KR20220086450A - 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주 및 이를 이용한 바이오 기반 가소제 생산 방법 - Google Patents

글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주 및 이를 이용한 바이오 기반 가소제 생산 방법 Download PDF

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류미희
송봉근
심완수
홍윤재
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한국화학연구원
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Abstract

본 발명은 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주 및 이를 이용한 바이오 기반 가소제 생산방법에 관한 것이다.

Description

글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주 및 이를 이용한 바이오 기반 가소제 생산 방법{Recombinant Corynebacterium glutamicum strain for producing glutaric acid and a method of producing bio-plasticizer using the same}
본 발명은 글루타릭산을 선택적으로 생산하는 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주 및 이를 이용한 바이오 기반 가소제의 생산방법에 관한 것이다.
전 세계적인 석유수급 불안과 석유자원 고갈, 지구 온난화에 대한 위기의식으로 최근 산업 바이오 기술을 이용하여 바이오매스에서 유래한 대체 생산 방법이나 대체 화합물을 생산하기 위한 전 인류적인 노력이 바이오에너지, 바이오플라스틱, 바이오화합물 등의 다양한 분야에서 가시화되고 있다.
바이오매스를 활용하여 생산되는 바이오 플라스틱 시장의 경우 2002년 Natureworks사에 의해 상업화된 폴리유산 (Poly Lactic acid)이 연 14만 톤 규모로 생산되어 최근 시장이 급속히 확대되고 있다. PHA계 바이오플라스틱인 폴리-(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레레이트 {poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalarate)}(P(3HB-co-3HV))도 Metabolix와 ADM의 합작회사인 Telles에 의해 5만 톤 규모의 공장이 2010년 완공되어 제품이 시판되고 있다. 또한, 듀폰사가 생산하고 있는 바이오매스 기반의 1,3-프로판디올을 이용하여 PTT 고분자 제품이 현재 상용화되어 있다. 이외에도 숙신산 기반의 PBS 등도 활발히 개발되고 있다.
나일론 55와 나일론 45의 제조시 사용되는 C5의 글루타릭산(glutaric acid)은 주로 화학적 방법에 의해 생산하나, 바이오매스를 기반으로 제조하는 것도 가능하며, 미생물에서 자연적으로 생산되는 글루타릭산은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주에서 L-라이신의 이화작용 경로 중 중간체로서 생성됨이 보고된 바 있다.
슈도모나스 푸티다 균주에서 L-라이신(L-lysine)은 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB) 효소에 의해 5-아미노발레르아미드(5-aminovaleramide)로 전환되며, 상기 5-아미노발레르아미드는 델타-아미노발레르아미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소에 의해 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)으로 전환되고, 상기 5-아미노발레르산은 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT) 효소에 의해 글루타레이트 세미알데하이드(glutarate semialdehyde)로 전환되며, 상기 글루타레이트 세미알데하이드는 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소에 의해 글루타릭산(glutaric acid)으로 전환된다. 그러나 슈도모나스 푸티다 균주에서는 상기 과정에 의해 생산된 글루타릭산을 아세틸-CoA(acetyl-CoA)로 변환하는 과정을 더 포함한다.
재조합 균주를 이용하여 글루타릭산을 생산하는 종래 선행기술로서, 한국등록특허 제10-1271160호 및 선행논문 [Park, S. J. et al., Metab Eng., 42-47, 2013]에는 재조합 대장균 균주로부터 글루타릭산을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0132093호 및 선행논문 [Shin, J. H. et al., Microb Cell Fact., 15(1), 174, 2016]에는 재조합 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주로부터 글루타릭산을 제조하는 방법이 개시된 바 있다. 마지막으로, 선행논문 [Kim, H. T. et al., Metab Eng., 99-109, 2019]에는 DavT, DavD, DavB 및 DavA 효소를 포함하는 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 사용하여 글루타릭산을 생산 하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 선행논문 [Kim, H. T. et al., Metab Eng., 99-109, 2019]는 글루타릭산 생산 과정에서 과량의 라이신이 전환되지 않고 축적되는 현상이 있었다. 이는 라이신으로부터 글루타릭산을 생합성하는 효소들의 반응이 원활하게 진행되지 않음을 의미한다. 원인은 단일 플라스미드를 사용하여 DavTDBA 효소를 발현했던 곳에서 기인한다고 볼 수 있다. 라이신에서 5-아미노발레르산을 생산하는 모듈이 뒤쪽에 위치하는 것을 근거로 원활한 효소 발현이 되지 않는 것을 파악 할 수 있다. 추가적으로 라이신 생합성 경로 분석결과 4mol의 NADPH가 요구되는 것을 확인하였고 글루타릭산의 전구체가 되는 라이신의 원활한 합성을 위해 조효소 특이성이 전환된 효소를 도입하였다.
따라서, 본 발명은 기존의 싱글벡터 시스템이 아닌 듀얼벡터 시스템으로 재조합 균주를 개발하였다. 이는 라이신에서 글루타릭산을 생산하는 모듈을 두 부분으로 나누어 원활한 효소발현을 토대로 기존의 문제점이었던 라이신의 축적이 일어나지 않도록 하였다. 추가적으로 라이신 생합성 효소의 조효소 특이성 정보를 얻어 조효소 특이성이 전환된 효소를 도입하였다.
한편, 중합체 첨가제인 가소제는 점도가 저하되고 유연성과 가소성이 증가된 중합체를 전달하여 제조 시 중합체 처리를 용이하게 하는 데 사용된다. 가소제의 전 세계 생산량은 2014년 기준으로 840만 미터 톤에 달하며, 그 중 프탈레이트는 거의 90%를 차지한다(Malveda, Michael P, 2015; David F). 프탈레이트는 의료 산업부터 자동차 산업까지 다양한 산업 분야에 활용되는 플렉시블 폴리비닐클로라이드 (PVC) 생산에 주로 사용된다. PVC의 다용성을 확장하기 위해 개발된 몇몇 특수 가소제가 있다. 예컨대, 디옥틸프탈레이트(DOP)는 우수한 호환성, 처리성 및 물리적 특성을 나타내는 PVC 가소화에서 가장 일반적인 첨가제 중 하나이다(Rahman et al., 2004; Chielini et al, 2013). 그러나, 프탈레이트 기반 가소제는 내분비-방해 활성과 같은 잠재적인 독성 효과 등 프탈레이트 기반 가소제가 야기하는 안전 및 환경 문제에 대한 대중의 우려가 있기 때문에, 미국, 유럽, 캐나다를 포함한 몇몇 국가에서 규제 조치에 의해 제한되었다. 따라서, 규제 요건과 가소제의 바람직한 특성을 충족할 수 있는 DOP에 대한 개발은 여전히 필요한 상황이다.
예를 들어, dioxyladipate(DOA), dioxlazelate 및 dioxyl sebacate와 같은 알리파틱 디카복실산 에스터(aliphatic dicarboxylic acid ester)는 PVC에서 높은 플라스틱화 효율성을 보여 프탈레이트 무가소제로서 개발되었다(Rahman et al, 2004). 그 외에도, 탄소 중립적인 프로세스로 재생 가능한 자원으로부터 생산된 가소제를 개발하는데, 예컨대, 효율적인 플라스틱 특성을 가진 바이오 숙신산에서 파생된 바이오 기반이면서 동시에 비프탈레이트 가소제(DOS)가 녹색 가소제로서 개발되기도 하였다(Anastas and Warner, 1998; Jamarani et al., 2018; Erythropel et al., 2013).
