KR20230102682A

KR20230102682A - 목적 단백질의 발현 방법

Info

Publication number: KR20230102682A
Application number: KR1020210193011A
Authority: KR
Inventors: 이유원; 김만수; 나완근; 류동균
Original assignee: (주)셀트리온
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2023-07-07
Also published as: WO2023128639A1

Abstract

본 발명은 목적 단백질의 발현 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 목적 단백질을 주변 세포질(periplasmic)로 분비시키기 위한 신호 펩티드, 이를 코딩하는 핵산, 이 핵산을 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물, 및 이 재조합 미생물을 이용한 목적 단백질의 발현 방법에 관한 것이다. 본 발명은 목적 단백질이 대장균에서 잘 발현되도록 할 뿐만 아니라 주변 세포질(periplasmic)로의 분비 효율이 향상되도록 한다. 이에 본 발명에 따른 목적 단백질 발현 방법을 통해 높은 수율의 단백질 생산이 가능하다.

Description

목적 단백질의 발현 방법 {Method for Expressing Target Protein}

본 발명은 목적 단백질의 발현 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 목적 단백질을 주변 세포질(periplasmic)로 분비시키기 위한 신호 펩티드, 이를 코딩하는 핵산, 이 핵산을 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물, 및 이 재조합 미생물을 이용한 목적 단백질의 발현 방법에 관한 것이다.

디프테리아 톡신(diphtheria toxin, DT)은 박테리아 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria)에 의해 생산되는 단백질 외독소의 한 종류이다. 성숙된 디프테리아 톡신은 535개 아미노산을 포함하는 단일 폴리펩타이드로 합성이 되며, 이 것은 536개 단백질 전구체 형태로 유래되며, 이 전구체는 190, 192, 193번의 아미노산이 단백질 분해(proteolysis)되어 성숙된 형태의 디프테리아 톡신이 된다. 성숙된 디프테리아 톡신은 2개의 서브유닛으로 구성되며, 서브유닛 A는 촉매적 활성 부위로서 NAD 의존적 ADP-리보실(ribosyl) 전이효소(transferase)이고, 이로 인해 EF-2를 불활화 시키고, 단백질의 합성을 저해하는 것으로 알려져 있다. 디프테리아 톡신은 세포 독성이 높은 단백질 중 하나로서 생체 내 치사량이 약 10 ng/kg으로 알려져 있다. 과거부터 디프테리아 톡신을 백신에 사용하기 위해 불활화 과정을 필수적으로 거쳤다.

CRM197은 디프테리아 톡신의 대체제로서 백신에 사용되어져 왔다. CRM197은 디프테리아 톡신과 아미노산 1개의 차이를 보이며, 이는 서브유닛 A의 52번 구아닌(Guanine)이 아데닌(Adenine)으로 치환된 형태(미스센스 돌연변이)로서, 이와 같은 변이를 통해 CRM197은 세포독성이 감소되고, 백신용으로 안전하게 사용 가능하다.

CRM197은 백신 내 단백질-탄수화물 접합 및 합텐-단백질 접합에서 운반 단백질로서 흔히 사용되고 있다. 백신 내 다수의 항원들은 단백질에 화학적으로 연결되지 않은 한, 특히 영유아에서 면역원성이 낮아 접합체 또는 접합 백신으로 제조되는 경우가 많고, 이를 위해서는 운반단백질이 필수이기 때문이다.

디프테리아 톡신 또는 CRM197은 코리네박테리움 디프테리아의 배양물로부터 톡신의 정제에 뒤따르는 화학적 무독화(detoxification)과정을 통해 생산되거나, 재조합체 또는 유전적으로 무독화된 톡신의 유사체 정제 과정을 거쳐 제조될 수도 있다.

대장균 대량 번식 과정 중 주변 세포질(periplasm)에서의 단백질 외독소 생산 방식은 세포내(cytoplasmic) 생산 방식 대비, 단백질이 신호 펩티드 절단 과정을 거쳐 성숙형으로 생산되거나, 주변 세포질이 이황화 결합의 형성을 허용하는 산화 환경이어서 제대로 폴딩된 가용성의 단백질이 만들어질 수 있다는 장점이 있다. 또한, 대장균의 주변 세포질은 세포내 대비 적은 프로테아제를 함유하고 있어 발현 단백질의 소모성 분해가 적고, 더 적은 단백질 종류들을 포함하고 있어 더 순도 높은 단백질 수득이 가능하다.

일반적으로 단백질 상의 신호서열(signal sequence) 또는 신호 펩티드(signal peptide)의 존재는 주변 세포질로의 단백질의 수송(원핵 숙주) 또는 분비(진핵 숙주)를 촉진한다. 원핵 숙주에서 신호서열은 신생 단백질을 내막을 가로질러 주변 세포질로 가도록 하며, 그 후 신호서열(신호펩티드)은 절단된다. 즉, 타겟 단백질을 더욱 효율적으로 대량 생산할 수 있도록 돕는 신규 신호서열의 개발은 전 생물 산업에 있어 매우 중요한 과제로 대두되고 있다.

