JP2017538444A - Ｃｒｍ１９７の高レベル発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチド - Google Patents

Ｃｒｍ１９７の高レベル発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチド Download PDF

Info

Publication number
JP2017538444A
JP2017538444A JP2017546275A JP2017546275A JP2017538444A JP 2017538444 A JP2017538444 A JP 2017538444A JP 2017546275 A JP2017546275 A JP 2017546275A JP 2017546275 A JP2017546275 A JP 2017546275A JP 2017538444 A JP2017538444 A JP 2017538444A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
crm
expression
polypeptide
seq
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2017546275A
Other languages
English (en)
Inventor
ゴエル アクシャイ
ゴエル アクシャイ
プラタプ ナーラーヤン ミシュラ ラヴィ
プラタプ ナーラーヤン ミシュラ ラヴィ
デーヴ マンテナ ナレンダー
デーヴ マンテナ ナレンダー
ダトラ マヒマー
ダトラ マヒマー
Original Assignee
バイオロジカル イー リミテッド
バイオロジカル イー リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バイオロジカル イー リミテッド, バイオロジカル イー リミテッド filed Critical バイオロジカル イー リミテッド
Publication of JP2017538444A publication Critical patent/JP2017538444A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本発明は、最適化した新規ポリヌクレオチド配列およびそのポリヌクレオチドで形質転換した宿主による、薬理学的に重要な細菌性のトキソイドまたは毒素タンパク質の高レベル発現に関する。詳細には、本発明はポリペプチドＣＲＭ１９７の高生産のための方法であって、本発明のポリヌクレオチドを用いて適切な宿主を形質転換して対応するタンパク質を過剰発現させるための方法、および発現したポリペプチドを単離するための方法を提供する。より具体的には、本発明は大腸菌におけるＣＲＭ１９７の高レベル発現、ならびにその単離および精製のための方法に関する。