글루타릭산 (DOS dioxil glutarate, DOG) 또한 바이오 기반 비프탈레이트 가소제와 마찬가지로, C5 선형 사슬 디카복시산으로서 가소제 역할을 할 수 있다. 나아가, 최근 재생원료에서 글루타릭산의 미생물 생산이 보고되고 있어 미생물 생산에서 수득한 글루타릭산의 추가 증식을 통해 새로운 녹색 가소제 개발로 이어질 수 있다는 전망이 있다. 하지만, 실질적으로 바이오 기반 글루타릭산의 가소제 성능은 지금까지 확인된 바는 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 이용하여 글루타릭산을 생산한 후, 이러한 바이오 기반의 글루타릭산을 이용하여 제조된 바이오 기반의 가소제가 녹색 바이오 가소제로서 우수한 효율을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2014-0132093호, 코리네박테리움 속 균주를 이용한 글루코스로부터 글루타릭산의 제조방법, 2014년 11월 17일, 공개. 한국등록특허 제10-1766964호, L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법, 2017년 08월 03일, 등록. 한국등록특허 제10-1271160호, 재조합 미생물을 이용한 글루타릭산의 제조 방법, 2013년05월 29일, 등록.
Park, S. J. et al., Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 5-aminovalerate and glutarate as C5 platform chemicals, Metab Eng., 42-47, 2013. Shin, J. H. et al., Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for enhanced production of 5-aminovaleric acid, Microb Cell Fact., 15(1), 174, 2016.
본 발명의 하나의 목적은 DavT, DavD 및 DapB를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1벡터; DavB 및 DavA를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제2벡터로 형질전환된, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하는 단계를 포함하는 글루타릭산 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 글루타릭산에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 글루타릭산을 에스테르화한 바이오-DOG에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하여 수득한 글루타릭산을 에스테르화하는 단계를 포함하는 바이오-DOG 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오-DOG을 포함하는 가소제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고분자 수지; 및 제20항 또는 제21항의 가소제 조성물을 포함하는, 고분자 수지 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 고분자 수지 조성물을 포함하는 고분자 필름에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 가소제 조성물을 이용한 가소화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 및 대장균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 리덕테아제(dihydrodipicolinate reductase; DapB)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1벡터; 및 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB) 및 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제2벡터로 형질전환된, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 제공한다.
상기 DavT 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davT)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 DavD 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davD)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 DavB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davB)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 DavA 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davA)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 DapB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(dapB)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 발현벡터는 히스티딘-태그(polyhistidine-tag, His-tag)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 히스티딘-태그는 6개 이상의 히스티딘(histidine) 잔기(residue)로 구성된 아미노산 모티프로, 본 발명에서는 6개의 히스티딘-태그를 사용한다. 구체적으로, 상기 히스티딘-태그는 DavB를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davB)의 N-말단에 위치할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 발현벡터는 NADH에 선호도가 증진된 변이형 DapB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 NADH에 선호도가 증진된 변이형 DapB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(dapBmut)은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. L- 라이신이 글루타릭산 생성의 핵심 전구체라는 점을 감안할 때, L- 라이신 생합성 경로 전반에 걸친 높은 NADPH 수요는 L-라이신의 효율적인 생산을 방해하여 글루타릭산의 수율을 낮출 수 있다. 본 발명의 목적상 NADH에 선호도가 증진된 변이형 DapB 효소를 코딩하는 dapBmut가 도입될 경우, L-라이신 플럭스가 증가되고 이는 글루타릭산 생산을 증가시키는데 도움을 줄 수 있다.
본 발명에서 제공하는 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주의 일 예로서, davT, davD, 및 dabB를 포함하는 pBL712 발현벡터; 및 davB와 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 각 발현벡터에 포함된 프로모터는 전사를 시작하는데 필요한 서열로, pL프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터, 합성 프로모터 등을 사용하는 것이 일반적이나, 최적의 발현세기를 나타내기 위해 구체적으로 합성 프로모터인 H30 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주의 다른 예로서 davB 및 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터; 및 davT 및 davD 가 포함된 pBL712 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주가 될 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
상기 용어 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물(상기 폴리뉴클레오티드)이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 발현벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 삽입된 외래 DNA가 발현될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
상기 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 형질전환에 사용될 수 있는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포 모두를 포함할 수 있으며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 사용될 수 있다. 예를 들어, 에스케리키아, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
형질전환은 폴리뉴클레오티드를 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아-매개 형질전환, PEG(polyethylene glycol), 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 입자 충격법(particle bombardment) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 실시양태는, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 이용하여, 글루타릭산을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 글루타릭산 생산방법은 구체적으로, (a) 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 배양물로부터 글루타릭산을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, davT, davD, 및 dabB를 포함하는 pBL712 발현벡터; 및 davB와 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주가 될 수 있다.
상기 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미하며 플라스크배양(flask culture), 회분식 배양(batch culture), 유가식 배양(fed-batch culture)등이 포함될 수 있으며, 구체적으로는 유가식배양 일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 배양은 회분식 배양 이외에 유가식 배양일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로 미생물의 발효 개시 전에 질소원이 포함된 배지를 첨가하는 것은 회분식 배양(batch culture)으로 균체증식 또는 물질생산에 필요한 모든 영양소를 함유한 배지를 접종하여 미생물 배양을 하는 것으로, 배양 중에는 새로운 배지의 첨가가 어렵다. 본 발명의 목적상 질소원이 포함된 배지에 재조합 벡터가 포함된 미생물을 접종하여 회분식 배양방법으로 발효하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 미생물의 발효시에 질소원이 포함된 배지를 첨가하는 것은 유가식 배양(fed-batch culture)으로 하나 이상의 영양소가 포함된 배지를 발효 개시 직후 또는 배양물이 어떤 단계에 도달한 후에, 또는 공급된 영양소가 배양물로부터 고갈되는 경우, 배양물에 연속적으로 공급하는 방식의 배양을 의미한다. 유가식 배양에서는 일반적으로 단일 영양소, 탄소원이 성장의 제한인자가 된다. 다른 종류의 영양소 제한을 이용할 수도 있는데, 예를 들면 질소원에 의한 제한, 산소에 의한 제한, 황에 의한 제한 및 인에 의한 제한 등이 있다. 본 발명의 목적상 재조합 벡터가 포함된 미생물의 발효시 질소원이 포함된 배지를 연속적으로 공급하는 것을 포함할 수 있다.
배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 탄산 칼슘을 사용하여 적정 pH 를 유지할 수 있고, 쉐이킹 속도를 조절하여 호기성 조건을 유지할 수 있다. 또한, 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있으며, 10 내지 160시간 동안 배양함이 바람직하다.
본 발명의 목적상 배지는 세포를 배양하는데 사용되는 배지, 목적하는 물질의 생산을 극대화하는데 사용되는 배지 등을 모두 포함한다.
구체적으로 "세포 배양 배지" 또는 "배양 배지" 는 다세포 유기체 또는 조직의 외측인 인공적인 시험관 내 환경에서 세포의 유지, 성장, 증식 또는 팽창을 위한 영양소 용액을 의미한다. 세포 배양 배지는 특정 세포 배양용으로 최적화될 수 있으며, 그 예로는 세포 성장의 지지를 위해 조제된 기본 배양 배지, 또는 목적 물질의 생산을 촉진하도록 조제된 세포 배양 생산 배지, 영양소들을 고농도로 농축시켜 만든 농축 배지일 수 있다. 영양소, 배지 성분이란 용어들은 배지를 구성하는 구성성분을 의미하는 것으로, 본 명세서에서 호환 사용되고 있다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 코리네박테리움 글루타미컴 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당 원으로는 글루코스, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인의 원료로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
구체적으로, "기본 배양 배지" 또는 "기본 배지"란 용어는 최소한의 세포의 성장을 지지할 수 있는 배지를 의미한다. 기본 배지는 탄소원, 질소원 이외에 비타민, 무기염류를 공급하는 배지를 의미한다.