이에 본 발명자들은 목적 단백질을 더 효율적으로 발현하기 위한 방법을 찾던 중, 더 높은 수율의 단백질 수득이 가능하도록 하는 단백질 발현용 신호 펩티드를 완성하였다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 특정 서열번호의 아미노산 서열로 표시되는, 목적 단백질 발현용 신호 펩티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 특정 서열번호의 아미노산 서열로 표시되는 목적 단백질 발현용 신호 펩티드를 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 특정 서열번호의 아미노산 서열로 표시되는 목적 단백질 발현용 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는 핵산 구조체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 특정 서열번호의 아미노산 서열로 표시되는 목적 단백질 발현용 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기의 핵산 구조체 또는 상기의 발현 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 생성하는 단계 및 (b) 상기 생성된 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 상기 목적 단백질의 발현 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 기재는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 상세한 설명에 기재된 사항들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 범위는, 이하 설명되는 내용에 의해 제한되지 않으며, 특히, 이하의 실시예 등에 기재된 실험 조건 등에 따라 가변될 수 있는 일체의 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해 제한될 것이므로, 오직 추가의 이해를 위해 본 명세서에서 사용된 용어는, 본 발명의 상세한 실시예를 설명하는 목적을 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 제한하여서는 안된다.

본 명세서에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 그리고 과학 용어는 당업계에서 통상적인 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 용어와 동일한 의미로 해석된다. 본 명세서에 언급된 모든 참조 문헌은, 이들의 공개된 전체의 내용이 본 명세서의 발명을 설명하기 위한 참조된 내용으로 본 발명의 명세서의 내용으로써 통합된다.

본 발명은 서열번호 7 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 목적 단백질 발현용 신호 펩티드를 제공한다.

구체적으로 상기 목적 단백질 발현용 신호 펩티드는 서열번호 7 내지 서열번호 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 단백질 발현용 신호 펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 '목적 단백질 발현용 신호 펩티드'란, 특정 타겟 단백질의 발현 및 주변 세포질(periplasm)로의 분비를 위한 신호 펩티드 또는 신호 서열(signal sequence)을 의미한다.

본 발명에 있어서 상기 신호 펩티드는 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria)에서 유래된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 목적 단백질 발현용 신호 펩티드는 주변 세포질(periplasm)로의 목적 단백질 분비 효율을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명은 목적 단백질 발현용 신호 펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 명세서에서 상기 핵산은 서열번호 3 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 핵산은 서열번호 3 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서 상기 핵산은 서열번호 4로 표시되는 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기의 핵산 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는 핵산 구조체를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 '핵산 구조체'는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체(chromosome) 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 '폴리뉴클레오타이드'는 '핵산'과 동일한 의미로 사용되며, 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 한정하지 않는다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터(vector) 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다.

본 발명은 상기의 핵산 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 '벡터(vector)'는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환(transformation)되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수도 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명에서 '플라스미드(plasmid)' 및 '벡터(vector)'는 때로 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수십 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지닐 수도 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

아울러, 상기 유전자는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동 가능하도록 연결된다(operably linked). 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전 서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다.

이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)가 사용될 수 있다.

본 발명의 '형질전환(transformation)'이란 특정 외래의 DNA 가닥을 세포 밖에서 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 가닥을 포함한 숙주 미생물 또는 재조합 미생물을 '형질전환된 미생물'이라 한다. DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미하는 '형질전환'은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하거나 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포의 염색체에 통합 완성시켜 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다.

형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 발현 벡터는 T7 프로모터를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.본 발명의 상기 발현 벡터는 T7 프로모터를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따라 사용한 프로모터는 구성 프로모터 또는 조절 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기에 기술한 프로모터 외에 당업계에 통상적으로 활용 가능한 프로모터라면 제한 없이 모두 사용될 수 있다

상기 목적 단백질은 접합 백신(conjugate vaccine)의 운반 단백질(carrier protein)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 '백신(vaccine)'은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 의미하며, '면역원성 조성물' 등과 같이 표현되어 사용되기도 한다.

본 발명의 '접합 백신(conjugate vaccine)'이란 박테리아의 다당류 (polysaccharide)처럼 기억면역 등의 면역반응(immune response)이 잘 유도되지 않는 항원에 대해 숙주(host)의 면역반응을 강력하게 유발하기 위해 다른 항원을 접합(conjugate)시킨 형태의 백신을 의미한다. 주로 면역원성이 강한 항원을 운반체로 결합하여 약한 항원에 대해 면역체계가 더 강한 반응을 갖도록 하는 백신 유형으로서, 박테리아 다당류에 대한 면역 반응이 성인 대비 상대적으로 약한 영유아 혹은 노인 층에 해당 백신 기술을 사용하여 백신의 효능을 증가시키기도 한다. 접합백신으로는 폐렴구균 접합 백신, 뇌수막염 접합 백신, 장티푸스 접합 백신 등이 있다.

본 발명의 '운반 단백질(carrier protein)'이란, 협막 다당류와 공유 결합 등으로 접합되어 다당류 항원의 면역원성을 증가시켜줄 수 있는 단백질을 의미하며, 면역원성이 높아 주로 접합 백신 등에서 활용된다.

