WO2021036901A1 - 支链α-酮酸脱氢酶复合体在制备丙二酸单酰辅酶A中的应用 - Google Patents

支链α-酮酸脱氢酶复合体在制备丙二酸单酰辅酶A中的应用 Download PDF

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陶勇
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Definitions

  • Flavonoids are commonly found in plants in nature. They are a class of compounds that contain the structure of 2-phenylchromone and belong to plant secondary metabolites. Flavonoids have anti-free radical and anti-oxidant effects. At the same time, these compounds also have antibacterial, anti-tumor and immune functions. Polyketides are also an important class of secondary metabolites, which are formed by continuous decarboxylation and condensation of lower carboxylic acids such as acetic acid, malonic acid, butyric acid, etc. by bacteria, fungi, actinomycetes, or plants. The synthesis pathway is similar to long-chain fatty acids.
  • antibiotics because of its important biological activity, it is widely used as an antibiotic in clinical practice, such as erythromycin, anticancer drug doxorubicin, antifungal amphotericin, antiparasitic abamectin, insecticide spinosad And the immunosuppressant rapamycin.
  • polyketides are mainly produced by its naturally occurring strain Streptomyces, but the production of Streptomyces faces problems such as complicated regulation of production strains and difficulty in increasing yield.
  • Trying to synthesize polyketides using Escherichia coli with a clear genetic background as chassis cells is not only conducive to achieving high-level synthesis of target compounds, but also helps to clarify the synthesis and regulation mechanism of polyketides.
  • polyketides such as erythromycin have been successfully synthesized in E. coli, but their yields are still low.
  • the main reason is that the synthesis of polyketides is limited by the content of intracellular malonyl-CoA.
  • malonate Acyl-CoA is also an important precursor for the synthesis of flavonoids, and the biosynthesis of flavonoids is also limited by the content of malonyl-CoA.
  • Malonyl-CoA is an important precursor for the synthesis of polyketones, flavonoids and fatty acids, and the increase in its intracellular content is the key to the high-level synthesis of this type of compound.
  • glucose is used as a carbon source to obtain pyruvate through a series of enzymatic reactions. Pyruvate is catalyzed by pyruvate dehydrogenase to generate CO 2 and acetyl-CoA. Most of the acetyl-CoA enters the tricarboxylic acid cycle, and a small amount of acetyl-CoA is involved in the synthesis of fatty acids.
  • Malonyl-CoA is the direct precursor of fatty acid synthesis.
  • the purpose of the present invention is to provide a new function of the branched chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex.
  • the branched chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex can use oxaloacetic acid as a substrate to carry out a catalytic reaction to synthesize malonic acid.
  • Monoacyl-CoA Monoacyl-CoA.
  • the present invention first provides a method for preparing malonyl-CoA, the method includes 11) and 12):
  • the branched chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex may be the following M1) or M2):
  • M1 consists of bkdF protein (branched-chain alpha keto acid dehydrogenase E1 ⁇ subunit), bkdG protein (branched-chain ⁇ keto acid dehydrogenase E1 ⁇ subunit), and bkdH protein (branched-chain ⁇ keto acid dehydrogenase E2 subunit) And lpdA1 protein (branched-chain alpha keto acid dehydrogenase E3 subunit) protein package;
  • M2 consists of bkdA protein (branched-chain alpha keto acid dehydrogenase E1 ⁇ subunit), bkdB protein (branched-chain beta keto acid dehydrogenase E1 ⁇ subunit), and bkdC protein (branched-chain alpha keto acid dehydrogenase E2 subunit) And the protein package consisting of the lpdA1 protein;
  • the coding gene of the branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex may be the following L1) or L2):
  • L1 a set of genes consisting of the gene encoding the bkdF protein, the gene encoding the bkdG protein, the gene encoding the bkdH protein, and the gene encoding the lpdA1 protein;
  • L2 A set of genes consisting of the gene encoding the bkdA protein, the gene encoding the bkdB protein, the gene encoding the bkdC protein, and the gene encoding the lpdA1 protein.
  • the ilvA gene may encode the following a15) or a16) protein:
  • knockout of the ilvA gene in the biological cell can be performed by homologous recombination, specifically, it can be achieved by using the E. coli strain JW3745 with the ilvA gene knockout trait.
  • step 11) may further include introducing the coding gene of ppc protein (phosphoenolpyruvate carboxylase) into the biological cell and expressing the coding gene, or increasing the total amount in the biological cell.
  • the content of the ppc protein may enhance the activity of the ppc protein.
  • the obtained recombinant cell A contains the coding gene of the branched chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex and the coding gene of the ppc protein, and the synthesis of the branched chain ⁇ -keto acid is inhibited.
  • ppc protein may be the following a19) or a20):
  • amino acid sequence of sequence 19 in the sequence listing is subject to substitution and/or deletion and/or addition of one or several amino acid residues, and the amino acid sequence of sequence 19 is 75% or more identical and has the same function Protein.
  • the gene encoding the ppc protein can be the following b21) or b22):
  • the biological cell can express the outer membrane protease VII, and step 11) may also include knocking out the gene encoding the outer membrane protease VII in the biological cell, or reducing the outer membrane protease in the biological cell VII content or activity.
  • outer membrane protease VII may be ompT protein.
  • the ompT protein is the following a21) or a22):
  • amino acid sequence of sequence 28 in the sequence listing is substituted and/or deleted and/or added to the amino acid sequence of sequence 28 to obtain 75% or more of identity and have the same function as the amino acid sequence of sequence 28. Protein.
  • the encoding gene of the ompT protein is the following b23) or b24):
  • the introduction of the gene encoding the ppc protein into the biological cell may be specifically introducing an expression vector containing the gene encoding the ppc protein into the biological cell, or by recombining the gene encoding the ppc protein into the biological cell.
  • the gene encoding the ppc protein is expressed in the genome of the biological cell.
  • the biological cell may contain an oxaloacetate synthesis pathway, which can synthesize oxaloacetate.
  • the microbial cell may be N1) or N2) or N3): N1) bacteria or fungi; N2) Escherichia coli; N3) Escherichia coli BW25113.
  • the catalytic reaction can be carried out at 30-37°C. Further, the catalytic reaction can be carried out at 30°C.
  • the target product may be 3-hydroxypropionic acid
  • the method includes: introducing an mcr protein (malonyl-CoA reductase) encoding gene into the recombinant cell A and making the encoding The gene is expressed, or the content of the mcr protein in the recombinant cell A is increased or the activity of the mcr protein is increased to obtain a recombinant cell, and the recombinant cell is referred to as recombinant cell-mcr; culturing the recombinant cell-mcr, The target product is prepared.
  • mcr protein malonyl-CoA reductase
  • the mcr protein may be composed of an mcr N-terminal domain and a mcr C-terminal domain, and the mcr N-terminal domain may be the following a23) or a24):
  • amino acid sequence of sequence 22 in the sequence listing is substituted and/or deleted and/or added to the amino acid sequence of sequence 22 to obtain 75% or more of identity and have the same function with the amino acid sequence of sequence 22.
  • the mcr C-terminal domain may be the following a25) or a26):
  • amino acid sequence of sequence 23 in the sequence listing is subject to substitution and/or deletion and/or addition of one or several amino acid residues, and the amino acid sequence of sequence 23 is 75% or more identical and has the same function Protein.
  • the coding gene of the mcr protein may be composed of the coding gene of the mcr N-terminal domain and the coding gene of the mcr C-terminal domain.
  • the coding gene of the mcr N-terminal domain may be the following b25) or b26) :
  • the coding gene of the mcr C-terminal domain may be the following b27) or b28):
  • b28 A DNA molecule that has 75% or more identity with the nucleotide sequence defined by b27) and has the same function.
  • the gene encoding the mcr protein may be the following b29) or b30):
  • the introduction of the gene encoding the mcr protein into the biological cell may specifically be the introduction of an expression vector containing the gene encoding the mcr protein into the biological cell.
  • the expression vector can be a plasmid, cosmid, phage or virus vector.
  • the plasmid may specifically be pYB1k or pLB1a, the sequence of pYB1k is sequence 6 in the sequence list, and the sequence of pLB1a is sequence 24 in the sequence list.
  • the expression vector containing the gene encoding the mcr protein may be pLB1a-mcr; the pLB1a-mcr is a recombinant vector obtained by inserting the gene encoding the mcr protein into the pLB1a, which can express the mcr protein.
  • the production of the target product requires the participation of branched ⁇ -keto acids.
  • the synthesis of branched ⁇ -keto acids may not be inhibited, and when the participation of branched ⁇ -keto acids is not required in the production process of the target product, the synthesis of branched ⁇ -keto acids can be inhibited to further increase the yield of the target product.
  • the target product may be picric acid or an intermediate product between malonyl-CoA and picric acid in the picric acid synthesis pathway
  • the method includes: introducing vps protein (benzene) into the recombinant cell A. Encoding gene of pentanone synthase) and expressing the encoding gene, or increasing the content of the vps protein in the recombinant cell A or enhancing the activity of the vps protein to obtain a recombinant cell, which is recorded as Recombinant cell-vps; culture the recombinant cell-vps to prepare the target product.
  • vps protein benzene
  • vps protein and its coding gene may be derived from hops (Humulus lupulus);
  • amino acid sequence of sequence 26 in the sequence listing is subject to substitution and/or deletion and/or addition of one or several amino acid residues, and the amino acid sequence of sequence 26 is 75% or more identical and has the same function Protein.
  • the coding gene of the vps protein can be the following b31) or b32):
  • b32 DNA molecules that have 75% or more identity with the nucleotide sequence defined by b31) and have the same function.
  • the introduction of the coding gene of the vps protein into the biological cell may specifically be the introduction of an expression vector containing the coding gene of the vps protein into the biological cell.
  • the expression vector can be a plasmid, cosmid, phage or virus vector.
  • the plasmid may specifically be pYB1k or pLB1a, the sequence of pYB1k is sequence 6 in the sequence list, and the sequence of pLB1a is sequence 24 in the sequence list.
  • the intermediate product does not include malonyl-CoA and picric acid.
  • the intermediate product is 3-methyl-isobutyrylphloroglucinol (PIVP).
  • the present invention also provides a set of reagents, the set of reagents is a set of reagent A or a set of reagent B or a set of reagent C;
  • the reagent kit A includes the coding gene of the branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex or the branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex;
  • the reagent set B consists of the reagent set A and the mcr protein or the coding gene of the mcr protein;
  • the reagent kit C consists of the reagent kit A and the vps protein or the coding gene of the vps protein.
  • the kit A may also include the ppc protein or the gene encoding the ppc protein.