또한 구체적으로, "세포 배양 생산 배지" 또는 "생산 배지"란 용어는 생물반응기에서 목적 물질의 발현을 극대화할 목적으로 사용되는 배지를 말한다. 생산배지는 기본배지와 동일하거나 달라질 수 있고, 만약 달라질 경우 기본배지 자체를 농축하거나 기본배지에 특정 성분들을 추가하는 방법으로 제작할 수 있다.
또한, "피딩(feeding) 배지" 및 "추가 배양배지"는 특정 영양소 또는 복수의 영양소로 구성된 배지로서 전부 기본배지의 농축 산물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자가 배양하는 세포에 따라 피딩 배지의 구성성분과 농도를 다양하게 제작할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 이용하여 생산된 글루타릭산을 제공한다.
또한, 상기 글루타릭산을 에스테르화한 바이오-DOG을 제공한다.
상기 용어 "재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주" 및 "글루타릭산"은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 용어 "바이오-DOG(bio-DOG, bio-Dioxil glutarate)"은 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 이용하여 제조된 글루타릭산을 에스테르화한 물질로서, 가소제로 사용될 수 있다.
상기 용어 "에스테르화(esterification)"는 산을 에스터로 변하게 하는 반응을 말하며 에스터화와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 에스테르화는 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주에서 생산된 글루타릭산을 에스테르화하는 것으로서, 예컨대 2-에틸헥사놀(2-ethylhexanol, 2HEX), n-OCA, 또는 HOX을 이용하여 글루타릭산을 에스테르화할 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 상기 바이오-DOG를 포함하는 가소제 조성물을 제공한다.
상기 용어 "바이오-DOG"는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 용어 "가소제"는 합성수지나 합성 고무 등에 첨가하여 가공성을 향상시키거나 유연성을 높이는 것을 말한다.
상기　가소제　조성물은 코팅제, 윤활유, 고분자 수지 등 가소제를 적용할 수 있는 것이면 제한 없이 적용 가능하고, 고분자 수지 중에서는 구체적으로는 폴리비닐클로라이드(PVC) 수지에 적용 가능한 것일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
상기 용어 "폴리비닐클로라이드(PVC)"는 고분자 수지 중 하나로서, 염화비닐의 단독중합체 및 염화비닐을 50%이상 함유한 혼성중합체를 말하며, 널리 사용되는 열가소성 중합체이다. 수익성 면에서 화학 산업 중 가장 가치 있는 제품 중 하나로 볼 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 이용하여 생산된 글루타릭산으로 바이오-DOG 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, (a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 배양물로부터 글루타릭산을 회수하는 단계; 및 (c) 상기 회수한 글루타릭산을 에스테르화하는 단계를 포함한다.
상기 용어 "재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주", "글루타릭산", "바이오-DOG", "배양", "배양물", "회수" 및 "에스테르화"는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 방법은 (b) 단계 이후, 글루타릭산을 분리 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 용어 "분리 정제"는 회수된 글루타릭산의 순도 등을 높이는 것으로서, 글루타릭산과 같은 특정 물질을 분리 정제하는 공지된 방법이면 제한 없이 사용될 수 있고, 구체적으로는 크로마토그래피, 보다 구체적으로는 HPLC 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 고분자 수지; 및 상기 가소제 조성물을 포함하는, 고분자 수지 조성물을 제공한다.
상기 용어 "가소제"는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 용어 "고분자 수지"는 분자량이 매우 큰 거대분자로 구성된 수지로서, 구체적으로는 "폴리비닐클로라이드(PVC)"일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 상기 고분자 수지 조성물을 포함하는 고분자 필름을 제공한다.
상기 용어 "고분자 수지"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 고분자 수지를 가소화하는 방법을 제공한다.
구체적으로, (a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 배양물로부터 글루타릭산을 회수하는 단계; (c) 상기 회수한 글루타릭산을 에스테르화하여 바이오-DOG을 합성하는 단계; 및 (d) 상기 바이오-DOG을 고분자 수지에 적용하는 단계를 포함한다.
상기 용어 "재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주", "글루타릭산", "회수", "에스테르화", "바이오-DOG" 및 "고분자 수지"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용하여 생산된 글루타릭산을 에스테르화하여 합성된 바이오-DOG를 사용한 플라스틱 PVC의 인장 강도, 인장 연장, 광학적 투과 및 흐림도가 기존에 사용되는 가소제인 DOS와 DOA와 큰 차이가 없는 것을 확인하였다(도 7 내지 도 9).
이러한 결과는 본 발명의 재조합 균주를 이용하여 생산된 바이오 기반의 글루타릭산으로 합성된 바이오-DOG가 현재 사용되는 다른 다른 디카르복실산 에스테르 가소제와 유사한 가소화 효율성을 갖는 것을 입증하는 것으로서, 프탈레이트 프리 가소제의 유망한 옵션이 될 수 있는 바이오 기반의 가소제 임을 시사하는 것이다.
본 발명은 기존의 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주의 문제점을 파악하여, 듀얼벡터 시스템을 통해 글루타릭산 생산량을 늘리는 방법 및 이를 이용한 가소제 생산 방법에 관한 것이다. 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 사용하여 글루타릭산을 생산하는 경우 생산량이 우수할 뿐만 아니라 부산물 없이 글루타릭산만 선택적으로 생산하는 것이 가능하며, 발효 규모에 상관없이 적용될 수 있다. 또한, 생산된 글루타릭산을 에스테르화하여 제조된 바이오-DOG은 종래 사용되는 프탈레이트 가소제의 유방한 옵션으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 핵심이 되는 듀얼벡터 시스템의 모식도이다.
도 2는 비교군인 C. glutamicum GTA-1 및 C. glutamicum GTA-2에서 글루타릭산 생산 및 듀얼 벡터 도입을 나타낸 것이다.
도 3은 NADH에서 NADPH로 보조 인자 친화도가 변경된 dapBmut 가 도입된 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 C. glutamicum GTA-1 (a), GTA-2 (b) and GTA-3(c)의 2.5 L batch fermentation에서 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 500 L 발효에서 글루타릭산 분리 및 정제과정을 나타낸 것이다.
도 6은 C. glutamicum GTA-3를 이용한 500 L 발효에서 글루타릭산 생산량을 나타낸 것이다.
도 7은 연질 PVC 시트의 기계적(인장강도, 신도)　시험분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 연질 PVC 시트의 광학적 특성(광투과율, 흐림도) 시험분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 바이오 기반 가소제를 연질 PVC에 적용하여 확인한 인장강도와 인장신장에 관한 결과이다.
도 10은 본 발명의 바이오 기반 가소제를 적용한 하이패션 피혁을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 시스템 구축
먼저, pCES208H30DapBmut을 구축하기 위해 E. coli dapBmut (R13A; Xu et al., Biotechnol Bioeng. Volume115, Issue7 ,July 2018:1764-1777) 유전자를 Cure bio (서울, 한국)로 합성하였다. 합성된 DNA 단편을 BamHI 및 NotI로 분해하고 BamHI/NotI로 분해된 pCES208H30GFP(Yim et al., Biotechnol Bioeng. 2013 Nov;110(11):2959-69.)로 연결하였다. 또한, pBL712H30DavTD는 각각 EcoRI/KpnI 및 KpnI/NotI 사이트에서 pBL712H30-MCS에 putida davT 및 putida davD를 순차적으로 삽입하여 구축하였다. pBL712H30DapBmut 및 pBL712H30DavTDDapBmut을 구축하기 위해 합성된 E. coli dapBmut 유전자를 NotI로 분해하고 NotI로 분해된 pBL712H30-MCS 및 pBL712 pBL712H30DavTD를 각각 연결시켰다.