Description

本発明は、最適化した新規ポリヌクレオチド配列およびそのポリヌクレオチドで形質転換した宿主による、細菌トキソイドの高レベル発現に関する。
本発明はまた、ポリペプチドＣＲＭ１９７の高生産のための方法であって、本発明のポリヌクレオチドを用いて適切な宿主を形質転換して対応するタンパク質を過剰発現させるための方法、および発現したポリペプチドを単離するための方法を提供する。
ジフテリア毒素（ＤＴ）は、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)が合成して分泌するタンパク質外毒素である。ジフテリア菌の毒素産生株は、毒素遺伝子を保有するバクテリオファージ溶原菌(lysogen)を含む。成熟型のＤＴは５３５個のアミノ酸を含有する単一ポリペプチドとして合成され、それは初期の５３６プロペプチドから誘導され、それが位置１９０、１９２および１９３においてタンパク質分解を受けて成熟毒素を形成する。このスプライシングまたはタンパク質分解の結果、ジスルフィド橋により互いに連結した２つのサブユニットＡおよびＢになる(Moskang et al Biol. Chem. 264: 15709-15713, 1989)。サブユニットＡは、触媒活性をもつＮＡＤ依存性ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ部分である。それは伸長因子−２(Elongation Factor-2)（ＥＦ−２）を不活性化するのに関与し、よって標的細胞においてタンパク質合成をダウンレギュレートする。
ジフテリア毒素は高毒性である；１分子が細胞に対して致死的となる可能性があり、１０ｎｇ／ｋｇの量が動物およびヒトを殺す可能性がある。このトキソイドの注射により人工免疫を付与する過程に、それをレシピエントによる摂取に対して安全にするために解毒プロセスを含めるべきである。一般的に、それは天然形態のＤＴをそれがワクチン調製に必要な抗原性をなお保持する様式で化学修飾することにより解毒された。
その後、交差反応性物質１９７(Cross Reacting Material 197)またはＣＲＭ１９７として知られる遺伝学的に解毒された形態のジフテリア毒素が導入された；それは本質的にＤＴの免疫学的交差反応特性を保持している。
ＣＲＭ１９７は、ジフテリア菌、Ｂ型肝炎、百日咳菌(Bordetella pertussis)、破傷風菌(Clostridium tetani)、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)を含むコンジュゲートワクチンの調製に用いられている。それは毒素産生型コリネファージ(corynephage)βのニトロソグアニジン変異形成、次いでそれを用いたジフテリア菌の感染により作製された(Uchida et al Nature New Biology (1971) 233; 8-11, Nucleic Acisd Res. 1984 May 25; 12(10): 4063-9)。
ＣＲＭ１９７は、ＤＴブースターまたはワクチン抗原としてのそれの使用の可能性について研究されてきた。ＣＲＭ１９７タンパク質はＤＴと同じ分子量をもつ；しかし、Ａサブユニットにおける１塩基の変化、すなわち野生型ＤＴのポリヌクレオチド配列における塩基の変化において異なり、グアニンからアデニンへの置き換えの結果、位置５２にアミノ酸置換が生じ、その結果、ＣＲＭ１９７においてはグリシンの代わりにグルタミン酸になる(Giannini G. et al., 1984)。この点変異の結果、毒性が有意に低減し、ＣＲＭ１９７はヒト用として安全になる。
ワクチンに使用するためのジフテリア毒素、たとえばＣＲＭ１９７の多量生産は、野生型細菌における発現レベルが低いため妨げられてきた。この問題は、これまでBishai et al., (J. Baeteriol. 189:5140-5151)によりＣＲＭ１９７を大腸菌(Escherichia coli)において発現させることによって対処されてきた：彼らはジフテリア毒素（ｔｏｘシグナル配列を含む）を含む組換え融合タンパク質の発現を記載している；しかし、これにより分解したタンパク質が生成した。活性形態の収率が低いのは、毒素の個々の特性、たとえばサイズおよび二次構造に応じて、分解、不適正フォールディング、または両方にも関連する。したがって、大部分の生物医薬と同様に、ＣＲＭ１９７の精製工程中に発現タンパク質の追加損失が生じ、それによりＣＲＭ１９７の生物活性形態の維持には困難が伴う。したがって、活性形態の細菌トキソイドＣＲＭ１９７の高レベル発現の達成に対するニーズがある。
WO 2011/042516には、細菌毒素をペリプラズム発現させることにより製造するための、下記の工程を含む改良法が開示されている：ａ）特定のシグナル配列が細菌毒素の配列に連結した発現ベクターを含む宿主細菌細胞の培養物を増殖させ、ｂ）細菌毒素がペリプラズム発現するように細菌毒素に連結した特定のシグナル配列を含むポリペプチドの発現を誘導する。
WO 2013/178974 A1には、ＣＲＭ１９７を大腸菌宿主において細胞内発現させるための方法であって、プロモーターおよび少なくとも１つの完全パリンドロームオペレーター(Palindrome Operator)配列に作動可能な状態で連結したＣＲＭ１９７をコードする遺伝子を含むベクターを発現させることを含む方法が開示されている。
WO 2015/134402A1には、大腸菌宿主の縮小ゲノム(reduced genome)において組換えＣＲＭ１９７を製造するための方法であって、ペリプラズムへのＣＲＭ１９７タンパク質の移行を指令するシグナル配列に融合したＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列が作動可能な状態で発現制御配列に連結したものを含む発現ベクターを含む縮小ゲノム大腸菌を、組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に適した条件下でインキュベートすることを含む方法が開示され、それによれば少なくともリットル当たり１グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量が得られ、その際、天然の親大腸菌株は１２株、好ましくはＫ１２ ＭＧ１６５５である。
US 2012/0128727 A1には、ポリペプチドＣＲＭ１９７をコードする単離された核酸分子、単離された核酸分子を含む発現ベクター、およびＣＲＭ１９７タグ融合タンパク質の組換え製造のための方法であって、組換え細胞をそのＣＲＭ１９７タグ融合タンパク質の産生に好ましい条件下で培養し、その融合タンパク質を単離することを含む方法が開示されている。
US 2012/0289688 A1には、下記により組換えポリペプチドをペリプラズム発現させるための方法が開示されている：（Ａ）グラム陰性宿主細胞の培養物を増殖させる；そして（Ｂ）タンパク質がペリプラズム発現するようにポリペプチドの発現を誘導する；その際、発現に際して下記の工程のうち１以上を実行する：（ｉ）工程ａ）のｐＨは工程ｂ）のｐＨより低い；（ｉｉ）工程ａ）の温度は工程ｂ）の温度より高い；または（ｉｉｉ）工程ａ）の基質供給速度は工程ｂ）の基質供給速度より高い。
US 2014/0050758 A1には、下記の工程を含む細菌トキソイドのペリプラズム発現のための方法が開示されている：ａ）グラム陰性宿主細胞の培養物を発酵培地中で増殖させる；その際、宿主細胞はポリヌクレオチドで形質転換されており、そのポリヌクレオチドは細菌トキソイドおよびペリプラズムシグナル配列をコードする；その細菌トキソイドの発現を誘導する；ｂ）宿主細胞を成熟させる；その際、成熟工程は下記を含む：Ｉ）宿主細胞にｐＨショックを施す：ＩＩ）栄養物を添加せずに宿主細胞をインキュベートする；あるいはＩＩＩ）宿主細胞に−２０℃より低い温度を施す；そしてｃ）細菌トキソイドを宿主細胞から抽出する；その際、抽出プロセスは浸透圧ショックを含み、グラム陰性宿主細胞は大腸菌、シュードモナス属(Pseudomonas)およびモラクセラ属(Moraxella)からなる群から選択され、宿主細胞は工程ｂ）に際して生存しており、この方法は１０〜５０００リットルの培養物を収容する発酵槽内で実施される。
US 8,530,171には、組換え毒素タンパク質をシュードモナス属宿主細胞において産生させるための方法が開示され、その方法は下記を含む：発現ベクターに毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列をライゲートさせる；シュードモナス属宿主細胞をその発現ベクターで形質転換する；そして形質転換したシュードモナス属宿主細胞を組換え毒素タンパク質の発現に適した培地中で培養する；その際、組換えキャリヤータンパク質はＣＲＭ１９７であり、組換えタンパク質は約０．２グラム／リットル〜約１２グラム／リットルの可溶性または活性ＣＲＭ１９７タンパク質収量で産生される。
ＣＲＭ１９７をキャリヤータンパク質として用いるコンジュゲート多糖ワクチンがヒト用として承認されている。これらには下記のものが含まれる：Ｍｅｎｖｅｏ（登録商標） （Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、すなわち髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)亜群Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ−１３５により引き起こされる侵襲性髄膜炎菌疾患を防止するために適用されるワクチン；Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（登録商標） （Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、すなわち髄膜炎菌Ｃ群コンジュゲートワクチン；ならびにＰｒｅｖｎａｒ（登録商標） （Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、すなわち肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の１３の血清型を標的とする小児用肺炎ワクチン；ならびにＨｉｂＴＩＴＥＲ（登録商標） （Ｗｙｅｔｈ）、すなわちインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)ｂ型ワクチン。さらに、ＣＲＭ１９７はジフテリア菌ワクチン接種のための追加免疫抗原としての使用の可能性をもち、他のワクチンに使用するためのキャリヤータンパク質として研究されている。
