CN103540559A - 利用重组微生物生产生物燃料 - Google Patents

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渥美正太
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罗·普·克莱尔·沈
安东尼·F·卡恩
迈克尔·R·康诺
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Abstract

本文提供了一种用于生产生物燃料的代谢修饰微生物。具体而言，本文提供了由合适的底物生产包括异丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇的高级醇的方法。

Description

利用重组微生物生产生物燃料
本申请是针对申请日为2008年2月8日、申请号为200880009662.8、发明名称为“利用重组微生物生产生物燃料”的专利申请的分案申请。 
对相关申请的交叉引用 
本申请要求2007年2月9日提交的第60/900,477号美国临时专利申请、2007年2月9日提交的第60/900,546号美国临时专利申请、2007年4月4日提交的第60/921,927号美国临时专利申请和2007年8月17日提交的第60/956,634号美国临时专利申请的优先权，这些申请的公开内容以引用的方式并入本申请。 
技术领域
本发明提供代谢修饰微生物以及生产这种微生物的方法。还提供通过利用合适的底物与代谢修饰微生物及其酶制剂接触生产生物燃料的方法。 
背景技术
由于经济和环境问题，用生物燃料代替石油的需求日益增长。常见的生物燃料如乙醇并不是一种理想的燃料，因为它的能量密度比汽油低，并且必须在限定的浓度范围内与汽油混合，才能作为运输用燃料。乙醇还具有吸湿性和腐蚀性，这就造成了贮存和配送系统方面的问题。 
发明内容
本发明提供一种能够产生选自下组的醇类的重组微生物：（a）正丙醇；（b）异丁醇，其产率为每克葡萄糖产生约0.12至0.41g异丁醇；（c）正丁醇；（d）2-甲基-1-丁醇；（e）3-甲基-1-丁醇；和（f）2-苯基乙醇，这种醇类从包含2-酮酸的代谢物中产生。在一实施方案中，该微生物经过112小时左右的培养，产生的乙醇不到240mg/L。在另一实施方案中，在相似条件下培养时，该微生物的乙醇生产曲线与被命名为SA237或 CRS-BuOH23的微生物的生产曲线基本相同。在另一实施方案中，经过大约16至64小时的培养，异丁醇的产率约为每克葡萄糖产生约0.33至0.36g异丁醇，或每克葡萄糖产生约0.36至0.40g异丁醇。还有一实施方案中，每克葡萄糖的乙醇产率不足0.0037g/g左右。在一实施方案中，与亲本微生物相比，该微生物的乙醇生产能力较低。在另一实施方案中，该微生物将乙酰辅酶A转化为乙醇的能力降低或受到抑制。在另一实施方案中，重组微生物的乙醇脱氢酶含量减少，因此，其乙醇生产能力降低。在一实施方案中，该微生物能够表达将丙酮酸转化为α-酮异戊酸的酶或增加此酶的表达。在另一实施方案中，此酶是2-酮酸脱羧酶（例如，Pdc、Pdc1、Pdc5、Pdc6、Aro10、Thi3、Kivd、KdcA和前述各种酶的同源体或变体，以及与前述任何一种酶有至少60%同一性且具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽）。在另一实施方案中，2-酮酸脱羧酶由一种多聚核苷酸编码，这种多聚核苷酸与选自下组的一种核酸有60%的同一性：pdc、pdc1、pdc5、pdc6、aro10、thi3、kivd、kdcA和前述各种基因的同源基因或变体，或它们的片段，其中这种多聚核苷酸编码具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。在一个具体实施方案中，2-酮酸脱羧酶由一个源自kivd基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。在一实施方案中，与其亲本微生物相比，此微生物能够增加2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的表达或活性。在一实施方案中，醇脱氢酶选自下组：Adh1、Adh2、Adh3、Adh4、Adh5、Adh6、Sfa1和前述各种酶的同源体或变体，以及与前述任何一种酶有至少60%同一性并具有醇脱氢酶活性的多肽。在另一实施方案中，醇脱氢酶由一种多聚核苷酸编码，这种多聚核苷酸与选自下组的一种核酸有至少60%同一性：adh1、adh2、adh3、adh4、adh5、adh6、sfa1基因和前述各种基因的同源基因或变体，其中这种多聚核苷酸编码具有2-醇脱氢酶活性的多肽。在一实施方案中，此重组微生物的一个基因发生一处或多处缺失或敲除，这个基因编码的酶能够催化乙酰辅酶A转化为乙醇；催化丙酮酸酯转化为乳酸酯；催化延胡索酸酯转化为琥珀酸酯；催化乙酰辅酶A和磷酸酯转化为辅酶A和乙酰磷酸；催化乙酰辅酶A和甲酸酯转化为辅酶A和丙酮酸酯，乙酰辅酶A的乙酰基和3-甲基-2-氧代丁酸酯（2-氧代异戊酸酯）的缩合反应，2-异丙基苹果酸酯和3-异丙基苹果酸酯的异构化反应；催化α-酮酸转化为支链氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或亮氨酸的合成；催化丙酮酸酯转化为乙酰辅酶A； 催化生成支链氨基酸；催化苏氨酸生成α-酮丁酸酯的反应；催化蛋氨酸生物合成的第一步反应；以及催化苏氨酸的代谢。例如，这种微生物可能包含选自下组的一种或多种基因缺失：adhE、ldhA、frdBC、fnr、pta、pflB、leuA、leuB、leuC、leuD、ilvE、tyrB、poxB、ilvB、ilvI、ilvA、metA、tdh、前述各种基因的同源基因及自然产生的突变。在一个具体实施方案中，此微生物的基因型选自下组：（a）选自下组基因的一种缺失或敲除，选自一组基因，这组基因包括：ΔadhE、ΔldhA、Δpta、ΔleuA、ΔleuB、ΔleuC、ΔleuD、ΔpoxB、ΔilvB、ΔilvI、ΔmetA、Δtdh及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生正丙醇；（b）选自下组基因的一种缺失或敲除：ΔadhE、ΔldhA、ΔfrdB、ΔfrdC、Δfnr、Δpta、ΔpflB、ΔleuA、ΔilvE、ΔpoxB、ΔilvA及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生异丁醇；（c）选自下组基因的一种缺失或敲除：ΔadhE、ΔldhA、Δpta、ΔpoxB、ΔilvB、ΔilvI、ΔmetA、Δtdh及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生正丁醇；（d）选自下组基因的一种缺失或敲除：ΔilvB、ΔilvI、ΔmetA、Δtdh及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生2-甲基-1-丁醇；（e）选自下组基因的一种缺失或敲除：ΔadhE、ΔldhA、ΔfrdB、ΔfrdC、Δfnr、Δpta、ΔpflB、ΔilvE、ΔtyrB及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生3-甲基1-丁醇；和（f）选自下组基因的一种缺失或敲除：ΔadhE、ΔldhA、ΔfrdB、ΔfrdC、Δfnr、Δpta、ΔpflB、ΔleuA、ΔilvE、ΔpoxB、ΔilvA及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生2-苯基乙醇。在另一实施方案中，ThrABC包含抗反馈抑制的ThrA*。在一实施方案中，此重组微生物含有被命名为SA237或CRS-BuOH23的微生物的表型。 
本文提供的是代谢修饰微生物，其包括生化重组途径，该途径利用合适的底物，通过代谢工程微生物生产生物燃料，包括异丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-苯基乙醇、正丙醇或正丁醇等。本发明还提供利用本文描述的微生物生产生物燃料的方法。 
在一实施方案中，提供了产生一种醇类的重组微生物。该醇类可以是正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙 醇。通常情况下，可利用含有2-酮酸的代谢物并以发酵或非发酵方式（即在有氧或无氧条件下）生产醇类。在某些方面，2-酮酸包含2-酮丁酸、2-酮异戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸、2-酮基-4-甲基戊酸或苯丙酮酸。在其他方面，与其亲本微生物相比，此重组微生物增加2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的表达或活性。2-酮酸脱羧酶可能是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Pdc6、或Aro10、或Thi3；来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的Kivd；来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的Pdc，或它们的同源体。2-酮酸脱羧酶可以由源自以下一种基因的多聚核苷酸编码：来自酿酒酵母的PDC6、来自酿酒酵母的ARO10、来自酿酒酵母的THI3、来自乳酸乳球菌的kivd、来自丙酮丁醇梭菌的pdc，或它们的同源基因。在某些方面，醇脱氢酶可能是来自酿酒酵母的Adh2或其同源基因，由源自酿酒酵母ADH2基因的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，提供了一种产生异丁醇的重组微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含增加乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶以及醇脱氢酶的表达或活性。在某些方面，此微生物能够包含增加乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶以及醇脱氢酶的表达。在某些方面，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有更高水平的丙酮酸酯。因此，此重组微生物还可以含有adhE、ldh、frd、fnr、pflB、ackA或pta基因或它们的任何组合的基因缺失或表达抑制。特别是，此重组微生物能够含有单独的adh、ldh、frd基因缺失或与fnr、fnr和pta、pta和pflb组合的基因缺失。在某些方面，此重组微生物还可以含有其基因组的部分缺失，例如缺失大肠杆菌(E.coli)基因组中约1,397,551个到约1,439,877个的核苷酸。一方面，乙酰羟酸合成酶可由源自以下基因的多聚核苷酸编码：ilvIH操纵子、ilvBN操纵子、大肠杆菌的ilvGM、来自枯草芽孢杆菌的alsS基因，或它们的同源基因。ilvIH操纵子的ilvI基因编码乙酰羟酸合成酶的大亚基多肽，ilvIH操纵子的ilvH基因编码乙酰羟酸合成酶的小亚基多肽。另一方面，乙酰羟酸还原异构酶可由源自大肠杆菌ilvC基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另外，二羟酸脱水酶可由源自ilvD基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，2-酮酸脱羧酶可由源自以下基因的多聚核苷酸编码：乳酸乳球菌的kivd基因 或其同源基因，或酿酒酵母的ARO10基因或其同源基因。另一方面，醇脱氢酶可由源自酿酒酵母的ADH2基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。 
通常，大肠杆菌的ilvIH操纵子编码乙酰羟酸合成酶，这是异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成途径中的第一个酶。乙酰羟酸合成酶III同功酶由两个亚基组成，即ilvI基因产物（乙酰羟酸合成酶III的大亚基）和ilvH基因产物（乙酰羟酸合成酶的小亚基），能够催化大肠杆菌K-12中异亮氨酸、亮氨酸及缬氨酸生物合成的共同第一步反应。大肠杆菌的ilvC基因编码乙酰羟酸还原异构酶，这是平行进行的异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径中的第二个酶。大肠杆菌的ilvD基因编码二羟酸脱水酶，这是异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径中的第三个酶。在某些方面，此重组微生物包含乙酰乳酸合成酶的表达增加。乙酰乳酸合成酶可来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的AlsS。 
在一实施方案中，提供了一种产生正丁醇的重组微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含2-异丙基苹果酸合成酶、β-异丙基苹果酸脱氢酶、异丙基苹果酸异构酶和苏氨酸脱水酶的表达或活性增加。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有更高水平的2-酮基戊酸。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有较低水平的2-酮异戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸或2-酮基-4-甲基戊酸或它们的任何组合。因此，与其亲本微生物相比，此微生物还可含有ilvD基因缺失或表达受抑制。一方面，2-异丙基苹果酸合成酶可由源自leuA基因的多聚核苷酸或其同源体编码。另一方面，β-异丙基苹果酸脱氢酶可由源自leuB基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，异丙基苹果酸异构酶可由源自leuCD操纵子或其同源操纵子的多聚核苷酸编码。通常，leuCD操纵子的leuC基因编码异丙基苹果酸异构酶的大亚基多肽，leuCD操纵子的leuD基因编码异丙基苹果酸异构酶的小亚基多肽。另一方面，苏氨酸脱水酶可由源自ilvA基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，苏氨酸脱水酶可由源自tdcB基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还可含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶、苏氨酸脱水酶或它们的任何组合的表达或活性的增加。在某些方面，磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶或苏氨酸脱水酶分别由源自以下基因或其同源基因的多聚核苷酸编码：ppc、pyc、aspC、thrA、asd、thrB、thrC、sdaAB和tdcB基因。 