상기, 모든 DNA 조작은 표준 절차에 따라 수행되었으며(Sambrook and Russell, 2001), 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 사용된 프라이머는 마크로젠 (대전, 대한민국)에서 합성 하였으며, 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
Primer 서열번호 Sequence (5'-3') Purpose
DavBHis-F 7 GGATCC ATG CAC CAT CAT CAC CAT CAC ATGAACAAGAAGAATCGACACC DavBHis
DavBHis-R 8 GCGGCCGC TTAATCTGCCAGGGCGATCGGG
DavA-F 9 GCGGCCGC AGGAGATATACAT ATGCGCATCGCACTGTACCAAG DavA
DavA-R 10 GCGGCCGC TTAGCCTTTACGCAGGTGCAGC
DavT-F 11 GGATCC AGGAGATATACAT ATGAGCAAAACCAACGAATCCTTG DavT
DavT-R 12 CCTGCAGG TTAGGCGATTTCAGCGAAGCAC
DavD-F 13 CCTGCAGG AGGAGATATACAT ATGCAGCTCAAAGACGCTCAG DavD
DavD-R 14 AAGCTT TTAGACGCTGATGCACAGGTATTT
DapBmut-F1 15 GAATTC AGGAGATATACATATGCATGATGCAAACATCCGC 1-DapBmut
DapBmut-R1 16 GGTACC TTACAAATTATTGAGATCAAGTACATC
DapBmut-F2 17 AAGCTT AGGAGATATACATATGCATGATGCAAACATCCGC 2-DapBmut
DapBmut-R2 18 AAGCTT TTACAAATTATTGAGATCAAGTACATC
H30-F 19 GCGCTCGAGAAAGTAACTTTTCGGTTAAGGTAGC H30 promoter
H30-R 20 GCGGAATTCCAATATACTCCTGCCCAACCAAC
pBL1-F 21 GACGTCATTCGGGGTCGTTCACTGG pBL1 origin
pBL1-R 22 CTCGAGCAACAACAAGACCCATCATAGTTTG
Sp-F 23 GACGTCGGTTTTTTGCTGAAACCTCAGGC Spectinomycin resistant gene
Sp-R 24 ACTAGTCTCACGCCCGGAGCGTAGCGAC
pBL712H30DavTD에는 디히드로디피콜리네이트 리덕테아제(DapB)를 변형시켜 NADH에 선호도가 증진된 효소(DapBmut)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입하여, pBL712H30DavTDDapBmut를 구축하였다. 또한, pCES208H30davBA 플라스미드는 davB 서열의 N-말단에 His6-tag 서열이 포함된 유전자를 삽입하여 pCES208H30DavBHisA 를 구축하였다.
이후, 상기 발현벡터를 코리네박테리움 글루타미컴 균주에 형질전환하여 하기 표 2의 균주를 확보하였으며, 사용한 플라스미드도 함께 나타내었다.
Strain and plasmid Relevant characteristic 비고
Strain
E. coli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F′ proAB lacI q Z△M15 Tn10 (TetR)]
C. glutamicum KCTC1857 Expired industrial l-lysine producer 비교군 1
C. glutamicum PKC 비교군 2
C. glutamicum Lys C. glutamicum PKC with pBL712H30DapBmut 비교군 3
C. glutamicum GTA-1 C. glutamicum PKC with pCES208H30DavTDBHisA 비교군 4
C. glutamicum GTA-2 C. glutamicum PKC with pCES208H30DavBHisA pBL712H30DavTD 비교군 5
C. glutamicum GTA-3 C. glutamicum PKC with pCES208H30DavBHisA pBL712H30DavTDDapBmut 실험군 1
Plasmid
pCES208H30DavTDBHisA pCES208H30GFP derivative; PH30 Promoter, P. putida KT2440 davTDB His A genes, KmR
pCES208H30DavBHisA pCES208H30GFP derivative; PH30 Promoter, P. putida KT2440 davB His A genes, KmR
pBL712H30DavTD pCES208H30GFP derivative; PH30 Promoter, P. putida KT2440 davTD genes, SpmR
pBL712H30DavTDDapBmut pCES208H30GFP derivative; PH30 Promoter, P. putida KT2440 davTD genes, E. coli mutant R13A dapB mut genes, SpmR
상기 듀얼 벡터 시스템에서 글루타릭산 생합성 모듈의 발현 수준을 조사하기 위해 실시간 qPCR 검출 시스템 (QuantStudioTM 3)을 사용하여 qPCR 분석을 수행하였다. 구체적으로, 듀얼 벡터 시스템을 보유한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 4℃에서 1분 동안 13000 rpm에서 원심 분리하였다. 이후, SET buffer와 tirzol (Qiagen, Venlo, Netherland)에서 lysozyme을 사용하여 total RNA를 추출하고 1 단계 키트 (Power SYBRTM Green RNA-to-CtTM)로 qPCR template에 RNA를 직접 사용하였다. 또한, 전사 수준을 분석하기 위해 100 ng의 주형 RNA와 200 nM의 각 프라이머를 실시간 qPCR 시스템에 추가하였다. qPCR에 사용된 프라이머는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다. 발현 수준은 Ct 값을 기준으로 상대적으로 분석되었다.
Primer 서열번호 Sequence (5'-3') Purpose
DavBHis-F 25 CGACCTGCCACAACTGTTTC DavBHis
DavBHis-R 26 TTCCAAAGTTCCTTCAGGCG
DavA-F 27 ATTGAGTATTGCGGGCAGAG DavA
DavA-R 28 AATCGGTCAGGTAGGGAAAC
DavT-F 29 CGAATCCTTGATGCAACGTC DavT
DavT-R 30 GATCACGGTCGAGTTCTTCG
DavD-F 31 CCAAGGTCCAGGAACACATC DavD
DavD-R 32 GTACGTCAACCAGGATGGTC
실시예 2: 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 균주로부터 글루타릭산의 생산 확인
상기 실시예 1의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 균주를 2㎖의 RG 배지(10g/L 글루코스, 40g/L 뇌심장침출액(brain heart infusion), 10g/L 육추출물(beef extract), 및 30g/L of D-솔비톨)가 포함된 14㎖의 둥근튜브(round bottom tube)에 접종하고, 30℃ 및 250rpm의 조건에서 오버나이트(overnight)로 배양하였다.
다음으로, 250㎖ 플라스크(baffled flask)에 20㎖의 CG50 배지 및 상기 오버나이트로 배양한 배양액을 넣고, 30℃ 및 250rpm의 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 이때 상기 CG50 배지는 1리터 기준 50g 글루코스, 15g 효모추출물(yeast extract), 15g (NH4)2SO4·7H2O, 0.5g KH2PO4, 0.5g MgSO4·7H2O, 0.01g MnSO4·H2O, 및 0.01g FeSO4·7H2O 이 포함되며, 급격한 pH 변화를 막기 위해 15g/L의 CaCO3을 첨가하였다.
< 2.5L batch fermentation >
2.5L batch 발효를 위해, 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 균주를 500㎖ 플라스크(baffled flask)에 50㎖의 CG50 배지 및 상기 오버나이트로 배양한 배양액을 넣고, 30℃ 및 250rpm의 조건에서 12시간 동안 배양하였다. batch 발효를 위해 세포는 초기 OD600 1을 접종하였다. 이때 상기 CG50 배지는 1리터 기준 100g 글루코스, 30g 효모추출물(yeast extract), 30g (NH4)2SO4·7H2O, 0.5g KH2PO4, 0.5g MgSO4·7H2O, 0.01g MnSO4·H2O, 0.01g FeSO4·7H2O, 0.5㎎ 비오틴(biotin) 및 0.3㎎ 티아민-염산염(thiamine-HCl)이 포함되며, 추가로 적절한 항생제를 첨가하였다. 또한, pH를 6.8로 유지하기 위해 28 % (v/v) NH4OH를 첨가하고, 거품형성 방지를 위해, Antifoam 204 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 주기적으로 첨가하였다.