最近、可溶性形態のＨＢ−ＥＧＦを結合するＣＲＭ１９７の能力に関係する抗腫瘍作用の可能性のため、ＣＲＭ１９７に関心が高まりつつある(Mekada et al, US Patent Publication NO. 2006/0270600A1)。この抗腫瘍機能は、ＣＲＭ１９７だけでなくＤＴ毒素の他の無毒性誘導体（たとえば、二重変異体ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋ、または融合タンパク質ＧＳＴ−ＤＴ）にも起因する。これらの変異体は、ＣＲＭ１９７をコードする遺伝子から出発してＰＣＲにより構築された。しかし、それらの研究で全ＣＲＭ１９７は３５℃で１６〜１７時間増殖させたジフテリア菌の培養物を用いて産生された。ＣＲＭ１９７は上清から、硫酸アンモニウムによる初期沈殿、続いて連続３工程のイオン交換および疎水性クロマトグラフィーによって精製された(Mekada et al.,)。
よって、ＣＲＭ１９７を高収率およびコスト効果の高い様式で製造するための別法に対する明らかなニーズがある。したがって、ＣＲＭ１９７を経済的に製造するための方法は、ワクチンの研究、開発および製造を大幅に促進するであろう。
WO 2011/042516 WO 2013/178974 A1 WO 2015/134402A1 US 2012/0128727 A1 US 2012/0289688 A1 US 2014/0050758 A1 US 8,530,171 US Patent Publication NO. 2006/0270600A1
Moskang et al Biol. Chem. 264: 15709-15713, 1989 Uchida et al Nature New Biology (1971) 233; 8-11 Nucleic Acisd Res. 1984 May 25; 12(10): 4063-9 Giannini G. et al., 1984 Bishai et al., (J. Baeteriol. 189:5140-5151)
本発明の主な目的は、ＣＲＭ１９７の高レベル発現のために最適化したポリヌクレオチドを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ＣＲＭ１９７が得られるようにポリペプチドの発現を制御するための調節可能な方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、純粋な形態のＣＲＭ１９７を高収率で商業的に製造するための高レベル発現方法を提供することである。
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２を含む最適化したポリヌクレオチド配列、およびその最適化したポリヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に対して少なくとも７０％相同であるそれのバリアントを提供する。
他の態様において、本発明は、ポリペプチドＣＲＭ１９７の高レベル発現に有用な最適化したポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、４、５、６、７、８、９および１０から選択される（これらに限定されない）それの構造バリアントを提供する。
さらに他の態様において、本発明は、最適化したポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）、ならびにその最適化したポリヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に対して少なくとも７０〜８８％相同であるそれのバリアント、たとえばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、４、５、６、７、８、９および１０を提供する。
本発明はさらに、下記の工程を含む、ポリペプチドの製造方法を提供する：
ａ）本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２からなる最適化したポリヌクレオチド配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に対して少なくとも７０％相同であるそれのバリアントを選択し、
ｂ）場合により工程（ａ）のポリヌクレオチド配列を適切なベクター内へライゲートさせ、
ｃ）そのポリヌクレオチド配列を大腸菌宿主細胞に挿入または形質転換し、
ｄ）形質転換した宿主細胞を、ポリペプチドの高レベル発現のための培地中で培養し、
ｅ）誘導温度１０〜４０℃を維持してポリペプチドを産生させ、
ｆ）細菌ポリペプチドを宿主細胞から抽出し、次いで精製して、純粋なポリペプチドを高収率で得る。
前記で得たポリペプチドは、コンジュゲートした免疫原製剤の調製のためのキャリヤータンパク質として用いるのに適切である。
図１：ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２によりコードされる発現ＣＲＭ１９７に対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル実験を示す；列１：標準分子質量マーカー；列２および３：大腸菌培養抽出物の総細胞タンパク質から分離および精製し、それぞれ非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させたＣＲＭ１９７。 図２：ウサギポリクローナル抗体を用いて精製したＣＲＭ１９７のウェスタンブロット分析を示す；列１：分子量ラダー；列２および３は、それぞれ還元および非還元条件下で電気泳動したＣＲＭ１９７試料を含む。 図３：ＳＤＳ ＰＡＧＥは精製した可溶性画分を示す；列１：基準タンパク質；列２：タンパク質分子量マーカー；列３〜１０：プールしたポリペプチドＣＲＭ１９７。 図４：ＣＲＭ１９７の可溶化について実施した試験を示す電気泳動ゲル実験（ＳＤＳ ＰＡＧＥ １２％）；列１：ＣＲＭ１９７の尿素可溶化画分；列２：上清；列３：１回目のペレット洗浄からの試料；列４：２回目のペレット洗浄からプールした試料。 図５：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）；主溶出ピークは試料中のＣＲＭ１９７の存在を示す。 図６：一次アミノ酸配列同一性を決定するための、ポリペプチドＣＲＭ１９７のペプチド質量フィンガープリント（質量分析）。本発明の組換えＣＲＭ（ＢｉｏＥ ｒＣＲＭ）は基準ＣＲＭ１９７配列との１００％配列類似性を備えていた。 図７：エドマン分解(Edman degradation)によるｒＣＲＭ１９７のＮ末端配列確認。１０アミノ酸配列ＧＡＤＤＶＶＤＳＳＫ（Ｎ末端アセチル）は精製ポリペプチドの開始部分を示す。第１アミノ酸をＧと同定する。 図８：本発明の組換えＣＲＭ（ＢｉｏＥ ｒＣＲＭ）のＣＤスペクトルは基準ＣＲＭ１９７とオーバーラップしていた。二次構造パラメーターも分析し、基準との類似性を示した。この結果は、本発明の組換えＣＲＭ（ＢｉｏＥ ｒＣＲＭ）が基準ＣＲＭ１９７に構造的に類似することを示す。 図９：蛍光アッセイを用いた、本発明の組換えＣＲＭ（ＢｉｏＥ ｒＣＲＭ）と基準との構造同等性の確認。本発明の組換えＣＲＭ（ＢｉｏＥ ｒＣＲＭ）と基準ＣＲＭ１９７（Ｃ７ ＣＲＭ）とのオーバーレイＤＳＦプロフィール。このデータにより本発明の組換えＣＲＭ（ＢｉｏＥ ｒＣＲＭ）と基準Ｃ７−ＣＲＭ１９７との類似性が確認される。 図１０：ジスルフィド結合の確認。本発明の組換えＣＲＭ（ＢｉｏＥ ｒＣＲＭ）をタンパク質中の適正ジスルフィド結合の存在について分析した。２つのジスルフィド結合がタンパク質中に存在することが確認される；第１はアミノ酸１８６を２０１に連結し、第２結合はアミノ酸４６１を４７１に連結する。質量分析法を用いてＣＲＭ１９７中のジスルフィド結合を分析した。 図１１：ＣＲＭ１９７特異的ＥＬＩＳＡによる本発明の組換えＣＲＭ（ＢｉｏＥ ｒＣＲＭ）と基準ＣＲＭ１９７との抗原性類似性の確認。異なる供給源に由来するすべてのＣＲＭが類似のモノクローナル抗体認識プロフィールを示した。
医薬品またはワクチンとして使用するためのポリペプチドの発現は、宿主細胞系の高いバイオマスおよび／または生産性の達成を必要とする。ポリペプチド産生の効率は、多数の要因が存在しなければ有意に低減する可能性があり、それにはそのポリペプチドをコードする最適ポリヌクレオチド配列の使用が含まれる。遺伝子コードは縮重を示すことが知られており、それは同じアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列の相異に相当する。アミノ酸鎖の合成速度は個々の遺伝子からの全体的発現レベルにおける決定因子であり、それは発現構築体の設計に影響を及ぼし、重要性が高い。よって、最適ポリヌクレオチド配列の構築はポリペプチドの全体的発現レベルを決定するのに重要であり、十分に調節すべきである。それには、生物においてそれらのコドンが好まれる頻度、あるいは人工的ビヒクルまたはベクターの場合は希望する最近接頻度(nearest frequency)が含まれるが、それらに限定されない。これは、ｔＲＮＡ存在度(abundance)またはコグネイト(cognate)細胞ｔＲＮＡ頻度を反映し、それから同義コドン(synonymous codon)選択パターンを慎重に選ぶべきである。さらに他の要因には、二次構造形成のポテンシャル、ｍＲＮＡレベルおよびＲＮＡ安定性、その後に実施を予定している操作、合成経路なども含まれる。これらのパターンの選択は目的とする個々のタンパク質の最適化および発現宿主に伴って異なるので、これらの構造の発生を慎重に調節すべきである。
したがって、本発明の主な態様は、最適化したポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）およびそれの構造バリアントを提供する。
他の態様において、本発明は、ＣＲＭ１９７のポリペプチドの高レベル発現に有用な最適化したポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）、ならびに７０％以上の類似性をもつそれの構造バリアントであってＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、４、５、６、７、８、９および１０から選択されるもの（それらに限定されない）を提供する。
ペリプラズム発現は、意図する目的遺伝子から発現した生成物（たとえば、細菌トキソイドまたはジフテリアトキソイド）が宿主細胞内のペリプラズム間隙に分泌されることを表わす。
細胞質発現は、タンパク質が細胞の細胞質コンパートメントに発現し、細胞膜内に収容されることを表わす。
