CN107365733B - 在重组微生物细胞中制备奇数链脂肪酸衍生物 - Google Patents

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Abstract

提供了重组的微生物细胞，其经改造而通过脂肪酸生物合成途径产生具有线性链的脂肪酸衍生物，所述线性链含有奇数的碳原子。还提供了利用所述重组微生物细胞制备奇数链脂肪酸衍生物的方法以及包含通过此类方法产生的奇数链脂肪酸衍生物的组合物。

Description

在重组微生物细胞中制备奇数链脂肪酸衍生物
本申请是申请日为2012年3月8日、申请号为201280054084.6、发明名称为“在重组微生物细胞中制备奇数链脂肪酸衍生物”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请是部分连续申请，并且要求2011年9月14日提交的美国申请系列第13/232,927号和2010年9月15日提交的美国临时专利申请第61/383,086号的权益，其通过引用以全文明确并入本文中。
通过引用并入电子递交材料
本申请含有通过EFS-Web以ASCII格式递交的序列表，其通过引用全文并入本文。所述ASCII副本，创建于2012年3月7日，名称为LS0033PC.txt，大小为350,776字节。
发明背景
原油是含有多种碳氢化合物的非常复杂的混合物。其通过精炼厂中的多种化学过程转变成多种燃料和化学品。原油是运输燃料的来源，也是生产石油化学品的原材料来源。石油化学品用于制备特定的化学品如塑料、树脂、光纤、弹性体、药品、润滑剂和凝胶。
最重要的运输燃料——汽油、柴油和喷气燃料，含有特别不同的碳氢化合物混合物，所述碳氢化合物均向最佳的引擎性能方面调整。例如，汽油包含范围通常为约4至12个碳原子的直链、支链和芳香族碳氢化合物，而柴油主要包含范围为约9至23个碳原子的直链碳氢化合物。柴油燃料质量通过诸如十六烷数、动力学粘度、氧化稳定性和浊点评估(Knothe G.,Fuel Process Technol.86:1059-1070(2005))。此外，这些参数受到碳氢化合物的长度以及碳氢化合物的分支程度和饱和度的影响。
可以通过遗传操作调整由微生物产生的脂肪酸衍生物。代谢改造使得微生物菌株能够产生脂肪酸衍生物的各种混合物，其可以被优化，例如，以符合或超出燃料标准或其他商业相关产品规格。可以改造微生物菌株以产生通常源自石油的化学或前体分子。在一些情形下，期望模拟已存在产品的产品概况，例如已存在的石油来源的燃料或化工产品的产品概况，以用于有效的嵌入兼容性或替代。本文所述的重组细胞和方法阐述了微生物生产具有各种比例的奇数：偶数长度链的脂肪酸衍生物，作为精确控制例如基于碳氢化合物的燃料和化工产品的结构和功能的手段。
人们需要石油产品的划算的替代物，其不需要勘探、提取、长距离运输或大量的精炼，并避免与石油加工相关的各种类型的环境破坏。由于类似的原因，人们需要通常源自石油的化工产品的替代来源。人们还需要从可再生能源生产高质量生物燃料、燃料替代物和化工产品的有效和划算的方法。
经改造以产生具有期望链长(如具有奇数个碳的链)的脂肪酸前体分子和从其制备而来的脂肪酸衍生物的重组微生物细胞、利用这些重组微生物细胞制备包含具有期望酰基链长和期望奇数：偶数长度链比例的脂肪酸衍生物的组合物的方法，以及通过这些方法生产的组合物解决了这些需要。
发明概述
本发明提供了产生奇数链长度脂肪酸衍生物的新的重组微生物细胞，和包含此类新重组微生物细胞的细胞培养物。本发明还提供了生产包含奇数链长度脂肪酸衍生物的组合物的方法(包括培养本发明的重组微生物细胞)、通过这类方法制备的组合物和进一步审查后显而易见的其他特征。
在第一个方面，本发明提供了重组微生物细胞，其包含编码具有有效增加细胞内丙酰辅酶A的产生的酶活性的多肽的多核苷酸，所述增加是相对于缺少或具有减少量的所述酶活性的亲代微生物细胞的丙酰辅酶A的产生，其中当所述细胞在碳源存在下、于有效表达所述多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物。所述重组微生物细胞包含：(a)编码具有有效在所述重组微生物细胞中产生增加量的丙酰辅酶A的酶活性的多肽的多核苷酸，所述增加量是相对于缺少或具有减少量的所述酶活性的亲代微生物细胞产生的丙酰辅酶A的量，其中所述多肽为所述重组微生物细胞外源性的，或相比所述亲代微生物细胞中所述多核苷酸的表达，重组微生物细胞中所述多核苷酸的表达被调节；(b)编码具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶(“FabH”)活性的多肽的多核苷酸，和(c)编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸，其中当所述细胞在碳源存在下、于有效表达(a)、(b)和(c)的多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物。在一些实施方案中，根据(a)的多核苷酸中的至少一个的表达通过所述多核苷酸的过表达而被调节，如通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子。
在一些实施方案中，由第一方面的微生物细胞产生的组合物中至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的脂肪酸衍生物为奇数链脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，当在含有碳源的培养基中、于有效表达(a)、(b)和(c)的多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生至少50mg/L、至少75mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少500mg/L、至少1000mg/L、至少2000mg/L、至少5000mg/L或至少10000mg/L奇数链脂肪酸衍生物。
在一些实施方案中，根据(a)的重组微生物细胞中编码具有有效产生增加量的丙酰辅酶A的酶活性的多肽的多核苷酸选自：(i)一个或多个编码具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性或苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；(ii)一个或多个编码具有(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性或β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸；和(iii)一个或多个编码具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性、甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性或甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，所述微生物细胞包含一个或多个根据(i)的多核苷酸和一个或多个根据(ii)的多核苷酸。在一些实施方案中，所述微生物细胞包含一个或多个根据(i)和/或(ii)的多核苷酸，和一个或多个根据(iii)的多核苷酸。
在一些实施方案中，具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽为所述重组微生物细胞外源性的。在更具体的实施方案中，所述重组微生物细胞内源性的、具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的表达被减弱。
所述脂肪酸衍生物酶活性可以为内源性的(“天然的”)或外源性的。在一些实施方案中，所述脂肪酸衍生物酶活性包括硫酯酶活性，并且由所述重组微生物细胞产生的脂肪酸衍生物组合物包含奇数链脂肪酸和偶数链脂肪酸。在一些实施方案中，所述组合物中至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的脂肪酸为奇数链脂肪酸。在一些实施方案中，当在含有碳源的培养基中，于有效表达所述多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生至少50mg/L、至少75mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少500mg/L、至少1000mg/L、至少2000mg/L、至少5000mg/L或至少10000mg/L的奇数链脂肪酸。
在第一方面的一些实施方案中，所述脂肪酸衍生物酶活性包括酯合酶活性，并且由所述重组微生物产生的脂肪酸衍生物组合物包含奇数链脂肪酯和偶数链脂肪酯。在一些实施方案中，所述组合物中至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的脂肪酯为奇数链脂肪酯。在一些实施方案中，当在含有碳源的培养基中、于有效表达所述多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生至少50mg/L、至少75mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少500mg/L、至少1000mg/L、至少2000mg/L、至少5000mg/L或至少10000mg/L奇数链脂肪酯。
在第一方面的一些实施方案中，所述脂肪酸衍生物酶活性包括脂肪醛生物合成活性，并且由所述重组微生物细胞产生的脂肪酸衍生物组合物包含奇数链脂肪醛和偶数链脂肪醛。在一些实施方案中，所述组合物中至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的脂肪醛为奇数链脂肪醛。在一些实施方案中，当在含有碳源的培养基中、于有效表达所述多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生至少50mg/L、至少75mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少500mg/L、至少1000mg/L、至少2000mg/L、至少5000mg/L或至少10000mg/L奇数链脂肪醛。
在第一方面的一些实施方案中，所述脂肪酸衍生物酶活性包括脂肪醇生物合成活性，并且由所述重组微生物细胞产生的脂肪酸衍生物组合物包含奇数链脂肪醇和偶数链脂肪醇。在一些实施方案中，所述组合物中至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的脂肪醇为奇数链脂肪醇。在一些实施方案中，当在含有碳源的培养基中、于有效表达所述多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生至少50mg/L、至少75mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少500mg/L、至少1000mg/L、至少2000mg/L、至少5000mg/L或至少10000mg/L奇数链脂肪醇。
在第一方面的一些实施方案中，所述脂肪酸衍生物酶活性包括碳氢化合物生物合成活性，并且由所述重组微生物细胞产生的脂肪酸衍生物组合物为碳氢化合物组合物，如烷烃组合物、烯烃组合物、端烯烃组合物、内烯烃组合物或酮类组合物，所述碳氢化合物组合物包含奇数链碳氢化合物和偶数链碳氢化合物。在一些实施方案中，所述组合物中至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的碳氢化合物为偶数链碳氢化合物。在一些实施方案中，当在含有碳源的培养基中、于有效表达所述多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生至少50mg/L、至少75mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少500mg/L、至少1000mg/L、至少2000mg/L、至少5000mg/L或至少10000mg/L偶数链碳氢化合物。
在不同的实施方案中，所述碳源包含碳水化合物如糖，例如，单糖、二糖、寡糖或多糖。在一些实施方案中，所述碳源获自生物质如纤维素水解液。
在不同的实施方案中，所述亲代(例如宿主)微生物细胞为丝状真菌、藻类、酵母或原核生物如细菌。在各种优选的实施方案中，所述宿主细胞为细菌细胞。在更优选的实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)细胞或芽孢杆菌(Bacillus)细胞。
制备偶数链脂肪酸衍生物和奇数链脂肪酸衍生物的示例性途径分别显示在图1A和图1B中。图2和3提供了通过丙酰辅酶A引导代谢流以增加奇数链脂肪酸衍生物产生的各种方法的概述；图2显示了通过中间产物α-酮丁酸的示例性途径，而图3显示了通过中间产物甲基丙二酰辅酶A的示例性途径。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性，优选归类为EC 2.3.1.180的β-酮酯酰-ACP合酶III活性。在一实施方案中，具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽由fabH基因编码。在一实施方案中，具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的。在另一实施方案中，具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7,8、9、10、11、12、13、146、147、148或149的序列或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化丙酰辅酶A与丙二酰ACP缩合形成奇数链酰基-ACP。在另一实施方案中，具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽包含一个或多个选自SEQ ID NO:14-19的序列基元，并在体外或体内，优选在体内催化丙酰辅酶A与丙二酰ACP缩合形成奇数链酰基-ACP。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的内源性多核苷酸序列(如内源性fabH基因)，并且所述重组微生物细胞中此类内源性多核苷酸序列的表达被减弱。在一些实施方案中，所述内源性多核苷酸的表达通过在重组微生物细胞中缺失所述内源性多核苷酸的所有或部分的序列而被减弱。此类包含减弱的内源性β-酮酯酰-ACP合酶基因的重组微生物细胞优选还包含编码具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的外源性多肽的多核苷酸序列。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC2.7.2.4的天冬氨酸激酶活性的多肽的多核苷酸(图2，途径(A))。在一些实施方案中，具有天冬氨酸激酶活性的多肽由thrA、dapG或hom3基因编码。在一实施方案中，具有天冬氨酸激酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有天冬氨酸激酶活性的多肽包含选自SEQ ID NO:20、21、22、23、24的序列或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有天冬氨酸激酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化天冬氨酸盐转化为天冬氨酰磷酸。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC1.1.1.3的高丝氨酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，具有高丝氨酸脱氢酶活性的多肽由thrA、hom或hom6基因编码。在一实施方案中，具有高丝氨酸脱氢酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有高丝氨酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有高丝氨酸脱氢酶活性的多肽包含选自SEQ ID NO:20、21、25、26、27的序列或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有高丝氨酸脱氢酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化天冬氨酸半醛转化为高丝氨酸。
在具体的实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。在一实施方案中，具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，重组微生物细胞中编码具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在一实施方案中，具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性的多肽包含序列SEQ IDNO:20或其变体或片段，如SEQ ID NO:21，其在体外或体内，优选在体内催化天冬氨酸盐转化为天冬氨酰磷酸以及天冬氨酸半醛转化为高丝氨酸。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC2.7.1.39的高丝氨酸激酶活性的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，具有高丝氨酸激酶活性的多肽由thrB基因或thr1基因编码。在一实施方案中，具有高丝氨酸激酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有高丝氨酸激酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有高丝氨酸激酶活性的多肽包含选自SEQ ID NO:28、29、30、31的序列或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有高丝氨酸激酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化高丝氨酸转化为O-磷-L-高丝氨酸。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC4.2.3.1的苏氨酸合酶活性的多肽的多核苷酸。在一实施方案中，具有苏氨酸合酶活性的多肽由thrC基因编码。在一实施方案中，具有苏氨酸合酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有苏氨酸合酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有苏氨酸合酶活性的多肽包含选自SEQID NO:32、33、34的序列或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有苏氨酸合酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化O-磷-L-高丝氨酸转化为苏氨酸。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC4.3.1.19的苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽由tdcB基因或ilvA基因编码。在一实施方案中，具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞编码具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽包含选自SEQ ID NO:35、36、37、38、39的序列或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有苏氨酸脱氨酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化苏氨酸转化为2-酮丁酸。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC2.3.1.182的(R)-柠苹酸合酶活性的多肽的多核苷酸(图2，途径(B))。在一实施方案中，具有(R)-柠苹酸合酶活性的多肽由cimA基因编码。在一实施方案中，具有(R)-柠苹酸合酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有(R)-柠苹酸合酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有(R)-柠苹酸合酶活性的多肽包含选自SEQ ID NO:40、41、42、43的序列或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有(R)-柠苹酸合酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化乙酰辅酶A和丙酮酸酯反应为(R)-柠苹酸。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC4.2.1.33的异丙基苹果酸异构酶活性的多肽的多核苷酸。在一实施方案中，具有异丙基苹果酸异构酶活性的多肽包含由leuCD基因编码的大亚基和小亚基。在一实施方案中，具有异丙基苹果酸异构酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有异丙基苹果酸异构酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有异丙基苹果酸异构酶活性的多肽包含大亚基和小亚基。在其它实施方案中，具有异丙基苹果酸异构酶活性的多肽包含选自SEQ ID NO:44和46的大亚基序列和选自SEQ ID NO:45和47的小亚基序列，或以上的变体或片段，所述序列或其变体或片段具有异丙基苹果酸异构酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化(R)-柠苹酸转化为衣康酸酯以及衣康酸酯转化为β-甲基-D-苹果酸酯。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC1.1.1.85的β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，具有β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽由leuB基因或leu2基因编码。在一实施方案中，具有β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽包含选自SEQ ID NO:48、49、50的序列或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有β-异丙基苹果酸脱氢酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化β-甲基-D-苹果酸酯转化为2-酮丁酸。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC5.4.99.2的甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的多肽的多核苷酸(图3)。在一些实施方案中，具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的多肽由scpA(也称为sbm)基因编码。在一实施方案中，具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的多肽包含选自SEQ ID NO:51、52、53、54、55、56、57、58的序列或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化琥珀酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC4.1.1.41的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，具有甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的多肽由scpB(也称为ygfG)基因编码。在一实施方案中，具有甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的多肽包含选自SEQ IDNO:59、60、61的序列或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化甲基丙二酰辅酶A转化为丙酰辅酶A。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC2.1.3.1的甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性的多肽的多核苷酸。在一实施方案中，具有甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过可操作地将所述多核苷酸连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性的多肽包含序列SEQ ID NO:62或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化甲基丙二酰辅酶A转化为丙酰辅酶A。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有归类为EC5.1.99.1的甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性的多肽的多核苷酸。在一实施方案中，具有甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性的多肽包含序列SEQ ID NO:63或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化(R)-甲基丙二酰辅酶A转化为(S)-甲基丙二酰辅酶A。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有丙酰辅酶A∷琥珀酰辅酶A转移酶活性的多肽的内源性多核苷酸序列(如内源性scpC基因(也称为ygfH))，并且所述重组微生物细胞中所述内源性多核苷酸的表达被减弱。在一些实施方案中，所述内源性多核苷酸的表达通过所述重组微生物细胞中所述内源性多核苷酸序列的所有或部分缺失而被减弱。
在一实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有酰基辅酶A脱氢酶活性的多肽的内源性多核苷酸序列(如内源性fadE基因)，并且所述重组微生物细胞中所述内源性多核苷酸的表达可能或可能未被减弱。
在其它实施方案中，根据第一方面的重组微生物细胞包含编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸，其中当在碳源存在下培养时，所述重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物。
在不同的实施方案中，所述脂肪酸衍生物酶活性包括硫酯酶活性、酯合酶活性、脂肪醛生物合成活性、脂肪醇生物合成活性、酮生物合成活性和/或碳氢化合物生物合成活性。在一些实施方案中，所述重组微生物细胞包含编码两种或多种多肽的多核苷酸，每种多肽都具有脂肪酸衍生物酶活性。在更具体的实施方案中，所述重组微生物细胞表达或过表达选自以下的一种或多种具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽：(1)具有硫酯酶活性的多肽；(2)具有脱羧酶活性的多肽；(3)具有羧酸还原酶活性的多肽；(4)具有醇脱氢酶活性(EC1.1.1.1)的多肽；(5)具有醛脱羰酶活性(EC 4.1.99.5)的多肽；(6)具有酰基辅酶A还原酶活性(EC 1.2.1.50)的多肽；(7)具有酰基-ACP还原酶活性的多肽；(8)具有酯合酶活性(EC3.1.1.67)的多肽；(9)具有OleA活性的多肽；或(10)具有OleCD或OleBCD活性的多肽；其中所述重组微生物细胞产生组合物，其包含奇数链脂肪酸、奇数链脂肪酯、奇数链蜡酯、奇数链脂肪醛、奇数链脂肪醇、偶数链烷烃、偶数链烯烃、偶数链内烯烃、偶数链端烯烃或偶数链酮类。
在一实施方案中，所述脂肪酸衍生物酶活性包含硫酯酶活性，其中当在碳源存在下培养时，包含所述重组微生物细胞的培养物产生包含奇数链脂肪酸的脂肪酸组合物。在一些实施方案中，所述多肽具有归类为EC 3.1.1.5、EC 3.1.2.-或EC 3.1.2.14的硫酯酶活性。在一些实施方案中，具有硫酯酶活性的多肽由tesA、tesB、fatA或fatB基因编码。在一些实施方案中，具有硫酯酶活性的多肽为所述亲代微生物细胞内源性的，或为所述亲代微生物细胞外源性的。在另一实施方案中，所述重组微生物细胞中编码具有硫酯酶活性的多肽的多核苷酸的表达被调节。在一些情形下，所述多核苷酸的表达通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子而被调节，使得所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中过表达。在另一实施方案中，具有硫酯酶活性的多肽包含选自SEQ ID NO:64、65、66、67、68、69、70、71和72的序列或其变体或片段，所述序列或其变体或片段具有硫酯酶活性，并在体外或体内，优选在体内催化奇数链酰基-ACP水解为奇数链脂肪酸，或催化奇数链酰基-ACP醇解为奇数链脂肪酯。在一些实施方案中，当在碳源存在下培养时，根据第一方面的包含编码具有硫酯酶活性的多肽的多核苷酸的重组微生物细胞在含有碳源的培养基中、于有效表达所述多核苷酸的条件下培养时，产生至少50mg/L、至少75mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少500mg/L、至少1000mg/L或至少2000mg/L奇数链脂肪酸。在一些实施方案中，根据第一方面的包含编码具有硫酯酶活性的多肽的多核苷酸的重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪酸和偶数链脂肪酸的脂肪酸组合物。在一些实施方案中，所述组合物中至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的脂肪酸为奇数链脂肪酸。
本发明包括包含根据第一方面的重组微生物细胞的细胞培养物。
在第二方面，本发明包括在重组微生物细胞中制备奇数链脂肪酸衍生物(或包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物)的方法，所述方法包括在所述细胞中表达具有有效增加细胞内丙酰辅酶A的产生的酶活性的重组多肽，以及在碳源存在下、于有效表达所述重组多肽并产生奇数链脂肪酸衍生物的条件下培养所述细胞。
在一实施方案中，所述制备包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物的方法包括获得根据第一方面的重组微生物细胞、在含有碳源的培养基中、于有效表达根据(a)、(b)和(c)的多核苷酸并产生包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物的条件下培养所述细胞，以及任选地从培养基回收所述组合物。
在一些实施方案中，通过根据第二方面的方法制备的脂肪酸衍生物组合物包含奇数链脂肪酸衍生物和偶数链脂肪酸衍生物，其中所述组合物中至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％重量的脂肪酸衍生物为奇数链脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，所述脂肪酸衍生物组合物包含的奇数链脂肪酸衍生物的量(例如，滴度)为至少50mg/L、至少75mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少500mg/L、至少1000mg/L、至少2000mg/L、至少5000mg/L、至少10000mg/L或至少20000mg/L。
在第二方面的各种方法中，所述脂肪酸衍生物酶活性包括硫酯酶活性、酯合酶活性、脂肪醛生物合成活性、脂肪醇生物合成活性、酮生物合成活性和/或碳氢化合物生物合成活性。在一些实施方案中，所述重组微生物细胞包含编码两种或更多种多肽的多核苷酸，每种多肽都具有脂肪酸衍生物酶活性。在更具体的实施方案中，所述重组微生物细胞表达或过表达选自以下的一种或多种具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽：(1)具有硫酯酶活性的多肽；(2)具有脱羧酶活性的多肽；(3)具有羧酸还原酶活性的多肽；(4)具有醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)的多肽；(5)具有醛脱羰酶活性(EC 4.1.99.5)的多肽；(6)具有酰基辅酶A还原酶活性(EC 1.2.1.50)的多肽；(7)具有酰基-ACP还原酶活性的多肽；(8)具有酯合酶活性(EC 3.1.1.67)的多肽；(9)具有OleA活性的多肽；或(10)具有OleCD或OleBCD活性的多肽；其中所述重组微生物细胞产生组合物，其包含一种或多种奇数链脂肪酸、奇数链脂肪酯、奇数链蜡酯、奇数链脂肪醛、奇数链脂肪醇、偶数链烷烃、偶数链烯烃、偶数链内烯烃、偶数链端烯烃和偶数链酮类。
本发明包括包含通过根据第二方面方法制备的奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物。
在第三个方面，本发明包括制备重组微生物细胞的方法，所述重组微生物细胞相比亲代微生物细胞产生更高滴度或更高比例的奇数链脂肪酸衍生物，所述方法包括获得包含编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸的亲代微生物细胞，以及改造所述亲代微生物细胞以获得重组微生物细胞，其相比所述亲代微生物细胞在相同的条件下培养时产生的丙酰辅酶A的量，产生或更产生更大量的丙酰辅酶A，其中当在碳源存在、于有效在所述重组微生物细胞中产生丙酰辅酶A和脂肪酸衍生物的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生更高滴度或更高比例的奇数链脂肪酸衍生物，所述更高滴度或更高比例是相对于在相同的条件下培养的亲代微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物的滴度和比例。
在第四个方面，本发明包括增加微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物的滴度或比例的方法，所述方法包括获得能产生脂肪酸衍生物的亲代微生物细胞，以及改造所述亲代微生物细胞以获得产生或能产生更大量的丙酰辅酶A重组微生物细胞，所述更大量是相对于亲代微生物细胞在相同的条件下培养时产生的丙酰辅酶A的量，，其中当在碳源存在下、于有效在所述重组微生物细胞中产生丙酰辅酶A和脂肪酸衍生物的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生更高滴度或更高比例的奇数链脂肪酸衍生物，所述更高滴度或更高比例是相对于在相同的条件下培养的亲代微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物的滴度和比例。
在根据第三或第四方面的一些实施方案中，改造亲代微生物细胞的步骤包括改造所述细胞以表达编码选自以下的多肽的多核苷酸：(a)具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性和苏氨酸脱氨酶活性的一种或多种多肽；(b)具有(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的一种或多种多肽；和(c)具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性、甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性和甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性的一种或多种多肽；其中根据(a)、(b)或(c)的至少一种多肽为所述亲代微生物细胞外源性的，或其中相比所述亲代微生物细胞中所述多核苷酸的表达，所述重组微生物细胞中根据(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸的表达被调节。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸的表达通过所述多核苷酸的过表达而被调节，如通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子。在一些实施方案中，所述改造的细胞表达根据(a)的一种或多种多肽和根据(b)的一种或多种多肽。
在根据第三或第四方面的一些实施方案中，所述亲代微生物细胞包含编码具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，所述重组微生物细胞经改造以表达编码具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的外源性多核苷酸或过表达其内源性多核苷酸。在一些实施方案中，所述重组微生物细胞经改造以表达编码具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的外源性多核苷酸，并且编码具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的内源性多核苷酸的表达被减弱。在一些实施方案中，编码具有β-酮酯酰-ACP合酶的多肽的多核苷酸为内源性多核苷酸的修饰、突变或变体形式，其相对于未修饰的内源性多核苷酸，经挑选用于增加的亲和力或对丙酰辅酶A作为底物的活性。多种产生修饰、突变或变体多核苷酸的方法为本领域熟知，其实例在下文有描述。
结合附图阅读以下详细描述时，本发明的这些和其他目的和特征将得以更加充分地显现。
附图的简要说明
图1A和1B比较了添加不同的酰基辅酶A“引发物”分子时脂肪酸生物合成途径的示例性中间物和产物：图1A显示了利用2碳引发物乙酰辅酶A的反应途径，其产生偶数链长度的β-酮酯酰-ACP中间产物——乙酰乙酰基-ACP，产生从其产生的偶数链(ec)-酰基-ACP中间产物和偶数链脂肪酸衍生物；而图1B显示了利用3碳引发物丙酰辅酶A的反应途径，其产生奇数链长度的β-酮酯酰-ACP中间产物——3-异戊酰-ACP，产生从其产生的奇数链(oc)-酰基-ACP中间产物和奇数链脂肪酸衍生物。
图2描绘了通过本文所述的苏氨酸生物合成途径(途径(A))和柠苹酸生物合成途径(途径(B))，用于增加经由中间产物α-酮丁酸酯的丙酰辅酶A生产的示例性途径。
图3描绘了通过本文所述的甲基丙二酰辅酶A生物合成途径(途径(C))，用于增加丙酰辅酶A生产的示例性途径。
发明的详细描述
本发明并不限制于本文描述的具体组合物和方法，因为，这些当然可以改变。还应当理解，本文使用的术语仅为描述具体实施方案的目的，并非意图限制本发明的范围。
登录号：本说明书通篇当中的序列登录号获自美国国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)维护的NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)提供的数据库(在本文称为“NCBI登录号”或者可选择地称为“GenBank登录号”)，以及瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)提供的UniProtKnowledgebase(UniProtKB)和Swiss-Prot数据库(在本文称为“UniProtKB登录号”)。除非明确指出并非如此，NCBI/GenBank登录号指定的序列是版本编号1(即序列的版本编号为“登录号.1”)。本文提供的NCBI和UniProtKB登录号截止至2011年8月2日。
酶分类(EC)号：EC编号由国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology(IUBMB))制定，其相关描述可在互联网的IUBMB命名网站获取。EC编号根据所催化的反应对酶进行分类。本文引用的EC编号来自由东京大学部分资助的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics)所维护的KEGG配体数据库。除非另作说明，EC编号按照截止到2011年8月2日的KEGG数据库中提供的。
除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员通常理解的具有相同的意义。尽管与本文所述的那些材料和方法相似或等同的材料和方法可以用于本发明的实践或测试，目前描述了优选的组合物和材料。
定义
如本文使用，术语“脂肪酸”表示具有通式R-(C＝O)-OH的羧酸，其中R表示长度可以为约4至约36个碳原子，长度更通常为约4至约22个碳原子的碳链。脂肪酸可以是饱和的或不饱和的。如果是不饱和的，R可以具有一个或多个不饱和点，即R可以是单不饱和的或多不饱和的。R可以是直链(在本文中也称为“线性链”)或支链。术语“脂肪酸”可以在本文中用于指可以包括一种或多种不同的“脂肪酸衍生物”脂肪酸衍生物的“脂肪酸衍生物”，或者脂肪酸衍生物的混合物。
本文所用的“奇数链脂肪酸”(缩写为“oc-FA”)是指具有含奇数个碳原子(包括羰基碳)的线性碳链的脂肪酸分子。oc-FA的非限制性实例包括十三烷酸(C13:0)、十五烷酸(C15:0)和十七烷酸(C17:0)，它们都是饱和的oc-FA，以及十七碳烯酸(C17:1)，其是不饱和的(即单不饱和的)oc-FA。
本文所用的术语“β-酮酯酰-ACP”是指酰基辅酶A引发物分子与丙二酰ACP由图1A和1B所示途径的部分(D)所表示的具有β酮酯酰-ACP合酶活性的酶(例如EC 2.3.1.180)催化的缩合产物。酰基辅酶A引发物分子可以具有含偶数个碳原子的酰基基团，例如图1A中所示的乙酰辅酶A，在这种情况下，产生的β-酮酯酰-ACP中间产物是乙酰乙酰-ACP，其为偶数链(ec-)β-酮酯酰-ACP。酰基辅酶A引发物分子可以具有含奇数个碳原子的酰基基团，例如图1B中所示的丙酰辅酶A，在这种情况下，产生的β-酮酯酰-ACP中间产物是3-氧代戊酰-ACP，其为奇数链(oc-)β-酮酯酰-ACP。β-酮酯酰-ACP中间产物进入由图1A和1B的部分(E)所示的脂肪酸合酶(FAS)循环，其中其进行延长循环(即，酮还原、脱水、和烯酰还原)，添加两个碳单元至酰基链，随后进入其他的延长循环，每一个循环涉及与另一丙二酰ACP分子的缩合、酮还原和烯酰还原，使得酰基-ACP的酰基链以每个延长循环延长两个碳单元。
“酰基-ACP”通常是指FAS催化β-酮酯酰-ACP中间产物延长的一轮或多轮产物。酰基-ACP是烷基链的羰基碳和酰基载体蛋白(ACP)的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基部分的巯基基团之间形成的酰基硫酯，在线性碳链的情况下，通常具有式CH3-(CH2)n-C(＝O)-s-ACP，其中n可以是偶数(例如，“偶数链酰基-ACP”或“ec-酰基-ACP”，其例如在乙酰辅酶A是引发物分子时产生，参见图1A)或奇数(例如，“奇数链酰基-ACP”或“oc-酰基-ACP”，其例如在丙酰辅酶A是引发物分子时产生，参见图1B)。
除非指出并非如此，“脂肪酸衍生物”(缩写为“FA衍生物”)意图包括至少部分由重组微生物细胞的脂肪酸生物合成途径产生的任何产物。脂肪酸衍生物还包括至少部分由脂肪酸途径中间产物如酰基-ACP中间产物产生的任何产物。本文所述的脂肪酸生物合成途径可以包括经改造以产生脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物酶，并且在一些情况下，可以表达其它酶以产生具有期望的碳链特征的脂肪酸衍生物，诸如例如，具有期望碳原子数的碳链的脂肪酸衍生物的组合物，或具有期望衍生物(含有奇数碳链)比例的脂肪酸衍生物的组合物等。脂肪酸衍生物包括但不限于，脂肪酸、脂肪醛、脂肪醇、脂肪酯(诸如蜡)、碳氢化合物(诸如烷烃和烯烃(包括端烯烃和内烯烃))以及酮。
术语“奇数链脂肪酸衍生物”(缩写为“oc-FA衍生物”)是指上文定义的oc-酰基-ACP与一种或多种脂肪酸衍生物酶的反应产物。产生的脂肪酸衍生物产物同样具有线性碳链，其含有奇数个碳原子，除非脂肪酸衍生物本身是oc-FA衍生物或oc-酰基-ACP的脱羰产物或脱羧产物，在这种情况下，产生的oc-FA衍生物具有偶数个碳原子；例如，当脂肪酸衍生物是oc-脂肪醛脱羰产生的ec-烷烃或ec-烯烃、oc-脂肪酸脱羧产生的ec-端烯烃、oc-酰基-ACP脱羧产生的ec-酮或ec-内烯烃时等等。应当理解，oc-FA衍生物或oc-酰基-ACP前体分子的此类偶数链长产物，尽管具有含偶数碳原子的线性链，仍然被认为落入“oc-FA衍生物”的定义中。
“内源”多肽是指由亲代微生物细胞(也称为“宿主细胞”)的基因组编码的多肽，从该亲代微生物细胞改造出(或“产生”)重组细胞。
“外源”多肽是指并非由亲代微生物细胞的基因组编码的多肽。变异的(即突变的)多肽是外源多肽的实例。
在本发明的实施方案中，其中多核苷酸序列编码内源多肽，在一些情况下，所述内源多肽过表达。如本文使用的，“过表达”意指在相同的条件下，细胞中以高于对应的亲代细胞(例如，野生型细胞)正常产生的浓度产生多肽或导致多核苷酸产生多肽。当在相同的条件下，与相同物种的非重组微生物细胞(例如，亲代微生物细胞)中的多核苷酸或多肽浓度相比，所述多核苷酸或多肽以更高的浓度存在于重组微生物细胞中，则该多核苷酸或多肽在所述重组微生物细胞中是“过表达的”。过表达可以通过本领域已知的任何合适的方式来实现。
在一些实施方案中，重组微生物细胞中内源多肽的过表达可以通过使用外源调节元件来实现。术语“外源调节元件”通常指源自宿主细胞外的调节元件(诸如，表达控制序列或化合物)。然而，在某些实施方案中，术语“外源调节元件”(例如“外源启动子”)可以指源自宿主细胞的调节元件，为了控制重组细胞中内源多肽的表达的目的，所述调节元件的功能被重复或侵占。例如，如果宿主细胞是大肠杆菌细胞，多肽是内源多肽，则重组细胞中内源多肽的表达可以由来自另一大肠杆菌基因的启动子控制。在一些实施方案中，导致内源多肽表达和/或活性水平升高的外源调节元件是化合物例如小分子。
在一些实施方案中，控制编码内源多肽的多核苷酸(例如，内源多核苷酸)的表达的外源调节元件是通过重组整合入宿主细胞基因组中的与所述内源多肽可操作连接的表达控制序列。在某些实施方案中，利用本领域已知的方法，通过同源重组将表达控制序列整合入宿主细胞染色体(例如，Datsenko et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97(12):6640-6645(2000))。
表达控制序列是本领域内已知的，并且包括，例如，提供多核苷酸序列在宿主细胞中表达的启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等。表达控制元件与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用(Maniatis et al,Science 236:1237,(1987))。示例性的表达控制序列描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中。
在本发明的方法中，表达控制序列与多核苷酸序列可操作地连接。“可操作地连接”表示多核苷酸序列和表达控制序列以这样的方式连接：当合适的分子(例如转录激活蛋白)与所述表达控制序列结合时，允许基因表达。可操作连接的启动子就转录和翻译的方向而言位于所选的多核苷酸序列的上游。可操作连接的增强子可以位于所选多核苷酸的上游、之内或下游。其它核酸序列，例如编码选择标记、纯化部分、靶向蛋白等的核酸序列，可以可操作地连接至所述多核苷酸序列，使得所述其它核酸序列与所述多核苷酸序列一起表达。
在一些实施方案中，通过重组载体的方式将多核苷酸序列提供给重组细胞，所述重组载体包含可操作连接至所述多核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，所述启动子是发育调节型、细胞器特异性、组织特异性、诱导型、组成型或细胞特异性启动子。
如本文所用，“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸(即多核苷酸序列)的核酸分子。一类有用的载体是附加体(即能够染色体外的复制的核酸)。有用的载体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些载体。能够指导与其可操作连接的基因的表达的载体在本文被称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中使用的表达载体经常是“质粒”的形式，所述“质粒”通常是指在其载体形式时不与染色体结合的环状双链DNA环。因为质粒是最通常使用的载体形式，所以术语“质粒”和“载体”是交换使用的。但是，还包括发挥等同功能并随后至今成为本领域已知的表达载体的这些其他形式。
在一些实施方案中，重组载体包含至少一个选自以下的序列：(a)可操作地连接至多核苷酸序列的表达控制序列；(b)可操作地连接至多核苷酸序列的选择标记；(c)可操作地连接至核苷酸序列的标记序列；(d)可操作地连接至多核苷酸序列的纯化部分；(e)可操作地连接至多核苷酸序列的分泌序列；和(f)可操作地连接至多核苷酸序列的引导序列(targeting sequence)。
本文所述的表达载体包括本文所述的其形式适合于在宿主细胞中表达多核苷酸序列的多核苷酸序列。本领域技术人员应当理解到，表达载体的设计可以取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需多肽的表达水平等因素。可以将本文所述的表达载体引入宿主细胞，以产生本文所述的多核酸序列所编码的多肽，包括融合多肽。
经常用含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体在例如大肠杆菌的原核生物中进行编码多肽的基因的表达。融合载体将许多氨基酸添加到其中编码的多肽，通常添加到重组多肽的氨基末端或羧基末端。这些融合载体通常担任以下3个用途中的一个或多个：(1)增加重组多肽的表达；(2)增加重组多肽的可溶性；和(3)通过作为亲和纯化中的配体，帮助重组多肽的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解切割位点。这使得在融合多肽纯化后，重组多肽能够从融合部分分离。这些酶及其同源识别序列的实例包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。示例性的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech,Inc.,Piscataway,NJ；Smith et al.,Gene,67:31-40(1988))、pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)和pRITS(Pharmacia Biotech,Inc.,Piscataway,N.J.)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到靶重组多肽。
通过常规转化或转染技术可以将载体引入原核或真核细胞。如本文所用，术语“转化”和“转染”是指许多本领域公认的用于将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可以见于例如Sambrook et al.(同上)。
对于细菌细胞的稳定转化，已知的是，根据所用的表达载体和转化技术，仅小部分的细胞会摄入并复制表达载体。为了鉴定和选择这些转化子，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。选择标记包括赋予药物抗性的那些标记，所述药物例如，但不限于氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素。编码选择标记的核酸可以与编码本文所述的多肽在同一载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。可以通过在存在合适选择药物的情况下的生长，鉴定稳定转化了所引入的核酸的宿主细胞，从而产生重组细胞。
类似地，对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知的是，根据使用的表达载体和转染技术，仅小部分的细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。优选的选择标记包括赋予药物抗性的那些标记，所述药物诸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。编码选择标记的核酸可以与编码本文所述的多肽在同一载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。可以通过在存在合适选择药物的情况下的生长，鉴定稳定转染了所引入的核酸的宿主细胞，从而产生重组细胞。
本文所用的“基因敲除”是指修饰或失活编码靶蛋白的基因以降低或消除该完整蛋白的功能的方法。基因的失活可以通过常规方法进行，例如，通过UV照射或用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍处理的诱变，定点诱变、同源重组、插入-缺失诱变、或“Red-drivenintegration”(Datsenko et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-45,2000)。例如，在一实施方案中，将构建体引入亲代细胞从而可能在得到的重组细胞中选择同源重组事件。本领域技术人员会容易地设计包含阳性或阴性选择基因的敲除构建体，所述选择基因有效地选择经历了与构建体的同源重组事件的转染细胞。例如，亲代细胞中的改变可以通过用包含改变的DNA序列置换野生型(即内源的)DNA序列获得，所述置换通过单或双交叉重组。为了方便地选择转化子(即重组细胞)，例如，所述改变可以是编码抗生素抗性标记的DNA序列或与宿主细胞的可能的营养缺陷型互补的基因。突变包括但不限于，缺失-插入突变。重组细胞中这类改变的实例包括基因中断，即基因干扰使得从该基因正常产生的产物没有以功能形式产生。这可以是由于完全缺失、选择标记的缺失或插入、选择标记的插入、移码突变、框内缺失或导致提前终止的点突变。在一些实例中，基因的整个mRNA均不存在。在其他情况下，产生的mRNA的量发生变化。
短语“增加内源多肽的表达水平”意指引起编码内源多肽的多核苷酸序列的过表达，或引起内源多肽序列的过表达。过表达的程度可以是约1.5倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约5倍或更多、约10倍或更多、约20倍或更多、约50倍或更多、约100倍或更多或其中的任何范围。
短语“增加内源多肽的活性水平”意指增强内源多肽的生物化学功能或生物功能(例如，酶促活性)。增强活性的程度可以是约10％或更多、约20％或更多、约50％或更多、约75％或更多、约100％或更多、约200％或更多、约500％或更多、约1000％或更多或其中的任何范围。
本文所用的短语“相对于野生型多核苷酸序列，所述多核苷酸序列的表达被修饰”意指内源多核苷酸序列的表达和/或活性水平升高或降低。在一些实施方案中，控制内源多核苷酸表达的外源调节元件是通过重组整合入宿主细胞基因组中的与所述内源多肽可操作连接的表达控制序列。在某些实施方案中，利用本领域已知的方法，通过同源重组将表达控制序列整合入宿主细胞染色体中。
本文所使用的短语“在有效表达所述多核苷酸序列的条件下”表示允许重组细胞产生所需的脂肪酸衍生物的任何条件。合适的条件包括，例如发酵条件。发酵条件可以包含很多参数，例如温度范围、通气水平和培养基组分。这些条件中每一个单独地以及联合地允许宿主细胞生长。示例性培养基包括培养液或凝胶。通常，培养基包括可以直接被重组细胞代谢的碳源。发酵意味着生产宿主例如本发明的重组微生物细胞对碳源的利用。发酵可以是需氧的、厌氧的或其变型(例如，微需氧的)。如本领域技术人员所理解的，重组微生物细胞能够将碳源处理成oc-酰基-ACP或期望的oc-FA衍生物(例如，oc-脂肪酸、oc-脂肪酯、oc-脂肪醛、oc-脂肪醇、ec-烷烃、ec-烯烃或ec-酮)的条件将在一定程度上随特定的微生物而不同。在一些实施方案中，处理发生在需氧环境中。在一些实施方案中，处理发生在厌氧环境中。在一些实施方案中，处理发生在微需氧环境中。
本文所用的术语“碳源”是指适于用作原核细胞或简单真核细胞生长的碳源的底物或化合物。碳源可以处于不同形式，包括但不限于聚合物、碳水化合物(例如，糖、诸如单糖、二糖、寡糖和多糖)、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽和气体(例如CO和CO2)。示例性的碳源包括但不限于，单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和松二糖；寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如淀粉、纤维素、果胶和木聚糖；纤维素原料及其变体，例如半纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；饱和或不饱和脂肪酸酸，例如琥珀酸酯(盐)、乳酸酯(盐)和醋酸酯(盐)；醇，例如乙醇、甲醇或丙三醇或其混合物。碳源可以是光合作用的产物，例如葡萄糖。在某些优选的实施方案中，碳源来源于生物质。在另一优选的实施方案中，碳源包含蔗糖。在另一优选的实施方案中，碳源包含葡萄糖。
本文所用的术语“生物质”是指碳源所来源的任何生物材料。在一些实施方案中，将生物质处理成适用于生物转化的碳源。在其他实施方案中，生物质不需要进一步处理成碳源。碳源可以转化成生物燃料。生物质的一个示例性来源是植物物质或植被。例如，玉米、甘蔗或柳枝稷。生物质的另一示例性来源是代谢废物，例如动物物质(例如牛粪)。生物质的其他示例性来源包括藻类或其他海洋植物。生物质还包括来自工业、农业、林业和家庭的废品，包括但不限于发酵废渣、青贮饲料、秸秆、无用杂物、污水、垃圾、纤维质城市废物和剩余食物。术语“生物质”还可以指例如碳水化合物(例如单糖、二糖或多糖)的碳源。
为确定条件是否足以允许多肽产物生产或表达，可以培养重组微生物细胞，例如约4、8、12、24、36、48、72小时或更久。在培养过程中和/或之后，获取并分析样品以确定条件是否允许生产或表达。例如，样品中或重组微生物细胞生长的培养基中的重组微生物细胞可以被测试是否存在需要的产物。当测试是否存在期望的产物，例如奇数链脂肪酸衍生物(例如，oc-脂肪酸、oc-脂肪酯、oc-脂肪醛、oc-脂肪醇或ec-碳氢化合物)时，可以使用这样的测定：包括但不限于，气相色谱法(GC)、质谱法(MS)、薄层色谱法(TLC)、高压液相色谱法(HPLC)、液相色谱法(LC)、与火焰电离检测器耦合的GC(GC-FID)、GC-MS和LC-MS。当测试多肽的表达时，可以使用例如但不限于Western印迹和点印迹的技术。
本文所用的术语“微生物”表示来自古菌域、细菌域和真核域的原核和真核微生物种类，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生生物。术语“微生物(microbe)”和“微生物细胞”(即，来自微生物的细胞)与“微生物(微生物)”是可交换使用的并且表示仅借助于显微镜可见的细胞或小有机体。
在一些实施方案中，宿主细胞(例如亲代细胞)是微生物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是选自以下的属的微生物细胞：埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、泛菌属(Pantoea)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、链孢霉属(Neurospora)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、根毛霉属(Rhizomucor)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、毛霉菌属(Mucor)、蚀丝霉属(Myceliophtora)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)、金黄孢子菌属(Chrysosporium)、酵母属(Saccharomyces)、寡养单胞菌属(Stenotrophamonas)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、小球藻属(Chlorella)或原壁菌属(Prototheca)。
在其他的实施方案中，宿主细胞为迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)细胞、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)细胞、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)细胞、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)细胞、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)细胞、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)细胞、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)细胞、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)细胞、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞或解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)细胞。
在其他的实施方案中，宿主细胞为康氏木霉(Trichoderma koningii)细胞、绿色木霉(Trichoderma viride)细胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)细胞、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)细胞、烟曲霉(Aspergillus fumigates)细胞、臭曲霉(Aspergillus foetidus)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞、特异腐质霉(Humicola insolens)细胞、棉毛状腐质霉(Humicolalanuginose)细胞、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)细胞、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)细胞或米黑毛酶(Mucor michei)细胞。
在其他实施方案中，宿主细胞是浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)细胞。
在其他实施方案中，宿主细胞是放线菌(Actinomycetes)细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
在其他实施方案中，宿主细胞是CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cvl细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞是来自真核植物、藻类、蓝藻(cyanolacterium)、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌、嗜极生物、酵母、真菌、其改造的有机体或合成的有机体的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为光依赖性或固定碳。在一些实施方案中，宿主细胞具有自养活性。在一些实施方案中，宿主细胞具有光合自养活性，例如在存在光的情况下。在一些实施方案中，在缺乏光时，宿主细胞是异养的或兼养的。
在某些实施方案中，宿主细胞是来自以下的细胞：拟南芥(Avabidopsisthaliana)、柳枝稷(Panicum virgatum)、巨芒(Miscanthus giganteus)、玉米(Zea mays)、葡萄藻(Botryococcuse braunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、杜氏盐藻(Dunaliela salina)、聚球蓝细菌(Synechococcus Sp.)PCC 7002、聚球蓝细菌PCC 7940、聚球蓝细菌PCC 6803、长嗜热聚球蓝细菌(Thermosynechococcus elongates)BP-1、绿硫菌(Chlorobium tepidum)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、酒色着色菌(Chromatiumm vinosum)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palusris)、将达梭菌(Clostridium ljungdahlii)、热纤梭菌(Clostridiuthermocellum)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、柠檬泛菌(Pantoea citrea)或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。在某些实施方案中，宿主细胞是来自以下的细胞：Chlorella fusca、原始小球藻(Chlorella protothecoides)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、Chlorella kessleri、Chlorella vulgaris、海水小球藻(Chlorella saccharophila)、Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)、Prototheca stagnora、波多黎各原壁菌(Prototheca portoricensis)、Prototheca moriformis、魏氏原壁菌(Prototheca wickerhamii)或左氏原壁菌(Prototheca zopfii)。
在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
在某些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，大肠杆菌细胞是B品系、C品系、K品系或W品系大肠杆菌细胞。
在本发明的某些实施方案中，宿主细胞经改造以表达(或过表达)转运蛋白。转运蛋白能够将多肽或有机化合物(例如，脂肪酸或其衍生物)输出至宿主细胞外。
本文使用的术语“在代谢上改造的”或“代谢改造”涉及合理的途径设计和用于在重组细胞如本文所述的重组微生物细胞中产生期望的代谢物，诸如例如oc-β-酮酯酰-ACP、oc-酰基-ACP或oc-脂肪酸衍生物的，对应于生物合成基因的多核苷酸、与操纵子相关的基因和此类多核苷酸的控制元件的组装。“代谢改造”还可以包括利用遗传改造和合适的培养条件(包括与产生期望途径的中间产物竞争的竞争代谢途径的减少、中断或敲除)，通过调节和优化转录、翻译、蛋白稳定性和蛋白功能性而优化代谢通量。“生物合成基因”可以是宿主细胞内源的(天然的)(即，未从宿主细胞修饰的基因)，或者由于对于宿主细胞是外来的或通过诱变、重组、和/或在重组细胞中与外源(异源)表达控制序列结合进行修饰，而可以是宿主细胞外源的(异源的)。生物合成基因编码“生物合成多肽”或“生物合成酶”。
术语“生物合成途径”也被称为“代谢途径”，是指由生物合成酶催化的一组生化反应，其将一种化学物质转化成另一种。本文使用的术语“脂肪酸生物合成途径”(或更简单地，“脂肪酸途径”)是指产生脂肪酸衍生物(例如，脂肪酸、脂肪酯、脂肪醛、脂肪醇、烷烃、烯烃、酮等)的一组生化反应。脂肪酸途径包括脂肪酸途径生物合成酶(即，“脂肪酸途径酶”)，其如本文所述可以被改造以产生脂肪酸衍生物，并且在一些实施方案中，其可以与其它酶一起表达以产生具有期望的碳链特征的脂肪酸衍生物。例如，本文所述的“奇数链脂肪酸生物合成途径”(即“oc-FA途径”)包括足以产生oc-脂肪酸衍生物的酶。
术语“重组微生物细胞”是指通过在选择的“亲代微生物细胞”(即宿主细胞)中引入遗传物质，从而修饰或改变所述亲代微生物细胞的细胞生理学和生物化学的遗传上修饰的(即“改造的”)的微生物细胞(即微生物)。通过引入遗传物质，重组微生物细胞获得与亲代微生物细胞相比新的或改善的特性，诸如例如，产生新的细胞内代谢物或更大量的现有细胞内代谢物的能力。本文提供的重组微生物细胞表达多种生物合成酶(例如，脂肪酸途径酶，例如oc-FA途径酶)，所述生物合成酶参与从适当的碳源产生例如oc-酰基-ACP中间产物或oc-脂肪酸衍生物的途径。引入亲代微生物细胞的遗传物质可以含有，编码参与产生oc-脂肪酸衍生物的生物合成途径(即生物合成酶)的一种或多种酶的基因或基因的一部分，以及任选地或另外可以包括表达或和/或调节表达编码此类生物合成酶的基因的其它元件，例如启动子序列。因此，本文所述的重组微生物细胞已经被遗传改造以表达或过表达参与本文所述的oc-脂肪酸(oc-FA)生物合成途径的生物合成酶。
应当理解，“重组微生物细胞”和“重组微生物”不仅指具体的重组微生物细胞/微生物，还指此类细胞的后代或可能的后代。
重组微生物细胞可选择地或除了包含引人亲代微生物细胞中的遗传物质之外，还可以包括基因或多核苷酸的减少、断裂、缺失或“敲除”以改变所述亲代微生物细胞的细胞生理学和生物化学。通过基因或多核苷酸的减少、断裂、缺失或“敲除”(也被称为基因或多核苷酸的“弱化”)，重组微生物细胞获得与亲代微生物细胞相比新的或改善的特性(诸如例如，产生新的或更大量的细胞内代谢物的能力，提高代谢物通过期望途径的通量的能力和/或降低不想要的副产物的产生的能力)。
改造重组微生物细胞以产生奇数链脂肪酸衍生物
很多微生物细胞正常地产生直链脂肪酸(其中线性脂肪族链主要含有偶数的碳原子)，并且通常产生相对少量的具有线性脂肪族链(其含有奇数碳原子)的脂肪酸。由此类微生物细胞如大肠杆菌产生的相对少量的线性奇数链脂肪酸(oc-FA)和其它线性奇数链脂肪酸衍生物(oc-FA衍生物)，在某些情况下归因于此类细胞中存在的低水平的丙酰辅酶A。此类细胞主要利用乙酰辅酶A作为脂肪酸生物合成的引发物分子，导致此类细胞产生的大多数脂肪酸和其它脂肪酸衍生物是线性偶数链脂肪酸(ec-FA)和其它线性偶数链脂肪酸衍生物(ec-FA衍生物)。
本发明部分基于这样的发现：通过改造微生物使其相对于亲代微生物产生的丙酰辅酶A的量产生增加量的丙酰辅酶A，改造的微生物相对于亲代微生物产生的oc-FA衍生物的量产生更大量(滴度)的oc-FA衍生物，和/或相对于亲代微生物产生的脂肪酸衍生物组合物中oc-FA衍生物的比例产生具有更高比例的oc-FA衍生物的脂肪酸衍生物组合物。
因为最终目的是为了提供从碳源(诸如例如，碳水化合物或生物质)开始的工业规模生产脂肪酸衍生物(包括oc-FA衍生物)的环保责任的、具有成本效益的方法，所以微生物产生oc-FA衍生物分子的产量的提高和/或微生物产生的脂肪酸衍生物分子的组成的优化(例如通过提高奇数链产物相对于偶数链产物的比例)是可取的。因此，不同途径中间产物的过量产生策略已被核查，以增加通过导致奇数链脂肪酸产生的途径的代谢通量。可以改造工业上有用的微生物中从起始原料例如糖将代谢引导至丙酰辅酶A，通过奇数链酰基-ACP(oc-酰基-ACP)中间产物，至oc-FA衍生物产物的途径。
在一方面，本发明包括含有编码多肽(例如，酶)的一种或多种多核苷酸的重组微生物细胞，当在有效表达所述多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下培养所述重组微生物细胞时，所述多肽具有参与丙酰辅酶A生物合成和/或参与oc-酰基-ACP中间产物生物合成的酶促活性。在一些实施方案中，所述重组微生物细胞还包含一种或多种多核苷酸，每一种都编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽，其中所述重组微生物细胞在足以表达所述多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下培养时，产生奇数链脂肪酸衍生物。本发明还包括制备包含奇数链脂肪酸衍生物的组合物的方法，包括培养本发明的重组微生物细胞。本发明还包括增加微生物细胞产生的丙酰辅酶A的量的方法，和增加微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物的量或比例的方法，以及进一步核查后显而易见的其它特征。
重组微生物细胞可以是丝状真菌、水藻、酵母或诸如细菌(例如，大肠杆菌或芽孢杆菌)的原核生物。
通常，可以在本发明的重组微生物细胞中通过图1B中描述的奇数链脂肪酸生物合成途径(“oc-FA途径”)产生奇数链脂肪酸衍生物(例如，奇数链脂肪酸、奇数链脂肪酯(包括奇数链脂肪酸甲酯(oc-FAMEs)、奇数链脂肪酸乙酯(oc-FAEEs)和奇数链蜡酯)、奇数链脂肪醛、奇数链脂肪醇，以及由于奇数链前体的脱羰或脱羧作用产生的偶数链碳氢化合物(如偶数链烷烃、偶数链烯烃、偶数链端烯烃、偶数链内烯烃和偶数链酮))。
为了产生奇数链脂肪酸衍生物，重组微生物细胞利用丙酰辅酶A作为脂酰链延长过程起始的“引发物”。如图1B中所示，脂酰延长过程最初涉及由具有β-酮酯酰ACP合酶活性(例如，β-酮酯酰ACP合酶III酶)的酶催化的奇数链长引发物分子丙酰辅酶A与丙二酰ACP分子的缩合，从而形成初始的奇数链β-酮酯酰-ACP中间产物(例如，3-氧代戊酰-ACP)，如图1B的步骤(D)中所描绘的。奇数链β-酮酯酰-ACP中间产物通过脂肪酸合酶(FAS)复合物在β-碳处经历酮还原、脱水和烯酰还原，从而形成初始的奇数链酰基-ACP中间产物，其经历与丙二酰ACP的缩合、酮还原、脱水和烯酰还原的进一步的循环，每个循环添加两个碳单元，从而形成增加奇数个碳链长度的酰基-ACP中间产物(“oc-酰基-ACP”)，如图1B的步骤(E)中所描绘的。如图1B的步骤(F)中所描绘的，oc-酰基-ACP中间产物与一种或多种脂肪酸衍生物酶反应，产生奇数链脂肪酸衍生物(oc-FA衍生物)产物。这与产生相对低水平的丙酰辅酶A的细胞(诸如例如，野生型大肠杆菌细胞)中的过程形成对比。此类细胞主要产生具有偶数碳原子的直链脂肪酸，和低量或痕量的具有奇数碳原子的直链脂肪酸。如图1A中所描绘的，偶数链长的引发物分子乙酰辅酶A最初与丙二酰ACP分子缩合，从而形成偶数链β-酮酰基-ACP中间产物(例如，乙酰乙酰-ACP)，如图1A的步骤(D)中所描绘的，其同样经历FAS催化的酮还原、脱水、烯酰还原和与其它丙二酰ACP分子的缩合的循环，同样是每个循环添加两个碳单元，这次形成增加偶数个碳链长度的酰基-ACP中间产物(“ec-酰基-ACP”)，如图1A的步骤(E)中所描绘的。如图1A的步骤(F)中所描绘的，ec-酰基-ACP中间产物与一种或多种脂肪酸衍生物酶反应，产生偶数链脂肪酸衍生物。
可以通过多种方法将丙酰辅酶A“引发物”分子提供给本发明的重组微生物细胞的oc-FA生物合成途径。增加微生物细胞中丙酰辅酶A的产生的方法包括但不限于以下：
丙酰辅酶A可以通过亲代微生物细胞的天然生物合成机制生成(例如，通过亲代微生物细胞的内源酶)。如果需要增加亲代微生物细胞中产生的丙酰辅酶A的量，可以使亲代微生物细胞内源的有助于丙酰辅酶A产生的一种或多种酶在重组微生物细胞中过表达。
可以通过改造细胞以过表达内源酶和/或表达将代谢通量转移通过图2所示的中间产物α-酮戊二酸盐(酯)的内源酶来生成丙酰辅酶A。改造此类途径中使用的酶的非限制实例提供在以下表1和2中。
可以通过改造细胞以过表达内源酶和/或表达将代谢通量从琥珀酰辅酶A转移通过图3所示的中间产物甲基丙二酰辅酶A的内源酶来生成丙酰辅酶A。改造此类途径中使用的酶的非限制实例提供在以下表3中。
在示例性的方法中，可以通过改造细胞以过表达内源酶和/或表达将代谢通量从丙二酰辅酶A转移通过中间产物丙二酸半醛和3-羟基丙酸酯(盐)的内源酶来生成丙酰辅酶A。改造此类途径中使用的酶的非限制实例提供在例如，美国专利申请公开号US20110201068A1中。
在另一方法中，可以通过改造细胞以过表达内源酶和/或表达将代谢通量从D-乳酸转移通过中间产物乳酰辅酶A和丙烯酰辅酶A的内源酶来生成丙酰辅酶A。改造此类途径中使用的酶的非限制实例提供在例如，美国专利申请公开号US20110201068A1中。
如上文所指出的，奇数链延长过程的起始涉及丙酰辅酶A与丙二酰ACP分子的缩合以形成oc-β-酮酯酰-ACP中间产物。如图1B的部分(D)所表示的，该步骤由重组微生物细胞中具有β-酮酯酰-ACP合酶活性，优选利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶III活性(例如，EC2.3.1.180)的酶催化。所述酶可以是重组微生物细胞内源的，或者可以是重组微生物细胞外源的。
在一实施方案中，使编码亲代微生物细胞内源的具有β-酮酯酰-ACP合酶活性(其利用丙酰辅酶A作为底物)的多肽的多核苷酸在重组微生物细胞中表达或过表达。在另一实施方案中，使编码亲代微生物细胞外源的具有β-酮酯酰-ACP合酶活性(其利用丙酰辅酶A作为底物)的多肽的多核苷酸在重组微生物细胞中表达。
oc-FA途径(图1B)的步骤(D)中生成的oc-β-酮酯酰-ACP中间产物可通过在β碳处的酮还原、脱水和烯酰还原的连续循环以及进一步由脂肪酸合酶(FAS)复合物诸如例如II型FAS复合物催化的与丙二酰ACP分子缩合经历延长，如通过图1B的步骤(E)所表示的，所述缩合向oc-酰基-ACP中间产物的延长的奇数碳链添加两个碳单元。在一实施方案中，重组微生物细胞天然的内源FAS复合物催化与丙二酰ACP的缩合/酮还原/脱水/烯酰还原的循环，从而产生oc-酰基-ACP中间产物。