본 발명의 운반 단백질은 표준 접합 방법을 통해 협막 다당류와 접합되어 제조될 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제조된 협막 다당류-운반 단백질 접합체는 하나 또는 다수의 협막 다당류가 하나의 운반 단백질에 접합된 형태일 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 운반 단백질은 디프테리아 독소(diphtheria toxin, DT) 파상풍 독소(tetanus toxin, TT), 수막염균(Neisseria meningitidis) 외부막 단백질 복합체(outer-membrane protein, OMP) 및 CRM197로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 운반 단백질은 CRM197일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, CRM197 단백질의 유전자는 CRM197 단백질을 암호화하는 유전자이면 제한 없이 이용 가능하다. 상기 CRM197은 서열번호 1의 염기 서열로 표시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아울러, 상기 CRM197은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 표시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 상기의 핵산 구조체 또는 상기의 발현 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

상기 재조합 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 재조합 미생물은 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용 가능하다. 본 발명의 구현예에서는 대장균(E. coli)을 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 상기 CRM197 단백질이 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 미생물이라도 무방하다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않고, 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 상태에서, 다른 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택하여 적용이 가능하다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이고, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

상기 형질전환된 재조합 미생물은 통상적으로 알려진 임의의 형질전환 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자 조작방법을 사용할 수도 있으며, 일 구현 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법도 가능하다.

또한, 본 발명의 형질전환 방법에는 발현 벡터를 이용한 방법 외에도, 상기 핵산 구조체를 숙주세포의 염색체상에 직접 삽입하는 방법도 이용될 수 있다. 일반적으로 전기천공법(electroporation), 리포펙션, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론, 화학물질 촉진 DNA 유입, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂)침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 이용될 수도 있다. 소소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있으며, 다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다. 리포펙션 방법은 미국특허 제5,049,386호, 미국 특허 제4,946,787호 및 미국특허 제4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있으며, 예를 들어, TRANSFECTAM^TM 및 LIPOFECTIN^TM 등이 있다. 폴리뉴클레오타이드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 펠그너(Felgner)의 지질을 포함하며(WO91/17424 및 WO91/16024), 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다. 면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다. (Crystal, Science., 270:404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2:291-297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5:382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5:647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy., 2:710-722, 1995; Ahmad et al., Cancer Res., 52:4817-4820, 1992; 미국특허 제4,186,183호; 미국특허 제4,217,344호; 미국특허 제4,235,871호; 미국특허 제4,261,975호; 미국특허 제4,485,054호; 미국특허 제4,501,728호; 미국특허 제4,774,085호; 미국특허 제4,837,028호; 미국특허 제4,946,787호).

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 목적 단백질의 발현 방법을 제공한다:

(a) 상기의 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 목적 단백질을 분리하는 단계.

상기의 목적 단백질은 디프테리아 독소(diphtheria toxin, DT) 파상풍 독소(tetanus toxin, TT), 수막염균(Neisseria meningitidis) 외부막 단백질 복합체(outer-membrane protein, OMP) 및 CRM197로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 단백질은 CRM197일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 상기 (b) 단계는 주변 세포질(periplasm)에 분비된 목적 단백질을 분리하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조 방법을 제공한다:

(b) 상기 생성된 목적 단백질을 분리하는 단계.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 방법은 목적 단백질이 이 대장균에서 잘 발현되도록 할 뿐만 아니라 주변 세포질(periplasmic)로의 분비 효율이 향상되도록 한다. 본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 방법을 통해 높은 수율의 단백질 생산이 가능하다.

도 1은 신호서열 S1 내지 S4 및 CRM197을 포함하는 플라스미드 구성을 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 대장균 BL21(DE3)에서, 신호서열 S1 내지 S4를 갖는 CRM197의 발현량을 나타낸 데이터이다.
도 3은 신호서열 S1 내지 S2를 갖는 재조합 대장균 플라스크에서의 CRM197 발현량을 나타낸 데이터이다.
도 4는 pET PAR-S2-CRM197 재조합 대장균의 각 배양 배지 조건에서의 CRM197 발현량을 나타낸 데이터이다.
도 5는 pET-PAR-S2-CRM197 재조합 대장균에서 CRM197 단백질의 회수 후 초기 정제된 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 데이터이다.
도 6은 pET-PAR-S2-CRM197 재조합 대장균에서 회수된 CRM197 단백질을 1차 정제 및 2차 정제 공정을 거친 후 SDS-PAGE 분석 결과로 나타낸 데이터이다.
도 7은 최종 회수된 CRM197 단백질이 대조군 단백질과 구조적으로 동일함을 확인하기 위해 CD(Circular Dichroism) 분석한 결과를 나타낸 데이터이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 기재는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 발명의 상세한 설명에 기재된 사항들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. CRM197 단백질의 제조

CRM197 단백질은 디프테리아 톡신 대비 ADP-리보실트랜스퍼라제(ADPRT) 활성이 결여되어 있어 비독성이다. (Bishai, et al.1987, "High-Level Expression of a Proteolytically Sensitive Diphtheria Toxin Fragment in Escherichia coli" J. Bact. 169(11):5140-51, Giannini, et al., 1984, "The Amino-Acid Sequence of Two Non-Toxic Mutants of Diphtheria Toxin: CRM45 and CRM197", Nucleic Acids Research 12(10): 4063-9, and GenBank Acc. No. 1007216A). CRM197 단백질은 디프테리아 톡신에 대한 야생형 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 제조되거나, 재조합 DNA 기술 및 특정 돌연변이 유발방식에 의해 제조될 수 있다.