発現の誘導は、生成物が加速された速度で得られるようにポリヌクレオチドからの発現を誘導するために実施される工程を表わし、これは適切な誘導剤、たとえばＩＰＴＧ、アラビノース、マルトースなどの添加を伴うことができる。
本発明の最適化した配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、４、５、６、７、８、９および１０（それらに限定されない）から選択されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の他のバリアントに適用でき、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、野生型ジフテリア毒素の誘導体の製造における配列をも含む；野生型は同じ炎症特性および免疫刺激特性をもち、細胞の受容体ＨＢ−ＥＧＦに結合できるが、単一アミノ酸置換および標的宿主に対する細胞毒性の欠如においてＣＲＭ１９７と異なる。
ＣＲＭ１９７のポリヌクレオチド配列は、ジフテリア毒素の配列から(Greenfield, L. et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6853-6857)、またはGiannini G. et al., (1984)が示したＣＲＭ１９７のアミノ酸配列を参考として用いることにより誘導できる。こうして得た野生型ポリヌクレオチド配列を、宿主細胞において、より好ましくは宿主細胞としてのグラム陰性細胞、より好ましくは大腸菌において高発現させるために、最適化した。そのような本発明のポリヌクレオチド配列は、化学合成により、またはアセンブリー法(assembly procedure)を用いて作製できる。
さらに他の態様において、宿主細胞におけるＣＲＭ１９７の細胞内発現のための方法を提供し、その際、調節配列を含む発現構築体が本発明のポリヌクレオチドを発現させる。このポリヌクレオチド配列は、コードされるポリペプチドの指向性輸送のためのシグナル配列を伴うことができる。それは、宿主のペリプラズム間隙内に分泌するように目標を定めて発現するペリプラズムシグナル配列に作動可能な状態で連結させることができる。
本発明はまた、ＣＲＭ１９７の高レベル産生を提供し、その際、ポリヌクレオチドの発現に適した誘導温度を付与することにより、ペリプラズム間隙への指向性輸送のためのヘテロロガス配列なしにペリプラズム発現がもたらされる。
場合により、本発明のポリヌクレオチドはタグポリペプチドのポリヌクレオチドをも伴うことができる。タグの存在は、細胞質において、またタンパク質の後続精製について、タンパク質の安定性および溶解性を高めることも知られている。
これらのタグは、タグポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列を用いて、５’末端または３’末端に、単一で、または多重タグ付けに適切なように組み合わせて結合させることができ、それの細胞質内での安定性、および／または種々のタグペプチドに対する高い親和性を備えたマトリックスおよび樹脂を用いる後続精製を高める。本発明により使用できる種々のタグには、ＨＡタグ（ヘマグルチニン）、ＭＹＣタグ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩ、ＦＬＡＧ、ＨＰＣ(heavy chain of protein C(プロテインＣの重鎖))、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(glutathione-S-transferase)（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質(maltose-binding protein)（ＭＢＰ）、セルロース結合タンパク質(cellulose-binding protein)（ＣＢＤ）およびキチン結合タンパク質(chitin-binding protein)（ＣＢＰ）が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドを、当技術分野で周知の分子手法を用いて調節配列を含むベクター構築体に導入することもできる(参照：Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed., (1989))。これには、適切なプロモーター、複製起点、リボソーム結合部位、転写終止配列、選択マーカー、および多重クローニング部位が含まれるが、これらに限定されない。特に、効率的かつ特異的な構築体を含むプラスミドが好ましい；たとえば、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ酵素に対して特異的なＴ７プロモーターを含むもの。そのような方法は、限定ではないが、U.S. Patent Application NO. 2012/0128727; U.S. Pat. NO. 5,055,294; U.S.Pat. NO. 5,128,130; U.S.Pat. NO. 5,281,532; U.S.Pat. NO. 4,695,455; U.S.Pat. NO. 4,861,595; U.S.Pat. NO. 4,755,465およびU.S. Pat. NO. 5,169,760に開示されたものを参照できる。ジフテリア菌においてＣＲＭ１９７タンパク質を産生させるためのプラスミド系は、U.S. Pat. NO. 5,614,382にも記載されている。
一態様において、宿主細胞はグラム陰性宿主細胞である。大腸菌、杆菌属の種(Bacillus sp.)、シュードモナス属の種などの宿主細胞発現系がタンパク質の産生において広範に考察されている。一態様において、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは大腸菌におけるＣＲＭ１９７の細胞内発現のために用いられ、その際、宿主株はＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ａ１、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＤＨ５α、Ｗ３１１０、Ｂ８３４、ｏｒｉｇａｍｉ、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）、Ｔ７、ＥＲ２５６６およびＣ４３（ＤＥ３）から選択される。
好ましい態様において、本発明は細菌トキソイドをコードするポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を提供し、それは場合によりベクター内へライゲートされ、続いてそれは宿主細胞に挿入される。宿主細胞への挿入は、当技術分野で既知であるいずれかの方法により実施できる。そのような挿入または形質転換は、物理的または化学的な形質転換方法により実施できる。その後、転換したコロニーをペトリ皿上で抗生物質を添加して選択する。
本発明に用いる適切なベクターには、ｐＥＴ９ａ、ｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ３ｂ、ｐＥＴ３ｃ、ｐＥＴ５ａ、ｐＥＴ５ｂ、ｐＥＴ５ｃ、ｐＥＴ９ｂ、ｐＥＴ９ｃ、ｐＥＴ１２ａ、ｐＴＷＩＮ１、ｐＴＷＩＮ２、ｐＥＴ１２ｂ、ｐＥＴ１２ｃ、ｐＥＴ１７ｂ、ならびに一般に強力なファージＴ７プロモーターをもつすべてのベクター（たとえば、ｐＲＳＥＴＡ、ＢおよびＣ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）、ならびにｐＴＹＢ１、ｐＴＹＢ２、ｐＴＹＢ３およびｐＴＹＢ４が含まれるが、これらに限定されない。
他の態様において、大腸菌細胞を用いてＣＲＭ１９７をコードするポリヌクレオチドを発現させる。挿入されたポリヌクレオチドを適正な向きおよび位置についてシーケンシング法により確認する。得られた構築体を用いて、いずれか既知の化学的または物理的方法により宿主細胞を形質転換する。たとえば、宿主細胞を６．５ｋＶ．ｃｍ−１〜２５ｋＶ．ｃｍ−１の範囲の電界でエレクトロポレートする；本発明において宿主細胞を形質転換するために用いる好ましい化学的方法。これらの細胞を２５〜４０℃で３０分〜１２０分間、ＬＢまたはＳＯＣ培地のような適切な培地において増殖させ、次いで選択培地ペトリ皿へ移して２５〜４０℃に１０〜３６時間おくと、本発明のポリヌクレオチドを含有する陽性コロニーが選択される。
陽性コロニーの選択はマーカーを用いて、または用いずに実施できる。使用できる適切なマーカーは抗生物質、たとえばアンピシリン、カナマイシンなどから選択されるが、これらに限定されない。
全長ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、大腸菌のＴ７ポリメラーゼ陽性株におけるタンパク質の発現を誘導するＴ７ ｌａｃＩプロモーターに隣接してクローニングする。ポリヌクレオチドの発現はＴ７プロモーターにより緊縮制御され、これはＩＰＴＧの存在下または自動誘導培地中で誘導される。
宿主を培養するためのパラメーターをＣＲＭ１９７タンパク質の高レベル発現に最適化する。一態様において、培地成分、培養条件（増殖温度、誘導物質濃度および誘導時間を含む）を最適化する。使用する培地は、化学的に規定された培地、ＬＢ(Luria-Bertani(ルリア−ベルタニ))、ＴＢ(Terrific Broth(テリフィックブロス))、ＳＯＢ（Super Optimal Broth(超最適ブロス))、ＳＯＣ（Super Optimal broth with catabolic repressor(異化抑制因子を含む超最適ブロス))、ＹＴブロス(Yeast Extract and Tryptone(酵母エキスおよびトリプトン))、スーパーブロス(Super broth)、富栄養培地(rich media)、最少培地、無機培地などから選択できるが、これらに限定されない。培地の成分には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：炭素源、たとえばグルコース、スクロースまたはグリセロール；有機窒素源、たとえばペプトン、トリプトン、アミノ酸、または酵母エキス；無機窒素源が用いられ、これは特にたとえばアンモニウム塩、アンモニア水、およびアンモニアガスから選択できる；補足成分、たとえば低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトン類または他の成分を補足するもの。培地は当技術分野で既知の方法を用いて調製できる。