奇数链脂肪酸衍生物(诸如oc-脂肪酸、oc-脂肪酯、oc-脂肪醛、oc-脂肪醇、ec-酮和ec-碳氢化合物)可从oc-酰基-ACP中间产物产生，这将在下文进行更为详细的描述。因此，在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含一种或多种多核苷酸序列，每一种多核苷酸序列都编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽，所述脂肪酸衍生物酶活性如硫酯酶(例如，TesA)、脱羧酶、羧酸还原酶(CAR；例如，CarA,CarB或FadD9)、醇脱氢酶/醛还原酶；醛脱羧酶(ADC)、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR)、酰基ACP还原酶(AAR)、酯合酶、酰基辅酶A还原酶(ACR1)、OleA、OleCD或OleBCD，其中在有效表达所述多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下培养所述重组微生物细胞时，所述微生物细胞产生包含oc-脂肪酸、oc-脂肪酯(诸如oc-脂肪酸甲酯、oc-脂肪酸乙酯、oc-蜡酯)、oc-脂肪醛、oc-脂肪醇、ec-酮或ec-碳氢化合物(诸如ec-烷烃、ec-烯烃、ec-端烯烃或ec-内烯烃)的组合物。本发明还包括产生oc-脂肪酸衍生物的方法，包括培养本发明的重组微生物细胞。
改造微生物细胞以产生增加量的丙酰辅酶A
在一方面，本发明包括增加微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物的量的方法，其包括改造亲代微生物细胞以产生增加量的丙酰辅酶A。例如，通过改造细胞以表达编码以下的多核苷酸可以实现改造亲代微生物细胞，从而产生增加量的丙酰辅酶A：(a)具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性和苏氨酸脱氨酶活性的多肽；(b)具有(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽；或者(c)具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的多肽和具有甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性和甲基丙二酰羧基转移酶活性的一种或多种多肽，以及任选地具有甲基丙二酰差向异构酶活性的多肽；其中至少一种多肽是重组微生物细胞外源的，或者与亲代微生物细胞中至少一种多核苷酸的表达相比，重组微生物细胞中的所述多核苷酸的表达被调节，并且其中当在有效表达所述多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下培养时，相对于相同条件下亲代微生物细胞所产生的丙酰辅酶A的量，所述重组微生物细胞产生更大量的丙酰辅酶A。
在一些实施方案中，(a)的多核苷酸所编码的至少一种多肽是外源多肽(例如，来自亲代微生物细胞以外的有机体的多肽，或者亲代微生物细胞的天然多肽的变体)。在一些情况下，(a)的多核苷酸所编码的至少一种多肽是内源多肽(即，亲代微生物细胞的天然多肽)，并且所述内源多肽在重组微生物细胞中过表达。
在一些实施方案中，(b)的多核苷酸所编码的至少一种多肽是外源多肽至少一种多肽。在一些情况下，(b)的多核苷酸所编码的至少一种多肽是内源多肽，并且所述内源多肽在重组微生物细胞中过表达。
在一些实施方案中，重组微生物细胞包含(a)的一种或多种多核苷酸以及(b)的一种或多种多核苷酸。在一些情况下，(a)或(b)的多核苷酸所编码的至少一种多肽是外源多肽。在一些情况下，(a)或(b)的多核苷酸所编码的至少一种多肽是内源多肽，并且所述内源多肽在重组微生物细胞中过表达。
在一些实施方案中，(c)的多核苷酸所编码的至少一种多肽是外源多肽。在一些情况下，(c)的多核苷酸所编码的至少一种多肽是内源多肽，并且所述内源多肽在重组微生物细胞中过表达。
通过改造亲代微生物细胞获得与所述亲代(例如，未改造的)微生物细胞相比，具有增加的通过丙酰辅酶A的代谢通量的重组微生物细胞，与所述亲代微生物细胞产生的oc-FA衍生物的量相比，改造的微生物细胞产生更大量(滴度)的oc-FA衍生物，和/或与所述亲代微生物细胞产生的脂肪酸衍生物组合物中oc-FA衍生物的比例相比，改造的微生物细胞产生具有更高比例的oc-FA衍生物的脂肪酸衍生物组合物。
因此，在另一方面中，本发明包括增加微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物的量或比例的方法，所述方法包括改造亲代微生物细胞以获得重组微生物细胞，相对于在相同条件下培养的所述亲代微生物细胞所产生的丙酰辅酶A的量，所述重组微生物细胞产生更大量或能够产生更大量的丙酰辅酶A，其中所述重组微生物细胞和所述亲代微生物细胞每一种都在相同的条件(相对于所述亲代微生物细胞，所述条件有效增加所述重组微生物细胞中丙酰辅酶A的水平)下，在存在碳源的情况下培养时，相对于所述亲代微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物的量或比例，所述重组微生物细胞的培养物产生更大量或更高比例的奇数链脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，重组微生物细胞包含编码途径(a)、(b)和(c)的一条或多条的多肽的多核苷酸，这将在下文进行更详细的描述，其中至少一种编码的多肽是重组微生物细胞外源的，或者其中与亲代微生物细胞中至少一种多核苷酸的表达相比，重组微生物细胞中的所述多核苷酸的表达被调节。在一些实施方案中，重组微生物细胞包含至少一种编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，重组微生物细胞包含编码具有β-酮酯酰-ACP合酶活性(其利用丙酰辅酶A作为底物)多肽的多核苷酸。
以下描述了用于增加重组微生物细胞中丙酰辅酶A产生的示例性代谢途径。应当理解，这些用于增加重组细胞中丙酰辅酶A产生的示例性途径并非意图限制本发明的范围。能够增加细胞中丙酰辅酶A产生和/或增加细胞中通过丙酰辅酶A中间产物的代谢通量的任何合适的代谢途径适用于本发明的重组微生物细胞、组合物和方法中。因此，能够增加丙酰辅酶A产生和/或增加通过丙酰辅酶A中间产物的代谢通量的代谢途径适用于本发明的重组微生物细胞、组合物和方法中。
丙酰辅酶A经由α-酮丁酸中间产物的产生
操纵多种氨基酸生物合成途径已被证实能够增加微生物细胞中所述多种氨基酸的产生(Guillouet S.,et al.,Appl.Environ.Microbiol.65:3100-3107(1999)；LeeK.H.,et al.,Mol.Syst.Biol.3:149(2007))。氨基酸生物合成途径已用于大肠杆菌中短链分支醇类的产生(Atsumi S.and Liao J.C.,Appl.Environ.Microbiol.74(24):7802-7808(2008)；Cann A.F.and Liao J.C.,Appl Microbiol Biotechnol.81(1):89-98(2008)；Zhang K.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.105(52):20653-20658(2008))。
将某些氨基酸生物合成代谢物的通量引导至产生中间产物α-酮丁酸(也称为α-酮丁酸、2-酮丁酸、2-酮丁酸盐(2-ketobutanoate)、2-氧代丁酸和2-氧桥丁酸盐(2-oxobutanoate))，导致丙酰辅酶A的产生增加。因此，在一实施方案中，本发明包括含有多核苷酸的重组微生物细胞，所述多核苷酸编码一种或多种酶(即“oc-FA途径酶”)，当所述重组微生物细胞在足以表达所述多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下培养时，所述一种或多种酶参与将碳源(例如，碳水化合物如糖)转化成α-酮丁酸。α-酮丁酸分子是微生物中产生丙酰辅酶A的中间产物，所述丙酰辅酶A充当根据oc-FA途径(图1B)产生线性奇数链脂肪酸衍生物的引发物。
丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)催化α-酮丁酸的氧化脱羧，从而在细菌中产生丙酰辅酶A(Danchin,A.et al.,Mol.Gen.Genet.193:473-478(1984)；Bisswanger,H.,J.Biol.Chem.256:815-822(1981))。丙酮酸脱氢酶复合物是含有三种活性的多酶复合物：丙酮酸脱羧酶(E1)、二氢硫辛酸转乙酰酶(E2)和二氢硫辛酸脱氢酶(E3)。存在其它合适的使用相似催化策略的酮酸脱氢酶复合物，其利用丙酮酸以外的α-酮酸底物。TCA循环α-酮戊二酸脱氢酶复合物是一个实例。在一实施方案中，利用宿主细胞内源的丙酮酸脱氢酶复合物(即，亲代细胞天然的丙酮酸脱氢酶复合物)来催化α-酮丁酸转化成丙酰辅酶A。在其它实施方案中，使编码一种或多种PDC复合物多肽的基因在重组微生物细胞中过表达，所述一种或多种PDC复合物多肽具有丙酮酸脱羧酶、二氢硫辛酸转乙酰酶和/或二氢硫辛酸脱氢酶活性。可以使催化α-酮丁酸转化成丙酰辅酶A的其它酶或酶复合物在重组微生物细胞中表达或过表达，以进一步增加从α-酮丁酸至丙酰辅酶A的代谢通量。
α-酮丁酸转化成丙酰辅酶A还可以通过使α-酮丁酸转化成丙酸并使丙酸活化成丙酰辅酶A来实现。α-酮丁酸转化成丙酸可以通过丙酮酸氧化酶(E.C.1.2.3.3)，诸如poxB基因编码的大肠杆菌丙酮酸氧化酶(Grabau and Cronan,Nucleic Acids Res.14(13):5449-5460(1986))来催化。天然的大肠杆菌PoxB酶与α-酮丁酸和丙酮酸反应，优先与丙酮酸反应，然而，Chang和Cronan(Biochem J.352:717-724(2000))描述了保持对α-酮丁酸的全活性以及对丙酮酸具有降低的活性的PoxB突变酶。丙酸活化成丙酰辅酶A可以由酰基辅酶A合酶，诸如乙酰辅酶A合成酶(Doi et al.,J.Chem Soc.23:1696(1986))来催化。酵母乙酰辅酶A合成酶已被证实催化丙酸活化成丙酰辅酶A(Patel and Walt,J.Biol.Chem.262:7132(1987))。丙酸还可以通过乙酸激酶(ackA)和磷酸转乙酰酶(pta)的作用活化成丙酰辅酶A。
亲代微生物细胞内源的一种或多种酶，可以与重组微生物细胞中改造的oc-FA生物合成途径的酶竞争底物，或者可以破坏中间产物(例如α-酮丁酸)或以其它方式使中间产物远离oc-FA生物合成途径；编码这些不想要的内源酶的基因可以被减弱，以增加重组微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物。例如，在大肠杆菌中，内源的乙酰羟酸合酶(AHAS)复合物如AHAS I(例如ilvBN基因编码的)、AHAS II(例如，ilvGM基因编码的)和AHAS III(例如，ilvIH基因编码的)，催化α-酮丁酸转化成α-乙酰-α-羟基丁酸，因而使代谢通量远离丙酰辅酶A并降低了oc-FA的产生。因而，缺失一种或多种内源AHAS基因或以其它方式降低一种或多种内源AHAS基因的表达，可以将重组微生物细胞中的生物合成更多地指向丙酰辅酶A，并最终更多地指向奇数链脂肪酸的产生。可以与oc-FA生物合成途径竞争的其它内源酶包括具有乙酰羟酸还原异构酶活性的酶(例如，由ilvC基因编码的)，其催化α-乙酰-α-羟基丁酸转化成2,3-二羟基-3-甲基戊酸；以及具有二羟酸脱水酶活性的酶(例如，由ilvD基因编码的)，其催化2,3-二羟基-3-甲基戊酸转化成2-酮-3-甲基戊酸。缺失这些基因的一种或多种或以其它方式降低这些基因的一种或多种的表达，可以将重组微生物细胞中的生物合成更多地指向丙酰辅酶A，并最终更多地指向奇数链脂肪酸的产生。
可以改造重组微生物细胞中以下示例性途径的任一种或两种，以增加通过共同的α-酮丁酸中间产物的代谢通量，从而导致细胞中产生的丙酰辅酶A增加。这些示例性途径显示在图2中，并且在下文进行更详细的描述。
途径A(苏氨酸中间产物)
产生了共同的α-酮丁酸中间产物的第一途径，如图2的途径(A)所表示的，包括由苏氨酸生物合成酶产生中间产物苏氨酸，随后由具有苏氨酸脱水酶活性的酶催化苏氨酸脱氨基成为α-酮丁酸。
在途径(A)中，增加至苏氨酸的代谢通量可以通过表达编码参与苏氨酸生物合成的酶的多核苷酸来实现，包括具有天冬氨酸激酶(天冬氨酸kinase)活性的酶(例如，EC2.7.2.4；也称为天冬氨酸激酶(aspartokinase)活性)，其催化天冬氨酸转化成天冬氨酰磷酸；具有天冬氨酸-半醛脱氢酶活性的酶(例如，EC 1.2.1.11)，其催化天冬氨酰磷酸转化成天冬氨酸半醛；具有高丝氨酸脱氢酶活性的酶(例如，EC 1.1.1.3)，其催化天冬氨酸半醛转化成高丝氨酸；具有高丝氨酸激酶活性的酶(例如，EC 2.7.1.39)，其催化高丝氨酸转化成O-磷酸-L-高丝氨酸；以及具有苏氨酸合酶活性的酶(例如，EC 4.2.3.1)，其催化O-磷酸-L-高丝氨酸转化成苏氨酸。并非需要在重组微生物细胞中改造出上文列出的所有活性以增加通过苏氨酸中间产物的代谢通量。在一些情况下，亲代微生物细胞中已经存在的活性(例如，亲代微生物细胞中天然基因所产生的多肽具有该活性)将足以催化上文列出的步骤。在一实施方案中，重组微生物细胞被改造成重组表达选自以下的一种或多种多核苷酸：编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽催化天冬氨酸转化为天冬氨酰磷酸；编码具有天冬氨酸-半醛脱氢酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽催化天冬氨酰磷酸转化为天冬氨酸半醛；编码具有高丝氨酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽催化天冬氨酸半醛转化为高丝氨酸；编码具有高丝氨酸激酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽催化高丝氨酸转化为O-磷酸-L-高丝氨酸；编码具有苏氨酸合酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽催化O-磷酸-L-高丝氨酸转化为苏氨酸；其中所述重组微生物细胞与亲代微生物细胞相比具有增加的通过中间产物苏氨酸途径的代谢通量。在一些情况下，在相同的条件下培养时，由重组表达的多核苷酸编码的多肽存在于重组微生物细胞中的浓度高于其在亲代微生物细胞中的浓度，即所述多肽在重组细胞中“过表达”。例如，重组表达的多核苷酸可以与启动子可操作地连接，当在相同的条件下培养时，所述启动子以高于亲代微生物细胞正常表达的浓度在重组微生物细胞中表达所述多核苷酸。在一实施方案中，使用大肠杆菌thrA基因，其编码具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性的双功能ThrA。在另一实施方案中，使用突变的大肠杆菌thrA基因，其编码具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性以及相对于亲代ThrA酶具有降低的反馈抑制的变体酶(称为ThrA*；Ogawa-Miyata,Y.,et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.65:1149-1154(2001)；Lee J.-H.,etal.,J.Bacteriol.185:5442-5451(2003))。
通过具有苏氨酸脱氨酶活性的酶(例如，EC 4.3.1.19；也称为苏氨酸解氨酶活性，之前被归为EC 4.2.1.16，苏氨酸脱水酶)，苏氨酸可以脱去氨基成为α-酮丁酸。在一实施方案中，亲代微生物细胞中已经存在(即内源)的苏氨酸脱氨酶活性足以催化苏氨酸转化为α-酮丁酸。在另一实施方案中，改造重组微生物细胞以重组表达具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽，其中所述多肽催化苏氨酸转变为α-酮丁酸。在一些实施方案中，具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽在重组微生物细胞中过表达。
用于改造途径(A)的酶及编码此类酶的多核苷酸的非限制性实例提供在表1中。
表1.oc-FA生物合成途径的途径A中使用的酶及核酸编码序列的非限制性实例显示在图2中
Figure BDA0001375943360000391
Figure BDA0001375943360000401
对于通过上述EC编号分类的多肽，例如，通过检索相关的数据库(诸如KEGG数据库(University of Tokyo)、PROTEIN或GENE数据库(Entrez数据库；NCBI)、UNIPROTKB或ENZYME数据库(ExPASy；Swiss Institute of Bioinformatics)以及BRENDA数据库(TheComprehensive Enzyme Information System；Technical University ofBraunschweig)，所有的数据库都可以在万维网上获得)，可以鉴定其他多肽。例如，可以通过检索归类为EC 2.7.2.4下的多肽来鉴定其他天冬氨酸激酶多肽；可以通过检索归类为EC1.1.1.3下的多肽来鉴定其他高丝氨酸脱氢酶多肽；可以通过检索归类为EC 2.7.1.39下的多肽来鉴定其他高丝氨酸激酶多肽；可以通过检索归类为EC 4.2.3.1下的多肽来鉴定其他苏氨酸合酶多肽；以及可以通过检索归类为EC 4.3.1.19下的多肽来鉴定其他苏氨酸脱氨酶多肽。
在一些实施方案中，利用本领域公知的方法修饰编码亲代脂肪酸途径多肽(诸如表1描述的或按EC编号识别的多肽或与示例性多肽同源的多肽)的多核苷酸，从而产生具有上述酶促活性(例如，天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性、苏氨酸脱氨酶活性)且与亲代多肽相比具有改良性质的变体多肽，其更适合于微生物细胞和/或被改造的途径，诸如例如，在培养重组微生物细胞的条件下增加的催化活性或提高的稳定性；细胞代谢物或培养基成分的降低的抑制(例如，降低的反馈抑制)等。
途径B(柠苹酸中间产物)
产生了共同的α-酮丁酸中间产物的第二途径，如图2的途径(B)所表示的，包括经由具有柠苹酸合酶活性的酶产生中间产物柠苹酸(也被称为2-甲基苹果酸)，并通过具有异丙基苹果酸异构酶和醇脱氢酶活性的酶的作用由柠苹酸转化为α-酮丁酸。
柠苹酸合酶活性(例如，EC 2.3.1.182)，其催化乙酰辅酶A和丙酮酸反应形成(R)-柠苹酸，可以由来自诸如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschi)或问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)的细菌的cimA基因的表达提供(Howell,D.M.et al.,J.Bacteriol.181(1):331-3(1999)；Xu,H.,et al.,J.Bacteriol.186:5400-5409(2004))，所述基因编码CimA多肽如来自詹氏甲烷球菌的CimA(SEQ ID NO:40)或来自问号钩端螺旋体的CimA(SEQ ID NO:42)。可选择地，可以使用编码CimA变体的修饰的cimA核酸序列，所述CimA变体在重组微生物细胞中具有提高的催化活性或稳定性和/或降低的反馈抑制，诸如例如，Atsumi S.和Liao J.C.描述的CimA变体(Appl.Environ.Microbiol.74(24):7802-7808(2008))，优选cimA3.7基因编码的CimA3.7变体(SEQ ID NO:41)。可选择地，可以使用问号钩端螺旋体CimA变体(SEQ ID NO:43)。异丙基苹果酸异构酶活性(EC 4.2.1.33；也称为异丙基苹果酸脱水酶)，其催化(R)-柠苹酸先转化为柠康酸，然后转化为β-甲基-D-苹果酸，其可以由例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌leuCD基因的编码的异二聚蛋白的表达提供。醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.85；β-异丙基苹果酸脱氢酶)，其催化β-甲基-D-苹果酸转化为2-酮丁酸(即α-酮丁酸)，其可以由例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌leuB基因或酵母leu2基因的表达提供。用于改造oc-FA途径的途径(B)的脂肪酸途径酶及编码此类酶的多核苷酸的非限制性实例提供在表2中。
表2.oc-FA生物合成途径的途径(B)中使用的酶及核酸编码序列的非限制性实例显示在图2中
Figure BDA0001375943360000421
对于通过上述EC编号分类的多肽，例如，通过检索相关的数据库(诸如KEGG数据库(University of Tokyo)、PROTEIN或GENE数据库(Entrez数据库；NCBI)、UNIPROTKB或ENZYME数据库(ExPASy；Swiss Institute of Bioinformatics)以及BRENDA数据库(TheComprehensive Enzyme Information System；Technical University ofBraunschweig)，所有的数据库都可以在万维网上获得)，可以鉴定其他多肽。例如，可以通过检索归类为EC 2.3.1.182下的多肽来鉴定其他(R)-柠苹酸合酶多肽；可以通过检索归类为EC 4.2.1.33下的多肽来鉴定其他异丙基苹果酸异构酶酶多肽；以及可以通过检索归类为EC 1.1.1.85下的多肽来鉴定其他β-异丙基苹果酸脱氢酶多肽。
在一些实施方案中，利用本领域公知的方法修饰编码亲代脂肪酸途径多肽(诸如表2描述的或按EC编号识别的多肽或与示例性多肽同源的多肽)的多核苷酸，从而产生具有上述酶促活性(例如，(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性、β-异丙基苹果酸脱氢酶活性)且与亲代多肽相比具有改良性质的变体多肽，其更适合于微生物细胞和/或被改造的途径，诸如例如，在培养重组微生物细胞的条件下增加的催化活性或提高的稳定性；细胞代谢物或培养基成分的降低的抑制(例如，降低的反馈抑制)等。
丙酰辅酶A经由甲基丙二酰辅酶A的产生
途径C(甲基丙二酰辅酶A中间产物)
可以改造重组微生物细胞中的以下示例性途径，以增加通过甲基丙二酰辅酶A中间产物的代谢通量，从而导致细胞中产生的丙酰辅酶A增加。该示例性途径显示在图3中，并且在下文进行更详细的描述。
引导经由甲基丙二酰辅酶A的代谢通量能导致丙酰辅酶A的产生增加。因此，在一实施方案中，本发明包括含有多核苷酸的重组微生物细胞，当所述重组微生物细胞在足以表达所述多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下培养时，所述多核苷酸编码参与将碳源(例如，碳水化合物如糖)转化成琥珀酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A的多肽。琥珀酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A是微生物中产生丙酰辅酶A的中间产物，所述丙酰辅酶A充当根据oc-FA途径(图1B)产生线性奇数链脂肪酸衍生物的引发物。
如图3所示的产生丙酰辅酶A的途径(在本文也称为“途径(C)”)，包括经由具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的酶由琥珀酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A，并通过具有甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的酶的作用和/或通过具有甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性的酶的作用，由甲基丙二酰辅酶A转化为丙酰辅酶A。在一些情况下，根据所用的特定甲基丙二酰辅酶A脱羧酶或甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶所利用的甲基丙二酰辅酶A的立体异构体，可以利用具有甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性的酶在(R)-和(S)-甲基丙二酰辅酶A之间互换。
可以通过细胞TCA循环为该途径提供琥珀酰辅酶A。在一些情况下，例如，通过过表达内源frd(延胡索酸还原酶)或参与产生琥珀酸或琥珀酰辅酶A的其它基因，可以增加从延胡索酸向琥珀酸的通量。琥珀酰辅酶A向甲基丙二酰辅酶A的转化可以由具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的酶(例如，EC 5.4.99.2)催化。可以通过外源scpA(也称为sbm)基因的表达或通过内源scpA基因的过表达，将这种活性提供给重组微生物细胞。一种示例性的sbm基因包括来自大肠杆菌的基因(Haller,T.et al.,Biochemistry 39:4622-4629(2000))，其编码具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的Sbm多肽(Accession NP_417392,SEQ ID NO:51)。可选择地，可以使用例如，来自费氏丙酸杆菌谢氏亚种(Propionibacteriumfreundenreichii subsp.Shermanii)的甲基丙二酰辅酶A变位酶，其包含α-亚基或“大亚基”(MutB,Accession YP_003687736)以及β-亚基或“小亚基”(MutA,AccessionCAA33089)。催化琥珀酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A的多肽的非限制性实例提供在以下的表3中。
在一实施方案中，甲基丙二酰辅酶A向丙酰辅酶A的转化可以由具有甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的多肽(例如，EC 4.1.1.41)催化，该多肽催化甲基丙二酰辅酶A脱羧，从而成为丙酰辅酶A。可以通过外源scpB(也称为ygfG)基因的表达或通过内源scpB基因的过表达，将这种活性提供给重组微生物细胞。示例性的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶多肽包括例如，由大肠杆菌scpB基因编码的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶多肽(Haller et al.,同上)、或者由肠沙门氏菌(Salmonella enterica)或小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)编码的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶多肽。在另一实施方案中，甲基丙二酰辅酶A向丙酰辅酶A的转化可以由具有甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性的多肽(例如，EC2.1.3.1)催化，此类多肽诸如例如，来自费氏丙酸杆菌谢氏亚种(P.freundenreichiisubsp.Shermanii)的甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶(mmdA,NBCI登录号Q8GBW6.3)。根据甲基丙二酰辅酶A脱羧酶或甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶所用的甲基丙二酰辅酶A的立体异构体，可以要求在(R)-甲基丙二酰辅酶A和(S)-甲基丙二酰辅酶A之间进行转化，这可以由具有甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性的多肽(例如，EC 5.1.99.1)催化，所述多肽诸如例如，来自枯草芽孢杆菌(yqjC；Haller et al.,Biochemistry 39:4622-4629(2000))或费氏丙酸杆菌谢氏亚种(NCBI Accession No.YP_003688018)的甲基丙二酰辅酶A差向异构酶。
亲代微生物细胞内源的一种或多种酶，可以与重组微生物细胞中改造的oc-FA生物合成途径的酶竞争底物，或者可以破坏中间产物或以其它方式使中间产物远离oc-FA生物合成途径；编码这些不想要的内源酶的基因可以被减弱，以增加重组微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物。例如，在大肠杆菌中，由大肠杆菌scpC(也称为ygfH)基因编码的内源丙酰辅酶A：琥珀酰辅酶A转移酶(NCBI登录号NP_417395)，催化丙酰辅酶A转化为琥珀酰辅酶A，因而使代谢通量远离丙酰辅酶A并降低了oc-FA的产生。因而，缺失scpC(ygfH)基因或以其它方式降低scpC(ygfH)基因的表达，可以将重组微生物细胞中的生物合成更多地指向丙酰辅酶A，并最终更多地指向奇数链脂肪酸的产生。
在改造oc-FA途径的途径(C)中使用的脂肪酸途径酶及编码此类酶的多核苷酸的非限制性实例提供在表3中，所述酶催化琥珀酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A以及甲基丙二酰辅酶A转化为丙酰辅酶A。
表3oc-FA生物合成途径的途径(C)中使用的酶及核酸编码序列的非限制性实例显示在图3中
Figure BDA0001375943360000451
Figure BDA0001375943360000461
对于通过上述EC编号分类的多肽，例如，通过检索相关的数据库(诸如KEGG数据库(University of Tokyo)、PROTEIN或GENE数据库(Entrez数据库；NCBI)、UNIPROTKB或ENZYME数据库(ExPASy；Swiss Institute of Bioinformatics)以及BRENDA数据库(TheComprehensive Enzyme Information System；Technical University ofBraunschweig)，所有的数据库都可以在万维网上获得)，可以鉴定其他多肽。例如，可以通过检索归类为EC 5.4.99.2下的多肽来鉴定其他甲基丙二酰辅酶A变位酶多肽；可以通过检索归类为EC 4.1.1.41下的多肽来鉴定其他甲基丙二酰辅酶A脱羧酶多肽；可以通过检索归类为EC 2.1.3.1下的多肽来鉴定其他甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶多肽；以及可以通过检索归类为EC 5.1.99.1下的多肽来鉴定其他甲基丙二酰辅酶A差向异构酶多肽。
在一些实施方案中，利用本领域公知的方法修饰编码亲代脂肪酸途径多肽(诸如表3描述的或按EC编号识别的多肽或与示例性多肽同源的多肽)的多核苷酸，从而产生具有上述酶促活性(例如，甲基丙二酰辅酶A变位酶活性、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性、甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性、甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性)且与亲代多肽相比具有改良性质的变体多肽，其更适合于微生物细胞和/或被改造的途径，诸如例如，在培养重组微生物细胞的条件下增加的催化活性或提高的稳定性；细胞代谢物或培养基成分的降低的抑制(例如，降低的反馈抑制)等。
改造微生物细胞以产生增加量的oc-FA衍生物
丙酰辅酶A至oc-β-酮酯酰-ACP
如上文所论述的，丙酰辅酶A充当oc-FA衍生物产生过程中后续的FAS催化的延长步骤。该步骤的起始涉及丙酰辅酶A与丙二酰ACP分子缩合形成oc-β-酮酯酰-ACP中间产物3-氧代戊酰-ACP(图1B)。如图1B的步骤(D)所表示的，重组微生物细胞中的该起始步骤由具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的酶(例如III型β-酮酯酰-ACP合酶(例如，EC 2.3.1.180))催化，该酶利用丙酰辅酶A作为底物。
来自具体微生物的β-酮酯酰-ACP合酶的底物特异性通常反映该微生物的脂肪酸组成(Han,L.,et al.,J.Bacteriol.180:4481-4486(1998)；Qui,X.,et al.,ProteinSci.14:2087-2094(2005))。例如，大肠杆菌FabH酶利用丙酰辅酶A和乙酰辅酶A，但对乙酰辅酶A具有非常强的偏向性(Choi,K.H.,et al.,J.Bacteriology 182:365-370(2000)；Qui,et al.,同上)，这反映产生了高比例的线性偶数链脂肪酸，而来肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的酶利用长度为2至4个碳的短直链酰基辅酶A引发物以及多种支链酰基辅酶A引发物(Khandekar S.S.,et al.,J.Biol.Chem.276:30024-30030(2001))，这反映产生了多种线性链和支链的脂肪酸。编码具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽(其利用丙酰辅酶A作为底物)的多核苷酸序列通常可以获自含有β-酮酯酰-ACP合酶(其具有广泛的酰基辅酶A底物特异性)的微生物细胞。广泛特异性β-酮酯酰-ACP合酶的来源可以包括产生多种脂肪酸结构(包括支链脂肪酸)的细菌，诸如例如，芽胞杆菌属(例如，枯草芽胞杆菌)、利斯特氏菌属(例如，单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes))、链霉菌属(例如，天蓝色链霉菌(S.coelicolor))和丙酸杆菌属(例如，费氏丙酸杆菌谢氏亚种)。特别优选的β-酮酯酰-ACP合酶包括对丙酰辅酶A与乙酰辅酶A的偏向性超过内源FabH对其表现的偏向性的酶。例如，当改造大肠杆菌细胞时，优选的β-酮酯酰-ACP合酶可以包括，但不限于，枯草芽孢杆菌FabH1(Choi et al.2000,同上)、淡青链霉菌(Streptomycesglaucescens)FabH(Han,L.,et al.,J.Bacteriol.180:4481-4486(1998))、肺炎链球菌FabH(Khandekar S.S.,et al.,J.Biol.Chem.276:30024-30030(2001)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)FabH(Qui,X.et al.,Protein Sci.14:2087-2094(2005))。
一种或多种内源性酶，可以与重组微生物细胞中改造的oc-FA生物合成途径的酶竞争底物，或者可以破坏oc-FA途径中间产物或以其它方式使代谢通量远离oc-FA产生；编码这些不想要的内源酶的基因可以被减弱，以增加重组微生物细胞产生的oc-FA衍生物。例如，尽管大肠杆菌内源fabH编码的β-酮酯酰-ACP合酶利用丙酰辅酶A作为底物，但是其对两个碳的乙酰辅酶A分子比对三个碳的丙酰辅酶A分子具有大得多的偏向性(Choi etal.2000,同上)。因而，表达大肠杆菌fabH基因的细胞偏向利用乙酰辅酶A作为脂肪酸合成的引发物，并且在体内主要产生偶数链脂肪酸分子。缺失内源fabH基因或以其它方式降低内源fabH基因的表达，并且表达编码β-酮酯酰-ACP合酶的外源基因，可以将重组微生物细胞中的代谢通量更多地指向oc-β-酮酯酰-ACP中间产物，并最终更多地指向oc-FA衍生物的产生，所述β-酮酯酰-ACP合酶对丙酰辅酶A的偏向性大于内源FabH对其表现的偏向性(例如，当改造大肠杆菌时，用枯草芽孢杆菌FabH1或替代性的外源FabH来替换内源的大肠杆菌FabH，相对于大肠杆菌FabH所表现出的偏爱性，所述枯草芽孢杆菌FabH1或替代性的外源FabH对丙酰辅酶A的偏向性大于对乙酰辅酶A)。
在改造oc-FA途径的步骤D中使用的脂肪酸途径酶及编码此类酶的多核苷酸的非限制性实例提供在表4中。
表4.oc-FA生物合成途径的步骤D中使用的酶及编码序列的非限制性实例显示在图1B中
Figure BDA0001375943360000481
Figure BDA0001375943360000491
对于归类为EC 2.3.1.180下的多肽，例如，通过检索相关的数据库(诸如KEGG数据库(University of Tokyo)、PROTEIN或GENE数据库(Entrez数据库；NCBI)、UNIPROTKB或ENZYME数据库(ExPASy；Swiss Institute of Bioinformatics)以及BRENDA数据库(TheComprehensive Enzyme Information System；Technical University ofBraunschweig)，所有的数据库都可以在万维网上获得)，可以鉴定其他β-酮酯酰-ACP合酶多肽。
对于包含下文列出的一个或多个序列基序的多肽，还可以通过检索序列模式数据库如Prosite数据库(ExPASy Proteomics Server,Swiss Institute ofBioinformatics)，来鉴定其他β-酮酯酰-ACP合酶多肽。这容易实现，例如，通过利用ExPASyProteomics Server的万维网网站上可利用的ScanProsite工具。
在一实施方案中，β-酮酯酰-ACP合酶多肽包含选自以下的一个或多个序列基序：
Figure BDA0001375943360000501
其中每个括号中的氨基酸残基表示在具体的位置可选择的氨基酸残基，每个x表示任何氨基酸残基，并且“x(n)”中的每个n表示氨基酸残基的连续区段中x残基的数目。
在一些实施方案中，利用本领域公知的方法修饰编码亲代脂肪酸途径多肽(诸如表4描述的或按EC编号或基序识别的多肽或与示例性多肽同源的多肽)的多核苷酸，从而产生具有β-酮酯酰-ACP合酶活性且与亲代多肽相比具有改良性质的变体多肽，其更适合于微生物细胞和/或被改造的途径，诸如例如，在培养重组微生物细胞的条件下增加的催化活性或提高的稳定性；细胞代谢物或培养基成分的降低的抑制(例如，降低的反馈抑制)等。
本发明包括重组微生物细胞，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、146、147、148和149之一具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列，其中所述多肽具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性。在一些情况下，所述多肽序列包含选自SEQ ID NO:14-19的一个或多个序列基序。本发明还包括包含所述多肽序列的分离的多肽，和编码所述多肽的分离的多核苷酸。在一实施方案中，所述多肽包含在位置W310或与其等同的位置处的取代。在一实施方案中，所述多肽包含W310G取代。在一实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列，且包含取代W310G。在一些实施方案中，所述多肽相对于乙酰辅酶A对丙酰辅酶A表现出更大的特异性。
如本文所用的，“具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽”包括，提供底物丙酰辅酶A时，具有可检测水平的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽。
β-酮酯酰-ACP合酶对底物(诸如丙酰辅酶A)的酶促活性和特异性可以利用已知的方法测定。例如，Choi et al.(J.Bacteriology 182(2):365-370(2000))详细描述了适于测定针对乙酰辅酶A底物的β-酮酯酰-ACP合酶(“FabH”)活性的过滤盘测定(filtered discassay)，其可以被改进以测定作为底物的丙酰辅酶A。该测定含有25μM ACP、1mMβ-巯基乙醇、65μM丙二酰辅酶A、45μM[1-14C]乙酰辅酶A(特异性活性约45.8Ci/mol)、大肠杆菌FadD(0.2μg)和0.1M磷酸纳缓冲液(pH 7.0)，终体积为40μL。为了测定β-酮酯酰-ACP合酶活性，[1-14C]乙酰辅酶A可以用14C标记的丙酰辅酶A替代。反应通过添加FabH起始，并将混合物于37℃孵育12分钟。然后取出35mL等分试样，并放置在Whatman 3MM滤纸盘上。然后通过更换三次(20mL/盘，每次20分钟)冰冷的三氯乙酸来洗涤滤纸盘。在每次相继的洗涤过程中，将三氯乙酸的浓度从10％降至5％再降至1％。在3mL闪烁液中对干燥的滤纸进行计数。
可选择地，利用放射性标记的丙二酰辅酶A底物以及分离和定量产物的凝胶电泳可以测定FabH活性(Choi et al.2000,同上)。该测定混合物含有25μM ACP、1mMβ-巯基乙醇、70μM[2-14C]丙二酰辅酶A(特异活性,～9Ci/mol),45μM辅酶A-底物(诸如乙酰辅酶A或丙酰辅酶A)、FadD(0.2μg)、100μM NADPH、FabG(0.2μg)和0.1M磷酸纳缓冲液(pH 7.0)，终体积为40μL。反应通过添加FabH起始。混合物于37℃孵育12分钟，然后放置在冰浆中，然后添加凝胶加样缓冲液，并将混合物加载至含有0.5至2.0M尿素的构象灵敏的13％聚丙烯酰胺凝胶上。电泳可以在25℃，于32mA/凝胶下进行。然后使凝胶干燥，并通过将凝胶暴露于PhosphoImager屏来对条带进行定量。可以从测定中产物形成相对于FabH蛋白浓度作图的斜率计算出特异活性。
oc-β-酮酯酰-ACP至oc-酰基-ACP
步骤(D)中生成的oc-β-酮酯酰-ACP中间产物3-氧代戊酰-ACP，由脂肪酸合酶(FAS)复合物诸如例如II型脂肪酸合酶复合物催化，可通过与丙二酰ACP的缩合/酮还原/脱水/烯酰还原的连续循环而经历延长，从而向产生的oc-酰基-ACP的延长的脂肪酸链添加两个碳单元，如图1B的步骤(E)所表示的。
oc-酰基-ACP至oc-FA衍生物
奇数链脂肪酸衍生物可通过本发明的重组微生物细胞产生。在由一种或多种每种都具有脂肪酸衍生物活性的酶(即，脂肪酸衍生物酶)催化的反应中，oc-酰基-ACP中间产物被转化为oc-FA衍生物，如通过图1B的步骤(F)所表示的。脂肪酸衍生物酶例如能够将oc-酰基-ACP转化为最初的oc-FA衍生物，或者能够将最初的oc-FA衍生物转化为第二oc-FA衍生物。在一些情况下，通过具有不同脂肪酸衍生物活性的酶，最初的oc-FA衍生物被转化为第二oc-FA衍生物。在一些情况下，通过另一种脂肪酸衍生物酶，第二oc-FA衍生物被进一步转化为第三oc-FA衍生物，依此类推。
因此，在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含一种或多种多核苷酸，每种多核苷酸都编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽，其中所述重组微生物细胞在有效表达所述多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下培养时，产生oc-FA衍生物。
在不同的实施方案中，脂肪酸衍生物活性包括硫酯酶活性，其中所述重组微生物细胞产生oc-脂肪酸；脂肪酸衍生物活性包括酯合酶活性，其中所述重组微生物细胞产生oc-脂肪酯；脂肪酸衍生物活性包括脂肪醛生物合成活性,其中所述重组微生物细胞产生oc-脂肪醛；脂肪酸衍生物活性包括脂肪醇生物合成活性,其中所述重组微生物细胞产生oc-脂肪醇；脂肪酸衍生物活性包括酮生物合成活性,其中所述重组微生物细胞产生ec-酮；或者脂肪酸衍生物活性包括碳氢化合物生物合成活性，其中所述重组微生物细胞产生ec-碳氢化合物。在一些实施方案中，所述重组微生物细胞包含编码两种或更多种多肽的多核苷酸，每种多肽都具有脂肪酸衍生物酶活性。
在更具体的实施方案中，重组微生物细胞表达或过表达具有上文所述的脂肪酸衍生物酶活性的一种或多种多肽，其中所述重组微生物细胞产生包含oc-脂肪酸、oc-脂肪酯、oc-蜡酯、oc-脂肪醛、oc-脂肪醇、ec-酮、ec-烷烃、ec-烯烃、ec-内烯烃或ec-端烯烃的oc-FA组合物。
以下是脂肪酸衍生物酶和根据本发明的多个实施方案由此类酶催化的反应所产生的oc-FA衍生物的其他实例。
oc-脂肪酸
在一实施方案中，重组微生物细胞包含编码硫酯酶的多核苷酸，并且所述重组微生物细胞产生的oc-酰基-ACP中间产物由该硫酯酶(例如，3.1.1.5,EC 3.1.2.-；诸如例如EC 3.1.2.14)水解，导致oc-脂肪酸的产生。在一些实施方案中，包含脂肪酸(包括oc-脂肪酸)的组合物(在本文中也称为“脂肪酸组合物”)通过在有效表达多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下，培养所述重组细胞来产生。在一些实施方案中，脂肪酸组合物包含oc-脂肪酸和ec-脂肪酸。在一些实施方案中，从细胞培养物回收所述组合物。
在一些实施方案中，重组微生物细胞包含编码具有硫酯酶活性的多肽的多核苷酸，和一种或多种编码具有其他脂肪酸衍生物酶活性的多肽的其它多核苷酸。在一些这样的实例中，通过硫酯酶的作用产生的oc-脂肪酸被一种或多种具有不同脂肪酸衍生物酶活性的酶转化成另一种oc-脂肪酸衍生物，诸如例如oc-脂肪酯、oc-脂肪醛、oc-脂肪醇或ec-碳氢化合物。
在一实施方案中，oc-酰基-ACP中间产物与硫酯酶反应，从而形成oc-脂肪酸。oc-脂肪酸可以从细胞培养物回收，或者可以进一步转化成另一种oc-FA衍生物，例如oc-脂肪酯、oc-脂肪醛、oc-脂肪醇或ec-端烯烃。
通过修饰某些硫酯酶的表达，可以选择脂肪酸或从其产生的脂肪酸衍生物的链长度。硫酯酶影响产生的脂肪酸以及从其产生的脂肪酸衍生物的链长度。因此，可以工程化重组的细菌细胞以表达、过表达、具有减弱表达或不表达一种或多种选择的硫酯酶，从而增加优选的脂肪酸或脂肪酸衍生物底物的产生。例如，C10脂肪酸可以通过表达具有产生C10脂肪酸偏向性的硫酯酶并减弱具有产生除了C10脂肪酸外的脂肪酸的偏向性的硫酯酶(例如，偏向产生C14脂肪酸的硫酯酶)来产生。这会产生碳链长度为10的脂肪酸的相对均质的群体。在其他情况下，C14脂肪酸可以通过减弱产生非C14脂肪酸的内源硫酯酶并且表达使用C14-ACP的硫酯酶来产生。在一些情况下，C12脂肪酸可以通过表达使用C12-ACP的硫酯酶并且减弱产生非C12脂肪酸的硫酯酶来产生。使用本领域已知的方法可以证实脂肪酸的过量产生，例如，通过在细胞裂解后使用放射性母核、HPLC或GC-MS。
在oc-脂肪酸途径中使用的硫酯酶以及编码它们的多核苷酸的其它非限制性实例提供在表5和通过引用并入本文的PCT公开号WO 2010/075483中。
表5.图1B所示的oc-FA途径中使用的硫酯酶及其编码序列的非限制性实例
Figure BDA0001375943360000541
oc-脂肪酯
在一实施方案中，重组微生物细胞产生oc-脂肪酯，诸如例如oc-脂肪酸甲酯或oc-脂肪酸乙酯或oc-蜡酯。在一些实施方案中，由重组微生物细胞产生的oc-脂肪酸被转化成oc-脂肪酯。
在一些实施方案中，重组微生物细胞包含编码具有酯合酶活性(在本文中也称为“酯合酶多肽”或“酯合酶类酶”)的多肽(即酶)的多核苷酸，并且oc-脂肪酯由重组微生物细胞中表达或过表达的酯合酶多肽催化的反应产生。在一些实施方案中，包含脂肪酯(包括oc-脂肪酯)的组合物(在本文中也称为“脂肪酯组合物”)通过在有效表达多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下，培养所述重组细胞来产生。在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含oc-脂肪酯和ec-脂肪酯。在一些实施方案中，从细胞培养物回收所述组合物。
酯合酶多肽包括，例如，归为EC 2.3.1.75的酯合酶多肽或催化酰基硫酯转化成脂肪酯的任何其它多肽，包括但不限于，蜡酯合酶、酰基辅酶A：醇酰基转移酶、酰基转移酶或脂肪酰基辅酶A：脂肪醇酰基转移酶。例如，多核苷酸可以编码蜡/dgat，一种来自以下的双功能酯合酶/酰基辅酶A：二脂酰甘油酰基转移酶：加州希蒙得木(Simmondsia chinensis)、不动杆菌菌株ADP1、泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、亚德海床杆菌(Fundibacter jadensis)、拟南芥或真养产碱杆菌(Alkaligenes eutrophus)。在具体的实施方案中，酯合酶多肽是不动杆菌(Acinetobacter sp.)二脂酰甘油O-酰基转移酶(wax-dgaT；UniProtKB Q8GGG1,GenBankAAO17391)或加州希蒙得木蜡合酶(UniProtKB Q9XGY6,GenBank AAD38041)。在具体的实施方案中，编码酯合酶多肽的多核苷酸在重组微生物细胞中过表达。在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含编码硫酯酶的多核苷酸。
在另一实施方案中，重组微生物细胞产生oc-脂肪酯，诸如例如，oc-脂肪酸甲酯或oc-脂肪酸乙酯，其中所述重组微生物细胞表达编码酯合酶/酰基转移酶(归为2.3.1.20)多肽的多核苷酸，所述酯合酶/酰基转移酶多肽如AtfA1(来自泊库岛食烷菌SK2的酰基转移酶，UniProtKB Q0VKV8,GenBank YP_694462)或AtfA2(来自泊库岛食烷菌SK2的另一种酰基转移酶，UniProtKB Q0VNJ6,GenBank YP_693524)。在具体的实施方案中，编码酯合酶多肽的多核苷酸在重组微生物细胞中过表达。在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含编码硫酯酶的多核苷酸。
在另一实施方案中，重组微生物细胞产生oc-脂肪酯，诸如例如，oc-脂肪酸甲酯或oc-脂肪酸乙酯，其中所述重组微生物细胞表达编码酯合酶多肽的多核苷酸，所述酯合酶多肽如ES9(来自除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)DSM 8798的蜡酯合酶,UniProtKB A3RE51,GenBank ABO21021,由ws2基因编码)或ES376(来自除烃海杆菌DSM8798的另一种蜡酯合酶,UniProtKB A3RE50,GenBank ABO21020,由ws1基因编码)。在具体的实施方案中，编码酯合酶多肽的多核苷酸在重组微生物细胞中过表达。在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含编码硫酯酶的多核苷酸。
适用于这些实施方案中的酯合酶多肽和编码它们的多核苷酸的其它非限制性实例包括PCT公开号WO 2007/136762和WO2008/119082中所描述的那些，其通过引用并入本文中。
oc-脂肪醛
在一实施方案中，重组微生物细胞产生oc-脂肪醛。在一些实施方案中，重组微生物细胞产生的oc-脂肪酸被转化为oc-脂肪醛。在一些实施方案中，重组微生物细胞产生的oc-脂肪醛然后被转化为oc-脂肪醇或ec-碳氢化合物。
在一些实施方案中，重组微生物细胞包含编码具有脂肪醛生物合成活性的多肽(即酶)(在本文也被称为“脂肪醛生物合成多肽”或“脂肪醛生物合成酶”)的多核苷酸，并且oc-脂肪醛由所述重组微生物细胞中表达或过表达的脂肪醛生物合成多肽所催化的反应产生。在一些实施方案中，包含脂肪醛(包括oc-脂肪醛)的组合物(在本文中也称为“脂肪醛组合物”)通过在有效表达多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下，培养所述重组细胞来产生。在一些实施方案中，脂肪醛组合物包含oc-脂肪醛和ec-脂肪醛。在一些实施方案中，从细胞培养物回收所述组合物。
在一些实施方案中，oc-脂肪醛通过以下产生：在重组微生物细胞中表达或过表达编码具有脂肪醛生物合成活性如羧酸还原酶(CAR)活性(例如，由car基因编码)的多肽的多核苷酸。用在本实施方案中的羧酸还原酶(CAR)多肽及编码它们的多核苷酸的实例包括但不限于，FadD9(EC 6.2.1.-,UniProtKB Q50631,GenBank NP_217106)、CarA(GenBankABK75684)、CarB(GenBank YP889972)和通过引用并入本文的PCT公开号WO 2010/042664中描述的相关的多肽。在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含编码硫酯酶的多核苷酸。
在一些实施方案中，oc-脂肪醛通过以下产生：在重组微生物细胞中表达或过表达编码脂肪醛生物合成多肽如具有酰基-ACP还原酶(AAR)活性的多肽(例如，由aar基因编码)的多核苷酸。用在本实施方案中的酰基-ACP还原酶多肽的实例包括但不限于，来自细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongates)PCC 7942(GenBank YP_400611)的酰基-ACP还原酶和通过引用并入本文的PCT公开号WO WO 2010/042664中描述的相关的多肽。
在一些实施方案中，oc-脂肪醛通过以下产生：在重组微生物细胞中表达或过表达编码脂肪醛生物合成多肽如具有酰基辅酶A还原酶活性的多肽(例如，EC 1.2.1.x)(例如，由acr1基因编码)的多核苷酸。用在本实施方案中的酰基辅酶A还原酶多肽的实例包括但不限于，来自不动杆菌菌株ADP1的ACR1(GenBank YP_047869)和通过引用并入本文的PCT公开号WO WO 2010/042664中描述的相关的多肽。在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含编码硫酯酶和酰基辅酶A合酶的多核苷酸。
oc-脂肪醇
在一实施方案中，重组微生物细胞产生oc-脂肪醇。在一些实施方案中，重组微生物细胞产生的oc-脂肪醛被转化为oc-脂肪醇。在其它实施方案中，重组微生物细胞产生的oc-脂肪酸被转化为oc-脂肪醇。
在一些实施方案中，重组微生物细胞包含编码具有脂肪醇生物合成活性的多肽(即酶)(在本文也被称为“脂肪醇生物合成多肽”或“脂肪醇生物合成酶”)的多核苷酸，并且oc-脂肪醇由所述重组微生物细胞中表达或过表达的脂肪醇生物合成酶所催化的反应产生。在一些实施方案中，包含脂肪醇(包括oc-脂肪醇)的组合物(在本文中也称为“脂肪醇组合物”)通过在有效表达多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下，培养所述重组细胞来产生。在一些实施方案中，脂肪醇组合物包含oc-脂肪醇和ec-脂肪醇。在一些实施方案中，从细胞培养物回收所述组合物。
在一些实施方案中，oc-脂肪醇通过以下产生：在重组微生物细胞中表达或过表达编码具有脂肪醇生物合成活性如醇脱氢酶(醛还原酶)活性(例如，EC 1.1.1.1)的多肽的多核苷酸。用在本实施方案中的醇脱氢酶多肽的实例包括但不限于，大肠杆菌醇脱氢酶YqhD(GenBank AP_003562)和通过引用并入本文的PCT公开号WO 2007/136762和WO2008/119082中描述的相关的多肽。在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含编码脂肪醛生物合成多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含编码硫酯酶的多核苷酸。
在一些实施方案中，oc-脂肪醇通过以下产生：在重组微生物细胞中表达或过表达编码脂肪醇生物合成多肽如具有脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR)活性(例如，EC1.1.1.x)的多肽的多核苷酸。用在本实施方案中的FAR多肽的实例包括但不限于，通过引用并入本文的PCT公开号WO 2010/062480中描述的那些。在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含编码硫酯酶和酰基辅酶A合酶的多核苷酸。
ec-碳氢化合物
在一实施方案中，重组微生物细胞产生ec-碳氢化合物，诸如ec-烷烃或ec-烯烃(例如，ec-端烯烃或ec-内烯烃)或ec-酮。在一些实施方案中，oc-酰基-ACP中间产物通过脱羧去除碳原子而形成ec-内烯烃或ec-酮。在一些实施方案中，重组微生物细胞产生的oc-脂肪醛通过脱羰去除碳原子而形成ec-碳氢化合物。在一些实施方案中，重组微生物细胞产生的oc-脂肪酸通过脱羧去除碳原子而形成ec-端烯烃。
在一些实施方案中，重组微生物细胞包含编码具有碳氢化合物生物合成活性的多肽(即酶)(在本文也被称为“碳氢化合物生物合成多肽”或“碳氢化合物生物合成酶”)的多核苷酸，并且ec-碳氢化合物由所述重组微生物细胞中表达或过表达的碳氢化合物生物合成酶所催化的反应产生。在一些实施方案中，包含碳氢化合物(包括ec-碳氢化合物)的组合物(在本文中也称为“碳氢化合物组合物”)通过在有效表达多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下，培养所述重组细胞来产生。在一些实施方案中，碳氢化合物组合物包含ec-碳氢化合物和oc-碳氢化合物。在一些实施方案中，从细胞培养物回收碳氢化合物组合物。
在一些实施方案中，ec-碳氢化合物通过以下产生：在重组微生物细胞中表达或过表达编码具有碳氢化合物生物合成活性如醛脱羧酶(ADC)活性(例如，EC 4.1.99.5)的多肽的多核苷酸，例如，编码来自海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus)MIT9313的醛脱羧酶(GenBank NP_895059)或来自点状念珠藻(Nostoc punctiforme)的醛脱羧酶(GenBank登录号YP_001865325)的多核苷酸。用在本实施方案中的醛脱羧酶和相关多肽的实例包括但不限于，通过引用并入本文的PCT公开号WO 2008/119082和WO 2009/140695中描述的那些。在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含编码脂肪醛生物合成多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，重组微生物细胞还包含编码酰基-ACP还原酶的多核苷酸。
在一些实施方案中，ec-端烯烃通过以下产生：在重组微生物细胞中表达或过表达编码碳氢化合物生物合成多肽如具有脱羧酶活性的多肽(例如，通过引用并入本文的PCT公开号WO 2009/085278中所描述的)的多核苷酸。
在一些实施方案中，ec-内烯烃通过以下产生：在重组微生物细胞中表达或过表达编码碳氢化合物生物合成多肽如具有OleCD或OleBCD活性的多肽(例如，通过引用并入本文的PCT公开号WO 2008/147781中所描述的)的多核苷酸。
在一些实施方案中，ec-酮通过以下产生：在重组微生物细胞中表达或过表达编码碳氢化合物生物合成多肽如具有OleA活性的多肽(例如，通过引用并入本文的PCT公开号WO2008/147781中所描述的)的多核苷酸。
oc-FA衍生物的饱和水平
oc-酰基-ACP(其然后可以被转化成上文所述的多种oc-FA衍生物)的饱和程度可以通过调节脂肪酸中间产物的饱和程度来控制。例如，可以表达、过表达或以降低的水平(例如，减弱的)表达sfa、gns和fab家族基因，从而控制oc-酰基-ACP的饱和量。
oc-FA途径多肽和多核苷酸
本公开鉴定了可用于本发明的重组微生物细胞、方法和组合物中的多核苷酸。然而，应当认识到，并不需要与此类多核苷酸的绝对序列同一性。例如，可以进行具体多核苷酸序列的改变，并筛查编码多肽的活性。此类改变通常包括保守突变和沉默突变(诸如例如，密码子优化)。可以利用本领域已知的方法筛查修饰或突变的(即突变体)多核苷酸及编码的变体多肽是否具有需要的功能，例如与亲代多肽相比改善的功能，包括但不限于，增加的催化活性、增加的稳定性或降低的抑制(例如，降低的反馈抑制)。
本公开根据酶分类(EC)编号鉴定了参与本文所述的oc-FA生物合成途径的多个步骤(即反应)的酶促活性，并提供了由这些EC编号分类的示例性多肽(即酶)和编码这些多肽的示例性多核苷酸。此类示例性多肽和多核苷酸，在本文由登录号和/或序列识别号(SEQID NO)来识别，用于改造亲代微生物细胞中的oc-FA途径，从而本文所述的重组微生物细胞。然而，应当理解，本文所述的多肽和多核苷酸是示例性的、非限制性的。利用数据库，本领域技术人员可获取本文所述的示例性多肽的同源序列，所述数据库诸如例如，国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)提供的Entrez数据库、瑞士生物信息学研究所提供的ExPasy数据库、不伦瑞克工业大学(TechnicalUniversity of Braunschweig)提供的BRENDA数据库和日本京都大学和东京大学的生物信息学中心(Bioinformatics Center of Kyoto University and University of Tokyo)提供的KEGG数据库，所有的数据库都可以在万维网上获得。
还应当理解，可以修饰多种微生物细胞以含有本文所述的oc-FA途径，从而得到适于产生奇数链脂肪酸衍生物的重组微生物细胞。还应当理解，多种细胞能够提供遗传物质的来源，包括适用于本文提供的重组微生物细胞中的编码多肽多核苷酸序列。
本公开提供了具有适用于本文所述的oc-FA生物合成途径中的活性的多肽(即酶)的多个实例。此类多肽在本文中共同称为“oc-FA途径多肽”(可选择地，“oc-FA途径酶”)。适用于本发明重组微生物细胞中的oc-FA途径多肽的非限制性实例提供在本文的表格、说明书和实施例中。
在一些实施方案中，本发明包括含有多核苷酸序列(在本文中也称为“oc-FA途径多核苷酸”序列)的重组微生物细胞，所述多核苷酸序列编码oc-FA途径多肽。
适用于改造本发明重组微生物细胞中oc-FA途径的其它oc-FA途径多肽及编码它们的多核苷酸可以通过多种方法获得。例如，EC编号根据所催化的反应对酶进行分类。催化本文所述的生物合成途径中的反应的酶可以通过检索对应于数据库中该反应的EC编号来鉴定，所述数据库诸如例如：KEGG数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；Kyoto University and University of Tokyo)；UNIPROTKB数据库或ENZYME数据库(ExPASy Proteomics Server；Swiss Institute of Bioinformatics)；PROTEIN数据库或GENE数据库(Entrez数据库；National Center for Biotechnology Information(NCBI))；或BRENDA数据库(The Comprehensive Enzyme Information System；TechnicalUniversity of Braunschweig)；所有的数据库都可以在万维网上获得。在一实施方案中，编码具有通过EC编号(诸如说明书或本文的表格之一中列出的EC编号)分类的酶促活性的oc-FA途径多肽的oc-FA途径多核苷酸，或其具有该活性的片段或变体，用于改造重组微生物细胞中oc-FA途径的对应步骤。
在一些实施方案中，oc-FA途径多核苷酸序列编码被改造的重组细胞的亲代细胞内源的多肽。一些这样的内源多肽在重组微生物细胞中过表达。本文所用的“内源多肽”是指亲代(例如，野生型)细胞的基因组编码的多肽，所述亲代待被改造以产生重组微生物细胞。
oc-FA途径多肽，诸如例如内源的oc-FA途径多肽，可以通过任何合适的方式过表达。如本文所用的，“过表达”意指在相同的条件下，以高于对应的亲代(例如，野生型)细胞正常表达的浓度在细胞中表达多核苷酸或多肽或促使多核苷酸或多肽在细胞中表达。例如，在相同的条件下培养时，当与相同类型的非重组细胞(例如，亲代细胞)中多肽的浓度相比，该多肽以更高的浓度存在于重组微生物细胞中，则该多肽在所述重组细胞中“过表达”。
在一些实施方案中，oc-FA途径多核苷酸序列编码外源或异源的多肽。换句话说，多核苷酸编码的多肽是亲代微生物细胞外源的。本文所用的“外源的”(或“异源的”)多肽是指不是由亲代(例如，野生型)微生物细胞(其待被改造以产生重组微生物细胞)的基因组编码的多肽。此类多肽还可以被称为“非天然的”多肽。
在某些实施方案中，oc-FA途径多肽包含本文提供的示例性多肽之一的氨基酸序列以外的氨基酸序列。例如，oc-FA途径多肽可以包含示例性多肽序列的同源物、片段或变体的序列。
本文所用的术语“同系物”、“同源物”和“同源的”是指包含与对应的多核苷酸或多肽序列至少50％、优选至少60％、更优选至少70％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同源的序列的多核苷酸或多肽。本领域技术人员应当知道确定两条或更多条序列之间的同源性的方法。简单而言，可以如下进行两条序列之间“同源性”的计算。将序列为最佳比较的目的而进行比对(例如，可以为最佳比对在第一和第二氨基酸或多核苷酸序列的一条或两条中引入空位，或者可以为比较目的而忽视非同源的序列)。在优选的实施方案中，为比较目的而进行比对的第一序列的长度是第二序列长度的至少约30％、优选至少约40％、更优选至少约50％、甚至更优选至少约60％，且甚至更优选至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。然后比较在第一和第二序列的对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列的位置由第二序列中对应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据，则分子在该位置处是相同的(如本文所用的，氨基酸或核酸“同一性”与氨基酸或核酸“同源性”等同)。两条序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数的函数，其中考虑空位数和每个空位的长度，所述空位需要为两条序列的最佳比对而引入。
两条序列之间的序列比较和百分比同源性(即，百分比同一性)的确定可以利用数学算法实现，例如BLAST(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215(3):403-410(1990))。两条氨基酸序列之间的百分比同源性还可以利用已被并入GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch算法确定，其利用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重(Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:444-453(1970))。两条核苷酸序列之间的百分比同源性也可以利用利用GCG软件包的GAP程序来确定，其利用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重。本领域技术人员可以进行初始的同源性计算并因此调整算法参数。优选的参数组(以及如果操作者不确定应当应用哪些参数以确定分子是否在要求的同源性限制内，应当使用的参数组)是Blossum 62评分矩阵，空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。序列比对的其它方法是生物技术领域内已知的(参见例如，Rosenberg,BMC Bioinformatics,6:278(2005)；Altschul et al.,FEBS J.,272(20):5101-5109(2005))。
“等同位置”(例如，“等同的氨基酸位置”或“等同的核酸位置”)在本文中被定义为，当利用本文所述的比对算法进行最佳比对时，与参照多肽(或参照多核苷酸)序列的对应位置比对的测试多肽(或测试多核苷酸)序列的位置(诸如氨基酸位置或核酸位置)。测试多肽的等同氨基酸位置不需要与参照多肽的对应位置具有相同的数字位置编号。同样地，测试多核苷酸的等同核酸位置不需要与参照多核苷酸的对应位置具有相同的数字位置编号。
在一些实施方案中，oc-FA途径多肽是参照(例如，亲代)多肽的变体，诸如本文所述的示例性oc-FA途径多肽的变体。本文所用的“变体”(可选择地，“突变体”)多肽是指具有的氨基酸序列与亲代(例如，野生型)多肽的氨基酸序列相差至少一个氨基酸的多肽。与亲代多肽序列相比，变体可以包含一个或多个保守型氨基酸取代和/或可以包含一个或多个非保守型取代。在一些实施方案中，与亲代多肽序列相比，变体多肽具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺。在一些实施方案中，变体多肽的序列与亲代多肽的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一。
在一些实施方案中，oc-FA途径多肽是参照(例如，亲代)多肽的片段，诸如本文所述的示例性oc-FA途径多肽的片段。术语“片段”是指全长多肽的较短的一部分或大小范围为四个氨基酸至整个氨基酸序列减去一个氨基酸残基的蛋白。在本发明的某些实施方案中，片段是指多肽或蛋白的结构域(例如，底物结合结构域或催化结构域)的整个氨基酸序列。
在一些实施方案中，同源物、变体或片段包含本文限定的一个或多个序列基序。在一实施方案中，β-酮酯酰-ACP合酶多肽的同源物、变体或片段包含选自SEQ ID NO:14-19的一个或多个序列基序。确定序列含有特定序列基序可以容易地实现，例如，使用ExPASy蛋白质组学服务器的万维网网址上可利用的ScanProsite工具。
应当理解到，相对于亲代多肽，oc-FA多肽可以具有保守型或非必需的氨基酸取代，这对该oc-FA多肽的生物功能或性质没有实质影响。特定取代是否会被允许(即不会不利地影响例如酶促活性的所需生物功能)，可以按照Bowie et al.(Science,247:1306-1310(1990))中所述进行测定。
“保守型氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替代的取代。具有相似氨基酸侧链的氨基酸残基家族，在本领域中已有定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
变体可以是天然存在的或在体外产生。具体而言，变体可以利用基因工程技术来产生，例如定向诱变、随机化学诱变、核酸外切酶III酶切程序或标准克隆技术。可选择地，这样的变体、片段、类似物或衍生物可以利用化学合成或修饰程序产生。
制备变体的方法是本领域内公知的。这些包括这样的方案：其中获自天然分离物的核酸序列经修饰以产生编码多肽的核酸，所述多肽具有提高其在工业或实验室应用中的价值的特性(包括但不限于，增加的催化活性(转换数)、体改的稳定性和降低的反馈抑制)。在这样的方案中，产生并表征大量的修饰的核酸序列，其相对于获自天然分离物的序列具有一个或多个核苷酸的差异。通常，这些核苷酸差异导致氨基酸相对于天然分离物的核酸所编码的多肽发生改变。例如，变体可以利用随机或定点诱变来制备。
变体还可以通过体内诱变来产生。在一些实施方案中，核酸序列中的随机突变通过使细菌菌株(如大肠杆菌菌株)中的序列增殖来产生，所述序列携带一种或多种DNA修复途径的突变。这类“突变基因(mutator)”菌株比野生型菌株具有更高的随机突变率。使DNA序列在这些菌株之一当中增殖将最终在DNA内产生随机突变。适用于体内诱变的突变基因菌株描述于例如国际专利申请公开号WO 1991/016427中。
变体还可以利用盒式诱变来产生。在盒式诱变中，双链DNA分子的小区域用与天然序列不同的合成的寡核苷酸“盒”替代。所述寡核苷酸通常含有完全和/或部分随机化的天然序列。
递归总体诱变(Recursive-ensemble mutagenesis)也可以用于产生变体。递归总体诱变是开发的用于产生多样的表型相关的突变体群(其成员在氨基酸序列上不同)的蛋白工程(即蛋白诱变)算法。该方法使用反馈机制以控制组合盒式诱变的连续循环。递归总体诱变描述于例如，Arkin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,89:7811-7815(1992)中。
在一些实施方案中，变体利用指数总体诱变(exponential ensemblemutagenesis)产生。指数总体诱变是产生具有高百分比的独特的、功能突变体的组合文库的过程，其中小的残基组被平行地随机化，以鉴定每个改变的位置处产生功能蛋白的氨基酸。指数总体诱变描述于例如，Delegrave et al.,Biotech.Res,11:1548-1552(1993)中。
亲代多肽的优选的片段或变体(例如，亲代oc-FA途径多肽的片段或变体)保留所述亲代多肽的一些或全部生物功能或特性(例如，酶促活性、热稳定性)。在一些实施方案中，片段或变体保留亲代多肽的至少75％(例如，至少80％、至少90％或至少95％)的生物功能或特性。在其它实施方案中，片段或变体保留亲代多肽的约100％的生物功能或特性。
在一些实施方案中，在培养重组微生物细胞的条件下，相对于亲代多肽，亲代多肽的片段或变体表现出增加的催化活性(如通过以下所反映的：例如，对期望底物的更高的转换数、改变的pH最适条件、降低的Km，或对期望底物增加的kcat/Km)。例如，如果亲代多肽是嗜热细胞内源的(即从其产生)，并且如果重组微生物细胞通常在低于所述嗜热细胞的温度下培养，亲代多肽在该较低的温度表现出明显降低的活性。在这种情况下，在该较低的温度下，相对于所述亲代多肽，变体多肽优选表显出增加的催化活性(例如，更高的转换数)。
在其它实施方案中，在培养重组微生物细胞的条件下，相对于亲代多肽，亲代多肽的片段或变体表现出增强的稳定性。这种稳定性可以包括针对温度、离子强度、pH变化或重组微生物细胞和获得亲代多肽的细胞之间的生长或培养基条件中的任何其它差异的稳定性。例如，如果亲代多肽来源于嗜冷细胞，并且如果重组微生物细胞通常在高于所述嗜冷细胞的温度下培养，亲代多肽在该较高的温度下可能相对不稳定。在这种情况下，在该较高的温度下，相对于所述亲代多肽，变体多肽优选表显出增加的稳定性。
在其它实施方案中，在培养重组微生物细胞的条件下，相对于亲代多肽所表现出的细胞代谢物或培养基成分对催化活性的抑制，亲代多肽的片段或变体表现出降低的抑制(例如，降低的反馈抑制)。
在某些实施方案中，oc-FA途径多肽是亲代多肽的同源物、片段或变体，其中所述oc-FA途径多肽在重组微生物细胞中有效执行oc-FA途径反应。此类oc-FA途径多肽适用于本发明的重组微生物细胞中。
测试多肽(诸如例如，本文所述的oc-FA途径多肽或其同源物片段或变体)在执行oc-FA途径反应中的效力可以通过多种方法进行测定。例如，为了测定测试多肽在催化生物化学途径的特定反应中的效力，首先改造细胞(如果需要的话)以获得亲代细胞，其包含催化所考虑的生物化学途径的反应所需的所有活性，除了被测试的特定途径的反应(尽管在一些情况下，亲代细胞可以表达催化被测试的特定途径反应的内源多肽，但在这些情况下，内源活性优选足够低使得容易地检测产物中由于测试多肽活性而导致的增加)。与合适的启动子可操作连接(例如，在表达载体中)的编码测试多肽的多核苷酸，然后被引入亲代细胞，从而产生测试细胞。将测试细胞与亲代细胞分别培养在相同的条件下，该条件对于途径多肽在亲代细胞和测试细胞培养中的表达和测试多肽在测试细胞培养物中的表达是足够的。在培养过程中和/或培养后的多个时间时，从测试细胞培养物和亲代细胞培养物获得样品。分析样品中是否存在特定途径中间产物或产物。途径中间产物或产物的存在可以通过以下方法测定：包括但不限于，气相色谱法(GC)、质谱法(MS)、薄层色谱法(TLC)、高压液相色谱法(HPLC)、液相色谱法(LC)、与火焰电离检测器耦合的GC(GC-FID)、GC-MS和LC-MS。测试细胞培养物样品中oc-FA途径中间产物或产物的存在，以及亲代细胞培养物样品中oc-FA途径中间产物或产物的不存在(或降低的量)，指示测试多肽在执行oc-FA途径反应中是有效的，并且适合用于本发明的重组微生物细胞中。
重组微生物细胞中奇数链脂肪酸衍生物的产生
一方面，本发明包括制备奇数链脂肪酸衍生物组合物的方法，所述方法包括在有效表达重组多核苷酸序列的条件下，在含有碳源的培养基中培养本发明的重组微生物细胞，以及任选地分离所产生的奇数链脂肪酸衍生物组合物。
“奇数链脂肪酸衍生物组合物”(缩写为“oc-FA衍生物组合物”)是包含本文定义的奇数链脂肪酸衍生物，诸如例如，奇数链脂肪酸、奇数链脂肪酯(例如，奇数链脂肪甲酯、奇数链脂肪乙酯、奇数链蜡酯)、奇数链脂肪醛、奇数链脂肪醇、偶数链碳氢化合物(诸如偶数链烷烃、偶数链烯烃、偶数链端烯烃、偶数链内烯烃)或偶数链酮的组合物。类似地，“奇数链脂肪酸组合物”是包含奇数链脂肪酸的组合物，“奇数链脂肪醇组合物”是包含奇数链脂肪醇的组合物，“偶数链烷烃组合物”是包含偶数链烷烃的组合物，以此类推。应当理解，包含奇数链脂肪酸衍生物的组合物还可以包含偶数链脂肪酸衍生物。
一方面，本发明包括制备包含奇数链脂肪酸衍生物的组合物的方法，所述方法包括：获得重组微生物细胞(诸如包含重组微生物细胞的培养物)，其包含：(a)编码具有在重组微生物细胞中有效产生增加的量的丙酰辅酶A的酶促活性的多肽的多核苷酸，所述增加的量是相对于缺少所述酶促活性或具有降低量的所述酶促活性的亲代微生物细胞中产生的丙酰辅酶A的量，其中至少一种多肽对于所述重组微生物细胞而言是外源的，或者其中与亲代微生物细胞中的至少一种多核苷酸的表达相比，所述重组微生物细胞中所述多核苷酸的表达被调整；(b)编码具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的多核苷酸，所述β-酮酯酰-ACP合酶利用丙酰辅酶A作为底物；以及(c)一种或多种编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述重组微生物细胞在有效表达(a)、(b)和(c)的多核苷酸的条件下，在存在碳源的情况下培养时，产生包含奇数链脂肪酸衍生物和偶数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物；在有效表达(a)、(b)和(c)的多核苷酸并产生包含奇数链脂肪酸衍生物和偶数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物的条件下，在含有碳源的培养基中培养所述重组微生物细胞，以及任选地从所述培养基中回收所述组合物。
在一些实施方案中，所述组合物中至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％重量比的脂肪酸衍生物是奇数链脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包含量(例如效价)为至少10mg/L、至少15mg/L、至少20mg/L、至少25mg/L、至少50mg/L、至少75mg/L、至少100mg/L、至少125mg/L、至少150mg/L、至少175mg/L、至少200mg/L、至少225mg/L、至少250mg/L、至少275mg/L、至少300mg/L、至少325mg/L、至少350mg/L、至少375mg/L、至少400mg/L、至少425mg/L、至少450mg/L、至少475mg/L、至少500mg/L、至少525mg/L、至少550mg/L、至少575mg/L、至少600mg/L、至少625mg/L、至少650mg/L、至少675mg/L、至少700mg/L、至少725mg/L、至少750mg/L、至少775mg/L、至少800mg/L、至少825mg/L、至少850mg/L、至少875mg/L、至少900mg/L、至少925mg/L、至少950mg/L、至少975mg/L、至少1000mg/L、至少1050mg/L、至少1075mg/L、至少1100mg/L、至少1125mg/L、至少1150mg/L、至少1175mg/L、至少1200mg/L、至少1225mg/L、至少1250mg/L、至少1275mg/L、至少1300mg/L、至少1325mg/L、至少1350mg/L、至少1375mg/L、至少1400mg/L、至少1425mg/L、至少1450mg/L、至少1475mg/L、至少1500mg/L、至少1525mg/L、至少1550mg/L、至少1575mg/L、至少1600mg/L、至少1625mg/L、至少1650mg/L、至少1675mg/L、至少1700mg/L、至少1725mg/L、至少1750mg/L、至少1775mg/L、至少1800mg/L、至少1825mg/L、至少1850mg/L、至少1875mg/L、至少1900mg/L、至少1925mg/L、至少1950mg/L、至少1975mg/L、至少2000mg/L、至少3000mg/L、至少4000mg/L、至少5000mg/L、至少6000mg/L、至少7000mg/L、至少8000mg/L、至少9000mg/L、至少10000mg/L、至少20000mg/L或上述任意两个值界定的范围的奇数链脂肪酸衍生物。