  • the reagent kit A may also include substances that inhibit the synthesis of branched-chain ⁇ -keto acids.
  • the substance that inhibits the synthesis of branched-chain ⁇ -keto acids may be knocking out at least one gene in the branched-chain ⁇ -keto acid synthesis pathway in biological cells, or reducing at least one gene encoding protein in the branched-chain ⁇ -keto acid synthesis pathway The content or activity required for the substance.
  • the substance that inhibits the synthesis of branched-chain ⁇ -keto acid may be a substance required to knock out the ilvA gene or/and the ilvE gene in the biological cell.
  • the biological cell contains the ilvA gene or/and the ilvE gene.
  • the ilvA gene in the knockout biological cell may specifically be a gene fragment or strain (such as E. coli strain JW3745) containing the ilvA gene knockout trait.
  • the ilvE gene in the knockout biological cell may specifically be a gene fragment or strain (such as E. coli strain JW5606) containing the ilvE gene knockout trait.
  • the reagent kit A may consist of only the coding gene of the branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex or the branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex, and may also be composed of the branched ⁇ -keto acid dehydrogenase complex.
  • the dehydrogenase complex or the coding gene of the branched chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex which is composed of the ppc protein or the coding gene of the ppc protein, may also be dehydrogenated by the branched chain ⁇ -keto acid
  • the enzyme complex or the coding gene of the branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex, the coding gene of the ppc protein or the ppc protein, and the substance that inhibits the synthesis of branched ⁇ -keto acid may also be dehydrogenated by the branched chain ⁇ -keto acid.
  • the set of reagent B can be used to produce 3-hydroxypropionic acid.
  • the set of reagent C can be used to prepare picric acid or an intermediate product from malonyl-CoA to picric acid in the picric acid synthesis pathway.
  • the present invention also provides a recombinant cell, the recombinant cell being the recombinant cell A, the recombinant cell-mcr or the recombinant cell-vps.
  • the present invention also provides the following applications of I, II or III:
  • ompT-up-F and ompT-up-R as PCR amplification primers
  • E. coli genomic DNA as template to amplify the fragment ompT-up
  • ompT-down-F and ompT-down-R as PCR amplification
  • the primers use E. coli genomic DNA as a template to amplify the fragment ompT-down.
  • the pKD46 plasmid (Clontech) was transformed into the engineered strain M-FGH by calcium chloride transformation method, and the clones were selected after culturing on an LB plate containing ampicillin and kanamycin at 30°C overnight to obtain a recombinant E. coli containing plasmid pKD46 M-FGH/pKD46.
  • Recombinant Escherichia coli M-FGH/pKD46 expresses 3 recombinant proteins of phage after arabinose induction, and the host bacteria has the ability of homologous recombination.
  • M-FGH/pKD46 competent cells were prepared by washing with 10% glycerol.
  • Example 3 Expression of the branched chain ⁇ -ketoacid dehydrogenase complex gene bkdFGH-lpdA1 of Streptomyces avermitilis can increase the production of 3-hydroxypropionic acid (3-HP).
  • the mcr gene fragment shown in sequence 21 was synthesized by the whole gene and connected to the pUC57 vector to obtain the recombinant vector pUC57-mcr. Using pUC57-mcr as a template and using primers mcr-F/mcrR to amplify the PCR amplified fragments.
  • (6-b) Perform agarose gel electrophoresis on the PCR amplified fragment obtained in (6-a) above to recover the target fragment; at the same time, digest the vector pLB1a with NcoI and XhoI (the nucleotide sequence of vector pLB1a is the sequence in the sequence table) 24), the large fragment of the vector LB1a-NX (ie the vector backbone) is recovered.
  • Use the Gibson assembly method to ligate the recovered target fragments with the LB1a-NX fragment, and use the CaCl 2 method to transform the ligated product into E.
  • coli DH5 ⁇ competent cells Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd., product catalog CD201
  • Select clones use primer F-105/mcr-R to identify clones that can amplify the target fragment and sequence them, select positive clones to extract the plasmid, and name the obtained positive plasmid with the correct sequence as pLB1a-mcr.
  • coli DH5 ⁇ competent cells Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd., product catalog CD201
  • Select clones use primer F-105/vps-R to identify clones that can amplify the target fragment and sequence them, select positive clones to extract the plasmid, and name the obtained positive plasmid with the correct sequence as pLB1a-vps.
  • PIVP can be produced after the introduction of the branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex encoding gene into E. coli: BW-PIVP does not synthesize PIVP; compared with the introduction of bkdA, bkdB, bkdC, and lpdA1 genes, the introduction of bkdF, bkdG , BkdH, lpdA1 gene PIVP yields higher; and bkdH, lpdA1 genes are optimized according to the E.
  • the yield of PIVP can be further improved; the basis for the introduction of bkdF, bkdG, bkdH, lpdA1 genes On the other hand, the introduction of ppc gene can further greatly increase the yield of PIVP.
  • D buffer is composed of a solvent and a solute.
  • the solvent is water.
  • (11-c) Equilibrate 10 times the column volume of the nickel column with D buffer solution, and flow the supernatant obtained by centrifugation in (11-b) through the balanced nickel column, wash with 10 times the column volume D buffer solution , Wash 5 times the column volume with the volume ratio of D buffer and E buffer of 49/1, 45/5 and 42/8 respectively, and then use the volume ratio of D buffer and E buffer to 1 /1 mixed buffer solution to obtain the Streptomyces avermitilis branched chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex protein.
  • Use a 100kDa ultrafiltration tube (Amicon Ultra-15) to clean and concentrate the complex protein to obtain the desalted protein , Can be used for in vitro enzyme activity detection.
  • E buffer is a solution with an imidazole concentration of 500 mM obtained by adding imidazole to D buffer.
  • the F buffer is composed of a solvent and a solute.