形質転換した宿主細胞を、小体積、たとえば５〜５０ｍｌで、ＬＢ、テリフィックブロスまたは化学的に規定された培地において、発現について試験することができる。発現を約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭおよび約１ｍＭからの範囲の種々の誘導物質濃度で行なうことができる。ポリペプチド発現を電気泳動設定で、好ましくはＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動で決定し、クーマシーブリリアントブルー（−）で染色した過剰発現バンドとして視覚化する。
その後、宿主細胞を５００ｍＬフラスコ培養に接種し；最適条件下で増殖させ、その間にＣＲＭ１９７発現が１６時間から３２時間まで継続した。定常的撹拌および好ましくは好気性条件下で培養した後、細胞を収穫し、細胞溶解する。細胞を溶解するためには既知のいずれかの方法を適用でき、好ましい方法には適宜な濃度の界面活性剤を含有する細胞溶解緩衝液が含まれる。細胞溶解後、タンパク質成分を１回以上の遠心工程でプールする。細胞溶解は、トリス−ＨＣｌ ２０〜５０ｍＭ ｐＨ７．５〜８．５、ＮａＣｌ １００〜１５０ｍＭ、界面活性剤０．５〜１．５％、およびプロテアーゼ阻害剤０．５〜１．５％を含有する緩衝液中で、撹拌しながら実施される。
一態様において、発現のための誘導温度は１０〜４０℃で実施される。一態様において、ＣＲＭ１９７は調節可能な誘導温度で誘導され、その際、誘導温度を１０〜２０℃に維持した場合、発現ＣＲＭ１９７のうち８０％より多くが可溶性画分中に存在する。他の態様において、誘導温度を２５〜４０℃に維持した場合、得られた発現ＣＲＭ１９７のうち８０％より多くが細胞質封入体(inclusion body)として不溶性画分中にあり、そこから可溶化工程後に、プールした細胞質画分から精製される。
一態様において、細胞質封入体を種々の濃度の尿素、本質的に１Ｍ尿素、または２Ｍ尿素、または３Ｍ尿素、または４Ｍ尿素、または５Ｍ尿素、または６Ｍ尿素、または７Ｍ尿素、または８Ｍ尿素、または９Ｍ尿素で可溶化する。
特定の態様において、可溶性ＣＲＭ１９７の収量は約０．１ｇ／ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌである。
特定の態様において、不溶性ＣＲＭ１９７の収量は約０．２５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌである。
発現したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーカラム、続いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。
よって、本発明は１より多い後続精製工程を伴い、イオン交換クロマトグラフィー工程ではＣＲＭ１９７のｐＩ値も利用し、それにより他の混在タンパク質からそれを分離する。最後に、ＣＲＭ１９７の量をＢＣＡ／ブラッドフォード／ローリー(BCA/Bradford/Lowry)アッセイにより定量し、１０〜１２％アクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で視覚化する。ポリペプチドの同定をウェスタンブロットおよび類似のイムノアッセイにより行なう。精製ポリペプチドの純度および統合性をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ法により測定する。こうして発現したタンパク質の収量は５００〜１０００ｍｇ／Ｌ（培地）であり、培養の添加物および条件ならびに精製工程の調節によりその後変動する可能性がある。本発明の方法は、誘導時間を調節し、その後クロマトグラフィー工程のｐＨおよび温度を調節する、工業的に適用できる方法をも提供し、簡単で低価格かつ労力を要しない方法を提供する。それは緩衝液またはそれのキットもしくは作業溶液の調製を伴う多大な工程の必要性を排除する。タグの除去に際して追加の緩衝液または塩類または酵素または装置を用意する必要がない。特定の態様において、精製ＣＲＭ１９７ポリペプチドは既に第１メチオニンアミノ酸を欠如している；それの存在は最終ＣＲＭ１９７タンパク質に望まれず、それの除去は追加の精製工程の必要性を伴う。こうして得られたポリペプチドは活性かつ自然形態である：それは第１アミノ酸としての望ましくないメチオニンを既に欠如しており、追加工程の必要性がない。ＣＲＭ１９７アミノ酸配列をインシリコ／バイオインフォーマティクスツールにより分析し、そのタンパク質において約３８．４％の疎水性を示した。ＣＲＭ１９７の等電点は約５．８１であることが認められた。ＣＲＭ１９７タンパク質は４個のシステインアミノ酸残基および２１個のプロリン残基を含んでいた。ポリペプチドのリフォールディングは、ＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼ活性を測定することによる機能アッセイにより確認される。生物物理学的／二次構造確認を、ポリペプチドの円偏光二色性(Circular Dichroism)（ＣＤ）分析（図８）および示差走査蛍光測定(Differential Scanning Fluorimetry)（ＤＳＦ）（図９）により行ない、市販のポリペプチド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と比較した。
他の態様において、適正なジスルフィド結合の存在を確認し、市販のＣＲＭ１９７ポリペプチド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と比較した（図１０）。生成ポリペプチドのアミノ酸配列の適正さも、ＣＲＭ１９７ポリペプチドを多重プロテアーゼで消化してアミノ酸配列をマッピングすることにより確認した（図６）。生成ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解シーケンシングにより確認した（図７）。
好ましい態様において、本発明は、ＣＲＭ１９７のポリペプチドの高レベル発現に有用な最適化したポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）、および７０％以上の類似性、好ましくは８５〜９９％の類似性をもつそれの構造バリアントを提供する。
さらに他の好ましい態様において、本発明は、大腸菌細胞におけるＣＲＭ１９７のポリペプチドの高レベル発現に有用な最適化したポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を提供する。
他の好ましい態様において、本発明は、核酸ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはそのバリアントを用いる、グラム陰性細菌細胞、好ましくは大腸菌における、下記の工程を含むジフテリア毒素もしくはＣＲＭ１９７またはそのバリアントの高レベル発現を提供する：
ａ）ポリペプチドＣＲＭ１９７をコードする、遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２またはそのバリアントを選択し、
ｂ）遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２を発現ベクター内へサブクローニングし、
ｃ）工程ｂの発現ベクターで宿主大腸菌細胞を形質転換し、
ｄ）形質転換した宿主細胞を、毒素タンパク質の発現に適した培地中で培養し、
ｅ）誘導物質としてＩＰＴＧを添加して３０〜４０℃の範囲の温度で融合タンパク質の発現を誘導し、
ｆ）不溶性形態の細菌トキソイドを宿主細胞から抽出し、
ｇ）純粋な形態のＣＲＭ１９７を０．５ｍｇ／ｌより多い収量で精製する。
精製はクロマトグラフィーを用いて実施される。クロマトグラフィー法はアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、もしくはイオン交換クロマトグラフィー、または２以上の組合わせであってもよい。好ましくは、ＣＲＭ１９７がタグ融合タンパク質と結合している場合、アフィニティークロマトグラフィーを用いてＣＲＭ１９７を他のタンパク質から分離できる。
他の好ましい態様において、カラム条件の温度およびｐＨのシフトを伴う簡単な工程も、結合したタグからのＣＲＭ１９７の溶離を容易にする。より具体的には、６．５〜８．５の範囲のｐＨおよび４℃〜３０°Ｃの範囲の温度を用いてＣＲＭ１９７をタグから分離できる。
他の態様において、本発明に従って製造したＣＲＭ１９７を、腸チフス菌(Salmonella typhi)、パラチフス菌(Salmonella paratyphi)、肺炎球菌(Pneumococcus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、髄膜炎菌(Meningococcus)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)および他の病原性細菌から単離された多糖分子とコンジュゲートさせるために使用する。
他の態様において、本発明に従って製造したＣＲＭ１９７を、ワクチン、たとえば腸チフス菌、パラチフス菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌および他の病原性細菌に対するワクチンのためのコンジュゲートしたキャリヤーとして使用する。
下記の例を参照して本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの例により決して限定されず、当業者に分かるように、本明細書に記載するパラメーターの範囲内のそのバリエーションを含むことを理解すべきである。
実施例１
工程（ｉ）：新規ＣＲＭ１９７遺伝子の合成：
全長ＣＲＭ１９７遺伝子を大腸菌コドン利用に応じて最適化した。ＣＲＭ１９７遺伝子最適化のために下記のパラメーターを用いた：コドン利用バイアス(Codon Usage Bias)、ＧＣ含量、ｍＲＮＡ二次構造、カスタム所望パターン(Custom Desired Pattern)、カスタム非所望パターン(Custom Undesired Pattern)、反復配列（直列反復(direct repeat)、逆方向反復(inverted repeat)、２組反復(dyad repeat)）、制限酵素認識部位（欠失または挿入）。
最適化したＣＲＭ１９７遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）をｐＵＣ５７プラスミドベクターの多重クローニング部位にＢａｍＨ１およびＳａｐ１制限部位を利用してクローニングして、ｐＵＣ５７＿ＣＲＭ１９７を作製した。ＣＲＭ１９７遺伝子を含むベクターを大腸菌ＤＨ５α宿主に形質転換し、クローンをＬＢ＋カナマイシン(LB + Kanamycin r)プレート上で選択した。ｐＵＣ５７における ＣＲＭ１９７遺伝子の存在および適正さをＡｇｅ Ｉ（ＣＲＭ１９７遺伝子内にある）およびＮｄｅ Ｉ（ｐＵＣ５７プラスミド内にある）によるｐＵＣ５７＿ＣＲＭ１９７プラスミドの制限消化により確認した。さらに、ＣＲＭ１９７の配列をＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシングにより確認した。
