KR102347459B1 - 글루타르산의 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루타르산이 포함된 발효액에 알코올을 가하여 상분리하는 단계를 포함하는, 글루타르산의 선택적 추출방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 글루타르산 추출방법을 이용하면, 생물전환 공정에 의해 생산된 글루타르산을 보다 효과적으로 추출하여 정제할 수 있으므로, 글루타르산 또는 글루타르산을 포함하는 제품의 경제적 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

글루타르산의 추출방법{Extraction of glutaric acid}

본 발명은 글루타르산의 추출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 글루타르산이 포함된 발효액에 알코올을 가하여 상분리하는 단계를 포함하는, 글루타르산의 선택적 추출방법에 관한 것이다.

합성 중합체는 일상 생활에서 널리 사용되지만, 이러한 중합체의 대부분의 빌딩 블록은 석유계 화학 공정에 의해 생성되어 지구 온난화 및 석유 매장량 고갈과 관련된 우려가 증가하고 있다. 결과적으로 석유 기반 생산 공정을 바이오 기반 생산 공정으로 대체해야 하는 요구가 증가하고 있다.

C5 디카르복실산인 글루타르산은 매력적인 화합물이다. 이는 카다베린 및 푸트레신과의 중합에 의해 나일론 55 및 나일론 45의 제조에 사용될 수 있다. 글루타르산은 또한 폴리에스테르 폴리올 및 폴리아미드의 빌딩 블록, 에스테르 가소제, 부식 억제제, 계면 활성제, 금속 마감 화합물, 강성-유연성 란타나이드 배위 중합체, 및 의약품의 합성에 사용될 수 있다. 산업적 중요성으로 인해 많은 연구에서 글루타르산 생산에 중점을 두었다. 발효 및 생물 전환과 같은 생물학적 방법은 글루타르산을 높은 수율로 제공하지만, 수성 매질 또는 완충제로부터 생체 글루타르 산의 회수에 관한 보고는 거의 없다.

몇몇 경우에, 카보사이클릭산은 반응성 추출을 사용하여 수용액으로부터 성공적으로 회수되었으며, 이는 추출제와 추출된 물질 사이의 반응에 기초한 분리 공정에 의한다. 유기상의 추출제는 수성상의 물질과 반응하여 착물을 형성하고, 이어서 착물을 유기상에 용해시킨다.

카르복실산의 반응성 추출을 위한 추출제로는 탄화수소, 인계 화합물 또는 지방족 아민이 있다. 글루타르산의 회수를 위해 반응성 추출이 사용되었지만, 이 방법에는 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 추출제와 글루타르산을 회수하기 위해서는 추가적인 분리 과정이 필요하다. 둘째, 추출제인 트리옥틸아민 (TOA) 또는 트리도데실 아민은 상당히 비싸다. 마지막으로, 추출제는 점도가 높기 때문에 다른 용매에 희석해야 한다.

반응성 추출에 대한 대안으로 물리적 추출로 알려진 용매 추출은 또한 침출수, 발효 배지, 산업 폐기물 및 기타 산업 스트림으로부터 용질의 분리 및 농축을 위한 효율적인 기술이다. 카르복실산의 물리적 추출은 2개의 비혼화성상인 수성상 및 용매상으로 구성되며, 분리는 2 개의 상이한 상에서 용질(카복실산)의 상대 용해도에 기초한다.

이에 본 발명자들은 반응성 추출을 통해 달성된 것과 유사한 추출 수율을 제공하면서도 경제적인 추출 방법을 결정하기 위해 글루타르산의 용매 추출을 위한 다양한 용매를 비교 실험하여 높은 추출 수율을 가지면서도 선택도가 우수한 용매를 예의 연구 노력한 결과, 글루타르산이 포함된 발효액에 알코올을 가하여 상분리할 경우, 글루타르산을 선택적으로 추출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-0557009호 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0132093호

본 발명의 하나의 목적은 글루타르산이 포함된 발효액에 알코올을 가하여 상분리하는 단계를 포함하는 글루타르산 선택적 추출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 추출된 글루타르산을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 글루타르산이 포함된 발효액 및 C3 내지 C6의 알코올을 포함하는 글루타르산 물리적 추출용 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 글루타르산이 포함된 발효액에 C3 내지 C6의 알코올을 부가한 후 교반하여 수성상층(aqueous phase)과 알코올층으로 상분리하는 제1단계; 상기 상분리 후 수성상층을 제거하고 알코올층을 수득한 뒤, 이로부터 알코올을 증발시켜 고상물질을 회수하는 제2단계; 및, 상기 고상물질을 유기용매에 용해하여 글루타르산 용액을 제조하는 제3단계를 포함하는, 글루타르산 추출방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시양태는 상기 방법으로 추출된 글루타르산을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시양태는 글루타르산이 포함된 발효액 및 C3 내지 C6의 알코올을 포함하는 글루타르산 물리적 추출용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 자세히 설명한다.