  • the solute and its concentration in the F buffer are 0.1mM CoA (coenzyme A) and 0.2mM DTT (dithiothionine).
  • Sugar alcohol 0.2mM TPP (thiamine pyrophosphate), 1mM MgSO 4 and 2mM NAD + (oxidized nicotinamide adenine dinucleotide).
  • ⁇ -ketoisovaleric acid (3-methyl-2-oxobutanoic acid) to each well of the KIV group, and the concentration of ⁇ -ketoisovaleric acid in the reaction system is 3mM;
  • ⁇ -ketoisovaleric acid and EDTA were added to each well of the KIV-EDTA group, and the concentrations of ⁇ -ketoisovaleric acid and EDTA in the reaction system were 3 mM and 10 mM, respectively.
  • the enzyme activity of the branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex is defined as the molar amount of NADH catalyzed per minute per milligram of the branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex.
  • the present invention has discovered a new source of malonyl-CoA, that is, malonyl-CoA can be obtained by catalyzing oxaloacetate by a branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex through biochemical and genetic tests. It is proved that the branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase complex has oxaloacetate dehydrogenase activity.
  • the present invention also found that introducing/increasing phosphoenolpyruvate carboxylase can further increase the synthesis of malonyl-CoA, and knocking out genes in the branched-chain ⁇ -keto acid synthesis pathway can also increase malonate Monoacyl-CoA synthesis amount.

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Abstract

支链α-酮酸脱氢酶复合体在制备丙二酸单酰辅酶A中的应用。利用支链α-酮酸脱氢酶复合体制备丙二酸单酰辅酶A的方法，该方法包括向生物细胞中导入支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因，并使支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因得到表达，得到重组细胞；该培养重组细胞，得到丙二酸单酰辅酶A；支链α-酮酸脱氢酶复合体为由M1)或M2)组成的成套蛋白质：M1)bkdF、bkdG、bkdH和lpdA1；M2)bkdA、bkdB、bkdC和lpdA1。实验证明，利用支链α-酮酸脱氢酶复合体不仅可以制备丙二酸单酰辅酶A，还可以制备以丙二酸单酰辅酶A为中间产物的目的产物。

Description

支链α-酮酸脱氢酶复合体在制备丙二酸单酰辅酶A中的应用 技术领域
本发明涉及生物技术领域中，支链α-酮酸脱氢酶复合体在制备丙二酸单酰辅酶A中的应用。
背景技术
黄酮化合物普遍存在于自然界的植物中，是含有2-苯基色原酮结构的一类化合物，属于植物次生代谢产物。黄酮化合物具有抗自由基和抗氧化作用，同时该类化合物还具有抑菌、抗肿瘤和增强机体免疫功能等。聚酮化合物也是一类重要次级代谢产物，由细菌、真菌、放线菌或植物通过低级羧酸如乙酸、丙二酸、丁酸等连续脱羧缩合形成，其合成途径类似于长链脂肪酸，因其重要的生物活性在临床上作为抗生素而得到广泛应用，如红霉素、抗癌药物多柔比星、抗真菌剂两性霉素、抗寄生虫剂阿维菌素、杀虫剂多杀菌素以及免疫抑制剂雷帕霉素等。
工业上聚酮化合物主要由其天然产生菌链霉菌生产，但采用链霉菌生产面临生产菌株调控复杂、产量不易提高等问题。尝试以遗传背景清晰的大肠杆菌为底盘细胞来合成聚酮化合物，不仅有利于实现目标化合物的高水平合成，也有助于阐明聚酮化合物的合成调控机理。目前红霉素等聚酮化合物已经在大肠杆菌中成功合成，但其产量仍然较低，主要原因是聚酮化合物的合成受胞内丙二酸单酰辅酶A含量的限制，此外丙二酸单酰辅酶A也是黄酮化合物合成的重要前体，黄酮化合物的生物合成也受到丙二酸单酰辅酶A含量的限制。
丙二酸单酰辅酶A作为聚酮、黄酮化合物以及脂肪酸合成的重要前体物质，其胞内含量的提高是该类化合物高水平合成的关键。在中央代谢途径中，葡萄糖作为碳源，通过一系列的酶反应得到丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的催化下生成CO 2和乙酰辅酶A。大部分的乙酰辅酶A进入三羧酸循环，少量的乙酰辅酶A参与脂肪酸的合成，丙二酸单酰辅酶A是脂肪酸合成的直接前体，是由乙酰辅酶A羧化酶催化乙酰辅酶A得到，该步反应不仅耗能，还涉及CO 2的固定。同时，在大肠杆菌中，为了协调磷脂、大分子物质合成和细胞生长等关系，调控脂肪酸合成比例，细胞内丙二酸单酰辅酶A浓度通常被控制的很低。为了提高前体物质的合成水平，当前许多研究集中在代谢流调控领域，通过多靶点遗传操作的代谢工程技术来提高细胞中丙二酸单酰辅酶A的产量，例如提高关键酶乙酰辅酶A羧化酶的表达水平，敲除乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A的竞争性支路等策略。
发明公开
本发明的目的是提供支链α-酮酸脱氢酶复合体的一种新功能，支链α-酮酸脱氢酶复合体可以以草酰乙酸为底物进行催化反应，合成丙二酸单酰辅酶A。
本发明首先提供了一种制备丙二酸单酰辅酶A的方法，所述方法包括11) 和12)：
11)向生物细胞中导入支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因，并使所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因得到表达，得到重组细胞，将该重组细胞记为重组细胞A；
12)培养所述重组细胞A，制备得到丙二酸单酰辅酶A。
上述方法中，所述支链α-酮酸脱氢酶复合体可为下述M1)或M2)：
M1)由bkdF蛋白质(支链α酮酸脱氢酶E1α亚基)、bkdG蛋白质(支链β酮酸脱氢酶E1β亚基)、bkdH蛋白质(支链α酮酸脱氢酶E2亚基)和lpdA1蛋白质(支链α酮酸脱氢酶E3亚基)组成的成套蛋白质；
M2)由bkdA蛋白质(支链α酮酸脱氢酶E1α亚基)、bkdB蛋白质(支链β酮酸脱氢酶E1β亚基)、bkdC蛋白质(支链α酮酸脱氢酶E2亚基)和所述lpdA1蛋白质组成的成套蛋白质；
所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因可为下述L1)或L2)：
L1)由所述bkdF蛋白质的编码基因、所述bkdG蛋白质的编码基因、所述bkdH蛋白质的编码基因和所述lpdA1蛋白质的编码基因组成的成套基因；
L2)由所述bkdA蛋白质的编码基因、所述bkdB蛋白质的编码基因、所述bkdC蛋白质的编码基因和所述lpdA1蛋白质的编码基因组成的成套基因。
上述方法中，所述bkdF蛋白质、所述bkdG蛋白质、所述bkdH蛋白质、所述lpdA1蛋白质、所述bkdA蛋白质、所述bkdB蛋白质和所述bkdC蛋白质及其编码基因可来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)。
上述方法中，所述bkdF蛋白质可为下述a1)或a2)的蛋白质：
a1)序列表中序列10所示的蛋白质；
a2)将序列表中序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列10的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述bkdG蛋白质可为下述a3)或a4)的蛋白质：
a3)序列表中序列11所示的蛋白质；
a4)将序列表中序列11的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列11的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述bkdH蛋白质可为下述a5)或a6)的蛋白质：
a5)序列表中序列12所示的蛋白质；
a6)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列12的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述lpdA1蛋白质可为下述a7)或a8)的蛋白质：
a7)序列表中序列13所示的蛋白质；
a8)将序列表中序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列13的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述bkdA蛋白质可为下述a9)或a10)的蛋白质：
a9)序列表中序列7所示的蛋白质；
a10)将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列7的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述bkdB蛋白质可为下述a11)或a12)的蛋白质：
a11)序列表中序列8所示的蛋白质；
a12)将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列8的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述bkdC蛋白质可为下述a13)或a14)的蛋白质：
a13)序列表中序列9所示的蛋白质；
a14)将序列表中序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列9的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
上述方法中，所述bkdF蛋白质的编码基因可为下述b1)或b2)：
b1)序列表中序列2的第1-1221位所示的DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
所述bkdG蛋白质的编码基因可为下述b3)或b4)：
b3)序列表中序列2的第1223-2200位所示的DNA分子；
b4)与b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
所述bkdH蛋白质的编码基因可为下述b5)或b6)或b7)：
b5)序列表中序列3所示的DNA分子；
b6)序列表中序列2的第2220-3608位所示的DNA分子；
b7)与b5)或b6)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
所述lpdA1蛋白质的编码基因可为下述b8)或b9)或b10)：
b8)序列表中序列5所示的DNA分子；
b9)序列表中序列4所示的DNA分子；
b10)与b8)或b9)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
所述bkdA蛋白质的编码基因可为下述b11)或b12)：
b11)序列表中序列1的第1-1146位所示的DNA分子；
b12)与b11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
所述bkdB蛋白质的编码基因可为下述b13)或b14)：
b13)序列表中序列1的第1220-2224位所示的DNA分子；
b14)与b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
所述bkdC蛋白质的编码基因可为下述b15)或b16)：
b15)序列表中序列1的第2224-3591位所示的DNA分子；
b16)与b15)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
上述方法中，所述向生物细胞中导入支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因具体可为将包含所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因的表达载体导入所述生物细胞。
所述表达载体均可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pYB1k或pLB1a，所述pYB1k的序列为序列表中序列6，所述pLB1a的序列为序列表中序列24。
所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因的四个独立基因(上述L1)或L2))可通过含有各个基因的共表达载体导入所述生物细胞中。所述共表达载体可为pYB1k-bkdABC-lpdA1、pYB1k-bkdFGH-lpdA1或pYB1k-bkdFG-opbkdH-oplpdA1；所述pYB1k-bkdABC-lpdA1为向所述pYB1k中插入所述bkdA蛋白质的编码基因、所述bkdB蛋白质的编码基因、所述bkdC蛋白质的编码基因和所述lpdA1蛋白质的编码基因得到的重组载体，能表达所述bkdA蛋白质、所述bkdB蛋白质、所述bkdC蛋白质和所述lpdA1蛋白质；所述pYB1k-bkdFGH-lpdA1和所述pYB1k-bkdFG-opbkdH-oplpdA1均为为向所述pYB1k中插入所述bkdF蛋白质的编码基因、所述bkdG蛋白质的编码基因、所述bkdH蛋白质的编码基因和所述lpdA1蛋白质的编码基因得到的重组载体，均能表达所述bkdF蛋白质、所述bkdG蛋白质、所述bkdH蛋白质和所述lpdA1蛋白质。