在一实施方案中，提供了一种产生正丙醇的重组微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含α-异丙基苹果酸合成酶、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)的LeuB、异丙基苹果酸异构酶和苏氨酸脱水酶的表达或活性的增加。一方面，α-异丙基苹果酸合成酶可由源自cimA基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。cimA基因可能是问号钩端螺旋体的cimA基因或詹氏甲烷暖球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的cimA基因。另一方面，β-异丙基苹果酸脱氢酶可由源自leuB基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，异丙基苹果酸异构酶可由源自leuCD操纵子或其同源操纵子的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还可含有以下酶的表达或活性的增加：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶或苏氨酸脱水酶，或它们的任何组合。在某些方面，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶或苏氨酸脱水酶分别由源自以下基因的多聚核苷酸编码：ppc、pyc、aspC、thrA、asd、thrB、thrC、sdaAB和tdcB基因，或其同源基因。 
在另一实施方案中，提供了一种产生2-甲基-1-丁醇的重组微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含苏氨酸脱水酶、乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的表达或活性的增加，并产生2-甲基1-丁醇。在某些方面，苏氨酸脱水酶可由源自ilvA基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，苏氨酸脱水酶可由源自tdcB基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有更高水平的2-酮基-3-甲基戊酸。另一方面，2-酮酸脱羧酶可由源自以下基因的多聚核苷酸编码：kivd基因或其同源基因；PDC6基因或其同源基因；THI3基因或其同源基因。 
在另一实施方案中，提供了一种产生3-甲基-1-丁醇的重组微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含乙酰羟酸合成酶或乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶，2-异丙基苹果酸合成酶、异丙基苹果酸异构酶、β-异丙基苹果酸脱氢酶、2-酮酸脱羧酶以及醇脱氢酶的表达或活性的增加。在某些方面，乙酰羟酸合成酶可由源自ilvIH操纵子或其同源操纵子的多聚核苷酸编码。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自alsS基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自ilvMG操纵子或其同源操纵子的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有更高水平的2-酮异己酸。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自ilvNB操纵子或其同源操纵子的多聚核苷酸编码。 
在另一个实施方案中，提供了一种生产苯基乙醇的重组微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶、分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的表达或活性的增加。另一方面，分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶可由源自pheA基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，分支酸变位酶T/预苯酸脱水酶可由源自tyrA基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有更高水平的苯丙酮酸。 
在一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能够将合适的底物或代谢中间物转化为正丁醇。此方法包含用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物的方法：2-异丙基苹果酸合成酶活性、β-异丙基苹果酸脱氢酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和苏氨酸脱水酶活性。 
在另一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能够将合适的底物或代谢中间物转化为异丁醇。此方法包含用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物：乙酰羟酸合成酶活性、乙酰羟酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。 
在另一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能够将合适的底物或代谢中间物转化为正丙醇。此方法包含用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物：α-异丙基苹果 酸合成酶活性、β-异丙基苹果酸脱氢酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和苏氨酸脱水酶活性。 
在一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能够将合适的底物或代谢中间物转化为2-甲基-1-丁醇。此方法包含用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物：苏氨酸脱水酶活性、乙酰羟酸合成酶活性、乙酰羟酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。 
在另一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能够将合适的底物或代谢中间物转化为3-甲基-1-丁醇。此方法包含用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物：乙酰羟酸合成酶活性或乙酰乳酸合成酶活性、乙酰羟酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、2-异丙基苹果酸合成酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性、β-异丙基苹果酸脱氢酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。 
在另一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能够将合适的底物或代谢中间物转化为苯基乙醇。此方法包含用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物：分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶活性、分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。 
在另一实施方案中，提供了一种生产一种醇类的方法。此方法包含提供一种本文中提供的重组微生物；在适合于将底物转化为醇类的条件下，利用合适的底物或代谢中间物培养微生物；以及检测醇类的产量。在许多方面，该醇类可以是正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇。另一方面，这些底物或代谢中间物包括一种2-酮酸，例如2-酮丁酸、2-酮异戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸、2-酮基-4-甲基-戊酸或苯丙酮酸。 
本发明的一个或多个实施方案的细节通过附图和以下说明陈述。其他特点、目标和优点在说明、附图和权利要求中显而易见。 
附图说明
本附图并入本说明书中，并构成本说明书的一部分，用来描述本发明的一个或多个实施方案，并与具体实施方式一起解释本发明的原理与实现方式。 
图1A-C描述了有助于了解本发明的反应途径。（A）描述了利用2-酮酸代谢生产醇类的一条代表性非发酵合成途径。（B）描述了基因工程大肠杆菌中醇类化合物的代表性生成途径。灰色箭头代表2-酮酸降解途径。酶、LeuABCD、IlvA和IlvIHCD代表氨基酸生物合成途径。双线代表氨基酸生物合成途径的副反应。（C）描述了微生物的一般反应途径，并标出了这个生物体内可被破坏或敲除的酶，以增加所需反应方向的通量（例如增加合成丙酮酸的通量，减少流向其他竞争性途径的丙酮酸通量）。 
图2A-C描述了经修饰的氨基酸生物合成途径，以改进异丁醇和正丁醇的生产。A图显示了经改造的ilvIHCD途径存在或不存在的情况下异丁醇的产量。左边区域：异丁醇产量；右边区域：每克葡萄糖的异丁醇产率。异丁醇的最高产率的理论值为0.41g/g。B图显示了经改造的ilvA-leuABCD途径存在或不存在的情况下由葡萄糖获得正丁醇的产量。左边区域：正丁醇产量；右边区域：相同菌株的正丙醇产量。图C显示了加入L-苏氨酸时的正丁醇产量。左边区域：正丁醇产量；右边区域：相同菌株的正丙醇产量。 
图3描述了异丁醇对细胞生长的影响。上面显示含有或不含有2%异丁醇时，野生型菌株和高耐受性突变菌株的细胞生长时间过程。两种菌株在LB培养基中都生长到指数期。在OD600为～3.5时，向培养基加入2%异丁醇。三角形：未加异丁醇的野生型菌株；菱形：添加异丁醇的野生型菌株；方形：未添加异丁醇的高耐受性突变菌株；圆形：添加异丁醇的高耐受性突变菌株。 
图4描述了大肠杆菌中异丁醇的代表性生产途径。 
图5描述了异丁醇产量的质谱分析检测结果。 
图6描述了质谱分析数据。 
图7描述了由丙酮酸生成2-酮基异戊酸的代表性途径。 
图8描述了亮氨酸的代表性生物合成途径。 
图9描述了异亮氨酸的代表性生物合成途径。 
图10描述了以2-酮基丁酸为中间产物的丁醇代表性生物合成途径。 
图11描述了由丙酮酸生成丁醇的代表性生物合成途径。 
图12描述了以苏氨酸为中间产物的丁醇代表性生物合成途径。 
图13描述了生产异丁醇类化合物（例如，2-甲基丙基醇）、3-甲基-1-丁醇、正丁醇、乙醇、2-甲基-1-丁醇和正丙醇的代表性生物合成途径。 
图14描述了生产苯基乙醇、乙醇、3-甲基-1-丁醇和异丁醇类化合物（例如2-甲基丙基醇）的代表性生物合成途径。 
图15描述了源自kivd基因的核酸序列（序列ID号：27），此基因编码具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。 
图16描述了源自PDC6基因的核酸序列（序列ID号：29），此基因编码一段具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。 
图17描述了源自AR010基因的核酸序列（序列ID号：31），此基因编码一段具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。 
图18描述了源自THI3基因的核酸序列（序列ID号：33），此基因编码一段具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。 
图19描述了源自pdc基因的核酸序列（序列ID号：35），此基因编码一段具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。 
图20描述了源自ADH2基因的核酸序列（序列ID号：37），此基因编码一段具有醇脱氢酶活性的多肽。 
图21描述了源自ilvI基因的核酸序列（序列ID号：39），此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶大亚基活性的多肽。 
图22描述了源自ilvH基因的核酸序列（序列ID号：41），此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶小亚基活性的多肽。 
图23描述了源自ilvC基因的核酸序列（序列ID号：43），此基因编码一段具有乙酰羟酸还原异构酶活性的多肽。 
图24描述了源自ilvD基因的核酸序列（序列ID号：45），此基因编码一段具有二羟酸脱水酶活性的多肽。 
图25描述了源自ilvA基因的核酸序列（序列ID号：47），此基因编码一段具有苏氨酸脱水酶活性的多肽。 
图26描述了源自leuA基因的核酸序列（序列ID号：49），此基因编码一段具有2-异丙基苹果酸合成酶活性的多肽。 
图27描述了源自leuB基因的核酸序列（序列ID号：51），此基因编码一段具有β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽。 
图28描述了源自leuC基因的核酸序列（序列ID号：53），此基因编码一段具有异丙基苹果酸异构酶大亚基活性的多肽。 
图29描述了源自leuD基因的核酸序列（序列ID号：55），此基因编码一段具有异丙基苹果酸异构酶小亚基活性的多肽。 
图30描述了源自cimA基因的核酸序列（序列ID号：57），此基因编码一段具有α-异丙基苹果酸合成酶活性的多肽。 
图31描述了源自ilvM基因的核酸序列（序列ID号：59），此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶大亚基活性的多肽。 
图32描述了源自ilvG基因的核酸序列（序列ID号：61），此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶小亚基活性的多肽。 
图33描述了源自ilvN基因的核酸序列（序列ID号：63），此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶大亚基活性的多肽。 
图34描述了源自ilvB基因的核酸序列（序列ID号：65），此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶小亚基活性的多肽。 
图35描述了源自adhE2基因的核酸序列（序列ID号：67），此基因编码一段具有醇脱氢酶活性的多肽。 
图36描述了源自Li-cimA基因的核酸序列（序列ID号：69），此基因编码一段具有α-异丙基苹果酸合成酶活性的多肽。 
图37描述了源自Li-leuC基因的核酸序列（序列ID号：71），此基因编码一段具有异丙基苹果酸异构酶大亚基活性的多肽。 
图38描述了源自Li-leuD基因的核酸序列（序列ID号：73），此基因编码一段具有异丙基苹果酸异构酶小亚基活性的多肽。 
图39描述了源自Li-leuB基因的核酸序列（序列ID号：75），此基因编码一段具有β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽。 
图40描述了源自pheA基因的核酸序列（序列ID号：77），此基因编码一段具有分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶活性的多肽。 
图41描述了源自TyrA基因的核酸序列（序列ID号：79），此基因编码一段具有分支酸变位酶T/预苯酸脱水酶活性的多肽。 
图42描述了源自alsS基因的核酸序列（序列ID号：81），此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶活性的多肽。 
图43描述了不同微生物的敲除突变与异丙酸产量间的相关性。 
图44描述了对普通摇瓶与带螺旋盖烧瓶内异丁醇产量的比较。 
图45描述了超过200小时的分批补料过程中，添加不同的复合培养基组分对异丁醇产量的影响。 
图46显示了从葡萄糖转化为3-甲基-1-丁醇的代谢途径。除另有注明外，所有基因均来自大肠杆菌。BS=枯草芽孢杆菌；LL=乳酸乳球菌；SC=酿酒酵母。 