참고로, 야생형 CRM197 단백질은 신호서열을 통해 디프테리아(C. diptheriae)로부터 세포외 공간으로 수송되고 분해되어, GADD의 아미노 말단 서열을 남긴다. 대장균에서 발현되는 경우 CRM197 단백질의 아미노 말단은 보존되고, 이황화 결합을 형성하기 위해, CRM197 단백질을 주변 세포질 공간으로 타겟팅한다.

실시예 2. 벡터 및 숙주세포 준비

본 발명의 핵산 구성체는 숙주 세포에서 핵산의 발현을 유도할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 또한 영양요구성 선별 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 영양요구성 선별 마커는 영양요구성 숙주 세포의 기본영양 (prototrophy)을 회복시키는 폴리펩티드를 지칭한다. 구체적인 준비 과정은 하기에 기술하였다.

실시예 3: 재조합 CRM197 단백질의 과발현 플라스미드 제조 및 발현 확인

실시예 3-1. CRM197 유전자 제조

대장균 내 발현이 최적화된 CRM197의 염기서열은 GeneArt (www.thermofisher.com)에서 합성하였다(서열번호 1). CRM197이 코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 2와 같다. (표 1)

	CRM197
서열번호 1 (CRM197 염기서열)	ATGAGCCGTAAACTGTTTGCCAGCATTCTGATTGGTGCACTGTTAGGTATTGGTGCCCCTCCGAGCGCACATGCCGGTGCAGATGATGTTGTTGATAGCAGCAAAAGCTTTGTGATGGAAAACTTTAGCAGCTACCATGGCACCAAACCGGGTTATGTGGATAGCATTCAGAAAGGTATTCAGAAACCGAAAAGCGGCACCCAGGGTAATTATGATGATGATTGGAAAGAGTTCTACAGCACCGATAACAAATATGATGCAGCAGGTTATAGCGTGGATAATGAAAATCCGCTGAGCGGTAAAGCCGGTGGTGTTGTTAAAGTTACCTATCCGGGTCTGACCAAAGTTCTGGCACTGAAAGTTGATAATGCCGAAACCATCAAAAAAGAACTGGGTCTGAGCCTGACCGAACCGCTGATGGAACAGGTTGGCACCGAAGAATTTATCAAACGTTTTGGTGATGGTGCAAGCCGTGTTGTGCTGAGCCTGCCGTTTGCAGAAGGTAGCAGCAGCGTTGAATATATCAATAATTGGGAACAAGCAAAAGCCCTGAGCGTTGAACTGGAAATCAATTTTGAAACCCGTGGTAAACGTGGTCAGGATGCAATGTATGAATACATGGCCCAGGCATGTGCAGGTAATCGTGTTCGTCGTAGCGTTGGTAGCAGCCTGAGCTGTATTAATCTGGATTGGGATGTGATTCGCGACAAAACCAAAACGAAAATCGAAAGCCTGAAAGAACATGGTCCGATCAAAAACAAAATGAGCGAAAGCCCGAATAAAACCGTGAGCGAAGAAAAAGCAAAACAGTATCTGGAAGAATTTCACCAGACCGCACTGGAACATCCGGAACTGAGCGAACTGAAAACCGTTACCGGCACCAATCCGGTTTTTGCGGGTGCAAATTATGCAGCATGGGCAGTTAATGTTGCACAGGTTATTGATAGCGAAACCGCAGATAATCTGGAAAAAACCACCGCAGCACTGAGCATTCTGCCTGGTATTGGTAGCGTTATGGGTATTGCAGATGGTGCAGTGCATCATAATACCGAAGAAATTGTTGCCCAGAGCATTGCCCTGAGCAGTCTGATGGTTGCCCAGGCAATTCCGCTGGTTGGTGAACTGGTTGATATTGGTTTTGCAGCCTATAACTTTGTCGAGAGCATCATTAACCTGTTTCAGGTTGTGCATAACAGCTATAATCGTCCGGCATATAGTCCGGGTCATAAAACCCAGCCGTTTCTGCATGATGGTTATGCAGTTAGCTGGAATACCGTTGAAGATAGCATTATTCGTACCGGCTTTCAGGGTGAAAGCGGTCATGATATCAAAATTACCGCAGAAAATACACCGCTGCCGATTGCCGGTGTTCTGCTGCCGACCATTCCGGGTAAACTGGATGTGAATAAAAGCAAGACCCATATTAGCGTGAACGGTCGTAAAATTCGTATGCGTTGTCGTGCAATTGATGGTGATGTTACCTTTTGTCGTCCGAAAAGTCCGGTTTATGTTGGTAATGGTGTTCATGCAAATCTGCATGTTGCATTTCATCGTAGCTCCAGCGAAAAAATTCATAGCAATGAAATTAGCAGCGATAGCATTGGTGTTCTGGGTTATCAGAAAACCGTGGATCATACCAAAGTGAATAGCAAACTGAGCCTGTTCTTTGAGATCAAGAGCTGA
서열번호 2 (CRM197 코딩 아미노산 서열)	MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS

실시예 3-2. 신호서열 유전자 제작

CRM197 단백질을 대장균의 주변 세포질로 효율적으로 타겟팅시키기 위해 고안된 신호서열을 하기의 표 2에 나타내었다. 대장균에서의 발현을 최적화하기 위해 코돈 사용빈도 및 단백질 2차 구조를 고려하여, 서열번호 3 내지 서열번호 6의 DNA 서열을 고안하였으며, 해당 서열들의 각 아미노산 서열을 서열번호 7 내지 10과 같이 나타내었다.(표 2)