上述方法中，所述生物细胞含有支链α-酮酸合成途径，步骤11)还可包括抑制所述生物细胞中支链α-酮酸的合成。
所得重组细胞A中含有所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因，且其支链α-酮酸的合成受到抑制。
上述方法中，所述抑制支链α-酮酸的合成可通过敲除所述生物细胞中支链α-酮酸合成途径中的至少一个基因，或降低支链α-酮酸合成途径中的至少一个基因编码蛋白质的含量或活性实现。
上述方法中，所述抑制支链α-酮酸的合成可通过敲除所述生物细胞中的ilvA基因(苏氨酸脱氨酶基因)或/和ilvE基因(支链氨基酸转氨酶基因)， 或降低所述生物细胞中的所述ilvA基因或/和所述ilvE基因编码蛋白质的含量或活性实现。
所述生物细胞含有所述ilvA基因或/和所述ilvE基因。
上述方法中，所述ilvA基因可编码下述a15)或a16)的蛋白质：
a15)序列表中序列15所示的蛋白质；
a16)将序列表中序列15的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列15的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述ilvE基因可编码下述a17)或a18)的蛋白质：
a17)序列表中序列17所示的蛋白质；
a18)将序列表中序列17的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列17的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
进一步，
所述ilvA基因可为下述b17)或b18)：
b17)序列表中序列14所示的DNA分子；
b18)与b17)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
所述ilvE基因可为下述b19)或b20)：
b19)序列表中序列16所示的DNA分子；
b20)与b19)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
上述方法中，敲除所述生物细胞中的ilvA基因可利用同源重组进行，具体可利用具有所述ilvA基因敲除性状的大肠杆菌菌株JW3745来实现。
上述方法中，敲除所述生物细胞中的ilvE基因可利用同源重组进行，具体可利用具有所述ilvE基因敲除性状的大肠杆菌菌株JW5606来实现。
上述方法中，步骤11)还可包括向所述生物细胞中导入ppc蛋白质(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的编码基因并使所述编码基因得到表达，或增加所述生物细胞中所述ppc蛋白质的含量或增强所述ppc蛋白质的活性。所得重组细胞A中含有所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因和所述ppc蛋白质的编码基因，且其支链α-酮酸的合成受到抑制。
进一步，所述ppc蛋白质及其编码基因可来源于谷氨酸棒状杆菌。
更进一步，所述ppc蛋白质可为下述a19)或a20)：
a19)序列表中序列19所示的蛋白质；
a20)将序列表中序列19的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列19的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述ppc蛋白质的编码基因可为下述b21)或b22)：
b21)序列表中序列18所示的DNA分子；
b22)与b21)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
上述方法中，所述生物细胞能表达外膜蛋白酶VII，步骤11)还可包括敲除所述生物细胞中所述外膜蛋白酶VII的编码基因，或降低所述生物细胞中所述外膜蛋白酶VII的含量或活性。
进一步，所述外膜蛋白酶VII可为ompT蛋白质。
更进一步，所述ompT蛋白质为下述a21)或a22)：
a21)序列表中序列28所示的蛋白质；
a22)将序列表中序列28的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列28的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述ompT蛋白质的编码基因为下述b23)或b24)：
b23)序列表中序列27所示的DNA分子；
b24)与b23)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
上述方法中，所述向生物细胞中导入ppc蛋白质的编码基因具体可为将包含所述ppc蛋白质的编码基因的表达载体导入所述生物细胞，也可通过将所述ppc蛋白质的编码基因重组至所述生物细胞的基因组中并使所述ppc蛋白质的编码基因得到表达实现。
上述方法中，所述生物细胞可含有草酰乙酸合成途径，能合成草酰乙酸。
进一步，所述生物细胞可为微生物细胞、动物细胞或植物细胞。
更进一步，所述微生物细胞可为N1)或N2)或N3)：N1)细菌或真菌；N2)大肠杆菌；N3)大肠杆菌BW25113。
本发明还提供了制备丙二酸单酰辅酶A的方法，所述方法包括：以草酰乙酸为底物，采用所述支链α-酮酸脱氢酶复合体进行催化反应，得到丙二酸单酰辅酶A。
上述方法中，所述催化反应可在F缓冲液中进行；所述F缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0)，所述溶质及其在所述F缓冲液中的浓度分别为0.1mM辅酶A、0.2mM二硫苏糖醇、0.2mM磷酸三苯酯、1mM MgSO 4和2mM NAD +(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。
所述催化反应可在30-37℃下进行。进一步，所述催化反应可在30℃下进行。
本发明还提供了生产以丙二酸单酰辅酶A为中间产物的目的产物的方法，所述方法包括：培养所述重组细胞A，制备得到目标产物。
上述方法中，所述目标产物可为3-羟基丙酸，所述方法包括：向所述重组 细胞A中导入mcr蛋白质(丙二酸单酰辅酶A还原酶)的编码基因并使所述编码基因得到表达，或增加所述重组细胞A中所述mcr蛋白质的含量或增强所述mcr蛋白质的活性，得到重组细胞，将该重组细胞记为重组细胞-mcr；培养所述重组细胞-mcr，制备得到所述目标产物。
进一步，所述mcr蛋白质及其编码基因可来源于嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)。
更进一步，所述mcr蛋白质可由mcr N端结构域和mcr C端结构域组成，所述mcr N端结构域可为下述a23)或a24)：
a23)序列表中序列22所示的蛋白质；
a24)将序列表中序列22的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列22的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述mcr C端结构域可为下述a25)或a26)：
a25)序列表中序列23所示的蛋白质；
a26)将序列表中序列23的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列23的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述mcr蛋白质的编码基因可由所述mcr N端结构域的编码基因和所述mcr C端结构域的编码基因组成，所述mcr N端结构域的编码基因可为下述b25)或b26)：
b25)序列表中序列21的第1-1689位所示的DNA分子；
b26)与b25)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
所述mcr C端结构域的编码基因可为下述b27)或b28)：
b27)序列表中序列21的第1704-3749位所示的DNA分子；
b28)与b27)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
再进一步，所述mcr蛋白质的编码基因可为下述b29)或b30)：
b29)序列表中序列21所示的DNA分子；
b30)与b29)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
序列21的第1-1689位为所述mcr N端结构域核苷酸序列，第1704-3749位为所述mcr C端结构域核苷酸序列，第1691-1696位为RBS位点的序列。
上述方法中，所述向生物细胞中导入mcr蛋白质的编码基因具体可为将包含所述mcr蛋白质的编码基因的表达载体导入所述生物细胞。
所述表达载体均可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pYB1k或pLB1a，所述pYB1k的序列为序列表中序列6，所述pLB1a的序列为序 列表中序列24。
所述包含所述mcr蛋白质的编码基因的表达载体可为pLB1a-mcr；所述pLB1a-mcr为向所述pLB1a中插入所述mcr蛋白质的编码基因得到的重组载体，能表达所述mcr蛋白质。
在实际应用中，可根据目标产物生产过程中是否需要支链α-酮酸的参与进一步确定是否需要抑制支链α-酮酸的合成，目标产物生产过程中需要支链α-酮酸的参与时，可不抑制支链α-酮酸的合成，目标产物生产过程中不需要支链α-酮酸的参与时，可通过抑制支链α-酮酸的合成，进一步提高目标产物的产量。
上述方法中，所述目标产物可为苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物，所述方法包括：向所述重组细胞A中导入vps蛋白质(苯戊酮合成酶)的编码基因并使所述编码基因得到表达，或增加所述重组细胞A中所述vps蛋白质的含量或增强所述vps蛋白质的活性，得到重组细胞，将该重组细胞记为重组细胞-vps；培养所述重组细胞-vps，制备得到所述目标产物。
进一步，所述vps蛋白质及其编码基因可来源于啤酒花(Humulus lupulus)；
更进一步，所述vps蛋白质可为下述a27)或a28)：
a27)序列表中序列26所示的蛋白质；
a28)将序列表中序列26的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列26的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述vps蛋白质的编码基因可为下述b31)或b32)：
b31)序列表中序列25所示的DNA分子；
b32)与b31)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
上述方法中，所述向生物细胞中导入vps蛋白质的编码基因具体可为将包含所述vps蛋白质的编码基因的表达载体导入所述生物细胞。
所述表达载体均可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pYB1k或pLB1a，所述pYB1k的序列为序列表中序列6，所述pLB1a的序列为序列表中序列24。
所述包含所述vps蛋白质的编码基因的表达载体可为pLB1a-vps；所述pLB1a-vps为向所述pLB1a中插入所述vps蛋白质的编码基因得到的重组载体，能表达所述vps蛋白质。
所述中间产物不包括丙二酸单酰辅酶A和苦味酸。在本发明的一个实施例中，所述中间产物为3-甲基-异丁酰间苯三酚(PIVP)。
本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂为成套试剂甲或成套试剂乙或成套试剂丙；
所述成套试剂甲包括所述支链α-酮酸脱氢酶复合体或所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因；
所述成套试剂乙由所述成套试剂甲与所述mcr蛋白质或所述mcr蛋白质的编码基因组成；
所述成套试剂丙由所述成套试剂甲与所述vps蛋白质或所述vps蛋白质的编码基因组成。
所述成套试剂甲还可包括所述ppc蛋白质或所述ppc蛋白质的编码基因。
所述成套试剂甲还可包括抑制支链α-酮酸合成的物质。
所述抑制支链α-酮酸合成的物质可为敲除生物细胞中支链α-酮酸合成途径中的至少一个基因，或降低支链α-酮酸合成途径中的至少一个基因编码蛋白质的含量或活性所需的物质。
所述抑制支链α-酮酸合成的物质可为敲除生物细胞中的ilvA基因或/和ilvE基因所需的物质。
所述生物细胞含有所述ilvA基因或/和所述ilvE基因。
所述敲除生物细胞中的ilvA基因具体可为含有ilvA基因敲除性状的基因片段或菌株(如大肠杆菌菌株JW3745)。
所述敲除生物细胞中的ilvE基因具体可为含有ilvE基因敲除性状的基因片段或菌株(如大肠杆菌菌株JW5606)。
所述成套试剂甲可仅由所述支链α-酮酸脱氢酶复合体或所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因组成，还可由所述支链α-酮酸脱氢酶复合体或所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因，与所述ppc蛋白质或所述ppc蛋白质的编码基因组成，还可由所述支链α-酮酸脱氢酶复合体或所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因，所述ppc蛋白质或所述ppc蛋白质的编码基因，以及所述抑制支链α-酮酸合成的物质组成。
所述成套试剂甲具有如下D1)或D2)的功能：
D1)合成丙二酸单酰辅酶A；
D2)生产以丙二酸单酰辅酶A为中间产物的目的产物。
所述成套试剂乙可用于生产3-羟基丙酸。
所述成套试剂丙可用于制备苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物。
本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞为所述重组细胞A、所述重组细胞-mcr或所述重组细胞-vps。
本发明还提供了下述I、II或III的应用：
I、所述支链α-酮酸脱氢酶复合体或所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因，所述重组细胞A，或，所述成套试剂甲的下述任一应用：
X1)合成丙二酸单酰辅酶A；
X2)制备合成丙二酸单酰辅酶A产品；
X3)生产以丙二酸单酰辅酶A为中间产物的目的产物；
X4)制备生产以丙二酸单酰辅酶A为中间产物的目的产物的产品；
X5)合成3-羟基丙酸；
X6)制备合成3-羟基丙酸产品；