在不同的实施方案中，脂肪酸衍生物酶活性包括硫酯酶活性、酯合酶活性、脂肪醛生物合成活性、脂肪醇生物合成活性、酮生物合成活性、和/或碳氢化合物生物合成活性。在一些实施方案中，重组微生物细胞包含编码两种或更多种多肽的多核苷酸，每种多肽具有脂肪酸衍生物酶活性。
在不同的实施方案中，重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪酸、奇数链脂肪酯、奇数链蜡酯、奇数链脂肪醛、奇数链脂肪醇、偶数链烷烃、偶数链烯烃、偶数链内烯烃、偶数链端烯烃或偶数链酮的组合物。
在不同的实施方案中，重组微生物细胞包含编码具有酶促活性的多肽的多核苷酸，所述酶促活性在所述重组微生物细胞中有效产生增加量的丙酰辅酶A，所述多核苷酸选自(i)编码具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性和苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸，或(ii)编码具有(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸，或(iii)编码具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性和/或甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性的多肽的多核苷酸，或(i)和(ii)，或(i)和(iii)，或(ii)和(iii)，或(i)、(ii)和(iii)，其中至少一种多肽对于所述重组微生物细胞而言是外源的，或者其中与亲代微生物细胞中的至少一种多核苷酸的表达相比，所述重组微生物细胞中所述多核苷酸的表达被调整。
包含通过本发明方法产生的奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物可以从所述重组微生物细胞培养物回收或分离。本文所用的术语“分离”相对于产物诸如脂肪酸衍生物而言，是指与细胞成分、细胞培养基或化学或合成前体分开的产物。通过本文所述的方法产生的脂肪酸衍生物在发酵液以及细胞质中可以是相对不混合的。因此，可以在细胞外或细胞内在有机相中收集脂肪酸衍生物。有机相中产物的收集可以减少脂肪酸衍生物对细胞功能的影响，并且可以允许重组微生物细胞产生更多的产物。
在一些实施方案中，对通过本发明方法产生的脂肪酸衍生物组合物(其包含奇数链脂肪酸衍生物)进行纯化。本文所用的术语“纯化(purify)”、“纯化的”或“纯化(purification)”表示通过例如分离或分开从其环境中移出或分离分子。“基本上纯化的”分子是至少约60％(例如至少70％、至少约75％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％)不含与其相关的其它成分。如本文所使用的，这些术语还指从样品去除污染物。例如，去除污染物能够导致样品中脂肪酸衍生物(诸如，脂肪酸或脂肪醇或脂肪酯或碳氢化合物)的百分比相对于其它成分增加。例如，当重组微生物细胞中产生脂肪酯或脂肪醇时，可以通过去除重组微生物细胞蛋白来纯化脂肪酯或脂肪醇。纯化之后，样品中脂肪酯或脂肪醇的百分比相对于其它成分提高。
本文所用的术语“纯化(purify)”、“纯化的”或“纯化(purification)”是不需要绝对纯的相对术语。因此，例如，当重组微生物细胞中产生脂肪酸衍生物组合物时，纯化的脂肪酸衍生物组合物是与其它细胞成分(例如，核酸、多肽、脂质、碳水化合物或其它碳氢化合物)基本上分离的脂肪酸衍生物组合物。
脂肪酸衍生物组合物(其包含奇数链脂肪酸衍生物)可以存在于细胞外环境中，或者其可以从重组微生物细胞的细胞外环境分离。在某些实施方案中，脂肪酸衍生物从重组微生物细胞分泌出来。在其它实施方案中，脂肪酸衍生物被运输至细胞外环境中。在其它实施方案中，脂肪酸衍生物被被动运输至细胞外环境中。可以利用本领域已知的方法从重组微生物细胞分离脂肪酸衍生物。
基于双重碳同位素指纹谱或14C测定年代法，脂肪酸衍生物(包括根据本发明方法产生的奇数链脂肪酸衍生物)可以区别于来自石化产品的碳的有机化合物。此外，可以通过双重碳同位素指纹谱确定生物来源的碳的具体来源(例如葡萄糖与甘油相比)(参见，例如美国专利第7,169,588号)。
区别由重组微生物细胞产生的脂肪酸衍生物与基于石油的有机化合物的能力对于在商业中追踪这些物质是有益的。例如，包含基于生物学的和基于石油的碳同位素谱两者的有机化合物或化学品可以区别于仅由基于石油的原料制备的有机化合物和化学品。因此，可以根据按本发明方法制备的材料的独特的碳同位素谱在商业中追踪它们。
通过比较每份燃料中稳定的碳同位素比(13C/12C)，可以区别由重组微生物细胞产生的脂肪酸衍生物与基于石油的有机化合物。给定的根据本发明方法产生的脂肪酸衍生物中13C/12C比是二氧化碳固定时大气二氧化碳中的13C/12C比的结果。它还反映精确的新陈代谢途径。还存在区域变化。石油、C3植物(阔叶植物)、C4植物(草)和海洋碳酸盐均表现出13C/12C比和相应的δ13C值的显著差异。此外，作为新陈代谢途径的结果，C3和C4植物的脂质物质与来自相同植物的碳水化合物成分的材料分析上是不同的。
13C测量标尺最初通过由Pee Dee Belemnite(PDB)石灰石所设定的零所定义，其中值是以从该物质的偏差的千分比给出。“δ13C”值以每千分比部分(千分)表达，简写为‰，并且按照以下计算：δ13C(‰)＝[(13C/12C)样品-(13C/12C)标准]/(13C/12C)标准×1000
在一些实施方案中，根据本发明方法产生的脂肪酸衍生物具有约-30或更大、约-28或更大、约-27或更大、约-20或更大、约-18或更大、约-15或更大、约-13或更大或约-10或更大的δ13C。可选择地或另外，脂肪酸衍生物具有约-4或更小、约-5或更小、约-8或更小、约-10或更小、约-13或更小、约-15或更小、约-18或更小或约-20或更小的δ13C。因此，脂肪酸衍生物可以具有由上述端点的任意两个所界定的δ13C。例如，脂肪酸衍生物可以具有约-30至约-15、约-27至约-19、约-25至约-21、约-15至约-5、约-13至约-7或约-13至约-10的δ13C。在一些实施方案中，脂肪酸衍生物可以具有约-10、-11、-12或-12.3的δ13C。在其它实施方案中，脂肪酸衍生物具有约-15.4或更大的δ13C。在其它实施方案中，脂肪酸衍生物具有约-15.4至约-10.9的δ13C，或者约-13.92至约-13.84的δ13C。
还可以通过比较每种化合物中14C的量来区分由重组微生物细胞产生的脂肪酸衍生物与石油来源的有机化合物。因为14C具有5730年的核半衰期，包含“较老的”碳的基于石油的燃料可以区别于包含“较新的”碳的脂肪酸或其衍生物(参见，例如Currie,"SourceApportionment of Atmospheric Particles",Characterization of EnvironmentalParticles,J.Buffle and H.P.van Leeuwen,Eds.,Vol.I of the IUPAC EnvironmentalAnalytical Chemistry Series Lewis Publishers,Inc.,pp.3-74(1992))。
本文所用的“现代碳比例(fraction of modern carbon)”或“fM”与分别由称为草酸标准HOxI和HOxII的国家标准技术研究院(National Institute of Standards andTechnology(NIST))标准参考物(SRMs)4990B和4990C所定义的具有相同意义。基本定义涉及0.95倍的14C/12C同位素比例HOxI(参考AD 1950)。这粗略地等于衰变校正的工业革命前树木(decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)。对于现今生命生物圈(植物物质)而言，fM约为1.1。
在一些实施方案中，根据本发明方法产生的脂肪酸衍生物具有至少约1，例如至少约1.003、至少约1.01、至少约1.04、至少约1.111、至少约1.18或至少约1.124的fM 14C。可选择地或另外，脂肪酸衍生具有约1.130或更小，例如约1.124或更小、约1.18或更小、约1.111或更小、或约1.04或更小的fM 14C。因此，脂肪酸衍生物可以具有由上述端点的任意两个所界定的fM 14C。例如，脂肪酸衍生物可以具有约1.003至约1.124的fM 14C、约1.04至约1.18的fM 14C、或约1.111至约1.124的fM 14C。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，在此通过引用并入本文，其程度如同单独地，具体地指出每一篇参考文献通过引用并入并全文展示在本文中。
本发明上下文(尤其是所附权利要求书的上下文)中术语“一个(a)”、“一种(an)”、“所述(the)”及相似表述应当被解释为覆盖单数及复数，除非本文指出并非如此或上下文明确相悖。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括，但不限于”)，除非指出并非如此。本文记载的数值范围仅仅意图充当落入该范围内的单独提及的每个单独的数值的速记法，除非本文指出并非如此，并且每个单独的数值都并入本说明书，如同在本文单独记载一样。本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行，除非本文指出并非如此或上下文明确相悖。本文提供使用的任何和所有实例，或示例性语言(“例如”、“诸如”)仅仅意图用于更好地说明本发明，而并不会造成对本发明范围的限制，除非声称并非如此。说明书中没有语言应当被解释为将任何没有请求保护的元件指示为实施本发明所必需的。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的实施本发明的最佳实施方式。在阅读完前述说明书之后，那些优选实施方案的变型对于本领域技术人员而言是显而易见的。本发明人预期本领域技术人员能按需要利用此类变型，并且本发明人意图按本文具体描述之外的方式来实施本发明。因此，本发明包括适用法律许可的在此所附的权利要求书中记载的主题的所有修改和等同项。而且，其所有可能变型中的上述元件的任何组合都包括在本发明中，除非本文指出并非如此或上下文明确相悖。
实施例
培养基组分：
Che-9培养基：M9补充有额外的NH4Cl(额外的1g/L)、Bis-Tris缓冲液(0.2M)、Triton X-100(0.1％v/v)和微量元素(27mg/L FeCl3·6H2O、2mg/L ZnCl·4H2O、2mg/LCaCl2·6H2O、2mg/L Na2MoO4·2H2O、1.9mg/LCuSO4·5H2O、0.5mg/L H3BO3、100mL/L浓HCl)。
2NBT：Che-9补充有20g/L(2％w/v)葡萄糖。
4NBT：Che-9补充有40g/L(4％w/v)葡萄糖。
实施例1.细菌菌株和质粒
大肠杆菌MG1655ΔfadE(菌株“D1”)
本实施例描述了脂肪酸降解酶表达被减弱的重组微生物细胞的构建。利用Datsenko,K.A.et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645(2000))描述的Red体系从大肠杆菌菌株MG1655删除了大肠杆菌的fadE基因(也称为yafH)，其编码涉及脂肪酸降解的酰基辅酶A脱氢酶(GenBank登录号AAC73325)，其中对所述体系进行了如下修改。
以下两条引物被用于制备fadE缺失：
Del-fadE-F 5’AAAAACAGCAACAATGTGAGCTTTGTTGTAATTATATTGTAAACATATTGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO:82)；和
Del-fadE-R 5’AAACGGAGCCTTTCGGCTCCGTTATTCATTTACGCGGCTTCAACTTTCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO:83)
Del-fadE-F和Del-fadE-R引物被用于通过PCR从质粒pKD13(Datsenko et al.,同上)扩增卡那霉素抗性(KmR)盒。随后将PCR产物用于转化包含质粒pKD46的电感受态的大肠杆菌MG1655细胞，所述质粒表达Red重组酶(Datsenko et al.,同上)，其在先前已用树胶醛糖诱导了3-4小时。于37℃在SOC培养基中生长3小时后，将细胞涂布在含50μg/mL卡那霉素的Luria琼脂平板上。37℃培养过夜后鉴定抗性菌落并分离。fadE基因的破坏通过利用引物fadE-L2和fadE-R1进行PCR扩增在一些菌落中得到确认，其被设计为位于大肠杆菌fadE基因的侧翼。
fadE-L2 5’-CGGGCAGGTGCTATGACCAGGAC(SEQ ID NO:84)；和
fadE-R1 5’-CGCGGCGTTGACCGGCAGCCTGG(SEQ ID NO:85)
确认fadE缺失后，采用单菌落、利用pCP20质粒(Datsenko et al.,同上)去除KmR标记。生成的缺失fadE基因并去除了KmR标记的MG1655大肠杆菌菌株被命名为大肠杆菌MG1655ΔfadE或菌株“D1”。
大肠杆菌MG1655ΔfadE_ΔtonA(菌株“DV2”)
本实施例描述了脂肪酸降解酶表达和外膜蛋白受体表达被减弱的重组微生物细胞的构建。利用根据Datsenko et al.,同上的Red系统从菌株D1(上述的)删除了大肠杆菌MG1655的tonA(也称为fhuA)基因，其编码铁色素外膜运输物，还用作噬菌体受体(GenBank登录号NP_414692)，其中对所述系统进行了如下修改。
用于制备tonA缺失的引物为：
Del-tonA-F 5’-ATCATTCTCGTTTACGTTATCATTCACTTTACATCAGAGATATACCAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO:86)；和
Del-tonA-R 5’-GCACGGAAATCCGTGCCCCAAAAGAGAAATTAGAAACGGAAGGTTGCGGTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO:87)
Del-tonA-F和Del-tonA-R引物被用于通过PCR从质粒pKD13扩增卡那霉素抗性(KmR)盒。将以这种方式得到的PCR产物用于转化含pKD46(Datsenko et al.,同上)的电感受态的大肠杆菌MG1655D1细胞，所述细胞先前已用树胶醛糖诱导3-4小时。于37℃在SOC培养基中生长3小时后，将细胞涂布在含50μg/mL卡那霉素的Luria琼脂平板上。37℃培养过夜后鉴定并分离抗性菌落。tonA基因的破坏通过利用大肠杆菌tonA基因侧翼的以下引物进行PCR扩增在一些菌落中得到确认：tonA-verF和tonA-verR：
tonA-verF 5’-CAACAGCAACCTGCTCAGCAA(SEQ ID NO:88)；和
tonA-verR 5’-AAGCTGGAGCAGCAAAGCGTT(SEQ ID NO:89)
确认tonA缺失后，采用单菌落、利用pCP20质粒(Datsenko et al.,同上)去除KmR标记。生成的具有fadE和tonA基因缺失的MG1655大肠杆菌菌株被命名为大肠杆菌MG1655ΔfadEΔtonA或菌株“DV2”。
大肠杆菌MG1655ΔfadE_ΔtonA lacI:tesA(菌株“DV2‘tesA”)
本实施例描述了包含编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸的重组微生物细胞的构建。编码大肠杆菌酰基辅酶A硫酯酶I(EC3.1.1.5,3.1.2.-；例如GenBank登陆号AAC73596；SEQ ID NO:64)的tesA多核苷酸序列经修饰以去除前导序列，使得生成的‘tesA基因产物被截短25个氨基酸，并且处于原始位置26的氨基酸——丙氨酸被蛋氨酸取代，其随后成为'TesA多肽序列的第1个氨基酸(SEQ ID NO:65；Cho et al.,J.Biol.Chem.,270:4216-4219(1995))。
利用下述引物从质粒pACYC-PTrc-tesA(实施例1，如下)经PCR扩增含有可操作地连接至PTrc启动子的‘tesA编码序列加上卡那霉素抗性基因的整合盒：lacI-正向：GGCTGGCTGGCATAAATATCTC(SEQ ID NO:90)，和lacZ-反向：GCGTTAAAGTTGTTCTGCTTCATCAGCAGGATATCCTGCACCATCGTCTGGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAAC(SEQ ID NO:91)，经电穿孔注入菌株DV2，并利用从pKD46质粒(Datsenko et al.,同上)表达的Red重组酶整合到染色体中。在添加有卡那霉素的LB平板上挑选转化株。利用诊断性PCR评估正确的整合。
pDG2表达载体
pDG2表达载体为下述的许多构建物的碱性质粒。pCDFDuet-1载体(Novagen/EMDBiosciences)携带由CloDF13复制子、lacI基因和链霉素/大观霉素抗性基因(aadA)。为了构建pDG2质粒，利用下述引物从大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增了plsX基因的C端部分，其含有下游fabH基因(Podkovyrov and Larson,Nucl.Acids Res.(1996)24(9):1747-1752(1996))的内部启动子：
5’-TGAATTCCATGGCGCAACTCACTCTTCTTTTAGTCG-3’(SEQ ID NO:92)，和
5’-CAGTACCTCGAGTCTTCGTATACATATGCGCT CAGTCAC-3’(SEQ ID NO:93)。这些引物引入末端附近的NcoI和XhoI限制位点，以及内部NdeI位点。
用限制酶NcoI和XhoI消化plsX插入物(含有EcfabH启动子)和pCDFDuet-1载体。用南极碱性磷酸酶(Antarctic phosphatase)处理切割的载体。将插入物连接至载体并转化至转化感受态大肠杆菌细胞。通过DNA测序筛选克隆。pDG2质粒序列在本文提供为SEQ IDNO:73。
FabH表达质粒
利用pDG2质粒构建了pDG6质粒，其表达枯草芽孢杆菌FabH1。利用下述引物从枯草芽孢杆菌菌株168扩增了fabH1编码序列：
5’-CCTTGGGGCATATGAAAGCTG-3’(SEQ ID NO:94)和
5’-TTTAGTCATCTCGAGTGCACCTCACCTTT-3’(SEQ ID NO:95)。这些引物在扩增产物末端引入NdeI和XhoI限制位点。
用限制酶NdeI和XhoI消化fabH1插入物和pDG2载体。用南极磷酸酶处理切割的载体。将插入物连接至载体并转化至转化感受态大肠杆菌细胞中。通过DNA测序筛选克隆。pDG6质粒序列在本文提供为SEQ ID NO:74，并在EcfabH启动子的控制下表达枯草芽孢杆菌FabH1多肽(SEQ ID NO:2)。
使用与pDG6质粒所采用的类似的策略制备基于pDG2的其他质粒。质粒pDG7包含枯草芽孢杆菌fabH2编码序列，其表达枯草芽孢杆菌FabH2多肽(SEQ ID NO:3)。质粒pDG8包含天蓝色链霉菌fabH编码序列，其表达天蓝色链霉菌FabH多肽(SEQ ID NO:4)。
pACYC-PTrc-tesA和pACYC-PTrc2-tesA质粒
通过利用下述引物从pTrcHis2A(Invitrogen,Carlsbad,CA)PCR扩增lacIq、PTrc启动子和终止子区域构建质粒pACYC-PTrc：
pTrc_F TTTCGCGAGGCCGGCCCCGCCAACACCCGCTGACG(SEQ ID NO:96)，和
pTrc_R AAGGACGTCTTAATTAATCAGGAGAGCGTTCACCGACAA(SEQ ID NO:97)
然后用AatII和NruI消化PCR产物，并插入至用AatII和ScaI消化的质粒pACYC177(Rose,R.E.,Nucleic Acids Res.,16:356(1988))。pACYC-PTrc载体的核苷酸序列在本文提供为SEQ ID NO:75。
为了产生pACYC-PTrc2质粒，在pACYC-PTrc质粒的PTrc启动子中引入了单点突变，以产生启动子变体PTrc2和pACYC-PTrc2质粒。野生型PTrc启动子序列在本文提供为SEQ ID NO:76，并且PTrc2启动子变体在本文提供为SEQ ID NO:77。
编码大肠杆菌酰基辅酶A硫酯酶I(TesA,EC 3.1.1.5,3.1.2.-；例如GenBank登录号AAC73596；SEQ ID NO:64)的核苷酸序列经修饰以去除前导序列，使得生成的‘tesA基因产物被截短25个氨基酸，并且位于原始位置26的氨基酸——丙氨酸被取代为蛋氨酸，其随后成为'TesA多肽(SEQ ID NO:65；Cho et al.,J.Biol.Chem.,270:4216-4219(1995))的第1个氨基酸。将编码‘TesA多肽的DNA插入至pACYC-PTrc载体和pACYC-PTrc2载体的NcoI和EcoRI位点，分别生成pACYC-PTrc-‘tesA和pACYC-PTrc2-‘tesA质粒。通过限制消化确认‘tesA序列至质粒的正确插入。
pOP80质粒
通过用限制酶AflII和SfoI消化克隆载体pCL1920(GenBank AB236930；LernerC.G.和Inouye M.,Nucleic Acids Res.18:4631(1990))构建pOP80质粒。通过该消化产生了3个DNA片段。利用凝胶纯化试剂盒(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)经凝胶纯化3737bp片段。同时，通过利用下述引物PCR扩增来自商购质粒pTrcHis2(Invitrogen,Carlsbad,CA)的含PTrc启动子和lacI区的DNA序列片段：LF302(5’-atatgacgtcGGCATCCGCTTACAGACA-3’,SEQID NO:98)和LF303(5’-aattcttaagTCAGGAGAGCGTTCACCGACAA-3’,SEQ ID NO:99)，分别引入ZraI和AflII酶的识别位点。纯化后，根据供应商(New England BioLabs Inc.,Ipswich,MA)的说明书，利用PCR扩增试剂盒(Qiagen,Inc.Valencia,CA)纯化PCR产物，并用ZraI和AflII消化。消化后，经凝胶纯化PCR产物并与源自pCL1920的3737bp DNA序列片段连接，以产生含PTrc启动子的表达载体pOP80。
单核细胞增生李斯特氏菌fabH1和fabH2质粒(pTB.079和pTB.081)
利用下述引物，将单核细胞增生李斯特氏菌Li23(ATCC 19114D-5)的基因组DNA用作模板扩增fabH基因：
TREE044(fabH_正向)GAGGAATAAACCATGAACGCAGGAATTTTAGGAGTAG(SEQ ID NO:100)；
引物61(fabH_反向)CCCAAGCTTCGAATTCTTACTTACCCCAACGAATGATTAGG(SEQ ID NO:101)
然后将PCR产物克隆至pDS80(基于pCL1920的载体，携带噬菌体λPL启动子；SEQ IDNO:78)的NcoI/EcoRI位点，并转化至转化感受态大肠杆菌细胞。挑取单个克隆以用于克隆的插入物的序列确认。野生型单核细胞增生李斯特氏菌fabH的核酸序列编码野生型LmFabH1蛋白(SEQ ID NO:7)，并且表达该序列的质粒被命名为pTB.079。
发现突变型单核细胞增生李斯特氏菌fabH基因在位置928处含有T到G的改变，引起表达的蛋白在氨基酸位置310处由色氨酸(W)改变为甘氨酸(G)，即，W310G变体。编码FabHW310G变体(SEQ ID NO:8)的突变型单核细胞增生李斯特氏菌fabH基因被命名为LmFabH2，且表达该序列的质粒被命名为pTB.081。
基于pOP80的fabH表达质粒
从所示模板和引物(表6)经PCR扩增每个基因。除了在PffabH中使用大肠杆菌密码子优化的序列(SEQ ID NO:150)外，使用了每个基因的天然序列形式。通过DNA2.0(MenloPark,CA)合成基因PffabH(opt)、DpfabH1和DpfabH2。用引物PTrc_载体_F和PTrc_载体_R(表7)、利用质粒OP80作为模板，还对克隆载体进行了PCR扩增。然后采用InFusion克隆(Clontech,Mountain View CA)将不同的fabH基因克隆至经PCR扩增的OP80载体骨架中。遵循生产商概述的标准方案。所有的构建物通过测序加以确认。
表6.FabH基因、引物和模板
Figure BDA0001375943360000791
表7.FabH引物序列
Figure BDA0001375943360000792
Figure BDA0001375943360000801
实施例2.改造大肠杆菌以用于通过途径(A)生产奇数链脂肪酸
以下实施例描述了重组大肠杆菌菌株的构建，其表达编码酶的外源基因和/或过表达编码酶的内源基因，所述酶用于通过图2的途径(A)增加从中间产物苏氨酸和α-酮丁酸至丙酰辅酶A的代谢流，引起这些重组细胞中奇数链酰基-ACP和奇数链脂肪酸衍生物产生的增加。
本实施例还证明了减弱内源基因表达以及用外源基因将其取代对oc-FA生产的影响；在本实施例中，编码β-酮酯酰-ACP合酶的内源性大肠杆菌fabH基因的表达通过基因缺失而被减弱，并且β-酮酯酰-ACP合酶活性通过外源性枯草芽孢杆菌fabH1基因的表达提供。
DV2 PL thrA*BC
构建了重组大肠杆菌菌株，其中涉及苏氨酸生物合成的染色体基因被置于染色体整合的强γPL启动子的控制下，并且一个基因发生了突变。
为了在天然天冬氨酸激酶I(thrA)基因中诱导单一突变，从大肠杆菌MG1655DNA的两个部位扩增了该基因。第一部位用引物TREE026和TREE028扩增，而第二部位用TREE029和TREE030扩增(表6)。用于扩增两个组件的引物含有重叠序列，其随后被用于将单个片段“缝合”在一起。在单个PCR反应中将两个PCR产物组合，并结合引物TREE026和TREE030以扩增完整thrA基因。引物TREE028和TREE029经设计以在天然thrA中的密码子345处制备突变，其产生天冬氨酸激酶I的S345F变体(SEQ ID NO:21)。已表明该突变通过寄主菌株中的苏氨酸消除酶的反馈抑制(Ogawa-Miyata,Y.,et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.65:1149-1154(2001)；Lee J.-H.,et al.,J.Bacteriol.185:5442-5451(2003))。该基因的修饰形式被命名为“thrA*”。
使用引物Km_trc_overF和TREE027(表8)、利用质粒pDS80(基于pCL1920的载体，携带噬菌体λPL启动子；SEQ ID NO:78)作为模板，扩增PL启动子。随后将该片段缝合至侧翼为FRT位点的卡那霉素抗性盒，其利用引物TREE025和Km_trc_overR(表8)从质粒pKD13扩增而来。生成的含有KmFRT盒和PL启动子的PCR产物被缝合至thrA*PCR产物。将引物TREE025和TREE030用来扩增完整KmFRT-PL-thrA*诱变盒。这些引物还含有5’端的整合位点的约50bp的同源物，并且整个thrA基因在3’端作为同源物，将该盒靶向大肠杆菌中的天然thrA位点，其为包含thrA、thrB和thrC基因的操纵子的一部分。将该诱变盒经电穿孔注入亲代菌株——大肠杆菌DV2(实施例1)，其含有表达Red重组酶的助质粒pKD46(Datsenko et al.,同上)。在卡那霉素存在下挑选含有染色体整合的克隆，并通过诊断性PCR加以确认。然后通过pCP20质粒(Datsenko et al.,同上)的表达去除卡那霉素标记。通过PCR和测序确认合适的整合和标记去除。在产生的菌株中突变的thrA*基因和内源性thrB和thrC基因通过染色体整合的λPL启动子过表达，其被命名为DV2PL thrA*BC。
表8：引物
Figure BDA0001375943360000811
Figure BDA0001375943360000821
DV2 PL thrA*BC PL tdcB
通过将额外拷贝的基因整合至lacZ位点，并将其置于染色体整合的γPL启动子控制下，天然大肠杆菌代谢性苏氨酸脱氨酶(tdcB)基因(也称为苏氨酸脱氨酶)被过表达。
代谢性苏氨酸脱氨酶催化苏氨酸降解为α-酮-丁酸酯，其为苏氨酸降解/异亮氨酸生产途径的第一个反应。催化的反应可能包括水的初始去除(因为早期将该酶归类为苏氨酸脱水酶)，随后的产物异构化和水解，其中C-N键破裂。已表明该基因的表达增加能极大地增加异源性有机体中异亮氨酸的水平(Guillouet S.et al.,Appl.Environ.Microbiol.65:3100-3107(1999))。此外，苏氨酸脱氨酶对异亮氨酸反馈机制(Guillouet et al.,同上)具有相对抗性。
利用引物TREE020和TREE021(表8)扩增大肠杆菌MG1655基因组DNA，以获得天然tdcB基因。同时，引物Kan/Chlor 1和Kan/Chlor 4(表8)被用于扩增用于先前所述的整合挑选/筛选的FRT-卡那霉素抗性盒。利用大肠杆菌MG1655基因组DNA作为模板，使用引物EG238和TREE018(表8)扩增与lacZ整合位点同源的3’区，而引物TREE022和TREE023(表8)被用于扩增与lacZ位点同源的5’区。将质粒pDS80(基于pCL1920的载体，携带噬菌体λPL启动子；SEQ ID NO:78)用作模板，通过使用引物TREE017和TREE018(表8)扩增含PL启动子的片段。这些片段中的每个都设计为具有对应的邻近片段的重叠，并利用重叠衍生PCR(SOEingPCR)技术缝合在一起。生成的PL tdcB诱变盒(约4.3kb)包含5’端整合位点的约700bp的同源物，和3’端整合位点的750bp的同源物。将PL tdcB诱变盒经电穿孔注入寄主菌株——大肠杆菌DV2PL thrA*BC(见上)，其含有助质粒pKD46(Datsenko et al.,同上)。在卡那霉素存在下挑选含有染色体整合的克隆，并通过PCR和测序分析加以验证。然后使用pCP22质粒(Datsenko et al.,同上)去除卡那霉素标记。产生的菌株被命名为DV2PLthrA*BC PL tdcB。用质粒pACYC-ptrc2-‘tesA(实施例1)转化菌株，其表达截短形式的大肠杆菌tesA。
菌株还用表达枯草芽孢杆菌FabH1酶的质粒pDG6(实施例1)转化。进行了发酵实验，并测定了游离脂肪酸(FFA)、奇数链脂肪酸(oc-FA)和产生为oc-FA的FFA部分的滴度，如实施例5和表11所示。可选地，可以用用表达不同FabH多肽的质粒转化菌株，例如表达枯草芽孢杆菌FabH2的pDG7、表达天蓝色链霉菌FabH的pDG8、表达单核细胞增生李斯特氏菌FabH的pTB.079、表达单核细胞增生李斯特氏菌FabH W310G变体的pTB.081或实施例5和表12A-12C中描述的FabH质粒。进行了发酵实验，并测定了游离脂肪酸(FFA)、奇数链脂肪酸(oc-FA)和产生为oc-FA的FFA部分的滴度。
DV2 PL-thrA*BC PT5-BsfabH1
构建了重组大肠杆菌菌株，其中枯草芽孢杆菌fabH1基因被整合至染色体，并被置于强构成性T5启动子的转录控制下。
首先，生成了PCR产物，以用于loxPcat整合盒的染色体整合，所述整合盒在DV2PLthrA*B的fadE缺失口位点处包含氯霉素抗性基因、T5启动子(PT5)和BsfabH1编码序列。首先对整合盒的单个组件作PCR扩增。loxP-cat-loxP PT5组件利用引物TREE133和TREE135(表9)从质粒p100.38(SEQ ID NO:79)扩增而来。BsfabH1基因利用引物TREE134和TREE136从携带BsfabH1基因的质粒扩增而来。引物TREE133和TREE136包含5’和3’端50bp的同源序列，以用于整合。用于扩增组件的引物包含重叠序列，其随后被用于将单个片段“缝合”在一起。通过在单个PCR反应中将两个片段组合，以及使用引物TREE133和TREE136，将loxP-cat-PT5和BsfabH1PCR产物缝合在一起，以扩增最终的loxPcat-PT5-BsfabH1整合盒。
表9：引物
Figure BDA0001375943360000831
Figure BDA0001375943360000841
利用Red重组酶体系(Datsenko,et al.,同上)整合loxP-cat-PT5-BsfabH1盒。loxP-cat-PT5-BsfabH1PCR产物被用于转化含质粒pKD46的电感受态DV2PL-thrA*BC细胞，其在先前已于30℃用树胶醛糖诱导3-4小时。37℃在SOC培养基中生长3小时后，将细胞涂布在含17μg/mL氯霉素的Luria琼脂平板上，并在37℃孵育过夜。通过PCR筛选合适的loxP-cat-PT5-BsfabH1整合的氯霉素抗性克隆。位于染色体整合位点侧翼的引物fadE-L2和fadE-R2(表9)被用于确认整合。确认整合后，通过表达促进位于氯霉素抗性基因侧翼的两个loxP位点间的重组的Cre重组酶去除氯霉素标记基因。将具有cre重组酶基因的质粒pJW168转化至菌株DV2PL-thrA*BC loxP-cat-PT5-BsfabH1，并根据Palmeros et al.(Gene 247:255-264(2000))描述的方法去除标记。产生的菌株DV2PL-thrA*BC PT5-BsfabH1通过测序加以确认。
DV2 PL-thrA*BC PT5-BsfabH1 ΔEcfabH
构建了重组大肠杆菌菌株，其中内源基因(在此情况下为大肠杆菌的fabH基因)的表达通过缺失该基因而被减弱。
利用Red重组体系(Datsenko et al.,同上)从DV2PL-thrA*BCPT5-BsfabH1删除大肠杆菌的fabH基因。引物TREE137和TREE138(表9)被用于通过PCR扩增来自质粒pKD13的卡那霉素抗性盒。然后将PCR产物用于转化含质粒pKD46的电感受态DV2PL-thrA*BC PT5-BsfabH1细胞。根据Wanner和Datsenko(同上)描述的方法进行EcfabH缺失和卡那霉素标记去除。引物TREE139和TREE140被用于确认EcfabH缺失。最终无标记的菌株被命名为DV2PL-thrA*BC PT5-BsfabH1ΔEcfabH。
DV2 PL-thrA*BC PL-tdcB PT5-BsfabH1 ΔEcfabH
构建的重组大肠杆菌菌株含有图2和图1B分别所示的途径(A)和oc-FA生物合成途径的步骤(D)的染色体整合基因过表达酶。将PL-tdcB诱变盒(按如上所述制备)整合至菌株DV2PL-thrA*BC PT5-BsfabH1ΔEcfabH，以产生菌株DV2PL-thrA*BC PL-tdcB PT5-BsfabH1ΔEcfabH。在该菌株中，整合的大肠杆菌thrA*BC基因和整合的大肠杆菌tdcB基因都位于强λPL启动子的控制下，整合的枯草芽孢杆菌fabH1基因位于强T5启动子的控制下，且内源大肠杆菌fabH基因缺失。进行了发酵实验，且结果提供在表11中。
实施例3.改造大肠杆菌以用于通过途径(B)制备奇数链脂肪酸
下述实施例描述了表达编码酶的外源基因和/或过表达编码酶的内源基因的重组大肠杆菌菌株的构建，所述酶用于通过图2的途径(B)增加从中间产物柠苹酸和α-酮丁酸至丙酰辅酶A的代谢流，引起这些重组细胞中奇数链酰基-ACP和奇数链脂肪酸衍生物产生的增加。
DV2 PTrc-cimA3.7 leuBCD
为了制备过表达内源性leuBCD基因和外源性cimA3.7基因的大肠杆菌菌株，生成了PCR产物以用于KmFRT盒、PTrc启动子和内源性染色体大肠杆菌leuA和leuB基因间的cimA3.7的染色体整合。该整合破坏了天然leuABCD操纵子，将操纵子中的cimA3.7和leuBCD置于强IPTG诱导性启动子——PTrc的控制下。
通过Geneart AG(雷根斯堡，德国)合成编码CimA3.7的DNA。将DNA克隆至质粒pMK-RQ(kanR)(Geneart AG,雷根斯堡，德国)的SfiI位点。将编码序列侧翼的5’KpnI限制位点和3’SacI限制位点分别引入ATG起始密码子的直接上游和TAA终止密码子的正下游。cimA 3.7克隆载体通过测序加以确认。
按如下经PCR扩增整合盒的单个组件。KmFRT组件利用引物TREE146和Km_trc_overR(表10)从质粒pKD13扩增而来。PTrc启动子利用引物Km_trc_overF和TREE033从pOP80(实施例1)扩增而来。
cimA3.7编码序列利用引物TREE032和TREE035从上述cimA 3.7克隆载体扩增而来。为了提供用于整合的3’同源序列，大肠杆菌天然leuBC基因利用大肠杆菌基因组DNA和引物TREE034和TREE104扩增而来。用于扩增KmFRT盒的正向引物TREE146包含用于整合的5’50bp的同源序列。用于扩增组件的每条引物都含有重叠序列，其被用于将单个片段“缝合”在一起。首先，通过将两个片段在单个PCR反应中组合并使用引物TREE146和TREE033将KmFRT和PTrc缝合在一起，以扩增KmFRT-PTrc产物。然后利用引物TREE146和TREE035缝合KmFRT-PTrc和cimA3.7，以产生KmFRT-PTrc-cimA3.7。利用引物TREE146和TREE104将最终的片段leuBC与KmFRT-PTrc-cimA3.7缝合，以生成最终的整合盒：KmFRT-PTrc-cimA3.7leuBC。
表10：引物
Figure BDA0001375943360000861
利用Red重组体系(Datsenko et al.,同上)将KmFRT-PTrc-cimA3.7leuBC盒整合至大肠杆菌基因组。KmFRT-PTrc-cimA3.7leuBC PCR产物被用于转化含质粒pKD46的电感受态大肠杆菌MG1655DV2细胞，所述质粒在先前已于30℃用树胶醛糖诱导3-4小时。37℃在SOC培养基中生长3小时后，将细胞涂布在含50μg/mL卡那霉素的Luria琼脂平板上，并于37℃孵育过夜。通过PCR筛选合适的KmFRT-PTrc-cimA3.7整合的卡那霉素抗性克隆。位于染色体郑盒位点侧翼的引物TREE151和TREE106被用于确认整合。确认整合后，根据Datsenko et al(同上)描述的方法去除卡那霉素标记基因。最终菌株DV2PTrc cimA3.7leuBCD中PTrc-cimA3.7的成功整合和卡那霉素标记基因的成功去除通过测序加以确认。
用表达截短形式的大肠杆菌tesA的质粒pACYC-ptrc2-tesA，以及在一些情形下表达枯草芽孢杆菌fabH1的pDG6转化菌株。进行了发酵实验，并且游离脂肪酸(FFA)、奇数链脂肪酸(oc-FA)和产生为oc-FA的FFA部分的滴度提供在表11中。
实施例4.改造大肠杆菌以用于通过(A)和(B)组合途径生产奇数链脂肪酸
下述实施例描述了表达编码酶的外源基因和/或过表达编码酶的内源基因的重组大肠杆菌菌株的构建，所述酶用于通过图2的(A)和(B)组合途径增加从常见中间产物α-酮丁酸到丙酰辅酶A的代谢流，引起这些重组细胞中oc-酰基-ACP和奇数链脂肪酸的甚至更大的生产。
DV2 PL-thrA*BC PTrc-cimA3.7_leuBCD PT5-BsfabH1ΔEcfabH(菌株“G1”)
为了开始图2的(A)和(B)组合途径，将PTrc-cimA3.7_leuBCD盒(实施例5)整合至菌株DV2PL-thrA*BC PT5-BsfabH1ΔEcfabH(实施例4)，以产生菌株DV2PL-thrA*BC PTrc-cimA3.7_leuBCD PT5-BsfabH1ΔEcfabH，其也称为菌株G1。该菌株根据oc-FA途径的途径(B)过表达具有(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽，并根据oc-FA途径的途径(A)过表达具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性和苏氨酸合酶活性的多肽(图2)。
DV2 PL-thrA*BC PL-tdcB PTrc-cimA3.7_leuBCD PT5-BsfabH1 ΔEcfabH(菌株 “G2”)
为了制备经改造过表达具有对应于oc-FA途径的(A)和(B)组合途径的活性的多肽的菌株，将PL-tdcB盒(实施例4)整合至菌株G1，以产生菌株DV2PL-thrA*BC PL-tdcB PTrc-cimA3.7_leuBCD PT5-BsfabH1ΔEcfabH，其也称为菌株G2。在该菌株中，整合的大肠杆菌thrA*BC基因和整合的大肠杆菌tdcB基因(编码对应于(A)的具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性和苏氨酸脱氨酶活性的多肽)被置于强λPL启动子的控制下，并被过表达。外源性cimA3.7基因和天然大肠杆菌leuBCD基因(编码具有对应途径(B)的(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽)也被整合至大肠杆菌染色体，处于强IPTG诱导性启动子PTrc的控制下，并因此也被过表达。编码对应于oc-FA途径的(D)部分的支链β酮酯酰-ACP合酶的整合的枯草芽孢杆菌fabH1基因(图1B)，也处于强T5启动子的控制下。内源性大肠杆菌fabH基因从该菌株缺失。
实施例5.奇数链脂肪酸生产的评估
下述实施例展示了经改造以表达编码酶的外源基因和/或过表达编码酶的内源基因的大肠杆菌菌株中线性奇数链脂肪酸的产生，所述酶经苏氨酸依赖性途径(图2的途径(A))或经柠苹酸途径(图2的途径(B))，增加通过常见的α-酮丁酸酯中间产物的代谢流，以产生丙酰辅酶A。丙酰辅酶A，其用作奇数链脂肪酸生产的“引发”分子，然后通过β-酮酯酰-ACP合酶III(FabH)的作用与丙二酰ACP缩合以形成奇数链β-酮酯酰-ACP中间产物，该中间产物进入脂肪酸合酶循环以产生奇数链脂肪酸和oc-FA衍生物。因此，本实施例还展示了外源性FabH酶对奇数链脂肪酸产生的影响。
在第一组实验中，通过利用4N-BT方案进行96深孔盘发酵评估了菌株的游离脂肪酸(FFA)产生。单一克隆或来自甘油储液的刮屑被用于接种300μL的LB+抗生素。将LB种子培养物于37℃在250rpm震荡下培养6-8小时直至浑浊。20μL的LB培养物被用于接种400μL的2N-BT。允许其于32℃在250rpm震荡下生长过夜。第二天早上，将20μL的2N-BT培养物转移至400μL的4N-BT。允许4N-BT培养物于32℃在250rpm震荡下生长6小时，此时用1mM IPTG诱导细胞。诱导后，允许培养物生长额外的16-18小时，然后提取并分析FFA产生。每孔加入40μL的1M HCl，然后加入400μL添加有500mg/L C24烷烃内标物的的乙酸丁酯。通过在2000rpm涡旋15分钟提取细胞。提取物用等量的N,O-二(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化，然后通过GC/MS分析。
表11：重组大肠杆菌菌株中奇数链脂肪酸的产生
Figure BDA0001375943360000891
所有滴度均为毫克每升(mg/L)
FFA＝游离脂肪酸(oc-FA+ec-FA)
oc-FA＝奇数链脂肪酸；ec-FA＝偶数链脂肪酸
Ec＝染色体(天然)大肠杆菌fabH基因
ΔEc＝缺失的染色体大肠杆菌fabH基因
pBsH1＝质粒表达的BsfabH1(pDG6质粒)
IntBsH1＝染色体整合的BsfabH1
p＝质粒表达的‘tesA基因(pACYC-pTrc2-tesA)
int＝染色体整合的‘tesA基因
这些实验中产生的奇数链脂肪酸通常包含C13:0、C15:0、C17:0和C17:1脂肪酸，其中C15:0为主要产生的oc-FA。
表11中的菌株1和2的比较表明过表达涉及生物合成和苏氨酸降解的基因的微生物细胞明显地增加了细胞产生的奇数链长度脂肪酸的比例，所述基因增加了通过中间产物α-酮丁酸酯途径的代谢流。虽然亲代DV2菌株产生直链脂肪酸和仅可忽略量的奇数链长度脂肪酸，但过表达thrA*BC和tdcB基因(编码具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性和苏氨酸脱氨酶活性的多肽)的DV2菌株产生明显更大量和明显更大比例的奇数链长度脂肪酸；产生的约18％(根据重量)的直链脂肪酸为奇数链长度脂肪酸。
菌株2和3证明通过包含入对丙酰辅酶A具有高特异性的外源性β-酮酯酰ACP合酶对oc-FA产生了影响。菌株2含有天然(内源性)大肠杆菌fabH基因。通过引入表达枯草芽孢杆菌fabH1基因的质粒，oc-FA产生从产生的直链脂肪酸的约18％(在菌株2中)显著地增加至约37％(在菌株3中)。
当内源性大肠杆菌fabH基因缺失且枯草芽孢杆菌fabH1基因被染色体整合时观察到对oc-FA产生的显著的影响。在菌株4中，oc-FA的产生增加至产生的直链脂肪酸的72％。
菌株5和6证明依据另一方式(此时为通过包括柠苹酸生物合成和降解的途径)通过α-酮丁酸增加代谢流也增加了产生的奇数链长度脂肪酸的比例。改造DV2菌株以过表达cimA3.7和leuBCD基因(编码具有(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽)引起产生的约4％的直链脂肪酸具有奇数链长度，其在包含有质粒表达的枯草芽孢杆菌fabH1时增加至约13％。
菌株7和9显示了组合苏氨酸和柠苹酸途径对oc-FA产生的影响。在菌株G1中，thrA*BC、cimA3.7和leuBCD基因被过表达，内源性大肠杆菌fabH基因缺失，且枯草芽孢杆菌fabH1基因被染色体整合，产生的约26％的直链脂肪酸为奇数链脂肪酸。在菌株G2中，thrA*BC、tdcB、cimA3.7和leuBCD基因被过表达，内源性大肠杆菌fabH基因缺失，且枯草芽孢杆菌fabH1基因被染色体整合，产生的约90％的直链脂肪酸为奇数链脂肪酸。‘tesA基因在Tn7结合位点被染色体整合的菌株G1/Tn7-tesA和G/Tn7-tesA(分别为菌株8和10)，显示了类似于‘tesA基因被质粒表达的菌株G1和G2(分别为菌株7和9)的那些的oc-FA量和比例。
在第二组实验中，检测了丙酰辅酶A产生对oc-FA产生的作用和FabH酶对其的影响。在这些实验中，外源性fabH编码序列被克隆至pOP80表达载体(实施例1)，其中表达受到强PTrc启动子的控制。将fabH表达构建物(或在缺少外源性fabH的菌株中，仅pOP80载体)联合‘tesA质粒pACYC-PTrc2-tesA转化至以下菌株：
·DV2
·DV2cimA3.7_leuBCD(丙酰辅酶A经图2的柠苹酸途径(B)增加)
·DV2thrA*BC tdcB(丙酰辅酶A经图2的苏氨酸依赖性途径(A)增加)
单克隆或来自冷冻甘油储液的刮屑被用于接种300μL的LB+抗生素。LB种子培养物于37℃在250rpm震荡下生长6-8小时直至浑浊。20μL的LB培养物被用于接种400μL的2N-BT培养基。允许其于32℃在250rpm震荡下生长过夜至少14小时。第二天早上，将20μL的2N-BT培养物转移至400μL的4N-BT。允许4N-BT培养物于32℃在250rpm震荡下生长6小时，此时用1mM IPTG诱导细胞。诱导后，允许培养物生长额外的20-22小时，然后提取并分析游离脂肪酸(FFA)产生。每孔加入40μL的1M HCl，然后加入400μL的乙酸丁酯。通过在2000rpm涡旋15分钟提取细胞。将提取物用等量的N,O-二(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化，然后通过GC结合火焰电离检测器(GC-FID)分析。
表达各种fabH基因的菌株产生的奇数链脂肪酸相对于总游离脂肪酸的比率提供在如下的表12A-C中。对照DV2菌株中产生的奇数链脂肪酸比率提供在表12A中，而经改造用于增加的代谢流的菌株中奇数链脂肪酸与经由柠苹酸途径(图2的途径(B))或苏氨酸依赖性途径(图2的途径(A))的丙酰辅酶A的比率分别显示在表12B和12C中。
表12A：重组大肠杆菌菌株中奇数链脂肪酸的产生
Figure BDA0001375943360000911
Figure BDA0001375943360000921
表12B：通过图2的柠苹酸途径(B)具有增加的丙酰辅酶A流的重组大肠杆菌菌株中的奇数链脂肪酸产生。
Figure BDA0001375943360000922
表12C：通过图2的苏氨酸依赖性途径(A)具有增加的丙酰辅酶A流的重组大肠杆菌菌株中的奇数链脂肪酸产生。
Figure BDA0001375943360000923
Figure BDA0001375943360000931
所有滴度均为毫克每升(mg/L)
所有链均还含有质粒表达的‘tesA(pACYC-pTrc2-tesA)
FFA＝游离脂肪酸(oc-FA+ec-FA)
oc-FA＝奇数链脂肪酸；ec-FA＝偶数链脂肪酸
Ec＝染色体(天然)大肠杆菌fabH基因
pCL-BsH1＝pOP80表达的枯草芽孢杆菌fabH1
pCL-BsH2＝pOP80表达的枯草芽孢杆菌fabH2
pCL-LmH＝pOP80表达的单核细胞增生李斯特氏菌fabH
pCL-LmH2＝pOP80表达的单核细胞增生李斯特氏菌fabH2
pCL-PfH(opt)＝pOP80表达的费氏丙酸杆菌fabH(密码子优化的)
pCL-SmH＝pOP80表达的嗜麦芽糖寡养单胞菌fabH
pCL-AaH＝pOP80表达的酸热脂环酸杆菌fabH
pCL-DpH1＝pOP80表达的丙酸脱硫叶菌fabH1
pCL-DpH2＝pOP80表达的丙酸脱硫叶菌fabH2
表12A-12C中所示的所有菌株均表达内源性大肠杆菌fabH基因。菌株2-10每个都还额外含有质粒表达的外源性fabH基因。表11(如上)表明相比含内源性大肠杆菌fabH加质粒表达的外源性枯草芽孢杆菌fabH1的菌株(表11，菌株3)，内源性大肠杆菌fabH基因缺失和外源性枯草芽孢杆菌fabH1基因的染色体整合产生更大量和更大比例的oc-FA(表11，菌株4)。然而，表12A-12C展示的结果证明：(a)丙酰辅酶A为细菌中重组线性奇数链脂肪酸产生所必需的前体，因为经改造用于评估α-酮丁酸和丙酰辅酶A水平--DV2cimA3.7leuBCD(表12B)和DV2thrA*BC tdcB(表12C)的菌株中测试的所有fabH表达性菌株均展现显著的线性oc-脂肪酸产生--但在DV2对照菌株(表12A)中未观察到明显的oc-脂肪酸产生，和(b)重组线性oc-脂肪酸的产生在多种异源性FabH酶存在下发生，所述酶分离自这样的有机体，其膜包含有支链脂肪酸和/或奇数链脂肪酸。此类FabH酶能在脂肪酸生物合成的引发反应中利用丙酰辅酶A分子，并赋予重组微生物奇数链脂肪酸生物合成能力。
总之，本实施例证明可以通过增加通过丙酰辅酶A的代谢流和表达利用丙酰辅酶A的β-酮酯酰合酶(FabH)，改造通常产生偶数链脂肪酸的微生物，以产生奇数链脂肪酸。实施例6(如下)展示了可以被改造用以增加通过丙酰辅酶A的代谢流的可选途径。还可以进一步修饰经改造用以产生奇数脂肪酸的重组微生物，以产生奇数链脂肪酸衍生物，如奇数链脂肪醇(实施例7)和偶数链烷烃(实施例8)。
实施例6：通过途径(C)改造大肠杆菌用于产生奇数链脂肪酸
下述实施例描述了表达编码酶的外源性基因和/或过表达编码酶的内源性基因的重组大肠杆菌菌株的构建，所述酶用于增加通过中间产物——甲基丙二酰辅酶A的代谢流，以通过图3的途径(C)制备丙酰辅酶A，引起这些重组细胞中奇数链酰基-ACP和奇数链脂肪酸衍生物产生的增加。具体来说，本实施例描述了在质粒上过表达内源性甲基丙二酰辅酶A变位酶(scpA/sbm)和甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(scpB/ygfG)基因的大肠杆菌菌株中奇数链脂肪酸的产生，并且染色体丙酰辅酶A:琥珀酰辅酶A转移酶(scpC/ygfH)和scpB/ygfG基因缺失。
按实施例1中所述制备大肠杆菌菌株DV2、质粒pDG6(表达枯草芽孢杆菌FabH1)和质粒pACYC-pTrc2-tesA(表达截短的‘TesA多肽)。
质粒pACYC-PTrc-sbm-ygfG
质粒pACYC-PTrc-sbm-ygfG为pACYC-PTrc质粒(实施例1)，其过表达编码甲基丙二酰辅酶A变位酶的大肠杆菌sbm和编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶的大肠杆菌ygfG。pACYC-PTrc-sbm-ygfG的序列在本文中提供为SEQ ID NO:80。
菌株sDF4
菌株sDF4为大肠杆菌菌株DV2，其中染色体scpB和scpC基因缺失，天然frd启动子被取代为trc启动子，且‘tesA基因在Tn7结合位点被染色体整合。
为了整合‘tesA基因，首先通过利用下述引物扩增pACYC-PTrc-‘tesA质粒(实施例1)制备了PTrc-‘tesA整合盒：
IFF:5’-GGGTCAATAGCGGCCGCCAATTCGCGCGCGAAGGCG(SEQ ID NO:140)
IFR:5’-TGGCGCGCCTCCTAGGGCATTACGCTGACTTGACGGG(SEQ ID NO:141)
将整合盒插入至pGRG25(GenBank登录号DQ460223)的NotI和AvrII限制位点，制备Tn7tes质粒(SEQ ID NO:81)，其中lacIq、PTrc-‘tesA盒两翼为左侧和右侧Tn7端。
为了制备菌株sDF4，首先利用McKenzie et al.,BMC Microbiology6:39(2006)描述的方案将质粒Tn7tes经电穿孔注入大肠杆菌菌株DV2(实施例1)。电穿孔后，通过于32℃在含0.1％葡萄糖和100μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中培养过夜，挑选氨苄青霉素抗性细胞。其后利用32℃下细胞在LB加0.1％树胶醛糖平板上的生长过夜，挑选包含Tn7转座部分的质粒。挑选单克隆并划线于新的有或无氨苄青霉素的LB培养平板上，并使其在42℃生长过夜，以矫正Tn7tes质粒。因此，lacIq、PTrc-‘tesA被整合至大肠杆菌染色体上位于pstS和glmS基因间的attTn7位点。这些基因的整合通过PCR和测序加以确认。产生的菌株被命名为DV2 Tn7-tesA。
为了从DV2Tn7-tesA删除scpBC基因，使用了以下两条引物：
ScpBC-KOfwd 5’-GCTCAGTGAATTTATCCAGACGCAATATTTTGATTAAAGGAATTTTTATGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO:142)；和
ScpBC-KOrc 5’-ATTGCTGAAGATCGTGACGGGACGAGTCATTAACCCAGCATCGAGCCGGTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO:143)
ScpBC-KOfwd和ScpBC-KOrc引物被用于通过PCR从质粒pKD13(Datsenko et al.,同上)扩增卡那霉素抗性(KmR)盒。然后将PCR产物用于转化包含质粒pKD46的电感受态大肠杆菌DV2Tn7-tesA细胞，所述质粒表达Red重组酶(Datsenko et al.,同上)，其在先前已用树胶醛糖诱导3-4小时。于37℃在SOC培养基中生长3小时后，将细胞涂布在含50μg/mL卡那霉素的Luria琼脂平板上。37℃培养过夜后鉴定和分离抗性克隆。scpBC基因的破坏通过利用设计的位于染色体scpBC基因侧翼的下述引物PCR扩增加以确认：
ScpBC检测-60fwd 5’-CGGGTTCTGACTTGTAGCG(SEQ ID NO:144)
ScpBC检测+60rc 5’-CCAACTTCGAAGCAATGATTGATG(SEQ ID NO:145)
确认scpBC缺失后，挑取单克隆并用于利用pCP20质粒(Datsenko et al.,同上)去除KmR标记。利用Datsenko et al.(同上)的方案的修改将天然延胡索酸还原酶(frd)启动子取代为PTrc启动子。生成的大肠杆菌DV2ΔscpBC::FRT、ΔPfrd::FRT-PTrc、attTn7::PTrc-‘tesA菌株被命名为“sDF4”。
用如下所示的质粒转化菌株，并利用实施例5所述的96深孔盘发酵方案评估其脂肪酸产生；因为ScpA为B-12依赖性酶，4N-BT培养基添加有钴胺素。
表13：重组大肠杆菌菌株中奇数链脂肪酸的产生
Figure BDA0001375943360000961
所有滴度均为毫克每升(mg/L)
FFA＝游离脂肪酸(oc-FA+ec-FA)
oc-FA＝奇数链脂肪酸；ec-FA＝偶数链脂肪酸
Ec＝染色体大肠杆菌fabH基因；pBsH1＝质粒表达的BsfabH1(pDG6)
p＝质粒表达的‘tesA基因(pACYC-pTrc2-tesA)；
int＝染色体整合的‘tesA基因
过表达涉及经由中间产物琥珀酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A的丙酰辅酶A产生的基因的微生物细胞增加了细胞产生的奇数链长度脂肪酸的比例。虽然DV2菌株(表13的菌株1)仅产生可忽略量的奇数链长度脂肪酸，过表达内源性大肠杆菌sbm和ygfG基因(编码具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性和甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的多肽)的sDF4菌株产生增加量的奇数链长度脂肪酸。
表13的菌株2和3通过包含入对丙酰辅酶A具有高特异性的外源性β-酮酯酰ACP合酶展示对oc-FA产生的影响。菌株2含有天然大肠杆菌fabH基因。通过引入表达枯草芽孢杆菌fabH1基因的质粒，oc-FA产生从菌株2中产生的脂肪酸的约4％进一步增加至菌株3中产生的脂肪酸的约16％。
实施例7：在大肠杆菌中生产奇数链脂肪醇
以下展示了通过先前描述的菌株生产奇数链脂肪醇，其在本实施例中还表达具有酰基-ACP还原酶(AAR)活性的多肽。AAR活性将oc-酰基-ACP中间产物转化为oc-脂肪醛，其与内源性醛还原酶反应形成oc-脂肪醇。
用质粒pLS9185或pDS171s转化菌株DV2、DV2PL-thrA*BC PL-tdcB PT5-BsfabH1ΔEcfabH和G1(分别按实施例1、2和4中所述制备)。质粒pLS9185表达聚球蓝细菌脂肪酰基-ACP还原酶(AAR；GenBank登录号YP_400611)。质粒pDS171s表达细长聚球蓝细菌AAR、来自蓝细菌点状念珠藻的酰基载体蛋白(ACP)(cACP；GenBank登录号YP_001867863)和来自枯草芽孢杆菌的磷酸泛酞琉基乙胺基转移酶(Sfp；GenBank登录号YP_004206313)。利用实施例5所述的96深孔盘发酵方案评估了这些菌株的脂肪醇产生。
表14：在重组大肠杆菌菌株中生产奇数链脂肪醇
Figure BDA0001375943360000971
Figure BDA0001375943360000981
所有滴度均为毫克每升(mg/L)
FAlc＝脂肪醇(oc-FAlc+ec-FAlc)
oc-FAlc＝奇数链脂肪醇；ec-FAlc＝偶数链脂肪醇
ΔEcFabH＝缺失的染色体大肠杆菌fabH基因
IntBsH1＝染色体整合的BsfabH1
pLS9185＝质粒表达的AAR
pDS171s＝质粒表达的AAR、cACP和Sfp
相比对照菌株DV2，当转染表达AAR的质粒或表达AAR、cACP和Sfp的质粒时，菌株DV2thrA*BC tdcB BsfabH1ΔEcfabH和G1均产生明显更高滴度和比例的奇数链脂肪醇(表14)。产生为奇数链脂肪醇的脂肪醇的比例大致反映了评估这些菌株的脂肪酸产生时观察到的比例(表11)，表明AAR不显示对类似总链长的奇数或偶数链脂肪酰基-ACP的偏好性。
实施例8：在大肠杆菌中生产偶数链烷烃
下述实施例展示了通过表达具有酰基-ACP还原酶(AAR)活性的多肽和具有醛脱羰酶(ADC)活性的多肽的菌株生产偶数链烷烃。AAR活性将oc-酰基-ACP中间产物转化为oc-脂肪醛，并且ADC活性将oc-脂肪醛脱羧形成偶数链(ec-)烷烃。
用质粒pLS9185和pLS9181转化菌株DV2、DV2thrA*BC tdcBBsfabH1ΔEcfabH和G1(分别按实施例1、2和4中所述制备)。质粒pLS9185表达细长聚球蓝细菌脂肪酰基-ACP还原酶(AAR；GenBank登录号YP_400611)。质粒pLS9181表达点状念珠藻醛脱羰酶(ADC；GenBank登录号YP_001865325)。利用以上实施例5中所述的96深孔盘发酵方案(但在诱导时添加了25μM MnSO4(终浓度))分析了用两种质粒转化的菌株的烷烃产生。
表15：在重组大肠杆菌菌株中生产偶数链烷烃
Figure BDA0001375943360000991
所有滴度均为毫克每升(mg/L)
Alk＝烷烃(oc-Alk+ec-Alk)；oc-Alk＝奇数链烷烃；ec-Alk＝偶数链烷烃
ΔEcFabH＝缺失了染色体大肠杆菌fabH基因
IntBsFabH1＝染色体整合BsfabH1
AAR＝质粒表达的aar基因(pLS9185)
ADC＝质粒表达的adc基因(pLS9181)
相比对照菌株DV2，当转染表达AAR和ADC的质粒时，DV2 thrA*BC tdcB BsfabH1ΔEcfabH和G1均产生明显更高滴度和比例的偶数链烷烃(表15)。产生为偶数链烷烃的烷烃的比例大致反映了评估这些菌株的脂肪酸产生(表11)和脂肪醇产生(表14)时产生的奇数链产物的比例，表明ADC如AAR，未在可比较总链长的奇数或偶数链底物间显示偏好性。
应当理解虽然本发明结合其详细描述进行描述，前述描述旨在阐释且不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围界定。其他方面、优势和修改位于以下权利要求的范围内。
优选的实施方式：
1.重组微生物细胞，其包含：
(a)编码具有在所述重组微生物细胞中有效产生增加的量的丙酰辅酶A的酶活性的多肽的多核苷酸，所述增加的量是相对于缺少或具有减少的量的所述酶活性的亲代微生物细胞中产生的丙酰辅酶A的量，其中所述多肽为所述重组微生物细胞外源性的，或其中相比所述亲代微生物细胞中所述多核苷酸的表达，所述重组微生物细胞中所述多核苷酸的表达被调节，
(b)编码具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的多核苷酸，和
(c)编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸，
其中于有效表达(a)、(b)和(c)所述的多核苷酸的条件下，在碳源存在下培养时，所述重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物，并且
其中所述脂肪酸衍生物组合物中至少10％的所述脂肪酸衍生物为奇数链脂肪酸衍生物。
2.如项目1所述的重组微生物细胞，其中所述脂肪酸衍生物组合物中至少20％的所述脂肪酸衍生物为奇数链脂肪酸衍生物。
3.如项目1所述的重组微生物细胞，其中所述细胞产生至少100mg/L的奇数链脂肪酸衍生物。
4.如项目1所述的重组微生物细胞，其中(a)所述的多核苷酸中的至少一个的表达通过所述多核苷酸在所述重组微生物细胞中的过表达而被调节。
5.如项目1所述的重组微生物细胞，其中(a)所述的多核苷酸选自：
(i)一个或多个编码具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性和苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；
(ii)一个或多个编码具有(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸；和
(iii)一个或多个编码具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性和甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性的多肽的多核苷酸。
6.如项目5所述的重组微生物细胞，其包含一个或多个(i)所述的多核苷酸，以及一个或多个(ii)所述的多核苷酸。
7.如项目1所述的重组微生物细胞，其中所述具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽为所述重组微生物细胞外源性的，并且所述重组微生物细胞内源性的具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的表达被减弱。
8.如项目1所述的重组微生物细胞，其中所述脂肪酸衍生物酶活性包括硫酯酶活性，并且所述重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪酸的脂肪酸组合物，
其中所述组合物中至少10％的脂肪酸为奇数链脂肪酸。
9.如项目1所述的重组微生物细胞，其中所述脂肪酸衍生物酶活性包括酯合成酶活性，并且所述重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪酯的脂肪酯组合物，
其中所述组合物中至少10％的脂肪酯为奇数链脂肪酯。
10.如项目1所述的重组微生物细胞，其中所述脂肪酸衍生物酶活性包括脂肪醛生物合成活性，并且所述重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪醛的脂肪醛组合物，
其中所述组合物中至少10％的脂肪醛为奇数链脂肪醛。
11.如项目1所述的重组微生物细胞，其中所述脂肪酸衍生物酶活性包括脂肪醇生物合成活性，并且所述重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪醇的脂肪醇组合物，
其中所述组合物中至少10％的脂肪醇为奇数链脂肪醇。
12.如项目1所述的重组微生物细胞，其中所述脂肪酸衍生物酶活性包括碳氢化合物生物合成活性，并且所述重组微生物细胞产生包含偶数链碳氢化合物的碳氢化合物组合物，
其中所述组合物中至少10％的碳氢化合物为偶数链碳氢化合物。
13.包含项目1所述的重组微生物细胞的细胞培养物。
14.制备包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物的方法，所述方法包括：
获得项目1所述的重组微生物细胞，
于有效表达(a)、(b)和(c)所述的多核苷酸，并产生包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物的条件下，在含有碳源的培养基中培养所述重组微生物细胞，其中所述组合物中至少10％的脂肪酸衍生物为奇数链脂肪酸衍生物，和
任选地从所述培养基中回收所述奇数链脂肪酸衍生物组合物。
15.如项目14所述的方法，其中所述重组微生物细胞表达一个或多个编码选自以下的具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸：
(1)具有硫酯酶活性的多肽；
(2)具有脱羧酶活性的多肽；
(3)具有羧酸还原酶活性的多肽；
(4)具有醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)的多肽；
(5)具有醛脱羧酶活性(EC 4.1.99.5)的多肽；
(6)具有酰基辅酶A还原酶活性(EC 1.2.1.50)的多肽；
(7)具有酰基-ACP还原酶活性的多肽；
(8)具有酯合酶活性(EC 3.1.1.67)的多肽；
(9)具有OleA活性的多肽；和
(10)具有OleCD或OleBCD活性的多肽；
其中所述重组微生物细胞产生组合物，其包含奇数链脂肪酸、奇数链脂肪酯、奇数链脂肪醛、奇数链脂肪醇、偶数链烷烃、偶数链烯烃、偶数链端烯烃、偶数链内烯烃或偶数链酮类中的一种或多种。
16.制备重组微生物细胞的方法，所述重组微生物细胞产生比亲代微生物细胞所产生的滴度更高或比例更高的奇数链脂肪酸衍生物，所述方法包括：
获得亲代微生物细胞，其包含编码具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的多核苷酸，以及编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸，和
改造所述亲代微生物细胞以获得重组微生物细胞，其在相同的条件下培养时，相比所述亲代微生物细胞产生的丙酰辅酶A的量，产生或能产生更大量的丙酰辅酶A，
其中当在碳源存在下、于有效表达所述多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生更高滴度或更高比例的奇数链脂肪酸衍生物，所述更高滴度或更高比例是相对于相同的条件下培养的所述亲代微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物的滴度或比例。
17.如项目16所述的方法，其中所述改造所述亲代微生物细胞的步骤包括：
改造所述亲代微生物细胞以表达编码选自以下的多肽的多核苷酸：
(a)具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性和苏氨酸脱氨酶活性的多肽；
(b)具有(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽；和
(c)具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性或甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性，以及任选地，甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性的多肽；
其中(a)、(b)或(c)所述的至少一种多肽为所述亲代微生物细胞外源性的，或其中相比亲代微生物细胞中所述多核苷酸的表达，(a)、(b)或(c)所述的至少一种多核苷酸的表达在所述重组微生物细胞被调节。
18.如项目16所述的方法，其中所述重组微生物细胞经改造以表达编码具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的外源性多核苷酸，并且编码具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的内源性多核苷酸的表达被减弱。
19.增加微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物的滴度或比例的方法，所述方法包括：
获得产生脂肪酸衍生物的亲代微生物细胞，和
改造所述亲代微生物细胞以获得重组微生物细胞，其在相同的条件下培养时，相比亲代微生物细胞产生的丙酰辅酶A的量，产生或能产生更大量的丙酰辅酶A，
其中当在碳源存在下、于在所述重组微生物细胞中有效产生丙酰辅酶A和脂肪酸衍生物的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生更高滴度或更高比例的奇数链脂肪酸衍生物，所述更高滴度或更高比例是相对于相同的条件下培养的所述亲代微生物细胞产生的奇数链脂肪酸衍生物的滴度或比例。
20.通过项目14所述的方法制备的脂肪酸衍生物组合物。
序列表
<110> LS9公司
<120> 在重组微生物细胞中制备奇数链脂肪酸衍生物
<130> LS00033 PCT/CIP
<140>
<141>
<150> 13/232,927
<151> 2011-09-14
<150> 61/383,086
<151> 2010-09-15
<160> 169
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 317
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 1
Met Tyr Thr Lys Ile Ile Gly Thr Gly Ser Tyr Leu Pro Glu Gln Val
1 5 10 15
Arg Thr Asn Ala Asp Leu Glu Lys Met Val Asp Thr Ser Asp Glu Trp
20 25 30
Ile Val Thr Arg Thr Gly Ile Arg Glu Arg His Ile Ala Ala Pro Asn
35 40 45
Glu Thr Val Ser Thr Met Gly Phe Glu Ala Ala Thr Arg Ala Ile Glu
50 55 60
Met Ala Gly Ile Glu Lys Asp Gln Ile Gly Leu Ile Val Val Ala Thr
65 70 75 80
Thr Ser Ala Thr His Ala Phe Pro Ser Ala Ala Cys Gln Ile Gln Ser
85 90 95
Met Leu Gly Ile Lys Gly Cys Pro Ala Phe Asp Val Ala Ala Ala Cys
100 105 110
Ala Gly Phe Thr Tyr Ala Leu Ser Val Ala Asp Gln Tyr Val Lys Ser
115 120 125
Gly Ala Val Lys Tyr Ala Leu Val Val Gly Ser Asp Val Leu Ala Arg
130 135 140
Thr Cys Asp Pro Thr Asp Arg Gly Thr Ile Ile Ile Phe Gly Asp Gly
145 150 155 160
Ala Gly Ala Ala Val Leu Ala Ala Ser Glu Glu Pro Gly Ile Ile Ser
165 170 175
Thr His Leu His Ala Asp Gly Ser Tyr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Pro
180 185 190
Asn Ala Asp Arg Val Asn Pro Glu Asn Ser Ile His Leu Thr Met Ala
195 200 205
Gly Asn Glu Val Phe Lys Val Ala Val Thr Glu Leu Ala His Ile Val
210 215 220
Asp Glu Thr Leu Ala Ala Asn Asn Leu Asp Arg Ser Gln Leu Asp Trp
225 230 235 240
Leu Val Pro His Gln Ala Asn Leu Arg Ile Ile Ser Ala Thr Ala Lys
245 250 255
Lys Leu Gly Met Ser Met Asp Asn Val Val Val Thr Leu Asp Arg His
260 265 270
Gly Asn Thr Ser Ala Ala Ser Val Pro Cys Ala Leu Asp Glu Ala Val
275 280 285
Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Gly Gln Leu Val Leu Leu Glu Ala Phe
290 295 300
Gly Gly Gly Phe Thr Trp Gly Ser Ala Leu Val Arg Phe
305 310 315
<210> 2
<211> 312
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III (FabH1)"
<400> 2
Met Lys Ala Gly Ile Leu Gly Val Gly Arg Tyr Ile Pro Glu Lys Val
1 5 10 15
Leu Thr Asn His Asp Leu Glu Lys Met Val Glu Thr Ser Asp Glu Trp
20 25 30
Ile Arg Thr Arg Thr Gly Ile Glu Glu Arg Arg Ile Ala Ala Asp Asp
35 40 45
Val Phe Ser Ser His Met Ala Val Ala Ala Ala Lys Asn Ala Leu Glu
50 55 60
Gln Ala Glu Val Ala Ala Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Val Ala Thr
65 70 75 80
Val Thr Pro Asp Gln Ser Phe Pro Thr Val Ser Cys Met Ile Gln Glu
85 90 95
Gln Leu Gly Ala Lys Lys Ala Cys Ala Met Asp Ile Ser Ala Ala Cys
100 105 110
Ala Gly Phe Met Tyr Gly Val Val Thr Gly Lys Gln Phe Ile Glu Ser
115 120 125
Gly Thr Tyr Lys His Val Leu Val Val Gly Val Glu Lys Leu Ser Ser
130 135 140
Ile Thr Asp Trp Glu Asp Arg Asn Thr Ala Val Leu Phe Gly Asp Gly
145 150 155 160
Ala Gly Ala Ala Val Val Gly Pro Val Ser Asp Asp Arg Gly Ile Leu
165 170 175
Ser Phe Glu Leu Gly Ala Asp Gly Thr Gly Gly Gln His Leu Tyr Leu
180 185 190
Asn Glu Lys Arg His Thr Ile Met Asn Gly Arg Glu Val Phe Lys Phe
195 200 205
Ala Val Arg Gln Met Gly Glu Ser Cys Val Asn Val Ile Glu Lys Ala
210 215 220
Gly Leu Ser Lys Glu Asp Val Asp Phe Leu Ile Pro His Gln Ala Asn
225 230 235 240
Ile Arg Ile Met Glu Ala Ala Arg Glu Arg Leu Glu Leu Pro Val Glu
245 250 255
Lys Met Ser Lys Thr Val His Lys Tyr Gly Asn Thr Ser Ala Ala Ser