工程（ｉｉ）：発現ベクターｐＴＷＩＮ１内へのＣＲＭ１９７の挿入
ｐＵＣ５７＿ＣＲＭ１９７を保有する大腸菌ＤＨ５αを５０ｍｌの体積のＬＢ＋カナマイシン中で一夜増殖させた。細菌を遠心し、ペレットをプラスミドの単離に用いた。プラスミドの単離は、Ｑｉａｇｅｎプラスミド微量調製キット(Qiagen plasmid mini-prep kit)により製造業者の指示を用いて行われた。単離したプラスミドをノノ−ドロップにより定量した。
ｐＵＣ５７からＣＲＭ１９７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を切り取り、５μｇのプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＳａｐＩで消化した。消化したプラスミドを１％アガロースゲル上で泳動させ、ＣＲＭ１９７遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２，約１．６ｋｂ）に対応するバンドをＱｉａｇｅｎゲル抽出キット(Qiagen Gel extraction kit)により製造業者の指示を用いて精製した。その後、５μｇの発現プラスミドｐＴＷＩＮ１を同様にＢａｍＨＩおよびＳａｐＩで消化して、それにＣＲＭ１９７遺伝子と適合する制限部位を作製した。消化したｐＴＷＩＮ１を同様にＱｉａｇｅｎゲル抽出キットにより製造業者の指示に従ってゲルから精製した。
消化したＣＲＭ１９７遺伝子をｐＴＷＩＮ１に、Ｔ４リガーゼベースのＤＮＡライゲーションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により製造業者の指示を用いてライゲートさせた。ベクター（ｐＴＷＩＮ１）と挿入配列（ＣＲＭ１９７）を１：３、１：４、１：５の比率で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよび緩衝液の存在下に２０μｌの反応体積で混合した。ライゲーション混合物を１６℃で一夜インキュベートした。翌朝、５μｌのライゲーション混合物をＢＬ２１−ＤＥ３大腸菌発現宿主に添加／形質転換した。化学的形質転換プロトコルを用いてＢＬ２１を形質転換した。ライゲーション＋ ＢＬ２１細胞を氷中で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、４２℃で４５秒間のヒートショックを与えた。試料を室温に冷却し、５００μｌのＳＯＣ培地をそれに添加した。形質転換体を入れたチューブを３７℃、２００ｒｐｍで２時間インキュベートした。形質転換体のスクリーニングのために、そこから１００μｌの混合物をＬＢ＋アンピシリン(LB + Ampicilin)プレートに播種した。
ＣＲＭ１９７発現ＢＬ２１−ＤＥ３形質転換体を、翌朝、ルリアブロス＋アンピシリン(Luria Broth + Ampicilin)プレートから選択した。ルリアブロス＋アンピシリン上で増殖しているこれら５クローンを選択し、１０ｍｌのルリアブロス＋アンピシリン培地中、３７℃、２００ｒｐｍで一夜、増殖させた。培養物を遠心し、Ｑｉａｇｅｎプラスミド抽出キットによりプラスミドを細胞ペレットから抽出した。
クローンの適正さを証明するために、２μｇのプラスミドをＡｇｅＩおよびＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼでそれぞれ消化した。ＡｇｅＩ部位はＣＲＭ１９７中に存在し、ＡｐａＩはｐＴＷＩＮ１中に存在する。したがって、適正クローンの確認のために両酵素による二重消化を用いた。クローンはｐＴＷＩＮ１＿ＣＲＭ１９７（ＢＬ２１−ＤＥ３）として消化された。さらに、ＣＲＭ１９７遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシングによりクローンを確認した。細菌を１０ｍｌのルリアブロス＋アンピシリン中で一夜増殖させることにより、ＣＲＭ１９７発現ＢＬ２１のグリセロールストックを行なった。翌朝、４０％の無菌グリセロールを培養物に添加し、１ｍｌアリコートを凍結用バイアル(cryovial)に分注した。発現分析にさらに使用するために、バイアルを−８０度で保存した。
工程（ｉｉｉ）：ＣＲＭ１９７の発現の確認：
−８０度で保存したＢＬ２１クローンをルリアブロス＋アンピシリンプレートに画線した。プレートを３７度で一夜インキュベートした。単一コロニーを採取し、１５０ｍｌフラスコ内の５０ｍｌのルリアブロス＋アンピシリン培地に接種した。フラスコを３７度、２００ＲＰＭで、ＯＤ６００＝１までインキュベートした。ＯＤが目標点に達すると、５ｍｌの培養物を取り出し、それを非誘導培養として用いた。非誘導培養を使用時まで氷上で維持した。ＣＲＭ１９７遺伝子の発現を誘導するために、０．５ｍＭのＩＰＴＧを残り４５ｍｌの培養物に添加し、さらにフラスコを３０度および２００ｒｐｍの旋回でさらに４時間インキュベートした。４時間後に誘導培養物を収穫し、ＣＲＭ１９７の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１）およびウェスタンブロット（図２）により調べた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、誘導培養および非誘導培養の培養物１ｍｌ（両方ともＯＤ６００＝１に正規化）を１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中へ採取した。チューブを遠心し、ペレットを５０μｌのＰＢＳに再懸濁した。この懸濁液に還元剤（２×）を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ装填緩衝液５０μｌを添加した。混合物を１００度で５分間煮沸した。試料を室温で冷却し、誘導および非誘導培養物２０μｌを４〜１２％のトリス グリシンゲルに装填した。ゲルを１５０ボルトで１．５時間泳動させた。ゲルを採取し、クーマシーブリリアントブルー色素中で１時間インキュベートした。染色後、ゲルを４０％メタノール＝１０％酢酸を含有する脱色溶液で３時間脱色した。誘導培養物においてのみ見える約５８ＫＤのタンパク質としてＣＲＭ１９７発現が可視化された。ウェスタンブロットのために、別セットのゲルをＳＤＳ−ＰＡＧＥと同じ様式で泳動させ、ゲルをＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド膜）上にブロットした。膜を抗−ＣＲＭ１９７抗体によりイムノブロッティングした。ウェスタンブロットにおいて、ＣＲＭ１９７は約５８Ｋｄに単一の免疫反応性バンドとして現われた。非誘導培養物にはＣＲＭ１９７特異的バンドは見られなかった。この実験は、この実験において作製したクローンがｒＣＲＭ１９７タンパク質を発現できることを確認する。これらのクローンをさらにＣＲＭ１９７の大規模な製造および精製のために用いた。
工程（ｉｖ）：ＢＬ２１大腸菌からのＣＲＭ１９７の発酵および精製
１ｍｌバイアルのＢＬ２１大腸菌細胞を５０ｍｌのＬＢ＋アンピシリン培地に接種し、３７度、２００ｒｐｍで一夜増殖させた。発酵を２０Ｌ規模で行なった。大腸菌細胞を発酵槽に接種し、３０℃で培養した。培養物を０．５ｍＭのＩＰＴＧによりＯＤ６００＝２０で誘導した。誘導の１２時間後、発酵培養物を収穫し、遠心により細胞ペレットを調製した。細胞ペレットをホモジナイザー内で機械的に細胞溶解した。封入体（目的タンパク質ＣＲＭ１９７を内封している）を細胞溶解物の遠心により単離した。上清を廃棄し、封入体（ＩＢ）を含むペレットを保存した。８Ｍ尿素にペレットを再懸濁することによりＩＢをホモジナイズし、イオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質を精製した。発酵レベルのＣＲＭ１９７の量を測定した。全細胞溶解物を基準としての既知量のＢＳＡと一緒にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約５８ＫＤバンドとして現われたＣＲＭ１９７（図３）の量をデンシトメトリー分析により定量した。ＢＳＡを定量のための基準として用いた。タンパク質の総量は１．４グラムのＣＲＭ１９７／リットル（ＢＬ２１大腸菌細胞）であることが認められた。
前記で作製したＣＲＭ１９７の可溶化試験を電気泳動ゲル実験（ＳＤＳ ＰＡＧＥ １２％）で実施し、ＣＲＭ１９７の可溶化について実施した試験を示す；列１：ＣＲＭ１９７の尿素可溶化画分；列２：上清；列３：１回目のペレット洗浄からの試料；列４：２回目のペレット洗浄からプールした試料（図４）。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により試料中のＣＲＭ１９７の存在を判定した；主溶出ピークは試料中のＣＲＭ１９７の存在を示す（図５）。
前記で作製したＣＲＭ１９７の一次アミノ酸配列はペプチド質量フィンガープリント（質量分析）により判定され、基準ＣＲＭ１９７配列との１００％配列類似性を備えていた（図６）；
Ａ．ＢＥ ｒＣＲＭの消化物(peptic digest)をＬＣ−ＭＳにより分析したもの；
Ｂ．トリプシン、Ｇｌｕ−ＣおよびＡｓｐ−Ｎ消化したＣＲＭ１９７における配列カバレージ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１と同一、すなわち１００％の相同性を示す）。
前記で作製したｒＣＲＭ１９７のＮ末端配列をエドマン分解により確認した。１０アミノ酸配列ＧＡＤＤＶＶＤＳＳＫ（Ｎ末端アセチル）は精製ポリペプチドの開始部分を示す。第１アミノ酸をＧと同定する（図７）。
前記で作製したＣＲＭ１９７のＣＤスペクトルは基準ＣＲＭ１９７とオーバーラップしていた。この結果は、前記で作製した組換えＣＲＭ１９７が基準ＣＲＭ１９７と構造的に類似していることを示す（図９）。
前記方法により作製したＣＲＭ１９７のジスルフィド結合の確認を分析し（図１０）、２つのジスルフィド結合がタンパク質中に存在することを質量分析により確認した；第１はアミノ酸１８６を２０１に連結し、第２結合はアミノ酸４６１を４７１に連結する。
Figure 2017538444
Figure 2017538444
前記方法により作製したＣＲＭ１９７と基準ＣＲＭ１９７の抗原性類似性をＣＲＭ１９７特異的ＥＬＩＳＡによ確認した。異なる供給源に由来するすべてのＣＲＭが類似のモノクローナル抗体認識プロフィールを示した（図１１）。