图47A-B显示了3-甲基-1-丁醇的初期产量。方格柱形代表异丁醇；实心柱形代表3-甲基-1-丁醇。（A）JCL16中3-甲基-1-丁醇的产量。对携带ilvIH（EC）或alsS（BS）基因并具有leuABCD基因染色体或质粒表达的菌株进行了醇产量测定。（B）JCL260中3-甲基-1-丁醇的产量。对携带ilvIH(IAA92)或alsS（IAA85）基因的菌株进行了醇产量测定。 
图48A-B是描述α-酮酸产量的图表。方格柱形代表2-酮异戊酸；实心柱形代表2-酮基异己酸。（A）JCL260背景下α-酮酸的产量。对菌株的2-酮异戊酸（异丁醇）和2-酮基异己酸（3-甲基-1-丁醇）的产量进行了测定。改变RBS仅用于leuA基因产物（IPMS）。（B）L-亮氨酸合成敲除背景中α-酮酸的产量。‘Δ’表示缺失。 
图49A-B显示了消除反馈抑制后3-甲基-1-丁醇的产量。（A）对含有WT IPMS（IAA88）和IPMS（G462D）(IAA89)的JCL260宿主的生长和醇产量进行了比较。（B）对JCL260ΔilvEΔtyrB(IAA69)背景中含有WT IPMS（IAA90）菌株的生长和醇产量进行了定量检测。 
图50是基因工程大肠杆菌内由苏氨酸生成丙醇和丁醇的生物合成途径示意图。图中描述了特定途径的中断；空心矩形框表示醇产物的前体。图中还描述了非正常的正缬氨酸途径，以及缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和蛋氨酸（这些氨基酸分别以缩写形式写在灰色框中）的生物合成途径。 
图51显示了thrA*BC的过度表达对BW WT中醇和主要代谢产物的影响，并显示了CRS-BuOH12（实心菱形）和CRS-BuOH31（空心菱形）中丙醇、丁醇、主要副产物、微生物生长及葡萄糖消耗的时间过程。CRS-BuOH12和CRS-BuOH31均为BW WT菌株。CRS-BuOH31含有pSA62和pSA55I，CRS-BuOH12还含有另外的质粒pCS49，此质粒携带的thrA*BC位于PLlacO1后。按照本发明所述的材料和方法培养细胞。 
图52A-B对各种敲除菌株的醇产量进行了比较。A.菌株被从左到右依次编号为CRS-BuOH12、32、2、11、23。所有菌株均包含pCS49、pSA62和pSA55I质粒。如本文所述，将细胞培养72小时。图中所示为第72个小时时间点的数据。B.A图中显示的各菌株生长时间过程。 
图53对采用替代性抗反馈苏氨酸脱水酶和2-异丙基苹果酸合成酶生产的丙醇和丁醇的产量进行了比较。比较时采用BWΔmetA、Δtdh、ΔilvB、ΔilvI作为背景菌株。各菌株被编号为CRS-BuOH11、18、19、20，除图中所示的质粒外，所有菌株还含有pSA62和pSA55I质粒。质粒编号下方为表达特定的苏氨酸脱水酶和2-异丙基苹果酶的基因名称。如本文所述，将细胞培养72小时。图中所示为第72个小时时间点的数据。 
图54A-E显示了CRS-BuOH23中丙醇、丁醇和代谢副产物的时间过程。A.正丙醇和正丁醇的产量。实心菱形代表丁醇，空心菱形代表丙醇。B.主要副产物醋酸的产量。C.次要副产物丙酮酸、乳酸和乙醇的产量。实心菱形代表丙酮酸，空心方块代表乳酸，交叉符号代表乙醇。D.葡萄糖的消耗过程。E.CRS-BuOH23在100小时内的生长过程。 
每张图里类似的参考符号代表类似的要素。 
具体实施方式
除非文中另有明确说明，否则，本文及随后所附的权利要求中使用的表示单数含义的“一种”、“和”及“此”等词语也包含复数指代。因此，例如提到“一种多聚核苷酸”时，也包含多种这样的多聚核苷酸；当提到“此微生物”时，也指一种或多种微生物等等。 
除非另有说明，本文中使用的所有技术术语与科学术语均与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的意思相同。虽然与本文所述的方法 和材料相似或相当的方法和材料也能用于本发明公开的方法和成分中，但是本文描述的是代表性方法、装置和材料。 
提供的上述及全文中的任何公开内容仅为在提交此申请之日公开的内容。本文不得被视为发明人无权凭借先有公开内容而先于这样的公开。 
丁醇是疏水性化合物，其挥发性比乙醇差。正丁醇的能量密度与汽油接近。浓度为85%的丁醇可用于汽车，并且不需对发动机做任何改动（与乙醇不同），它产生的动力比乙醇大，几乎与汽油相同。丁醇也被作为溶剂用于化学和纺织工艺、有机合成以及用作化学中间体。丁醇还被作为液压制动液中的一种成分使用，以及作为基础成分用于香水中。 
与乙醇相比，异丁醇具有优点且和正丁醇相同。此外，由于异丁醇带有分支碳链，所以其辛烷值比正丁醇高，正丁醇作为发酵产物生产，并用作发动机燃料。虽然异丁醇已被用作发动机添加剂，但是还不能以高产率由可再生资源生产出异丁醇。异丁醇尚未被考虑作为汽油的替代品。 
能够生产正丁醇的天然菌种如丙酮丁醇梭菌，还能生产出作为发酵产物的诸如丙酮、乙醇及丁酸等副产物。但是，这些微生物较难操控，其基因操控工具不如大肠杆菌等易操控的宿主的基因操控工具有效，而且对它们的生理学和代谢调节的了解也较少，因此阻碍了其高效生产的步伐。此外，虽然已在微生物代谢副产物中发现少量的其他高级醇，例如异丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇，但是尚未发现可以由葡萄糖生成并能够达到工业利用量的高级醇的天然菌种。 
通过各种酵母菌(包括酿酒酵母)生产异丁醇和其他杂醇，这对酒精饮料制造商颇具吸引力。对酒精饮料而言，杂醇通常属于不期望的异常成分。用野生型酵母菌生产异丁醇已经在各种培养基上证实过，这些培养基包括制酒过程中的葡萄汁（Romano等，Metabolic diversity of Saccharomyces cerevisiae strains from spontaneously fermented grape musts （来自自然发酵葡萄汁的各种酿酒酵母菌株的代谢多样性），19:311-315,2003）到基本补充培养基（Oliviera等，（2005）World Journal of Microbiology and Biotechnology21:1569-1576），前者可产生12-219mg/L异丁醇，后者可产生16-34mg/L异丁醇。Dickinson等人的研究（J Biol Chem.272(43):26871-8,1997）已确定支链氨基酸（例如，缬氨酸和亮氨酸）转化为异丁醇的反应途径中的酶反应步骤。 
本发明提供了代谢工程微生物，其包含利用合适底物生产高级醇（包括异丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇）的生物化学途径。本发明的一种代谢工程微生物包含该生物体基因组内的或该生物体基因组以外的一种或多种重组多聚核苷酸。此微生物能够包含在野生型微生物内发现的基因的减少、破坏或敲除，和/或导入外源多聚核苷酸。 
本发明还包括利用生物体的天然氨基酸途径的代谢工程生物合成途径。利用天然氨基酸途径生产生物燃料有多种好处。它不仅避免了表达一大组的外源基因的困难，还将积累有毒中间产物的可能性降到最低。与在多种梭状芽孢杆菌(Clostridium)中发现的丁醇产生途径相反，用于生物燃料生产的经改造氨基酸生物合成路径避免了涉及氧气敏感酶和对辅酶A依赖的中间产物。本发明提供了一种宿主友好型生物燃料生产系统，其利用微生物氨基酸生物合成途径中的自然代谢产物生产生物燃料。 
一方面，本发明提供了一种重组微生物，与其亲本微生物相比，此重组微生物包含至少一种目标酶的表达增加，或编码在其亲本微生物中未发现的酶。另一方面，此微生物包含至少一种基因的减少、破坏或敲除，此基因编码的酶与生产期望的高级醇产物所需的代谢产物有竞争作用。重组微生物产生至少一种与异丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇的生物合成途径相关的代谢产物。一般情况下，重组微生物包含至少一种重组代谢途径，此途径包含一种目标酶，并且还可包含竞争性生物合成途径中一种酶的活性或表达降低。此途径的作用是修饰异丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇生产过程中的底物或代谢中间产物。目标酶通过源自合适的生物来源的多聚核苷酸进行编码和表达。在某些实施方案中，此多聚核苷酸包含源自一种细菌或酵母的一种基因，其经重组改造引入本发明的微生物中。 
正如本文中所使用的，“代谢工程”或“代谢改造”这一术语涉及生物合成基因、与操纵子有关的基因以及此类多聚核苷酸的调控元件的合理途径改造与组装，其目的是在一种微生物里产生期望的代谢产物，例如2-酮酸或高级醇。“代谢工程”还包含利用基因工程和合适的培养基条件（包括与导向所需路径的中间产物相竞争的一种竞争性代谢途径的减少、破坏或敲除）对转录、翻译、蛋白质稳定性和蛋白质功能进行调节和优化，以优 化代谢通量。一种生物合成基因可能与宿主微生物异源，可利用宿主异源的基因，或通过致突变作用、重组进行修饰，并且/或与存在于内源性宿主细胞的异源表达控制序列有关。一方面，如果此多聚核苷酸对宿主生物体是异源基因，则能对此多聚核苷酸进行密码子优化。 
术语“生物合成途径”，也称“代谢途径”，指将一种化合物转化（改变）为另一种化合物的一组合成代谢或分解代谢生化反应。如果基因产物平行或连续地作用于相同的底物，产生相同的产物或作用于或产生一种在该相同底物与代谢终产物之间的代谢中间物（例如代谢产物），则这些基因产物属于相同的“代谢途径”。 
例如，通过L-亮氨酸固有的生物合成途径合成亮氨酸，此途径偏离L-缬氨酸生物合成系统的中间产物（2-酮异戊酸）。在大肠杆菌中，L-缬氨酸的生物合成和L-亮氨酸固有的生物合成是通过一组分别由ilvGMEDA操纵子和leuABCD操纵子编码的酶进行。 
leuABCD操纵子包括leuA、leuB、leuC和leuD基因。其中，leu A编码α-异丙基苹果酸合成酶，leuB编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，leuC和leuD编码α-异丙基苹果酸异构酶。其中，α-异丙基苹果酸合成酶催化由α-酮异戊酸生成α-异丙基苹果酸的合成反应，α-异丙基苹果酸异构酶催化由α-异丙基苹果酸生成β-异丙基苹果酸的异构化反应，β-异丙基苹果酸脱氢酶催化由β-异丙基苹果酸生成α-酮基异己酸的脱氢反应，α-酮基异己酸是L-亮氨酸生物合成的最终中间产物。大肠杆菌具有四种转氨酶，即由aspC基因编码的转氨酶A（天冬氨酸-谷氨酸转氨酶）、由ilvGMEDA操纵子含有的ilvE基因编码的转氨酶B（BCAA转氨酶）、由avtA基因编码的转氨酶C（丙氨酸-缬氨酸转氨酶）和由tyrB基因编码的转氨酶D（酪氨酸转氨酶）。这些酶参与各种胺化反应。其中，转氨酶B和转氨酶D催化上述由α-酮基异己酸生成L-亮氨酸的胺化反应。转氨酶C和转氨酶D催化L-缬氨酸生物合成途径的最后一步反应，这一步是L-缬氨酸生物合成和L-亮氨酸生物合成的共有反应。 
另外，leuABCD操纵子的表达也受到L-亮氨酸的抑制。编码乙酰羟酸合成酶I的ilvBN基因的表达受到L-缬氨酸和L-亮氨酸的协同抑制，编码乙酰羟酸合成酶II的ilvGM基因的表达受到L-异亮氨酸、 L-缬氨酸和L-亮氨酸的协同抑制，编码乙酰羟酸合成酶III的ilvIH基因的表达受到L-亮氨酸的抑制。 
术语“底物”或“合适的底物”指在酶的作用下转化为或要转化为另一种化合物的物质或化合物。此术语不仅包含一种化合物，也包含化合物组合，例如溶液、混合物或至少包含一种底物或其衍生物的其他物质。并且，术语“底物”不仅包括适合作为起始物质的提供碳源的化合物，例如源自任何生物质的糖类，还包括本文所述的用于与代谢工程微生物相关途径的中间代谢产物和最终代谢产物，“源自生物质的糖类”包括但不限于例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的分子。术语“源自生物质的糖类”包括通常被微生物利用的合适的碳底物，诸如6碳糖，包括但不限于葡萄糖、乳糖、山梨糖、果糖、艾杜糖、半乳糖和甘露糖，所有糖的构型均为D型或L型，或6碳糖组合如葡萄糖和果糖和/或6碳糖酸类，包括但不限于2-酮基-L-古洛糖酸、艾杜糖酸（IA）、葡萄糖酸（GA）、6-磷酸葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸（2KDG）、5-酮基-D葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸磷酸、2,5-二酮基-L-古洛糖酸、2,3-L-二酮基古洛糖酸、脱氢抗坏血酸、异抗坏血酸（EA）和D-甘露糖酸。 
术语“醇类”包括正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇。术语“1-丁醇”或“正丁醇”一般指末端碳原子带有醇官能团的直链异构体。内部碳原子带有醇官能团的直链异构体是仲丁醇或2-丁醇。末端碳原子带有醇官能团的支链异构体是异丁醇，内部碳原子带有醇官能团的支链异构体是叔丁醇。 
本文提供的重组微生物能够表达多种目标酶，这些酶与由合适碳底物生成正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇的合成途径相关。 
因此，通过将基因物质引入选择的某个宿主或亲本微生物，从而产生经代谢“改造”或“修饰”的微生物，以修改或改变此微生物的细胞生理学或生物化学特性。通过引入基因物质，亲本微生物获得了新性状，例如，能够产生新的或更多数量的胞内代谢产物。在一示例实施方案中，将基因物质引入亲本微生物中导致其获得新的能力或经改进的能力，能够生产一种醇，例如正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇。引入亲本微生物的基因物质包括基因或部分基因，其编码一种 或多种与醇类生产的生物合成途径相关的酶，并且还包含参与这些基因的表达和/或表达调控的其他要素，例如启动子序列。 
除了将基因物质引入宿主或亲本微生物外，在可选的方法中，一种经改造或修饰的微生物还能包括基因或多聚核苷酸的破坏、缺失或敲除，以改变微生物的细胞生理学和生物化学特性。通过基因或多聚核苷酸的减少、破坏或敲除，微生物获得了新的或经改进的性状（例如能够产生一种新的或更多数量的胞内代谢产物，改进所需途径的代谢通量，并且/或降低不需要的副产物的产量）。 
本发明证实了在具有以下酶活性的多肽存在时编码具有酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的多肽的一种或多种异源多聚核苷酸的表达或过度表达：α-异丙基苹果酸合成酶、β-异丙基苹果酸脱氢酶、α-异丙基苹果酸异构酶、苏氨酸脱水酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶活性以及苏氨酸合成酶。 
例如，本发明证实了通过异源kivd和adh2；大肠杆菌的ilvA、leuA、leuB、leuC、leuD（或Leu操纵子，例如leuABCD）；以及thrA、thrB、thrC或Thr操纵子（例如thrABC，thrA可能是抗反馈抑制多肽，例如thrA*）的过表达可以生产出正丁醇和正丙醇。利用2-酮戊酸生产正丁醇涉及到中间产物2-酮基丁酸和非自然的正缬氨酸生物合成途径。由于Kivd与两种2-酮酸的亲和力相近，且2-酮基丁酸是LeuA的第二底物，因此，正丙醇与正丁醇一同被生产出来，且数量相近。 
本文提供的微生物经修饰能够大量产生亲本微生物中不能产生的代谢产物。“代谢产物”指微生物产生的任何物质或某代谢过程所需的或参与此过程的物质。一种代谢产物可以是作为起始物质的一种有机物（例如，葡萄糖或丙酮酸）；代谢过程中的一种中间产物（例如，2-酮酸）；或一种最终产物（例如，正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇）。代谢产物可用来构建更复杂的分子，或被分解成更简单的分子。中间代谢产物可由其他代谢产物合成，可用来构建更复杂的物质，或被分解成更简单的化合物，通常伴随着化学能的释放。 