260 265 270
Ile Pro Ile Ser Leu Val Glu Glu Leu Glu Ala Gly Lys Ile Lys Asp
275 280 285
Gly Asp Val Val Val Met Val Gly Phe Gly Gly Gly Leu Thr Trp Gly
290 295 300
Ala Ile Ala Ile Arg Trp Gly Arg
305 310
<210> 3
<211> 325
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III (FabH2)"
<400> 3
Met Ser Lys Ala Lys Ile Thr Ala Ile Gly Thr Tyr Ala Pro Ser Arg
1 5 10 15
Arg Leu Thr Asn Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Asp Thr Ser Asp Glu
20 25 30
Trp Ile Val Gln Arg Thr Gly Met Arg Glu Arg Arg Ile Ala Asp Glu
35 40 45
His Gln Phe Thr Ser Asp Leu Cys Ile Glu Ala Val Lys Asn Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Tyr Lys Gly Thr Leu Asp Asp Val Asp Met Ile Leu Val Ala
65 70 75 80
Thr Thr Thr Ser Asp Tyr Ala Phe Pro Ser Thr Ala Cys Arg Val Gln
85 90 95
Glu Tyr Phe Gly Trp Glu Ser Thr Gly Ala Leu Asp Ile Asn Ala Thr
100 105 110
Cys Ala Gly Leu Thr Tyr Gly Leu His Leu Ala Asn Gly Leu Ile Thr
115 120 125
Ser Gly Leu His Gln Lys Ile Leu Val Ile Ala Gly Glu Thr Leu Ser
130 135 140
Lys Val Thr Asp Tyr Thr Asp Arg Thr Thr Cys Val Leu Phe Gly Asp
145 150 155 160
Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val Glu Arg Asp Glu Glu Thr Pro Gly Phe
165 170 175
Leu Ala Ser Val Gln Gly Thr Ser Gly Asn Gly Gly Asp Ile Leu Tyr
180 185 190
Arg Ala Gly Leu Arg Asn Glu Ile Asn Gly Val Gln Leu Val Gly Ser
195 200 205
Gly Lys Met Val Gln Asn Gly Arg Glu Val Tyr Lys Trp Ala Ala Arg
210 215 220
Thr Val Pro Gly Glu Phe Glu Arg Leu Leu His Lys Ala Gly Leu Ser
225 230 235 240
Ser Asp Asp Leu Asp Trp Phe Val Pro His Ser Ala Asn Leu Arg Met
245 250 255
Ile Glu Ser Ile Cys Glu Lys Thr Pro Phe Pro Ile Glu Lys Thr Leu
260 265 270
Thr Ser Val Glu His Tyr Gly Asn Thr Ser Ser Val Ser Ile Val Leu
275 280 285
Ala Leu Asp Leu Ala Val Lys Ala Gly Lys Leu Lys Lys Asp Gln Ile
290 295 300
Val Leu Leu Phe Gly Phe Gly Gly Gly Leu Thr Tyr Thr Gly Leu Leu
305 310 315 320
Ile Lys Trp Gly Met
325
<210> 4
<211> 320
<212> PRT
<213> 天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 4
Met Ala Arg Gly Ala Gly Arg Leu Thr Gly Ile Gly Val Tyr Arg Pro
1 5 10 15
Gly Gly Leu Leu Thr Ser Ala Glu Leu Asp Thr Arg Phe Gly His Glu
20 25 30
Asp Gly Tyr Ile Glu Gln Ile Thr Gly Ile Arg Thr Arg Leu Lys Ala
35 40 45
Asp Pro Asp Asp Thr Phe Val Glu Met Ala Ala Gln Ala Ala Asp Lys
50 55 60
Ala Leu Ala His Ala Gly Val Leu Ala Glu Asp Leu Asp Cys Val Leu
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Ser Ser Val Gly Gln Ala Ser Cys Arg Ala Ala Ser
85 90 95
Leu Thr His Arg Ile Gly Ala Gly Arg Ala Gly Gly Phe Asp Leu Asn
100 105 110
Gly Gly Cys Ala Gly Phe Gly Tyr Gly Leu Thr Leu Ala Ser Gly Leu
115 120 125
Ile Ala Ala Gln Gln Ala Arg Gln Ile Leu Val Val Ala Ala Glu Arg
130 135 140
Leu Ser Asp Ile Thr Asp Pro Asp Asp Cys Gly Thr Val Met Val Phe
145 150 155 160
Gly Asp Ala Ala Gly Ala Ala Val Val Ser Ala Ala Glu His Pro Gly
165 170 175
Ile Gly Pro Ala Val Trp Gly Thr His Gly Pro Gly Glu Pro Trp Met
180 185 190
Thr Ser Ala Pro Pro Lys Pro Gly Ala Ala Arg Pro Tyr Met His Met
195 200 205
Asp Gly Thr Arg Val Val Arg Trp Phe Gly Ser Gln Met Pro Gln Val
210 215 220
Ala Arg Asp Ala Leu Glu Ala Ala Gly Leu Thr Trp Asp Asp Ile Gly
225 230 235 240
Ala Phe Val Pro His Gln Cys Asn Gly Arg Leu Ile Asp Ala Met Val
245 250 255
Arg Arg Leu Arg Pro Pro Glu His Val Ala Ile Ala Arg Ser Ile Val
260 265 270
Thr Asp Gly Asn Thr Ser Ser Ala Ser Ile Pro Leu Ala Leu Glu Ser
275 280 285
Leu Leu Ala Ser Ala Thr Val Arg Pro Gly Asp Lys Ala Leu Leu Leu
290 295 300
Gly Phe Gly Ala Gly Leu Thr Trp Cys Ala Gln Val Val Glu Leu Pro
305 310 315 320
<210> 5
<211> 333
<212> PRT
<213> 淡青链霉菌(Streptomyces glaucescens)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 5
Met Ser Lys Ile Lys Pro Ala Lys Gly Ala Pro Tyr Ala Arg Ile Leu
1 5 10 15
Gly Val Gly Gly Tyr Arg Pro Thr Arg Val Val Pro Asn Glu Val Ile
20 25 30
Leu Glu Thr Ile Asp Ser Ser Asp Glu Trp Ile Arg Ser Arg Ser Gly
35 40 45
Ile Gln Thr Arg His Trp Ala Asn Asp Glu Glu Thr Val Ala Ala Met
50 55 60
Ser Ile Glu Ala Ser Gly Lys Ala Ile Ala Asp Ala Gly Ile Thr Ala
65 70 75 80
Ala Gln Val Gly Ala Val Ile Val Ser Thr Val Thr His Phe Lys Gln
85 90 95
Thr Pro Ala Val Ala Thr Glu Ile Ala Asp Lys Leu Gly Thr Asn Lys
100 105 110
Ala Ala Ala Phe Asp Ile Ser Ala Gly Cys Ala Gly Phe Gly Tyr Gly
115 120 125
Leu Thr Leu Ala Lys Gly Met Ile Val Glu Gly Ser Ala Glu Tyr Val
130 135 140
Leu Val Ile Gly Val Glu Arg Leu Ser Asp Leu Thr Asp Leu Glu Asp
145 150 155 160
Arg Ala Thr Ala Phe Leu Phe Gly Asp Gly Ala Gly Ala Val Val Val
165 170 175
Gly Pro Ser Asn Glu Pro Ala Ile Gly Pro Thr Ile Trp Gly Ser Glu
180 185 190
Gly Asp Lys Ala Glu Thr Ile Lys Gln Thr Val Pro Trp Thr Asp Tyr
195 200 205
Arg Glu Gly Gly Val Glu Arg Phe Pro Ala Ile Thr Gln Glu Gly Gln
210 215 220
Ala Val Phe Arg Trp Ala Val Phe Glu Met Ala Lys Val Ala Gln Gln
225 230 235 240
Ala Leu Asp Ala Ala Gly Val Ala Ala Ala Asp Leu Asp Val Phe Ile
245 250 255
Pro His Gln Ala Asn Glu Arg Ile Ile Asp Ser Met Val Lys Thr Leu
260 265 270
Lys Leu Pro Glu Ser Val Thr Val Ala Arg Asp Val Arg Thr Thr Gly
275 280 285
Asn Thr Ser Ala Ala Ser Ile Pro Leu Ala Met Glu Arg Leu Leu Ala
290 295 300
Thr Gly Glu Ala Lys Ser Gly Asp Thr Ala Leu Val Ile Gly Phe Gly
305 310 315 320
Ala Gly Leu Val Tyr Ala Ala Ser Val Val Thr Leu Pro
325 330
<210> 6
<211> 335
<212> PRT
<213> 除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 6
Met Ser Gly Gly Arg Ala Ala Val Ile Thr Gly Ile Gly Gly Tyr Val
1 5 10 15
Pro Pro Asp Leu Val Thr Asn Asp Asp Leu Ala Gln Arg Leu Asp Thr
20 25 30
Ser Asp Ala Trp Ile Arg Ser Arg Thr Gly Ile Ala Glu Arg His Val
35 40 45
Ile Ala Pro Gly Thr Ala Thr Ser Asp Leu Ala Val Glu Ala Gly Leu
50 55 60
Arg Ala Leu Lys Ser Ala Gly Asp Glu His Val Asp Ala Val Val Leu
65 70 75 80
Ala Thr Thr Thr Pro Asp Gln Pro Cys Pro Ala Thr Ala Pro Gln Val
85 90 95
Ala Ala Arg Leu Gly Leu Gly Gln Val Pro Ala Phe Asp Val Ala Ala
100 105 110
Val Cys Ser Gly Phe Leu Phe Gly Leu Ala Thr Ala Ser Gly Leu Ile
115 120 125
Ala Ala Gly Val Ala Asp Lys Val Leu Leu Val Ala Ala Asp Ala Phe
130 135 140
Thr Thr Ile Ile Asn Pro Glu Asp Arg Thr Thr Ala Val Ile Phe Ala
145 150 155 160
Asp Gly Ala Gly Ala Val Val Leu Arg Ala Gly Ala Ala Asp Glu Pro
165 170 175
Gly Ala Val Gly Pro Leu Val Leu Gly Ser Asp Gly Glu Leu Ser His
180 185 190
Leu Ile Glu Val Pro Ala Gly Gly Ser Arg Gln Arg Ser Ser Gly Pro
195 200 205
Thr Thr Asp Pro Asp Asp Gln Tyr Phe Arg Met Leu Gly Arg Asp Thr
210 215 220
Tyr Arg His Ala Val Glu Arg Met Thr Asp Ala Ser Gln Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Leu Ala Asp Trp Arg Ile Asp Asp Val Asp Arg Phe Ala Ala His
245 250 255
Gln Ala Asn Ala Arg Ile Leu Asp Ser Val Ala Glu Arg Leu Gly Val
260 265 270
Pro Ala Glu Arg Gln Leu Thr Asn Ile Ala Arg Val Gly Asn Thr Gly
275 280 285
Ala Ala Ser Ile Pro Leu Leu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Ala Gly Arg
290 295 300
Leu Gly Ala Gly His Arg Val Leu Leu Thr Ala Phe Gly Gly Gly Leu
305 310 315 320
Ser Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Trp Pro Glu Val Gln Pro Val
325 330 335
<210> 7
<211> 312
<212> PRT
<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 7
Met Asn Ala Gly Ile Leu Gly Val Gly Lys Tyr Val Pro Glu Lys Ile
1 5 10 15
Val Thr Asn Phe Asp Leu Glu Lys Ile Met Asp Thr Ser Asp Glu Trp
20 25 30
Ile Arg Thr Arg Thr Gly Ile Glu Glu Arg Arg Ile Ala Arg Asp Asp
35 40 45
Glu Tyr Thr His Asp Leu Ala Tyr Glu Ala Ala Lys Val Ala Ile Glu
50 55 60
Asn Ala Gly Leu Thr Pro Asp Asp Ile Asp Leu Phe Ile Val Ala Thr
65 70 75 80
Val Thr Gln Glu Ala Thr Phe Pro Ser Val Ala Asn Ile Ile Gln Asp
85 90 95
Arg Leu Gly Ala Thr Asn Ala Ala Gly Met Asp Val Glu Ala Ala Cys
100 105 110
Ala Gly Phe Thr Phe Gly Val Val Thr Ala Ala Gln Phe Ile Lys Thr
115 120 125
Gly Ala Tyr Lys Asn Ile Val Val Val Gly Ala Asp Lys Leu Ser Lys
130 135 140
Ile Thr Asn Trp Asp Asp Arg Ala Thr Ala Val Leu Phe Gly Asp Gly
145 150 155 160
Ala Gly Ala Val Val Met Gly Pro Val Ser Asp Asp His Gly Leu Leu
165 170 175
Ser Phe Asp Leu Gly Ser Asp Gly Ser Gly Gly Lys Tyr Leu Asn Leu
180 185 190
Asp Glu Asn Lys Lys Ile Tyr Met Asn Gly Arg Glu Val Phe Arg Phe
195 200 205
Ala Val Arg Gln Met Gly Glu Ala Ser Leu Arg Val Leu Glu Arg Ala
210 215 220
Gly Leu Glu Lys Glu Glu Leu Asp Leu Leu Ile Pro His Gln Ala Asn
225 230 235 240
Ile Arg Ile Met Glu Ala Ser Arg Glu Arg Leu Asn Leu Pro Glu Glu
245 250 255
Lys Leu Met Lys Thr Val His Lys Tyr Gly Asn Thr Ser Ser Ser Ser
260 265 270
Ile Ala Leu Ala Leu Val Asp Ala Val Glu Glu Gly Arg Ile Lys Asp
275 280 285
Asn Asp Asn Val Leu Leu Val Gly Phe Gly Gly Gly Leu Thr Trp Gly
290 295 300
Ala Leu Ile Ile Arg Trp Gly Lys
305 310
<210> 8
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
单核细胞增生李斯特氏菌β酮酯酰-ACP合酶III变体
多肽"
<400> 8
Met Asn Ala Gly Ile Leu Gly Val Gly Lys Tyr Val Pro Glu Lys Ile
1 5 10 15
Val Thr Asn Phe Asp Leu Glu Lys Ile Met Asp Thr Ser Asp Glu Trp
20 25 30
Ile Arg Thr Arg Thr Gly Ile Glu Glu Arg Arg Ile Ala Arg Asp Asp
35 40 45
Glu Tyr Thr His Asp Leu Ala Tyr Glu Ala Ala Lys Val Ala Ile Glu
50 55 60
Asn Ala Gly Leu Thr Pro Asp Asp Ile Asp Leu Phe Ile Val Ala Thr
65 70 75 80
Val Thr Gln Glu Ala Thr Phe Pro Ser Val Ala Asn Ile Ile Gln Asp
85 90 95
Arg Leu Gly Ala Thr Asn Ala Ala Gly Met Asp Val Glu Ala Ala Cys
100 105 110
Ala Gly Phe Thr Phe Gly Val Val Thr Ala Ala Gln Phe Ile Lys Thr
115 120 125
Gly Ala Tyr Lys Asn Ile Val Val Val Gly Ala Asp Lys Leu Ser Lys
130 135 140
Ile Thr Asn Trp Asp Asp Arg Ala Thr Ala Val Leu Phe Gly Asp Gly
145 150 155 160
Ala Gly Ala Val Val Met Gly Pro Val Ser Asp Asp His Gly Leu Leu
165 170 175
Ser Phe Asp Leu Gly Ser Asp Gly Ser Gly Gly Lys Tyr Leu Asn Leu
180 185 190
Asp Glu Asn Lys Lys Ile Tyr Met Asn Gly Arg Glu Val Phe Arg Phe
195 200 205
Ala Val Arg Gln Met Gly Glu Ala Ser Leu Arg Val Leu Glu Arg Ala
210 215 220
Gly Leu Glu Lys Glu Glu Leu Asp Leu Leu Ile Pro His Gln Ala Asn
225 230 235 240
Ile Arg Ile Met Glu Ala Ser Arg Glu Arg Leu Asn Leu Pro Glu Glu
245 250 255
Lys Leu Met Lys Thr Val His Lys Tyr Gly Asn Thr Ser Ser Ser Ser
260 265 270
Ile Ala Leu Ala Leu Val Asp Ala Val Glu Glu Gly Arg Ile Lys Asp
275 280 285
Asn Asp Asn Val Leu Leu Val Gly Phe Gly Gly Gly Leu Thr Trp Gly
290 295 300
Ala Leu Ile Ile Arg Gly Gly Lys
305 310
<210> 9
<211> 313
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 9
Met Asn Val Gly Ile Lys Gly Phe Gly Ala Tyr Ala Pro Glu Lys Ile
1 5 10 15
Ile Asp Asn Ala Tyr Phe Glu Gln Phe Leu Asp Thr Ser Asp Glu Trp
20 25 30
Ile Ser Lys Met Thr Gly Ile Lys Glu Arg His Trp Ala Asp Asp Asp
35 40 45
Gln Asp Thr Ser Asp Leu Ala Tyr Glu Ala Ser Leu Lys Ala Ile Ala
50 55 60
Asp Ala Gly Ile Gln Pro Glu Asp Ile Asp Met Ile Ile Val Ala Thr
65 70 75 80
Ala Thr Gly Asp Met Pro Phe Pro Thr Val Ala Asn Met Leu Gln Glu
85 90 95
Arg Leu Gly Thr Gly Lys Val Ala Ser Met Asp Gln Leu Ala Ala Cys
100 105 110
Ser Gly Phe Met Tyr Ser Met Ile Thr Ala Lys Gln Tyr Val Gln Ser
115 120 125
Gly Asp Tyr His Asn Ile Leu Val Val Gly Ala Asp Lys Leu Ser Lys
130 135 140
Ile Thr Asp Leu Thr Asp Arg Ser Thr Ala Val Leu Phe Gly Asp Gly
145 150 155 160
Ala Gly Ala Val Ile Ile Gly Glu Val Ser Asp Gly Arg Gly Ile Ile
165 170 175
Ser Tyr Glu Met Gly Ser Asp Gly Thr Gly Gly Lys His Leu Tyr Leu
180 185 190
Asp Lys Asp Thr Gly Lys Leu Lys Met Asn Gly Arg Glu Val Phe Lys
195 200 205
Phe Ala Val Arg Ile Met Gly Asp Ala Ser Thr Arg Val Val Glu Lys
210 215 220
Ala Asn Leu Thr Ser Asp Asp Ile Asp Leu Phe Ile Pro His Gln Ala
225 230 235 240
Asn Ile Arg Ile Met Glu Ser Ala Arg Glu Arg Leu Gly Ile Ser Lys
245 250 255
Asp Lys Met Ser Val Ser Val Asn Lys Tyr Gly Asn Thr Ser Ala Ala
260 265 270
Ser Ile Pro Leu Ser Ile Asp Gln Glu Leu Lys Asn Gly Lys Ile Lys
275 280 285
Asp Asp Asp Thr Ile Val Leu Val Gly Phe Gly Gly Gly Leu Thr Trp
290 295 300
Gly Ala Met Thr Ile Lys Trp Gly Lys
305 310
<210> 10
<211> 324
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 10
Met Ala Phe Ala Lys Ile Ser Gln Val Ala His Tyr Val Pro Glu Gln
1 5 10 15
Val Val Thr Asn His Asp Leu Ala Gln Ile Met Asp Thr Asn Asp Glu
20 25 30
Trp Ile Ser Ser Arg Thr Gly Ile Arg Gln Arg His Ile Ser Arg Thr
35 40 45
Glu Ser Thr Ser Asp Leu Ala Thr Glu Val Ala Lys Lys Leu Met Ala
50 55 60
Lys Ala Gly Ile Thr Gly Glu Glu Leu Asp Phe Ile Ile Leu Ala Thr
65 70 75 80
Ile Thr Pro Asp Ser Met Met Pro Ser Thr Ala Ala Arg Val Gln Ala
85 90 95
Asn Ile Gly Ala Asn Lys Ala Phe Ala Phe Asp Leu Thr Ala Ala Cys
100 105 110
Ser Gly Phe Val Phe Ala Leu Ser Thr Ala Glu Lys Phe Ile Ala Ser
115 120 125
Gly Arg Phe Gln Lys Gly Leu Val Ile Gly Ser Glu Thr Leu Ser Lys
130 135 140
Ala Val Asp Trp Ser Asp Arg Ser Thr Ala Val Leu Phe Gly Asp Gly
145 150 155 160
Ala Gly Gly Val Leu Leu Glu Ala Ser Glu Gln Glu His Phe Leu Ala
165 170 175
Glu Ser Leu Asn Ser Asp Gly Ser Arg Ser Glu Cys Leu Thr Tyr Gly
180 185 190
His Ser Gly Leu His Ser Pro Phe Ser Asp Gln Glu Ser Ala Asp Ser
195 200 205
Phe Leu Lys Met Asp Gly Arg Thr Val Phe Asp Phe Ala Ile Arg Asp
210 215 220
Val Ala Lys Ser Ile Lys Gln Thr Ile Asp Glu Ser Pro Ile Glu Val
225 230 235 240
Thr Asp Leu Asp Tyr Leu Leu Leu His Gln Ala Asn Asp Arg Ile Leu
245 250 255
Asp Lys Met Ala Arg Lys Ile Gly Val Asp Arg Ala Lys Leu Pro Ala
260 265 270
Asn Met Met Glu Tyr Gly Asn Thr Ser Ala Ala Ser Ile Pro Ile Leu
275 280 285
Leu Ser Glu Cys Val Glu Gln Gly Leu Ile Pro Leu Asp Gly Ser Gln
290 295 300
Thr Val Leu Leu Ser Gly Phe Gly Gly Gly Leu Thr Trp Gly Thr Leu
305 310 315 320
Ile Leu Thr Ile
<210> 11
<211> 325
<212> PRT
<213> 变异链球菌(Streptococcus mutans)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 11
Met Thr Phe Ala Lys Ile Ser Gln Ala Ala Tyr Tyr Val Pro Ser Gln
1 5 10 15
Val Val Thr Asn Asp Asp Leu Ser Lys Ile Met Asp Thr Ser Asp Glu
20 25 30
Trp Ile Thr Ser Arg Thr Gly Ile Arg Glu Arg Arg Ile Ser Gln Ser
35 40 45
Glu Asp Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gln Val Ala Lys Glu Leu Leu Lys
50 55 60
Lys Ala Ser Leu Lys Ala Lys Glu Ile Asp Phe Ile Ile Val Ala Thr
65 70 75 80
Ile Thr Pro Asp Ala Met Met Pro Ser Thr Ala Ala Cys Val Gln Ala
85 90 95
Lys Ile Gly Ala Val Asn Ala Phe Ala Phe Asp Leu Thr Ala Ala Cys
100 105 110
Ser Gly Phe Ile Phe Ala Leu Ser Ala Ala Glu Lys Met Ile Lys Ser
115 120 125
Gly Gln Tyr Gln Lys Gly Leu Val Ile Gly Ala Glu Val Leu Ser Lys
130 135 140
Ile Ile Asp Trp Ser Asp Arg Thr Thr Ala Val Leu Phe Gly Asp Gly
145 150 155 160
Ala Gly Gly Val Leu Leu Glu Ala Asp Ser Ser Glu His Phe Leu Phe
165 170 175
Glu Ser Ile His Ser Asp Gly Ser Arg Gly Glu Ser Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Glu His Ala Val Ser Ser Pro Phe Ser Gln Val Asp Lys Lys Asp Asn
195 200 205
Cys Phe Leu Lys Met Asp Gly Arg Ala Ile Phe Asp Phe Ala Ile Arg
210 215 220
Asp Val Ser Lys Ser Ile Ser Met Leu Ile Arg Lys Ser Asp Met Pro
225 230 235 240
Val Glu Ala Ile Asp Tyr Phe Leu Leu His Gln Ala Asn Ile Arg Ile
245 250 255
Leu Asp Lys Met Ala Lys Lys Ile Gly Ala Asp Arg Glu Lys Phe Pro
260 265 270
Ala Asn Met Met Lys Tyr Gly Asn Thr Ser Ala Ala Ser Ile Pro Ile
275 280 285
Leu Leu Ala Glu Cys Val Glu Asn Gly Thr Ile Glu Leu Asn Gly Ser
290 295 300
His Thr Val Leu Leu Ser Gly Phe Gly Gly Gly Leu Thr Trp Gly Ser
305 310 315 320
Leu Ile Val Lys Ile
325
<210> 12
<211> 325
<212> PRT
<213> 乳链球菌(Lactococcus lactis)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 12
Met Thr Phe Ala Lys Ile Thr Gln Val Ala His Tyr Val Pro Glu Asn
1 5 10 15
Val Val Ser Asn Asp Asp Leu Ser Lys Ile Met Asp Thr Asn Asp Glu
20 25 30
Trp Ile Tyr Ser Arg Thr Gly Ile Lys Asn Arg His Ile Ser Thr Gly
35 40 45
Glu Asn Thr Ser Asp Leu Ala Ala Lys Val Ala Lys Gln Leu Ile Ser
50 55 60
Asp Ser Asn Leu Ser Pro Glu Thr Ile Asp Phe Ile Ile Val Ala Thr
65 70 75 80
Val Thr Pro Asp Ser Leu Met Pro Ser Thr Ala Ala Arg Val Gln Ala
85 90 95
Gln Val Gly Ala Val Asn Ala Phe Ala Tyr Asp Leu Thr Ala Ala Cys
100 105 110
Ser Gly Phe Val Phe Ala Leu Ser Thr Ala Glu Lys Leu Ile Ser Ser
115 120 125
Gly Ala Tyr Gln Arg Gly Leu Val Ile Gly Ala Glu Val Phe Ser Lys
130 135 140
Val Ile Asp Trp Ser Asp Arg Ser Thr Ala Val Leu Phe Gly Asp Gly
145 150 155 160
Ala Ala Gly Val Leu Ile Glu Ala Gly Ala Ser Gln Pro Leu Ile Ile
165 170 175
Ala Glu Lys Met Gln Thr Asp Gly Ser Arg Gly Asn Ser Leu Leu Ser
180 185 190
Ser Tyr Ala Asp Ile Gln Thr Pro Phe Ala Ser Val Ser Tyr Glu Ser
195 200 205
Ser Asn Leu Ser Met Glu Gly Arg Ala Ile Phe Asp Phe Ala Val Arg
210 215 220
Asp Val Pro Lys Asn Ile Gln Ala Thr Leu Glu Lys Ala Asn Leu Ser
225 230 235 240
Ala Glu Glu Val Asp Tyr Tyr Leu Leu His Gln Ala Asn Ser Arg Ile
245 250 255
Leu Asp Lys Met Ala Lys Lys Leu Gly Val Thr Arg Gln Lys Phe Leu
260 265 270
Gln Asn Met Gln Glu Tyr Gly Asn Thr Ser Ala Ala Ser Ile Pro Ile
275 280 285
Leu Leu Ser Glu Ser Val Lys Asn Gly Ile Phe Ser Leu Asp Gly Gln
290 295 300
Thr Lys Val Val Leu Thr Gly Phe Gly Gly Gly Leu Thr Trp Gly Thr
305 310 315 320
Ala Ile Ile Asn Leu
325
<210> 13
<211> 300
<212> PRT
<213> 费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="谢氏亚种(subsp. shermanii),β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 13
Met Ile Asp Ser Thr Pro Glu Trp Ile Glu Gln Arg Thr Gly Ile Arg
1 5 10 15
Glu Arg Arg Trp Ala Thr Lys Asp Glu Thr Val Leu Ser Met Ala Thr
20 25 30
Asp Ala Gly Arg Lys Ala Leu Asp Met Ala Gly Val Lys Pro Glu Gln
35 40 45
Val Gly Ala Ile Ile Val Ser Thr Val Ser His His Ile Pro Ser Pro
50 55 60
Gly Leu Ser Asp Tyr Leu Ala Glu Glu Leu Gly Cys Pro Ala Pro Ala
65 70 75 80
Thr Phe Asp Ile Ser Ala Ala Cys Ala Gly Phe Cys Tyr Ala Leu Thr
85 90 95
Leu Ala Glu Ser Ile Val Arg Ala Gly His Ala Gly Lys Asp Gly Phe
100 105 110
Val Leu Ile Val Gly Val Glu Arg Leu Ser Asp Met Thr Asn Met Asp
115 120 125
Asp Arg Gly Thr Asp Phe Leu Phe Gly Asp Gly Ala Gly Ala Ala Val
130 135 140
Val Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ala Ile Gly Pro Ala Val Trp Gly Ser
145 150 155 160
Lys Pro Ala Asn Val Lys Thr Ile Glu Ile Gln Ser Trp Thr Glu Ala
165 170 175
Asp Lys Asn Pro Thr Gly Phe Pro Leu Ile Gln Met Asp Gly His Thr
180 185 190
Val Phe Lys Trp Ala Leu Ser Glu Val Ala Asp His Ala Ala Glu Ala
195 200 205
Ile Asp Ala Ala Gly Ile Thr Pro Glu Gln Leu Asp Ile Phe Leu Pro
210 215 220
His Gln Ala Asn Asp Arg Ile Thr Asp Ala Ile Ile Arg His Leu His
225 230 235 240
Leu Pro Asp Ser Val Ser Val Cys Arg Asp Ile Ala Glu Met Gly Asn
245 250 255
Thr Ser Ala Ala Ser Ile Pro Ile Ala Met Asp Ala Met Ile Arg Glu
260 265 270
Gly Arg Ala Lys Ser Gly Gln Thr Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ala
275 280 285
Gly Leu Val Tyr Ala Gly Arg Val Val Val Leu Pro
290 295 300
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
FabH基序肽"
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> /取代="Ser"
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /取代="Glu"
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> /取代="Arg"
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> /取代="Glu"
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> 变体
<222> (17)..(17)
<223> /取代="His"
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<400> 14
Asp Thr Asn Asp Ala Trp Ile Xaa Xaa Met Thr Gly Ile Xaa Asn Arg
1 5 10 15
Arg
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
FabH基序肽"
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /取代="Ala"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(5)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> /取代="Val"
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> /取代="Ser"
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(14)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> /取代="Leu"
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(17)
<223> 任何氨基酸
<400> 15
Ser Xaa Asp Xaa Xaa Ala Ala Cys Ala Gly Phe Xaa Xaa Xaa Met Xaa
1 5 10 15
Xaa Ala
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
FabH基序肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /取代="Ile"
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /取代="Val"
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> /取代="Gly"
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> 变体
<222> (13)..(14)
<223> /取代="Gly"
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释中的那些无偏好性"
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> /取代="Val"
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<400> 16
Asp Arg Xaa Thr Ala Ile Xaa Phe Ala Asp Gly Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
FabH基序肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> /取代="Leu"
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<400> 17
His Gln Ala Asn Xaa Arg Ile Met
1 5
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
FabH基序肽"
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /取代="Ser"
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> /取代="Ile"
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(11)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (12)..(12)
<223> /取代="Leu"
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(18)
<223> 任何氨基酸
<400> 18
Gly Asn Thr Gly Ala Ala Ser Val Pro Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Gly
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
FabH基序肽"
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /取代="Val"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(5)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> /取代="Phe"
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> /取代="Ser"
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> /注解="序列中给出的残基对于所述位置的注释无偏好性"
<400> 19
Ile Xaa Leu Xaa Xaa Phe Gly Gly Gly Leu Thr Trp Gly
1 5 10
<210> 20
<211> 820
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶(ThrA)"
<400> 20
Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg
1 5 10 15
Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln
20 25 30
Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile
50 55 60
Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala
65 70 75 80
Ala Gln Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln
85 90 95
Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly
100 105 110
Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys
115 120 125
Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn
130 135 140
Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala
165 170 175
Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala
180 185 190
Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp
195 200 205
Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu
210 215 220
Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val
225 230 235 240
Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu
245 250 255
Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro
260 265 270
Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro
275 280 285
Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu
290 295 300
Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val
305 310 315 320
Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe
325 330 335
Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser
340 345 350
Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val
355 360 365
Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu
370 375 380
Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser
385 390 395 400
Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe
405 410 415
Phe Ala Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln
420 425 430
Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala
435 440 445
Thr Thr Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln
450 455 460
Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu
465 470 475 480
Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile
485 490 495
Asp Leu Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn
500 505 510
Val His Gly Leu Asn Leu Glu Asn Trp Gln Glu Glu Leu Ala Gln Ala
515 520 525
Lys Glu Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr
530 535 540
His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val
545 550 555 560
Ala Asp Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr
565 570 575
Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu
580 585 590
Arg Tyr Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn
595 600 605
Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn
610 615 620
Ala Gly Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu
625 630 635 640
Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala
645 650 655
Thr Thr Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp
660 665 670
Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg
675 680 685
Glu Thr Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val
690 695 700
Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala
705 710 715 720
Asn Leu Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala
725 730 735
Arg Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp
740 745 750
Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu
755 760 765
Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr
770 775 780
Tyr Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp
785 790 795 800
Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp
805 810 815
Lys Leu Gly Val
820
<210> 21
<211> 820
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
大肠杆菌Thra S345F变体多肽"
<400> 21
Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg
1 5 10 15
Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln
20 25 30
Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile
50 55 60
Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala
65 70 75 80
Ala Gln Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln
85 90 95
Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly
100 105 110
Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys
115 120 125
Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn
130 135 140
Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala
165 170 175
Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala
180 185 190
Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp
195 200 205
Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu
210 215 220
Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val
225 230 235 240
Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu
245 250 255
Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro
260 265 270
Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro
275 280 285
Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu
290 295 300
Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val
305 310 315 320
Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe
325 330 335
Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Phe Val Val Leu Ile Thr Gln Ser
340 345 350
Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val
355 360 365
Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu
370 375 380
Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser
385 390 395 400
Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe
405 410 415
Phe Ala Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln
420 425 430
Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala
435 440 445
Thr Thr Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln
450 455 460
Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu
465 470 475 480
Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile
485 490 495
Asp Leu Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn
500 505 510
Val His Gly Leu Asn Leu Glu Asn Trp Gln Glu Glu Leu Ala Gln Ala
515 520 525
Lys Glu Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr
530 535 540
His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val
545 550 555 560
Ala Asp Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr
565 570 575
Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu
580 585 590
Arg Tyr Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn
595 600 605
Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn
610 615 620
Ala Gly Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu
625 630 635 640
Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala
645 650 655
Thr Thr Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp
660 665 670
Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg
675 680 685
Glu Thr Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val
690 695 700
Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala
705 710 715 720
Asn Leu Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala
725 730 735
Arg Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp
740 745 750
Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu
755 760 765
Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr
770 775 780
Tyr Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp
785 790 795 800
Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp
805 810 815
Lys Leu Gly Val
820
<210> 22
<211> 404
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="天冬氨酸激酶"
<400> 22
Met Lys Ile Ile Val Gln Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Lys Asp Asp
1 5 10 15
Lys Gly Arg Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Lys Glu Ala Ile Ser Glu
20 25 30
Gly Tyr Lys Val Val Val Val Val Ser Ala Met Gly Arg Lys Gly Asp
35 40 45
Pro Tyr Ala Thr Asp Ser Leu Leu Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Gln Ser
50 55 60
Ala Ile Ser Pro Arg Glu Gln Asp Leu Leu Leu Ser Cys Gly Glu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Val Phe Thr Ser Met Leu Leu Asp Asn Gly Val Lys
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Thr Gly Ala Gln Ala Gly Phe Leu Thr Asn Asp Gln
100 105 110
His Thr Asn Ala Lys Ile Ile Glu Met Lys Pro Glu Arg Leu Phe Ser
115 120 125
Val Leu Ala Asn His Asp Ala Val Val Val Ala Gly Phe Gln Gly Ala
130 135 140
Thr Glu Lys Gly Asp Thr Thr Thr Ile Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr
145 150 155 160
Ser Ala Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val Asp Ala Glu Tyr Ile Asp Ile
165 170 175
Phe Thr Asp Val Glu Gly Val Met Thr Ala Asp Pro Arg Val Val Glu
180 185 190
Asn Ala Lys Pro Leu Pro Val Val Thr Tyr Thr Glu Ile Cys Asn Leu
195 200 205
Ala Tyr Gln Gly Ala Lys Val Ile Ser Pro Arg Ala Val Glu Ile Ala
210 215 220
Met Gln Ala Lys Val Pro Ile Arg Val Arg Ser Thr Tyr Ser Asn Asp
225 230 235 240
Lys Gly Thr Leu Val Thr Ser His His Ser Ser Lys Val Gly Ser Asp
245 250 255
Val Phe Glu Arg Leu Ile Thr Gly Ile Ala His Val Lys Asp Val Thr
260 265 270
Gln Phe Lys Val Pro Ala Lys Ile Gly Gln Tyr Asn Val Gln Thr Glu
275 280 285
Val Phe Lys Ala Met Ala Asn Ala Gly Ile Ser Val Asp Phe Phe Asn
290 295 300
Ile Thr Pro Ser Glu Ile Val Tyr Thr Val Ala Gly Asn Lys Thr Glu
305 310 315 320
Thr Ala Gln Arg Ile Leu Met Asp Met Gly Tyr Asp Pro Met Val Thr
325 330 335
Arg Asn Cys Ala Lys Val Ser Ala Val Gly Ala Gly Ile Met Gly Val
340 345 350
Pro Gly Val Thr Ser Lys Ile Val Ser Ala Leu Ser Glu Lys Glu Ile
355 360 365
Pro Ile Leu Gln Ser Ala Asp Ser His Thr Thr Ile Trp Val Leu Val
370 375 380
His Glu Ala Asp Met Val Pro Ala Val Asn Ala Leu His Glu Val Phe
385 390 395 400
Glu Leu Ser Lys
<210> 23
<211> 411
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="天冬氨酸激酶"
<400> 23
Met Ala Leu Ile Val Gln Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Gly Ser Ile
1 5 10 15
Glu Arg Ile Glu Gln Val Ala Glu Lys Val Lys Lys His Arg Glu Ala
20 25 30
Gly Asp Asp Leu Val Val Val Leu Ser Ala Met Ser Gly Glu Thr Asn
35 40 45
Arg Leu Ile Asp Leu Ala Lys Gln Ile Thr Asp Gln Pro Val Pro Arg
50 55 60
Glu Leu Asp Val Ile Val Ser Thr Gly Glu Gln Val Thr Ile Ala Leu
65 70 75 80
Leu Thr Met Ala Leu Ile Lys Arg Gly Val Pro Ala Val Ser Tyr Thr
85 90 95
Gly Asn Gln Val Arg Ile Leu Thr Asp Ser Ser His Asn Lys Ala Arg
100 105 110
Ile Leu Gln Ile Asp Asp Gln Lys Ile Arg Ala Asp Leu Lys Glu Gly
115 120 125
Arg Val Val Val Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asp Glu His Gly Ser
130 135 140
Ile Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Gly Val Ala Leu
145 150 155 160
Ala Ala Ala Leu Lys Ala Asp Glu Cys Gln Ile Tyr Thr Asp Val Asp
165 170 175
Gly Val Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Pro Gln Ala Arg Arg Leu
180 185 190
Glu Lys Ile Thr Phe Glu Glu Met Leu Glu Met Ala Ser Leu Gly Ser
195 200 205
Lys Val Leu Gln Ile Arg Ser Val Glu Phe Ala Gly Lys Tyr Asn Val
210 215 220
Pro Leu Arg Val Leu His Ser Phe Lys Glu Gly Pro Gly Thr Leu Ile
225 230 235 240
Thr Ile Asp Glu Glu Glu Ser Met Glu Gln Pro Ile Ile Ser Gly Ile
245 250 255
Ala Phe Asn Arg Asp Glu Ala Lys Leu Thr Ile Arg Gly Val Pro Asp
260 265 270
Thr Pro Gly Val Ala Phe Lys Ile Leu Gly Pro Ile Ser Ala Ser Asn
275 280 285
Ile Glu Val Asp Met Ile Val Gln Asn Val Ala His Asp Asn Thr Thr
290 295 300
Asp Phe Thr Phe Thr Val His Arg Asn Glu Tyr Glu Lys Ala Gln Ser
305 310 315 320
Val Leu Glu Asn Thr Ala Arg Glu Ile Gly Ala Arg Glu Val Ile Gly
325 330 335
Asp Thr Lys Ile Ala Lys Val Ser Ile Val Gly Val Gly Met Arg Ser
340 345 350
His Ala Gly Val Ala Ser Cys Met Phe Glu Ala Leu Ala Lys Glu Ser
355 360 365
Ile Asn Ile Gln Met Ile Ser Thr Ser Glu Ile Lys Val Ser Val Val
370 375 380
Leu Glu Glu Lys Tyr Leu Glu Leu Ala Val Arg Ala Leu His Thr Ala
385 390 395 400
Phe Asp Leu Asp Ala Pro Ala Arg Gln Gly Glu
405 410
<210> 24
<211> 527
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="天冬氨酸激酶"
<400> 24
Met Pro Met Asp Phe Gln Pro Thr Ser Ser His Ser Asn Trp Val Val
1 5 10 15
Gln Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Gly Lys Phe Pro Val Gln Ile Val
20 25 30
Asp Asp Ile Val Lys His Tyr Ser Lys Pro Asp Gly Pro Asn Asn Asn
35 40 45
Val Ala Val Val Cys Ser Ala Arg Ser Ser Tyr Thr Lys Ala Glu Gly
50 55 60
Thr Thr Ser Arg Leu Leu Lys Cys Cys Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ser
65 70 75 80
Glu Phe Gln Asp Ile Ile Glu Val Ile Arg Gln Asp His Ile Asp Asn
85 90 95
Ala Asp Arg Phe Ile Leu Asn Pro Ala Leu Gln Ala Lys Leu Val Asp
100 105 110
Asp Thr Asn Lys Glu Leu Glu Leu Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ala Ser
115 120 125
Lys Val Leu Gly Glu Val Ser Ser Arg Thr Val Asp Leu Val Met Ser
130 135 140
Cys Gly Glu Lys Leu Ser Cys Leu Phe Met Thr Ala Leu Cys Asn Asp
145 150 155 160
Arg Gly Cys Lys Ala Lys Tyr Val Asp Leu Ser His Ile Val Pro Ser
165 170 175
Asp Phe Ser Ala Ser Ala Leu Asp Asn Ser Phe Tyr Thr Phe Leu Val
180 185 190
Gln Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ala Pro Phe Val Ser Ala Lys Glu Arg
195 200 205
Ile Val Pro Val Phe Thr Gly Phe Phe Gly Leu Val Pro Thr Gly Leu
210 215 220
Leu Asn Gly Val Gly Arg Gly Tyr Thr Asp Leu Cys Ala Ala Leu Ile
225 230 235 240
Ala Val Ala Val Asn Ala Asp Glu Leu Gln Val Trp Lys Glu Val Asp
245 250 255
Gly Ile Phe Thr Ala Asp Pro Arg Lys Val Pro Glu Ala Arg Leu Leu
260 265 270
Asp Ser Val Thr Pro Glu Glu Ala Ser Glu Leu Thr Tyr Tyr Gly Ser
275 280 285
Glu Val Ile His Pro Phe Thr Met Glu Gln Val Ile Arg Ala Lys Ile
290 295 300
Pro Ile Arg Ile Lys Asn Val Gln Asn Pro Leu Gly Asn Gly Thr Ile
305 310 315 320
Ile Tyr Pro Asp Asn Val Ala Lys Lys Gly Glu Ser Thr Pro Pro His
325 330 335
Pro Pro Glu Asn Leu Ser Ser Ser Phe Tyr Glu Lys Arg Lys Arg Gly
340 345 350
Ala Thr Ala Ile Thr Thr Lys Asn Asp Ile Phe Val Ile Asn Ile His
355 360 365
Ser Asn Lys Lys Thr Leu Ser His Gly Phe Leu Ala Gln Ile Phe Thr
370 375 380
Ile Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Val Val Asp Leu Ile Ser Thr Ser Glu
385 390 395 400
Val His Val Ser Met Ala Leu Pro Ile Pro Asp Ala Asp Ser Leu Lys
405 410 415