신호 서열	염기서열 (5'→3')	아미노산 서열
S1	ATGCTGCGTCGTGATTTTCTGAAACTGCTGGCAGCAGCAACCACCATTGCAGCCGCACTGCCGGCAATGGCC (서열번호 3)	MLRRDFLKLLAAATTIAAALPAMA (서열번호 7)
S2	ATGAAAAAACTGAGCGGTGTTTTTGCAGCAGTTACCGCAGCAGTTAGCATTATGAGCGCACCGGCAATGGCA (서열번호 4)	MKKLSGVFAAVTAAVSIMSAPAMA (서열번호 8)
S3	ATGAAAAAAACCGCAATTGCACTGGCACTGGCAAGCACCGTTGCACTGACCGCACATGCA (서열번호 5)	MKKTAIALALASTVALTAHA (서열번호 9)
S4	ATGAAAAAACGTTTTGTGTATAAGCTGAGCGCCCTGGGTCTGGTTATGGGTATGAGCATTAGCGCAATGGCA (서열번호 6)	MKKRFVYKLSALGLVMGMSISAMA (서열번호 10)

실시예 3-3. CRM197 단백질 발현을 위한 플라스미드 제작

CRM197 단백질을 대장균 내 과발현 및 주변 세포질로 효율적 타겟팅시키기 위한 플라스미드를 아래의 방식으로 제조하였다. pET PAR 플라스미드 벡터를 제한효소 NdeI 및 XhoI으로 절단한 후, 아가로즈 전기영동을 이용하여 약 5.2kb의 DNA 절편(fragment)을 분리하였다. 신호서열 S1 내지 S4 서열을 가지는 프라이머와 합성한 CRM197을 주형으로 이용하여 PCR 방법으로 신호서열 S1 내지 S4를 갖는 CRM197을 증폭하였다. 증폭된 신호서열 S1 내지 S4 서열을 갖는 CRM197과 절단된 pET PAR 벡터를 In Fusion Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 결합한 후 E. coli DH5a (RBC Bioscinece)에 형질전환(transformation)하여 신호서열 S1 내지 S4를 갖는 CRM197 대장균 발현 플라스미드 pET PAR-S1-CRM197, pET PAR-S2-CRM197, pET PAR-S3-CRM197, pET PAR-S4-CRM197을 최종 제작하였다. 대조군으로서, CRM197 신호서열 Ori와, 대장균 유래 신호서열인 FlgI 또는 OmpA 를 가지는 CRM197을 동일한 방법으로 제작하여, 플라스미드 pET PAR-Ori-CRM197, pET PAR-FlgI-CRM197 및 pET PAR-OmpA-CRM197을 최종 완성하였다. 본 발명의 신호서열 S1 내지 S4 서열 및 CRM197을 포함하는 플라스미드 구성을 도 1에 나타내었다. (도 1)

실시예 3-4. 대장균에서의 CRM197 단백질 발현 확인

플라스미드 pET PAR-S1-CRM197, pET PAR-S2-CRM197, pET PAR-S3-CRM197 및 pET PAR-S4-CRM197와, 대조군인 pET PAR-FlgI-CRM197, pET PAR-OmpA-CRM197 및 pET PAR-Ori-CRM197 을 재조합 대장균 BL21(DE3)에 형질전환한 후 카나마이신 50 νg/ml을 함유하는 20mL의 LB 액체 배지에서 OD600 값이 0.2 내지 0.6에 도달할 때까지 배양한 후, 인듀서(inducer)로서 IPTG(Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranosid) 1 mM을 첨가하여 신호서열 S1 내지 S4를 갖는 CRM197 단백질의 발현을 각각 유도하였다. 배양 온도는 25℃ 내지 30℃로 하였다.

배양 후 세포를 회수한 후, 포스페이트 버퍼에 현탁 및 세포 파쇄(sonication) 하였다. 파쇄한 각 샘플을 SDS-PAGE를 수행하여 쿠마시 블루 염색을 진행하였고, 그 결과 신호서열 S1 내지 S4 서열을 갖는 CRM197 단백질이 각 대장균 내에서 정상적으로 발현되었음을 확인하였다 (도 2). 각 레인(lane)별 구성은 아래의 표 3과 같다.

No.	설명
Lane 1	분자량 마커
Lane 2	IPTG에 유도되지 않았던 BL21(DE3) 균주
Lane 3	대장균 유래 신호서열 FlgI을 갖는 CRM197
Lane 4	대장균 유래 신호서열 OmpA를 갖는 CRM197
Lane 5	CRM197 신호서열 Ori를 갖는 CRM197
Lane 6	신호서열 S1을 갖는 CRM197
Lane 7	신호서열 S2를 갖는 CRM197
Lane 8	신호서열 S3를 갖는 CRM197
Lane 9	신호서열 S4를 갖는 CRM197

실험예 1. 플라스크에서의 CRM197 단백질 발현 비교

S1 및 S2 신호서열을 포함하고 있는 pET PAR-S1-CRM197 및 pET PAR-S2-CRM197과, 대조군인 pET PAR-FlgI-CRM197 및 pET PAR-Ori-CRM197을 함유하는 재조합 대장균 BL21(DE3) 연구용 세포은행 (Research Cell Bank) 1 바이알(vial)을 해동하여, 카나마이신 50 νg/mL을 함유하는 LB 배지가 담긴 125 mL 삼각 플라스크에 접종하였다. 접종한 플라스크를 OD600 값이 0.8 내지 1.2에 도달할 때까지 37℃, 230 RPM에서 약 4 내지 6시간 동안 배양하였고, 글리세롤의 농도가 최종 20%가 되도록 배양액을 혼합하여 연구용 마스터 세포은행(Research Master Cell Bank)를 제작하였다.