본 발명에서, "글루타르산"은 C5 디카르복실산으로, 카다베린 및 푸트레신과의 중합에 의해 나일론 55 및 나일론 45의 제조에 사용될 수 있다. 또한, 글루타르산은 폴리에스테르 폴리올 및 폴리아미드의 빌딩 블록, 에스테르 가소제, 부식 억제제, 계면 활성제, 금속 마감 화합물, 강성-유연성 란타나이드 배위 중합체, 및 의약품의 합성에 사용될 수 있는 화합물이다.

본 발명의 글루타르산 추출방법의 상기 제1단계는 글루타르산이 포함된 발효액으로부터 글루타르산만을 선택적으로 추출하기 위해 물리적 추출방법 중 용매 추출을 의미할 수 있다.

상기 물리적 추출의 하나인 용매 추출은 침출수, 발효 배지, 산업 폐기물 및 기타 산업 스트림으로부터 용질의 분리 및 농축을 위한 효율적인 기술이다. 기존의 수계 시스템(water based systems)으로부터 글루타르산을 회수하기 위한 효과적인 공정이 없었으나, 본 발명은 글루타르산이 용해도 차이에 의해 물층에서 용매층인 알코올층으로 옮겨지는 물리적 추출방법을 이용함으로서 수성상(aqueous phase)에서도 글루타르산의 효과적인 추출이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 상기 글루타르산이 포함된 발효액은 글루타르산 생산 균주 등을 배양하여 글루타르산이 포함된 발효액 또는 배양액을 의미하는 것으로, 글루타르산이 일 성분으로 포함된 것을 의미하고, 이에 제한된 것은 아니나, L-라이신, 2-옥소글루타르산, 5-아미노발레르산, 글루타메이트 및 글루타르산을 포함하는 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 글루타르산은 글루타르산 생성 균주를 배양 배지를 발효하여 글루타르산을 회수하는 것으로, 도 1에 나타낸 바와 같이 글루타르산의 생물학적 생산 과정에서 많은 중간체가 형성된다. L-라이신, 2-옥소글루타르산, 5-AVA, 글루타메이트는 중간체의 예시일 수 있으며, 글루타르산의 응용에 필요한 고순도의 글루타르산을 공급하기 위해서는 글루타르산 추출뿐만 아니라 선택성이 높은 효율적인 추출 방법이 필요하다. 이에 본 발명에 개시된 알코올 용매에 의하면 높은 추출율 뿐만 아니라 높은 선택성으로 글루타르산이 추출 가능함을 확인할 수 있다.

본 발명은 상기 제1단계 이전에 상기 글루타르산이 포함된 발효액은 pH 약 3.0 이하로 조절된 것일 수 있다.

글루타르산의 경우 발효액 내에서 암모늄염 또는 나트륨염 형태로 존재하기 때문에 산성 용액을 사용하여 발효액의 pH를 약 3.0 이하로 조절하여 글루타르산을 유리산(free acid)형태로 전환시키는 것이 필요하다.

본 발명의 일 실시예에서는 우수한 추출율을 갖도록 하는 pH 조건에 대한 비교데이터를 개시하고 있다. 이를 통해 pH 가 낮을수록 글루타르산 추출율이 증가하며, pH 5 이상에서는 글루타르산이 추출되지 않으며, pH 약 3.0 이하인 경우 추출율이 급격하게 증가하며, 보다 구체적으로 pH 약 2.0 이하인 경우 가장 우수한 추출율을 나타냄을 알 수 있다.

본 발명의 상기 알코올은 C3 내지 C6의 알코올일 수 있다. 구체적으로, n-프로판올, n-부탄올, n-펜탄올, n-헥산올 또는 iso-부탄올 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 구체적으로는, n-부탄올 또는 n-펜탄올일 수 있다. 이는 탄소수가 2 이하인 경우 물층과의 분리가 용이하지 않은 문제가 있으며, 탄소수가 7 이상일 경우 글루타르산 추출 선택성이 떨어지는 문제가 있기 때문이다.