Claims (13)

  1. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２を含む最適化したポリヌクレオチド配列、およびその最適化したポリヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に対して少なくとも７０％相同であるそれのバリアント。
  2. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２を含む最適化したポリヌクレオチド配列、およびその最適化したポリヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に対して少なくとも７０〜８８％相同であるそれのバリアント。
  3. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、４、５、６、７、８、９、１０から選択される、請求項１および２に記載のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２のバリアント。
  4. ａ）本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２からなる最適化したポリヌクレオチド配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に対して少なくとも７０％相同であるそれのバリアントを選択し、
    ｂ）場合により工程（ａ）のポリヌクレオチド配列を適切なベクター内へライゲートさせ、
    ｃ）そのポリヌクレオチド配列を大腸菌(Escherichia coli)宿主細胞に挿入または形質転換し、
    ｄ）形質転換した宿主細胞を、ポリペプチドの高レベル発現のための培地中で培養し、
    ｅ）誘導温度１０〜４０℃を維持してポリペプチドを産生させ、
    ｆ）細菌ポリペプチドを宿主細胞から抽出し、次いで精製して、純粋なポリペプチドを高収率で得る
    工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
  5. 適切なベクターが、ｐＥＴ９ａ、ｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ３ｂ、ｐＥＴ３ｃ、ｐＥＴ５ａ、ｐＥＴ５ｂ、ｐＥＴ５ｃ、ｐＥＴ９ｂ、ｐＥＴ９ｃ、ｐＥＴ１２ａ、ｐＴＷＩＮ１、ｐＴＷＩＮ２、ｐＥＴ１２ｂ、ｐＥＴ１２ｃ、ｐＥＴ１７ｂから選択されるプラスミドベクターである、請求項４に記載の方法。
  6. 大腸菌株が、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ａ１、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＤＨ５α、Ｗ３１１０、Ｂ８３４、ｏｒｉｇａｍｉ、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）、Ｔ７、ＥＲ２５６６およびＣ４３（ＤＥ３）から選択される、請求項４に記載の方法。
  7. ＣＲＭ１９７の収量が、約０．１g/ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌである、請求項４に記載の方法。
  8. ペリプラズム間隙内へ指向する輸送のためのヘテロロガス配列なしに、ポリヌクレオチドの発現に適した誘導温度を付与することによりペリプラズム発現が引き起こされる、請求項４に記載の方法。
  9. 誘導温度が１０℃から４０℃までの範囲である、請求項８に記載の方法。
  10. ポリペプチドがキャリヤータンパク質である、請求項４に記載の方法。
  11. キャリヤータンパク質がジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７である、請求項１０に記載のキャリヤータンパク質。
  12. ＣＲＭ１９７を、腸チフス菌(Salmonella typhi)、パラチフス菌(Salmonella paratyphi)、肺炎球菌(Pneumococcus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、髄膜炎菌(Meningococcus)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)および他の病原性細菌から単離された多糖分子とコンジュゲートさせた、前記請求項のいずれかに記載のＣＲＭ１９７。
  13. ＣＲＭ１９７を、ワクチン、例えば、腸チフス菌(Salmonella typhi)、パラチフス菌(Salmonella paratyphi)、肺炎球菌(Pneumococcus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、髄膜炎菌(Meningococcus)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)および他の病原性細菌に対するワクチンのためのコンジュゲートしたキャリヤーとして使用する、前記請求項のいずれかに記載のＣＲＭ１９７。
JP2017546275A 2014-11-20 2015-11-17 Ｃｒｍ１９７の高レベル発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチド Pending JP2017538444A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN4045/CHE/2014 2014-11-20
IN4045CH2014 2014-11-20
PCT/IN2015/000427 WO2016079755A1 (en) 2014-11-20 2015-11-17 Codon optimized polynucleotide for high level expression of crm197