代表性代谢产物包括葡萄糖、丙酮酸、正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基1-丁醇、3-甲基1-丁醇或2-苯基乙醇，以及2-酮酸。如图1A所示，代表性的2-酮酸中间产物包括2-酮基丁酸、2-酮异戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基3-甲基戊酸、2-酮基4-甲基-戊酸、和苯丙酮酸。图1A所示的代表性 2-酮酸可被用作正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇生产过程中的代谢中间产物。例如，如图1B所示，一种重组微生物经代谢改造，可以提供表达水平增加的如由Leu操纵子（例如LeuABCD）编码的2-异丙基苹果酸合成酶、β-异丙基苹果酸脱氢酶和异丙基苹果酸异构酶，其催化2-酮基丁酸生成2-酮基戊酸。2-酮戊酸代谢物可用于生产正丁醇，此过程由代谢修饰微生物产生的其他酶产生。此外，可通过重组微生物由2-酮丁酸和2-酮基-3-甲基戊酸生产1-丙醇和2-甲基-1-丁醇，此微生物经过代谢改造，可表达或过度表达乙酰羟酸合成酶、α-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶，这些酶由例如ilvIHDC、kdc和adh基因编码。此外，代谢产物2-酮酸异戊酸可由经过代谢改造的重组微生物生成，此微生物能够表达或过度表达由例如ilvIHCD基因编码的乙酰羟酸合成酶。此代谢产物可继续用于异丁醇或3-甲基-1-丁醇的生产。代谢产物丙酮酸和苯丙酮酸可用于由经过代谢改造的重组微生物生产2-苯基乙醇，此微生物能够表达或过度表达α-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶，这些酶由例如kdc和adh基因编码。其他代谢产物和基因见图1B。 
此外，本文提供的是生产异丁醇的重组微生物，在某些方面，可能包含目标酶的增加表达，例如乙酰羟酸合成酶（例如ilvIH操纵子）、乙酰羟酸还原异构酶（例如ilvC）、二羟酸脱水酶（例如ilvD）、2-酮酸脱羧酶（例如PDC6、ARO10、THI3、kivd或pdc）及醇脱氢酶（例如ADH2）。此微生物还可含有乙醇脱氢酶（例如，adhE）、ldh（例如ldhA）、frd（例如frdB、frdC或frdBC）、fnr、leuA、ilvE、poxB、ilvA、pflB、pta基因或它们的任何组合的表达缺失或受抑制，以增加丙酮酸的可利用性或减少会争夺所需的生物合成途径里的代谢物的酶。在某些方面，此重组微生物可以含有乙酰乳酸合成酶（例如alsS）、乙酰羟酸还原异构酶（例如ilvC）、二羟酸脱水酶（例如ilvD）、2-酮酸脱羧酶（例如PDC6、ARO10、TH13、kivd或pdc），以及醇脱氢酶（例如ADH2）的增加表达。关于醇脱氢酶方面，虽然乙醇脱氢酶属于醇脱氢酶，但是在此生物合成途径中，乙醇的合成是不需要的副反应。因此，当提到微生物里醇脱氢酶活性或表达增强时，明确不包括乙醇脱氢酶活性。 
本发明还提供产生正丁醇的重组微生物，可包括目标酶的增加表达，例如2-异丙基苹果酸合成酶（例如leuA）、β-异丙基苹果酸脱氢酶（例 如leuB）、异丙基苹果酸异构酶（例如leuC、leuD或leuCD操纵子）、丝氨酸脱水酶（例如ilvA）。与亲本微生物相比，此微生物还可以含有2-酮异戊酸、2-酮基-3-甲基-戊酸、2-酮基-4-甲基戊酸或他们的任何组合的含量减少。此外，与亲本微生物相比，此微生物可含有二羟酸脱水酶（例如ilvD基因）表达破坏、缺失或敲除。产生正丁醇的重组微生物还可以含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶和/或苏氨酸脱水酶的表达或活性增加，这些酶分别由源自ppc、pyc、aspC、thrA、asd、thrB、thrC、sdaAB、tdcB基因或其同源基因的核酸序列编码。 
本发明还提供产生正丙醇的重组微生物，可包括目标酶的增加表达，例如α-异丙基苹果酸合成酶（例如cimA）、β-异丙基苹果酸脱氢酶（例如leuB）、异丙基苹果酸异构酶（例如leuCD操纵子）和丝氨酸脱水酶。 
本发明还提供产生2-甲基-1-丁醇的重组微生物，可包含目标酶的增加表达，例如苏氨酸脱水酶（例如ilvA或tdcB）、乙酰羟酸合成酶（例如ilvIH操纵子）、乙酰羟酸还原异构酶（例如ilvC）、二羟酸脱水酶（例如ilvD）,2-酮酸脱羧酶（例如PDC6、ARO10、THI3、kivd和/或pdc）及醇脱氢酶（例如ADH2）。 
本发明还提供产生3-甲基-1-丁醇的重组微生物，可以含有目标酶的增加表达，例如乙酰乳酸合成酶（例如alsS）、乙酰羟酸合成酶（例如ilvIH）、乙酰乳酸合成酶（例如ilvMG）或（例如ilvNB）、乙酰羟酸还原异构酶（例如ilvC）,二羟酸脱水酶（例如ilvD）,2-异丙基苹果酸酶合成酶（leuA）、异丙基苹果酸异构酶（例如leuC、D或leuCD操纵子）、β-异丙基苹果酸脱氢酶（例如leuB）、2-酮酸脱羧酶（例如kivd、PDC6或THI3）及醇脱氢酶（例如ADH2）。 
本发明还提供产生苯基乙醇的重组微生物，可以含有目标酶的增加表达，例如分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶（例如pheA）、分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶（例如tyrA）、2-酮酸脱羧酶（例如kivd、PDC6、或THI3）和醇脱氢酶（例如ADH2）。 
如前所述，本发明描述的目标酶一般都会生成代谢产物。例如，2-异丙基苹果酸合成酶（leuA）、β-异丙基苹果酸脱氢酶（leuB）和异丙基 苹果酸异构酶（leuC、leuD或leuCD操纵子）可由含有2-酮基丁酸的底物生成2-酮基戊酸。此外，本文所述的目标酶都由多聚核苷酸编码。例如，苏氨酸脱水酶由源自ilvA基因的多聚核苷酸编码。乙酰羟酸合成酶由源自ilvIH操纵子的多聚核苷酸编码。乙酰羟酸还原异构酶由源自ilvC基因的多聚核苷酸编码。二羟酸脱水酶由源自ilvD基因的多聚核苷酸编码。2-酮酸脱羧酶由源自PDC6、ARO10、THI3、kivd和或pdc基因的多聚核苷酸编码。醇脱氢酶由源自ADH2基因的多聚核苷酸编码。其他酶和代表性基因详见本文。各种多肽与多聚核苷酸的同源体可以来自提供由合适多聚核苷酸编码的合适酶的任何生物来源。例如，可以通过参考各种数据库来确定同源体。 
本发明确定了对本发明的方法、组成成分和生物体有用的特定基因；但是，应当认识到，没必要完全识别这些基因。例如，为了改变活性，可以对含有编码某多肽或酶的序列的某种基因或多聚核苷酸进行改变或筛选。通常，此类改变包含保守突变和沉默突变。可以利用所属领域中的方法对这类修饰或突变多聚核苷酸和多肽进行功能酶活性表达筛选。 
由于此遗传密码固有的简并性，其他编码基本相同或功能等同的多肽的多聚核苷酸也可用于复制，并表达编码此类酶的多聚核苷酸。 
正如本发明所属领域的技术人员所理解的，修饰编码序列有利于增强在特定宿主中的表达。此遗传密码具有64个可能的密码子是冗余的，但是大多数生物体通常只利用其中的部分密码子。一个物种中最频繁利用的密码子称为最佳密码子，那些不经常被利用的称为稀有或低利用率密码子。密码子的取代反应了宿主对偏爱密码子的利用，此过程通常称为“密码子优化”或“物种密码子偏爱控制”。 
可以制备含有特定的原核宿主或真核宿主偏爱的密码子的优化编码序列（见Murray等，(1989)《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)17:477-508），例如，以增加翻译率或生成具有所需的特性的重组RNA转录产物，例如与非优化序列产生的转录产物相比此转录产物具有更长的半衰期。也可根据宿主偏好修饰翻译终止密码子。例如，酿酒酵母和哺乳动物的典型终止密码子分别为UAA和UGA。单子叶植物的典型终止密码子是UGA，昆虫和大肠杆菌共同利用的终止密码子是UAA(Dalphin等，(1996)《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)24:216-218)。第6,015,891号美 国专利以及本文引用的文献提供了用于植物中表达的优化核苷酸序列的方法。 
本发明所属领域的技术人员公认的，由于遗传密码的简并性，许多具有不同核苷酸序列的DNA化合物可用于编码本发明中的某种酶。本文对编码上述生物合成酶的天然DNA序列的引用仅为了说明本发明的一个实施方案，公开的内容包括对本发明提供的方法中利用的酶和多肽的氨基酸序列进行编码的任何序列的DNA化合物。以类似的方式，通常可以允许多肽的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的置换、缺失和插入，而不对其所需的活性造成损害或严重损害。本发明包含与本文所述的特定蛋白质具有不同氨基酸序列的多肽，这些经过修饰的多肽变体具有参照多肽的酶的合成代谢或催化代谢活性。此外，本文所示的DNA序列编码的氨基酸序列仅用于说明本发明的实施方案。 
此外，本文提供的方法和微生物包含可用于产生代谢物（例如，酮硫解酶、乙酰CoA、乙酰基转移酶、羟丁酰CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA还原酶、丁酰-CoA-脱氢酶、醇脱氢酶(ADH)）的酶的同源体。针对第一个家族或物种的原始的酶或基因而言的所用术语“同源体”指第二个家族或物种的不同酶或基因，这些不同酶或基因通过进行功能、结构或基因组分析确定，对应于第一个家族或物种的原始酶或基因。同源体往往具有相似的功能、结构或基因组。通过基因探针和PCR能够易于克隆酶或基因的同源体的技术是已知的。通过功能分析或基因的基因组作图可确认复制的同源体序列的身份。 
如果编码一个蛋白质的核酸序列与编码第二个蛋白质的核酸序列相似，则该蛋白质与第二个蛋白质具有“同源性”或是“同源的”。或者，如果这两种蛋白质具有“相似”的氨基酸序列，则这两种蛋白质具有同源性（因此，术语“同源蛋白质”是指具有相似氨基酸序列的两种蛋白质）。 
如本文所使用的，当两种蛋白质（或蛋白质区域）的氨基酸序列具有至少30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性时，它们就基本同源。为了确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的百分比同一性，将这两种序列进行比对以达到最优的比较目的（例如，可在第一和第二氨基酸或核酸之一或两者中插入空位以便于最优比对，并且通过比对能够忽 略非同源序列）。在一实施方案中，进行比较目的时比对用的参考序列长度至少为该序列长度的30%，通常为40%以上，较典型的长度为50%以上，更加典型的长度为60%以上，最典型的长度至少为70%、80%、90%、100%。然后，比较相应位置的氨基酸残基或核苷酸。如果第一个序列某位置的氨基酸残基或核苷酸与第二个序列相应位置的相同，则这两个分子在此位置上相同（如本文所使用的，氨基酸或核酸“相同”等同于氨基酸或核酸“同源”）。两种序列间的百分比同一性是这两种序列的相同位置数目的函数，同时要考虑空位数以及每段空位的长度，空位是为了便于最优比对两种序列而插入的。例如，kivd基因包含来自其他生物体的编码具有基本相似酶活性的酶的同源基因（例如pdc6、aro10、thI3、pdc、kdcA、pdc1、pdc5），以及与该参考基因的同一性至少为30、40、50、60、70、80、85、90、95、98、或99%并且它们编码的酶与参考基因编码的酶具有基本相似酶活性的基因。例如，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中的丙酮酸脱羧酶在氨基酸水平上与Kivd同一性为37%；kivd和thI3在核酸水平上的同一性为32%；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的醇脱氢酶与酿酒酵母中的ADH2在氨基酸序列水平上的同一性为52%；酿酒酵母adh2与乳酸乳球菌adh的同一性为49%；KIVD（乳酸乳球菌）与PDC6（酿酒酵母）间的同一性为36%（相似残基=322/562(57%)，空位=24/562(4%)）；KIVD（乳酸乳球菌）和THI3（酿酒酵母）间的同一性为32%（相似残基=307/571(53%)，空位=35/571(6%)）；kivd（乳酸乳球菌）和ARO10（酿酒酵母）间的同一性为30%（相似残基=296/598(49%)，空位=65/598(10%)）；ARO10（酿酒酵母）与PDC6（酿酒酵母）间的同一性为34%（相似残基=320/616(51%)，空位=61/616(9%)）；ARO10（酿酒酵母）与THI3（酿酒酵母）间的同一性为30%（相似残基=304/599(50%)，空位=48/599(8%)）；ARO10（酿酒酵母）与丙酮酸脱羧酶（丙酮丁醇梭菌ATCC824）间的同一性为30%（相似残基=291/613(47%)，空位=73/613(11%)）；PDC6（酿酒酵母）与THI3（酿酒酵母）间的同一性为50%（相似残基=402/561(71%)，空位=17/561(3%)）；PDC6（酿酒酵母）与丙酮酸脱羧酶（丙酮丁醇梭菌ATCC824）间的同一性为38%（相似残基=328/570(57%)，空位=30/570(5%)）；THI3（酿酒酵母）与丙酮酸脱羧酶（丙酮丁醇梭菌ATCC824）间的同一性为35%（相似残基=284/521 (54%)，空位=25/521(4%)）。本文所列的每个基因和多肽/酶的序列可通过互联网上的数据库轻易获得（例如http:(//)eecoli.kaist.ac.kr/main.html）。此外，可利用本发明所属领域的常用算法对氨基酸序列和核酸序列进行比对，以确定其同一性。 
当“同源”一词用于蛋白质和多肽时，即承认不相同的残基位置通常其保守氨基酸置换不同。“保守氨基酸置换”指一个氨基酸残基被另一个具有侧链（R基团）的氨基酸残基置换，此另一个氨基酸残基具有相似的化学性质（例如电荷、疏水性）。一般情况下，保守氨基酸置换不会显著改变蛋白质的功能特性。如果两个或多个氨基酸序列由于保守置换互不相同，则可以要向上调整序列同一性或同源度，以修正置换的保守性。本发明所属领域的技术人员很了解这种调整方法（见Pearson等，1994，以引用的方式并入本文）。 
以下六组中，每组的氨基酸都可以相互进行保守置换。1）丝氨酸（S）,苏氨酸（T）；2）天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）；3）天冬酰胺（N）、谷胺酰胺（Q）；4）精氨酸（R）、赖氨酸（K）；5）异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、蛋氨酸（M）、丙氨酸（A）、缬氨酸（V）；6）苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）。 
多肽的序列同源也称为序列百分比同一性，通常利用序列分析软件对其进行测量。例如威斯康辛大学生物技术中心遗传学计算机集团（Genetics Computer Group）(GCG)的序列分析软件包（Sequence Analysis Software Package），该公司位于威斯康星州麦迪逊大学街910号，邮编53705。蛋白质分析软件通过测定各种置换、缺失及其他修饰(包括保守氨基酸置换)的同源性配对相似序列。例如，GCG包含诸如“Gap(空位)”和“Bestfit(最佳配合)”之类的程序，他们能够结合使用默认参数来确定紧密相关的多肽例如来自不同种类生物体的同源多肽间的序列同源度或序列同一性，或野生型蛋白质与其突变体之间的序列同源度或序列同一性。见GCG6.1版。 
计算机程序BLAST（Altschul，1990；Gish1993；Madden，1996；Altschul1997；Zhang，1997）特别是blastp或tblastn（Altschul，1997）是一种典型算法，它可以将一个分子序列与包含大量源自不同生物体的序列的数据库进行比较。BLASTp的典型参数是：期望值：10（默 认值）；过滤器:seg（默认值）；开放空位罚分：11（默认值）；扩展空位罚分：1（默认值）；最大比对:100（默认值）；字长:11（默认值）；描述量：100（默认值）；矩阵罚分：BLOWSUM62。 