플라스크에서의 CRM197 단백질 발현을 비교하기 위해, 연구용 마스터 세포은행 1 바이알을 해동하여, 카나마이신 50 νg/mL을 함유한 LB 배지 30 mL이 담긴 125 mL 삼각 플라스크에 접종하였다. 접종한 플라스크를 OD600 값이 약 0.6에 도달할 때까지 30℃, 230RPM 에서 약 7 내지 8시간 동안 배양하였고, IPTG 1mM을 첨가 후 23℃, 230 RPM에서 약 16시간 동안 추가 배양하였다. 배양액을 원심분리 후 세포 펠렛을 완충용액으로 현탁한 다음 세포를 파쇄하였다. 파쇄한 각 샘플과 각각의 상등액을 SDS-PAGE를 수행한 다음, 쿠마시 블루 염색하여 CRM197 단백질의 발현량을 각각 비교하였다 (도 3).

그 결과, S2 신호서열을 포함한 pET PAR-S2-CRM197의 발현량이 가장 높음을 확인하였다.(도 3의 lane 10) 아울러, S1 신호서열의 경우에도 타 대조군에 비해 뛰어난 발현량을 보이는 것을 확인하였다. (lane 8) 각 레인(lane)별 구성은 아래의 표 4와 같다.

No.	설명
Lane 1	분자량 마커
Lane 2	IPTG 유도하지 않은 pET PAR-FlgI-CRM197 재조합 대장균 펠렛
Lane 3	IPTG 유도하지 않은 pET PAR-FlgI-CRM197 재조합 대장균 상등액
Lane 4	pET PAR-FlgI-CRM197 재조합 대장균 펠렛
Lane 5	pET PAR-FlgI-CRM197 재조합 대장균 상등액
Lane 6	pET PAR-Ori-CRM197 재조합 대장균 펠렛
Lane 7	pET PAR-Ori-CRM197 재조합 대장균 상등액
Lane 8	pET PAR-S1-CRM197 재조합 대장균 펠렛
Lane 9	pET PAR-S1-CRM197 재조합 대장균 상등액
Lane 10	pET PAR-S2-CRM197 재조합 대장균 펠렛
Lane 11	pET PAR-S2-CRM197 재조합 대장균 상등액
Lane 12	reference CRM197 50 g/mL

실험예 2. 재조합 CRM197 단백질의 대량 배양

pET PAR-S2-CRM197을 함유하는 재조합 대장균 연구용 세포은행 1 바이알을 해동하여, 카나마이신 50 νg/mL을 함유한 LB 배지 30mL이 담긴 125 mL 삼각 플라스크에 접종하였다. 접종한 플라스크를 OD600 값이 0.8 내지 1.2에 도달할 때까지 37℃, 230 RPM에서 약 4 내지 5시간 배양하였고, 본 배양 배지 2L가 담긴 5L 발효조에 1% (v/v) 비율로 접종하였다. 배양에 사용한 배지와 용액의 조성을 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.

본 배양에 사용한 배지 조성

성분	본 배양 배지 (g/L)	Feeding 배지 (g/L)
Glucose	18	-
Glycerol	-	600
Yeast extract	18	35
(NH₄)₂SO₄	3.0	-
KH₂PO₄	6.25	-
Na₂HPO₄	6.25	-
MgSO₄·7H₂O	4.5	5
Na-L-glutamate H₂O	2.5	5
L-methionine	0.5	1
CaCl₂·2H₂O	0.2	0.6
Antifoam 204	2 mL	-
Trace element (100X)	10 mL	10 mL
Kanamycin 50 mg/mL	1 mL	-

본 배양에 사용한 trace element 용액 (100X) 조성

성분	Trace element 용액 (g/L)
FeSO₄·7H₂O	20
MnSO₄·H₂O	5.3
CoCl₂·6H₂O	1.3
ZnSO₄·7H₂O	7.5
CuCl₂·2H₂O	1.3
Na₂MoO₄·2H₂O	1.3

5L 발효조에서 배양을 28℃에서 시작하였고, 암모니아 용액을 이용하여 pH를 6.8로 유지하였다. 초기 교반속도는 500 rpm, 공기(air)는 0.5 vvm, 그리고 용존산소 (DO)는 20%로 설정하였고, 용손산소가 20% 미만으로 떨어지면 교반 속도를 증가시키고 산소(O₂)를 공급함으로써 20% 수준으로 유지되도록 하였다. 접종 후 약 13시간 후에 15 mL/hr의 속도로 피딩(feeding) 배지의 공급을 시작하였고, OD600 값이 약 90(±10)에 도달하면 온도를 23℃로 감소시킨 뒤, 피딩 배지의 공급 속도를 5 mL/hr 로 조정하였다. 염기 첨가를 통해 pH를 약 7.5 또는 7.8로 증가시킨 뒤, IPTG를 1 mM의 최종 농도로 첨가하여 CRM197 발현 유도를 시작하였다. 유도 후 약 24시간 동안 추가 배양한 다음, 원심분리(7000 rpm, 4℃, 30분) 및 회수된 세포 펠렛을 약 -20℃에서 보관하였다.