X7)合成苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物；
X8)制备合成苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物产品；
X9)合成脂肪酸；
X10)制备合成脂肪酸产品；
X11)合成聚酮化合物；
X12)制备合成聚酮化合物产品；
X13)合成黄酮化合物；
X14)制备合成黄酮化合物产品；
II、所述重组细胞-mcr或所述成套试剂乙的下述任一应用：
Y1)合成3-羟基丙酸；
Y2)制备合成3-羟基丙酸产品；
III、所述重组细胞-vps或所述成套试剂丙的下述任一应用：
Z1)合成苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物；
Z2)制备合成苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物产品。
丙二酸单酰辅酶A的合成以草酰乙酸为底物。
所述目的产物的合成途径中，需要丙二酸单酰辅酶A的参与。
所述目的产物可为3-羟基丙酸、苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物。
所述中间产物不包括丙二酸单酰辅酶A和苦味酸。在本发明的一个实施例中，所述中间产物为3-甲基-异丁酰间苯三酚(PIVP)。
本发明中，所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
附图说明
图1为表达支链α-酮酸脱氢酶复合体工程菌株的丙二酸单酰辅酶A相对含量的检测结果。
图2为ppc基因导入M-FGH中后丙二酸单酰辅酶A相对含量的检测结果。
图3为表达支链α-酮酸脱氢酶复合体后3-羟基丙酸的产量。
图4为啤酒花α/β酸代谢途径。
图5为表达支链α-酮酸脱氢酶复合体后工程菌株PIVP的产量。
图6为支链α-酮酸脱氢酶复合体体外酶活检测。草酰乙酸为OAA组，草酰乙酸-EDTA为OAA-EDTA组，3-甲基-2氧代丁酸为KIV组，3-甲基-2氧代丁酸--EDTA为KIV-EDTA组。
实施发明的最佳方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中，大肠杆菌BW25113(Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000；97(12):6640-6645.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉，该菌株中含有草酰乙酸合成途径，能合成草酰乙酸。大肠杆菌BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的野生型P1噬菌体(Thomason LC,Costantino N.2007.E.coli genome manipulation by P1 transduction.Current Protocols in Molecular Biology:1.17.1-8)公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、支链α-酮酸脱氢酶复合体可以催化丙二酸单酰辅酶A的合成
本发明发现支链α-酮酸脱氢酶复合体可以催化丙二酸单酰辅酶A的合成，本实施例制备了含有支链α-酮酸脱氢酶复合体编码基因(bkdA、bkdB、bkdC、lpdA1、bkdF、bkdG、bkdH基因)的重组菌，并进一步敲除了支链α-酮酸合成途径中的两个基因(苏氨酸脱氨酶ilvA和支链氨基酸转氨酶ilvE基因)，对α-酮酸脱氢酶复合体催化丙二酸单酰辅酶A的合成进行了检测，所用引物见表1。
(1)表达阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)支链α-酮酸脱氢酶复合体的质粒的构建
(1-a)bkdA、bkdB、bkdC、lpdA1、bkdF、bkdG、bkdH基因的PCR扩增
采用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，产品目录为DP302)提取阿维链霉菌基因组DNA。以提取的阿维链霉菌基因组DNA作为模板，以bkdA-NcoI和bkdC-rbs-R为引物，用高保真TransStart FastPfu DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为AP221)进行PCR扩增，将得到的基因 片段记为ABC，ABC含有序列表中序列1所示的DNA片段；以bkdF-NcoI和bkdH-rbs-R为引物进行PCR扩增，将得到的基因片段记为FGH，FGH含有序列表中序列2所示的DNA片段；以bkdF-NcoI和bkdG-rbs-R为引物进行PCR扩增，将得到的基因片段记为FG，FG含有序列表中序列2的第1-2200位；以rbs-lpdA1-F和lpdA1-XhoI为引物进行PCR扩增，将得到的基因片段记为lpd，lpd含有序列表中序列4所示的lpdA1基因。
其中，序列1的第1-1146位为bkdA基因的DNA序列，编码序列表中序列7所示的bkdA蛋白质；第1220-2224位为bkdB的DNA序列，编码序列表中序列8所示的bkdB蛋白质；2224-3591位为bkdC的DNA序列，编码序列表中序列9所示的bkdC蛋白质；
序列2的第1-1221位为bkdF基因的DNA序列，编码序列表中序列10所示的bkdF蛋白质；序列2的第1223-2200位为bkdG基因的DNA序列，编码序列表中序列11所示的bkdG蛋白质；序列2的第2220-3608位为bkdH基因的DNA序列，编码序列表中序列12所示的bkdH蛋白质；
序列4所示的lpdA1基因编码序列表中序列13所示的lpdA1蛋白质。
根据大肠杆菌中密码子的偏好性，分别优化bkdH和lpdA1基因的序列，将优化后的基因分别记为opbkdH和oplpdA1基因，opbkdH和oplpdA1基因的序列分别为序列表中序列3和序列5，序列3和序列5分别编码序列表中序列12和13所示的bkdH蛋白质和lpdA1蛋白质。人工合成opbkdH和oplpdA1基因，以opbkdH基因为模板，利用rbs-opbkdH-F和rbs-opbkdH-R进行PCR扩增，将得到的基因片段记为opH，opH含有序列3所示的opbkdH基因；以oplpdA1基因为模板，利用rbs-oplpdA1-F和oplpdA1-XhoI进行PCR扩增，将得到的基因片段记为oplpd，oplpd含有序列表中序列5所示的oplpdA1基因。
(1-b)构建含有bkdA、bkdB、bkdC、lpdA1、bkdF、bkdG、bkdH基因的重组表达载体
将上述步骤(1-a)得到的各PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；同时用NcoI和XhoI酶切载体pYB1k(载体pYB1k核苷酸序列如序列表中序列6)，回收载体大片段YB1k-NX片段(即载体骨架)。用Gibson组装方法(Gibson DG,Young L,et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat.methods.2009；6(5):343-345)将回收的ABC、lpd片段与YB1k-NX片段进行连接反应；将回收的FGH、lpd片段与YB1k-NX片段进行Gibson组装连接反应；将回收的FG、opH、oplpd与YB1k-NX片段进行Gibson组装连接反应。将各连接产物用CaCl 2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为CD201)后，均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物F108/R124鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，挑选阳性克隆提取质粒，将ABC、lpd片段与YB1k-NX片段连接得到的序列正确的重组质粒命名为pYB1k-bkdABC-lpdA1，将FGH、lpd片段与YB1k-NX片段连接得到的序列正确的重组 质粒命名为pYB1k-bkdFGH-lpdA1，将FG、opH、oplpd与YB1k-NX片段连接得到的序列正确的重组质粒命名为pYB1k-bkdFG-opbkdH-oplpdA1。
pYB1k-bkdABC-lpdA1含有序列表中序列1和4所示的DNA片段，能表达序列7、8、9和13所示的四种蛋白质，pYB1k-bkdFGH-lpdA1含有序列表中序列2和4所示的DNA片段，能表达序列10、11、12和13所示的四种蛋白质，pYB1k-bkdFG-opbkdH-oplpdA1含有序列表中序列2的第1-2200位、序列3和序列4所示的DNA片段，能表达序列10、11、12和13所示的四种蛋白质。
(2)工程菌株苏氨酸脱氨酶ilvA和支链氨基酸转氨酶ilvE基因的敲除
以大肠杆菌BW25113为出发菌，敲除其ilvA基因，将得到的重组菌记为M01A，敲除其ilvE基因，将得到的重组菌记为M01E。
(2-a)制备含有大肠杆菌基因片段的P1噬菌体，所含有的基因片段具有ilvA和ilvE敲除性状
含有ilvA基因敲除性状的大肠杆菌基因片段和含有ilvE基因敲除性状的大肠杆菌基因片段分别来自大肠杆菌菌株JW3745和JW5606，这两株菌为分别含有ilvA和ilvE敲除性状的W3110系列菌株，均来自于日本国立遗传学研究所(NIG，Japan)，这两株菌中的编码苏氨酸脱氨酶的ilvA基因和支链氨基酸转氨酶的ilvE基因被替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因(约1300bp)从而将ilvA或ilvE基因敲除(Baba T,Ara T,et al.Construction of Escherichia coli K-12 in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol.Syst.Biol.2006；2:2006.0008.)。P1噬菌体制备过程如下：将JW3745或JW5606菌株37℃过夜培养后转接于含5mmol/L CaCl 2和0.1％葡萄糖的LB培养基中，37℃培养1h，然后加入野生型P1噬菌体继续培养1-3h。加几滴氯仿再培养几分钟，离心取上清即得到含有ilvA敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体P1vir ilvA和含有ilvE敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体P1vir ilvE。
(2-b)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌菌株M01A-Kan和M01E-Kan
过夜培养的大肠杆菌BW25113(受体菌)，取1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液(溶剂为水，溶质为10mM CaCl 2和5mM MgSO 4)重悬BW25113菌体细胞，将100μL噬菌体P1vir ilvA或P1vir ilvE与100μL BW25113细胞悬浮液混和，37℃孵育30min，然后加入1mL的LB培养基和200μL的1mol/L柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集菌体，用100μL的LB培养基重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板(卡那霉素的浓度为50μg/ml)上，37℃培养过夜后，挑选克隆，用ilvA-F/ilvA-R或ilvE-F/ilvE-R引物PCR扩增鉴定(扩增出1700bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆，将噬菌体P1vir ilvA得到的阳性克隆命名为M01A-Kan，将噬菌体P1vir ilvE得到的阳性克隆命名为M01E-Kan。
(2-c)抗性的消除
将pCP20质粒(Clontech公司)通过氯化钙转化法转化分别至M01A-Kan和M01E-Kan中，并在含有氨苄青霉素的LB平板30℃过夜培养后挑选克隆，分别得到含有质粒pCP20的重组大肠杆菌M01A-Kan/pCP20和M01E-Kan/pCP20。将这两种菌分别在含有氨苄青霉素抗性的LB培养基30℃培养后，涂布于无抗性LB平板上42℃培养过夜，挑选克隆，然后用ilvA-F/ilvA-R或ilvE-F/ilvE-R引物PCR扩增鉴定(扩增出400bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆，将由M01A-Kan得到的阳性克隆命名为M01A，M01A即为将大肠杆菌BW25113的ilvA基因敲除的菌株；将由M01E-Kan得到的阳性克隆命名为M01E，M01E即为将将大肠杆菌BW25113的ilvE基因敲除的菌株。
大肠杆菌BW25113中，ilvA基因的编码序列为序列表中序列14，编码序列表中序列15所示的ilvA蛋白质，ilvE基因的编码序列为序列表中序列16，编码序列表中序列17所示的ilvE蛋白质。
表1.所用引物序列列表
Figure PCTCN2020110232-appb-000001
Figure PCTCN2020110232-appb-000002
(3)外源表达支链α-酮酸脱氢酶复合体提高工程菌株丙二酸单酰辅酶A合成量检测
(3-a)重组菌的制备
将步骤(1)的pYB1k-bkdABC-lpdA1、pYB1k-bkdFGH-lpdA1和pYB1k-bkdFG-opbkdH-oplpdA1以及载体pYB1k分别导入大肠杆菌BW25113中，将得到的重组菌依次记为M-ABC、M-FGH、M-opFGH和BW；将pYB1k-bkdFGH-lpdA1分别导入步骤(1)的M01A和M01E中，将得到的重组菌分别记为MA-FGH和ME-FGH。
(3-b)培养基的制备
A培养基：A培养基是由溶质和溶剂组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在该培养基中的浓度分别为：NaHPO 4 25mM，KH 2PO 4 25mM，NH 4Cl 50mM。
B培养基：B培养基为在A培养基中添加Na 2SO 4、MgSO 4、甘油、酵母粉和微量元素得到的无菌培养基，B培养基中Na 2SO 4的浓度为5mM，MgSO 4的浓度为2mM，甘油的体积百分比为0.5％，酵母粉的质量百分比为0.5mg/100mL，各微量元素及其在B培养基中的浓度分别为50μM FeCl 3，20μM CaCl 2，10μM MnCl 2，10μM ZnSO 4，2μM CoCl 2，2μM NiCl 2，2μM Na 2MO 4，2μM Na 2SeO 3和2μM H 3BO 3。