상기 제1단계의 상기 C3 내지 C6의 알코올을 상기 글루타르산이 포함된 발효액 부피 대비 약 1 배 내지 약 5 배를 부가하는 것일 수 있다. 약 1 배 이상 부가하는 경우 글루타르산 추출율이 반응성 추출 용매와 비교하여 동등 또는 그 이상의 추출율을 보이며, 약 5 배 초과로 부가하는 경우 추출율이 더이상 증가하지 않아 비경제적이다.

제1단계에서 설명하는 교반하고 상분리하는 방법는 공지된 다양한 방법을 제한없이 이용할 수 있다.

본 발명 글루타르산 추출방법의 상기 제2단계는 상기 제1단계에서 수성상층(aqueous phase)과 알코올층으로 상분리 후 수성상층을 제거하고 알코올층을 수득한 뒤 알코올을 증발시켜 고상물질을 회수하는 단계를 의미할 수 있다.

상기 제2단계는 상기 수득한 알코올층에 증류수를 부가하여 희석시킨 후 희석된 용액을 교반하여 상분리하고 다시 알코올층을 수득한 다음, 수득한 알코올층에서 알코올을 증발시켜 고상물질을 회수하는 방식으로 수행될 수 있는데, 이를 통해 글루타르산의 추출율을 향상시킬 수 있다.

본 발명 글루타르산 추출방법의 상기 제3단계는 상기 고상물질을 유기용매에 용해하여 글루타르산 용액을 제조하는 단계를 의미할 수 있다.

상기 제3단계의 유기용매는 톨루엔, 크실렌, n-헥세인, n-햅테인, 클로로포름 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유기용매인 것일 수 있다. 상기 고상물질에 포함된 불순물을 제거하기 위한 것으로 상기 유기용매에 상기 고상물질로부터 나온 불용분이 석출되고 이를 여과함으로서 불순물이 제거될 수 있다.

본 발명의 추출방법은 상기 제3단계 이후 상기 글루타르산 용액을 농축하여 재결정하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 불순물이 제거된 여과액을 농축한 다음 상온에 방치하여 결정을 형성시킨 후 냉장 상태에서 추가 결정화를 수행하는 것일 수 있다. 상기 상온에서 방치하여 수득한 결정형태의 글루타르산 분말입자를 유기용매를 사용하여 세척하고 진공건조하는 과정을 2회 이상 거침으로서 글루타르산을 회수할 수 있다.

본 발명은 상기 글루타르산 추출방법으로 추출된 글루타르산을 제공한다.

본 발명에서, "글루타르산 추출방법" 및 "글루타르산"은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명은 글루타르산이 포함된 발효액 및 C3 내지 C6의 알코올을 포함하는 글루타르산 물리적 추출용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "글루타르산", "글루타르산이 포함된 발효액", "C3 내지 C6의 알코올" 및 "물리적 추출"에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 글루타르산 생성 균주 배양하여 글루타르산이 포함된 발효액을 수득 후 이에 알코올을 부가하는 단계를 거쳐 매우 효과적으로 글루타르산 용액을 물리적으로 추출할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 제공하는 글루타르산 추출방법을 이용하면, 생물전환 공정에 의해 생산된 글루타르산을 보다 효과적으로 추출하여 정제할 수 있으므로, 글루타르산 또는 글루타르산을 포함하는 제품의 경제적 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 생물변형 (biotransformation)에 의한 글루타르산 생산 경로를 나타낸 도이다.
도 2는 추출 수율의 비교에 의한 유기 용매의 스크리닝을 나타낸 그래프이다.
도 3a, 3b, 및 3c 는 LSER (linear solvation energy relationship) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 계산된 글루타르산 추출 수율과 예측의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 수소결합 염기도 (β)와 추출 수율의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 힐데브란트 용해도 (δ_H ²) 파라미터 및 추출 수율의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 최적화된 조건에서 n-부탄올을 이용한 글루타르산의 반복 추출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 n-부탄올을 이용한 글루타르산의 반복 추출 및 증발 후 n-부탄올 회수 수율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 글루타르산의 용매 추출(물리적 추출) 공정을 나타낸 도이다.
도 6은 중간 산물 및 글루타르산에 대한 다양한 용매의 선택성을 비교한 그래프이다.
도 7은 n-부탄올을 이용한 배양 배지에서의 글루타르산의 용매 추출율을 나타낸 그래프이다.
도 8a는 n-부탄올을 이용한 추출 조건 중 pH 에 따른 추출율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8b는 n-부탄올을 이용한 추출 조건 중 V_1-butanol / V_{glutaric acid} 비율에 따른 추출율 변화를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<물질>