5L 발효조에서 CRM197 단백질의 발현 수율을 확인하기 위해, 세포 펠렛을 완충용액으로 현탁한 후 세포 파쇄(sonication) 하였으며, SDS-PAGE에서 대조군(reference) CRM197 단백질과 비교하여 정량 및 쿠마시 블루 염색한 결과를 도 4에 나타내었다 (도 4). 발현수율은 pH 7.5에서 약 3.5 g/mL, pH 7.8에서 약 2.2 g/mL 으로, pH 7.5에서 발현량이 더 높게 나오는 것을 확인하였다. 실험에 사용한 각 레인(lane)별 구성은 아래의 표 7과 같다.

No.	설명
Lane 1	분자량 마커
Lane 2	reference CRM197 200 g/Ml
Lane 3	reference CRM197 150 g/mL
Lane 4	reference CRM197 100 g/mL
Lane 5	reference CRM197 50 g/mL
Lane 6	IPTG 유도 전 배양액 (유도 pH 7.5) 20배 희석한 샘플
Lane 7	IPTG 유도 전 배양액 (유도 pH 7.8) 20배 희석한 샘플
Lane 8	IPTG 24시간 유도 후 배양액 (유도 pH 7.5) 20배 희석한 샘플
Lane 9	IPTG 24시간 유도 후 배양액 (유도 pH 7.8) 20배 희석한 샘플

실험예 3. 재조합 CRM197 단백질의 초기 정제

pET PAR-S2-CRM197을 사용하여 배양한 대장균 세포로부터 원형질 막 내 주변 세포질(periplasm)에 위치하는 재조합 CRM197 단백질을 회수 및 정제하고자 하기와 같이 진행하였다. 각 레인(lane)별 조건은 상기 실험예 2와 동일하다.

세포 배양액을 2 내지 8℃, 4,000 x g에서 30분간 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 세포 침전물은 단백질의 원형질막 유도 완충용액(50mM Tris + 20% sucrose + 10mM EDTA, pH 7.0)에 재현탁하여 2 내지 8℃ 에서 1 내지 4시간 동안 교반 수행하였다. 이후 4,000 x g에서 15분간 원심분리하여 세포를 회수하고, 동일한 양의 50mM Tris-HCl pH 8.0을 첨가하여 2 내지 8℃ 에서 1 내지 4 시간동안 교반 하였다. 이후 4,000 x g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하고, 0.45 um 필터를 이용하여 불순물을 제거하였다. 상기의 과정을 거쳐 회수된 재조합 CRM197 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 도 5 에 나타내었다. (도 5) 이는 상기 실험예 2의 결과값인 도 4와 동일하다.

실험예 4. 재조합 CRM197의 후기 정제

상기의 초기 정제를 통해 주변 세포질에 존재하는 재조합 CRM197 단백질을 회수한 후 다음과 같이 후기 정제를 진행하였다. 음이온 교환 크로마토그래피(Anionin exchange chromatography)를 통해 1차 정제를 수행하였으며, 회수된 CRM197 단백질을 별도의 정제 공정 없이 음이온 교환 수지 레진에 결합시켰고, 전도도를 증가시켜 결합된 CRM197를 용출시켜 1차 정제를 완료하였다.

음이온 교환 수지를 통해 1차 정제된 시료를 양이온 교환 크로마토그래피(Cationic exchange chromatography) 또는 멀티모달 크로마토 그래피를 통해 2차 정제를 진행하였고, pH와 전도도를 증가시켜 레진에 결합된 CRM197을 용출시켰다. 또한 2차 정제된 시료를 한외여과를 통해 농축시켜 CRM197을 정제하였다. 그 결과, pET PAR-S2-CRM197을 사용한 대장균 내 각 희석 농도 조건 의존적으로 CRM197 단백질 정제값이 도출되는 것을 최종적으로 확인하였다.(도 6) 또한, 각 실험에 사용한 각 레인(lane)별 구성은 아래의 표 8에 나타내었다.

No.	설명
Lane 1	대조군 재조합 CRM197, 400ug/mL 희석
Lane 2	대조군 재조합 CRM197, 200ug/mL 희석
Lane 3	S2 사용 재조합 CRM197, 400ug/mL 희석
Lane 4	S2 사용 재조합 CRM197, 200ug/mL 희석
Lane 5	S2 사용 재조합 CRM197, 100ug/mL 희석
Lane 6	S2 사용 재조합 CRM197, 1,000ug/mL 희석