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020115624A Division JP7042305B2 (ja) 2014-11-20 2020-07-03 Ｃｒｍ１９７の高レベル発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチド

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2017538444A true JP2017538444A (ja) 2017-12-28

Family

ID=55346156

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017546275A Pending JP2017538444A (ja) 2014-11-20 2015-11-17 Ｃｒｍ１９７の高レベル発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチド
JP2020115624A Active JP7042305B2 (ja) 2014-11-20 2020-07-03 Ｃｒｍ１９７の高レベル発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチド

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020115624A Active JP7042305B2 (ja) 2014-11-20 2020-07-03 Ｃｒｍ１９７の高レベル発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチド

Country Status (12)

Country Link
US (1) US10280409B2 (ja)
EP (1) EP3221339A1 (ja)
JP (2) JP2017538444A (ja)
CN (1) CN107109416A (ja)
AU (1) AU2015348922B2 (ja)
BR (1) BR112017010718A2 (ja)
CA (1) CA2968491C (ja)
EA (1) EA035117B1 (ja)
MX (1) MX2017006506A (ja)
SA (1) SA517381488B1 (ja)
WO (1) WO2016079755A1 (ja)
ZA (1) ZA201703150B (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3313436T (pt) 2015-06-23 2021-02-25 Biological E Ltd Vacina de conjugado pneumocócico multivalente
WO2018064444A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Biological E Limited Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates
WO2019043593A1 (en) * 2017-09-01 2019-03-07 Lorven Biologics Private Limited NUCLEIC ACID ENCODING CRM197 AND ENHANCED EXPRESSION PROCESS THEREOF
US20230018689A1 (en) * 2018-01-19 2023-01-19 Obi Pharma, Inc. Crm197 protein expression
WO2020033398A1 (en) * 2018-08-06 2020-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compositions and methods for treating atii cell-dependent lung diseases
KR102142255B1 (ko) * 2019-12-05 2020-08-07 주식회사 제노포커스 Crm197 단백질 발현 방법
GB202108650D0 (en) * 2021-06-17 2021-08-04 Inst De Medicina Molecular Joaeo Lobo Antunes Production of cross-reactive material 197 fusion proteins
KR20230102682A (ko) * 2021-12-30 2023-07-07 (주)셀트리온 목적 단백질의 발현 방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009520759A (ja) * 2005-12-22 2009-05-28 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 肺炎球菌多糖類コンジュゲートワクチン
JP2012531198A (ja) * 2009-06-25 2012-12-10 コンソルヅィオ インターユニヴァーシタリオ パー ロ シヴィルッポ デイ システミ ア グランデ インターフェイス シーエスジーアイ Ｃｒｍ１９７及びその誘導体の産生のための人工遺伝子の細菌発現
JP2013507113A (ja) * 2009-10-08 2013-03-04 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 発現系
JP2013529064A (ja) * 2010-03-30 2013-07-18 フェニックス インク． 組み換え型毒素タンパク質の高レベルの発現
CN103266125A (zh) * 2013-06-04 2013-08-28 北京民海生物科技有限公司 白喉毒素突变体crm197的制备方法
WO2014102265A1 (en) * 2012-12-27 2014-07-03 Glycovaxyn Ag Methods and compositions relating to crm197

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4755465A (en) 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
US5281532A (en) 1983-07-27 1994-01-25 Mycogen Corporation Pseudomas hosts transformed with bacillus endotoxin genes
US4695455A (en) 1985-01-22 1987-09-22 Mycogen Corporation Cellular encapsulation of pesticides produced by expression of heterologous genes
US4695462A (en) 1985-06-28 1987-09-22 Mycogen Corporation Cellular encapsulation of biological pesticides
US5128130A (en) 1988-01-22 1992-07-07 Mycogen Corporation Hybrid Bacillus thuringiensis gene, plasmid and transformed Pseudomonas fluorescens
US5055294A (en) 1988-03-03 1991-10-08 Mycogen Corporation Chimeric bacillus thuringiensis crystal protein gene comprising hd-73 and berliner 1715 toxin genes, transformed and expressed in pseudomonas fluorescens
US5169760A (en) 1989-07-27 1992-12-08 Mycogen Corporation Method, vectors, and host cells for the control of expression of heterologous genes from lac operated promoters
DE69434079T2 (de) 1993-03-05 2005-02-24 Wyeth Holdings Corp. Plasmid zur Herstellung von CRM-Protein und Diphtherie-Toxin
US20060270600A1 (en) 2005-05-26 2006-11-30 Eisuke Mekada Anti-cancer agents
GB201106225D0 (en) * 2011-04-13 2011-05-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
GB201209896D0 (en) 2012-06-01 2012-07-18 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Process
CN102766647A (zh) * 2012-07-25 2012-11-07 天津康希诺生物技术有限公司 在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及含该载体的白喉杆菌
US10479820B2 (en) 2014-03-03 2019-11-19 Scarab Genomics, Llc Enhanced production of recombinant CRM197 in E. coli

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009520759A (ja) * 2005-12-22 2009-05-28 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 肺炎球菌多糖類コンジュゲートワクチン
JP2012531198A (ja) * 2009-06-25 2012-12-10 コンソルヅィオ インターユニヴァーシタリオ パー ロ シヴィルッポ デイ システミ ア グランデ インターフェイス シーエスジーアイ Ｃｒｍ１９７及びその誘導体の産生のための人工遺伝子の細菌発現
JP2013507113A (ja) * 2009-10-08 2013-03-04 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 発現系
JP2013529064A (ja) * 2010-03-30 2013-07-18 フェニックス インク． 組み換え型毒素タンパク質の高レベルの発現
WO2014102265A1 (en) * 2012-12-27 2014-07-03 Glycovaxyn Ag Methods and compositions relating to crm197
CN103266125A (zh) * 2013-06-04 2013-08-28 北京民海生物科技有限公司 白喉毒素突变体crm197的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, 2010, VOL.156, P.245-252, JPN6019036991, ISSN: 0004228561 *

Also Published As

Publication number Publication date
SA517381488B1 (ar) 2021-10-17
MX2017006506A (es) 2018-03-12
EA035117B1 (ru) 2020-04-29
CA2968491C (en) 2023-09-26
US10280409B2 (en) 2019-05-07
AU2015348922B2 (en) 2020-01-23
AU2015348922A8 (en) 2019-03-14
JP7042305B2 (ja) 2022-03-25
EA201791118A1 (ru) 2017-10-31
ZA201703150B (en) 2019-05-29
WO2016079755A1 (en) 2016-05-26
JP2020171307A (ja) 2020-10-22
EP3221339A1 (en) 2017-09-27
CA2968491A1 (en) 2016-05-26
CN107109416A (zh) 2017-08-29
US20170306302A1 (en) 2017-10-26
AU2015348922A1 (en) 2017-06-01
BR112017010718A2 (pt) 2017-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7042305B2 (ja) Ｃｒｍ１９７の高レベル発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチド
US9346860B2 (en) Expression system
US10287330B2 (en) Methods and compositions relating to CRM197
KR20120099672A (ko) 발현 시스템
KR20160128362A (ko) 대장균에서 재조합 ｃｒｍ197의 향상된 생산
US20150184215A1 (en) Development of the soluble recombinant crm197 production by e. coli
Xu et al. Stability of plasmid and expression of a recombinant gonadotropin-releasing hormone (GnRH) vaccine in Escherichia coli
JP7446227B2 (ja) Ｃｒｍ１９７タンパク質の発現方法
OA18278A (en) Codon optimized polynucleotide for high level expression of CRM197
KR20180098541A (ko) 생물학적 활성 재조합 캐리어 단백질을 회수하기 위한 산업적 확장성이 있는 방법
US11060123B2 (en) Production of soluble recombinant protein without n-terminal methionine
RU2575621C1 (ru) ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО CRM197 НА ОСНОВЕ КЛЕТОК E. coli BL21 (DE3)
AU2001269305B2 (en) Expression system
US20210348174A1 (en) Production of Soluble Recombinant Proteins without N-Terminal Methionine in E-Coli
Manukhov et al. GroEL/GroES chaperone and Lon protease regulate expression of the Vibrio fischeri lux operon in Escherichia coli
AU2001269305A1 (en) Expression system
MXPA98002798A (en) Live attenuated bacteria of the species actinobacillus pleuropneumon

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20181010

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190926

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191226

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20200306