在搜索包含来自大量不同生物体序列的数据库时，通常要比对氨基酸序列。可以利用本发明所属领域内除blastp以外的算法分析氨基酸序列搜索数据库。例如，可以利用FASTA，GCG6.1版中的一个程序，来比对多肽序列。FASTA提供查询和搜索序列间最佳重叠区域的比对和序列百分比同一性（Pearson，1990，以引用的方式并入本文）。例如，可以利用FASTA及GCG6.1版中提供的默认参数（字长为2，以及PAM250得分矩阵），确定氨基酸序列间的序列百分比同一性，此参数以引用的方式特此并入本文。 
下表及公开内容提供了基因以及每种基因的同源基因的非限定性例子，这些基因的多聚核苷酸和多肽序列是本发明所属领域的技术人员可以得到的。 
表1：描述了生产各种高级醇的重组途径（“+”=表达、表达或活性增强/“-”=表达或活性降低或敲除*）。 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000271
表2-9阐明了本发明各种重组微生物的反应途径，并列出了代表性基因和同源基因及其生物来源。 
表2 
异丁醇产生途径（由丙酮酸生成） 
表3 
由L-苏氨酸生成正丁醇的反应途径 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000291
表4 
由丙酮酸生成正丁醇的反应途径 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000301
表4（续） 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000311
表5 
由L-苏氨酸生成正丙醇的反应途径 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000312
表6 
由丙酮酸生成正丙醇的反应途径 
表7 
由L-苏氨酸生成2-甲基-1-丁醇的反应途径 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000331
表8 
由丙酮酸生成3-甲基-1-丁醇的反应途径 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000341
表9 
由分支酸生成苯基乙醇的反应途径 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000351
本发明提供了可用于本文所述的重组微生物构建的各种基因、同源体及突变体的登记号。应当了解，本文所述的同源体和突变体为代表性的而非限制性的。本发明所属领域的技术人员可利用各种数据库获得其他同源体、突变体和序列，这些数据库包括例如，可通过互联网访问的美国国家生物技术信息中心（NCBI，National Center for Biotechnology Information）。 
乙醇脱氢酶（又称为醛醇脱氢酶）由大肠杆菌中的adhE编码。adhE含有三种酶的活性：醇脱氢酶（ADH）；乙醛/乙酰-CoA脱氢酶（ACDH）；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶（PFL失活酶）；PFL失活酶的活性能够催化铁、NAD和CoA依赖性反应中丙酮酸-甲酸-裂解酶催化剂的灭活。此项技术中的同源体为已知（见醛/醇脱氢酶（Polytomella种Pringsheim198.80)gi|40644910|emb|CAD42653.2|(40644910)；醛/醇脱氢酶（A型肉毒梭菌ATCC3502）gi|148378348|ref|YP_001252889.1|(148378348)；醛/醇脱氢酶（鼠疫耶尔 森氏杆菌CO92）gi|16122410|ref|NP_405723.1|(16122410)；醛/醇脱氢酶（假结核耶尔森氏菌IP32953）gi|51596429|ref|YP_070620.1|(51596429)；醛/醇脱氢酶（鼠疫耶尔森氏杆菌CO92）gi|115347889|emb|CAL20810.1|(115347889)；醛/醇脱氢酶（假结核耶尔森氏菌IP32953）gi|51589711|emb|CAH21341.1|(51589711)醛/醇脱氢酶（大肠杆菌CFT073）gi|26107972|gb|AAN80172.1|AE016760_31(26107972)；醛/醇脱氢酶（田鼠型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种91001）gi|45441777|ref|NP_993316.1|(45441777)；醛/醇脱氢酶（田鼠型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种91001）gi|45436639|gb|AAS62193.1|(45436639)；醛/醇脱氢酶（产气荚膜梭菌ATCC13124）gi|110798574|ref|YP_697219.1|(110798574)（希瓦氏菌MR-1）gi|24373696|ref|NP_717739.1|(24373696)；醛/醇脱氢酶（A型肉毒梭菌ATCC19397）gi|153932445|ref|YP_001382747.1|(153932445)；醛/醇脱氢酶（古典型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种E1979001)gi|165991833|gb|EDR44134.1|(165991833)；醛/醇脱氢酶（A型肉毒梭菌Hall株)gi|153937530|ref|YP_001386298.1|(153937530)；醛/醇脱氢酶（肉毒梭菌ATCC13124）gi|110673221|gb|ABG82208.1|(110673221)；醛/醇脱氢酶（A型肉毒梭菌Hall株）gi|152933444|gb|ABS38943.1|(152933444)；醛/醇脱氢酶（东方型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种F1991016）gi|165920640|gb|EDR37888.1|(165920640)；醛/醇脱氢酶（东方型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种IP275）gi|165913933|gb|EDR32551.1|(165913933)；醛/醇脱氢酶（安哥拉鼠疫耶尔森氏杆菌）gi|162419116|ref|YP_001606617.1|(162419116)；醛/醇脱氢酶（F型肉毒梭菌Langeland）gi|153940830|ref|YP_001389712.1|(153940830)；醛/醇脱氢酶（大肠杆菌HS）gi|157160746|ref|YP_001458064.1|(157160746)；醛/醇脱氢酶（大肠杆菌E24377A）gi|157155679|ref|YP_001462491.1|(157155679)；醛/醇脱氢酶（小肠结肠炎耶尔森氏杆菌小肠结肠炎亚种8081）gi|123442494|ref|YP_001006472.1|(123442494)；醛/醇脱氢酶（聚球藻种JA-3-3Ab）gi|86605191|ref|YP_473954.1|(86605191)；醛/醇脱氢酶（单核细胞增生李斯特氏菌4b F2365）gi|46907864|ref|YP_014253.1|(46907864)；醛/醇脱氢酶（粪肠球菌V583）gi|29375484|ref|NP_814638.1|(29375484)；醛/醇脱氢酶（无乳链球菌2603V/R）gi|22536238|ref|NP_687089.1|(22536238)；醛/醇脱氢酶（A型 肉毒梭菌ATCC19397）gi|152928489|gb|ABS33989.1|(152928489)；醛/醇脱氢酶（大肠杆菌E24377A）gi|157077709|gb|ABV17417.1|(157077709)；醛/醇脱氢酶（大肠杆菌HS）gi|157066426|gb|ABV05681.1|(157066426)；醛/醇脱氢酶（F型肉毒梭菌Langeland）gi|152936726|gb|ABS42224.1|(152936726))；醛/醇脱氢酶（鼠疫耶尔森氏杆菌CA88-4125）gi|149292312|gb|EDM42386.1|(149292312)；醛/醇脱氢酶（小肠结肠炎耶尔森氏杆菌小肠结肠炎亚种8081）gi|122089455|emb|CAL12303.1|(122089455)；醛/醇脱氢酶（莱茵衣藻）gi|92084840|emb|CAF04128.1|(92084840)；醛/醇脱氢酶（聚球藻种JA-3-3Ab）gi|86553733|gb|ABC98691.1|(86553733)；醛/醇脱氢酶（希瓦氏菌MR-1）gi|24348056|gb|AAN55183.1|AE015655_9(24348056)；醛/醇脱氢酶（粪肠球菌V583）gi|29342944|gb|AAO80708.1|(29342944)；醛/醇脱氢酶（单核细胞增生李斯特氏菌4b F2365）gi|46881133|gb|AAT04430.1|(46881133)；醛/醇脱氢酶（单核细胞增生李斯特氏菌1/2a F6854)gi|47097587|ref|ZP_00235115.1|(47097587)；醛/醇脱氢酶（单核细胞增生李斯特氏菌4b H7858）gi|47094265|ref|ZP_00231973.1|(47094265)；醛/醇脱氢酶（单核细胞增生李斯特氏菌4b H7858）gi|47017355|gb|EAL08180.1|(47017355)；醛/醇脱氢酶（单核细胞增生李斯特氏菌1/2a F6854）gi|47014034|gb|EAL05039.1|(47014034)；醛/醇脱氢酶（无乳链球菌2603V/R）gi|22533058|gb|AAM98961.1|AE014194_6(22533058)p；醛/醇脱氢酶（古典型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种E1979001）gi|166009278|ref|ZP_02230176.1|(166009278)；醛/醇脱氢酶（东方型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种IP275）gi|165938272|ref|ZP_02226831.1|(165938272)；醛/醇脱氢酶（东方型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种F1991016）gi|165927374|ref|ZP_02223206.1|(165927374)；醛/醇脱氢酶（安哥拉鼠疫耶尔森氏杆菌）gi|162351931|gb|ABX85879.1|(162351931)；醛/醇脱氢酶（假结核耶尔森氏菌IP31758）gi|153949366|ref|YP_001400938.1|(153949366)；醛/醇脱氢酶（假结核耶尔森氏菌IP31758）gi|152960861|gb|ABS48322.1|(152960861)；醛/醇脱氢酶（鼠疫耶尔森氏杆菌CA88-4125）gi|149365899|ref|ZP_01887934.1|(149365899)；乙醛脱氢酶（乙酰化）（大肠杆菌CFT073）gi|26247570|ref|NP_753610.1|(26247570)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶；乙醛脱氢酶（乙酰化）（EC1.2.1.10）（acdh）；丙酮酸-甲酸-裂解酶失 活酶（pfl失活酶））（A型肉毒梭菌ATCC3502）gi|148287832|emb|CAL81898.1|(148287832)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶（ADH）；乙醛脱氢酶（乙酰化）（ACDH）；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶（PFL失活酶））gi|71152980|sp|P0A9Q7.2|ADHE_ECOLI(71152980)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶（胡萝卜软腐欧式杆菌胡萝卜软腐亚种SCRI1043）gi|50121254|ref|YP_050421.1|(50121254)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶（胡萝卜软腐欧式杆菌胡萝卜软腐亚种SCRI1043）gi|49611780|emb|CAG75229.1|(49611780)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶（ADH）；乙醛脱氢酶（乙酰化）（ACDH））gi|19858620|sp|P33744.3|ADHE_CLOAB(19858620)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶（ADH）；乙醛脱氢酶（乙酰化）（ACDH）；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶（PFL失活酶））gi|71152683|sp|P0A9Q8.2|ADHE_ECO57(71152683)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶；乙醛脱氢酶（乙酰化）；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶（艰难梭菌630）gi|126697906|ref|YP_001086803.1|(126697906)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶；乙醛脱氢酶（乙酰化）；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶（艰难梭菌630）gi|115249343|emb|CAJ67156.1|(115249343)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶（ADH）；乙醛脱氢酶（乙酰化）（ACDH）；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶（PFL失活酶））（发光杆菌laumondii亚种TTO1）gi|37526388|ref|NP_929732.1|(37526388)；醛/醇脱氢酶2（包括：醇脱氢酶；乙醛脱氢酶）（化脓链球菌Manfredo）gi|134271169|emb|CAM29381.1|(134271169)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶（ADH）；乙醛脱氢酶（乙酰化）（ACDH）；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶（PFL失活酶））（发光杆菌laumondii亚种TTO1）gi|36785819|emb|CAE14870.1|(36785819)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶和丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶（艰难梭菌630）gi|126700586|ref|YP_001089483.1|(126700586)；醛/醇脱氢酶（包括：醇脱氢酶和丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶（艰难梭菌630）gi|115252023|emb|CAJ69859.1|(115252023)；醛/醇脱氢酶2（化脓链球菌Manfredo）gi|139472923|ref|YP_001127638.1|(139472923)；醛/醇脱氢酶E（产气荚膜梭菌13)gi|18311513|ref|NP_563447.1|(18311513)；醛/醇脱氢酶E（产气荚 膜梭菌13）gi|18146197|dbj|BAB82237.1|(18146197)；醛/醇脱氢酶ADHE1（丙酮丁醇梭菌ATCC824）gi|15004739|ref|NP_149199.1|(15004739)；醛/醇脱氢酶ADHE1（丙酮丁醇梭菌ATCC824）gi|14994351|gb|AAK76781.1|AE001438_34(14994351)；醛/醇脱氢酶2（包括醇脱氢酶（ADH）；乙醛/乙酰CoA脱氢酶（ACDH））gi|2492737|sp|Q24803.1|ADH2_ENTHI(2492737)；醇脱氢酶（肠道沙门氏菌肠道伤寒杆菌亚种CT18）gi|16760134|ref|NP_455751.1|(16760134)；以及醇脱氢酶（肠道沙门氏菌肠道伤寒杆菌亚种）gi|16502428|emb|CAD08384.1|(16502428))，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。 