C培养基：C培养基为在A培养基中添加葡萄糖得到的无菌培养基，C培养基中葡萄糖的浓度为20g/L。
(3-c)菌体的培养和酶的诱导
将过夜培养的工程菌株M-ABC按1％接种量接种于20ml B培养基的摇瓶中，37℃培养6h后，向培养体系中添加阿拉伯糖使阿拉伯糖在培养体系中的质量百分比浓度为0.2％，继续培养12h，收集菌体，即M-ABC菌体。
按照上述方法，将M-ABC分别替换为M-FGH、M-opFGH、BW、MA-FGH和ME-FGH，得到M-FGH、M-opFGH、BW、MA-FGH和ME-FGH菌体。
(3-d)丙二酸单酰辅酶A的全细胞催化
将步骤(3-c)收集的菌体取等量(所用菌体量为1mL OD 600＝90的菌体)按照如下方法检测各菌中丙二酸单酰辅酶A的合成量：
将菌体重悬于含5ml C培养基的摇瓶中，37℃培养3h后，离心收集菌体， 然后将该菌体重悬于400μL负80℃预冷的80％(体积百分比)甲醇水溶液中，超声破碎细胞，12000rpm 4℃离心20min，收集上清液检测上清液中丙二酸单酰辅酶A的含量。上清液中丙二酸单酰辅酶A的含量采用标准曲线法(外标法)以丙二酸单酰辅酶A(Sigma，63410-10MG-F)为标准品利用LCMS/MS进行分析。
结果如图1，图中，纵坐标为检测的丙二酸单酰辅酶A的相对信号强度，检测BW、M-ABC、M-FGH、M-opFGH、MA-FGH和ME-FGH的上清液中丙二酸单酰辅酶A的相对信号强度分别为0.22、1.13、1.89、2.43、2.44和4.59。相对于BW，M-ABC、M-FGH、M-opFGH、MA-FGH和ME-FGH的上清液中丙二酸单酰辅酶A的相对含量分别为5.09、8.48、10.94、10.98和20.61，即M-ABC、M-FGH、M-opFGH、MA-FGH和ME-FGH的上清液中丙二酸单酰辅酶A的含量分别为BW的5.09倍、8.48倍、10.94倍、10.98倍、20.61倍。
表明，向大肠杆菌中导入支链α-酮酸脱氢酶复合体编码基因后，丙二酸单酰辅酶A的合成量显著提高；与导入bkdA、bkdB、bkdC、lpdA1基因相比，导入bkdF、bkdG、bkdH、lpdA1基因丙二酸单酰辅酶A的合成量更高；而将bkdH、lpdA1基因根据大肠杆菌密码子的偏好性进行优化后，丙二酸单酰辅酶A的合成量可以得到进一步的提高；在导入bkdF、bkdG、bkdH、lpdA1基因的基础上，敲除支链α-酮酸脱氢酶复合体的底物—支链α-酮酸合成途径中的ilvA和ilvE基因，丙二酸单酰辅酶A的合成量也可以得到进一步的提升，且ilvE基因敲除后丙二酸单酰辅酶A的合成量可以得到大幅度提升。
实施例2、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因可提高工程菌株M-FGH丙二酸单酰辅酶A的合成量
本实施例在实施例1的工程菌株M-FGH基础上，导入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因并敲除了ompT基因(ompT基因的序列为序列表中序列27，编码序列28所示的ompT蛋白质)，进一步提高了丙二酸单酰辅酶A的合成量，所用引物见表2。
(4)表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因工程菌株的构建
(4-a)谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌基因组提取，以及ppc基因、氯霉素抗性片段和ompT基因上下游同源臂的PCR扩增
以ppc-F和ppc-R为PCR扩增引物，利用谷氨酸棒状杆菌基因组DNA为模板，扩增得到片段tac-ppc，tac-ppc含有ppc基因，ppc基因的核苷酸序列为序列表中序列18，编码序列19所示的ppc蛋白质。以Cm-F和Cm-R为PCR扩增引物，利用lox71-Cm-lox66-tac为模板，扩增得到片段Cm，lox71-Cm-lox66-tac片段核苷酸序列为序列表中序列20，该片段通过全基因合成获得(南京金斯瑞)。以ompT-up-F和ompT-up-R为PCR扩增引物，利用大肠杆菌基因组DNA为模板，扩增得到片段ompT-up，以ompT-down-F和ompT-down-R为PCR扩增引物，利用大肠杆菌基因组DNA为模板，扩增得到片段ompT-down。
(4-b)ompT-up-Cm-tac-ppc-ompT-down打靶片段的制备
以tac-ppc、Cm、ompT-up和ompT-down四个片段为模板，以ompT-up-F和ompT-down-R为引物，通过融合PCR的手段，扩增得到打靶片段ompT-up-Cm-tac-ppc-ompT-down，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段(天根生化科技有限公司，产品目录为DP209)。
(4-c)含有pKD46质粒宿主菌的制备
将pKD46质粒(Clontech公司)通过氯化钙转化法转化至工程菌株M-FGH中，在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板30℃过夜培养后挑选克隆，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌M-FGH/pKD46。重组大肠杆菌M-FGH/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。然后通过10％甘油洗涤制备成M-FGH/pKD46感受态细胞。
(4-d)同源重组
将(4-b)的ompT-up-Cm-tac-ppc-ompT-down片段电转入(4-c)所制备的M-FGH/pKD46感受态细胞中，于含有卡那霉素(浓度为50μg/ml)和氯霉素(浓度为34μg/ml)的LB平板37℃过夜，挑选克隆，用ompT-up1k-F和ppc-R引物PCR扩增鉴定(扩增出6000bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为M-FGH-ppc。M-FGH-ppc含有序列表中序列18所示的ppc基因，能表达序列19所示的ppc蛋白质。M-FGH-ppc不含有ompT基因。
(5)过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因及阿维链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体基因bkdFGH-lpdA1工程菌株丙二酸单酰辅酶A合成量检测
按照实施例1中步骤(3)的(3-c)和(3-d)的方法，将M-ABC分别替换为M-FGH和M-FGH-ppc，其他步骤均不变，检测这两株菌的丙二酸单酰辅酶A合成量。
结果如图2，图中，纵坐标为检测的丙二酸单酰辅酶A的相对信号强度，检测M-FGH和M-FGH-ppc的上清液中丙二酸单酰辅酶A的相对信号强度分别为1.89和3.66。相对于M-FGH，M-FGH-ppc的上清液中丙二酸单酰辅酶A的相对含量为1.94，即M-FGH-ppc的上清液中丙二酸单酰辅酶A的含量为M-FGH的1.94倍。表明，ppc基因可以提高丙二酸单酰辅酶A的合成量。
表2.引物序列列表
Figure PCTCN2020110232-appb-000003
Figure PCTCN2020110232-appb-000004
实施例3、表达阿维链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体基因bkdFGH-lpdA1可提高3-羟基丙酸(3-HP)产量。
3-羟基丙酸为重要的平台化合物，为多种化学品的合成原料，可以丙二酸单酰辅酶A为前体，经两步还原反应得到3-羟基丙酸。本实施例通过向实施例1和实施例2得到的M-ABC、M-FGH、M-opFGH、MA-FGH、ME-FGH、M-FGH-ppc中导入嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr基因制备3-羟基丙酸，并利用实施例1的BW作为对照。所用引物如表3所示。
(6)表达嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr的质粒的构建
(6-a)经过改造的嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr基因的核苷酸序列为序列表中序列21，其中mcr基因的N端结构域核苷酸序列是序列21的第1-1689位，编码序列表中序列22所示的mcr的N端结构域；mcr基因的C端结构域核苷酸序列是序列21的第1704-3749位，编码序列表中序列23所示的mcr的C端结构域；N端结构域和C端结构域之间含有RBS位点，序列是序列21的第1691-1696位。序列21所示的mcr基因片段通过全基因合成，连接在pUC57载体上，获得重组载体pUC57-mcr。以pUC57-mcr为模板用引物mcr-F/mcrR扩增得到PCR扩增片段。
(6-b)将上述(6-a)得到的PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；同时用NcoI和XhoI酶切载体pLB1a(载体pLB1a核苷酸序列为序列表中序列24)，回收载体大片段LB1a-NX(即载体骨架)。用Gibson组装方法将上述回收的目的片段与LB1a-NX片段进行连接反应，将连接产物用CaCl 2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为CD201)后，涂布于含链霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物F-105/mcr-R鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，挑选阳性克隆提取质粒，将获得的序列正确的阳性质粒命名为pLB1a-mcr。
pLB1a-mcr含有序列表中序列21所示的mcr基因，能表达序列22和23所示的mcr的N端结构域和C端结构域。
(7)产3-羟基丙酸工程菌株构建及3-羟基丙酸全细胞催化
(7-a)将步骤(6)所得pLB1a-mcr分别导入M-ABC、M-FGH、M-opFGH、MA-FGH、ME-FGH、M-FGH-ppc和BW中，将得到的重组菌依次命名为M-ABC-HP、M-FGH-HP、M-opFGH-HP、MA-FGH-HP、ME-FGH-HP、M-FGH-ppc-HP和BW-HP，将各重组菌作为待测菌株进一步用于3-羟基丙酸的制备。
(7-b)工程菌株的培养和酶的诱导
将过夜培养的待测菌株按1％接种量接种于(3-b)所述20ml B培养基的摇瓶中，37℃培养6h后，向培养体系中添加阿拉伯糖使阿拉伯糖在培养体系中的质量百分比浓度为0.2％，继续培养12h，收集菌体。
(7-c)3-羟基丙酸的全细胞催化
将上述收集的菌体重悬于含5ml C培养基的摇瓶中，37℃培养8h后，离心取上清过滤，收集滤液。所用菌体量为5mL OD 600＝30的菌体。以3-羟基丙酸(TCI，H0297-10G)为标准品采用标准曲线法(外标法)利用HPLC定量分析滤液中3-羟基丙酸的含量。
结果如图3所示，M-ABC-HP、M-FGH-HP、M-opFGH-HP、MA-FGH-HP、ME-FGH-HP、M-FGH-ppc-HP和BW-HP所得滤液中3-羟基丙酸的含量分别为0.86、1.44、1.65、1.80、3.84、1.94和0.55g/L，M-ABC-HP、M-FGH-HP、M-opFGH-HP、MA-FGH-HP、ME-FGH-HP和M-FGH-ppc-HP的3-羟基丙酸产量分别为BW-HP的1.56倍、2.62倍、3.00倍、3.27倍、6.98倍和3.53倍。
表明，向大肠杆菌中导入支链α-酮酸脱氢酶复合体编码基因后，3-羟基丙酸的产量显著提高；与导入bkdA、bkdB、bkdC、lpdA1基因相比，导入bkdF、bkdG、bkdH、lpdA1基因3-羟基丙酸的产量更高；而将bkdH、lpdA1基因根据大肠杆菌密码子的偏好性进行优化后，3-羟基丙酸的产量可以得到进一步的提高；在导入bkdF、bkdG、bkdH、lpdA1基因的基础上，敲除支链α-酮酸脱氢酶复合体的底物—支链α-酮酸合成途径中的ilvA和ilvE基因，3-羟基丙酸的产量也可以得到进一步的提升，且ilvE基因敲除后3-羟基丙酸的产量可以得到大幅度提升；在导入bkdF、bkdG、bkdH、lpdA1基因的基础上，再导入ppc基因后可进一步提高3-羟基丙酸的产量。3-羟基丙酸的产量的变化趋势与实施例1和2中相应菌株丙二酸单酰辅酶A的合成量的变化趋势是相同的。
表3.引物序列列表
Figure PCTCN2020110232-appb-000005
实施例4、表达阿维链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体基因bkdFGH-lpdA1可提高啤酒花β酸前体PIVP产量
来源于植物啤酒花的III型聚酮化合物苦味酸在大肠杆菌中的异源表达。苦味酸作为啤酒花(Humulus lupulus大麻科葎草属)风味物质在啤酒花腺体 腺毛特异合成积累，是啤酒酿造工业必不可少的要素，有很高的药用价值和保健功能，也是很多药物的前体物质。现在已经报道可以在酵母中实现其途径合成。途径主要是支链脂酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A在vps(苯戊酮合成酶)的作用下生成3-甲基-异丁酰间苯三酚(PIVP)，然后PIVP与DMAPP在HIPT1 HIPT2(异戊烯基转移酶)的作用下生成的直接前体Di-Prenyl PIVP。然后经过氧化反应到苦味酸(图4)。本实施例通过向实施例1和实施例2得到的M-ABC、M-FGH、M-opFGH、MA-FGH、ME-FGH、M-FGH-ppc中导入啤酒花(Humulus lupulus)苯戊酮合成酶基因vps基因合成PIVP，并利用实施例1的BW作为对照。所用引物如表4和表3所示。
(8)表达啤酒花(Humulus lupulus)苯戊酮合成酶基因vps基因的质粒的构建
(8-a)啤酒花苯戊酮合成酶基因vps基因的核苷酸序列为序列表中序列25。vps基因通过全基因合成，连接在pUC57载体上，获得载体pUC57-vps。以pUC57-vps为模板用引物vps-F/vps-R进行PCR扩增vps基因片段。