Ser Leu Arg Gln Ala Glu Glu Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ser Val Asp
420 425 430
Ile Thr Lys Lys Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Gly Lys His Met Lys
435 440 445
Gln Tyr Ile Gly Ile Ala Gly Thr Met Phe Thr Thr Leu Ala Glu Glu
450 455 460
Gly Ile Asn Ile Glu Met Ile Ser Gln Gly Ala Asn Glu Ile Asn Ile
465 470 475 480
Ser Cys Val Ile Asn Glu Ser Asp Ser Ile Lys Ala Leu Gln Cys Ile
485 490 495
His Ala Lys Leu Leu Ser Glu Arg Thr Asn Thr Ser Asn Gln Phe Glu
500 505 510
His Ala Ile Asp Glu Arg Leu Glu Gln Leu Lys Arg Leu Gly Ile
515 520 525
<210> 25
<211> 433
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="高丝氨酸脱氢酶"
<400> 25
Met Lys Ala Ile Arg Val Gly Leu Leu Gly Leu Gly Thr Val Gly Ser
1 5 10 15
Gly Val Val Lys Ile Ile Gln Asp His Gln Asp Lys Leu Met His Gln
20 25 30
Val Gly Cys Pro Val Thr Ile Lys Lys Val Leu Val Lys Asp Leu Glu
35 40 45
Lys Lys Arg Glu Val Asp Leu Pro Lys Glu Val Leu Thr Thr Glu Val
50 55 60
Tyr Asp Val Ile Asp Asp Pro Asp Val Asp Val Val Ile Glu Val Ile
65 70 75 80
Gly Gly Val Glu Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Val Asp Ala Leu Arg Ser
85 90 95
Lys Lys His Val Val Thr Ala Asn Lys Asp Leu Met Ala Val Tyr Gly
100 105 110
Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asn Gly Cys Asp Ile Tyr Phe
115 120 125
Glu Ala Ser Val Ala Gly Gly Ile Pro Ile Leu Arg Thr Leu Glu Glu
130 135 140
Gly Leu Ser Ser Asp Arg Ile Thr Lys Met Met Gly Ile Val Asn Gly
145 150 155 160
Thr Thr Asn Phe Ile Leu Thr Lys Met Ile Lys Glu Lys Ser Pro Tyr
165 170 175
Glu Glu Val Leu Lys Glu Ala Gln Asp Leu Gly Phe Ala Glu Ala Asp
180 185 190
Pro Thr Ser Asp Val Glu Gly Leu Asp Ala Ala Arg Lys Met Ala Ile
195 200 205
Leu Ala Arg Leu Gly Phe Ser Met Asn Val Asp Leu Glu Asp Val Lys
210 215 220
Val Lys Gly Ile Ser Gln Ile Thr Asp Glu Asp Ile Ser Phe Ser Lys
225 230 235 240
Arg Leu Gly Tyr Thr Met Lys Leu Ile Gly Ile Ala Gln Arg Asp Gly
245 250 255
Ser Lys Ile Glu Val Ser Val Gln Pro Thr Leu Leu Pro Asp His His
260 265 270
Pro Leu Ser Ala Val His Asn Glu Phe Asn Ala Val Tyr Val Tyr Gly
275 280 285
Glu Ala Val Gly Glu Thr Met Phe Tyr Gly Pro Gly Ala Gly Ser Met
290 295 300
Pro Thr Ala Thr Ser Val Val Ser Asp Leu Val Ala Val Met Lys Asn
305 310 315 320
Met Arg Leu Gly Val Thr Gly Asn Ser Phe Val Gly Pro Gln Tyr Glu
325 330 335
Lys Asn Met Lys Ser Pro Ser Asp Ile Tyr Ala Gln Gln Phe Leu Arg
340 345 350
Ile His Val Lys Asp Glu Val Gly Ser Phe Ser Lys Ile Thr Ser Val
355 360 365
Phe Ser Glu Arg Gly Val Ser Phe Glu Lys Ile Leu Gln Leu Pro Ile
370 375 380
Lys Gly His Asp Glu Leu Ala Glu Ile Val Ile Val Thr His His Thr
385 390 395 400
Ser Glu Ala Asp Phe Ser Asp Ile Leu Gln Asn Leu Asn Asp Leu Glu
405 410 415
Val Val Gln Glu Val Lys Ser Thr Tyr Arg Val Glu Gly Asn Gly Trp
420 425 430
Ser
<210> 26
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
恶臭假单胞菌高丝氨酸脱氢酶多肽"
<400> 26
Met Lys Pro Val Lys Val Gly Ile Cys Gly Leu Gly Thr Val Gly Gly
1 5 10 15
Gly Thr Phe Asn Val Leu Gln Arg Asn Ala Glu Glu Ile Ala Arg Arg
20 25 30
Ala Gly Arg Gly Ile Glu Val Ala Gln Ile Ala Met Arg Ser Gln Asn
35 40 45
Pro Asn Cys Gln Ile Thr Gly Thr Pro Ile Thr Ala Asp Val Phe Glu
50 55 60
Val Ala Ser Asn Pro Glu Ile Asp Ile Val Ile Glu Leu Ile Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Thr Ile Ala Arg Asp Leu Val Leu Lys Ala Ile Glu Asn Gly Lys
85 90 95
His Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Ile Ala Val His Gly Asn Glu
100 105 110
Ile Phe Ala Lys Ala Arg Glu Lys Gly Val Ile Val Ala Phe Glu Ala
115 120 125
Ala Val Ala Gly Gly Ile Pro Val Ile Lys Ala Ile Arg Glu Gly Leu
130 135 140
Ser Ala Asn Arg Ile Asn Trp Leu Ala Gly Ile Ile Asn Gly Thr Gly
145 150 155 160
Asn Phe Ile Leu Thr Glu Met Arg Glu Lys Gly Arg Ala Phe Pro Asp
165 170 175
Val Leu Ala Glu Ala Gln Ala Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr
180 185 190
Phe Asp Val Glu Gly Ile Asp Ala Ala His Lys Leu Thr Ile Leu Ala
195 200 205
Ser Ile Ala Phe Gly Ile Pro Leu Gln Phe Asp Lys Ala Tyr Thr Glu
210 215 220
Gly Ile Thr Gln Leu Thr Thr Ala Asp Val Asn Tyr Ala Glu Ala Leu
225 230 235 240
Gly Tyr Arg Ile Lys His Leu Gly Val Ala Arg Arg Thr Ala Glu Gly
245 250 255
Ile Glu Leu Arg Val His Pro Thr Leu Ile Pro Ala Asp Arg Leu Ile
260 265 270
Ala Asn Val Asn Gly Val Met Asn Ala Val Met Val Asn Gly Asp Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Thr Leu Tyr Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Met Glu Pro Thr
290 295 300
Ala Ser Ser Val Val Gly Asp Leu Val Asp Val Val Arg Ala Met Thr
305 310 315 320
Ser Asp Pro Glu Asn Arg Val Pro His Leu Ala Phe Gln Pro Asp Ser
325 330 335
Leu Ser Ala His Pro Ile Leu Pro Ile Glu Ala Cys Glu Ser Ala Tyr
340 345 350
Tyr Leu Arg Ile Gln Ala Lys Asp His Pro Gly Val Leu Ala Gln Val
355 360 365
Ala Ser Ile Leu Ser Glu Arg Gly Ile Asn Ile Glu Ser Ile Met Gln
370 375 380
Lys Glu Ala Glu Glu Gln Asp Gly Leu Val Pro Met Ile Leu Val Thr
385 390 395 400
His Gly Val Val Glu Gln Arg Ile Asn Asp Ala Ile Val Ala Leu Glu
405 410 415
Ala Leu Gln Asp Val Val Gly Lys Val Val Arg Ile Arg Val Glu Gln
420 425 430
Leu Asn
<210> 27
<211> 359
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<220>
<221> 来源
<223> /注解="高丝氨酸脱氢酶"
<400> 27
Met Ser Thr Lys Val Val Asn Val Ala Val Ile Gly Ala Gly Val Val
1 5 10 15
Gly Ser Ala Phe Leu Asp Gln Leu Leu Ala Met Lys Ser Thr Ile Thr
20 25 30
Tyr Asn Leu Val Leu Leu Ala Glu Ala Glu Arg Ser Leu Ile Ser Lys
35 40 45
Asp Phe Ser Pro Leu Asn Val Gly Ser Asp Trp Lys Ala Ala Leu Ala
50 55 60
Ala Ser Thr Thr Lys Thr Leu Pro Leu Asp Asp Leu Ile Ala His Leu
65 70 75 80
Lys Thr Ser Pro Lys Pro Val Ile Leu Val Asp Asn Thr Ser Ser Ala
85 90 95
Tyr Ile Ala Gly Phe Tyr Thr Lys Phe Val Glu Asn Gly Ile Ser Ile
100 105 110
Ala Thr Pro Asn Lys Lys Ala Phe Ser Ser Asp Leu Ala Thr Trp Lys
115 120 125
Ala Leu Phe Ser Asn Lys Pro Thr Asn Gly Phe Val Tyr His Glu Ala
130 135 140
Thr Val Gly Ala Gly Leu Pro Ile Ile Ser Phe Leu Arg Glu Ile Ile
145 150 155 160
Gln Thr Gly Asp Glu Val Glu Lys Ile Glu Gly Ile Phe Ser Gly Thr
165 170 175
Leu Ser Tyr Ile Phe Asn Glu Phe Ser Thr Ser Gln Ala Asn Asp Val
180 185 190
Lys Phe Ser Asp Val Val Lys Val Ala Lys Lys Leu Gly Tyr Thr Glu
195 200 205
Pro Asp Pro Arg Asp Asp Leu Asn Gly Leu Asp Val Ala Arg Lys Val
210 215 220
Thr Ile Val Gly Arg Ile Ser Gly Val Glu Val Glu Ser Pro Thr Ser
225 230 235 240
Phe Pro Val Gln Ser Leu Ile Pro Lys Pro Leu Glu Ser Val Lys Ser
245 250 255
Ala Asp Glu Phe Leu Glu Lys Leu Ser Asp Tyr Asp Lys Asp Leu Thr
260 265 270
Gln Leu Lys Lys Glu Ala Ala Thr Glu Asn Lys Val Leu Arg Phe Ile
275 280 285
Gly Lys Val Asp Val Ala Thr Lys Ser Val Ser Val Gly Ile Glu Lys
290 295 300
Tyr Asp Tyr Ser His Pro Phe Ala Ser Leu Lys Gly Ser Asp Asn Val
305 310 315 320
Ile Ser Ile Lys Thr Lys Arg Tyr Thr Asn Pro Val Val Ile Gln Gly
325 330 335
Ala Gly Ala Gly Ala Ala Val Thr Ala Ala Gly Val Leu Gly Asp Val
340 345 350
Ile Lys Ile Ala Gln Arg Leu
355
<210> 28
<211> 310
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="高丝氨酸激酶"
<400> 28
Met Val Lys Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Ala Asn Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Phe Asp Val Leu Gly Ala Ala Val Thr Pro Val Asp Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Gly Asp Val Val Thr Val Glu Ala Ala Glu Thr Phe Ser Leu Asn Asn
35 40 45
Leu Gly Arg Phe Ala Asp Lys Leu Pro Ser Glu Pro Arg Glu Asn Ile
50 55 60
Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Phe Cys Gln Glu Leu Gly Lys Gln Ile
65 70 75 80
Pro Val Ala Met Thr Leu Glu Lys Asn Met Pro Ile Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Gly Ser Ser Ala Cys Ser Val Val Ala Ala Leu Met Ala Met Asn Glu
100 105 110
His Cys Gly Lys Pro Leu Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ala Leu Met Gly
115 120 125
Glu Leu Glu Gly Arg Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Asp Asn Val Ala
130 135 140
Pro Cys Phe Leu Gly Gly Met Gln Leu Met Ile Glu Glu Asn Asp Ile
145 150 155 160
Ile Ser Gln Gln Val Pro Gly Phe Asp Glu Trp Leu Trp Val Leu Ala
165 170 175
Tyr Pro Gly Ile Lys Val Ser Thr Ala Glu Ala Arg Ala Ile Leu Pro
180 185 190
Ala Gln Tyr Arg Arg Gln Asp Cys Ile Ala His Gly Arg His Leu Ala
195 200 205
Gly Phe Ile His Ala Cys Tyr Ser Arg Gln Pro Glu Leu Ala Ala Lys
210 215 220
Leu Met Lys Asp Val Ile Ala Glu Pro Tyr Arg Glu Arg Leu Leu Pro
225 230 235 240
Gly Phe Arg Gln Ala Arg Gln Ala Val Ala Glu Ile Gly Ala Val Ala
245 250 255
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Pro Thr Leu Phe Ala Leu Cys Asp Lys
260 265 270
Pro Glu Thr Ala Gln Arg Val Ala Asp Trp Leu Gly Lys Asn Tyr Leu
275 280 285
Gln Asn Gln Glu Gly Phe Val His Ile Cys Arg Leu Asp Thr Ala Gly
290 295 300
Ala Arg Val Leu Glu Asn
305 310
<210> 29
<211> 309
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="高丝氨酸激酶"
<400> 29
Met Asn Glu Ala Asp Met Leu Phe Ser Val Thr Val Pro Gly Ser Thr
1 5 10 15
Ala Asn Leu Gly Pro Gly Phe Asp Ser Val Gly Met Ala Leu Ser Arg
20 25 30
Tyr Leu Lys Leu Thr Val Phe Glu Ser Asp Lys Trp Ser Phe Glu Ala
35 40 45
Glu Thr Glu Thr Val Ala Gly Ile Pro Ala Gly Thr Asp Asn Leu Ile
50 55 60
Tyr Gln Val Ala Lys Arg Thr Ala Asp Leu Tyr Gly Lys Glu Met Pro
65 70 75 80
Pro Val His Val Lys Val Trp Ser Asp Ile Pro Leu Ala Arg Gly Leu
85 90 95
Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ile Val Ala Ala Ile Glu Leu Ala Asp Glu
100 105 110
Leu Cys Gly Leu Lys Leu Ser Glu Ala Asp Lys Leu His Leu Ala Ser
115 120 125
Leu Glu Glu Gly His Pro Asp Asn Ala Gly Ala Ser Leu Val Gly Gly
130 135 140
Leu Val Ile Gly Leu His Glu Asp Asp Glu Thr Gln Met Ile Arg Val
145 150 155 160
Pro Asn Ala Asp Ile Asp Val Val Val Val Ile Pro Phe Tyr Glu Val
165 170 175
Leu Thr Arg Asp Ala Arg Asp Val Leu Pro Lys Glu Phe Pro Tyr Ala
180 185 190
Asp Ala Val Lys Ala Ser Ala Val Ser Asn Ile Leu Ile Ala Ala Ile
195 200 205
Met Ser Lys Asp Trp Pro Leu Val Gly Lys Ile Met Lys Lys Asp Met
210 215 220
Phe His Gln Pro Tyr Arg Ala Met Leu Val Pro Glu Leu Ser Lys Val
225 230 235 240
Glu His Val Ala Glu Met Lys Gly Ala Tyr Gly Thr Ala Leu Ser Gly
245 250 255
Ala Gly Pro Thr Ile Leu Val Met Thr Glu Lys Gly Lys Gly Glu Glu
260 265 270
Leu Lys Glu Gln Leu Ala Leu His Phe Pro His Cys Glu Val Asp Ala
275 280 285
Leu Thr Val Pro Lys Glu Gly Ser Ile Ile Glu Arg Asn Pro Leu Tyr
290 295 300
Gln Val Lys Ser Val
305
<210> 30
<211> 316
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="高丝氨酸激酶"
<400> 30
Met Ser Val Phe Thr Pro Val Thr Arg Pro Glu Leu Glu Thr Phe Leu
1 5 10 15
Ala Pro Tyr Glu Leu Gly Arg Leu Leu Asp Phe Gln Gly Ile Ala Ala
20 25 30
Gly Thr Glu Asn Ser Asn Phe Phe Val Ser Leu Glu Gln Gly Glu Phe
35 40 45
Val Leu Thr Leu Ile Glu Arg Gly Pro Ser Glu Asp Met Pro Phe Phe
50 55 60
Ile Glu Leu Leu Asp Thr Leu His Gly Ala Asp Met Pro Val Pro Tyr
65 70 75 80
Ala Ile Arg Asp Arg Asp Gly Asn Gly Leu Arg Glu Leu Cys Gly Lys
85 90 95
Pro Ala Leu Leu Gln Pro Arg Leu Ser Gly Lys His Ile Lys Ala Pro
100 105 110
Asn Asn Gln His Cys Ala Gln Val Gly Glu Leu Leu Ala His Ile His
115 120 125
Leu Ala Thr Arg Glu His Ile Ile Glu Arg Arg Thr Asp Arg Gly Leu
130 135 140
Asp Trp Met Leu Ala Ser Gly Val Glu Leu Leu Pro Arg Leu Thr Ala
145 150 155 160
Glu Gln Ala Ala Leu Leu Gln Pro Ala Leu Asp Glu Ile Ser Ala His
165 170 175
Lys Ala Gln Ile Leu Ala Leu Pro Arg Ala Asn Leu His Ala Asp Leu
180 185 190
Phe Arg Asp Asn Val Met Phe Glu Gly Thr His Leu Thr Gly Val Ile
195 200 205
Asp Phe Tyr Asn Ala Cys Ser Gly Pro Met Leu Tyr Asp Ile Ala Ile
210 215 220
Thr Val Asn Asp Trp Cys Leu Asp Glu Gln Gly Ala Val Asp Val Pro
225 230 235 240
Arg Ala Gln Ala Leu Leu Ala Ala Tyr Ala Ala Leu Arg Pro Phe Thr
245 250 255
Ala Ala Glu Ala Glu Leu Trp Pro Glu Met Leu Arg Val Gly Cys Val
260 265 270
Arg Phe Trp Leu Ser Arg Leu Ile Ala Ala Glu Ser Phe Ala Gly Met
275 280 285
Asp Val Met Ile His Asp Pro Ser Glu Phe Glu Val Arg Leu Ala Gln
290 295 300
Arg Gln Gln Val Ala Leu His Leu Pro Phe Ala Leu
305 310 315
<210> 31
<211> 357
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<220>
<221> 来源
<223> /注解="高丝氨酸激酶"
<400> 31
Met Val Arg Ala Phe Lys Ile Lys Val Pro Ala Ser Ser Ala Asn Ile
1 5 10 15
Gly Pro Gly Tyr Asp Val Leu Gly Val Gly Leu Ser Leu Phe Leu Glu
20 25 30
Leu Asp Val Thr Ile Asp Ser Ser Gln Ala Gln Glu Thr Asn Asp Asp
35 40 45
Pro Asn Asn Cys Lys Leu Ser Tyr Thr Lys Glu Ser Glu Gly Tyr Ser
50 55 60
Thr Val Pro Leu Arg Ser Asp Ala Asn Leu Ile Thr Arg Thr Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Val Leu Arg Cys Asn Asn Ile Arg Asn Phe Pro Ser Gly Thr Lys
85 90 95
Val His Val Ser Asn Pro Ile Pro Leu Gly Arg Gly Leu Gly Ser Ser
100 105 110
Gly Ala Ala Val Val Ala Gly Val Ile Leu Gly Asn Glu Val Ala Gln
115 120 125
Leu Gly Phe Ser Lys Gln Arg Met Leu Asp Tyr Cys Leu Met Ile Glu
130 135 140
Arg His Pro Asp Asn Ile Thr Ala Ala Met Met Gly Gly Phe Cys Gly
145 150 155 160
Ser Phe Leu Arg Asp Leu Thr Pro Gln Glu Val Glu Arg Arg Glu Ile
165 170 175
Pro Leu Ala Glu Val Leu Pro Glu Pro Ser Gly Gly Glu Asp Thr Gly
180 185 190
Leu Val Pro Pro Leu Pro Pro Thr Asp Ile Gly Arg His Val Lys Tyr
195 200 205
Gln Trp Asn Pro Ala Ile Lys Cys Ile Ala Ile Ile Pro Gln Phe Glu
210 215 220
Leu Ser Thr Ala Asp Ser Arg Gly Val Leu Pro Lys Ala Tyr Pro Thr
225 230 235 240
Gln Asp Leu Val Phe Asn Leu Gln Arg Leu Ala Val Leu Thr Thr Ala
245 250 255
Leu Thr Met Asp Pro Pro Asn Ala Asp Leu Ile Tyr Pro Ala Met Gln
260 265 270
Asp Arg Val His Gln Pro Tyr Arg Lys Thr Leu Ile Pro Gly Leu Thr
275 280 285
Glu Ile Leu Ser Cys Val Thr Pro Ser Thr Tyr Pro Gly Leu Leu Gly
290 295 300
Ile Cys Leu Ser Gly Ala Gly Pro Thr Ile Leu Ala Leu Ala Thr Glu
305 310 315 320
Asn Phe Glu Glu Ile Ser Gln Glu Ile Ile Asn Arg Phe Ala Lys Asn
325 330 335
Gly Ile Lys Cys Ser Trp Lys Leu Leu Glu Pro Ala Tyr Asp Gly Ala
340 345 350
Ser Val Glu Gln Gln
355
<210> 32
<211> 428
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="苏氨酸合成酶"
<400> 32
Met Lys Leu Tyr Asn Leu Lys Asp His Asn Glu Gln Val Ser Phe Ala
1 5 10 15
Gln Ala Val Thr Gln Gly Leu Gly Lys Asn Gln Gly Leu Phe Phe Pro
20 25 30
His Asp Leu Pro Glu Phe Ser Leu Thr Glu Ile Asp Glu Met Leu Lys
35 40 45
Leu Asp Phe Val Thr Arg Ser Ala Lys Ile Leu Ser Ala Phe Ile Gly
50 55 60
Asp Glu Ile Pro Gln Glu Ile Leu Glu Glu Arg Val Arg Ala Ala Phe
65 70 75 80
Ala Phe Pro Ala Pro Val Ala Asn Val Glu Ser Asp Val Gly Cys Leu
85 90 95
Glu Leu Phe His Gly Pro Thr Leu Ala Phe Lys Asp Phe Gly Gly Arg
100 105 110
Phe Met Ala Gln Met Leu Thr His Ile Ala Gly Asp Lys Pro Val Thr
115 120 125
Ile Leu Thr Ala Thr Ser Gly Asp Thr Gly Ala Ala Val Ala His Ala
130 135 140
Phe Tyr Gly Leu Pro Asn Val Lys Val Val Ile Leu Tyr Pro Arg Gly
145 150 155 160
Lys Ile Ser Pro Leu Gln Glu Lys Leu Phe Cys Thr Leu Gly Gly Asn
165 170 175
Ile Glu Thr Val Ala Ile Asp Gly Asp Phe Asp Ala Cys Gln Ala Leu
180 185 190
Val Lys Gln Ala Phe Asp Asp Glu Glu Leu Lys Val Ala Leu Gly Leu
195 200 205
Asn Ser Ala Asn Ser Ile Asn Ile Ser Arg Leu Leu Ala Gln Ile Cys
210 215 220
Tyr Tyr Phe Glu Ala Val Ala Gln Leu Pro Gln Glu Thr Arg Asn Gln
225 230 235 240
Leu Val Val Ser Val Pro Ser Gly Asn Phe Gly Asp Leu Thr Ala Gly
245 250 255
Leu Leu Ala Lys Ser Leu Gly Leu Pro Val Lys Arg Phe Ile Ala Ala
260 265 270
Thr Asn Val Asn Asp Thr Val Pro Arg Phe Leu His Asp Gly Gln Trp
275 280 285
Ser Pro Lys Ala Thr Gln Ala Thr Leu Ser Asn Ala Met Asp Val Ser
290 295 300
Gln Pro Asn Asn Trp Pro Arg Val Glu Glu Leu Phe Arg Arg Lys Ile
305 310 315 320
Trp Gln Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Ala Ala Val Asp Asp Glu Thr Thr
325 330 335
Gln Gln Thr Met Arg Glu Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Ser Glu Pro
340 345 350
His Ala Ala Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg Asp Gln Leu Asn Pro Gly
355 360 365
Glu Tyr Gly Leu Phe Leu Gly Thr Ala His Pro Ala Lys Phe Lys Glu
370 375 380
Ser Val Glu Ala Ile Leu Gly Glu Thr Leu Asp Leu Pro Lys Glu Leu
385 390 395 400
Ala Glu Arg Ala Asp Leu Pro Leu Leu Ser His Asn Leu Pro Ala Asp
405 410 415
Phe Ala Ala Leu Arg Lys Leu Met Met Asn His Gln
420 425
<210> 33
<211> 352
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="苏氨酸合成酶"
<400> 33
Met Trp Lys Gly Leu Ile His Gln Tyr Lys Glu Phe Leu Pro Val Thr
1 5 10 15
Asp Gln Thr Pro Ala Leu Thr Leu His Glu Gly Asn Thr Pro Leu Ile
20 25 30
His Leu Pro Lys Leu Ser Glu Gln Leu Gly Ile Glu Leu His Val Lys
35 40 45
Thr Glu Gly Val Asn Pro Thr Gly Ser Phe Lys Asp Arg Gly Met Val
50 55 60
Met Ala Val Ala Lys Ala Lys Glu Glu Gly Asn Asp Thr Ile Met Cys
65 70 75 80
Ala Ser Thr Gly Asn Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Ala Ala Arg
85 90 95
Ala Asn Met Lys Cys Ile Val Ile Ile Pro Asn Gly Lys Ile Ala Phe
100 105 110
Gly Lys Leu Ala Gln Ala Val Met Tyr Gly Ala Glu Ile Ile Ala Ile
115 120 125
Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Leu Lys Ile Val Arg Ser Ile Cys Glu
130 135 140
Lys Ser Pro Ile Ala Leu Val Asn Ser Val Asn Pro Tyr Arg Ile Glu
145 150 155 160
Gly Gln Lys Thr Ala Ala Phe Glu Val Cys Glu Gln Leu Gly Glu Ala
165 170 175
Pro Asp Val Leu Ala Ile Pro Val Gly Asn Ala Gly Asn Ile Thr Ala
180 185 190
Tyr Trp Lys Gly Phe Lys Glu Tyr His Glu Lys Asn Gly Thr Gly Leu
195 200 205
Pro Lys Met Arg Gly Phe Glu Ala Glu Gly Ala Ala Ala Ile Val Arg
210 215 220
Asn Glu Val Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ile Ala Thr Ala Ile Arg Ile
225 230 235 240
Gly Asn Pro Ala Ser Trp Asp Lys Ala Val Lys Ala Ala Glu Glu Ser
245 250 255
Asn Gly Lys Ile Asp Glu Val Thr Asp Asp Glu Ile Leu His Ala Tyr
260 265 270
Gln Leu Ile Ala Arg Val Glu Gly Val Phe Ala Glu Pro Gly Ser Cys
275 280 285
Ala Ser Ile Ala Gly Val Leu Lys Gln Val Lys Ser Gly Glu Ile Pro
290 295 300
Lys Gly Ser Lys Val Val Ala Val Leu Thr Gly Asn Gly Leu Lys Asp
305 310 315 320
Pro Asn Thr Ala Val Asp Ile Ser Glu Ile Lys Pro Val Thr Leu Pro
325 330 335
Thr Asp Glu Asp Ser Ile Leu Glu Tyr Val Lys Gly Ala Ala Arg Val
340 345 350
<210> 34
<211> 481
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="苏氨酸合成酶"
<400> 34
Met Asp Tyr Ile Ser Thr Arg Asp Ala Ser Arg Thr Pro Ala Arg Phe
1 5 10 15
Ser Asp Ile Leu Leu Gly Gly Leu Ala Pro Asp Gly Gly Leu Tyr Leu
20 25 30
Pro Ala Thr Tyr Pro Gln Leu Asp Asp Ala Gln Leu Ser Lys Trp Arg
35 40 45
Glu Val Leu Ala Asn Glu Gly Tyr Ala Ala Leu Ala Ala Glu Val Ile
50 55 60
Ser Leu Phe Val Asp Asp Ile Pro Val Glu Asp Ile Lys Ala Ile Thr
65 70 75 80
Ala Arg Ala Tyr Thr Tyr Pro Lys Phe Asn Ser Glu Asp Ile Val Pro
85 90 95
Val Thr Glu Leu Glu Asp Asn Ile Tyr Leu Gly His Leu Ser Glu Gly
100 105 110
Pro Thr Ala Ala Phe Lys Asp Met Ala Met Gln Leu Leu Gly Glu Leu
115 120 125
Phe Glu Tyr Glu Leu Arg Arg Arg Asn Glu Thr Ile Asn Ile Leu Gly
130 135 140
Ala Thr Ser Gly Asp Thr Gly Ser Ser Ala Glu Tyr Ala Met Arg Gly
145 150 155 160
Arg Glu Gly Ile Arg Val Phe Met Leu Thr Pro Ala Gly Arg Met Thr
165 170 175
Pro Phe Gln Gln Ala Gln Met Phe Gly Leu Asp Asp Pro Asn Ile Phe
180 185 190
Asn Ile Ala Leu Asp Gly Val Phe Asp Asp Cys Gln Asp Val Val Lys
195 200 205
Ala Val Ser Ala Asp Ala Glu Phe Lys Lys Asp Asn Arg Ile Gly Ala
210 215 220
Val Asn Ser Ile Asn Trp Ala Arg Leu Met Ala Gln Val Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Val Ser Ser Trp Ile Arg Thr Thr Thr Ser Asn Asp Gln Lys Val Ser
245 250 255
Phe Ser Val Pro Thr Gly Asn Phe Gly Asp Ile Cys Ala Gly His Ile
260 265 270
Ala Arg Gln Met Gly Leu Pro Ile Asp Arg Leu Ile Val Ala Thr Asn
275 280 285
Glu Asn Asp Val Leu Asp Glu Phe Phe Arg Thr Gly Asp Tyr Arg Val
290 295 300
Arg Ser Ser Ala Asp Thr His Glu Thr Ser Ser Pro Ser Met Asp Ile
305 310 315 320
Ser Arg Ala Ser Asn Phe Glu Arg Phe Ile Phe Asp Leu Leu Gly Arg
325 330 335
Asp Ala Thr Arg Val Asn Asp Leu Phe Gly Thr Gln Val Arg Gln Gly
340 345 350
Gly Phe Ser Leu Ala Asp Asp Ala Asn Phe Glu Lys Ala Ala Ala Glu
355 360 365
Tyr Gly Phe Ala Ser Gly Arg Ser Thr His Ala Asp Arg Val Ala Thr
370 375 380
Ile Ala Asp Val His Ser Arg Leu Asp Val Leu Ile Asp Pro His Thr
385 390 395 400
Ala Asp Gly Val His Val Ala Arg Gln Trp Arg Asp Glu Val Asn Thr
405 410 415
Pro Ile Ile Val Leu Glu Thr Ala Leu Pro Val Lys Phe Ala Asp Thr
420 425 430
Ile Val Glu Ala Ile Gly Glu Ala Pro Gln Thr Pro Glu Arg Phe Ala
435 440 445
Ala Ile Met Asp Ala Pro Phe Lys Val Ser Asp Leu Pro Asn Asp Thr
450 455 460
Asp Ala Val Lys Gln Tyr Ile Val Asp Ala Ile Ala Asn Thr Ser Val
465 470 475 480
Lys
<210> 35
<211> 329
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="苏氨酸脱氨酶(TdcB)"
<400> 35
Met His Ile Thr Tyr Asp Leu Pro Val Ala Ile Asp Asp Ile Ile Glu
1 5 10 15
Ala Lys Gln Arg Leu Ala Gly Arg Ile Tyr Lys Thr Gly Met Pro Arg
20 25 30
Ser Asn Tyr Phe Ser Glu Arg Cys Lys Gly Glu Ile Phe Leu Lys Phe
35 40 45
Glu Asn Met Gln Arg Thr Gly Ser Phe Lys Ile Arg Gly Ala Phe Asn
50 55 60
Lys Leu Ser Ser Leu Thr Asp Ala Glu Lys Arg Lys Gly Val Val Ala
65 70 75 80
Cys Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ser Leu Ser Cys Ala Met
85 90 95
Leu Gly Ile Asp Gly Lys Val Val Met Pro Lys Gly Ala Pro Lys Ser
100 105 110
Lys Val Ala Ala Thr Cys Asp Tyr Ser Ala Glu Val Val Leu His Gly
115 120 125
Asp Asn Phe Asn Asp Thr Ile Ala Lys Val Ser Glu Ile Val Glu Met
130 135 140
Glu Gly Arg Ile Phe Ile Pro Pro Tyr Asp Asp Pro Lys Val Ile Ala
145 150 155 160
Gly Gln Gly Thr Ile Gly Leu Glu Ile Met Glu Asp Leu Tyr Asp Val
165 170 175
Asp Asn Val Ile Val Pro Ile Gly Gly Gly Gly Leu Ile Ala Gly Ile
180 185 190
Ala Val Ala Ile Lys Ser Ile Asn Pro Thr Ile Arg Val Ile Gly Val
195 200 205
Gln Ser Glu Asn Val His Gly Met Ala Ala Ser Phe His Ser Gly Glu
210 215 220
Ile Thr Thr His Arg Thr Thr Gly Thr Leu Ala Asp Gly Cys Asp Val
225 230 235 240
Ser Arg Pro Gly Asn Leu Thr Tyr Glu Ile Val Arg Glu Leu Val Asp
245 250 255
Asp Ile Val Leu Val Ser Glu Asp Glu Ile Arg Asn Ser Met Ile Ala
260 265 270
Leu Ile Gln Arg Asn Lys Val Val Thr Glu Gly Ala Gly Ala Leu Ala
275 280 285
Cys Ala Ala Leu Leu Ser Gly Lys Leu Asp Gln Tyr Ile Gln Asn Arg
290 295 300
Lys Thr Val Ser Ile Ile Ser Gly Gly Asn Ile Asp Leu Ser Arg Val
305 310 315 320
Ser Gln Ile Thr Gly Phe Val Asp Ala
325
<210> 36
<211> 514
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="苏氨酸脱氨酶(IlvA)"
<400> 36
Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr
1 5 10 15
Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr
20 25 30
Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile
35 40 45
Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg
50 55 60
Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His
65 70 75 80
Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe
85 90 95
Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala
100 105 110
Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val
115 120 125
Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu
130 135 140
Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro
145 150 155 160
Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln
165 170 175
Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu
180 185 190
Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys
195 200 205
Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu
210 215 220
Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu
225 230 235 240
Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln
245 250 255
Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala
260 265 270
Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Glu Pro Ser
275 280 285
Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn
290 295 300
Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn
305 310 315 320
Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln
325 330 335
Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe
340 345 350
Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn
355 360 365
Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg
370 375 380
Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn
385 390 395 400
Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys
405 410 415
Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln
420 425 430
Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Pro Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu
435 440 445
Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His
450 455 460
Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu
465 470 475 480
Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly
485 490 495
Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu
500 505 510
Ala Gly
<210> 37
<211> 422
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="苏氨酸脱氨酶(IlvA)"
<400> 37
Met Lys Pro Leu Leu Lys Glu Asn Ser Leu Ile Gln Val Lys Asp Ile
1 5 10 15
Leu Lys Ala His Gln Asn Val Lys Asp Val Val Ile His Thr Pro Leu
20 25 30
Gln Arg Asn Asp Arg Leu Ser Glu Arg Tyr Glu Cys Asn Ile Tyr Leu
35 40 45
Lys Arg Glu Asp Leu Gln Val Val Arg Ser Phe Lys Leu Arg Gly Ala
50 55 60
Tyr His Lys Met Lys Gln Leu Ser Ser Glu Gln Thr Glu Asn Gly Val
65 70 75 80
Val Cys Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe Ser Cys
85 90 95
Lys His Leu Gly Ile His Gly Lys Ile Phe Met Pro Ser Thr Thr Pro
100 105 110
Arg Gln Lys Val Ser Gln Val Glu Leu Phe Gly Lys Gly Phe Ile Asp
115 120 125
Ile Ile Leu Thr Gly Asp Thr Phe Asp Asp Ala Tyr Lys Ser Ala Ala
130 135 140
Glu Cys Cys Glu Ala Glu Ser Arg Thr Phe Ile His Pro Phe Asp Asp
145 150 155 160
Pro Asp Val Met Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Val Glu Ile Leu Asn
165 170 175
Asp Ile Asp Thr Glu Pro His Phe Leu Phe Ala Ser Val Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Leu Leu Ser Gly Val Gly Thr Tyr Leu Lys Asn Val Ser Pro Asp
195 200 205
Thr Lys Val Ile Ala Val Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Tyr Phe Glu
210 215 220
Ser Asn Lys Ala Gly His Val Val Thr Leu Asp Lys Ile Asp Lys Phe
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Val Asp Gly Ala Ala Val Lys Lys Ile Gly Glu Glu Thr Phe Arg Thr
245 250 255
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290 295 300
Ile Lys Gly Lys Asn Val Val Cys Val Val Ser Gly Gly Asn Asn Asp
305 310 315 320
Ile Gly Arg Met Gln Glu Met Lys Glu Arg Ser Leu Ile Phe Glu Gly
325 330 335
Leu Gln His Tyr Phe Ile Val Asn Phe Pro Gln Arg Ala Gly Ala Leu
340 345 350
Arg Glu Phe Leu Asp Glu Val Leu Gly Pro Asn Asp Asp Ile Thr Arg
355 360 365
Phe Glu Tyr Thr Lys Lys Asn Asn Lys Ser Asn Gly Pro Ala Leu Val
370 375 380
Gly Ile Glu Leu Gln Asn Lys Ala Asp Tyr Gly Pro Leu Ile Glu Arg
385 390 395 400
Met Asn Lys Lys Pro Phe His Tyr Val Glu Val Asn Lys Asp Glu Asp
405 410 415
Leu Phe His Leu Leu Ile
420
<210> 38
<211> 436
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="苏氨酸脱氨酶(IlvA)"
<400> 38
Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg
20 25 30
Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu
35 40 45
Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln
50 55 60
Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln
65 70 75 80
Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly
85 90 95
Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln
100 105 110
Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg
115 120 125
Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn
130 135 140
Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr
145 150 155 160
Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly
165 170 175
Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly
180 185 190
Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu
195 200 205
Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile
210 215 220
Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His
225 230 235 240
Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly
245 250 255
Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys
260 265 270
Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys
275 280 285
Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro
290 295 300
Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro
305 310 315 320
Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu
325 330 335
Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys
340 345 350
His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His
355 360 365
Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Thr Leu Phe Glu
370 375 380
Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile
385 390 395 400
His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu
405 410 415
Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr
420 425 430
Glu Tyr Leu Thr
435
<210> 39
<211> 310
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="苏氨酸脱氨酶(TdcB)"
<400> 39
Met Leu Thr Leu Asn Asp Val Ile Thr Ala Gln Gln Arg Thr Ala Pro
1 5 10 15
His Val Arg Arg Thr Pro Leu Phe Glu Ala Asp Pro Ile Asp Gly Thr
20 25 30
Gln Ile Trp Ile Lys Ala Glu Phe Leu Gln Lys Cys Gly Val Phe Lys
35 40 45
Thr Arg Gly Ala Phe Asn Arg Gln Leu Ala Ala Ser Glu Asn Gly Leu
50 55 60
Leu Asp Pro Thr Val Gly Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Asn Ala Gly
65 70 75 80
Leu Ala Asn Ala Phe Ala Ala Ala Ser Leu Ser Val Pro Ala Thr Val
85 90 95
Leu Val Pro Glu Thr Ala Pro Gln Val Lys Val Asp Arg Leu Lys Gln
100 105 110
Tyr Gly Ala Thr Val Gln Gln Ile Gly Ser Glu Tyr Ala Glu Ala Phe
115 120 125
Glu Ala Ala Gln Thr Phe Glu Ser Glu Thr Gly Ala Leu Phe Cys His
130 135 140
Ala Tyr Asp Gln Pro Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Val Ile Gly Leu
145 150 155 160
Glu Ile Val Glu Asp Leu Pro Asp Val Asp Thr Ile Val Val Ala Val
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Leu Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Val Val Ala Ala His
180 185 190
Asp Ile Lys Val Val Ala Val Glu Pro Ser Lys Ile Pro Thr Leu His
195 200 205
Asn Ser Leu Ile Ala Gly Gln Pro Val Asp Val Asn Val Ser Gly Ile
210 215 220
Ala Ala Asp Ser Leu Gly Ala Arg Gln Ile Gly Arg Glu Ala Phe Asp
225 230 235 240
Ile Ala Thr Ala His Pro Pro Ile Gly Val Leu Val Asp Asp Glu Ala
245 250 255
Ile Ile Ala Ala Arg Arg His Leu Trp Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala
260 265 270
Glu His Gly Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ser Leu Thr Ser Gly Ala Tyr
275 280 285
Lys Pro Ala Ala Asp Glu Lys Val Ala Val Ile Val Cys Gly Ala Asn
290 295 300
Thr Asp Leu Thr Thr Leu
305 310
<210> 40
<211> 491
<212> PRT
<213> 詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="柠苹酸合成酶"
<400> 40
Met Met Val Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Thr
1 5 10 15
Pro Gly Val Ser Leu Thr Pro Asn Asp Lys Leu Glu Ile Ala Lys Lys
20 25 30
Leu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Ile Glu Ala Gly Ser Ala Ile Thr
35 40 45
Ser Lys Gly Glu Arg Glu Gly Ile Lys Leu Ile Thr Lys Glu Gly Leu
50 55 60
Asn Ala Glu Ile Cys Ser Phe Val Arg Ala Leu Pro Val Asp Ile Asp
65 70 75 80
Ala Ala Leu Glu Cys Asp Val Asp Ser Val His Leu Val Val Pro Thr
85 90 95
Ser Pro Ile His Met Lys Tyr Lys Leu Arg Lys Thr Glu Asp Glu Val
100 105 110
Leu Glu Thr Ala Leu Lys Ala Val Glu Tyr Ala Lys Glu His Gly Leu
115 120 125
Ile Val Glu Leu Ser Ala Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Val Asn Phe
130 135 140
Leu Ile Lys Leu Phe Asn Glu Gly Glu Lys Val Gly Ala Asp Arg Val
145 150 155 160
Cys Val Cys Asp Thr Val Gly Val Leu Thr Pro Gln Lys Ser Gln Glu
165 170 175
Leu Phe Lys Lys Ile Thr Glu Asn Val Asn Leu Pro Val Ser Val His
180 185 190
Cys His Asn Asp Phe Gly Met Ala Thr Ala Asn Thr Cys Ser Ala Val
195 200 205
Leu Gly Gly Ala Val Gln Cys His Val Thr Val Asn Gly Ile Gly Glu
210 215 220
Arg Ala Gly Asn Ala Ser Leu Glu Glu Val Val Ala Ala Leu Lys Ile
225 230 235 240
Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Lys Ile Lys Met Glu Lys Leu Tyr Glu Val
245 250 255
Ser Arg Ile Val Ser Arg Leu Met Lys Leu Pro Val Pro Pro Asn Lys
260 265 270
Ala Ile Val Gly Asp Asn Ala Phe Ala His Glu Ala Gly Ile His Val
275 280 285
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290 295 300
Met Val Gly Asn Arg Arg Arg Ile Ile Leu Gly Lys His Ser Gly Arg
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340 345 350
Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ala Ile Val Arg Glu Val
355 360 365
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370 375 380
Val Ser Gly Asn Lys Ile Thr Pro Ile Ala Ser Val Lys Leu His Tyr
385 390 395 400
Lys Gly Glu Asp Ile Thr Leu Ile Glu Thr Ala Tyr Gly Val Gly Pro
405 410 415
Val Asp Ala Ala Ile Asn Ala Val Arg Lys Ala Ile Ser Gly Val Ala
420 425 430
Asp Ile Lys Leu Val Glu Tyr Arg Val Glu Ala Ile Gly Gly Gly Thr
435 440 445
Asp Ala Leu Ile Glu Val Val Val Lys Leu Arg Lys Gly Thr Glu Ile
450 455 460
Val Glu Val Arg Lys Ser Asp Ala Asp Ile Ile Arg Ala Ser Val Asp
465 470 475 480
Ala Val Met Glu Gly Ile Asn Met Leu Leu Asn
485 490
<210> 41
<211> 372
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
詹氏甲烷球菌柠苹酸合成酶变体多肽"
<400> 41
Met Met Val Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Thr
1 5 10 15
Pro Gly Val Ser Leu Thr Pro Asn Asp Lys Leu Glu Ile Ala Lys Lys
20 25 30
Leu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Ile Glu Ala Gly Ser Ala Val Thr
35 40 45
Ser Lys Gly Glu Arg Glu Gly Ile Lys Leu Ile Thr Lys Glu Gly Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Ala Ala Leu Glu Cys Asp Val Asp Ser Val His Leu Val Val Pro Thr
85 90 95
Ser Pro Ile His Met Lys Tyr Lys Leu Arg Lys Thr Glu Asp Glu Val
100 105 110
Leu Val Thr Ala Leu Lys Ala Val Glu Tyr Ala Lys Glu Gln Gly Leu
115 120 125
Ile Val Glu Leu Ser Ala Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Val Asn Phe
130 135 140
Leu Ile Lys Leu Phe Asn Glu Gly Glu Lys Val Gly Ala Asp Arg Val
145 150 155 160
Cys Val Cys Asp Thr Val Gly Val Leu Thr Pro Gln Lys Ser Gln Glu
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Cys His Asn Asp Phe Gly Met Ala Thr Ala Asn Ala Cys Ser Ala Val
195 200 205
Leu Gly Gly Ala Val Gln Cys His Val Thr Val Asn Gly Ile Gly Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Lys Ile Lys Met Glu Lys Leu Tyr Glu Val
245 250 255
Ser Arg Ile Val Ser Arg Leu Met Lys Leu Pro Val Pro Pro Asn Lys
260 265 270
Ala Ile Val Gly Asp Asn Ala Phe Ala His Glu Ala Gly Ile His Val
275 280 285
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290 295 300
Met Val Gly Asn Arg Arg Arg Ile Ile Leu Gly Lys His Ser Gly Arg
305 310 315 320
Lys Ala Leu Lys Tyr Lys Leu Asp Leu Met Gly Ile Asn Val Ser Asp
325 330 335
Glu Gln Leu Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Lys Glu Phe Gly Asp Leu
340 345 350
Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ala Ile Val Arg Glu Val
355 360 365
Thr Gly Lys Leu
370
<210> 42
<211> 516
<212> PRT
<213> 问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="柠苹酸合成酶"
<400> 42
Met Thr Lys Val Glu Thr Arg Leu Glu Ile Leu Asp Val Thr Leu Arg
1 5 10 15
Asp Gly Glu Gln Thr Arg Gly Val Ser Phe Ser Thr Ser Glu Lys Leu
20 25 30
Asn Ile Ala Lys Phe Leu Leu Gln Lys Leu Asn Val Asp Arg Val Glu
35 40 45
Ile Ala Ser Ala Arg Val Ser Lys Gly Glu Leu Glu Thr Val Gln Lys
50 55 60
Ile Met Glu Trp Ala Ala Thr Glu Gln Leu Thr Glu Arg Ile Glu Ile
65 70 75 80
Leu Gly Phe Val Asp Gly Asn Lys Thr Val Asp Trp Ile Lys Asp Ser
85 90 95
Gly Ala Lys Val Leu Asn Leu Leu Thr Lys Gly Ser Leu His His Leu
100 105 110
Glu Lys Gln Leu Gly Lys Thr Pro Lys Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser
115 120 125
Phe Val Ile Glu Tyr Ala Ile Lys Ser Gly Leu Lys Ile Asn Val Tyr
130 135 140
Leu Glu Asp Trp Ser Asn Gly Phe Arg Asn Ser Pro Asp Tyr Val Lys
145 150 155 160
Ser Leu Val Glu His Leu Ser Lys Glu His Ile Glu Arg Ile Phe Leu