글루타르산, 5-아미노 발레르산(5-Aminovaleric acid, 5-AVA), 2-옥소 글루타르산(2-oxoglutaric acid, α-Ketoglutaric acid), L-라이신 모노 하이드로클로라이드, 나트륨 글루타메이트, 나트륨 수산화물, 염산, 트리옥틸아민(Trioctylamine, TOA), 메틸에틸케톤(Methyl ethyl ketone, MEK), 메틸이소부틸 케톤(Methyl isobutyl ketone, MIBK), 헥산, 헵탄, n-부탄올, n-펜탄올, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 톨루엔은 Sigma-Aldrich 에서 구입하였다. 유도체화 시약인 디에틸 에톡시 메틸렌 말로네이트(diethyl ethoxymethylenemalonate, DEEMM)는 Fluka (일본) 및 붕산 나트륨 10수화물은 Sigma-Aldrich 에서 구입하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 1857 (한국의 Type Cultures)가 숙주 균주로 사용되었다.

실시예 1. 글루타르산 생성 균주 배양 및 글루타르산 합성 경로의 주요 대사 산물 분석

실시예 1.1 글루타르산 생성 균주 배양

C. 글루타미쿰을 라이신 유사체 S-(β아미노에틸시스테인)에 노출시켜 무작위로 조작된 L-라이신 과잉 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 1857 균주에, davTDBA를 도입하여 글루타르산 생산을 위해 대사적으로 조작된 C. 글루타미쿰 H30-GAHis 균주를 수득하고 이를 배양하였다.

대략적으로, 상기 C. 글루타미쿰 H30-GAHis 균주를 약 2 mL의 RG 배지를 함유한 둥근 바닥 14 mL에서 30℃ 및 250 rpm에서 밤새 배양하였다. RG 배지에는 약 10 g/L의 포도당, 약 40 g/L의 뇌 심장 주입물(brain heart infusion), 약 10 g/L의 쇠고기 추출물 및 약 30 g/L의 D-소르비톨이 함유되어 있다. 주요 플라스크 배양 물을 30 mL 및 250 rpm에서 120시간 동안 약 20 mL의 CG50 배지를 함유하는 250 mL 당황 플라스크에서 수행 하였다. 플라스크 배양용 CG50 배지에는 포도당 약 50 g/L, 효모 추출물 약 30 g/L, (NH₄)₂SO₄ㆍ7H₂O 약 30 g/L, KH₂PO₄ 약 0.5 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 약 0.5 g/L, MnSO₄ㆍH₂O 약 0.01 g/L, FeSO₄ㆍ7H₂O 약 0.01 g/L, 비오틴 약 0.5 mg/L 및 티아민-염산(HCl) 약 0.3 mg/L 이 함유되어 있다. 이어서, 약 20 mg/L의 카나마이신(Km)을 배지에 첨가하여 재조합 C. 글루타미쿰 균주를 배양하였다. 상기의 플라스크 배양 실험을 3 회 수행하였다.

회분식 발효의 경우, 재조합 C. 글루타미쿰 균주를 500 mL 의 CG100을 함유하는 2.5 L 자(jar) 발효기 (BioCNS, 대한민국)에서 30℃ 및 600 rpm 에서 배양하였다. CG100에는 글루코오스 약 100 g/L, 효모 추출물 약 30 g/L, NH₄2SO₄ㆍ7H₂O 약 30 g/L, KH₂PO₄ 약 0.5 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 약 0.5 g/L, MnSO₄ㆍH₂O 약 0.01 g/L, FeSO₄ㆍ7H₂O 약 0.01 g/L, 비오틴 약 0.5 mg/L 및 티아민-염산(HCl) 약 0.3 mg/L이 함유되어 있다. 이어서, 약 20 mg/L의 카나마이신을 배지에 첨가하였다. 배양하는 동안, 28 %(v/v) NH₄OH를 첨가하여 pH를 약 6.9로 유지하였다. 거품 형성을 방지하기 위해 소포제 204 (Sigma-Aldrich)가 주기적으로 추가되었다.