< 5L fed-batch fermentation >
5L Fed-batch를 위해, 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 균주를 100㎖의 CG50 배지에서 30℃ 및 250rpm의 조건에서 12시간 동안 배양하였다. Fed-batch 발효는 Biostat B 플러스 컨트롤러(30°C, 1000rpm)가 있는 Satorius 5L jar fermenter 에서 수행되었으며, CG100 배지의 초기 부피는 1L이다.
글루코스의 농도는 feeding solution(750 g/L glucose, 270 g/L (NH4)2SO4·7H2O, 및 0.5 g/L MgSO4·7H2O)을 사용하여 10-30G/L로 유지하였다. 추가로 적절한 항생제를 첨가하였다. 또한, pH를 6.9로 유지하기 위해 28 % (v/v) NH4OH를 첨가하고, 거품형성 방지를 위해, 소포제를 주기적으로 첨가하였다. 샘플분석을 위해, 샘플을 주기적으로 수집하였다.
< 500L fed-batch fermentation >
500L Fed-batch를 위해, 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 균주를 2L의 CG50 배지에서 30℃ 및 250rpm의 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 상기 오버나이트로 배양한 배양액을 넣고, 30℃ 및 250rpm의 조건에서 교반 인큐베이터를 이용하여 Fed-batch 발효는 펌프를 사용하여, pH를 6.8로 유지하기 위해 28 % (v/v) NH4OH를 첨가하고, 거품형성 방지를 위해, 소포제를 주기적으로 첨가하면서, 500L jar fermenter(KoBio Tech, 한국)에서 수행하였다. 용존 산소 (DO)는 교반 및 aeration를 조정하여 24 시간까지 30 % 이하로 유지시켰다. 이후, DO는 거품 형성을 방지하기 위해 24 시간 후에 제어하지 않았다. 글루코스의 농도는 feeding solution(690 g/L glucose, 270 g/L (NH4)2SO4·7H2O, 및 0.5 g/L MgSO4·7H2O)을 사용하여 10-25G/L로 유지하였으며, 50L 발효기를 사용하여 feeding하였다. 추가로 적절한 항생제를 첨가하였다.
Biostat B 플러스 컨트롤러(30°C, 1000rpm)가 있는 Satorius 5L jar fermenter 에서 수행되었으며, CG100 배지의 초기 부피는 1L이다.
글루코스의 농도는 feeding solution(750 g/L glucose, 270 g/L (NH4)2SO4·7H2O, 및 0.5 g/L MgSO4·7H2O)을 사용하여 10-30G/L로 유지하였다. 추가로 적절한 항생제를 첨가하였다. 또한, pH를 6.9로 유지하기 위해 28 % (v/v) NH4OH를 첨가하고, 거품형성 방지를 위해, 소포제를 주기적으로 첨가하였다. 샘플분석을 위해, 샘플을 주기적으로 수집하였다.
<HPLC 분석 조건>
글루코스 및 재조합 코리네박테리움 글루타미컴으로부터 생산된 글루타릭산을 측정하기 위해, 하기 표 4의 조건으로 HPLC를 수행하였다.
Figure pat00001
실시예 3: 조효소 특이성이 변형된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 균주로부터 글루타릭산의 생산 확인
L-라이신 생합성 경로의 핵심 효소 중 하나 인 DHDPR (dihydrodipicolinate reductase)은 dapB 유전자에 의해 암호화되며 탈수 효소와 NAD(P)H-의존적 환원 효소와 같은 촉매 활성을 갖는 이중 기능을 갖는 것으로 알려져 있다 (Girish et al., FEBS Letters 585 (2011) 2561-2567). 공지된 C. glutamicum dapB 유전자는 NADH보다 NADPH에 더 높은 특이성을 보인 반면 E. coli dapB 유전자는 NADH에 더 높은 친화성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Cirilli et al., Biochemistry, 2003, 42, 36, 10644-10650; Xu et al., Microbial Cell Factories, volume 17, Article number: 105 (2018)). NADPH의 세포 내 농도가 NADH보다 낮다는 점을 감안할 때, NADPH에 대한 의존성을 완화하기 위해 E. coli dapBC115G, G116C를 도입하여 C. glutamicum에서 DHDPR의 보조 인자 친화도가 NADPH에서 NADH로 변경되어 결과적으로 L- 라이신 생산이 증가한다고 알려져 있다(Xu et al., Microbial Cell Factories, volume 17, Article number: 105 (2018)).
상기와 같은 내용을 토대로 L-라이신 플럭스를 지원하기 위해, E. coli DHDPR에 돌연변이 R13A 인 dapBmut (dapBC115G, G116C)을 도입하여 C. glutamicum PKC를 추가로 제조하였다(도 3a). L-라이신 생산의 증가를 확인하기 위해, pBL712DapBmut (C. glutamicum Lys)을 포함하는 균주의 성능을 bacth 발효에서 확인하였다(도 3b).
그 결과, 포도당 소비와 세포성장률은 C. glutamicum Lys와 C. glutamicum PKC 균주 모두 비슷하였으나, L-라이신 생산은 C. glutamicum Lys가 1.1배 더 높음을 확인할 수 있었다. 이에, 글루타릭산 생산을 위한 L-라이신 플러스를 증가시키기 위해, C. glutamicum GTA-2(C. glutamicum PKC with pCES208H30DavBHisA pBL712H30DavTD)에 dapBmut가 도입시키고, 도입된 균주를 C. glutamicum GTA-3(C. glutamicum PKC with pCES208H30DavBHisA pBL712H30DavTDDapBmut)라 명명하였다. (도 3c).
상기, 변형된 시스템을 확인하기 위해, C. glutamicum GTA-1(C. glutamicum PKC with pCES208H30DavTDBHisA), C. glutamicum GTA-2(C. glutamicum PKC with pCES208H30DavBHisA pBL712H30DavTD) 및 C. glutamicum GTA-3(C. glutamicum PKC with pCES208H30DavBHisA pBL712H30DavTDDapBmut)를 포함하는 균주를 bacth 발효를 하였다(도 4).
그 결과, 회분식(bacth) 발효에서는 C. glutamicum GTA-1 균주는 글루타릭산이 24.2g/L가 생산되었으며, L-라이신은 11.2g/L 생성되었다. C. glutamicum GTA-2 균주에서는 글루타릭산이 27.6g/L이 생산되어, C. glutamicum GTA-1균주의 생산량보다 14% 증가함을 확인하였다. 또한, L-라이신은 XX.Xg/L 생성되어 C. glutamicum GTA-1균주의 라이신 생산량보다 80% 감소함을 확인하였다. C. glutamicum GTA-3 균주는 27시간 후, 글루타릭산이 28.7 g/L로 생산되는 것을 확인할 수 있었으며, 회분식(bacth) 발효가 끝날 때 배지에서 소량의 L-라이신(5.1g/L) 및 5-AVA(3g/L 이하)도 확인되었다.
다만, 유가식(fed-bacth) 발효에서는 C. glutamicum GTA-1 균주는 글루타릭산이 47.4g/L가 생산되었으며, L-라이신은 24.4g/L 생성되었다. 이는 L- 라이신을 글루 타르 산으로 완전히 전환하여 글루타릭산 수율을 더욱 향상시킬 수 있음을 시사하는 것이다. C. glutamicum GTA-2 균주에서는 글루타릭산이 61.8g/L이 생산되었으며, 이는 C. glutamicum GTA-1균주의 글루타릭산 생산량보다 30% 증가한 것이다. 또한, L-라이신은 1g/L 미만으로 감소하고, 5-AVA는 1.7g/L 생성되었다. 또한 C. glutamicum GTA-3 균주는 글루타릭산이 65.6g/L로 생산되는 것을 확인할 수 있었으며, C. glutamicum GTA-2 균주가 생산한 글루타릭산보다 3.8g/L 더 높음을 확인할 수 있었으며(도 3d), L-라이신(5.1g/L) 및 5-AVA도 모두 전환되어 발효가 끝날때까지 배지에서 검출되지 않았다.