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Pro Asp Thr Leu Gly Val Leu Ser Pro Glu Glu Thr Phe Gln Gly Val
180 185 190
Asp Ser Leu Ile Gln Lys Tyr Pro Asp Ile His Phe Glu Phe His Gly
195 200 205
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210 215 220
Ala Gly Val Lys Gly Leu His Ala Ser Ile Asn Gly Leu Gly Glu Arg
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Ala Gly Asn Thr Pro Leu Glu Ala Leu Val Thr Thr Ile His Asp Lys
245 250 255
Ser Asn Ser Lys Thr Asn Ile Asn Glu Ile Ala Ile Thr Glu Ala Ser
260 265 270
Arg Leu Val Glu Val Phe Ser Gly Lys Arg Ile Ser Ala Asn Arg Pro
275 280 285
Ile Val Gly Glu Asp Val Phe Thr Gln Thr Ala Gly Val His Ala Asp
290 295 300
Gly Asp Lys Lys Gly Asn Leu Tyr Ala Asn Pro Ile Leu Pro Glu Arg
305 310 315 320
Phe Gly Arg Lys Arg Ser Tyr Ala Leu Gly Lys Leu Ala Gly Lys Ala
325 330 335
Ser Ile Ser Glu Asn Val Lys Gln Leu Gly Met Val Leu Ser Glu Val
340 345 350
Val Leu Gln Lys Val Leu Glu Arg Val Ile Glu Leu Gly Asp Gln Asn
355 360 365
Lys Leu Val Thr Pro Glu Asp Leu Pro Phe Ile Ile Ala Asp Val Ser
370 375 380
Gly Arg Thr Gly Glu Lys Val Leu Thr Ile Lys Ser Cys Asn Ile His
385 390 395 400
Ser Gly Ile Gly Ile Arg Pro His Ala Gln Ile Glu Leu Glu Tyr Gln
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Gly Lys Ile His Lys Glu Ile Ser Glu Gly Asp Gly Gly Tyr Asp Ala
420 425 430
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435 440 445
Pro Lys Leu Ile Asp Tyr Glu Val Arg Ile Pro Pro Gly Gly Lys Thr
450 455 460
Asp Ala Leu Val Glu Thr Arg Ile Thr Trp Asn Lys Ser Leu Asp Leu
465 470 475 480
Glu Glu Asp Gln Thr Phe Lys Thr Met Gly Val His Pro Asp Gln Thr
485 490 495
Val Ala Ala Val His Ala Thr Glu Lys Met Leu Asn Gln Ile Leu Gln
500 505 510
Pro Trp Gln Ile
515
<210> 43
<211> 386
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
问号钩端螺旋体柠苹酸合成酶变体
多肽"
<400> 43
Met Thr Lys Val Glu Thr Arg Leu Glu Ile Leu Asp Val Thr Leu Arg
1 5 10 15
Asp Gly Glu Gln Thr Arg Gly Val Ser Phe Ser Thr Ser Glu Lys Leu
20 25 30
Asn Ile Ala Lys Phe Leu Leu Gln Lys Leu Asn Val Asp Arg Val Glu
35 40 45
Ile Ala Ser Ala Arg Val Ser Lys Gly Glu Leu Glu Thr Val Gln Lys
50 55 60
Ile Met Glu Trp Ala Ala Thr Glu Gln Leu Thr Glu Arg Ile Glu Ile
65 70 75 80
Leu Gly Phe Val Asp Gly Asn Lys Thr Val Asp Trp Ile Lys Asp Ser
85 90 95
Gly Ala Lys Val Leu Asn Leu Leu Thr Lys Gly Ser Leu His His Leu
100 105 110
Glu Lys Gln Leu Gly Lys Thr Pro Lys Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser
115 120 125
Phe Val Ile Glu Tyr Ala Ile Lys Ser Gly Leu Lys Ile Asn Val Tyr
130 135 140
Leu Glu Asp Trp Ser Asn Gly Phe Arg Asn Ser Pro Asp Tyr Val Lys
145 150 155 160
Ser Leu Val Glu His Leu Ser Lys Glu His Ile Glu Arg Ile Phe Leu
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Pro Asp Thr Leu Gly Val Leu Ser Pro Glu Glu Thr Phe Gln Gly Val
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Asp Ser Leu Ile Gln Lys Tyr Pro Asp Ile His Phe Glu Phe His Gly
195 200 205
His Asn Asp Tyr Asp Leu Ser Val Ala Asn Ser Leu Gln Ala Ile Arg
210 215 220
Ala Gly Val Lys Gly Leu His Ala Ser Ile Asn Gly Leu Gly Glu Arg
225 230 235 240
Ala Gly Asn Thr Pro Leu Glu Ala Leu Val Thr Thr Ile His Asp Lys
245 250 255
Ser Asn Ser Lys Thr Asn Ile Asn Glu Ile Ala Ile Thr Glu Ala Ser
260 265 270
Arg Leu Val Glu Val Phe Ser Gly Lys Arg Ile Ser Ala Asn Arg Pro
275 280 285
Ile Val Gly Glu Asp Val Phe Thr Gln Thr Ala Gly Val His Ala Asp
290 295 300
Gly Asp Lys Lys Gly Asn Leu Tyr Ala Asn Pro Ile Leu Pro Glu Arg
305 310 315 320
Phe Gly Arg Lys Arg Ser Tyr Ala Leu Gly Lys Leu Ala Gly Lys Ala
325 330 335
Ser Ile Ser Glu Asn Val Lys Gln Leu Gly Met Val Leu Ser Glu Val
340 345 350
Val Leu Gln Lys Val Leu Glu Arg Val Ile Glu Leu Gly Asp Gln Asn
355 360 365
Lys Leu Val Thr Pro Glu Asp Leu Pro Phe Ile Ile Ala Asp Val Ser
370 375 380
Gly Arg
385
<210> 44
<211> 466
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="异丙基苹果酸异构酶大亚基"
<400> 44
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Val Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Leu Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 45
<211> 201
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="异丙基苹果酸异构酶小亚基"
<400> 45
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Leu Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
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Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
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Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 46
<211> 472
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="异丙基苹果酸异构酶大亚基"
<400> 46
Met Met Pro Arg Thr Ile Ile Glu Lys Ile Trp Asp Gln His Ile Val
1 5 10 15
Lys His Gly Glu Gly Lys Pro Asp Leu Leu Tyr Ile Asp Leu His Leu
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Ile His Glu Val Thr Ser Pro Gln Ala Phe Glu Gly Leu Arg Gln Lys
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Gly Arg Lys Val Arg Arg Pro Gln Asn Thr Phe Ala Thr Met Asp His
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Asn Ile Pro Thr Val Asn Arg Phe Glu Ile Lys Asp Glu Val Ala Lys
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Arg Gln Val Thr Ala Leu Glu Arg Asn Cys Glu Glu Phe Gly Val Arg
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Leu Ala Asp Leu His Ser Val Asp Gln Gly Ile Val His Val Val Gly
100 105 110
Pro Glu Leu Gly Leu Thr Leu Pro Gly Lys Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ser Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
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Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ser Thr Gln Thr Leu Trp Gln
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165 170 175
Gly Val Thr Ala Lys Asp Val Ile Leu Ala Val Ile Gly Lys Tyr Gly
180 185 190
Val Lys Phe Gly Thr Gly Tyr Val Ile Glu Tyr Thr Gly Glu Val Phe
195 200 205
Arg Asn Met Thr Met Asp Glu Arg Met Thr Val Cys Asn Met Ser Ile
210 215 220
Glu Ala Gly Ala Arg Ala Gly Leu Ile Ala Pro Asp Glu Val Thr Phe
225 230 235 240
Glu Tyr Cys Lys Asn Arg Lys Tyr Thr Pro Lys Gly Glu Glu Phe Asp
245 250 255
Lys Ala Val Glu Glu Trp Lys Ala Leu Arg Thr Asp Pro Gly Ala Val
260 265 270
Tyr Asp Lys Ser Ile Val Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Pro Met Val
275 280 285
Thr Trp Gly Ile Asn Pro Gly Met Val Leu Pro Val Asp Ser Glu Val
290 295 300
Pro Ala Pro Glu Ser Phe Ser Ala Glu Asp Asp Lys Lys Glu Ala Ile
305 310 315 320
Arg Ala Tyr Glu Tyr Met Gly Leu Thr Pro His Gln Lys Ile Glu Asp
325 330 335
Ile Lys Val Glu His Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Met
340 345 350
Thr Asp Leu Arg Gln Ala Ala Asp Met Ile Lys Gly Lys Lys Val Ala
355 360 365
Asp Ser Val Arg Ala Ile Val Val Pro Gly Ser Gln Ser Val Lys Leu
370 375 380
Gln Ala Glu Lys Glu Gly Leu Asp Gln Ile Phe Leu Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Glu Ser Gly Cys Ser Met Cys Leu Ser Met Asn Asn Asp
405 410 415
Val Val Pro Glu Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Lys Gly Ala Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Met Ala Ala Ile His Gly His Phe Val Asp Val Arg Lys
450 455 460
Phe Tyr Gln Glu Lys Thr Val Val
465 470
<210> 47
<211> 199
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="异丙基苹果酸异构酶小亚基"
<400> 47
Met Glu Pro Leu Lys Ser His Thr Gly Lys Ala Ala Val Leu Asn Arg
1 5 10 15
Ile Asn Val Asp Thr Asp Gln Ile Ile Pro Lys Gln Phe Leu Lys Arg
20 25 30
Ile Glu Arg Thr Gly Tyr Gly Arg Phe Ala Phe Phe Asp Trp Arg Tyr
35 40 45
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Ser Ser Arg Glu His Ala Pro Trp Ala Leu Asp Asp Tyr Gly Phe Lys
85 90 95
Ile Ile Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe His Gln Asn Cys Phe
100 105 110
Lys Asn Gly Met Leu Pro Ile Arg Met Pro Tyr Asp Asn Trp Lys Gln
115 120 125
Leu Val Gly Gln Tyr Glu Asn Gln Ser Leu Gln Met Thr Val Asp Leu
130 135 140
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180 185 190
Arg Ser Ser Trp Leu Gln Ala
195
<210> 48
<211> 363
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β-异丙基苹果酸脱氢酶"
<400> 48
Met Ser Lys Asn Tyr His Ile Ala Val Leu Pro Gly Asp Gly Ile Gly
1 5 10 15
Pro Glu Val Met Thr Gln Ala Leu Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Asn
20 25 30
Arg Phe Ala Met Arg Ile Thr Thr Ser His Tyr Asp Val Gly Gly Ala
35 40 45
Ala Ile Asp Asn His Gly Gln Pro Leu Pro Pro Ala Thr Val Glu Gly
50 55 60
Cys Glu Gln Ala Asp Ala Val Leu Phe Gly Ser Val Gly Gly Pro Lys
65 70 75 80
Trp Glu His Leu Pro Pro Asp Gln Gln Pro Glu Arg Gly Ala Leu Leu
85 90 95
Pro Leu Arg Lys His Phe Lys Leu Phe Ser Asn Leu Arg Pro Ala Lys
100 105 110
Leu Tyr Gln Gly Leu Glu Ala Phe Cys Pro Leu Arg Ala Asp Ile Ala
115 120 125
Ala Asn Gly Phe Asp Ile Leu Cys Val Arg Glu Leu Thr Gly Gly Ile
130 135 140
Tyr Phe Gly Gln Pro Lys Gly Arg Glu Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Lys
145 150 155 160
Ala Phe Asp Thr Glu Val Tyr His Arg Phe Glu Ile Glu Arg Ile Ala
165 170 175
Arg Ile Ala Phe Glu Ser Ala Arg Lys Arg Arg His Lys Val Thr Ser
180 185 190
Ile Asp Lys Ala Asn Val Leu Gln Ser Ser Ile Leu Trp Arg Glu Ile
195 200 205
Val Asn Glu Ile Ala Thr Glu Tyr Pro Asp Val Glu Leu Ala His Met
210 215 220
Tyr Ile Asp Asn Ala Thr Met Gln Leu Ile Lys Asp Pro Ser Gln Phe
225 230 235 240
Asp Val Leu Leu Cys Ser Asn Leu Phe Gly Asp Ile Leu Ser Asp Glu
245 250 255
Cys Ala Met Ile Thr Gly Ser Met Gly Met Leu Pro Ser Ala Ser Leu
260 265 270
Asn Glu Gln Gly Phe Gly Leu Tyr Glu Pro Ala Gly Gly Ser Ala Pro
275 280 285
Asp Ile Ala Gly Lys Asn Ile Ala Asn Pro Ile Ala Gln Ile Leu Ser
290 295 300
Leu Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Ser Leu Asp Ala Asp Asp Ala Ala Cys
305 310 315 320
Ala Ile Glu Arg Ala Ile Asn Arg Ala Leu Glu Glu Gly Ile Arg Thr
325 330 335
Gly Asp Leu Ala Arg Gly Ala Ala Ala Val Ser Thr Asp Glu Met Gly
340 345 350
Asp Ile Ile Ala Arg Tyr Val Ala Glu Gly Val
355 360
<210> 49
<211> 365
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β-异丙基苹果酸脱氢酶"
<400> 49
Met Lys Lys Arg Ile Ala Leu Leu Pro Gly Asp Gly Ile Gly Pro Glu
1 5 10 15
Val Leu Glu Ser Ala Thr Asp Val Leu Lys Ser Val Ala Glu Arg Phe
20 25 30
Asn His Glu Phe Glu Phe Glu Tyr Gly Leu Ile Gly Gly Ala Ala Ile
35 40 45
Asp Glu His His Asn Pro Leu Pro Glu Glu Thr Val Ala Ala Cys Lys
50 55 60
Asn Ala Asp Ala Ile Leu Leu Gly Ala Val Gly Gly Pro Lys Trp Asp
65 70 75 80
Gln Asn Pro Ser Glu Leu Arg Pro Glu Lys Gly Leu Leu Ser Ile Arg
85 90 95
Lys Gln Leu Asp Leu Phe Ala Asn Leu Arg Pro Val Lys Val Phe Glu
100 105 110
Ser Leu Ser Asp Ala Ser Pro Leu Lys Lys Glu Tyr Ile Asp Asn Val
115 120 125
Asp Phe Val Ile Val Arg Glu Leu Thr Gly Gly Leu Tyr Phe Gly Gln
130 135 140
Pro Ser Lys Arg Tyr Val Asn Thr Glu Gly Glu Gln Glu Ala Val Asp
145 150 155 160
Thr Leu Phe Tyr Lys Arg Thr Glu Ile Glu Arg Val Ile Arg Glu Gly
165 170 175
Phe Lys Met Ala Ala Ala Arg Lys Gly Lys Val Thr Ser Val Asp Lys
180 185 190
Ala Asn Val Leu Glu Ser Ser Arg Leu Trp Arg Glu Val Ala Glu Asp
195 200 205
Val Ala Gln Glu Phe Pro Asp Val Lys Leu Glu His Met Leu Val Asp
210 215 220
Asn Ala Ala Met Gln Leu Ile Tyr Ala Pro Asn Gln Phe Asp Val Val
225 230 235 240
Val Thr Glu Asn Met Phe Gly Asp Ile Leu Ser Asp Glu Ala Ser Met
245 250 255
Leu Thr Gly Ser Leu Gly Met Leu Pro Ser Ala Ser Leu Ser Ser Ser
260 265 270
Gly Leu His Leu Phe Glu Pro Val His Gly Ser Ala Pro Asp Ile Ala
275 280 285
Gly Lys Gly Met Ala Asn Pro Phe Ala Ala Ile Leu Ser Ala Ala Met
290 295 300
Leu Leu Arg Thr Ser Phe Gly Leu Glu Glu Glu Ala Lys Ala Val Glu
305 310 315 320
Asp Ala Val Asn Lys Val Leu Ala Ser Gly Lys Arg Thr Arg Asp Leu
325 330 335
Ala Arg Ser Glu Glu Phe Ser Ser Thr Gln Ala Ile Thr Glu Glu Val
340 345 350
Lys Ala Ala Ile Met Ser Glu Asn Thr Ile Ser Asn Val
355 360 365
<210> 50
<211> 364
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β-异丙基苹果酸脱氢酶"
<400> 50
Met Ser Ala Pro Lys Lys Ile Val Val Leu Pro Gly Asp His Val Gly
1 5 10 15
Gln Glu Ile Thr Ala Glu Ala Ile Lys Val Leu Lys Ala Ile Ser Asp
20 25 30
Val Arg Ser Asn Val Lys Phe Asp Phe Glu Asn His Leu Ile Gly Gly
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Ala Thr Gly Val Pro Leu Pro Asp Glu Ala Leu Glu
50 55 60
Ala Ser Lys Lys Ala Asp Ala Val Leu Leu Gly Ala Val Gly Gly Pro
65 70 75 80
Lys Trp Gly Thr Gly Ser Val Arg Pro Glu Gln Gly Leu Leu Lys Ile
85 90 95
Arg Lys Glu Leu Gln Leu Tyr Ala Asn Leu Arg Pro Cys Asn Phe Ala
100 105 110
Ser Asp Ser Leu Leu Asp Leu Ser Pro Ile Lys Pro Gln Phe Ala Lys
115 120 125
Gly Thr Asp Phe Val Val Val Arg Glu Leu Val Gly Gly Ile Tyr Phe
130 135 140
Gly Lys Arg Lys Glu Asp Asp Gly Asp Gly Val Ala Trp Asp Ser Glu
145 150 155 160
Gln Tyr Thr Val Pro Glu Val Gln Arg Ile Thr Arg Met Ala Ala Phe
165 170 175
Met Ala Leu Gln His Glu Pro Pro Leu Pro Ile Trp Ser Leu Asp Lys
180 185 190
Ala Asn Val Leu Ala Ser Ser Arg Leu Trp Arg Lys Thr Val Glu Glu
195 200 205
Thr Ile Lys Asn Glu Phe Pro Thr Leu Lys Val Gln His Gln Leu Ile
210 215 220
Asp Ser Ala Ala Met Ile Leu Val Lys Asn Pro Thr His Leu Asn Gly
225 230 235 240
Ile Ile Ile Thr Ser Asn Met Phe Gly Asp Ile Ile Ser Asp Glu Ala
245 250 255
Ser Val Ile Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro Ser Ala Ser Leu Ala
260 265 270
Ser Leu Pro Asp Lys Asn Thr Ala Phe Gly Leu Tyr Glu Pro Cys His
275 280 285
Gly Ser Ala Pro Asp Leu Pro Lys Asn Lys Val Asn Pro Ile Ala Thr
290 295 300
Ile Leu Ser Ala Ala Met Met Leu Lys Leu Ser Leu Asn Leu Pro Glu
305 310 315 320
Glu Gly Lys Ala Ile Glu Asp Ala Val Lys Lys Val Leu Asp Ala Gly
325 330 335
Ile Arg Thr Gly Asp Leu Gly Gly Ser Asn Ser Thr Thr Glu Val Gly
340 345 350
Asp Ala Val Ala Glu Glu Val Lys Lys Ile Leu Ala
355 360
<210> 51
<211> 714
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A变位酶"
<400> 51
Met Ser Asn Val Gln Glu Trp Gln Gln Leu Ala Asn Lys Glu Leu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Glu Lys Thr Val Asp Ser Leu Val His Gln Thr Ala Glu Gly
20 25 30
Ile Ala Ile Lys Pro Leu Tyr Thr Glu Ala Asp Leu Asp Asn Leu Glu
35 40 45
Val Thr Gly Thr Leu Pro Gly Leu Pro Pro Tyr Val Arg Gly Pro Arg
50 55 60
Ala Thr Met Tyr Thr Ala Gln Pro Trp Thr Ile Arg Gln Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Phe Ser Thr Ala Lys Glu Ser Asn Ala Phe Tyr Arg Arg Asn Leu Ala
85 90 95
Ala Gly Gln Lys Gly Leu Ser Val Ala Phe Asp Leu Ala Thr His Arg
100 105 110
Gly Tyr Asp Ser Asp Asn Pro Arg Val Ala Gly Asp Val Gly Lys Ala
115 120 125
Gly Val Ala Ile Asp Thr Val Glu Asp Met Lys Val Leu Phe Asp Gln
130 135 140
Ile Pro Leu Asp Lys Met Ser Val Ser Met Thr Met Asn Gly Ala Val
145 150 155 160
Leu Pro Val Leu Ala Phe Tyr Ile Val Ala Ala Glu Glu Gln Gly Val
165 170 175
Thr Pro Asp Lys Leu Thr Gly Thr Ile Gln Asn Asp Ile Leu Lys Glu
180 185 190
Tyr Leu Cys Arg Asn Thr Tyr Ile Tyr Pro Pro Lys Pro Ser Met Arg
195 200 205
Ile Ile Ala Asp Ile Ile Ala Trp Cys Ser Gly Asn Met Pro Arg Phe
210 215 220
Asn Thr Ile Ser Ile Ser Gly Tyr His Met Gly Glu Ala Gly Ala Asn
225 230 235 240
Cys Val Gln Gln Val Ala Phe Thr Leu Ala Asp Gly Ile Glu Tyr Ile
245 250 255
Lys Ala Ala Ile Ser Ala Gly Leu Lys Ile Asp Asp Phe Ala Pro Arg
260 265 270
Leu Ser Phe Phe Phe Gly Ile Gly Met Asp Leu Phe Met Asn Val Ala
275 280 285
Met Leu Arg Ala Ala Arg Tyr Leu Trp Ser Glu Ala Val Ser Gly Phe
290 295 300
Gly Ala Gln Asp Pro Lys Ser Leu Ala Leu Arg Thr His Cys Gln Thr
305 310 315 320
Ser Gly Trp Ser Leu Thr Glu Gln Asp Pro Tyr Asn Asn Val Ile Arg
325 330 335
Thr Thr Ile Glu Ala Leu Ala Ala Thr Leu Gly Gly Thr Gln Ser Leu
340 345 350
His Thr Asn Ala Phe Asp Glu Ala Leu Gly Leu Pro Thr Asp Phe Ser
355 360 365
Ala Arg Ile Ala Arg Asn Thr Gln Ile Ile Ile Gln Glu Glu Ser Glu
370 375 380
Leu Cys Arg Thr Val Asp Pro Leu Ala Gly Ser Tyr Tyr Ile Glu Ser
385 390 395 400
Leu Thr Asp Gln Ile Val Lys Gln Ala Arg Ala Ile Ile Gln Gln Ile
405 410 415
Asp Glu Ala Gly Gly Met Ala Lys Ala Ile Glu Ala Gly Leu Pro Lys
420 425 430
Arg Met Ile Glu Glu Ala Ser Ala Arg Glu Gln Ser Leu Ile Asp Gln
435 440 445
Gly Lys Arg Val Ile Val Gly Val Asn Lys Tyr Lys Leu Asp His Glu
450 455 460
Asp Glu Thr Asp Val Leu Glu Ile Asp Asn Val Met Val Arg Asn Glu
465 470 475 480
Gln Ile Ala Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Thr Arg Asp Asp Ala Ala
485 490 495
Val Thr Ala Ala Leu Asn Ala Leu Thr His Ala Ala Gln His Asn Glu
500 505 510
Asn Leu Leu Ala Ala Ala Val Asn Ala Ala Arg Val Arg Ala Thr Leu
515 520 525
Gly Glu Ile Ser Asp Ala Leu Glu Val Ala Phe Asp Arg Tyr Leu Val
530 535 540
Pro Ser Gln Cys Val Thr Gly Val Ile Ala Gln Ser Tyr His Gln Ser
545 550 555 560
Glu Lys Ser Ala Ser Glu Phe Asp Ala Ile Val Ala Gln Thr Glu Gln
565 570 575
Phe Leu Ala Asp Asn Gly Arg Arg Pro Arg Ile Leu Ile Ala Lys Met
580 585 590
Gly Gln Asp Gly His Asp Arg Gly Ala Lys Val Ile Ala Ser Ala Tyr
595 600 605
Ser Asp Leu Gly Phe Asp Val Asp Leu Ser Pro Met Phe Ser Thr Pro
610 615 620
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Ala Val Glu Asn Asp Val His Val Val Gly
625 630 635 640
Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly His Lys Thr Leu Ile Pro Glu Leu Val
645 650 655
Glu Ala Leu Lys Lys Trp Gly Arg Glu Asp Ile Cys Val Val Ala Gly
660 665 670
Gly Val Ile Pro Pro Gln Asp Tyr Ala Phe Leu Gln Glu Arg Gly Val
675 680 685
Ala Ala Ile Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Met Leu Asp Ser Val Arg Asp
690 695 700
Val Leu Asn Leu Ile Ser Gln His His Asp
705 710
<210> 52
<211> 714
<212> PRT
<213> 肠沙门氏菌(Salmonella enterica)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A变位酶"
<400> 52
Met Ala Asn Leu Gln Ala Trp Gln Thr Leu Ala Asn Asn Glu Leu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Glu Lys Thr Val Glu Ser Leu Ile Arg Gln Thr Ala Glu Gly
20 25 30
Ile Ala Val Lys Pro Leu Tyr Thr Glu Ala Asp Leu Asn Asn Leu Glu
35 40 45
Val Thr Gly Thr Leu Pro Gly Leu Pro Pro Tyr Val Arg Gly Pro Arg
50 55 60
Ala Thr Met Tyr Thr Ala Gln Pro Trp Thr Ile Arg Gln Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Phe Ser Thr Ala Lys Glu Ser Asn Ala Phe Tyr Arg Arg Asn Leu Ala
85 90 95
Ala Gly Gln Lys Gly Leu Ser Val Ala Phe Asp Leu Ala Thr His Arg
100 105 110
Gly Tyr Asp Ser Asp Asn Pro Arg Val Ala Gly Asp Val Gly Lys Ala
115 120 125
Gly Val Ala Ile Asp Thr Val Glu Asp Met Lys Val Leu Phe Asp Gln
130 135 140
Ile Pro Leu Asp Lys Met Ser Val Ser Met Thr Met Asn Gly Ala Val
145 150 155 160
Leu Pro Val Met Ala Phe Tyr Ile Val Ala Ala Glu Glu Gln Gly Val
165 170 175
Ser Pro Glu Gln Leu Thr Gly Thr Ile Gln Asn Asp Ile Leu Lys Glu
180 185 190
Tyr Leu Cys Arg Asn Thr Tyr Ile Tyr Pro Pro Lys Pro Ser Met Arg
195 200 205
Ile Ile Ala Asp Ile Ile Ala Trp Cys Ser Gly Asn Met Pro Arg Phe
210 215 220
Asn Thr Ile Ser Ile Ser Gly Tyr His Met Gly Glu Ala Gly Ala Asn
225 230 235 240
Cys Val Gln Gln Val Ala Phe Thr Leu Ala Asp Gly Ile Glu Tyr Ile
245 250 255
Lys Ala Ala Leu Ser Ala Gly Leu Lys Ile Asp Asp Phe Ala Pro Arg
260 265 270
Leu Ser Phe Phe Phe Gly Ile Gly Met Asp Leu Phe Met Asn Val Ala
275 280 285
Met Leu Arg Ala Ala Arg Tyr Leu Trp Ser Glu Ala Val Ser Gly Phe
290 295 300
Gly Ala Thr Asn Pro Lys Ser Leu Ala Leu Arg Thr His Cys Gln Thr
305 310 315 320
Ser Gly Trp Ser Leu Thr Glu Gln Asp Pro Tyr Asn Asn Ile Ile Arg
325 330 335
Thr Thr Ile Glu Ala Leu Gly Ala Thr Leu Gly Gly Thr Gln Ser Leu
340 345 350
His Thr Asn Ala Phe Asp Glu Ala Leu Gly Leu Pro Thr Asp Phe Ser
355 360 365
Ala Arg Ile Ala Arg Asn Thr Gln Ile Ile Ile Gln Glu Glu Ser Ser
370 375 380
Ile Cys Arg Thr Val Asp Pro Leu Ala Gly Ser Tyr Tyr Val Glu Ser
385 390 395 400
Leu Thr Asp Gln Ile Val Lys Gln Ala Arg Ala Ile Ile Lys Gln Ile
405 410 415
Asp Ala Ala Gly Gly Met Ala Lys Ala Ile Glu Ala Gly Leu Pro Lys
420 425 430
Arg Met Ile Glu Glu Ala Ser Ala Arg Glu Gln Ser Leu Ile Asp Gln
435 440 445
Gly Glu Arg Val Ile Val Gly Val Asn Lys Tyr Lys Leu Glu Lys Glu
450 455 460
Asp Glu Thr Ala Val Leu Glu Ile Asp Asn Val Lys Val Arg Asn Glu
465 470 475 480
Gln Ile Ala Ala Leu Glu Arg Ile Arg Ala Thr Arg Asp Asn Arg Ala
485 490 495
Val Asn Ala Ala Leu Gln Ala Leu Thr His Ala Ala Gln His His Glu
500 505 510
Asn Leu Leu Ala Ala Ala Val Glu Ala Ala Arg Val Arg Ala Thr Leu
515 520 525
Gly Glu Ile Ser Asp Ala Leu Glu Ala Ala Phe Asp Arg Tyr Leu Val
530 535 540
Pro Ser Gln Cys Val Thr Gly Val Ile Ala Gln Ser Tyr His Gln Ser
545 550 555 560
Asp Lys Ser Ala Gly Glu Phe Asp Ala Ile Val Ala Gln Thr Gln Gln
565 570 575
Phe Leu Ala Asp Thr Gly Arg Arg Pro Arg Ile Leu Ile Ala Lys Met
580 585 590
Gly Gln Asp Gly His Asp Arg Gly Ala Lys Val Ile Ala Ser Ala Tyr
595 600 605
Ser Asp Leu Gly Phe Asp Val Asp Leu Ser Pro Met Phe Ser Thr Pro
610 615 620
Asp Glu Ile Ala Arg Leu Ala Val Glu Asn Asp Val His Val Ile Gly
625 630 635 640
Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly His Lys Thr Leu Ile Pro Glu Leu Val
645 650 655
Ala Ala Leu Lys Lys Trp Gly Arg Glu Asp Ile Cys Val Val Ala Gly
660 665 670
Gly Val Ile Pro Pro Gln Asp Tyr Ala Phe Leu Lys Ala His Gly Val
675 680 685
Ala Ala Ile Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Met Leu Glu Ser Val Arg Asp
690 695 700
Val Leu Ala Arg Ile Ser Gln His His Asp
705 710
<210> 53
<211> 638
<212> PRT
<213> 费氏丙酸杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A变位酶β (小)亚基"
<400> 53
Met Ser Ser Thr Asp Gln Gly Thr Asn Pro Ala Asp Thr Asp Asp Leu
1 5 10 15
Thr Pro Thr Thr Leu Ser Leu Ala Gly Asp Phe Pro Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Glu Gln Trp Glu Arg Glu Val Glu Lys Val Leu Asn Arg Gly Arg Pro
35 40 45
Pro Glu Lys Gln Leu Thr Phe Ala Glu Cys Leu Lys Arg Leu Thr Val
50 55 60
His Thr Val Asp Gly Ile Asp Ile Val Pro Met Tyr Arg Pro Lys Asp
65 70 75 80
Ala Pro Lys Lys Leu Gly Tyr Pro Gly Val Ala Pro Phe Thr Arg Gly
85 90 95
Thr Thr Val Arg Asn Gly Asp Met Asp Ala Trp Asp Val Arg Ala Leu
100 105 110
His Glu Asp Pro Asp Glu Lys Phe Thr Arg Lys Ala Ile Leu Glu Gly
115 120 125
Leu Glu Arg Gly Val Thr Ser Leu Leu Leu Arg Val Asp Pro Asp Ala
130 135 140
Ile Ala Pro Glu His Leu Asp Glu Val Leu Ser Asp Val Leu Leu Glu
145 150 155 160
Met Thr Lys Val Glu Val Phe Ser Arg Tyr Asp Gln Gly Ala Ala Ala
165 170 175
Glu Ala Leu Val Ser Val Tyr Glu Arg Ser Asp Lys Pro Ala Lys Asp
180 185 190
Leu Ala Leu Asn Leu Gly Leu Asp Pro Ile Ala Phe Ala Ala Leu Gln
195 200 205
Gly Thr Glu Pro Asp Leu Thr Val Leu Gly Asp Trp Val Arg Arg Leu
210 215 220
Ala Lys Phe Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr Ile Asp Ala Asn Ile
225 230 235 240
Tyr His Asn Ala Gly Ala Gly Asp Val Ala Glu Leu Ala Trp Ala Leu
245 250 255
Ala Thr Gly Ala Glu Tyr Val Arg Ala Leu Val Glu Gln Gly Phe Thr
260 265 270
Ala Thr Glu Ala Phe Asp Thr Ile Asn Phe Arg Val Thr Ala Thr His
275 280 285
Asp Gln Phe Leu Thr Ile Ala Arg Leu Arg Ala Leu Arg Glu Ala Trp
290 295 300
Ala Arg Ile Gly Glu Val Phe Gly Val Asp Glu Asp Lys Arg Gly Ala
305 310 315 320
Arg Gln Asn Ala Ile Thr Ser Trp Arg Asp Val Thr Arg Glu Asp Pro
325 330 335
Tyr Val Asn Ile Leu Arg Gly Ser Ile Ala Thr Phe Ser Ala Ser Val
340 345 350
Gly Gly Ala Glu Ser Ile Thr Thr Leu Pro Phe Thr Gln Ala Leu Gly
355 360 365
Leu Pro Glu Asp Asp Phe Pro Leu Arg Ile Ala Arg Asn Thr Gly Ile
370 375 380
Val Leu Ala Glu Glu Val Asn Ile Gly Arg Val Asn Asp Pro Ala Gly
385 390 395 400
Gly Ser Tyr Tyr Val Glu Ser Leu Thr Arg Ser Leu Ala Asp Ala Ala
405 410 415
Trp Lys Glu Phe Gln Glu Val Glu Lys Leu Gly Gly Met Ser Lys Ala
420 425 430
Val Met Thr Glu His Val Thr Lys Val Leu Asp Ala Cys Asn Ala Glu
435 440 445
Arg Ala Lys Arg Leu Ala Asn Arg Lys Gln Pro Ile Thr Ala Val Ser
450 455 460
Glu Phe Pro Met Ile Gly Ala Arg Ser Ile Glu Thr Lys Pro Phe Pro
465 470 475 480
Ala Ala Pro Ala Arg Lys Gly Leu Ala Trp His Arg Asp Ser Glu Val
485 490 495
Phe Glu Gln Leu Met Asp Arg Ser Thr Ser Val Ser Glu Arg Pro Lys
500 505 510
Val Phe Leu Ala Cys Leu Gly Thr Arg Arg Asp Phe Gly Gly Arg Glu
515 520 525
Gly Phe Ser Ser Pro Val Trp His Ile Ala Gly Ile Asp Thr Pro Gln
530 535 540
Val Glu Gly Gly Thr Thr Ala Glu Ile Val Glu Ala Phe Lys Lys Ser
545 550 555 560
Gly Ala Gln Val Ala Asp Leu Cys Ser Ser Ala Lys Val Tyr Ala Gln
565 570 575
Gln Gly Leu Glu Val Ala Lys Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ala Lys Ala
580 585 590
Leu Tyr Leu Ser Gly Ala Phe Lys Glu Phe Gly Asp Asp Ala Ala Glu
595 600 605
Ala Glu Lys Leu Ile Asp Gly Arg Leu Phe Met Gly Met Asp Val Val
610 615 620
Asp Thr Leu Ser Ser Thr Leu Asp Ile Leu Gly Val Ala Lys
625 630 635
<210> 54
<211> 728
<212> PRT
<213> 费氏丙酸杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A变位酶α (大)亚基"
<400> 54
Met Ser Thr Leu Pro Arg Phe Asp Ser Val Asp Leu Gly Asn Ala Pro
1 5 10 15
Val Pro Ala Asp Ala Ala Gln Arg Phe Glu Glu Leu Ala Ala Lys Ala
20 25 30
Gly Thr Glu Glu Ala Trp Glu Thr Ala Glu Gln Ile Pro Val Gly Thr
35 40 45
Leu Phe Asn Glu Asp Val Tyr Lys Asp Met Asp Trp Leu Asp Thr Tyr
50 55 60
Ala Gly Ile Pro Pro Phe Val His Gly Pro Tyr Ala Thr Met Tyr Ala
65 70 75 80
Phe Arg Pro Trp Thr Ile Arg Gln Tyr Ala Gly Phe Ser Thr Ala Lys
85 90 95
Glu Ser Asn Ala Phe Tyr Arg Arg Asn Leu Ala Ala Gly Gln Lys Gly
100 105 110
Leu Ser Val Ala Phe Asp Leu Pro Thr His Arg Gly Tyr Asp Ser Asp
115 120 125
Asn Pro Arg Val Ala Gly Asp Val Gly Met Ala Gly Val Ala Ile Asp
130 135 140
Ser Ile Tyr Asp Met Arg Glu Leu Phe Ala Gly Ile Pro Leu Asp Gln
145 150 155 160
Met Ser Val Ser Met Thr Met Asn Gly Ala Val Leu Pro Ile Leu Ala
165 170 175
Leu Tyr Val Val Thr Ala Glu Glu Gln Gly Val Lys Pro Glu Gln Leu
180 185 190
Ala Gly Thr Ile Gln Asn Asp Ile Leu Lys Glu Phe Met Val Arg Asn
195 200 205
Thr Tyr Ile Tyr Pro Pro Gln Pro Ser Met Arg Ile Ile Ser Glu Ile
210 215 220
Phe Ala Tyr Thr Ser Ala Asn Met Pro Lys Trp Asn Ser Ile Ser Ile
225 230 235 240
Ser Gly Tyr His Met Gln Glu Ala Gly Ala Thr Ala Asp Ile Glu Met
245 250 255
Ala Tyr Thr Leu Ala Asp Gly Val Asp Tyr Ile Arg Ala Gly Glu Ser
260 265 270
Val Gly Leu Asn Val Asp Gln Phe Ala Pro Arg Leu Ser Phe Phe Trp
275 280 285
Gly Ile Gly Met Asn Phe Phe Met Glu Val Ala Lys Leu Arg Ala Ala
290 295 300
Arg Met Leu Trp Ala Lys Leu Val His Gln Phe Gly Pro Lys Asn Pro
305 310 315 320
Lys Ser Met Ser Leu Arg Thr His Ser Gln Thr Ser Gly Trp Ser Leu
325 330 335
Thr Ala Gln Asp Val Tyr Asn Asn Val Val Arg Thr Cys Ile Glu Ala
340 345 350
Met Ala Ala Thr Gln Gly His Thr Gln Ser Leu His Thr Asn Ser Leu
355 360 365
Asp Glu Ala Ile Ala Leu Pro Thr Asp Phe Ser Ala Arg Ile Ala Arg
370 375 380
Asn Thr Gln Leu Phe Leu Gln Gln Glu Ser Gly Thr Thr Arg Val Ile
385 390 395 400
Asp Pro Trp Ser Gly Ser Ala Tyr Val Glu Glu Leu Thr Trp Asp Leu
405 410 415
Ala Arg Lys Ala Trp Gly His Ile Gln Glu Val Glu Lys Val Gly Gly
420 425 430
Met Ala Lys Ala Ile Glu Lys Gly Ile Pro Lys Met Arg Ile Glu Glu
435 440 445
Ala Ala Ala Arg Thr Gln Ala Arg Ile Asp Ser Gly Arg Gln Pro Leu
450 455 460
Ile Gly Val Asn Lys Tyr Arg Leu Glu His Glu Pro Pro Leu Asp Val
465 470 475 480
Leu Lys Val Asp Asn Ser Thr Val Leu Ala Glu Gln Lys Ala Lys Leu
485 490 495
Val Lys Leu Arg Ala Glu Arg Asp Pro Glu Lys Val Lys Ala Ala Leu
500 505 510
Asp Lys Ile Thr Trp Ala Ala Ala Asn Pro Asp Asp Lys Asp Pro Asp
515 520 525
Arg Asn Leu Leu Lys Leu Cys Ile Asp Ala Gly Arg Ala Met Ala Thr
530 535 540
Val Gly Glu Met Ser Asp Ala Leu Glu Lys Val Phe Gly Arg Tyr Thr
545 550 555 560
Ala Gln Ile Arg Thr Ile Ser Gly Val Tyr Ser Lys Glu Val Lys Asn
565 570 575
Thr Pro Glu Val Glu Glu Ala Arg Glu Leu Val Glu Glu Phe Glu Gln
580 585 590
Ala Glu Gly Arg Arg Pro Arg Ile Leu Leu Ala Lys Met Gly Gln Asp
595 600 605
Gly His Asp Arg Gly Gln Lys Val Ile Ala Thr Ala Tyr Ala Asp Leu
610 615 620
Gly Phe Asp Val Asp Val Gly Pro Leu Phe Gln Thr Pro Glu Glu Thr
625 630 635 640
Ala Arg Gln Ala Val Glu Ala Asp Val His Val Val Gly Val Ser Ser
645 650 655
Leu Ala Gly Gly His Leu Thr Leu Val Pro Ala Leu Arg Lys Glu Leu
660 665 670
Asp Lys Leu Gly Arg Pro Asp Ile Leu Ile Thr Val Gly Gly Val Ile
675 680 685
Pro Glu Gln Asp Phe Asp Glu Leu Arg Lys Asp Gly Ala Val Glu Ile
690 695 700
Tyr Thr Pro Gly Thr Val Ile Pro Glu Ser Ala Ile Ser Leu Val Lys
705 710 715 720
Lys Leu Arg Ala Ser Leu Asp Ala
725
<210> 55
<211> 678
<212> PRT
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A变位酶β (小)亚基"
<400> 55
Met Lys Thr Asn Thr Leu Ser Phe His Glu Phe Thr Arg Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Asp Trp Ala Gln Glu Val Ser Lys Asn Thr Ala Ile Ser Ser Lys
20 25 30
Glu Thr Leu Glu Asn Ile Phe Leu Lys Pro Leu Tyr Phe Glu Ser Asp
35 40 45
Thr Ala His Leu Asp Tyr Leu Gln Gln Ser Pro Ala Gly Ile Asp Tyr
50 55 60
Leu Arg Gly Ala Gly Lys Glu Ser Tyr Ile Leu Gly Glu Trp Glu Ile
65 70 75 80
Thr Gln Lys Ile Asp Leu Pro Ser Ile Lys Glu Ser Asn Lys Leu Leu
85 90 95
Leu His Ser Leu Arg Asn Gly Gln Asn Thr Ala Ala Phe Thr Cys Ser
100 105 110
Glu Ala Met Arg Gln Gly Lys Asp Ile Asp Glu Ala Thr Glu Ala Glu
115 120 125
Val Ala Ser Gly Ala Thr Ile Ser Thr Leu Glu Asp Val Ala His Leu
130 135 140
Phe Gln His Val Ala Leu Glu Ala Val Pro Leu Phe Leu Asn Thr Gly
145 150 155 160
Cys Thr Ser Val Pro Leu Leu Ser Phe Leu Lys Ala Tyr Cys Val Asp
165 170 175
His Asn Phe Asn Met Arg Gln Leu Lys Gly Thr Val Gly Met Asp Pro
180 185 190
Leu Gly Thr Leu Ala Glu Tyr Gly Arg Val Pro Leu Ser Thr Arg Asp
195 200 205
Leu Tyr Asp His Leu Ala Tyr Ala Thr Arg Leu Ala His Ser Asn Val
210 215 220
Pro Glu Leu Lys Thr Ile Ile Val Ser Ser Ile Pro Tyr His Asn Ser
225 230 235 240
Gly Ala Asn Ala Val Gln Glu Leu Ala Tyr Met Leu Ala Thr Gly Val
245 250 255
Gln Tyr Ile Asp Glu Cys Ile Lys Arg Gly Leu Ser Leu His Gln Val
260 265 270
Leu Pro His Met Thr Phe Ser Phe Ser Val Ser Ser His Leu Phe Met
275 280 285
Glu Ile Ser Lys Leu Arg Ala Phe Arg Met Leu Trp Ala Asn Val Val
290 295 300
Arg Ala Phe Asp Asp Thr Ala Val Ser Val Pro Phe Ile His Thr Glu
305 310 315 320
Thr Ser His Leu Thr Gln Ser Lys Glu Asp Met Tyr Thr Asn Ala Leu
325 330 335
Arg Ser Thr Val Gln Ala Phe Ala Ser Ile Val Gly Gly Ala Asp Ser
340 345 350
Leu His Ile Glu Pro Tyr Asp Ser Val Thr Ser Ser Ser Ser Gln Phe
355 360 365
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370 375 380
His Ile Ser Lys Val Met Asp Pro Ala Gly Gly Ser Trp Tyr Val Glu
385 390 395 400
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405 410 415
Ile Glu Asp His Gly Gly Met Glu Glu Ala Leu Lys Gln Gly Arg Ile
420 425 430
Gln Asp Glu Val Glu Gln Met Lys Val Lys Arg Gln Glu Asp Ile Glu
435 440 445
Cys Arg Ile Glu Arg Leu Ile Gly Val Thr His Tyr Ala Pro Lys Gln
450 455 460
Gln Asp Ala Ser Gln Glu Ile Lys Ser Thr Pro Phe Lys Lys Glu Glu
465 470 475 480
Ile Lys Met Asp Lys Tyr Ser Asp Gln Asn Ala Ser Glu Phe Ser Ser
485 490 495
Asn Leu Ser Leu Glu Asp Tyr Thr Lys Leu Ala Ser Lys Gly Val Thr
500 505 510
Ala Gly Trp Met Leu Lys Gln Met Ala Lys Gln Thr Gln Pro Asp Ser
515 520 525
Val Val Pro Leu Thr Lys Trp Arg Ala Ala Glu Lys Phe Glu Lys Ile
530 535 540
Arg Val Tyr Thr Lys Gly Met Ser Ile Gly Ile Met Glu Leu Thr Asp
545 550 555 560
Pro Ser Ser Arg Lys Lys Ala Glu Ile Ala Arg Ser Leu Phe Glu Ser
565 570 575
Ala Gly Phe Ala Cys Glu Thr Ile Lys Asn Ile Asp Ser Tyr Val Glu
580 585 590
Ile Ala Asp Trp Met Asn Glu Gln Lys His Glu Ala Tyr Val Ile Cys
595 600 605
Gly Ser Asp Glu Leu Val Glu Lys Leu Leu Thr Lys Ala Met Thr Tyr
610 615 620
Phe Glu Glu Asp Ser Val Tyr Val Tyr Val Val Gly Glu Glu His Val
625 630 635 640
Ser Arg Lys Thr Gln Trp Gln Gln Lys Gly Val Met Ser Val Ile His
645 650 655
Pro Lys Thr Asn Val Ile Gln Cys Val Lys Lys Leu Leu Cys Ala Leu
660 665 670
Glu Val Glu Val His Val
675
<210> 56
<211> 716
<212> PRT
<213> 巨大芽孢杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A变位酶α (大)亚基"
<400> 56
Met Tyr Lys Lys Pro Ser Phe Ser Asn Ile Pro Leu Ser Phe Ser Lys
1 5 10 15
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Thr Asn Glu Gln Ile Glu Leu Lys Ser Val Tyr Thr Lys Lys Asp Arg
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Met Ser Met Arg Ile Ile Ala Asp Ile Phe Lys Tyr Thr Ala Glu Tyr
210 215 220
Met Pro Lys Phe Asn Ser Ile Ser Ile Ser Gly Tyr His Met Gln Glu
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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675 680 685
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Ser Val Leu His Glu Ile Lys Lys Arg Leu Glu Glu
705 710 715
<210> 57
<211> 616
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A变位酶β (小)亚基"
<400> 57
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Asn Ala Leu Asn Ser Gly Thr Thr Thr Leu Gly Phe Glu Phe Ser Glu
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Glu Phe Thr Ala Ala Asp Leu Lys Val Ala Leu Glu Gly Val Tyr Leu
130 135 140
Asn Met Ala Pro Leu Leu Ile His Ala Gly Gly Ser Thr Ser Glu Val
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165 170 175
Ala Leu Thr Leu Gly Ser Arg Pro Leu Thr Ala Gln Val Asp Gly Ser
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Val Asp Tyr Val Arg Arg Leu Val Asp Ala Gly Leu Ser Thr Glu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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545 550 555 560
Thr Gly Glu Gly Ala Val Glu Lys Leu Arg Glu Ala Gly Val Glu Arg
565 570 575
Ile Leu Leu Ala Gly Ala Pro Lys Ser Phe Glu Gly Ser Ala His Ala
580 585 590
Pro Asp Gly Tyr Leu Asn Met Thr Ile Asp Ala Ala Ala Thr Leu Ala
595 600 605
Asp Leu Leu Asp Ala Leu Gly Ala
610 615
<210> 58
<211> 737
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A变位酶α (大)亚基"
<400> 58
Met Thr Ser Ile Pro Asn Phe Ser Asp Ile Pro Leu Thr Ala Glu Thr
1 5 10 15
Arg Ala Ser Glu Ser His Asn Val Asp Ala Gly Lys Val Trp Asn Thr
20 25 30
Pro Glu Gly Ile Asp Val Lys Arg Val Phe Thr Gln Ala Asp Arg Asp
35 40 45
Glu Ala Gln Ala Ala Gly His Pro Val Asp Ser Leu Pro Gly Gln Lys
50 55 60
Pro Phe Met Arg Gly Pro Tyr Pro Thr Met Tyr Thr Asn Gln Pro Trp
65 70 75 80
Thr Ile Arg Gln Tyr Ala Gly Phe Ser Thr Ala Ala Glu Ser Asn Ala
85 90 95
Phe Tyr Arg Arg Asn Leu Ala Ala Gly Gln Lys Gly Leu Ser Val Ala
100 105 110
Phe Asp Leu Ala Thr His Arg Gly Tyr Asp Ser Asp Asn Glu Arg Val
115 120 125
Val Gly Asp Val Gly Met Ala Gly Val Ala Ile Asp Ser Ile Leu Asp
130 135 140
Met Arg Gln Leu Phe Asp Gly Ile Asp Leu Ser Ser Val Ser Val Ser
145 150 155 160
Met Thr Met Asn Gly Ala Val Leu Pro Ile Leu Ala Phe Tyr Ile Val
165 170 175
Ala Ala Glu Glu Gln Gly Val Gly Pro Glu Gln Leu Ala Gly Thr Ile
180 185 190
Gln Asn Asp Ile Leu Lys Glu Phe Met Val Arg Asn Thr Tyr Ile Tyr
195 200 205
Pro Pro Lys Pro Ser Met Arg Ile Ile Ser Asn Ile Phe Glu Tyr Thr
210 215 220
Ser Leu Lys Met Pro Arg Phe Asn Ser Ile Ser Ile Ser Gly Tyr His
225 230 235 240
Ile Gln Glu Ala Gly Ala Thr Ala Asp Leu Glu Leu Ala Tyr Thr Leu
245 250 255
Ala Asp Gly Ile Glu Tyr Ile Arg Ala Gly Lys Glu Val Gly Leu Asp
260 265 270
Val Asp Lys Phe Ala Pro Arg Leu Ser Phe Phe Trp Gly Ile Ser Met
275 280 285
Tyr Thr Phe Met Glu Ile Ala Lys Leu Arg Ala Gly Arg Leu Leu Trp
290 295 300
Ser Glu Leu Val Ala Lys Phe Asp Pro Lys Asn Ala Lys Ser Gln Ser
305 310 315 320
Leu Arg Thr His Ser Gln Thr Ser Gly Trp Ser Leu Thr Ala Gln Asp
325 330 335
Val Tyr Asn Asn Val Ala Arg Thr Ala Ile Glu Ala Met Ala Ala Thr
340 345 350
Gln Gly His Thr Gln Ser Leu His Thr Asn Ala Leu Asp Glu Ala Leu
355 360 365
Ala Leu Pro Thr Asp Phe Ser Ala Arg Ile Ala Arg Asn Thr Gln Leu
370 375 380
Leu Leu Gln Gln Glu Ser Gly Thr Val Arg Pro Val Asp Pro Trp Ala
385 390 395 400
Gly Ser Tyr Tyr Val Glu Trp Leu Thr Asn Glu Leu Ala Asn Arg Ala
405 410 415
Arg Lys His Ile Asp Glu Val Glu Glu Ala Gly Gly Met Ala Gln Ala
420 425 430
Thr Ala Gln Gly Ile Pro Lys Leu Arg Ile Glu Glu Ser Ala Ala Arg
435 440 445