실시예 1.2 글루타르산 합성 경로의 주요 대사 산물 분석

도 1 에 나타낸 바와 같이, 글루타르산의 생물학적 생산은 라이신으로부터의 생물 전환 또는 포도당으로부터의 발효에 의해 달성될 수 있다. AMV 경로(aminovalerate pathway)를 통한 L-라이신(L-lysine)의 글루타르산으로의 전환은 4개의 과발현된 효소에 의해 촉매된다. 먼저, L-라이신은 davB에 의해 인코딩된 라이신 2-모노옥시게나제에 의해 5-아미노발레르아마이드로 전환된다. 이어서, davA에 의해 코딩된 d-아미노발레르-아미다제는 5-아미노발레르아마이드로부터 5-아미노발레르산 (5-Aminovaleric acid; 5-AVA)의 생성을 촉매한다. 글루타르산 생산의 다운 스트림 경로에서, 5-AVA는 gabT에 의해 코딩된 아미노발레레이트 아미노 트랜스퍼라제에 의해 글루타레이트 세미 알데히드로 전환된다. 이 과정에서 아민기를 받아들이고 케톤기를 내어주는데 사용되는 2-옥소글루타르산(2-oxoglutaric acid, α-Ketoglutaric acid) 은 글루타메이트(glutamate)로 전환된다. 마지막으로, gabD에 의해 인코딩된 글루타레이트 세미 알데히드 탈수소 효소는 글루타레이트 세미 알데히드를 글루타르산(glutaric acid)으로 전환시킨다. 상기 AMV 경로를 통해 다량의 글루타르산을 생산하려면 다량의 L-라이신, 2-옥소글루타르산, 5-아미노발레르산 및 글루타메이트를 중간체로 생성하거나 첨가해야 한다. 다른 응용에 필요한 고순도의 글루타르산을 고려하면, 글루타르산의 회수율뿐만 아니라 선택성이 높은 효율적인 추출방법이 개발되어야 한다.

실시예 2. 용매 스크리닝에 의한 물리적 추출에 적합한 용매 선정

메틸에틸케톤, 에틸아세테이트, 메틸이소부틸케톤, 부틸아세테이트, 톨루엔, 헵테인, 헥세인, n-부탄올, n-펜탄올 총 9가지 물리적 추출 용매를 이용하여 액체-액체 물리적 추출에 의한 글루타르산 추출율을 측정하였다. 또한 트리옥틸아민을 이용한 반응성 용매 추출에 의한 글루타르산 추출율을 측정하여 상기 9가지 물리적 추출 용매와 추출율을 비교하였다.

추출공정을 위해, 500 μl 의 200 mM 글루타르산 용액(pH 2)을 500 μl 상기 9가지 용매 중 어느 하나와 혼합하였다. 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 상기 교반된 용액에서 50 μl 의 수성상을 유도체화 후 분석하기에 적합하도록 희석하여 HPLC 로 분석하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 조사된 물리적 추출 용매 중 n-부탄올은 가장 높은 추출율 69.1%을 나타냈으며, n-펜탄올은 61.4%, 메틸에틸케톤은 57%, 에틸아세테이트가 45.2% 순으로 높은 추출율을 보였다. 부틸아세테이트 또는 메틸이소부틸케톤은 40% 의 낮은 추출율을 보였으며, 헥산, 헵탄, 톨루엔은 추출율이 매우 낮았다. 이에 따라, n-부탄올 및 n-펜탄올이 60% 이상의 높은 추출율을 나타냄을 알 수 있었다. TOA에 의한 반응성 추출 결과인 71.8% 와 비교하여도 유사한 수준의 유효한 추출율을 가짐을 알 수 있었다.

다만, TOA의 경우 추출효율은 좋지만 값비싼 TOA를 사용해야 하며, 추출 후에도 별도의 공정을 통하여 TOA로부터 글루타르산을 분리해야 하는 등 경제성에 있어 한계가 있으므로, 이를 모두 고려하면 n-부탄올 또는 n-펜탄올과 같은 알코올이 물리적 추출에 적합함을 확인할 수 있다.