(8-b)将上述(8-a)得到的PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；同时用NcoI和XhoI酶切载体pLB1a(载体pLB1a核苷酸序列如序列24)，回收载体大片段LB1a-NX片段(即载体骨架)。用Gibson组装方法将上述回收的目的片段与LB1a-NX片段进行连接反应，将连接产物用CaCl 2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为CD201)后，涂布于含链霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物F-105/vps-R鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，挑选阳性克隆提取质粒，将获得的序列正确的阳性质粒命名为pLB1a-vps。
pLB1a-vps含有序列表中序列25所示的vps基因，能表达序列26所示的vps蛋白质。
(9)产PIVP菌株构建及3-羟基丙酸全细胞催化
(9-a)将步骤(8)所得pLB1a-vps分别导入M-ABC、M-FGH、M-opFGH、MA-FGH、ME-FGH、M-FGH-ppc和BW中，将得到的重组菌依次命名为M-ABC-PIVP、M-FGH-PIVP、M-opFGH-PIVP、MA-FGH-PIVP、ME-FGH-PIVP、M-FGH-ppc-PIVP和BW-PIVP，将各重组菌作为待测菌株进一步用于合成PIVP。
(9-b)工程菌株的培养和酶的诱导
将过夜培养的各待测菌株按1％接种量接种于(3-b)所述20ml B培养基的摇瓶中，37℃培养6h后，向培养体系中添加阿拉伯糖使阿拉伯糖在培养体系中的质量百分比浓度为0.2％，继续培养12h，收集菌体。
(9-c)PIVP的全细胞催化
将上述收集的菌体重悬于含5ml C培养基的摇瓶中，37℃培养8h后，离心后重悬于400μL负80℃预冷的80％(体积百分比)甲醇水溶液中，超声破碎细胞，12000rpm 4℃离心20min，收集上清液检测上清液中PIVP的含量。 所用菌体量为5mL OD 600＝30的菌体。上清液中PIVP的含量采用标准曲线法(外标法)以PIVP(TRC，P339590-1g)为标准品利用LCMS/MS进行分析。
结果如图5所示，M-ABC-PIVP、M-FGH-PIVP、M-opFGH-PIVP、MA-FGH-PIVP、ME-FGH-PIVP、M-FGH-ppc-PIVP和BW-PIVP所得上清液中PIVP的含量分别为8.96、16.68、23.63、15.14、2.49、82.50和0mg/L，BW-PIVP不产PIVP，M-ABC-PIVP、M-FGH-PIVP、M-opFGH-PIVP、MA-FGH-PIVP、ME-FGH-PIVP、M-FGH-ppc-PIVP均可生产PIVP。
表明，向大肠杆菌中导入支链α-酮酸脱氢酶复合体编码基因后，可生产PIVP：BW-PIVP不合成PIVP；与导入bkdA、bkdB、bkdC、lpdA1基因相比，导入bkdF、bkdG、bkdH、lpdA1基因PIVP的产量更高；而将bkdH、lpdA1基因根据大肠杆菌密码子的偏好性进行优化后，PIVP的产量可以得到进一步的提高；在导入bkdF、bkdG、bkdH、lpdA1基因的基础上，再导入ppc基因后可进一步大幅度提高PIVP的产量。而在导入bkdF、bkdG、bkdH、lpdA1基因的基础上，敲除支链α-酮酸脱氢酶复合体的底物—支链α-酮酸合成途径中的ilvA和ilvE基因，PIVP的产量并未同实施例1相应菌株的丙二酸单酰辅酶A的合成量变化趋势一样进一步提高，这是因为PIVP生成过程中还需要支链α-酮酸的参与，而ilvA和ilvE基因敲除后支链α-酮酸含量下降，进而影响了PIVP的产量，因此在生产以丙二酸单酰辅酶A为中间产物的目的产物中，可根据合成途径中是否需要支链α-酮酸来确定是否敲除支链α-酮酸合成途径中的基因。
表4.引物序列列表
Figure PCTCN2020110232-appb-000006
实施例5、表达纯化阿维链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体基因和其草酰乙酸脱氢酶复合体活力检测
(10)阿维链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体蛋白表达载体的构建
(10-a)以(1-b)所述pYB1k-bkdFGH-lpdA1质粒为模板，利用引物BCDH-His-F和BCDH-His-R(表5)进行PCR扩增得到YK-BCDH-His DNA片段。
(10-b)将上述(10-a)PCR扩增得到的YK-BCDH-His DNA片段进行DpnI酶切处理，将酶切产物用CaCl 2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为CD201)后，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物F108/lpdA1-XhoI鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，挑选阳性克隆提取质粒，将获得的序列正确的阳性质粒命名为pYB1k-His-BCDH。
(11)阿维链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体蛋白表达纯化
(11-a)将pYB1k-His-BCDH导入实施例1的大肠杆菌BW25113中，将得到的重组菌命名为His-BCDH。
(11-b)将过夜培养的工程菌株His-BCDH按1％接种量接种于(3-a)所述5L B培养基的摇瓶中，30℃培养6h后，向培养体系中添加阿拉伯糖使阿拉伯糖在培养体系中的质量百分比浓度为0.2％，继续培养20h，收集菌体，用D缓冲液清洗菌体两遍，然后重悬于D缓冲液中，破碎细胞，20000rpm离心2小时，收集上清液。
D缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在D缓冲液中的浓度为50mM Tris-HCl和200mM KCl，pH＝8.0。
(11-c)用D缓冲液平衡镍柱10倍柱体积，将(11-b)中离心得到的上清液，流穿上述平衡后的镍柱，用10倍柱体积D缓冲液冲洗后，依次用D缓冲液与E缓冲液的体积比为49/1、45/5和42/8的混合缓冲液分别冲洗5倍柱体积，然后用D缓冲液与E缓冲液的体积比为1/1的混合缓冲液洗脱，得到阿维链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体蛋白，使用100kDa的超滤管(Amicon Ultra-15)清洗和浓缩上述复合体蛋白，得到脱盐蛋白，可用于体外酶活检测。
E缓冲液为向D缓冲液中添加咪唑得到的咪唑浓度为500mM的溶液。
(12)阿维链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合体催化草酰乙酸产生丙二酸单酰辅酶A活力检测
在96孔板中，每孔添加200μL F缓冲液，然后分为五组，即OAA组、OAA-EDTA组、KIV组(正对照)、KIV-EDTA组和对照组，每组3个重复。
F缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0)，溶质及其在F缓冲液中的浓度分别为0.1mM CoA(辅酶A)、0.2mM DTT(二硫苏糖醇)、0.2mM TPP(硫胺素焦磷酸)、1mM MgSO 4和2mM NAD +(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。
向OAA组的每孔中添加草酰乙酸，草酰乙酸在反应体系中的浓度为3mM；
向OAA-EDTA组的每孔中添加草酰乙酸和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，草酰乙酸和EDTA在反应体系中的浓度分别为3mM和10mM；
向KIV组的每孔中添加α-酮异戊酸(3-甲基-2-氧代丁酸)，α-酮异戊酸在反应体系中的浓度为3mM；
向KIV-EDTA组的每孔中添加α-酮异戊酸和EDTA，α-酮异戊酸和EDTA在反应体系中的浓度分别为3mM和10mM。
对照组仅含有F缓冲液。
每组各试剂添加完后，添加支链α-酮酸脱氢酶复合体，每200μL的反应体系中，加入10μL 0.054mg/mL的支链α-酮酸脱氢酶复合体溶液。
然后将各组96孔板置于30℃反应30min，用酶标仪(BioTek)每分钟检测一次340nm处的吸光值。
结果如图6所示。体外生化实验证实来源于阿维链霉菌的支链α-酮酸脱氢酶复合体具有催化草酰乙酸产生丙二酸单酰辅酶A的活力，支链α-酮酸脱氢酶复合体的酶活力为2.238mM/min/mg蛋白，支链α-酮酸脱氢酶复合体的酶活力 定义是每毫克支链α-酮酸脱氢酶复合体每分钟催化产生NADH的摩尔量。
表5.引物序列列表
Figure PCTCN2020110232-appb-000007
工业应用
本发明发现了一类新的丙二酸单酰辅酶A来源，即丙二酸单酰辅酶A可以由支链α-酮酸脱氢酶复合体催化草酰乙酸得到，通过生化和遗传等试验证明支链α-酮酸脱氢酶复合体具有草酰乙酸脱氢酶活性。另外，本发明还发现引入/提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶可进一步提高丙二酸单酰辅酶A合成量，敲除支链α-酮酸合成途径中的基因也可提高丙二酸单酰辅酶A合成量。本发明进一步还利用支链α-酮酸脱氢酶复合体制备了以丙二酸单酰辅酶A为中间产物的目的产物，如3-羟基丙酸、苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物。表明，可以利用本发明的支链α-酮酸脱氢酶复合体制备丙二酸单酰辅酶A以及以丙二酸单酰辅酶A为中间产物的目的产物，如3-羟基丙酸、苦味酸、脂肪酸、聚酮化合物和黄酮化合物等，具有广泛的应用前景。

Claims (22)

  1. 制备丙二酸单酰辅酶A的方法，包括11)和12)：
    11)向生物细胞中导入支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因，并使所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因得到表达，得到重组细胞，将该重组细胞记为重组细胞A；
    12)培养所述重组细胞A，制备得到丙二酸单酰辅酶A。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述支链α-酮酸脱氢酶复合体为下述M1)或M2)：
    M1)由bkdF蛋白质、bkdG蛋白质、bkdH蛋白质和lpdA1蛋白质组成的成套蛋白质；
    M2)由bkdA蛋白质、bkdB蛋白质、bkdC蛋白质和所述lpdA1蛋白质组成的成套蛋白质；
    所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因为下述L1)或L2)：
    L1)由所述bkdF蛋白质的编码基因、所述bkdG蛋白质的编码基因、所述bkdH蛋白质的编码基因和所述lpdA1蛋白质的编码基因组成的成套基因；
    L2)由所述bkdA蛋白质的编码基因、所述bkdB蛋白质的编码基因、所述bkdC蛋白质的编码基因和所述lpdA1蛋白质的编码基因组成的成套基因。
  3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述bkdF蛋白质、所述bkdG蛋白质、所述bkdH蛋白质、所述lpdA1蛋白质、所述bkdA蛋白质、所述bkdB蛋白质和所述bkdC蛋白质及其编码基因来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)。
  4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述bkdF蛋白质为下述a1)或a2)的蛋白质：
    a1)序列表中序列10所示的蛋白质；
    a2)将序列表中序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列10的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述bkdG蛋白质为下述a3)或a4)的蛋白质：
    a3)序列表中序列11所示的蛋白质；
    a4)将序列表中序列11的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列11的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述bkdH蛋白质为下述a5)或a6)的蛋白质：
    a5)序列表中序列12所示的蛋白质；
    a6)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列12的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述lpdA1蛋白质为下述a7)或a8)的蛋白质：
    a7)序列表中序列13所示的蛋白质；
    a8)将序列表中序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列13的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述bkdA蛋白质为下述a9)或a10)的蛋白质：
    a9)序列表中序列7所示的蛋白质；
    a10)将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列7的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述bkdB蛋白质为下述a11)或a12)的蛋白质：
    a11)序列表中序列8所示的蛋白质；
    a12)将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列8的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述bkdC蛋白质为下述a13)或a14)的蛋白质：
    a13)序列表中序列9所示的蛋白质；
    a14)将序列表中序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列9的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
  5. 根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：
    所述bkdF蛋白质的编码基因为下述b1)或b2)：
    b1)序列表中序列2的第1-1221位所示的DNA分子；
    b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
    所述bkdG蛋白质的编码基因为下述b3)或b4)：
    b3)序列表中序列2的第1223-2200位所示的DNA分子；