이를 통해, L-lysine 플럭스의 증가에 관계없이 높은 생산량과 높은 선택성을 갖춘 글루타릭산 생합성 균주가 제조되었음을 알 수 있다.
실시예 4: 재조합 코리네박테리움 글루타미컴를 사용한 스케일업 발효에서 글루타릭산의 생산 확인
C. glutamicum GTA-3를 사용하여 대용량에서 발효를 수행하였다 (도 5). 그 결과, 34 mol/mol의 수율을 가진 56g/L의 글루타릭산이 얻어졌다. L-라이신 및 5-AVA와 같은 미량의 전환되지 않은 전구체는 발효가 끝날 때 각각 2.52 g/L 및 3.55g/L의 농도로 검출되었다(도 6).
이는, 본 발명에서 제조한 재조합 균주는 발효 규모에 관계없이 적용될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 5: 가소제 합성 및 연질 PVC 필름의 물리적 특성 확인
바이오 기반으로 제조된 가소제의 효율을 평가하기 위해 역류 콘덴서와 자기 교반기를 장착한 250mL의 2목 원형 바닥 플라스크에 2-에틸헥사놀 73.92g(0.57mol, 초과), nOCN 또는 HOX와 글루타르산 25g(0.19mol)을 혼합하여 180℃로 가열하고 12시간 동안 역류 상태에서 반응시킨 후, 촉매로 Tinoxalate(2-에틸헥사놀의 0.1 wt%)를 사용하여 바이오-DOG를 합성하였다. 그 후, 회전 증발기를 사용하여 알코올을 제거한 후 증류로 합성된 DOG를 정제하였다. 상기 정제된 바이오-DOG을 1H 및 13CNMR 분광법을 사용하여 특성을 확인한 후, 이를 PVC에 추가하여 부드럽고 신축성 있게 만들었다.
구체적으로, 기계식 교반기를 갖춘 내부 믹서에 PVC 페이스트 100개(고무 100개당 부품), 각 다이카복시산 에스터 60개, 및 열안정제 2개(CZ-400)를 추가하였다. 이 후, 상기 혼합물을 12분 동안 165℃로 가열하고, 필름들이 입수될 때까지 3분 동안 175℃에서 2,500 psi로 압축 성형 과정을 수행하였다.
그 외에도, nOCA와 HOX 및 2HEX-poly를 사용하여 바이오-DOG를 합성하였다.
이 후, 본 발명의 바이오-DOG로 제조된 각 PVC 필름의 인장강도, 인장연장, 광투과, 흐림도(haze) 등 물리적 특성을 확인하였으며, 대조군으로서 DOG와 탄소 번호가 유사한 DOS(동남합성, 공주) 및 DOA(동남합성, 공주)를 PVC에 적용한 이들과 특성을 비교하였다.
참고로, 플라스틱 PVC 필름의 인장 강도와 인장 연장은 상온에서 범용 테스트 머신(LR30K, LLOID Instruments)으로 조사하였고, 플라스틱 연성 PVC 필름의 투과와 흐림도는 헤이즈 미터(HAM-300, Everfine)로 측정하였다.
그 결과, 도 7 및 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 바이오 기반 글루타릭 가소제가 적용된 연질 PVC 시트의 인장강도는 1.2~1.6kgf/mm2로서, 목표치인 1.2kgf/mm2 이상임을 확인할 수 있었다. 또한, 인장신도는 356~396%로 모두 340% 이상으로 우수함을 확인하였다.
가소제 종류에 따른 연질 PVC 시트 인장강도 및 인장신도
구분 인장강도(kgf/mm2) 인장신도(%) 시험규격
DOA 1.6 376 ASTM D 412-16,
-시험편: 아령형 C,
-시험속도 : 300m/min
-폭 : 6mm
DOS 1.4 349
DOG 1.7 340
nOCA 1.4 396
HOX 1.6 352
또한, 도 8 및 표 6에서 확인할 수 있듯이, 개발 글루타릭산 가소제가 적용된 연질 PVC 시트의 광투과율은 92.5%~94.9%의 결과이고, 흐림도는 2.1%~3.5%의 결과를 가지는 것을 확인하였다.
가소제 종류에 따른 연질 PVC 시트 광투과율 및 흐림도
구분 광투과율(%) 흐림도(%) 시험규격
DOA 93.3 1.9 ASTM D 1003-13, A, HAZE
METER METHOD
- CIE-C
- 0/d Type
DOS 92.8 1.8
DOG 93.4 1.8
nOCA 93.7 3.3
HOX 93.1 2.1
뿐만 아니라, 바이오-DOG를 사용한 플라스틱 PVC의 인장 강도와 인장 연장은 각각 1.7 kgf/mm2 및 340%였다. 또한, DOS는 인장 강도와 인장 연장이 각각 1.4 kgf/mm2 및 349%였고, DOA는 각각 1.6 kgf/mm2 및 376%로 확인할 수 있었다 (도 9d). 또한, PVC/바이오-DOG 시스템의 광학적 투과와 흐림도는 각각 93.4%, 1.8%로 PVC/DOS 시스템 92.8%, 1.8%, PVC/DOA 시스템이 93.3%, 1.9%이었다(도 9e).
이러한 결과는 DOG가 현재 사용되는 다른 알리파틱 디카복실산 에스터 가소제와 유사한 플라스틱화 효율성을 갖는 것으로서, 프탈레이트 프리 가소제의 유망한 옵션이 될 수 있는 바이오 기반의 가소제 임을 시사한다.
실시예 6: 피혁코팅제에 본 발명의 가소제 적용 시의 물성 확인
본 발명의 바이오 기반의 가소제(DOG, nOCA, HOX)를 함량 4 내지 16%로 투입하여 코팅제를 제조한 후, 날염공정을 통해 펄(Pearl)과 글리터(Glitter)가 접목된 하이패션 피혁의 보호 코팅제로 적용실험을 진행하였다.
본 발명의 코팅제 적용 하이패션 피혁 물성 시험분석 결과
구분 유연성*(mm) 내마모도**(mg. loss)
DOA 4& 21.9
8% 13.4
12% 8.0
16% 8.8
DOS 4& 51.8
8% 27.3
2% 20.4
6% 14.7
DOG 4& 40.1
8% 16.4
2% 14.5
6% 13.2
nOCA 4& 42.8
8% 17.8
2% 13.3
6% 15.2
HOX 4& 40.0
8% 31.0
2% 19.4
6% 19.0
* : KS M ISO 17235 ** : ASTM D 3884, Wheel number CS-10, 1,000cycles
가소제를 4 내지 16% 투입하여 6시간 동안 방치한 결과, 상기 표 7서 확인할 수 있듯이, 응집 및 층분리 현상은 보이지 않아 화학적으로 안정하며 상용성이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 기존에 공지된 가소제 중 DOA를 투입한 코팅제가 적용된 하이패션 피혁의 물성 실험결과에서 가장 우수한 물성을 가짐을 확인하였고, 본 발명의 바이오 기반 가소제 DOG, nOCA(n-octanol) 및 HOX(n-hexanol)도 12% 이상 투입 시 유연성 5.7mm 이상, 내마모성 20mg 이내로 우수한 결과를 나타냄을 확인하였다.
한편, 피혁 코팅에 사용하는 셀룰로오스 수지에 본 발명의 가소제를 이용하여 하이패션 피혁(도 10)의 보호 코팅제로 적용하여 내마모성, 유연성, 일광견뢰도, 열변색에 대하여 확인하였다.