乳酸脱氢酶（又称为D-乳酸脱氢酶和发酵脱氢酶）由大肠杆菌中的ldhA编码，它能催化丙酮酸到乳酸的NADH依赖型的转化。ldhA的同源基因和突变基因已知。事实上，目前通过NCBI可以查到1664种细菌乳酸脱氢酶。例如，这些同源基因和突变基因包括D-乳酸脱氢酶（D-LDH）（发酵乳酸脱氢酶）gi|1730102|sp|P52643.1|LDHD_ECOLI(1730102)；D-乳酸脱氢酶gi|1049265|gb|AAB51772.1|(1049265)；D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌APEC O1）gi|117623655|ref|YP_852568.1|(117623655)；D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌CFT073）gi|26247689|ref|NP_753729.1|(26247689)；D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌O157:H7EDL933）gi|15801748|ref|NP_287766.1|(15801748)；D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌APEC O1）gi|115512779|gb|ABJ00854.1|(115512779))；D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌CFT073）gi|26108091|gb|AAN80291.1|AE016760_150(26108091)；NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌K12）gi|16129341|ref|NP_415898.1|(16129341)；NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌UTI89）gi|91210646|ref|YP_540632.1|(91210646)；NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌K12）gi|1787645|gb|AAC74462.1|(1787645)；NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌W3110）gi|89108227|ref|AP_002007.1|(89108227)；NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌W3110）gi|1742259|dbj|BAA14990.1|(1742259)；NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌UTI89）gi|91072220|gb|ABE07101.1|(91072220)；NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌O157:H7EDL933）gi|12515320|gb|AAG56380.1|AE005366_6(12515320)；NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶（大肠杆菌O157:H7str.Sakai）gi|13361468|dbj|BAB35425.1|(13361468)；COG1052：乳酸脱氢酶及相关脱氢酶 （大肠杆菌101-1）gi|83588593|ref|ZP_00927217.1|(83588593)；COG1052：乳酸脱氢酶及相关脱氢酶（大肠杆菌53638）gi|75515985|ref|ZP_00738103.1|(75515985)；COG1052：乳酸脱氢酶及相关脱氢酶（大肠杆菌E22）gi|75260157|ref|ZP_00731425.1|(75260157)；COG1052：乳酸脱氢酶及相关脱氢酶（大肠杆菌F11）gi|75242656|ref|ZP_00726400.1|(75242656)；COG1052：乳酸脱氢酶及相关脱氢酶（大肠杆菌E110019）gi|75237491|ref|ZP_00721524.1|(75237491)；COG1052：乳酸脱氢酶及相关脱氢酶（大肠杆菌B7A）gi|75231601|ref|ZP_00717959.1|(75231601)；和COG1052：乳酸脱氢酶及相关脱氢酶（大肠杆菌B171）gi|75211308|ref|ZP_00711407.1|(75211308)，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。 
两种含有FAD的膜结合酶负责催化延胡索酸和琥珀酸的相互转化；延胡索酸还原酶用于厌氧生长，琥珀酸脱氢酶用于好氧生长。延胡索酸还原酶包含多个亚基（例如大肠杆菌中的frdA、B、C）。对任一亚基进行修饰都会得到本文所需的活性。例如，本发明的方法可使用frdB、frdC或frdBC的敲除。Frd同源体和突变体已知。例如，同源体和突变体包括如延胡索酸还原酶亚基D（延胡索酸还原酶13kDa疏水蛋白）gi|67463543|sp|P0A8Q3.1|FRDD_ECOLI(67463543)；延胡索酸还原酶亚基C（延胡索酸还原酶15kDa疏水蛋白）gi|1346037|sp|P20923.2|FRDC_PROVU(1346037)；延胡索酸还原酶亚基D（延胡索酸还原酶13kDa疏水蛋白）gi|120499|sp|P20924.1|FRDD_PROVU(120499)；延胡索酸还原酶亚基C（延胡索酸还原酶15kDa疏水蛋白）gi|67463538|sp|P0A8Q0.1|FRDC_ECOLI(67463538)；延胡索酸还原酶铁-硫亚基（大肠杆菌）gi|145264|gb|AAA23438.1|(145264)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基（大肠杆菌）gi|145263|gb|AAA23437.1|(145263)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|37538290|sp|P17412.3|FRDA_WOLSU(37538290)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|120489|sp|P00363.3|FRDA_ECOLI(120489)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|120490|sp|P20922.1|FRDA_PROVU(120490)；黄素细胞色素c）（黄素细胞色素c3）（Fcc3）gi|119370087|sp|Q07WU7.2|FRDA_SHEFN(119370087)；延胡索酸还原酶铁-硫亚基gi|81175308|sp|P0AC47.2|FRDB_ECOLI(81175308)延胡索酸 还原酶黄素蛋白亚基（黄素细胞色素c）（黄素细胞色素c3）（Fcc3）；gi|119370088|sp|P0C278.1|FRDA_SHEFR(119370088)；Frd操纵子非典型蛋白质C gi|140663|sp|P20927.1|YFRC_PROVU(140663)；Frd操纵子可能的铁-硫亚基Agi|140661|sp|P20925.1|YFRA_PROVU(140661)；延胡索酸还原酶铁-硫亚基gi|120493|sp|P20921.2|FRDB_PROVU(120493)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基;gi|2494617|sp|O06913.2|FRDA_HELPY(2494617)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基前体（三价铁离子诱发的黄素细胞色素c3）（Ifc3）gi|13878499|sp|Q9Z4P0.1|FRD2_SHEFN(13878499)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|54041009|sp|P64174.1|FRDA_MYCTU(54041009)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|54037132|sp|P64175.1|FRDA_MYCBO(54037132)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|12230114|sp|Q9ZMP0.1|FRDA_HELPJ(12230114)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|1169737|sp|P44894.1|FRDA_HAEIN(1169737)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基（产琥珀酸沃廉菌）gi|13160058|emb|CAA04214.2|(13160058)；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基前体（黄素细胞色素c）（FL cyt）gi|25452947|sp|P83223.2|FRDA_SHEON(25452947)；延胡索酸还原酶铁-硫亚基（产琥珀酸沃廉菌）gi|2282000|emb|CAA04215.1|(2282000)；以及延胡索酸还原酶细胞色素b亚基（产琥珀酸沃廉菌）gi|2281998|emb|CAA04213.1|(2281998)，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。 
乙酸激酶由大肠杆菌中的ackA编码。AckA参与到乙酰-coA转化为乙酸的反应。具体讲，即ackA催化乙酰磷酸转化为乙酸。AckA的同源体和突变体已知。NCBI数据库列出了约1450种用作细菌乙酸激酶的多肽。例如，此类同源体和突变体包括乙酸激酶（天蓝色链霉菌A3(2)）gi|21223784|ref|NP_629563.1|(21223784)；乙酸激酶（天蓝色链霉菌A3(2)）gi|6808417|emb|CAB70654.1|(6808417)；乙酸激酶（化脓链球菌M1GAS）gi|15674332|ref|NP_268506.1|(15674332))；乙酸激酶（空肠弯曲杆菌空肠弯曲亚种NCTC11168）gi|15792038|ref|NP_281861.1|(15792038)；乙酸激酶（化脓链球菌M1GAS）gi|13621416|gb|AAK33227.1|(13621416)；乙酸激酶（波罗的海红小梨形菌SH1）gi|32476009|ref|NP_869003.1|(32476009)；乙酸激酶（波罗的海红小梨形菌SH1）gi|32472045|ref|NP_865039.1|(32472045)；乙酸激酶（空肠弯曲杆菌空肠弯曲亚种NCTC11168） gi|112360034|emb|CAL34826.1|(112360034)；乙酸激酶（波罗的海红小梨形菌SH1）gi|32446553|emb|CAD76388.1|(32446553))；乙酸激酶（波罗的海红小梨形菌SH1）gi|32397417|emb|CAD72723.1|(32397417)；AckA（克氏梭菌DSM555）gi|153954016|ref|YP_001394781.1|(153954016))；乙酸激酶（双歧杆菌NCC2705）gi|23465540|ref|NP_696143.1|(23465540);AckA（克氏梭菌DSM555）gi|146346897|gb|EDK33433.1|(146346897)；乙酸激酶（白喉杆菌）gi|38200875|emb|CAE50580.1|(38200875)；乙酸激酶（双歧杆菌NCC2705）gi|23326203|gb|AAN24779.1|(23326203)；乙酸激酶（乙酰激酶）gi|67462089|sp|P0A6A3.1|ACKA_ECOLI(67462089)；和AckA（地衣芽孢杆菌DSM13）gi|52349315|gb|AAU41949.1|(52349315)，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。 