    b4)与b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
    所述bkdH蛋白质的编码基因为下述b5)或b6)或b7)：
    b5)序列表中序列3所示的DNA分子；
    b6)序列表中序列2的第2220-3608位所示的DNA分子；
    b7)与b5)或b6)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
    所述lpdA1蛋白质的编码基因为下述b8)或b9)或b10)：
    b8)序列表中序列5所示的DNA分子；
    b9)序列表中序列4所示的DNA分子；
    b10)与b8)或b9)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
    所述bkdA蛋白质的编码基因为下述b11)或b12)：
    b11)序列表中序列1的第1-1146位所示的DNA分子；
    b12)与b11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
    所述bkdB蛋白质的编码基因为下述b13)或b14)：
    b13)序列表中序列1的第1220-2224位所示的DNA分子；
    b14)与b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
    所述bkdC蛋白质的编码基因为下述b15)或b16)：
    b15)序列表中序列1的第2224-3591位所示的DNA分子；
    b16)与b15)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
  6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述生物细胞含有支链α-酮酸合成途径，步骤11)还包括抑制所述生物细胞中支链α-酮酸的合成。
  7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述抑制支链α-酮酸的合成通过敲除所述生物细胞中支链α-酮酸合成途径中的至少一个基因，或降低支链α-酮酸合成途径中的至少一个基因编码蛋白质的含量或活性实现。
  8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述抑制支链α-酮酸的合成通过敲除所述生物细胞中的ilvA基因或/和ilvE基因，或降低所述生物细胞中的所述ilvA基因或/和所述ilvE基因编码蛋白质的含量或活性实现。
  9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述ilvA基因编码下述a15)或a16)的蛋白质：
    a15)序列表中序列15所示的蛋白质；
    a16)将序列表中序列15的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列15的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述ilvE基因编码下述a17)或a18)的蛋白质：
    a17)序列表中序列17所示的蛋白质；
    a18)将序列表中序列17的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列17的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    进一步，
    所述ilvA基因为下述b17)或b18)：
    b17)序列表中序列14所示的DNA分子；
    b18)与b17)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
    所述ilvE基因为下述b19)或b20)：
    b19)序列表中序列16所示的DNA分子；
    b20)与b19)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
  10. 根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：步骤11)还包括向所述生物细胞中导入ppc蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达，或增加所述生物细胞中所述ppc蛋白质的含量或增强所述ppc蛋白质的活性；
    进一步，所述ppc蛋白质及其编码基因来源于谷氨酸棒状杆菌；
    更进一步，所述ppc蛋白质为下述a19)或a20)：
    a19)序列表中序列19所示的蛋白质；
    a20)将序列表中序列19的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列19的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述ppc蛋白质的编码基因为下述b21)或b22)：
    b21)序列表中序列18所示的DNA分子；
    b22)与b21)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
  11. 根据权利要求1-10中任一所述的方法，其特征在于：所述生物细胞能表达外膜蛋白酶VII，步骤11)还包括敲除所述生物细胞中所述外膜蛋白酶VII的编码基因，或降低所述生物细胞中所述外膜蛋白酶VII的含量或活性；
    进一步，所述外膜蛋白酶VII为ompT蛋白质；
    更进一步，所述ompT蛋白质为下述a21)或a22)：
    a21)序列表中序列28所示的蛋白质；
    a22)将序列表中序列28的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列28的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述ompT蛋白质的编码基因为下述b23)或b24)：
    b23)序列表中序列27所示的DNA分子；
    b24)与b23)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
  12. 根据权利要求1-11中任一所述的方法，其特征在于：所述生物细胞含有草酰乙酸合成途径，能合成草酰乙酸；
    进一步，所述生物细胞为微生物细胞、动物细胞或植物细胞；
    更进一步，所述微生物细胞为N1)或N2)或N3)：
    N1)细菌或真菌；
    N2)大肠杆菌；
    N3)大肠杆菌BW25113。
  13. 制备丙二酸单酰辅酶A的方法，包括：以草酰乙酸为底物，采用权利要求1-5中任一所述支链α-酮酸脱氢酶复合体进行催化反应，得到丙二酸单酰辅酶A。
  14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述催化反应在F缓冲液中进行；所述F缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0)，所述溶质及其在所述F缓冲液中的浓度分别为0.1mM辅酶A、0.2mM二硫苏糖醇、0.2mM磷酸三苯酯、1mM MgSO 4和2mM NAD +；
    和/或，所述催化反应在30-37℃下进行，
    进一步，所述催化反应在30℃下进行。
  15. 生产以丙二酸单酰辅酶A为中间产物的目的产物的方法，包括：培养权利要求1-12中任一所述重组细胞A，制备得到目标产物。
  16. 根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述目标产物为3-羟基丙酸，所述方法包括：向所述重组细胞A中导入mcr蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达，或增加所述重组细胞A中所述mcr蛋白质的含量或增强所述mcr蛋白质的活性，得到重组细胞，将该重组细胞记为重组细胞-mcr；培养所述重组细胞-mcr，制备得到所述目标产物；
    进一步，所述mcr蛋白质及其编码基因来源于嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)；
    更进一步，所述mcr蛋白质由mcr N端结构域和mcr C端结构域组成，所述mcr N端结构域为下述a23)或a24)：
    a23)序列表中序列22所示的蛋白质；
    a24)将序列表中序列22的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列22的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述mcr C端结构域为下述a25)或a26)：
    a25)序列表中序列23所示的蛋白质；
    a26)将序列表中序列23的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列23的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述mcr蛋白质的编码基因由所述mcr N端结构域的编码基因和所述mcr C端结构域的编码基因组成，所述mcr N端结构域的编码基因为下述b25)或b26)：
    b25)序列表中序列21的第1-1689位所示的DNA分子；
    b26)与b25)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
    所述mcr C端结构域的编码基因为下述b27)或b28)：
    b27)序列表中序列21的第1704-3749位所示的DNA分子；
    b28)与b27)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
    再进一步，所述mcr蛋白质的编码基因为下述b29)或b30)：
    b29)序列表中序列21所示的DNA分子；
    b30)与b29)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
  17. 根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述目标产物为苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物，所述方法包括：向所述重组细胞A中导入vps蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达，或增加所述重组细胞A中所述vps蛋白质的含量或增强所述vps蛋白质的活性，得到重组细胞，将该重组细胞记为重组细胞-vps；培养所述重组细胞-vps，制备得到所述目标产物；
    进一步，所述vps蛋白质及其编码基因来源于啤酒花(Humulus lupulus)；
    更进一步，所述vps蛋白质为下述a27)或a28)：
    a27)序列表中序列26所示的蛋白质；
    a28)将序列表中序列26的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与序列26的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
    所述vps蛋白质的编码基因为下述b31)或b32)：
    b31)序列表中序列25所示的DNA分子；
    b32)与b31)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
  18. 成套试剂，为成套试剂甲或成套试剂乙或成套试剂丙；
    所述成套试剂甲包括权利要求1-5中任一所述支链α-酮酸脱氢酶复合体或所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因；
    所述成套试剂乙由所述成套试剂甲与权利要求16中所述mcr蛋白质或所述mcr蛋白质的编码基因组成；
    所述成套试剂丙由所述成套试剂甲与权利要求17中所述vps蛋白质或所述vps蛋白质的编码基因组成。
  19. 根据权利要求18所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂甲还包括权利要求10中所述ppc蛋白质或所述ppc蛋白质的编码基因。
  20. 根据权利要求18或19所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂甲还包括抑制支链α-酮酸合成的物质。
  21. 重组细胞，为权利要求1-12中任一所述重组细胞A、权利要求16中所述重组细胞-mcr或权利要求17中所述重组细胞-vps。
  22. 下述I、II或III的应用：
    I、权利要求1-5中任一所述支链α-酮酸脱氢酶复合体或所述支链α-酮酸脱氢酶复合体的编码基因，权利要求1-12中任一所述重组细胞A，或，权利要求18-20中任一所述成套试剂甲的下述任一应用：
    X1)合成丙二酸单酰辅酶A；
    X2)制备合成丙二酸单酰辅酶A产品；
    X3)生产以丙二酸单酰辅酶A为中间产物的目的产物；
    X4)制备生产以丙二酸单酰辅酶A为中间产物的目的产物的产品；
    X5)合成3-羟基丙酸；
    X6)制备合成3-羟基丙酸产品；
    X7)合成苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物；
    X8)制备合成苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物产品；
    X9)合成脂肪酸；
    X10)制备合成脂肪酸产品；
    X11)合成聚酮化合物；
    X12)制备合成聚酮化合物产品；
    X13)合成黄酮化合物；
    X14)制备合成黄酮化合物产品；
    II、权利要求16中所述重组细胞-mcr或利要求18-20中任一所述成套试剂乙的下述任一应用：
    Y1)合成3-羟基丙酸；
    Y2)制备合成3-羟基丙酸产品；
    III、权利要求17中所述重组细胞-vps或利要求18-20中任一所述成套试剂丙的下述任一应用：
    Z1)合成苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物；
    Z2)制备合成苦味酸或苦味酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A至苦味酸间的中间产物产品。
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