실시예 3. LSER (linear solvation energy relationship)에 의한 용매 특성 평가

도 3a, 3b, 및 3c는 어떤 용매 특성이 추출율에 영향을 미치는지 결정하기 위해 LSER 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다. LSER 분석을 사용하여 다양한 용매 효과와 분자 구조 효과를 예측할 수 있다. 추출 효율에 대한 주어진 용매의 효과를 이해하기 위해, 용매는 극성/분극성 (p *), 산도 (α), 염기도 (β) 몰부피 (V_m/100) 및 힐데브란트 용해도 (δ_H ²) 파라미터를 포함한 용매화 파라미터에 기초하여 파라미터화 할 수 있다. 글루타르산의 추출을 분석하기 위해 상기 실시예 2에서 사용된 용매를 하기의 계산식 (1)을 적용하여 분석하였다. 계산식 (1)은 추출 용매와 용매 특성 사이의 상관 관계를 나타낸 것이다.

실험 데이터 및 용매 매개 변수를 바탕으로 각 파라미터에 대한 회귀 곡선 및 계수가 얻어졌다(도 3a).

로그 수율(log yield)

도 3b 는 상기 계산식 (1)은 수소결합 수용 능력이 높은 용매가 산성 물질을 추출하는데 효과적이기 때문에 추출율과 수소결합 염기도 (수소결합 수용 특성) (β)사이의 높은 상관 관계를 보여주었다. 또한, 도 3c 를 통해 글루타르산의 용해도 변수 (δ_H ²)가 25.04 (δ_H ²/1000 = 0.627)이므로 용해도 변수값이 높은 용매는 향상된 용해도 및 추출율을 가짐을 알 수 있었다. 도 3a, 3b, 및 3c 를 종합하면 염기도와 용해도 모두 고려하였을 때, n-부탄올 및 n-펜탄올이 글루타르산 추출에 유용한 용매임을 알 수 있었다.

실시예 4. 글루타르산의 반복 추출 및 용매 회수

도 4a 에 나타낸 바와 같이, 반복 추출에 의해 얼마나 많은 글루타르산이 추출될 수 있는지 결정하기 위해 추출 과정을 5회 반복하였다. 초기에, 200 mL의 200 mM 글루타르산 용액 20 mL를 pH 2에서 20 mL의 n-부탄올과 혼합하였다. 두 상 사이의 분리 후, 글루타르산을 함유하는 n-부탄올을 진공 회전 증발기로 증발시키고 재사용을 위해 수집하였다. 수집된 n-부탄올을 수성상에 첨가하고, 추출 절차를 총 5회 반복하였다. 글루타르산의 추출율은 첫번째 추출 공정에서 63.17% 였고, 추출 공정이 반복됨에 따라 24.35%, 8.89%, 3.25% 및 1.19%로 감소했다.

도 4b 를 통해 수성상의 글루타르산의 대부분은 n-부탄올 (98.4 %의 누적 회수 수율)로 5번의 추출 공정을 통해 성공적으로 회수됨을 확인할 수 있었다. 추출에 사용되는 용매의 양을 줄이는 것이 중요하기 때문에, 용매를 재사용하면 추출 공정 비용을 줄일 수 있다. 용매 회수를 조사하기 위해, 반복 추출 및 증발 후 수집된 n-부탄올의 양을 측정하고, 5번의 추출 공정 후 n-부탄올의 회수율이 78.6% 인 것으로 확인되었다.