磷酸乙酰基转移酶由大肠杆菌中的pta编码。PTA参与到乙酸转化为乙酰CoA的反应。具体讲，即PTA催化乙酰coA转化为乙酰磷酸。PTA的同源体和突变体已知。通过NCBI可以查到约1075种细菌磷酸乙酰基转移酶。例如，此类同源体和突变体包括磷酸乙酰基转移酶Pta（猫立克次氏体URRWXCal2）gi|67004021|gb|AAY60947.1|(67004021)；磷酸乙酰基转移酶（aphidicola布赫纳氏菌Cc（雪松长足大蚜））gi|116256910|gb|ABJ90592.1|(116256910)；pta（aphidicola布赫纳氏菌Cc（雪松长足大蚜））gi|116515056|ref|YP_802685.1|(116515056)；pta（brevipalpis舌蝇的魏格沃菌共生体）gi|25166135|dbj|BAC24326.1|(25166135)；Pta（多杀性巴氏杆菌多杀性亚种Pm70）gi|12720993|gb|AAK02789.1|(12720993)；Pta（深红红螺菌）gi|25989720|gb|AAN75024.1|(25989720)；pta（6b型威氏李斯特氏菌变种SLCC5334）gi|116742418|emb|CAK21542.1|(116742418)；Pta（鸟分支杆菌副结核亚种K-10）gi|41398816|gb|AAS06435.1|(41398816)；磷酸乙酰基转移酶（pta）（博氏疏螺旋体B31）gi|15594934|ref|NP_212723.1|(15594934)；磷酸乙酰基转移酶（pta）（博氏疏螺旋体B31）gi|2688508|gb|AAB91518.1|(2688508)；磷酸乙酰基转移酶（pta）（流感嗜血杆菌Rd KW20）gi|1574131|gb|AAC22857.1|(1574131)；磷酸乙酰基转移酶Pta（bellii立克次氏体RML369-C）gi|91206026|ref|YP_538381.1|(91206026)；磷酸乙酰基转移酶Pta（bellii立克次氏体RML369-C） gi|91206025|ref|YP_538380.1|(91206025)；磷酸乙酰基转移酶pta（结核分支杆菌F11）gi|148720131|gb|ABR04756.1|(148720131)；磷酸乙酰基转移酶pta（结核分支杆菌Haarlem型）gi|134148886|gb|EBA40931.1|(134148886)；磷酸乙酰基转移酶pta（结核分支杆菌C）gi|124599819|gb|EAY58829.1|(124599819)；磷酸乙酰基转移酶Pta（bellii立克次氏体RML369-C）gi|91069570|gb|ABE05292.1|(91069570)；磷酸乙酰基转移酶Pta（bellii立克次氏体RML369-C）gi|91069569|gb|ABE05291.1|(91069569)；磷酸乙酰基转移酶（pta）（梅毒螺旋体梅毒亚种，Nichols型）gi|15639088|ref|NP_218534.1|(15639088)；和磷酸乙酰基转移酶（pta）（梅毒螺旋体梅毒亚种，Nichols型）gi|3322356|gb|AAC65090.1|(3322356)，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。 
丙酮酸-甲酸裂解酶（甲酸乙酰基转移酶）能够催化丙酮酸转化为乙酰CoA和甲酸。此酶通过在厌氧条件下由plf-活化酶诱导，产生有机自由基，在磷酸限制条件下此酶显著减少。甲酸乙酰基转移酶由大肠杆菌中的pflB编码。PFLB的同源体和突变体已知。例如，此同源体和突变体包含甲酸乙酰基转移酶1（丙酸-甲酸-裂解酶）gi|129879|sp|P09373.2|PFLB_ECOLI(129879)；甲酸乙酰基转移酶1（鼠疫耶尔森氏杆菌CO92）gi|16121663|ref|NP_404976.1|(16121663)；甲酸乙酰基转移酶1（假结核耶尔森氏菌IP32953）gi|51595748|ref|YP_069939.1|(51595748)；甲酸乙酰基转移酶1（田鼠型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种91001）gi|45441037|ref|NP_992576.1|(45441037)；甲酸乙酰基转移酶1（鼠疫耶尔森氏杆菌CO92）gi|115347142|emb|CAL20035.1|(115347142)；甲酸乙酰基转移酶1（田鼠型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种91001）gi|45435896|gb|AAS61453.1|(45435896)；甲酸乙酰基转移酶1（假结核耶尔森氏菌IP32953）gi|51589030|emb|CAH20648.1|(51589030)；甲酸乙酰基转移酶1（肠道沙门氏菌肠道伤寒亚种Typhi变种CT18）gi|16759843|ref|NP_455460.1|(16759843)；甲酸乙酰基转移酶1（肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒A变种ATCC9150）gi|56413977|ref|YP_151052.1|(56413977)；甲酸乙酰基转移酶1（肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒变种）gi|16502136|emb|CAD05373.1|(16502136)；甲酸乙酰基转移酶1（肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒A变种ATCC9150）gi|56128234|gb|AAV77740.1|(56128234)；甲 酸乙酰基转移酶1（痢疾志贺氏菌Sd197）gi|82777577|ref|YP_403926.1|(82777577)；甲酸乙酰基转移酶1（2a型福氏志贺氏菌2457T）gi|30062438|ref|NP_836609.1|(30062438)；甲酸乙酰基转移酶1（2a型福氏志贺氏菌2457T）gi|30040684|gb|AAP16415.1|(30040684)；甲酸乙酰基转移酶1（5型福氏志贺氏菌8401）gi|110614459|gb|ABF03126.1|(110614459)；甲酸乙酰基转移酶1（痢疾志贺氏菌Sd197）gi|81241725|gb|ABB62435.1|(81241725)；甲酸乙酰基转移酶1（大肠杆菌O157:H7EDL933）gi|12514066|gb|AAG55388.1|AE005279_8(12514066)；甲酸乙酰基转移酶1（鼠疫耶尔森氏杆菌KIM）gi|22126668|ref|NP_670091.1|(22126668)；甲酸乙酰基转移酶1（无乳链球菌A909）gi|76787667|ref|YP_330335.1|(76787667)；甲酸乙酰基转移酶1（鼠疫耶尔森氏杆菌KIM）gi|21959683|gb|AAM86342.1|AE013882_3(21959683)；甲酸乙酰基转移酶1（无乳链球菌A909）gi|76562724|gb|ABA45308.1|(76562724)；甲酸乙酰基转移酶1（小肠结肠炎耶尔森氏杆菌小肠结肠炎亚种8081）gi|123441844|ref|YP_001005827.1|(123441844)；甲酸乙酰基转移酶1（5型福氏志贺氏菌8401)gi|110804911|ref|YP_688431.1|(110804911)；甲酸乙酰基转移酶1（大肠杆菌UTI89）gi|91210004|ref|YP_539990.1|(91210004)；甲酸乙酰基转移酶1（鲍氏志贺氏菌Sb227）gi|82544641|ref|YP_408588.1|(82544641))；甲酸乙酰基转移酶1（宋内氏志贺氏菌Ss046）gi|74311459|ref|YP_309878.1|(74311459)；甲酸乙酰基转移酶1（肺炎克伯氏菌肺炎亚种MGH78578）gi|152969488|ref|YP_001334597.1|(152969488)；甲酸乙酰基转移酶1（肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒变种Ty2）gi|29142384|ref|NP_805726.1|(29142384)；甲酸乙酰基转移酶1（2a型福氏志贺氏菌301）gi|24112311|ref|NP_706821.1|(24112311)；甲酸乙酰基转移酶1（大肠杆菌O157:H7EDL933）gi|15800764|ref|NP_286778.1|(15800764)；甲酸乙酰基转移酶1（肺炎克伯氏菌肺炎亚种MGH78578）gi|150954337|gb|ABR76367.1|(150954337)；甲酸乙酰基转移酶1（鼠疫耶尔森氏杆菌CA88-4125）gi|149366640|ref|ZP_01888674.1|(149366640)；甲酸乙酰基转移酶1（鼠疫耶尔森氏杆菌CA88-4125）gi|149291014|gb|EDM41089.1|(149291014)；甲酸乙酰基转移酶1（小肠结肠炎耶尔森氏杆菌小肠结肠炎亚种8081）gi|122088805|emb|CAL11611.1|(122088805)； 甲酸乙酰基转移酶1（宋内氏志贺氏菌Ss046）gi|73854936|gb|AAZ87643.1|(73854936)；甲酸乙酰基转移酶1（大肠杆菌UTI89）gi|91071578|gb|ABE06459.1|(91071578)；甲酸乙酰基转移酶1（肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒变种Ty2）gi|29138014|gb|AAO69575.1|(29138014)；甲酸乙酰基转移酶1（鲍氏志贺氏菌Sb227）gi|81246052|gb|ABB66760.1|(81246052)；甲酸乙酰基转移酶1（2a型福氏志贺氏菌301）gi|24051169|gb|AAN42528.1|(24051169)；甲酸乙酰基转移酶1（大肠杆菌O157:H7301）gi|24051169|gb|AAN42528.1|(13360445)；甲酸乙酰基转移酶1（大肠杆菌O157:H7Sakai)gi|15830240|ref|NP_309013.1|(15830240)；甲酸乙酰基转移酶I（丙酮酸甲酸裂解酶1）（发光杆菌laumondii亚种TTO1）gi|36784986|emb|CAE13906.1|(36784986)；甲酸乙酰基转移酶I（丙酮酸甲酸裂解酶1）（发光杆菌laumondii亚种TTO1）gi|37525558|ref|NP_928902.1|(37525558)；甲酸乙酰基转移酶（金黄色葡萄球菌金黄色亚种Mu50）gi|14245993|dbj|BAB56388.1|(14245993)甲酸乙酰基转移酶（金黄色葡萄球菌金黄色亚种Mu50）gi|15923216|ref|NP_370750.1|(15923216)；甲酸乙酰基转移酶（丙酮酸甲酸裂解酶）gi|81706366|sp|Q7A7X6.1|PFLB_STAAN(81706366)；甲酸乙酰基转移酶（丙酮酸甲酸裂解酶）gi|81782287|sp|Q99WZ7.1|PFLB_STAAM(81782287)；甲酸乙酰基转移酶（丙酮酸甲酸裂解酶）gi|81704726|sp|Q7A1W9.1|PFLB_STAAW(81704726)；甲酸乙酰基转移酶（金黄色葡萄球菌金黄色亚种Mu3）gi|156720691|dbj|BAF77108.1|(156720691)；甲酸乙酰基转移酶（胡萝卜软腐欧式杆菌胡萝卜软腐亚种SCRI1043）gi|50121521|ref|YP_050688.1|(50121521)；甲酸乙酰基转移酶（胡萝卜软腐欧式杆菌胡萝卜软腐亚种SCRI1043）gi|49612047|emb|CAG75496.1|(49612047)；甲酸乙酰基转移酶（金黄色葡萄球菌金黄色亚种Newman）gi|150373174|dbj|BAF66434.1|(150373174)；甲酸乙酰基转移酶（希瓦氏菌MR-1)gi|24374439|ref|NP_718482.1|(24374439)；甲酸乙酰基转移酶（希瓦氏菌MR-1)gi|24349015|gb|AAN55926.1|AE015730_3(24349015)；甲酸乙酰基转移酶（胸膜肺炎放线杆菌3型变种JL03）gi|165976461|ref|YP_001652054.1|(165976461)；甲酸乙酰基转移酶（胸膜肺炎放线杆菌3型变种JL03)gi|165876562|gb|ABY69610.1|(165876562)；甲酸乙酰基 转移酶（金黄色葡萄球菌金黄色亚种MW2）gi|21203365|dbj|BAB94066.1|(21203365)；甲酸乙酰基转移酶（金黄色葡萄球菌金黄色亚种N315）gi|13700141|dbj|BAB41440.1|(13700141)；甲酸乙酰基转移酶（金黄色葡萄球菌金黄色亚种Newman)gi|151220374|ref|YP_001331197.1|(151220374)；甲酸乙酰基转移酶（金黄色葡萄球菌金黄色亚种Mu3）gi|156978556|ref|YP_001440815.1|(156978556)；甲酸乙酰基转移酶（聚球藻种JA-2-3B'a(2-13)）gi|86607744|ref|YP_476506.1|(86607744)；甲酸乙酰基转移酶（聚球藻种JA-3-3Ab)gi|86605195|ref|YP_473958.1|(86605195)；甲酸乙酰基转移酶（肺炎链球菌D39）gi|116517188|ref|YP_815928.1|(116517188)；甲酸乙酰基转移酶（聚球藻种JA-2-3B'a(2-13)）gi|86556286|gb|ABD01243.1|(86556286)；甲酸乙酰基转移酶（聚球藻种JA-3-3Ab)gi|86553737|gb|ABC98695.1|(86553737)；甲酸乙酰基转移酶（诺氏梭菌NT）gi|118134908|gb|ABK61952.1|(118134908)；甲酸乙酰基转移酶（金黄色葡萄球菌金黄色亚种MRSA252）gi|49482458|ref|YP_039682.1|(49482458)；和甲酸乙酰基转移酶（金黄色葡萄球菌金黄色亚种MRSA252）gi|49240587|emb|CAG39244.1|(49240587)，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。 
α-异丙基苹果酸合成酶（EC2.3.3.13，有时称为2-异丙基苹果酸合成酶，α-IPM合成酶）催化乙酰-CoA的乙酰基与3-甲基-2-氧代丁酸（2-氧代异戊酸）缩合成3-羧基-3-羟基-4-甲基戊酸（2-异丙基苹果酸）。α-异丙基苹果酸合成酶由大肠杆菌中的leuA编码。LeuA的同源体和突变体已知。例如，此类同源体和突变体，例如2-异丙基苹果酸合成酶（谷氨酸棒状杆菌）gi|452382|emb|CAA50295.1|(452382)；2-异丙基苹果酸合成酶（大肠杆菌K12）gi|16128068|ref|NP_414616.1|(16128068)；2-异丙基苹果酸合成酶（大肠杆菌K12）gi|1786261|gb|AAC73185.1|(1786261)；2-异丙基苹果酸合成酶（拟南芥）gi|15237194|ref|NP_197692.1|(15237194)；2-异丙基苹果酸合成酶（拟南芥）gi|42562149|ref|NP_173285.2|(42562149)；2-异丙基苹果酸合成酶（拟南芥）gi|15221125|ref|NP_177544.1|(15221125)；2-异丙基苹果酸合成酶（天蓝色链霉菌A3(2)）gi|32141173|ref|NP_733575.1|(32141173)；2-异丙基苹果酸合成酶（波罗的海红小梨形菌SH1)gi|32477692|ref|NP_870686.1|(32477692)；2-异丙基苹果酸合成酶（波罗的海红小梨形菌SH1)gi|32448246|emb|CAD77763.1|(32448246)； 2-异丙基苹果酸合成酶（Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835）gi|166241432|gb|EDR53404.1|(166241432)；2-异丙基苹果酸合成酶（橙色滑柱菌ATCC23779）gi|159900959|ref|YP_001547206.1|(159900959)；2-异丙基苹果酸合成酶（Dinoroseobacter shibae DFL12）gi|159043149|ref|YP_001531943.1|(159043149)；2-异丙基苹果酸合成酶（砂嗜盐产孢菌CNS-205）gi|159035933|ref|YP_001535186.1|(159035933)；2-异丙基苹果酸合成酶（番茄细菌性溃疡病菌NCPPB382)gi|148272757|ref|YP_001222318.1|(148272757)；2-异丙基苹果酸合成酶（大肠杆菌B）gi|124530643|ref|ZP_01701227.1|(124530643)；2-异丙基苹果酸合成酶（大肠杆菌C ATCC8739）gi|124499067|gb|EAY46563.1|(124499067)；2-异丙基苹果酸合成酶（百日咳博德特氏菌Tohama I）gi|33591386|ref|NP_879030.1|(33591386)；2-异丙基苹果酸合成酶（Polynucleobacter necessarius STIR1）gi|164564063|ref|ZP_02209880.1|(164564063)；2-异丙基苹果酸合成酶（Polynucleobacter necessarius STIR1）gi|164506789|gb|EDQ94990.1|(164506789)；2-异丙基苹果酸合成酶（韦氏芽孢杆菌KBAB4）gi|163939313|ref|YP_001644197.1|(163939313)，任何带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。 