그 결과, 표 8에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 가소제가 12% 포함된 수지를 보호코팅제로서 피혁에 적용 시 유연성 5.2~5.8mm, 내마모도 4.4~9.3mg/loss, 일광견뢰도 4등급 이상, 내열성 4등급 이상으로 확인하였으며, 표 9에서 확인할 수 있듯이, 환경영향평가에서도 프탈레이트 가소제 등의 유해물질이 확인되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 코팅제 적용 피혁 제품영향평가
구분 유연성*
(mm)		 내마모도**
(mg. loss)		 일광
견뢰도***
(Grade)		 내열성****
(Grade)		 굴곡성*****
(5,000회)
DOG(2HEX) 5.6 5.8 4 4 pass
nOCA 5.4 4.4 4 4 pass
HOX 5.8 4.6 4 4 pass
2HEX-poly 5.2 9.3 4 4 pass
* : KS M ISO 17235 ** : ASTM D 3884, Wheel number CS-10, 1,000cycles
*** : KS K ISO 105-B02:2014(2015) Xenon arc
**** : 온도 120℃, 시간 2h
***** : KS M ISO 17694(Room temp.)
개발 코팅제 적용 피혁 환경영향평가
시험항목 단위 결과 시험방법
DOG(2HEX) nOCA HOX 2HEX-poly
아릴아민 함유량 mg/kg 검출안됨 검출안됨 검출안됨 검출안됨 KS K 0147:2015
(검출한계: 5mg/kg)
폼알데하이드 함유량 mg/kg 검출안됨 검출안됨 검출안됨 검출안됨 KS M ISO 17226-2:2014
(검출한계: 20mg/kg)
염소화페놀류 함유량 mg/kg 검출안됨 검출안됨 검출안됨 검출안됨 KS K 0733:2014
(검출한계: 0.1mg/kg)
6가 크로뮴 함유량 mg/kg 검출안됨 검출안됨 검출안됨 검출안됨 KS M ISO 17075: 2008
(검출한계: 1.0mg/kg)
다이메틸푸마레이트 함유량 mg/kg 검출안됨 검출안됨 검출안됨 검출안됨 안전확인 안전기준 부속서1 유아용 섬유제품 부속서 B
(검출한계: 0.1mg/kg)
유기주석화합물 함유량 mg/kg 검출안됨 검출안됨 검출안됨 검출안됨 KS K 0737:2014
(검출한계: 0.1mg/kg)
DBP, BBP, DEHP, DNOP, DIDP, DIDP % 검출안됨 검출안됨 검출안됨 검출안됨 KS M 1991:2015
(검출한계: 0.0%)
실시예 6: 윤활유에 본 발명의 가소제 적용 시의 물성 확인
비수용성 윤활유의 저온유동특성을 부여하기 위한 용도로 사용되는 DOA와 개발가소제 중 글루타릭산-nOCA를 10% 첨가하여 동점도, 인화점, 전산가, 극압성 및 내마모도를 확인해 보았다.
윤활유 적용평가 결과
구분 동점도 인화점 전산가 극압성*
(kgf)
 내마모도*
(mm)
DOA 11 ≥150℃ ≤0.2 315 0.512
nOCA 11 ≥150℃ ≤0.2 310 0.508
* : KS M 2026
그 결과, 상기 표 10에서 확인할 수 있듯이, 글루타릭산-nOCA를 적용하였을 때 극압성과 내마모도에서 DOA와 유사한 결과가 나타남을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY/DONGNAM CO., LTD <120> Recombinant Corynebacterium glutamicum strain for producing glutaric acid and a method of producing bio-plasticizer using the same <130> KPA201291-KR-P1 <150> KR 10-2020-0175787 <151> 2020-12-15 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> davT <400> 1 atgagcaaaa ccaacgaatc cttgatgcaa cgtcgtgtag ctgccgtccc acgtggcgtc 60 ggccagatcc acccgatctt cgtcgacacc gcgaagaact cgaccgtgat cgacgttgaa 120 ggccgcgaac tgatcgactt cgccggcggc atcgcagtac tgaacaccgg ccacctgcac 180 ccgaaagtag ttgcagccgt gcaagagcag ctgaccaagg tcagccacac ctgcttccag 240 gtgctggctt acgagcccta tgtagagctg tgcgaaaaga tcaacaagct ggtcccaggc 300 gacttcgaca agaagaccct gctggtcacc accggctccg aagccgttga aaacgccgtc 360 aagatcgccc gtgctgccac tggccgcgct ggcgtcatcg ccttcaccgg cggttatcac 420 ggccgtacca tgatgaccct gggcctgacc ggcaaggtcg tgccgtactc cgctggcatg 480 ggcctgatgc caggcggcat cttccgcgcc ctgttcccga gcgaactgca 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acgaggcttc caagctgggc 240 ggccggctgc gctcgcaagc cttcaatggc actgacggga tcgttgccga actgggtggc 300 atgcgcttcc cggtgtcgtc caccgccttc taccactacg tcgacaagct gggcctggaa 360 accaagccct tccccaaccc gctgaccccg gcttcgggca gcacggtgat cgacctggaa 420 ggccagacct actacgccga gaagcccacc gacctgccac aactgtttca tgaggtagcc 480 gacgcctggg ccgatgcgct ggagagcggt gcgcagttcg ccgatatcca gcaggccatc 540 cgcgaccgtg atgtaccgcg cctgaaggaa ctttggaaca agctggtgcc gctgtgggac 600 gaccgcacct tctacgactt cgtcgccacc tcgcgctctt ttgccaagct gagcttccag 660 caccgcgaag tgttcggcca ggtcggtttc ggcaccggcg gttgggactc ggacttcccc 720 aactcgatgc tggaaatctt ccgcgtggtg atgaccaact gcgacgacca ccagcacctg 780 gtggtcgggg gcgtggaaca agtgccacaa ggcatctggc gccacgtacc ggaacgctgc 840 gtgcattggc cagagggcac cagcctgagc acgctgcatg gcggcgcacc gcgtaccggt 900 gtcaagcgca ttgcccgcgc ctccgatggc cgcctggcgg tcaccgacaa ctggggcgat 960 acccgccact acagcgcagt actcgccacc tgccagacct ggttgctgac cacccagatc 1020 gactgcgaag aatcgctgtt ctcgcaaaag atgtggatgg ccctggaccg 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tcgagcgcct ggccgaggcc 180 gccgatggcc cggcagccat gaccgtggta gagatcgccc aggcgcaccg catcgccatt 240 gtctatggct acccggagcg cggtgacgac ggggcgatct acaacagcgt gcagttgatc 300 gatgcgcatg gccgcagcct gagcaattac cgcaagacgc acctgttcgg tgaactggac 360 cgctcgatgt tcagccctgg tgcggaccac ttcccggtgg tggaactgga aggctggaag 420 gttggcctgc tgatctgcta cgacatcgag ttcccggaga acgcccgacg cctagcgctg 480 gacggcgccg agctgatcct ggtgccgacg gcgaacatga cgccgtacga ctttacctgc 540 caggtgaccg tgagagcgag ggcacaggaa aaccagtgct acctggtata tgccaactac 600 tgcggtgcgg aagacgagat tgagtattgc gggcagagca gcatcatcgg cccggatggc 660 agcttgctgg ccatggccgg gcgggatgag tgccagttgt tggcagagct tgaacatgag 720 cgggtggtgc aggggcgcac ggcgtttccc tacctgaccg atttgcgcca ggagctgcac 780 ctgcgtaaag gctga 795 <210> 5 <211> 920 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dapB <400> 5 gcggccgcaa agtaactttt cggttaaggt agcgcattcg tggtgttgcc cgtggcccgg 60 ttggttgggc aggagtatat tgatgcatga tgcaaacatc cgcgttgcca tcgcgggagc 120 cggggggcgt atgggccgcc agttgattca ggcggcgctg gcattagagg gcgtgcagtt 180 gggcgctgcg ctggaggctg aaggatcttc tttactgggc agcgacgccg gtgagctggc 240 cggagccggg aaaacaggcg ttaccgtgca aagcagcctc gatgcggtaa aagatgattt 300 tgatgtgttt atcgatttta cccgtccgga aggtacgctg aaccatctcg ctttttgtcg 360 ccagcatggc aaagggatgg tgatcggcac tacggggttt gacgaagccg gtaaacaagc 420 aattcgtgac gccgctgccg atattgcgat tgtctttgct gccaatttta gcgttggcgt 480 taacgtcatg cttaagctgc tggagaaagc agccaaagtg atgggtgact acaccgatat 540 cgaaattatt gaagcacatc atagacataa agttgatgcg ccgtcaggca ccgcactggc 600 aatgggagag gcgatcgccc acgcccttga taaagatctg aaagattgcg cggtctacag 660 tcgtgaaggc cacaccggtg aacgtgtgcc tggcaccatt ggttttgcca ccgtgcgtgc 720 aggtgacatc gttggtgaac ataccgcgat gtttgccgat attggcgagc gtctggagat 780 cacccataag gcgtccagcc gtatgacatt tgctaacggc gcggtaagat cggctttgtg 840 gttgagtggt aaggaaagcg gtctttttga tatgcgagat gtacttgatc tcaataattt 900 gtaacctgca gggcggccgc 920 <210> 6 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dapBmut <400> 6 atgcatgatg caaacatccg cgttgccatc gcgggagccg gggggcgtat gggccgccag 60 ttgattcagg cggcgctggc attagagggc gtgcagttgg gcgctgcgct ggaggctgaa 120 ggatcttctt tactgggcag cgacgccggt gagctggccg gagccgggaa aacaggcgtt 180 accgtgcaaa gcagcctcga tgcggtaaaa gatgattttg atgtgtttat cgattttacc 240 cgtccggaag gtacgctgaa ccatctcgct ttttgtcgcc agcatggcaa agggatggtg 300 atcggcacta cggggtttga cgaagccggt aaacaagcaa ttcgtgacgc cgctgccgat 360 