실시예 5. 글루타르산 물리적 추출의 선택성 평가

실시예 5.1 n-부탄올을 이용한 글루타르산 추출

도 5에 나타낸 바와 같이, 글루타르산, L-라이신, 5-아미노발레릭산(5-AVA), 글루탐산 및 α-케토글루타르산을 각각 약 200 mM씩 함유하는 수성상(aqueous phase)을 제조하고, 수성상의 산 농도를 염산으로 적정하여 측정하였다. 혼합물의 pH는 pH 측정기 (P15, iSTEK, 대한민국)를 사용하여 측정하였다. 액체-액체(liquid-liquid) 물리적 추출을 위해 n-부탄올 유기상을 준비하였다. 동일한 부피의 상기 수성상 및 n-부탄올 유기상을 아날로그 로티세리 튜브 회전자 (Dlab MX-RL-E, USA)를 사용하여 약 1.7 mL 에펜도르프 튜브에서 실온에서 약 2시간 동안 교반하였다. 상분리 후 수성상 층을 다른 에펜도르프 튜브에 옮기고 남은 유기상 층에 증류수 약 950 uL를 관에 첨가하여 약 20배 희석시켰다. 희석된 용액을 교반하여 상분리시킨 후 다시 수성상 층을 제거하는 과정을 반복하고, n-부탄올 재사용을 위해 진공 회전 증발기(N-1100, EYELA, Japan)를 사용하여 증발시켜 제거한 후 고상물질을 회수하였다. 상기 고상물질은 클로로포름과 아세톤을 적절한 비율로 조절하여 부가한 후 약 45℃에서 교반하면 혼합용매에 불용분을 조각형태로 석출시킨 다음 여과에 의해 불용분을 제거하였다. 상기 여과액을 농축한 후 상온에서 결정을 형성시키고 4℃냉장 상태에서 추가로 결정화를 진행하였다. 결정화된 물질을 클로로포름(chloroform)/n-헥세인(n-hexane) 약 1.5/1의 혼합용매를 사용하여 1회 세척하여 잔류 색상물질을 제거 한 다음 약 60℃에서 진공건조 하였다. 여과액은 농축 재결정 및 세척을 2회 반복하여 여분의 백색 분말상의 결정화된 글루타르산 추정 물질을 회수하였다. 결정화된 글루타르산 추정 물질을 HPLC 분석에 적합한 농도에 도달하도록 희석시켰다. 용액 내 초기 농도와 용매 추출 후 회수된 농도를 비교하여 추출 수율을 계산하였다.

실시예 5.2 n-펜탄올, 메틸에틸케톤, 및 에틸아세테이트를 이용한 글루타르산의 물리적 추출

용매를 n-부탄올 대신 n-펜탄올, 메틸에틸케톤, 및 에틸아세테이트 중 어느 하나의 용매를 이용하여 상기 실시예 3.1 과 동일한 방법으로 글루타르산을 추출하였다.

실시예 5.3 선택성 비교 평가

도 6은 상기 실시예 5.1 내지 5.2의 결과 값을 나타낸 그래프이다. 예상한 바와 같이, 반응성 추출 용매인 TOA/톨루엔은 글루타르산에 대해 높은 추출율을 나타냈다. 그러나, 1 : 1의 농도비로 (2-옥소글루타르산 : 글루타르산) 2-옥소글루타르산도 글루타르산과 유사한 수율로 추출되어, 선택성이 낮음을 알 수 있었다. 아민 함유 물질인 L-라이신, 글루타메이트 및 5-AVA의 경우 낮은 추출 수율이 얻어졌다. 이는 장쇄 지방족 3차 아민을 갖는 TOA에 의해 낮은 pH에서 이러한 물질이 정상적으로 잘 추출되지 않기 때문이다. 그러나, 2번째로 최고 추출율을 나타내는 n-부탄올은 가장 높은 선택도를 나타냈다. 이는 도 6에 나타낸 바와 같이, 2-옥소글루타르산 : 글루타르산의 추출 비율이 1 : 4.53 의 농도비로 나타났다. n-펜탄올은 또한 우수한 선택성을 나타내었으며, n-부탄올과 유사한 글루타르산 추출율을 나타내었다. MEK 및 에틸 아세테이트는 글루타르산 추출에 대한 선택성이 낮았다. 결과적으로, n-부탄올 및 n-펜탈올은 글루타르산에 대한 높은 선택성을 갖는 가장 적합한 추출 용매로 선택되었다.

글루타르산 생산을 위한 전체 세포 반응에서, L-라이신이 기질로 사용되고 2-옥소글루타르산, 5-AVA 및 글루타메이트가 중간체로 생성된다. 결과적으로, 다량의 L-라이신, 5-AVA, 2-옥소글루타르산 및 글루타메이트가 수성상에 남아 용매상으로 추출될 수 있다. 예를 들어, 나일론 중합에 대한 글루타르산의 추가 적용을 억제할 수 있는 이러한 불순물의 존재는 추가적인 분리 공정의 도입이 필요하게 된다. 따라서 높은 선택성으로 글루타르산을 추출하여 고순도를 얻을 수 있는 용매를 찾는 것은 중요하다.