Thr Gln Ala Arg Ile Asp Ser Gly Arg Gln Ala Leu Ile Gly Val Asn
450 455 460
Arg Tyr Val Ala Glu Glu Asp Glu Glu Ile Glu Val Leu Lys Val Asp
465 470 475 480
Asn Thr Lys Val Arg Ala Glu Gln Leu Ala Lys Leu Ala Gln Leu Lys
485 490 495
Ala Glu Arg Asn Asp Ala Glu Val Lys Ala Ala Leu Asp Ala Leu Thr
500 505 510
Ala Ala Ala Arg Asn Glu His Lys Glu Pro Gly Asp Leu Asp Gln Asn
515 520 525
Leu Leu Lys Leu Ala Val Asp Ala Ala Arg Ala Lys Ala Thr Ile Gly
530 535 540
Glu Ile Ser Asp Ala Leu Glu Val Val Phe Gly Arg His Glu Ala Glu
545 550 555 560
Ile Arg Thr Leu Ser Gly Val Tyr Lys Asp Glu Val Gly Lys Glu Gly
565 570 575
Thr Val Ser Asn Val Glu Arg Ala Ile Ala Leu Ala Asp Ala Phe Glu
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Arg Arg Pro Arg Ile Phe Ile Ala Lys Met Gly Gln
595 600 605
Asp Gly His Asp Arg Gly Gln Lys Val Val Ala Ser Ala Tyr Ala Asp
610 615 620
Leu Gly Met Asp Val Asp Val Gly Pro Leu Phe Gln Thr Pro Ala Glu
625 630 635 640
Ala Ala Arg Ala Ala Val Asp Ala Asp Val His Val Val Gly Met Ser
645 650 655
Ser Leu Ala Ala Gly His Leu Thr Leu Leu Pro Glu Leu Lys Lys Glu
660 665 670
Leu Ala Ala Leu Gly Arg Asp Asp Ile Leu Val Thr Val Gly Gly Val
675 680 685
Ile Pro Pro Gly Asp Phe Gln Asp Leu Tyr Asp Met Gly Ala Ala Ala
690 695 700
Ile Tyr Pro Pro Gly Thr Val Ile Ala Glu Ser Ala Ile Asp Leu Ile
705 710 715 720
Thr Arg Leu Ala Ala His Leu Gly Phe Asp Leu Asp Val Asp Val Asn
725 730 735
Glu
<210> 59
<211> 261
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A脱羧酶"
<400> 59
Met Ser Tyr Gln Tyr Val Asn Val Val Thr Ile Asn Lys Val Ala Val
1 5 10 15
Ile Glu Phe Asn Tyr Gly Arg Lys Leu Asn Ala Leu Ser Lys Val Phe
20 25 30
Ile Asp Asp Leu Met Gln Ala Leu Ser Asp Leu Asn Arg Pro Glu Ile
35 40 45
Arg Cys Ile Ile Leu Arg Ala Pro Ser Gly Ser Lys Val Phe Ser Ala
50 55 60
Gly His Asp Ile His Glu Leu Pro Ser Gly Gly Arg Asp Pro Leu Ser
65 70 75 80
Tyr Asp Asp Pro Leu Arg Gln Ile Thr Arg Met Ile Gln Lys Phe Pro
85 90 95
Lys Pro Ile Ile Ser Met Val Glu Gly Ser Val Trp Gly Gly Ala Phe
100 105 110
Glu Met Ile Met Ser Ser Asp Leu Ile Ile Ala Ala Ser Thr Ser Thr
115 120 125
Phe Ser Met Thr Pro Val Asn Leu Gly Val Pro Tyr Asn Leu Val Gly
130 135 140
Ile His Asn Leu Thr Arg Asp Ala Gly Phe His Ile Val Lys Glu Leu
145 150 155 160
Ile Phe Thr Ala Ser Pro Ile Thr Ala Gln Arg Ala Leu Ala Val Gly
165 170 175
Ile Leu Asn His Val Val Glu Val Glu Glu Leu Glu Asp Phe Thr Leu
180 185 190
Gln Met Ala His His Ile Ser Glu Lys Ala Pro Leu Ala Ile Ala Val
195 200 205
Ile Lys Glu Glu Leu Arg Val Leu Gly Glu Ala His Thr Met Asn Ser
210 215 220
Asp Glu Phe Glu Arg Ile Gln Gly Met Arg Arg Ala Val Tyr Asp Ser
225 230 235 240
Glu Asp Tyr Gln Glu Gly Met Asn Ala Phe Leu Glu Lys Arg Lys Pro
245 250 255
Asn Phe Val Gly His
260
<210> 60
<211> 261
<212> PRT
<213> 肠沙门氏菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A脱羧酶"
<400> 60
Met Ser Tyr Gln Tyr Val Asn Val Ile Ile Ile Gln Lys Val Ala Val
1 5 10 15
Ile Glu Phe Asn Tyr Ala Arg Lys Leu Asn Ala Leu Ser Lys Val Phe
20 25 30
Ile Asp Asp Leu Met Gln Ala Leu Ser Asp Leu Ser Arg Pro Glu Ile
35 40 45
Arg Cys Ile Ile Leu Arg Ala Pro Ser Gly Ala Lys Val Phe Ser Ala
50 55 60
Gly His Asp Ile His Glu Leu Pro Ser Gly Arg Arg Asp Pro Leu Ser
65 70 75 80
Tyr Asp Asp Pro Leu Arg Gln Ile Thr Arg Leu Ile Gln Lys Tyr Pro
85 90 95
Lys Pro Val Ile Ser Met Val Glu Gly Ser Val Trp Gly Gly Ala Phe
100 105 110
Glu Met Ile Met Ser Ser Asp Leu Ile Ile Ala Ala Ser Thr Ser Thr
115 120 125
Phe Ser Met Thr Pro Val Asn Leu Gly Val Pro Tyr Asn Leu Val Gly
130 135 140
Ile His Asn Leu Thr Arg Asp Ala Gly Phe His Ile Val Lys Glu Leu
145 150 155 160
Ile Phe Thr Ala Ser Pro Ile Thr Ala Gln Arg Ala Leu Ala Val Gly
165 170 175
Ile Leu Asn His Val Val Glu Ala Asp Glu Leu Glu Asp Phe Thr Leu
180 185 190
Gln Met Ala His His Ile Ser Glu Lys Ala Pro Leu Ala Ile Ala Val
195 200 205
Ile Lys Glu Glu Leu Arg Val Leu Gly Glu Ala His Thr Met Asn Ser
210 215 220
Asp Glu Phe Glu Arg Ile Gln Gly Met Arg Arg Ala Val Tyr Asp Ser
225 230 235 240
Glu Asp Tyr Gln Glu Gly Met Asn Ala Phe Leu Glu Lys Arg Lys Pro
245 250 255
His Phe Val Gly His
260
<210> 61
<211> 261
<212> PRT
<213> 小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A脱羧酶"
<400> 61
Met Ser Tyr Gln Tyr Val Lys Val Leu Ile Ala Asn Arg Val Gly Ile
1 5 10 15
Ile Glu Phe Asn His Ala Arg Lys Leu Asn Ala Leu Ser Lys Val Phe
20 25 30
Met Asp Asp Leu Met Leu Ala Leu His Asp Leu Asn Asn Thr Asp Ile
35 40 45
Arg Cys Ile Ile Leu Arg Ala Ala Glu Gly Ser Lys Val Phe Ser Ala
50 55 60
Gly His Asp Ile His Glu Leu Pro Thr Gly Arg Arg Asp Pro Leu Ser
65 70 75 80
Tyr Asp Asp Pro Leu Arg Gln Ile Thr Arg Ala Ile Gln Lys Tyr Pro
85 90 95
Lys Pro Ile Ile Ser Met Val Glu Gly Ser Val Trp Gly Gly Ala Phe
100 105 110
Glu Met Ile Met Ser Ser Asp Ile Ile Ile Ala Cys Arg Asn Ser Thr
115 120 125
Phe Ser Met Thr Pro Val Asn Leu Gly Val Pro Tyr Asn Leu Val Gly
130 135 140
Ile His Asn Leu Ile Arg Asp Ala Gly Phe His Ile Val Lys Glu Leu
145 150 155 160
Ile Phe Thr Ala Ala Pro Ile Thr Ala Glu Arg Ala Leu Ser Val Gly
165 170 175
Ile Leu Asn His Val Val Glu Pro Ser Glu Leu Glu Asp Phe Thr Leu
180 185 190
Lys Leu Ala His Val Ile Ser Glu Lys Ala Pro Leu Ala Ile Ala Val
195 200 205
Ile Lys Glu Glu Leu Arg Val Leu Gly Glu Ala His Thr Met Asn Ser
210 215 220
Asp Glu Phe Glu Arg Ile Gln Gly Met Arg Arg Ala Val Tyr Asp Ser
225 230 235 240
Asn Asp Tyr Gln Glu Gly Met Ser Ala Phe Met Glu Lys Arg Lys Pro
245 250 255
Asn Phe Leu Gly Arg
260
<210> 62
<211> 611
<212> PRT
<213> 费氏丙酸杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶"
<400> 62
Met Ala Glu Asn Asn Asn Leu Lys Leu Ala Ser Thr Met Glu Gly Arg
1 5 10 15
Val Glu Gln Leu Ala Glu Gln Arg Gln Val Ile Glu Ala Gly Gly Gly
20 25 30
Glu Arg Arg Val Glu Lys Gln His Ser Gln Gly Lys Gln Thr Ala Arg
35 40 45
Glu Arg Leu Asn Asn Leu Leu Asp Pro His Ser Phe Asp Glu Val Gly
50 55 60
Ala Phe Arg Lys His Arg Thr Thr Leu Phe Gly Met Asp Lys Ala Val
65 70 75 80
Val Pro Ala Asp Gly Val Val Thr Gly Arg Gly Thr Ile Leu Gly Arg
85 90 95
Pro Val His Ala Ala Ser Gln Asp Phe Thr Val Met Gly Gly Ser Ala
100 105 110
Gly Glu Thr Gln Ser Thr Lys Val Val Glu Thr Met Glu Gln Ala Leu
115 120 125
Leu Thr Gly Thr Pro Phe Leu Phe Phe Tyr Asp Ser Gly Gly Ala Arg
130 135 140
Ile Gln Glu Gly Ile Asp Ser Leu Ser Gly Tyr Gly Lys Met Phe Phe
145 150 155 160
Ala Asn Val Lys Leu Ser Gly Val Val Pro Gln Ile Ala Ile Ile Ala
165 170 175
Gly Pro Cys Ala Gly Gly Ala Ser Tyr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Phe
180 185 190
Ile Ile Met Thr Lys Lys Ala His Met Phe Ile Thr Gly Pro Gln Val
195 200 205
Ile Lys Ser Val Thr Gly Glu Asp Val Thr Ala Asp Glu Leu Gly Gly
210 215 220
Ala Glu Ala His Met Ala Ile Ser Gly Asn Ile His Phe Val Ala Glu
225 230 235 240
Asp Asp Asp Ala Ala Glu Leu Ile Ala Lys Lys Leu Leu Ser Phe Leu
245 250 255
Pro Gln Asn Asn Thr Glu Glu Ala Ser Phe Val Asn Pro Asn Asn Asp
260 265 270
Val Ser Pro Asn Thr Glu Leu Arg Asp Ile Val Pro Ile Asp Gly Lys
275 280 285
Lys Gly Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Ala Lys Ile Val Asp Trp Gly
290 295 300
Asp Tyr Leu Glu Val Lys Ala Gly Tyr Ala Thr Asn Leu Val Thr Ala
305 310 315 320
Phe Ala Arg Val Asn Gly Arg Ser Val Gly Ile Val Ala Asn Gln Pro
325 330 335
Ser Val Met Ser Gly Cys Leu Asp Ile Asn Ala Ser Asp Lys Ala Ala
340 345 350
Glu Phe Val Asn Phe Cys Asp Ser Phe Asn Ile Pro Leu Val Gln Leu
355 360 365
Val Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Val Gln Gln Glu Tyr Gly Gly
370 375 380
Ile Ile Arg His Gly Ala Lys Met Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Ala Thr
385 390 395 400
Val Pro Lys Ile Thr Val Val Leu Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ser Tyr
405 410 415
Leu Ala Met Cys Asn Arg Asp Leu Gly Ala Asp Ala Val Tyr Ala Trp
420 425 430
Pro Ser Ala Glu Ile Ala Val Met Gly Ala Glu Gly Ala Ala Asn Val
435 440 445
Ile Phe Arg Lys Glu Ile Lys Ala Ala Asp Asp Pro Asp Ala Met Arg
450 455 460
Ala Glu Lys Ile Glu Glu Tyr Gln Asn Ala Phe Asn Thr Pro Tyr Val
465 470 475 480
Ala Ala Ala Arg Gly Gln Val Asp Asp Val Ile Asp Pro Ala Asp Thr
485 490 495
Arg Arg Lys Ile Ala Ser Ala Leu Glu Met Tyr Ala Thr Lys Arg Gln
500 505 510
Thr Arg Pro Ala Lys Lys Pro Trp Lys Leu Pro Leu Leu Ser Glu Glu
515 520 525
Glu Ile Met Ala Asp Glu Glu Glu Lys Asp Leu Met Ile Ala Thr Leu
530 535 540
Asn Lys Arg Val Ala Ser Leu Glu Ser Glu Leu Gly Ser Leu Gln Ser
545 550 555 560
Asp Thr Gln Gly Val Thr Glu Asp Val Leu Thr Ala Ile Ser Ala Val
565 570 575
Ala Ala Tyr Leu Gly Asn Asp Gly Ser Ala Glu Val Val His Phe Ala
580 585 590
Pro Ser Pro Asn Trp Val Arg Glu Gly Arg Arg Ala Leu Gln Asn His
595 600 605
Ser Ile Arg
610
<210> 63
<211> 148
<212> PRT
<213> 费氏丙酸杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="甲基丙二酰辅酶A差向异构酶"
<400> 63
Met Ser Asn Glu Asp Leu Phe Ile Cys Ile Asp His Val Ala Tyr Ala
1 5 10 15
Cys Pro Asp Ala Asp Glu Ala Ser Lys Tyr Tyr Gln Glu Thr Phe Gly
20 25 30
Trp His Glu Leu His Arg Glu Glu Asn Pro Glu Gln Gly Val Val Glu
35 40 45
Ile Met Met Ala Pro Ala Ala Lys Leu Thr Glu His Met Thr Gln Val
50 55 60
Gln Val Met Ala Pro Leu Asn Asp Glu Ser Thr Val Ala Lys Trp Leu
65 70 75 80
Ala Lys His Asn Gly Arg Ala Gly Leu His His Met Ala Trp Arg Val
85 90 95
Asp Asp Ile Asp Ala Val Ser Ala Thr Leu Arg Glu Arg Gly Val Gln
100 105 110
Leu Leu Tyr Asp Glu Pro Lys Leu Gly Thr Gly Gly Asn Arg Ile Asn
115 120 125
Phe Met His Pro Lys Ser Gly Lys Gly Val Leu Ile Glu Leu Thr Gln
130 135 140
Tyr Pro Lys Asn
145
<210> 64
<211> 208
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="硫酯酶(TesA)"
<400> 64
Met Met Asn Phe Asn Asn Val Phe Arg Trp His Leu Pro Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Thr Phe Arg Ala Ala Ala Ala Asp Thr Leu Leu Ile
20 25 30
Leu Gly Asp Ser Leu Ser Ala Gly Tyr Arg Met Ser Ala Ser Ala Ala
35 40 45
Trp Pro Ala Leu Leu Asn Asp Lys Trp Gln Ser Lys Thr Ser Val Val
50 55 60
Asn Ala Ser Ile Ser Gly Asp Thr Ser Gln Gln Gly Leu Ala Arg Leu
65 70 75 80
Pro Ala Leu Leu Lys Gln His Gln Pro Arg Trp Val Leu Val Glu Leu
85 90 95
Gly Gly Asn Asp Gly Leu Arg Gly Phe Gln Pro Gln Gln Thr Glu Gln
100 105 110
Thr Leu Arg Gln Ile Leu Gln Asp Val Lys Ala Ala Asn Ala Glu Pro
115 120 125
Leu Leu Met Gln Ile Arg Leu Pro Ala Asn Tyr Gly Arg Arg Tyr Asn
130 135 140
Glu Ala Phe Ser Ala Ile Tyr Pro Lys Leu Ala Lys Glu Phe Asp Val
145 150 155 160
Pro Leu Leu Pro Phe Phe Met Glu Glu Val Tyr Leu Lys Pro Gln Trp
165 170 175
Met Gln Asp Asp Gly Ile His Pro Asn Arg Asp Ala Gln Pro Phe Ile
180 185 190
Ala Asp Trp Met Ala Lys Gln Leu Gln Pro Leu Val Asn His Asp Ser
195 200 205
<210> 65
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
大肠杆菌硫酯酶(TesA)变体多肽"
<400> 65
Met Ala Asp Thr Leu Leu Ile Leu Gly Asp Ser Leu Ser Ala Gly Tyr
1 5 10 15
Arg Met Ser Ala Ser Ala Ala Trp Pro Ala Leu Leu Asn Asp Lys Trp
20 25 30
Gln Ser Lys Thr Ser Val Val Asn Ala Ser Ile Ser Gly Asp Thr Ser
35 40 45
Gln Gln Gly Leu Ala Arg Leu Pro Ala Leu Leu Lys Gln His Gln Pro
50 55 60
Arg Trp Val Leu Val Glu Leu Gly Gly Asn Asp Gly Leu Arg Gly Phe
65 70 75 80
Gln Pro Gln Gln Thr Glu Gln Thr Leu Arg Gln Ile Leu Gln Asp Val
85 90 95
Lys Ala Ala Asn Ala Glu Pro Leu Leu Met Gln Ile Arg Leu Pro Ala
100 105 110
Asn Tyr Gly Arg Arg Tyr Asn Glu Ala Phe Ser Ala Ile Tyr Pro Lys
115 120 125
Leu Ala Lys Glu Phe Asp Val Pro Leu Leu Pro Phe Phe Met Glu Glu
130 135 140
Val Tyr Leu Lys Pro Gln Trp Met Gln Asp Asp Gly Ile His Pro Asn
145 150 155 160
Arg Asp Ala Gln Pro Phe Ile Ala Asp Trp Met Ala Lys Gln Leu Gln
165 170 175
Pro Leu Val Asn His Asp Ser
180
<210> 66
<211> 286
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="硫酯酶(TesB)"
<400> 66
Met Ser Gln Ala Leu Lys Asn Leu Leu Thr Leu Leu Asn Leu Glu Lys
1 5 10 15
Ile Glu Glu Gly Leu Phe Arg Gly Gln Ser Glu Asp Leu Gly Leu Arg
20 25 30
Gln Val Phe Gly Gly Gln Val Val Gly Gln Ala Leu Tyr Ala Ala Lys
35 40 45
Glu Thr Val Pro Glu Glu Arg Leu Val His Ser Phe His Ser Tyr Phe
50 55 60
Leu Arg Pro Gly Asp Ser Lys Lys Pro Ile Ile Tyr Asp Val Glu Thr
65 70 75 80
Leu Arg Asp Gly Asn Ser Phe Ser Ala Arg Arg Val Ala Ala Ile Gln
85 90 95
Asn Gly Lys Pro Ile Phe Tyr Met Thr Ala Ser Phe Gln Ala Pro Glu
100 105 110
Ala Gly Phe Glu His Gln Lys Thr Met Pro Ser Ala Pro Ala Pro Asp
115 120 125
Gly Leu Pro Ser Glu Thr Gln Ile Ala Gln Ser Leu Ala His Leu Leu
130 135 140
Pro Pro Val Leu Lys Asp Lys Phe Ile Cys Asp Arg Pro Leu Glu Val
145 150 155 160
Arg Pro Val Glu Phe His Asn Pro Leu Lys Gly His Val Ala Glu Pro
165 170 175
His Arg Gln Val Trp Ile Arg Ala Asn Gly Ser Val Pro Asp Asp Leu
180 185 190
Arg Val His Gln Tyr Leu Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Leu Asn Phe Leu
195 200 205
Pro Val Ala Leu Gln Pro His Gly Ile Gly Phe Leu Glu Pro Gly Ile
210 215 220
Gln Ile Ala Thr Ile Asp His Ser Met Trp Phe His Arg Pro Phe Asn
225 230 235 240
Leu Asn Glu Trp Leu Leu Tyr Ser Val Glu Ser Thr Ser Ala Ser Ser
245 250 255
Ala Arg Gly Phe Val Arg Gly Glu Phe Tyr Thr Gln Asp Gly Val Leu
260 265 270
Val Ala Ser Thr Val Gln Glu Gly Val Met Arg Asn His Asn
275 280 285
<210> 67
<211> 362
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="硫酯酶(FatA)"
<400> 67
Met Leu Lys Leu Ser Cys Asn Val Thr Asp Ser Lys Leu Gln Arg Ser
1 5 10 15
Leu Leu Phe Phe Ser His Ser Tyr Arg Ser Asp Pro Val Asn Phe Ile
20 25 30
Arg Arg Arg Ile Val Ser Cys Ser Gln Thr Lys Lys Thr Gly Leu Val
35 40 45
Pro Leu Arg Ala Val Val Ser Ala Asp Gln Gly Ser Val Val Gln Gly
50 55 60
Leu Ala Thr Leu Ala Asp Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu Thr Glu Asp
65 70 75 80
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Lys Phe Val Val Arg Ser Tyr Glu Val Gly
85 90 95
Ser Asn Lys Thr Ala Thr Val Glu Thr Ile Ala Asn Leu Leu Gln Glu
100 105 110
Val Gly Cys Asn His Ala Gln Ser Val Gly Phe Ser Thr Asp Gly Phe
115 120 125
Ala Thr Thr Thr Thr Met Arg Lys Leu His Leu Ile Trp Val Thr Ala
130 135 140
Arg Met His Ile Glu Ile Tyr Lys Tyr Pro Ala Trp Gly Asp Val Val
145 150 155 160
Glu Ile Glu Thr Trp Cys Gln Ser Glu Gly Arg Ile Gly Thr Arg Arg
165 170 175
Asp Trp Ile Leu Lys Asp Ser Val Thr Gly Glu Val Thr Gly Arg Ala
180 185 190
Thr Ser Lys Trp Val Met Met Asn Gln Asp Thr Arg Arg Leu Gln Lys
195 200 205
Val Ser Asp Asp Val Arg Asp Glu Tyr Leu Val Phe Cys Pro Gln Glu
210 215 220
Pro Arg Leu Ala Phe Pro Glu Glu Asn Asn Arg Ser Leu Lys Lys Ile
225 230 235 240
Pro Lys Leu Glu Asp Pro Ala Gln Tyr Ser Met Ile Gly Leu Lys Pro
245 250 255
Arg Arg Ala Asp Leu Asp Met Asn Gln His Val Asn Asn Val Thr Tyr
260 265 270
Ile Gly Trp Val Leu Glu Ser Ile Pro Gln Glu Ile Val Asp Thr His
275 280 285
Glu Leu Gln Val Ile Thr Leu Asp Tyr Arg Arg Glu Cys Gln Gln Asp
290 295 300
Asp Val Val Asp Ser Leu Thr Thr Thr Thr Ser Glu Ile Gly Gly Thr
305 310 315 320
Asn Gly Ser Ala Thr Ser Gly Thr Gln Gly His Asn Asp Ser Gln Phe
325 330 335
Leu His Leu Leu Arg Leu Ser Gly Asp Gly Gln Glu Ile Asn Arg Gly
340 345 350
Thr Thr Leu Trp Arg Lys Lys Pro Ser Ser
355 360
<210> 68
<211> 412
<212> PRT
<213> 拟南芥
<220>
<221> 来源
<223> /注解="硫酯酶(FatB)"
<400> 68
Met Val Ala Thr Ser Ala Thr Ser Ser Phe Phe Pro Val Pro Ser Ser
1 5 10 15
Ser Leu Asp Pro Asn Gly Lys Gly Asn Lys Ile Gly Ser Thr Asn Leu
20 25 30
Ala Gly Leu Asn Ser Ala Pro Asn Ser Gly Arg Met Lys Val Lys Pro
35 40 45
Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Lys Val Gly Leu Pro
50 55 60
Gly Ser Val Asp Ile Val Arg Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ser His Pro
65 70 75 80
Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu
85 90 95
Ala Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met
100 105 110
Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Leu Val Asp Pro Phe Gly
115 120 125
Ile Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn Phe Ser
130 135 140
Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile Glu Thr
145 150 155 160
Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val Lys Thr Ala
165 170 175
Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Phe Lys Lys
180 185 190
Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val Asp Lys Tyr
195 200 205
Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser Gln Ser
210 215 220
Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Cys Asn Thr
225 230 235 240
Gly Glu Thr Leu Thr Arg Ala Ser Ser Val Trp Val Met Met Asn Lys
245 250 255
Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys Ile Pro Glu Glu Val Arg Gly Glu Ile
260 265 270
Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val Leu Ala Glu Asp Ser Arg
275 280 285
Lys Leu Thr Lys Ile Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg Ser Gly
290 295 300
Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val Asn Asn
305 310 315 320
Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Val Gly Ile Met
325 330 335
Glu Arg Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys
340 345 350
Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Thr Gly Cys Asp
355 360 365
Ile Gly Asn Leu Ala Thr Ala Gly Asp Val Glu Cys Gln His Leu Leu
370 375 380
Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu Trp Ser
385 390 395 400
Ser Lys Thr Pro Thr Thr Thr Trp Gly Thr Ala Pro
405 410
<210> 69
<211> 382
<212> PRT
<213> 加州月桂(Umbellularia californica)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="硫酯酶(FatB)"
<400> 69
Met Ala Thr Thr Ser Leu Ala Ser Ala Phe Cys Ser Met Lys Ala Val
1 5 10 15
Met Leu Ala Arg Asp Gly Arg Gly Met Lys Pro Arg Ser Ser Asp Leu
20 25 30
Gln Leu Arg Ala Gly Asn Ala Pro Thr Ser Leu Lys Met Ile Asn Gly
35 40 45
Thr Lys Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Lys Arg Leu Pro Asp Trp Ser
50 55 60
Met Leu Phe Ala Val Ile Thr Thr Ile Phe Ser Ala Ala Glu Lys Gln
65 70 75 80
Trp Thr Asn Leu Glu Trp Lys Pro Lys Pro Lys Leu Pro Gln Leu Leu
85 90 95
Asp Asp His Phe Gly Leu His Gly Leu Val Phe Arg Arg Thr Phe Ala
100 105 110
Ile Arg Ser Tyr Glu Val Gly Pro Asp Arg Ser Thr Ser Ile Leu Ala
115 120 125
Val Met Asn His Met Gln Glu Ala Thr Leu Asn His Ala Lys Ser Val
130 135 140
Gly Ile Leu Gly Asp Gly Phe Gly Thr Thr Leu Glu Met Ser Lys Arg
145 150 155 160
Asp Leu Met Trp Val Val Arg Arg Thr His Val Ala Val Glu Arg Tyr
165 170 175
Pro Thr Trp Gly Asp Thr Val Glu Val Glu Cys Trp Ile Gly Ala Ser
180 185 190
Gly Asn Asn Gly Met Arg Arg Asp Phe Leu Val Arg Asp Cys Lys Thr
195 200 205
Gly Glu Ile Leu Thr Arg Cys Thr Ser Leu Ser Val Leu Met Asn Thr
210 215 220
Arg Thr Arg Arg Leu Ser Thr Ile Pro Asp Glu Val Arg Gly Glu Ile
225 230 235 240
Gly Pro Ala Phe Ile Asp Asn Val Ala Val Lys Asp Asp Glu Ile Lys
245 250 255
Lys Leu Gln Lys Leu Asn Asp Ser Thr Ala Asp Tyr Ile Gln Gly Gly
260 265 270
Leu Thr Pro Arg Trp Asn Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val Asn Asn
275 280 285
Leu Lys Tyr Val Ala Trp Val Phe Glu Thr Val Pro Asp Ser Ile Phe
290 295 300
Glu Ser His His Ile Ser Ser Phe Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys
305 310 315 320
Thr Arg Asp Ser Val Leu Arg Ser Leu Thr Thr Val Ser Gly Gly Ser
325 330 335
Ser Glu Ala Gly Leu Val Cys Asp His Leu Leu Gln Leu Glu Gly Gly
340 345 350
Ser Glu Val Leu Arg Ala Arg Thr Glu Trp Arg Pro Lys Leu Thr Asp
355 360 365
Ser Phe Arg Gly Ile Ser Val Ile Pro Ala Glu Pro Arg Val
370 375 380
<210> 70
<211> 376
<212> PRT
<213> 萼距花(Cuphea hookeriana)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="硫酯酶(FatA1)"
<400> 70
Met Leu Lys Leu Ser Cys Asn Ala Ala Thr Asp Gln Ile Leu Ser Ser
1 5 10 15
Ala Val Ala Gln Thr Ala Leu Trp Gly Gln Pro Arg Asn Arg Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Ala Arg Arg Arg Gly Ala Val Cys Cys Ala Pro Pro Ala
35 40 45
Ala Gly Lys Pro Pro Ala Met Thr Ala Val Ile Pro Lys Asp Gly Val
50 55 60
Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Leu Ala Asp Gln Leu Arg Leu Gly Ser
65 70 75 80
Arg Thr Gln Asn Gly Leu Ser Tyr Thr Glu Lys Phe Ile Val Arg Cys
85 90 95
Tyr Glu Val Gly Ile Asn Lys Thr Ala Thr Val Glu Thr Met Ala Asn
100 105 110
Leu Leu Gln Glu Val Gly Cys Asn His Ala Gln Ser Val Gly Phe Ser
115 120 125
Thr Asp Gly Phe Ala Thr Thr Pro Thr Met Arg Lys Leu Asn Leu Ile
130 135 140
Trp Val Thr Ala Arg Met His Ile Glu Ile Tyr Lys Tyr Pro Ala Trp
145 150 155 160
Ser Asp Val Val Glu Ile Glu Thr Trp Cys Gln Ser Glu Gly Arg Ile
165 170 175
Gly Thr Arg Arg Asp Trp Ile Leu Lys Asp Tyr Gly Asn Gly Glu Val
180 185 190
Ile Gly Arg Ala Thr Ser Lys Trp Val Met Met Asn Gln Asn Thr Arg
195 200 205
Arg Leu Gln Lys Val Asp Asp Ser Val Arg Glu Glu Tyr Met Val Phe
210 215 220
Cys Pro Arg Glu Pro Arg Leu Ser Phe Pro Glu Glu Asn Asn Arg Ser
225 230 235 240
Leu Arg Lys Ile Ser Lys Leu Glu Asp Pro Ala Glu Tyr Ser Arg Leu
245 250 255
Gly Leu Thr Pro Arg Arg Ala Asp Leu Asp Met Asn Gln His Val Asn
260 265 270
Asn Val Ala Tyr Ile Gly Trp Ala Leu Glu Ser Val Pro Gln Glu Ile
275 280 285
Ile Asp Ser Tyr Glu Leu Glu Thr Ile Thr Leu Asp Tyr Arg Arg Glu
290 295 300
Cys Gln Gln Asp Asp Val Val Asp Ser Leu Thr Ser Val Leu Ser Asp
305 310 315 320
Glu Glu Ser Gly Thr Leu Pro Glu Leu Lys Gly Thr Asn Gly Ser Ala
325 330 335
Ser Thr Pro Leu Lys Arg Asp His Asp Gly Ser Arg Gln Phe Leu His
340 345 350
Leu Leu Arg Leu Ser Pro Asp Gly Leu Glu Ile Asn Arg Gly Arg Thr
355 360 365
Glu Trp Arg Lys Lys Ser Thr Lys
370 375
<210> 71
<211> 415
<212> PRT
<213> 萼距花
<220>
<221> 来源
<223> /注解="硫酯酶(FatB2)"
<400> 71
Met Val Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ala Phe Phe Pro Val Pro Ala Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Pro Lys Pro Gly Lys Phe Gly Asn Trp Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Pro Ser Phe Lys Pro Lys Ser Ile Pro Asn Gly Gly Phe Gln Val
35 40 45
Lys Ala Asn Asp Ser Ala His Pro Lys Ala Asn Gly Ser Ala Val Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Gly Ser Leu Asn Thr Gln Glu Asp Thr Ser Ser Ser Pro
65 70 75 80
Pro Pro Arg Thr Phe Leu His Gln Leu Pro Asp Trp Ser Arg Leu Leu
85 90 95
Thr Ala Ile Thr Thr Val Phe Val Lys Ser Lys Arg Pro Asp Met His
100 105 110
Asp Arg Lys Ser Lys Arg Pro Asp Met Leu Val Asp Ser Phe Gly Leu
115 120 125
Glu Ser Thr Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Ser Phe Ser Ile
130 135 140
Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Thr Asp Arg Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu
145 150 155 160
Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ser Leu Asn His Cys Lys Ser Thr Gly
165 170 175
Ile Leu Leu Asp Gly Phe Gly Arg Thr Leu Glu Met Cys Lys Arg Asp
180 185 190
Leu Ile Trp Val Val Ile Lys Met Gln Ile Lys Val Asn Arg Tyr Pro
195 200 205
Ala Trp Gly Asp Thr Val Glu Ile Asn Thr Arg Phe Ser Arg Leu Gly
210 215 220
Lys Ile Gly Met Gly Arg Asp Trp Leu Ile Ser Asp Cys Asn Thr Gly
225 230 235 240
Glu Ile Leu Val Arg Ala Thr Ser Ala Tyr Ala Met Met Asn Gln Lys
245 250 255
Thr Arg Arg Leu Ser Lys Leu Pro Tyr Glu Val His Gln Glu Ile Val
260 265 270
Pro Leu Phe Val Asp Ser Pro Val Ile Glu Asp Ser Asp Leu Lys Val
275 280 285
His Lys Phe Lys Val Lys Thr Gly Asp Ser Ile Gln Lys Gly Leu Thr
290 295 300
Pro Gly Trp Asn Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val Ser Asn Val Lys
305 310 315 320
Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Met Pro Thr Glu Val Leu Glu Thr
325 330 335
Gln Glu Leu Cys Ser Leu Ala Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg
340 345 350
Asp Ser Val Leu Glu Ser Val Thr Ala Met Asp Pro Ser Lys Val Gly
355 360 365
Val Arg Ser Gln Tyr Gln His Leu Leu Arg Leu Glu Asp Gly Thr Ala
370 375 380
Ile Val Asn Gly Ala Thr Glu Trp Arg Pro Lys Asn Ala Gly Ala Asn
385 390 395 400
Gly Ala Ile Ser Thr Gly Lys Thr Ser Asn Gly Asn Ser Val Ser
405 410 415
<210> 72
<211> 394
<212> PRT
<213> 萼距花
<220>
<221> 来源
<223> /注解="硫酯酶(FatB3)"
<400> 72
Met Val Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ala Phe Phe Ser Val Pro Thr Pro
1 5 10 15
Gly Ile Ser Pro Lys Pro Gly Lys Phe Gly Asn Gly Gly Phe Gln Val
20 25 30
Lys Ala Asn Ala Asn Ala His Pro Ser Leu Lys Ser Gly Ser Leu Glu
35 40 45
Thr Glu Asp Asp Thr Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Arg Thr Phe Ile
50 55 60
Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu Ser Ala Ile Thr Thr Ile
65 70 75 80
Phe Gly Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met Leu Asp Arg Lys Ser Lys
85 90 95
Arg Pro Asp Met Leu Met Glu Pro Phe Gly Val Asp Ser Ile Val Gln
100 105 110
Asp Gly Val Phe Phe Arg Gln Ser Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile
115 120 125
Gly Ala Asp Arg Thr Thr Ser Ile Glu Thr Leu Met Asn Met Phe Gln
130 135 140
Glu Thr Ser Leu Asn His Cys Lys Ser Asn Gly Leu Leu Asn Asp Gly
145 150 155 160
Phe Gly Arg Thr Pro Glu Met Cys Lys Lys Gly Leu Ile Trp Val Val
165 170 175
Thr Lys Met Gln Val Glu Val Asn Arg Tyr Pro Ile Trp Gly Asp Ser
180 185 190
Ile Glu Val Asn Thr Trp Val Ser Glu Ser Gly Lys Asn Gly Met Gly
195 200 205
Arg Asp Trp Leu Ile Ser Asp Cys Ser Thr Gly Glu Ile Leu Val Arg
210 215 220
Ala Thr Ser Val Trp Ala Met Met Asn Gln Lys Thr Arg Arg Leu Ser
225 230 235 240
Lys Phe Pro Phe Glu Val Arg Gln Glu Ile Ala Pro Asn Phe Val Asp
245 250 255
Ser Val Pro Val Ile Glu Asp Asp Arg Lys Leu His Lys Leu Asp Val
260 265 270
Lys Thr Gly Asp Ser Ile His Asn Gly Leu Thr Pro Arg Trp Asn Asp
275 280 285
Leu Asp Val Asn Gln His Val Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile
290 295 300
Leu Lys Ser Val Pro Thr Asp Val Phe Glu Ala Gln Glu Leu Cys Gly
305 310 315 320
Val Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Met Glu
325 330 335
Ser Val Thr Ala Met Asp Pro Ser Lys Glu Gly Asp Arg Ser Val Tyr
340 345 350
Gln His Leu Leu Arg Leu Glu Asp Gly Ala Asp Ile Ala Ile Gly Arg
355 360 365
Thr Glu Trp Arg Pro Lys Asn Ala Gly Ala Asn Gly Ala Ile Ser Thr
370 375 380
Gly Lys Thr Ser Asn Arg Asn Ser Val Ser
385 390
<210> 73
<211> 4559
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
pDG2质粒多核苷酸"
<400> 73
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atggcgcaac tcactcttct tttagtcggc aattccgacg ccatcacgcc 120
attacttgct aaagctgact ttgaacaacg ttcgcgtctg cagattattc ctgcgcagtc 180
agttatcgcc agtgatgccc ggccttcgca agctatccgc gccagtcgtg ggagttcaat 240
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
pACYC-PTrc载体多核苷酸"
<400> 75
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acattaatat atacctcttt aatttttaat aataaagtta atcgataatt ccggtcgagt 4020
gcccacacag attgtctgat aaattgttaa agagcagtgc cgcttcgctt tttctcagcg 4080
gcgctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacattat acgagccgga 4140
tgattaattg tcaacagctc atttcagaat atttgccaga accgttatga tgtcggcgca 4200
aaaaacatta tccagaacgg gagtgcgcct tgagcgacac gaattatgca gtgatttacg 4260
acctgcacag ccataccaca gcttccgatg gctgcctgac gccagaagca ttggtgcacc 4320
gtgcagtcga tgataagctg tcaaaccaga tcaattcgcg ctaactcaca ttaattgcgt 4380
tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 4440
gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc 4500
agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag 4560
cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt tgacggcggg 4620
atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg 4680
cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc 4740
agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac 4800
atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat 4860
ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc 4920
gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca 4980
tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga 5040
acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg 5100
atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg 5160
ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta 5220
atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc 5280
agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc 5340
gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc 5400
acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact 5460
ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga 5520
aaggttttgc accattcgat ggtgtcaacg taaatgcatg ccgcttcgcc ttcgcgcgcg 5580
aattgatctg ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc 5640
tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg 5700
gcgcgtcagc gggtgttggc ggggccggcc tcg 5733
<210> 76
<211> 193
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
PTrc启动子多核苷酸"
<400> 76
ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60
cacacaggaa acagcgccgc tgagaaaaag cgaagcggca ctgctcttta acaatttatc 120
agacaatctg tgtgggcact cgaccggaat tatcgattaa ctttattatt aaaaattaaa 180
gaggtatata tta 193
<210> 77
<211> 193
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
PTrc2启动子多核苷酸"
<400> 77
ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtgta atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60
cacacaggaa acagcgccgc tgagaaaaag cgaagcggca ctgctcttta acaatttatc 120
agacaatctg tgtgggcact cgaccggaat tatcgattaa ctttattatt aaaaattaaa 180
gaggtatata tta 193
<210> 78
<211> 5978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
pDS80质粒多核苷酸"
<400> 78
cactatacca attgagatgg gctagtcaat gataattact agtccttttc ctttgagttg 60
tgggtatctg taaattctgc tagacctttg ctggaaaact tgtaaattct gctagaccct 120
ctgtaaattc cgctagacct ttgtgtgttt tttttgttta tattcaagtg gttataattt 180
atagaataaa gaaagaataa aaaaagataa aaagaataga tcccagccct gtgtataact 240
cactacttta gtcagttccg cagtattaca aaaggatgtc gcaaacgctg tttgctcctc 300
tacaaaacag accttaaaac cctaaaggcg tcggcatccg cttacagaca agctgtgacc 360
gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag 420
cagatcaatt cgcgcgcgaa ggcgaagcgg catgcattta cgttgacacc atcgaatggt 480
gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga 540
atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg 600
tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag 660
cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac 720
agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg 780
tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag 840
aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca 900
gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct 960
gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta 1020
ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc 1080
agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg 1140
gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact 1200
ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca 1260
ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt 1320
ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct 1380
catgttatat cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca 1440
gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc 1500
ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 1560
gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc 1620
agtgagcgca acgcaattaa tgtaagttag cgcgaattga tctggtttga cagcttatca 1680
tcgactgcac ggtgcaccaa tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc tgtggtatgg 1740
ctgtgcaggt cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc ccgttctgga 1800
taatgttttt tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attttcagat ctctcaccta 1860
ccaaacaatg cccccctgca aaaaataaat tcatataaaa aacatacaga taaccatctg 1920
cggtgataaa ttatctctgg cggtgttgac ataaatacca ctggcggtga tactgagcac 1980
agaatattca cacaggaaac agcgccgctg agaaaaagcg aagcggcact gctctttaac 2040
aatttatcag acaatctgtg tgggcactcg accggaatta tcgattaact ttattattaa 2100
aaattaaaga ggtatatatt aatgtatcga ttaaataagg aggaataaac catggatccg 2160
agctcgagat ctgcagctgg taccatatgg gaattcgaag cttgggcccg aacaaaaact 2220
catctcagaa gaggatctga atagcgccgt cgaccatcat catcatcatc attgagttta 2280
aacggtctcc agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt 2340
aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg 2400
gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg 2460
gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 2520
gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgacgcctga 2580
tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca 2640
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg 2700
acgagcttag taaagccctc gctagatttt aatgcggatg ttgcgattac ttcgccaact 2760
attgcgataa caagaaaaag ccagcctttc atgatatatc tcccaatttg tgtagggctt 2820
attatgcacg cttaaaaata ataaaagcag acttgacctg atagtttggc tgtgagcaat 2880
tatgtgctta gtgcatctaa cgcttgagtt aagccgcgcc gcgaagcggc gtcggcttga 2940
acgaattgtt agacattatt tgccgactac cttggtgatc tcgcctttca cgtagtggac 3000
aaattcttcc aactgatctg cgcgcgaggc caagcgatct tcttcttgtc caagataagc 3060
ctgtctagct tcaagtatga cgggctgata ctgggccggc aggcgctcca ttgcccagtc 3120
ggcagcgaca tccttcggcg cgattttgcc ggttactgcg ctgtaccaaa tgcgggacaa 3180
cgtaagcact acatttcgct catcgccagc ccagtcgggc ggcgagttcc atagcgttaa 3240
ggtttcattt agcgcctcaa atagatcctg ttcaggaacc ggatcaaaga gttcctccgc 3300
cgctggacct accaaggcaa cgctatgttc tcttgctttt gtcagcaaga tagccagatc 3360
aatgtcgatc gtggctggct cgaagatacc tgcaagaatg tcattgcgct gccattctcc 3420
aaattgcagt tcgcgcttag ctggataacg ccacggaatg atgtcgtcgt gcacaacaat 3480
ggtgacttct acagcgcgga gaatctcgct ctctccaggg gaagccgaag tttccaaaag 3540
gtcgttgatc aaagctcgcc gcgttgtttc atcaagcctt acggtcaccg taaccagcaa 3600
atcaatatca ctgtgtggct tcaggccgcc atccactgcg gagccgtaca aatgtacggc 3660
cagcaacgtc ggttcgagat ggcgctcgat gacgccaact acctctgata gttgagtcga 3720
tacttcggcg atcaccgctt ccctcatgat gtttaacttt gttttagggc gactgccctg 3780
ctgcgtaaca tcgttgctgc tccataacat caaacatcga cccacggcgt aacgcgcttg 3840
ctgcttggat gcccgaggca tagactgtac cccaaaaaaa cagtcataac aagccatgaa 3900
aaccgccact gcgccgttac caccgctgcg ttcggtcaag gttctggacc agttgcgtga 3960
gcgcatacgc tacttgcatt acagcttacg aaccgaacag gcttatgtcc actgggttcg 4020
tgccttcatc cgtttccacg gtgtgcgtca cccggcaacc ttgggcagca gcgaagtcga 4080
ggcatttctg tcctggctgg cgaacgagcg caaggtttcg gtctccacgc atcgtcaggc 4140
attggcggcc ttgctgttct tctacggcaa ggtgctgtgc acggatctgc cctggcttca 4200
ggagatcgga agacctcggc cgtcgcggcg cttgccggtg gtgctgaccc cggatgaagt 4260
ggttcgcatc ctcggttttc tggaaggcga gcatcgtttg ttcgcccagc ttctgtatgg 4320
aacgggcatg cggatcagtg agggtttgca actgcgggtc aaggatctgg atttcgatca 4380
cggcacgatc atcgtgcggg agggcaaggg ctccaaggat cgggccttga tgttacccga 4440
gagcttggca cccagcctgc gcgagcaggg gaattaattc ccacgggttt tgctgcccgc 4500
aaacgggctg ttctggtgtt gctagtttgt tatcagaatc gcagatccgg cttcagccgg 4560
tttgccggct gaaagcgcta tttcttccag aattgccatg attttttccc cacgggaggc 4620
gtcactggct cccgtgttgt cggcagcttt gattcgataa gcagcatcgc ctgtttcagg 4680
ctgtctatgt gtgactgttg agctgtaaca agttgtctca ggtgttcaat ttcatgttct 4740
agttgctttg ttttactggt ttcacctgtt ctattaggtg ttacatgctg ttcatctgtt 4800
acattgtcga tctgttcatg gtgaacagct ttgaatgcac caaaaactcg taaaagctct 4860
gatgtatcta tcttttttac accgttttca tctgtgcata tggacagttt tccctttgat 4920
atgtaacggt gaacagttgt tctacttttg tttgttagtc ttgatgcttc actgatagat 4980
acaagagcca taagaacctc agatccttcc gtatttagcc agtatgttct ctagtgtggt 5040
tcgttgtttt tgcgtgagcc atgagaacga accattgaga tcatacttac tttgcatgtc 5100
actcaaaaat tttgcctcaa aactggtgag ctgaattttt gcagttaaag catcgtgtag 5160
tgtttttctt agtccgttat gtaggtagga atctgatgta atggttgttg gtattttgtc 5220
accattcatt tttatctggt tgttctcaag ttcggttacg agatccattt gtctatctag 5280
ttcaacttgg aaaatcaacg tatcagtcgg gcggcctcgc ttatcaacca ccaatttcat 5340
attgctgtaa gtgtttaaat ctttacttat tggtttcaaa acccattggt taagcctttt 5400
aaactcatgg tagttatttt caagcattaa catgaactta aattcatcaa ggctaatctc 5460
tatatttgcc ttgtgagttt tcttttgtgt tagttctttt aataaccact cataaatcct 5520
catagagtat ttgttttcaa aagacttaac atgttccaga ttatatttta tgaatttttt 5580
