgtgaaaagg gtctgatcct gctgtcttgc ggcacctacg gcaacgtcct gcgtatcctg 1200 gttccgctga ccgccgaaga cgcgctgctg gacaaaggcc tggccatcat cgaagagtgc 1260 ttcgctgaaa tcgcctga 1278

Claims (5)

1. 당에서 L-라이신을 생합성하는 경로를 가지는 코리네박테리움 속 균주에서 라이신-2-모노옥시게나아제 효소를 코딩하는 유전자, 델타-아미노발레르아미다아제를 코딩하는 유전자, 5-아미노발레르산 아미노전이 효소를 코딩하는 유전자 및 글루타릭산 세미알데히드 탈수소 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글루타릭산 생성능을 가지는 재조합 코리네박테리움.
   
2. 제1항에 있어서, 코리네박테리움 속 균주는 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium diptheriae, Corynebacterium granulosum, Corynebacterium haemolyticum, Corynebacterium minutissimun, Corynebacterium pyrogenes, Corynebacterium renale, Corynebacteriumrenailis Corynebacteriumulcerans 및 Corynebacterium ammoniagenes 으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 라이신-2-모노옥시게나아제 효소를 코딩하는 유전자는 DavB, 델타-아미노발레르아미다아제를 코딩하는 유전자는 DavA, 5-아미노발레르산 아미노전이 효소를 코딩하는 유전자는 GabT 및 글루타릭산 세미알데히드 탈수소 효소를 코딩하는 유전자는 GabD 인 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움.
   
4. 당에서 L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 균주에서 DavB 유전자, DavA 유전자, GabT 유전자 및 GabD 유전자가 도입되어 있고, 글루타릭산 생성능을 가지는 재조합 코리네박테리움.
   
5. 다음 단계를 포함하는 글루코스로부터 5-아미노발레르산의 제조방법:
   (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 코리네박테리움을 글루코스 함유하는 배지에서 배양하여 글루타릭산을 생산하는 단계; 및
   (c) 상기 배양액으로부터 글루타릭산을 수득하는 단계.
   

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