실험예 5. 재조합 CRM197의 특성 분석

최종 수득된 재조합 CRM197 단백질의 2차 구조 분석을 위해서 CD (Circular Dichroism) 분석을 실시 하였다. 대조군으로는 ㈜유바이오로직스에서 생산한 재조합 CRM197을 사용하였다. 실험을 위한 대조군 및 재조합 CRM197 단백질 버퍼 조성을 동일하게 하기 위해 분자량 30kD의 원심분리 필터장치를 이용하여 멸균된 증류수로 버퍼를 교환하였다. 버퍼 교환시에는 4 ℃, 4000 rpm 조건에서 40분간 진행하였고 대조군과 재조합 CRM 197 단백질 농도는 로리법을 이용하여 측정하였다. 두 개의 시료의 농도는 0.05 mg/mL 로 멸균된 증류수를 이용하여 희석한 뒤 Far UV 측정을 위해 0.1 cm 큐벳(Path length)에 샘플을 0.3 mL 씩 로딩한 후 10회 반복 측정하여 평균값을 구하는 방식으로 진행하였다. 평균값을 “Mean residue molar elipticity” 단위로 수정 후 그 결과를 확인하였으며, 수득된 CRM197 단백질이 대조군 단백질과 구조적으로 동일함을 최종적으로 확인하였다.(도 6)

<110> CELLTRION <120> Method for Expressing Target Protein <130> CPD2021085KR <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1683 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197 <400> 1 atgagccgta aactgtttgc cagcattctg attggtgcac tgttaggtat tggtgcccct 60 ccgagcgcac atgccggtgc agatgatgtt gttgatagca gcaaaagctt tgtgatggaa 120 aactttagca gctaccatgg caccaaaccg ggttatgtgg atagcattca gaaaggtatt 180 cagaaaccga aaagcggcac ccagggtaat tatgatgatg attggaaaga gttctacagc 240 accgataaca aatatgatgc agcaggttat agcgtggata atgaaaatcc gctgagcggt 300 aaagccggtg gtgttgttaa agttacctat ccgggtctga ccaaagttct ggcactgaaa 360 gttgataatg ccgaaaccat caaaaaagaa ctgggtctga gcctgaccga accgctgatg 420 gaacaggttg gcaccgaaga atttatcaaa cgttttggtg atggtgcaag ccgtgttgtg 480 ctgagcctgc cgtttgcaga aggtagcagc agcgttgaat atatcaataa ttgggaacaa 540 gcaaaagccc tgagcgttga actggaaatc aattttgaaa cccgtggtaa acgtggtcag 600 gatgcaatgt atgaatacat ggcccaggca tgtgcaggta atcgtgttcg tcgtagcgtt 660 ggtagcagcc tgagctgtat taatctggat 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ttgcatttca tcgtagctcc 1560 agcgaaaaaa ttcatagcaa tgaaattagc agcgatagca ttggtgttct gggttatcag 1620 aaaaccgtgg atcataccaa agtgaatagc aaactgagcc tgttctttga gatcaagagc 1680 tga 1683 <210> 2 <211> 560 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197 <400> 2 Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp 20 25 30 Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr 35 40 45 Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys 50 55 60 Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser 65 70 75 80 Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn 85 90 95 Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly 100 105 110 Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys 115 120 125 Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly 130 135 140 Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val 145 150 155 160 Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn 165 170 175 Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe 180 185 190 Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala 195 200 205 Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu 210 215 220 Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr 225 230 235 240 Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser 245 250 255 Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu 260 265 270 Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu 275 280 285 Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala 290 295 300 Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp 305 310 315 320 Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly 325 330 335 Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu 340 345 350 Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala 355 360 365 Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn 370 375 380 Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr 385 390 395 400 Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His 405 410 415 Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg 420 425 430 Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu 435 440 445 Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly 450 455 460 Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg 465 470 475 480 Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys 485 490 495 Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu 500 505 510 His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu 515 520 525 Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp 530 535 540 His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 545 550 555 560 <210> 3 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1 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S3 <400> 9 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Leu Ala Leu Ala Ser Thr Val Ala Leu 1 5 10 15 Thr Ala His Ala 20 <210> 10 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S4 <400> 10 Met Lys Lys Arg Phe Val Tyr Lys Leu Ser Ala Leu Gly Leu Val Met 1 5 10 15 Gly Met Ser Ile Ser Ala Met Ala 20

Claims

서열번호 7 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 목적 단백질 발현용 신호 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 신호 펩티드는 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria)에서 유래된 것을 특징으로 하는, 목적 단백질 발현용 신호 펩티드.
제1항에 있어서, 주변 세포질(periplasm)로의 목적 단백질 분비 효율을 증가시킬 수 있음을 특징으로 하는, 목적 단백질 발현용 신호 펩티드.
제1항의 목적 단백질 발현용 신호 펩티드를 코딩하는 핵산.
제4항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 3 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제4항의 핵산; 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는 핵산 구조체.
제4항의 핵산; 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
제7항에 있어서, T7 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제7항에 있어서, 상기 목적 단백질은 접합 백신(conjugate vaccine)의 운반 단백질(carrier protein)인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제9항에 있어서, 상기 운반 단백질은 디프테리아 독소(diphtheria toxin, DT) 파상풍 독소(tetanus toxin, TT) 및 CRM197로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제10항에 있어서, 상기 CRM197은 서열번호 1의 염기 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제10항에 있어서, 상기 CRM197은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제6항의 핵산 구조체 또는 제7항의 발현 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
제13항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 재조합미생물.
다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 발현 방법:
(a) 제14항의 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 목적 단백질을 분리하는 단계.
제15항에 있어서, 상기 목적 단백질은 디프테리아 독소(diphtheria toxin, DT) 파상풍 독소(tetanus toxin, TT) 및 CRM197로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 발현 방법.
제15항에 있어서, 상기 (b) 단계는 주변 세포질(periplasm)에 분비된 목적 단백질을 분리하는 것을 특징으로 하는 발현 방법.