taactggaaa agataaggca atatctcttc actaaaaact aattctaatt tttcgcttga 5640
gaacttggca tagtttgtcc actggaaaat ctcaaagcct ttaaccaaag gattcctgat 5700
ttccacagtt ctcgtcatca gctctctggt tgctttagct aatacaccat aagcattttc 5760
cctactgatg ttcatcatct gagcgtattg gttataagtg aacgataccg tccgttcttt 5820
ccttgtaggg ttttcaatcg tggggttgag tagtgccaca cagcataaaa ttagcttggt 5880
ttcatgctcc gttaagtcat agcgactaat cgctagttca tttgctttga aaacaactaa 5940
ttcagacata catctcaatt ggtctaggtg attttaat 5978
<210> 79
<211> 3227
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
p100.38质粒多核苷酸"
<400> 79
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt tgtgcatccg aagatcagca 1140
gttcaacctg ttgatagtac gtactaagct ctcatgtttc acgtactaag ctctcatgtt 1200
taacgtacta agctctcatg tttaacgaac taaaccctca tggctaacgt actaagctct 1260
catggctaac gtactaagct ctcatgtttg aacaataaaa ttaatataaa tcagcaactt 1320
aaatagcctc taaggtttta agttttataa gaaaaaaaag aatatataag gcttttaaag 1380
ctagctttta aggtttcacc atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 1440
gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg 1500
agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt 1560
ggccgattca ttaagacagc tgtctcttat acacatctca accctgaagc tcttgttggc 1620
tagtgcgtag tcgttggcaa gctttccgct gtttctgcat tcttacgttt taggatgcat 1680
atggcggccg cataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatctaga gttgcatgcc 1740
tgcaggtccg cttattatca cttattcagg cgtagcaacc aggcgtttaa gggcaccaat 1800
aactgcctta aaaaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat 1860
taagcattct gccgacatgg aagccatcac aaacggcatg atgaacctga atcgccagcg 1920
gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga 1980
agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg 2040
agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac 2100
acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc 2160
agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat 2220
cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ttccggatga gcattcatca 2280
ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct 2340
ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact 2400
gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag 2460
tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata 2520
cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa 2580
cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg acaccaggat 2640
ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta ttcgactcta gataacttcg 2700
tatagcatac attatacgaa gttatggatc cagcttatcg ataccgtcaa acaaatcata 2760
aaaaatttat ttgctttcag gaaaattttt ctgtataata gattcaattg cgatgacgac 2820
gaacacgcat taaggaggtg aagagctcga attcgagcca atatgcgaga acacccgaga 2880
aaattcatcg atgatggttg agatgtgtat aagagacagc tgtcgtaata gcgaagaggc 2940
ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg 3000
gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac 3060
aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 3120
gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 3180
gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcga 3227
<210> 80
<211> 7877
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
pACYC-PTrc-sbm-ygfG质粒266 - 1348:lacI 1577 -
1769:PTrc1800 - 3944:sbm3967 - 4752:ygfG5208 -
6020:kanR6347 - 7176:p15A ori多核苷酸"
<400> 80
cgaggccggc cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat 60
ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt 120
catcaccgaa acgcgcgagg cagcagatca attcgcgcgc gaaggcgaag cggcatgcat 180
ttacgttgac accatcgaat ggtgcaaaac ctttcgcggt atggcatgat agcgcccgga 240
agagagtcaa ttcagggtgg tgaatgtgaa accagtaacg ttatacgatg tcgcagagta 300
tgccggtgtc tcttatcaga ccgtttcccg cgtggtgaac caggccagcc acgtttctgc 360
gaaaacgcgg gaaaaagtgg aagcggcgat ggcggagctg aattacattc ccaaccgcgt 420
ggcacaacaa ctggcgggca aacagtcgtt gctgattggc gttgccacct ccagtctggc 480
cctgcacgcg ccgtcgcaaa ttgtcgcggc gattaaatct cgcgccgatc aactgggtgc 540
cagcgtggtg gtgtcgatgg tagaacgaag cggcgtcgaa gcctgtaaag cggcggtgca 600
caatcttctc gcgcaacgcg tcagtgggct gatcattaac tatccgctgg atgaccagga 660
tgccattgct gtggaagctg cctgcactaa tgttccggcg ttatttcttg atgtctctga 720
ccagacaccc atcaacagta ttattttctc ccatgaagac ggtacgcgac tgggcgtgga 780
gcatctggtc gcattgggtc accagcaaat cgcgctgtta gcgggcccat taagttctgt 840
ctcggcgcgt ctgcgtctgg ctggctggca taaatatctc actcgcaatc aaattcagcc 900
gatagcggaa cgggaaggcg actggagtgc catgtccggt tttcaacaaa ccatgcaaat 960
gctgaatgag ggcatcgttc ccactgcgat gctggttgcc aacgatcaga tggcgctggg 1020
cgcaatgcgc gccattaccg agtccgggct gcgcgttggt gcggatatct cggtagtggg 1080
atacgacgat accgaagaca gctcatgtta tatcccgccg tcaaccacca tcaaacagga 1140
ttttcgcctg ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg caactctctc agggccaggc 1200
ggtgaagggc aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa agaaaaacca ccctggcgcc 1260
caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca 1320
ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagcgcgaat 1380
tgatctggtt tgacagctta tcatcgactg cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc 1440
agccatcgga agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc 1500
tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca 1560
aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt gtggaattgt 1620
gagcggataa caatttcaca caggaaacag cgccgctgag aaaaagcgaa gcggcactgc 1680
tctttaacaa tttatcagac aatctgtgtg ggcactcgac cggaattatc gattaacttt 1740
attattaaaa attaaagagg tatatattaa tgtatcgatt aaataaggag gaataaacca 1800
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<210> 81
<211> 15179
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
Tn7tes质粒多核苷酸"
<400> 81
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caacaaagca aataaataag gcggatcgtg tgattgagtt tgaagcatcg gatcttcaac 7800
gagccaaaat aatcgatttt cctaatctct cgtcctttgc ttccgtacgc aacaaggatg 7860
gagcgcagag ttcatttatt tacgaagctg aaacaccata tagcaagact cgttatcaca 7920
tcccacagtt agagctagct cggtcattat ttttagggga tcctctagag tcgacctgca 7980
ggcatgcaag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa 8040
atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt 8100
cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg 8160
gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga 8220
aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa 8280
atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac 8340
gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt 8400
ttgcgtttct acaaactctt ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 8460
atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 8520
caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 8580
cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 8640
tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 8700
tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac 8760
gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 8820
tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 8880
gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 8940
aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 9000
gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgcagca 9060
atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 9120
caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 9180
ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 9240
attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 9300
agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 9360
aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttacgcgcc 9420
ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 9480
tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 9540
cgccggccag cctcgcagag caggattccc gttgagcacc gccaggtgcg aataagggac 9600
agtgaagaag gaacacccgc tcgcgggtgg gcctacttca cctatcctgc ccggcggcat 9660
caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc gacatcaccg atggggaaga 9720
tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccc 9780
cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca ccattccttg cggcggcggt 9840
gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg caggagtcgc ataagggaga 9900
gcgtcgatcc ccgacagtaa gacgggtaag cctgttgatg ataccgctgc cttactgggt 9960
gcattagcca gtctgaatga cctgtcacgg gataatccga agtggtcaga ctggaaaatc 10020
agagggcagg aactgctgaa cagcaaaaag tcagatagca ccacatagca gacccgccat 10080
aaaacgccct gagaagcccg tgacgggctt ttcttgtatt atgggtagtt tccttgcatg 10140
aatccataaa aggcgcctgt agtgccattt acccccattc actgccagag ccgtgagcgc 10200
agcgaactga atgtcacgaa aaagacagcg actcaggtgc ctgatggtcg gagacaaaag 10260
gaatattcag cgatttgccc gagcttgcga gggtgctact taagccttta gggttttaag 10320
gtctgttttg tagaggagca aacagcgttt gcgacatcct tttgtaatac tgcggaactg 10380
actaaagtag tgagttatac acagggctgg gatctattct ttttatcttt ttttattctt 10440
tctttattct ataaattata accacttgaa tataaacaaa aaaaacacac aaaggtctag 10500
cggaatttac agagggtcta gcagaattta caagttttcc agcaaaggtc tagcagaatt 10560
tacagatacc cacaactcaa aggaaaagga ctagtaatta tcattgacta gcccatctca 10620
attggtatag tgattaaaat cacctagacc aattgagatg tatgtctgaa ttagttgttt 10680
tcaaagcaaa tgaactagcg attagtcgct atgacttaac ggagcatgaa accaagctaa 10740
ttttatgctg tgtggcacta ctcaacccca cgattgaaaa ccctacaagg aaagaacgga 10800
cggtatcgtt cacttataac caatacgttc agatgatgaa catcagtagg gaaaatgctt 10860
atggtgtatt agctaaagca accagagagc tgatgacgag aactgtggaa atcaggaatc 10920
ctttggttaa aggctttgag attttccagt ggacaaacta tgccaagttc tcaagcgaaa 10980
aattagaatt agtttttagt gaagagatat tgccttatct tttccagtta aaaaaattca 11040
taaaatataa tctggaacat gttaagtctt ttgaaaacaa atactctatg aggatttatg 11100
agtggttatt aaaagaacta acacaaaaga aaactcacaa ggcaaatata gagattagcc 11160
ttgatgaatt taagttcatg ttaatgcttg aaaataacta ccatgagttt aaaaggctta 11220
accaatgggt tttgaaacca ataagtaaag atttaaacac ttacagcaat atgaaattgg 11280
tggttgataa gcgaggccgc ccgactgata cgttgatttt ccaagttgaa ctagatagac 11340
aaatggatct cgtaaccgaa cttgagaaca accagataaa aatgaatggt gacaaaatac 11400
caacaaccat tacatcagat tcctacctac ataacggact aagaaaaaca ctacacgatg 11460
ctttaactgc aaaaattcag ctcaccagtt ttgaggcaaa atttttgagt gacatgcaaa 11520
gtaagtatga tctcaatggt tcgttctcat ggctcacgca aaaacaacga accacactag 11580
agaacatact ggctaaatac ggaaggatct gaggttctta tggctcttgt atctatcagt 11640
gaagcatcaa gactaacaaa caaaagtaga acaactgttc accgttacat atcaaaggga 11700
aaactgtcca tatgcacaga tgaaaacggt gtaaaaaaga tagatacatc agagctttta 11760
cgagtttttg gtgcatttaa agctgttcac catgaacaga tcgacaatgt aacagatgaa 11820
cagcatgtaa cacctaatag aacaggtgaa accagtaaaa caaagcaact agaacatgaa 11880
attgaacacc tgagacaact tgttacagct caacagtcac acatagacag cctgaaacag 11940
gcgatgctgc ttatcgaatc aaagctgccg acaacacggg agccagtgac gcctcccgtg 12000
gggaaaaaat catggcaatt ctggaagaaa tagcgctttc agcctgtggg cggacaaaat 12060
agttgggaac tgggaggggt ggaaatggag tttttaagga ttatttaggg aagagtgaca 12120
aaatagatgg gaactgggtg tagcgtcgta agctaatacg aaaattaaaa atgacaaaat 12180
agtttggaac tagatttcac ttatctggtt ggtcgacact agtattaccc tgttatccct 12240
agatttaaat gatatcggat cctagtaagc cacgttttaa ttaatcagat gggtcaatag 12300
cggccgccaa ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca ccatcgaatg 12360
gtgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt 12420
gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac 12480
cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga 12540
agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa 12600
acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat 12660
tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt 12720
agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt 12780
cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc 12840
ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat 12900
tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca 12960
ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc 13020
tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga 13080
ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc 13140
cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga 13200
gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag 13260
ctcatgttat atcccgccgt caaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac 13320
cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt 13380
gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 13440
ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 13500
gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agcgcgaatt gatctggttt gacagcttat 13560
catcgactgc acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca gccatcggaa gctgtggtat 13620
ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg 13680
gataatgttt tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt 13740
gacaattaat catccggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 13800
aggaaacagc gccgctgaga aaaagcgaag cggcactgct ctttaacaat ttatcagaca 13860
atctgtgtgg gcactcgacc ggaattatcg attaacttta ttattaaaaa ttaaagaggt 13920
atatattaat gtatcgatta aataaggagg aataaaccat ggcggacacg ttattgattc 13980
tgggtgatag cctgagcgcc gggtatcgaa tgtctgccag cgcggcctgg cctgccttgt 14040
tgaatgataa gtggcagagt aaaacgtcgg tagttaatgc cagcatcagc ggcgacacct 14100
cgcaacaagg actggcgcgc cttccggctc tgctgaaaca gcatcagccg cgttgggtgc 14160
tggttgaact gggcggcaat gacggtttgc gtggttttca gccacagcaa accgagcaaa 14220
cgctgcgcca gattttgcag gatgtcaaag ccgccaacgc tgaaccattg ttaatgcaaa 14280
tacgtctgcc tgcaaactat ggtcgccgtt ataatgaagc ctttagcgcc atttacccca 14340
aactcgccaa agagtttgat gttccgctgc tgcccttttt tatggaagag gtctacctca 14400
agccacaatg gatgcaggat gacggtattc atcccaaccg cgacgcccag ccgtttattg 14460
ccgactggat ggcgaagcag ttgcagcctt tagtaaatca tgactcataa tgactctaga 14520
aataatttaa atggaattcg aagcttgggc ccgaacaaaa actcatctca gaagaggatc 14580
tgaatagcgc cgtcgaccat catcatcatc atcattgagt ttaaacggtc tccagcttgg 14640
ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag attaaatcag aacgcagaag 14700
cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat 14760
gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag 14820
agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc 14880
gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgattaa ttaagacgtc ccgtcaagtc 14940
agcgtaatgc cctaggaggc gcgccacggc cgcgtcgacc ccacgcccct ctttaatacg 15000
acgggcaatt tgcacttcag aaaatgaaga gtttgcttta gccataacaa aagtccagta 15060
tgctttttca cagcataact ggactgattt cagtttacaa ctattctgtc tagtttaaga 15120
ctttattgtc atagtttaga tctattttgt tcagtttaag actttattgt ccgcccaca 15179
<210> 82
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
Del-fadE-F引物"
<400> 82
aaaaacagca acaatgtgag ctttgttgta attatattgt aaacatattg attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 83
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
Del-fadE-R引物"
<400> 83
aaacggagcc tttcggctcc gttattcatt tacgcggctt caactttcct gtaggctgga 60
gctgcttc 68
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
fadE-L2引物"
<400> 84
cgggcaggtg ctatgaccag gac 23
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
fadE-R1引物"
<400> 85
cgcggcgttg accggcagcc tgg 23
<210> 86
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
Del-tonA-F引物"
<400> 86
atcattctcg tttacgttat cattcacttt acatcagaga tataccaatg attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 87
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
Del-tonA-R引物"
<400> 87
gcacggaaat ccgtgcccca aaagagaaat tagaaacgga aggttgcggt tgtaggctgg 60
agctgcttc 69
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
tonA-verF引物"
<400> 88
caacagcaac ctgctcagca a 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
tonA-verR引物"
<400> 89
aagctggagc agcaaagcgt t 21
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
lacI-正向引物"
<400> 90
ggctggctgg cataaatatc tc 22
<210> 91
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
lacZ-反向引物"
<400> 91
gcgttaaagt tgttctgctt catcagcagg atatcctgca ccatcgtctg gattttgaac 60
ttttgctttg ccacggaac 79
<210> 92
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
引物"
<400> 92
tgaattccat ggcgcaactc actcttcttt tagtcg 36
<210> 93
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
引物"
<400> 93
cagtacctcg agtcttcgta tacatatgcg ctcagtcac 39
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
引物"
<400> 94
ccttggggca tatgaaagct g 21
<210> 95
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
引物"
<400> 95
tttagtcatc tcgagtgcac ctcaccttt 29
<210> 96
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
pTrc_F引物"
<400> 96
tttcgcgagg ccggccccgc caacacccgc tgacg 35
<210> 97
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
pTrc_R引物"
<400> 97
aaggacgtct taattaatca ggagagcgtt caccgacaa 39
<210> 98
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
LF302引物"
<400> 98
atatgacgtc ggcatccgct tacagaca 28
<210> 99
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
LF303引物"
<400> 99
aattcttaag tcaggagagc gttcaccgac aa 32
<210> 100
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE044引物"
<400> 100
gaggaataaa ccatgaacgc aggaatttta ggagtag 37
<210> 101
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
引物61"
<400> 101
cccaagcttc gaattcttac ttaccccaac gaatgattag g 41
<210> 102
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE025引物"
<400> 102
cctgacagtg cgggcttttt ttttcgacca aaggtaacga ggtaacaacc gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 103
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE026引物"
<400> 103
gtatatatta atgtatcgat taaataagga ggaataaacc atgcgagtgt tgaagttcgg 60
cg 62
<210> 104
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE027引物"
<400> 104
ctgatgtacc gccgaacttc aacactcgca tggtttattc ctccttattt aatcgatac 59
<210> 105
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE028引物
<400> 105
gcgcccgtat tttcgtggtg ctgattac 28
<210> 106
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE029引物"
<400> 106
gtaatcagca ccacgtaaat acgggcgc 28
<210> 107
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE030引物"
<400> 107
tcagactcct aacttccatg agagg 25
<210> 108
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
Km_trc_overR引物"
<400> 108
aatatttgcc agaaccgtta tgatgtcggc attccgggga tccgtcgacc 50
<210> 109
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
Km_trc_overF引物"
<400> 109
cttcgaactg caggtcgacg gatccccgga atgccgacat cataacggtt ctggc 55
<210> 110
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
EG238引物"
<400> 110
gctgatcatt aactatccgc tggatgacc 29
<210> 111
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE017引物"
<400> 111
actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtaag 40
<210> 112
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE018引物"
<400> 112
tcactgcccg ctttcc 16
<210> 113
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE019引物"
<400> 113
accggcagat cgtatgtaat atgcatggtt tattcctcct tatttaatcg ataca 55
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE020引物"
<400> 114
atgcatatta catacgatct gcc 23
<210> 115
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE021引物"
<400> 115
ggtcgacgga tccccggaat taagcgtcaa cgaaaccg 38
<210> 116
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE022引物"
<400> 116
gaagcagctc cagcctacac cagacgatgg tgcaggat 38
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE023引物"
<400> 117
gcaaagacca gaccgttcat a 21
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
Kan/Chlor1引物"
<400> 118
attccgggga tccgtcgacc 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
Kan/Chlor4引物"
<400> 119
tgtaggctgg agctgcttcg 20
<210> 120
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE133引物"
<400> 120
aaaaacagca acaatgtgag ctttgttgta attatattgt aaacatattg tccgctgttt 60
ctgcattctt acgt 74
<210> 121
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE134引物"
<400> 121
gatgacgacg aacacgcatt aaggaggtga ataaggagga ataacatatg aaagctggca 60
ttcttggtgt tg 72
<210> 122
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE135引物"
<400> 122
gtaacgtcca acaccaagaa tgccagcttt catatgttat tcctccttat tcacctcctt 60
aatgcgtgtt cg 72
<210> 123
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE136引物"
<400> 123
aaacggagcc tttcggctcc gttattcatt tacgcggctt caactttccg ttatcggccc 60
cagcggattg 70
<210> 124
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE137引物"
<400> 124
cgcagtttgc aagtgacggt atataaccga aaagtgactg agcgtacatg attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 125
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE138引物"
<400> 125
gcaaattgcg tcatgtttta atccttatcc tagaaacgaa ccagcgcgga tgtaggctgg 60
agctgcttcg 70
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE139引物"
<400> 126
gcagcgacaa gttcctcagc 20
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE140引物"
<400> 127
ccgcagaagc ttcagcaaac g 21
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
fadE-L2引物"
<400> 128
cgggcaggtg ctatgaccag gac 23
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
fadE-R2引物"
<400> 129
gggcaggata agctcgggag g 21
<210> 130
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
Km_trc_overF引物"
<400> 130
cttcgaactg caggtcgacg gatccccgga atgccgacat cataacggtt ctggc 55
<210> 131
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
Km_trc_overR引物"
<400> 131
aatatttgcc agaaccgtta tgatgtcggc attccgggga tccgtcgacc 50
<210> 132
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE032引物"
<400> 132
gtatatatta atgtatcgat taaataagga ggaataaacc atgatggtaa ggatatttga 60
tacaacac 68
<210> 133
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE033引物"
<400> 133
ctaagtgttg tatcaaatat ccttaccatc atggtttatt cctccttatt taatcgatac 60
<210> 134
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE034引物"
<400> 134
gatttgttgg ctatagttag agaagttact ggaaaattgt aacaaggaaa ccgtgtgatg 60
tcgaag 66
<210> 135
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE035引物"
<400> 135
gtaattcttc gacatcacac ggtttccttg ttacaatttt ccagtaactt ctctaactat 60
ag 62
<210> 136
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE104引物"
<400> 136
ggtagcgaag gttttgcccg gc 22
<210> 137
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE106引物"
<400> 137
gattggtgcc ccaggtgacc tg 22
<210> 138
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE146引物"
<400> 138
gagttgcaac gcaaagctca acacaacgaa aacaacaagg aaaccgtgtg agtgtaggct 60
ggagctgctt cg 72
<210> 139
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
TREE151引物"
<400> 139
cttccacggc gtcggcctg 19
<210> 140
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
IFF引物"
<400> 140
gggtcaatag cggccgccaa ttcgcgcgcg aaggcg 36
<210> 141
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
IFR引物"
<400> 141
tggcgcgcct cctagggcat tacgctgact tgacggg 37
<210> 142
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
ScpBC-KO正向引物"
<400> 142
gctcagtgaa tttatccaga cgcaatattt tgattaaagg aatttttatg attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 143
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
ScpBC-KO反向引物"
<400> 143
attgctgaag atcgtgacgg gacgagtcat taacccagca tcgagccggt tgtaggctgg 60
agctgcttc 69
<210> 144
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
ScpBC检测-60正向引物"
<400> 144
cgggttctga cttgtagcg 19
<210> 145
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
ScpBC检测+60反向引物"
<400> 145
ccaacttcga agcaatgatt gatg 24
<210> 146
<211> 325
<212> PRT
<213> 嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophila)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 146
Met Ser Lys Arg Ile Tyr Ser Arg Ile Ala Gly Thr Gly Ser Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Glu Lys Val Leu Thr Asn Ala Asp Leu Glu Lys Met Val Glu Thr
20 25 30
Ser Asp Glu Trp Ile Gln Ser Arg Thr Gly Ile Arg Glu Arg His Ile
35 40 45
Ala Ala Glu Gly Glu Thr Thr Ser Asp Leu Gly Tyr Asn Ala Ala Leu
50 55 60
Arg Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Asp Ala Ser Gln Leu Asp Met Ile
65 70 75 80
Val Val Gly Thr Thr Thr Pro Asp Leu Ile Phe Pro Ser Thr Ala Cys
85 90 95
Leu Ile Gln Ala Lys Leu Gly Val Ala Gly Cys Pro Ala Phe Asp Val
100 105 110
Asn Ala Ala Cys Ser Gly Phe Val Phe Ala Leu Gly Val Ala Asp Lys
115 120 125
Phe Ile Arg Ser Gly Asp Cys Arg His Val Leu Val Ile Gly Thr Glu
130 135 140
Thr Leu Thr Arg Met Val Asp Trp Asn Asp Arg Thr Thr Cys Val Leu
145 150 155 160
Phe Gly Asp Gly Ala Gly Ala Val Val Leu Lys Ala Asp Glu Asp Thr
165 170 175
Gly Ile Leu Ser Thr His Leu His Ala Asp Gly Ser Lys Lys Glu Leu
180 185 190
Leu Trp Asn Pro Val Gly Val Ser Thr Gly Phe Lys Asp Gly Ala Asn
195 200 205
Gly Gly Gly Thr Ile Asn Met Lys Gly Asn Asp Val Phe Lys Tyr Ala
210 215 220
Val Lys Ala Leu Asp Ser Val Val Asp Glu Thr Leu Ala Ala Asn Gly
225 230 235 240
Leu Asp Lys Ser Asp Leu Asp Trp Leu Ile Pro His Gln Ala Asn Leu
245 250 255
Arg Ile Ile Glu Ala Thr Ala Lys Arg Leu Asp Met Ser Met Asp Gln
260 265 270
Val Val Val Thr Val Asp Lys His Gly Asn Thr Ser Ser Gly Ser Val
275 280 285
Pro Leu Ala Leu Asp Ala Ala Val Arg Ser Gly Lys Val Glu Arg Gly
290 295 300
Gln Leu Leu Leu Leu Glu Ala Phe Gly Gly Gly Phe Thr Trp Gly Ser
305 310 315 320
Ala Leu Leu Arg Tyr
325
<210> 147
<211> 324
<212> PRT
<213> 酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III"
<400> 147
Met Tyr Lys Ala Val Ile Arg Gly Val Gly Ser Tyr Leu Pro Glu Thr
1 5 10 15
Arg Leu Thr Asn Val Glu Ile Glu Gln Met Val Ala Thr Ser Asp Glu
20 25 30
Trp Ile Gln Thr Arg Thr Gly Ile Ala Glu Arg Arg Ile Ala Arg Pro
35 40 45
Asp Glu Ala Thr Ser Asp Phe Ala Tyr Leu Ala Ala Gln Ala Ala Leu
50 55 60
Ala Asp Ala Lys Leu His Pro Thr Asp Ile Asp Leu Leu Ile Val Ala
65 70 75 80
Thr Glu Thr Pro Asp Tyr Leu Leu Pro Pro Val Ala Cys Gln Val Gln
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Cys Arg Asn Ile Gly Ala Phe Asp Leu His Ala Thr
100 105 110
Cys Ala Gly Phe Leu Ser Ala Leu Gln Val Ala Glu Gln Phe Val Lys
115 120 125
Ser Gly Val His Glu His Val Leu Ile Val Gly Ala Asp Thr Leu Ser
130 135 140
Arg Phe Thr Asp Tyr Thr Asp Arg Gly Thr Cys Ile Leu Phe Ala Asp
145 150 155 160
Gly Ala Gly Ala Phe Val Val Ser Arg Ser Asp Asp Arg Ala Ala Arg
165 170 175
Gly Val Ile Ala Thr Thr Ile His Ser Asp Gly Thr Tyr Phe His Asn
180 185 190
Leu Tyr Ile Pro Gly Gly Gly Ser Arg Thr Pro Tyr Gly Asp Gly Ala
195 200 205
Lys Ala Lys Ile Val Met Asp Gly Arg Lys Ile Phe Lys Leu Ala Val
210 215 220
Asn Val Met Ser Ser Thr Val Glu Glu Leu Leu Gln Lys Thr Gly Arg
225 230 235 240
Gln Arg Asp Glu Ile Asp Trp Leu Ile Pro His Gln Ala Asn Gln Arg
245 250 255
Ile Ile Asp Ala Val Ala Glu Ser Leu Asp Phe Pro Gln Glu Lys Val
260 265 270
Val Ser Thr Ile Gln Asn Ile Gly Asn Asn Ser Ser Ala Thr Ile Pro
275 280 285
Ile Ala Val Asp Thr Ala Ile Arg Asp Gly Arg Ile Gln Arg Gly Asp
290 295 300
Leu Leu Met Leu Val Ala Phe Gly Gly Gly Leu Val Trp Gly Gly Ala
305 310 315 320
Met Val Glu Tyr
<210> 148
<211> 325
<212> PRT
<213> 丙酸脱硫叶菌(Desulfobulbus propionicus)
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III (FabH1)"
<400> 148
Met Asn Arg Ala Val Ile Leu Gly Thr Gly Ser Cys Leu Pro Glu Arg
1 5 10 15
Lys Leu Thr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Met Val Asp Thr Ser Asp Glu
20 25 30
Trp Ile Thr Thr Arg Thr Gly Ile Arg Asn Arg His Ile Ala Gly Lys
35 40 45
Asn Glu Gln Asn Tyr Gln Leu Ala Ala Lys Ala Gly Arg Arg Ala Leu
50 55 60
Ala Val Thr Gly Ile Asp Ala Glu Glu Leu Asp Leu Ile Ile Val Ala
65 70 75 80
Thr Val Ser Pro His Met Ile Met Pro Ser Thr Ala Cys Phe Val Gln
85 90 95
Ala Glu Leu Gly Ala Val Asn Ala Phe Ala Tyr Asp Ile Asn Ala Ala
100 105 110
Cys Ala Gly Phe Thr Tyr Gly Leu Asp Leu Ala Ser Asn Tyr Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Pro Glu Met Lys Ile Leu Leu Ile Gly Ala Glu Thr Leu Ser
130 135 140
Ala Arg Val Asp Trp Glu Asp Arg Asn Thr Cys Val Leu Phe Gly Asp
145 150 155 160
Gly Ala Gly Ala Val Val Leu Ser Gly Ser His Asp Gly Arg Gly Val
165 170 175
Phe Gly Ser Ser Leu His Ser Asp Gly Lys Leu Trp Asn Leu Leu Cys
180 185 190
Met Asp Ser Pro Glu Ser Leu Asn Pro Asp Leu Arg Pro Asp Ile Trp
195 200 205
His Gly Pro His Ile Arg Met Ser Gly Ser Asp Ile Phe Lys His Ala
210 215 220
Val Arg Met Met Glu Asp Ala Val Thr Ser Leu Leu Arg Lys His Asp
225 230 235 240
Leu Thr Ile Asp Asp Val Asn Leu Met Ile Pro His Gln Ala Asn Ile
245 250 255
Arg Ile Leu Thr Asn Leu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Ala Glu Glu Lys
260 265 270
Val Phe Ile Asn Leu Ser Lys Tyr Gly Asn Thr Ser Ala Ala Ser Ile
275 280 285
Pro Ile Ala Leu Asp Glu Ala His Arg Glu Gly Arg Leu Arg Arg Gly
290 295 300
Asp Ile Val Leu Leu Cys Thr Phe Gly Gly Gly Leu Thr Trp Gly Ser
305 310 315 320
Leu Leu Met Arg Trp
325
<210> 149
<211> 346
<212> PRT
<213> 丙酸脱硫叶菌
<220>
<221> 来源
<223> /注解="β酮酯酰-ACP合酶III (FabH2)"
<400> 149
Met Thr Leu Arg Tyr Thr Gln Val Cys Leu His Asp Phe Gly Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Pro Pro Val Glu Leu Ser Ser Ala Ala Ile Glu Glu Arg Leu Gln
20 25 30
Pro Leu Tyr Glu Arg Leu Lys Leu Pro Ala Gly Arg Leu Glu Leu Met
35 40 45
Thr Gly Ile Asn Thr Arg Arg Leu Trp Gln Pro Gly Thr Arg Pro Ser
50 55 60
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Asp Ala Met Ala Lys Ala Gly Val
65 70 75 80
Asp Val Ala Asp Leu Gly Cys Leu Leu Phe Thr Ser Val Ser Arg Asp
85 90 95
Met Met Glu Pro Ala Thr Ala Ala Phe Val His Arg Ser Leu Gly Leu
100 105 110
Pro Ser Ser Cys Leu Leu Phe Asp Ile Ser Asn Ala Cys Leu Gly Phe
115 120 125
Leu Asp Gly Met Ile Met Leu Ala Asn Met Leu Glu Leu Gly Gln Val
130 135 140
Lys Ala Gly Leu Val Val Ala Gly Glu Thr Ala Glu Gly Leu Val Glu
145 150 155 160
Ser Thr Leu Ala His Leu Leu Ala Glu Thr Gly Leu Thr Arg Lys Ser
165 170 175
Ile Lys Pro Leu Phe Ala Ser Leu Thr Ile Gly Ser Gly Ala Val Ala
180 185 190
Leu Val Met Thr Arg Arg Asp Tyr Arg Asp Thr Gly His Tyr Leu His
195 200 205
Gly Gly Ala Cys Trp Ala Gln Thr Val His Asn Asp Leu Cys Gln Gly
210 215 220
Gly Gln Asn Ala Glu Gln Gly Thr Leu Met Ser Thr Asp Ser Glu Gln
225 230 235 240
Leu Leu Glu Lys Gly Ile Glu Thr Ala Ala Ala Cys Trp Gln Gln Phe
245 250 255
His Ala Thr Leu Gly Trp Asp Lys Gly Ser Ile Asp Arg Phe Phe Cys
260 265 270
His Gln Val Gly Lys Ala His Ala Gln Leu Leu Phe Glu Thr Leu Glu
275 280 285
Leu Asp Pro Ala Lys Asn Phe Glu Thr Leu Pro Leu Leu Gly Asn Val
290 295 300
Gly Ser Val Ser Ala Pro Ile Thr Met Ala Leu Gly Ile Glu Gln Gly
305 310 315 320
Ala Leu Gly Ala Gly Gln Arg Ala Ala Ile Leu Gly Ile Gly Ser Gly
325 330 335
Ile Asn Ser Leu Met Leu Gly Ile Asp Trp
340 345
<210> 150
<211> 903
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
大肠杆菌密码子优化的费氏丙酸杆菌
fabH编码多核苷酸"
<400> 150
atgattgata gcacaccgga atggattgaa cagcgtaccg gtattcgtga acgtcgttgg 60
gcaaccaaag atgaaaccgt tctgagcatg gcaaccgatg caggtcgtaa agcactggat 120
atggcaggcg ttaaaccgga acaggttggg gcaattattg ttagcaccgt tagccatcat 180
attccgagtc cgggtctgag cgattatctg gcagaagaac tgggttgtcc ggcaccggca 240
acctttgata ttagcgcagc atgtgcaggt ttttgttatg cactgaccct ggcagaaagc 300
attgttcgtg caggtcatgc aggtaaagat ggttttgttc tgattgttgg tgttgaacgt 360
ctgtccgata tgaccaatat ggatgatcgt ggcaccgatt ttctgtttgg tgatggtgcc 420
ggtgcagcag ttgttggtcc gagcgataca ccggcaattg gtccggcagt ttggggtagc 480
aaaccggcaa atgttaaaac cattgaaatt cagagctgga ccgaagcaga taaaaatccg 540
accggttttc cgctgattca gatggatggt cataccgtgt ttaaatgggc actgagcgaa 600
gttgcagatc acgcagccga agcaattgat gcagcaggta ttactccgga acagctggat 660
atctttctgc cgcatcaggc aaatgatcgt attaccgatg ccattattcg tcatctgcat 720
ctgccggata gcgttagcgt ttgtcgtgat attgcagaaa tgggtaatac cagcgcagca 780
agcattccga ttgcaatgga tgcaatgatt cgcgaaggtc gtgcaaaaag cggtcagacc 840
gcactgatta ttggttttgg tgcaggtctg gtttatgccg gtcgtgttgt tgttctgccg 900
taa 903
<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
PTrc_载体_F寡核苷酸"
<400> 151
gaattcgaag cttgggcccg aac 23
<210> 152
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
PTrc_载体_R寡核苷酸"
<400> 152
catggtttat tcctccttat ttaatcgata c 31
<210> 153
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
BsfabH1_IFF寡核苷酸"
<400> 153
gaggaataaa ccatgaaagc tggaatactt ggtgttggac 40
<210> 154
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
BsfabH1_IFR寡核苷酸"
<400> 154
ccaagcttcg aattcttatc ggccccagcg gattgc 36
<210> 155
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
BsfabH2_IFF寡核苷酸"
<400> 155
gaggaataaa ccatgtcaaa agcaaaaatt acagctatcg gc 42
<210> 156
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
BsfabH2_IFR寡核苷酸"
<400> 156
ccaagcttcg aattcttaca tcccccattt aataagcaat cctg 44
<210> 157
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
LmfabH1-2_IFF寡核苷酸"
<400> 157
gaggaataaa ccatgaacgc aggaatttta ggagtagg 38
<210> 158
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
LmfabH1_IFR寡核苷酸"
<400> 158
ccaagcttcg aattcttact taccccaacg aatgattagg gc 42
<210> 159
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
LmfabH2_IFR寡核苷酸"
<400> 159
ccaagcttcg aattcttact tacccccacg aatgattagg g 41
<210> 160
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
DpfabH1_IFF寡核苷酸"
<400> 160
gaggaataaa ccatgaatag agcagttatc ttgggaacc 39
<210> 161
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
DpfabH1_IFR寡核苷酸"
<400> 161
ccaagcttcg aattcttacc aacgcatgag cagcgaacc 39
<210> 162
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
DpfabH2_IFF寡核苷酸"
<400> 162
gaggaataaa ccatgacttt gcgttacacc caggtc 36
<210> 163
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
DpfabH2_IFR寡核苷酸"
<400> 163
ccaagcttcg aattcttacc agtcgatgcc cagcatg 37
<210> 164
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
AafabH_IFF寡核苷酸"
<400> 164
gaggaataaa ccatgtacaa ggccgtgatt cgcg 34
<210> 165
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
AafabH_IFR寡核苷酸"
<400> 165
ccaagcttcg aattctcaat actccaccat cgcgcc 36
<210> 166
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
PffabHopt_IFF寡核苷酸"
<400> 166
gaggaataaa ccatgattga tagcacaccg gaatgg 36
<210> 167
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
PffabHopt_IFR寡核苷酸"
<400> 167
ccaagcttcg aattcttacg gcagaacaac aacacgacc 39
<210> 168
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
SmfabH_IFF寡核苷酸"
<400> 168
gaggaataaa ccatgagcaa gcggatctat tcgagg 36
<210> 169
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
SmfabH_IFR寡核苷酸"
<400> 169
ccaagcttcg aattctcaat agcgcagcag ggccg 35

Claims (8)

1.重组大肠杆菌，其包含：
(a)编码下述的多核苷酸：
(i)一个或多个具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性或甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性的多肽；
(ii)一个或多个具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性或苏氨酸脱氨酶活性的多肽；或
(iii)一个或多个具有(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性或β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽；和
(b)编码具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽利用丙酰辅酶A作为底物，和
(c)编码具有硫酯酶活性、酯合酶活性或羧酸还原酶活性的多肽的外源多核苷酸，
其中于有效表达(a)、(b)和(c)所述的多核苷酸的条件下，在碳源存在下培养时，重组大肠杆菌细胞产生包含奇数链脂肪酸衍生物和偶数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物，并且其中所述脂肪酸衍生物组合物中至少10％的所述脂肪酸衍生物为奇数链脂肪酸衍生物。
2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其中所述脂肪酸衍生物组合物中至少20％的所述脂肪酸衍生物为奇数链脂肪酸衍生物。
3.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其中于有效表达(a)、(b)和(c)所述的多核苷酸的条件下，在碳源存在下培养时，所述重组大肠杆菌细胞产生至少100mg/L的奇数链脂肪酸衍生物。
4.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其中(a)所述的多核苷酸的表达通过所述多核苷酸在所述重组大肠杆菌细胞中的过表达而被调节。
5.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其中所述具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽为所述重组大肠杆菌细胞外源性的，并且所述重组大肠杆菌细胞内源性的具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的表达被减弱。
6.包含权利要求1所述的重组大肠杆菌的细胞培养物。
7.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其中所述硫酯酶归类为酶分类号EC 3.1.1.5或EC 3.1.2.14。
8.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其中所述酯合酶归类为酶分类号EC 3.1.1.67。
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