attgcgattg tctttgctgc caattttagc gttggcgtta acgtcatgct taagctgctg 420 gagaaagcag ccaaagtgat gggtgactac accgatatcg aaattattga agcacatcat 480 agacataaag ttgatgcgcc gtcaggcacc gcactggcaa tgggagaggc gatcgcccac 540 gcccttgata aagatctgaa agattgcgcg gtctacagtc gtgaaggcca caccggtgaa 600 cgtgtgcctg gcaccattgg ttttgccacc gtgcgtgcag gtgacatcgt tggtgaacat 660 accgcgatgt ttgccgatat tggcgagcgt ctggagatca cccataaggc gtccagccgt 720 atgacatttg ctaacggcgc ggtaagatcg gctttgtggt tgagtggtaa ggaaagcggt 780 ctttttgata tgcgagatgt acttgatctc aataatttgt aa 822 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavBHis-F <400> 7 ggatccatgc accatcatca ccatcacatg aacaagaaga atcgacacc 49 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavBHis-R <400> 8 gcggccgctt aatctgccag ggcgatcggg 30 <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavA-F <400> 9 gcggccgcag gagatataca tatgcgcatc gcactgtacc aag 43 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavA-R <400> 10 gcggccgctt agcctttacg caggtgcagc 30 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavT-F <400> 11 ggatccagga gatatacata tgagcaaaac caacgaatcc ttg 43 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavT-R <400> 12 cctgcaggtt aggcgatttc agcgaagcac 30 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavD-F <400> 13 cctgcaggag gagatataca tatgcagctc aaagacgctc ag 42 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavD-R <400> 14 aagcttttag acgctgatgc acaggtattt 30 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DapBmut-F1 <400> 15 gaattcagga gatatacata tgcatgatgc aaacatccgc 40 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DapBmut-R1 <400> 16 ggtaccttac aaattattga gatcaagtac atc 33 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DapBmut-F2 <400> 17 aagcttagga gatatacata tgcatgatgc aaacatccgc 40 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DapBmut-R2 <400> 18 aagcttttac aaattattga gatcaagtac atc 33 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer H30-F <400> 19 gcgctcgaga aagtaacttt tcggttaagg tagc 34 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer H30-R <400> 20 gcggaattcc aatatactcc tgcccaacca ac 32 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pBL1-F <400> 21 gacgtcattc ggggtcgttc actgg 25 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pBL1-R <400> 22 ctcgagcaac aacaagaccc atcatagttt g 31 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Sp-F <400> 23 gacgtcggtt ttttgctgaa acctcaggc 29 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Sp-R <400> 24 actagtctca cgcccggagc gtagcgac 28 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavBHis-F <400> 25 cgacctgcca caactgtttc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavBHis-R <400> 26 ttccaaagtt ccttcaggcg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavA-F <400> 27 attgagtatt gcgggcagag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavA-R <400> 28 aatcggtcag gtagggaaac 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavT-F <400> 29 cgaatccttg atgcaacgtc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavT-R <400> 30 gatcacggtc gagttcttcg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavD-F <400> 31 ccaaggtcca ggaacacatc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DavD-R <400> 32 gtacgtcaac caggatggtc 20

Claims (25)

  1. 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 및 대장균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 리덕테아제(dihydrodipicolinate reductase; DapB)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1벡터; 및 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB) 및 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 제2벡터로 형질전환된, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발현벡터는 NADH에 선호도가 증진된 변이형 DapB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 발현벡터는 히스티딘-태그(polyhistidine-tag, His-tag)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 히스티딘-태그는 DavB를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davB)의 N-말단에 위치하는 것인, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 DavT 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davT)은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 DavD 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davD)은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 DavB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davB)은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 DavA 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davA)은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 DapB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(dapB)은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 NADH에 선호도가 증진된 변이형 DapB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(dapBmut)은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 davT, davD, 및 dabB를 포함하는 pBL712 발현벡터; 및 davB와 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
  12. (a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 수득한 배양물로부터 글루타릭산을 회수하는 단계를 포함하는, 글루타릭산 생산방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 배양은 유가식 배양을 특징으로 하는 것인, 글루타릭산 생산방법.
  14. 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 글루타릭산.
  15. 제14항의 글루타릭산을 에스테르화한 바이오-DOG.
  16. 제15항의 바이오-DOG를 포함하는 가소제 조성물.
  17. (a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득한 배양물로부터 글루타릭산을 회수하는 단계; 및
    (c) 상기 회수한 글루타릭산을 에스테르화하는 단계를 포함하는, 바이오-DOG 생산 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 방법은 (b) 단계 이후, 글루타릭산을 분리 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 바이오-DOG 생산방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 방법으로 생산된 바이오-DOG.
  20. 제19항의 바이오-DOG을 포함하는 가소제 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 조성물은 코팅제 또는 윤활유에 적용하는 것인, 조성물.
  22. 제20항에 있어서,
    상기　가소제　조성물은 폴리비닐클로라이드(PVC) 수지에 적용 가능한 것인, 가소제　조성물.
  23. 고분자 수지; 및 제20항 또는 제21항의 가소제 조성물을 포함하는, 고분자 수지 조성물.
  24. 제23항의 고분자 수지 조성물을 포함하는 고분자 필름.
  25. (a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득한 배양물로부터 글루타릭산을 회수하는 단계;
    (c) 상기 회수한 글루타릭산을 에스테르화하여 바이오-DOG을 합성하는 단계; 및
    (d) 상기 바이오-DOG을 고분자 수지에 적용하는 단계를 포함하는, 가소화하는 방법.
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