실시예 5.4 배양 배지에서 글루타르산의 선택적 추출 평가

n-부탄올을 이용한 용매 추출의 글루타르산 회수에 대한 실제 적용성을 결정하기 위해, 최적화 된 추출 조건을 다양한 대사물을 함유하는 발효 배지에 적용하였다. L-라이신, 2-옥소글루타르산, 5-AVA, 글루타메이트 및 글루타르산만을 함유한 생물 전환 용액과 비교하여, 발효 배지는 상기 실시예 1.2에서 분석한 바와 같이 더 많은 대사 산물을 함유하는 것이다. 코리네박테리움(Corynebacterium)을 사용하여 발효를 통해 글루타르산을 생성했다. 초기 pH 6.5의 배양 배지를 n-부탄올을 사용한 용매 추출 전에 염산을 사용하여 pH 2로 적정하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 배양 배지에서 글루타르산의 전구체인 5-AVA가 가장 많은 양 (650 mM)으로 생성되었다. 그러나, n-부탄올에 의한 용매 추출 시 배양 배지로부터 7.7 mM의 5-AVA만이 추출되었으며, 이는 1.2 %의 추출율에 해당한다. 대조적으로, 배양 배지에서 생성된 344 mM의 글루타르산으로부터 240 mM이 추출되어 69.7 %의 추출율이 얻어졌다. 또한, 다른 성분의 농도는 HPLC 검출 수준 미만으로 나타났다. 이를 통해 n-부탄올에 의한 글루타르산의 효율적인 추출을 확인할 수 있었다.

실시예 6. n-부탄올 용매의 최적화 조건 평가

실시예 6.1 수성상의 pH 조절

도 8a 에 나타낸 바와 같이, 글루타르산이 포함된 수성상의 pH를 수산화 나트륨 및 염산을 사용하여 2, 3, 4, 5, 7, 10으로 조정하였다. 수성상 pH가 5 이하의 범위에서 pH 값이 감소할수록 글루타르산의 추출율이 개선됨을 확인할 수 있었다.

실시예 6.2 n-부탄올과 수성상 사이의 부피비 조절

도 8b 에 나타낸 바와 같이, V_1-butanol / V_{glutaric acid} 가 각각 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0 을 사용하여 추출 수율에 대한 n-부탄올과 수성상 사이의 부피비의 영향을 평가하였다. 비율이 증가함에 따라 추출 수율이 증가했다. 다만, 추출 효율과 공급된 용매의 양을 고려할 때 수성상과 n-부탄올 사이에 부피비는 1 : 1 내지 1 : 2 가 보다 적합할 수 있다.

Claims (9)

1. 글루타르산이 포함된 발효액에 C3 내지 C6의 알코올을 부가한 후 교반하여 수성상층(aqueous phase)과 알코올층으로 상분리하는 제1단계;
   상기 상분리 후 수성상층을 제거하고 알코올층을 수득한 뒤, 이로부터 알코올을 증발시켜 고상물질을 회수하는 제2단계; 및,
   상기 고상물질을 유기용매에 용해하여 글루타르산 용액을 제조하는 제3단계를 포함하는, 글루타르산 추출방법.
   
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 제1단계 이전에 글루타르산이 포함된 발효액의 pH를 3이하로 조절하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 글루타르산 추출방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 글루타르산이 포함된 발효액은 L-라이신, 2-옥소글루타르산, 5-아미노발레르산, 글루타메이트 및 글루타르산을 포함하는 것인, 글루타르산 추출방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 제1단계의 상기 C3 내지 C6의 알코올을 상기 글루타르산이 포함된 발효액 부피 대비 1 배 내지 5 배를 부가하는 것인, 글루타르산 추출방법.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 제2단계는 상기 수득한 알코올층에 증류수를 부가하여 희석시킨 후 희석된 용액을 교반하여 상분리하고 다시 알코올층을 수득한 다음, 수득한 알코올층에서 알코올을 증발시켜 고상물질을 회수하여 수행되는 것인, 글루타르산 추출방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 제3단계의 유기용매는 톨루엔, 크실렌, n-헥세인, n-햅테인, 클로로포름 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유기용매인 것인, 글루타르산 추출방법.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 제3단계 이후 상기 글루타르산 용액을 농축하여 재결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 글루타르산 추출방법.
   
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 추출된 글루타르산.
   
9. 글루타르산이 포함된 발효액 및 C3 내지 C6의 알코올을 포함하는 글루타르산 물리적 추출용 조성물.
   
   

Images