BCCA转氨酶催化支链氨基酸（BCAA）的形成。一些已知的这类转氨酶由大肠杆菌中的ilvE编码。典型同源体和突变体包含下列登记号所指的序列：ilvE（铜绿微囊藻PCC7806）gi|159026756|emb|CAO86637.1|(159026756)；IlvE（大肠杆菌）gi|87117962|gb|ABD20288.1|(87117962)；IlvE（大肠杆菌）gi|87117960|gb|ABD20287.1|(87117960)；IlvE（大肠杆菌）gi|87117958|gb|ABD20286.1|(87117958)；IlvE（福氏志贺氏菌）gi|87117956|gb|ABD20285.1|(87117956)；IlvE（福氏志贺氏菌）gi|87117954|gb|ABD20284.1|(87117954)；IlvE（福氏志贺氏菌）gi|87117952|gb|ABD20283.1|(87117952)；IlvE（福氏志贺氏菌）gi|87117950|gb|ABD20282.1|(87117950)；IlvE（福氏志贺氏菌）gi|87117948|gb|ABD20281.1|(87117948)；IlvE（福氏志贺氏菌）gi|87117946|gb|ABD20280.1|(87117946)；IlvE（福氏志贺氏菌） gi|87117944|gb|ABD20279.1|(87117944)；IlvE（福氏志贺氏菌）gi|87117942|gb|ABD20278.1|(87117942)；IlvE（福氏志贺氏菌）gi|87117940|gb|ABD20277.1|(87117940)；IlvE（福氏志贺氏菌）gi|87117938|gb|ABD20276.1|(87117938)；IlvE（痢疾志贺氏菌）gi|87117936|gb|ABD20275.1|(87117936)；IlvE（痢疾志贺氏菌）gi|87117934|gb|ABD20274.1|(87117934)；IlvE（痢疾志贺氏菌）gi|87117932|gb|ABD20273.1|(87117932)；IlvE（痢疾志贺氏菌）gi|87117930|gb|ABD20272.1|(87117930)；和IlvE（痢疾志贺氏菌）gi|87117928|gb|ABD20271.1|(87117928)，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。 
酪氨酸转氨酶催化二羧酸和芳香族氨基酸底物的转氨基作用。大肠杆菌中的酪氨酸转氨酶由tyrB基因编码。TyrB的同源体和突变体已知。例如，此类同源体和突变体包括tyrB（博德特氏菌）gi|163857093|ref|YP_001631391.1|(163857093)；tyrB（博德特氏菌）gi|163260821|emb|CAP43123.1|(163260821)；转氨酶gi|551844|gb|AAA24704.1|(551844)；转氨酶（慢生根瘤菌BTAi1）gi|146404387|gb|ABQ32893.1|(146404387)；酪氨酸转氨酶TyrB（肠道沙门氏菌）gi|4775574|emb|CAB40973.2|(4775574)；酪氨酸转氨酶（鼠伤寒沙门氏菌LT2）gi|16422806|gb|AAL23072.1|(16422806)；和酪氨酸转氨酶gi|148085|gb|AAA24703.1|(148085)，其所有序列均以引用的方式并入本文。 
丙酮酸氧化酶催化丙酮酸转化为乙酸和CO2的反应。在大肠杆菌中，丙酮酸氧化酶由poxB编码。PoxB及其同源体和突变体包括如丙酮酸氧化酶；PoxB（大肠杆菌）gi|685128|gb|AAB31180.1||bbm|348451|bbs|154716(685128)；PoxB（荧光假单胞菌）gi|32815820|gb|AAP88293.1|(32815820)；PoxB（大肠杆菌）gi|25269169|emb|CAD57486.1|(25269169)；丙酮酸脱氢酶（肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒变异型)gi|16502101|emb|CAD05337.1|(16502101)；丙酮酸氧化酶（植物乳杆菌）gi|41691702|gb|AAS10156.1|(41691702)；丙酮酸脱氢酶（慢生型大豆根瘤菌）gi|20257167|gb|AAM12352.1|(20257167)；丙酮酸脱氢酶（鼠疫耶尔森氏杆菌KIM）gi|22126698|ref|NP_670121.1|(22126698)；丙酮酸脱氢酶（细胞色素）（古典型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变异体B42003004）gi|166211240|ref|ZP_02237275.1|(166211240)；丙酮酸脱氢酶（细胞色素）（古典 型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变异型B42003004)gi|166207011|gb|EDR51491.1|(166207011)；丙酮酸脱氢酶（番茄细菌性叶斑病菌DC3000）gi|28869703|ref|NP_792322.1|(28869703)；丙酮酸脱氢酶（鼠伤寒沙门氏菌LT2)gi|16764297|ref|NP_459912.1|(16764297)；丙酮酸脱氢酶（肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒变异型CT18）gi|16759808|ref|NP_455425.1|(16759808)；丙酮酸脱氢酶（细胞色素）（贝纳特氏立克次体Dugway5J108-111）gi|154706110|ref|YP_001424132.1|(154706110)；丙酮酸脱氢酶（番茄细菌性溃疡病菌NCPPB382）gi|148273312|ref|YP_001222873.1|(148273312)；丙酮酸脱氢酶（嗜酸乳杆菌NCFM）gi|58338213|ref|YP_194798.1|(58338213)；和丙酮酸脱氢酶（鼠疫耶尔森氏杆菌CO92）gi|16121638|ref|NP_404951.1|(16121638)，带有登记号的序列以引用方式并入本文。 
L-苏氨酸-3-脱氢酶（EC1.1.1.103）催化L-苏氨酸转化成L-2-氨基-3-氧代丁酸的反应。tdh基因编码L-苏氨酸-3-脱氢酶。NCBI中认可的来自细菌的L-苏氨酸-3-脱氢酶约有700种。tdh的各种同源体和突变体包括如L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|135560|sp|P07913.1|TDH_ECOLI(135560)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227854|sp|A4TSC6.1|TDH_YERPP(166227854)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227853|sp|A1JHX8.1|TDH_YERE8(166227853)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227852|sp|A6UBM6.1|TDH_SINMW(166227852)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227851|sp|A1RE07.1|TDH_SHESW(166227851)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227850|sp|A0L2Q3.1|TDH_SHESA(166227850)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227849|sp|A4YCC5.1|TDH_SHEPC(166227849)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227848|sp|A3QJC8.1|TDH_SHELP(166227848)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227847|sp|A6WUG6.1|TDH_SHEB8(166227847)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227846|sp|A3CYN0.1|TDH_SHEB5(166227846)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227845|sp|A1S1Q3.1|TDH_SHEAM(166227845)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227844|sp|A4FND4.1|TDH_SACEN(166227844)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227843|sp|A1SVW5.1|TDH_PSYIN(166227843)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227842|sp|A5IGK7.1|TDH_LEGPC(166227842)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227841|sp|A6TFL2.1|TDH_KLEP7(166227841)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227840|sp|A4IZ92.1|TDH_FRATW(166227840)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227839|sp|A0Q5K3.1|TDH_FRATN(166227839)；L-苏氨酸-3-脱氢酶 gi|166227838|sp|A7NDM9.1|TDH_FRATF(166227838)；L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227837|sp|A7MID0.1|TDH_ENTS8(166227837)；和L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227836|sp|A1AHF3.1|TDH_ECOK1(166227836)，带有登记号的序列以引用方式并入本文。 
乙酰羟酸合成酶（例如ilvH）和乙酰乳酸合成酶（例如alsS、ilvB、ilvI）催化支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）的合成反应。大肠杆菌中的IlvH编码乙酰羟酸合成酶（见乙酰羟酸合成酶AHAS III（IlvH）（大肠杆菌）gi|40846|emb|CAA38855.1|(40846)，以引用的方式并入本文）。ilvH的同源体、突变体以及构成ilvH的操纵子已知，其包含如ilvH（铜绿微囊藻PCC7806）gi|159026908|emb|CAO89159.1|(159026908)；IlvH（淀粉液化芽孢杆菌FZB42）gi|154686966|ref|YP_001422127.1|(154686966)；IlvH（淀粉液化芽孢杆菌FZB42）gi|154352817|gb|ABS74896.1|(154352817)；IlvH（嗜线虫致病杆菌）gi|131054140|gb|ABO32787.1|(131054140)；IlvH（鼠伤寒沙门氏菌）gi|7631124|gb|AAF65177.1|AF117227_2(7631124)；ilvN（无害李斯特氏菌）gi|16414606|emb|CAC97322.1|(16414606)；ilvN（单核细胞增生李斯特氏菌）gi|16411438|emb|CAD00063.1|(16411438)；乙酰羟酸合成酶（新月柄杆菌）gi|408939|gb|AAA23048.1|(408939)；乙酰羟酸合成酶I，小亚基（肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒变异型）gi|16504830|emb|CAD03199.1|(16504830)；乙酰羟酸合成酶，小亚基（Tropheryma whipplei TW08/27）gi|28572714|ref|NP_789494.1|(28572714)；乙酰羟酸合成酶，小亚基（Tropheryma whipplei TW08/27）gi|28410846|emb|CAD67232.1|(28410846)；乙酰羟酸合成酶I，小亚基（肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒A变异型）ATCC9150）gi|56129933|gb|AAV79439.1|(56129933)；乙酰羟酸合成酶小亚基；乙酰羟酸合成酶，小亚基gi|551779|gb|AAA62430.1|(551779)；乙酰羟酸合成酶I，小亚基（肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒变异型Ty2）gi|29139650|gb|AAO71216.1|(29139650)；乙酰羟酸合成酶小亚基（肉桂地链霉菌）gi|5733116|gb|AAD49432.1|AF175526_1(5733116)；乙酰羟酸合成酶大亚基；和乙酰羟酸合成酶，大亚基gi|400334|gb|AAA62429.1|(400334)，带有登记号的序列以引用方式并入本文。乙酰乳酸合成酶基因包括alsS和ilvI。ilvI和alsS的同源体已知，例如，乙酰乳酸合成酶小亚基（长双歧杆菌NCC2705）gi|23325489|gb|AAN24137.1|(23325489)；乙酰乳酸合成酶小亚基（嗜热脂肪芽孢 杆菌）gi|19918933|gb|AAL99357.1|(19918933)；乙酰乳酸合成酶（固氮弧菌BH72）gi|119671178|emb|CAL95091.1|(119671178)；乙酰乳酸合成酶小亚基（白喉杆菌）gi|38199954|emb|CAE49622.1|(38199954)；乙酰乳酸合成酶（固氮弧菌BH72）gi|119669739|emb|CAL93652.1|(119669739)；乙酰乳酸合成酶小亚基（詹氏棒状杆菌K411）gi|68263981|emb|CAI37469.1|(68263981)；乙酰乳酸合成酶小亚基（枯草芽孢杆菌）gi|1770067|emb|CAA99562.1|(1770067)；乙酰乳酸合成酶同工酶1小亚基（AHAS-I）（乙酰羟酸合成酶同工酶1小亚基）（ALS-I）gi|83309006|sp|P0ADF8.1|ILVN_ECOLI(83309006)；乙酰乳酸合成酶大亚基;（嗜热脂肪芽孢杆菌）gi|19918932|gb|AAL99356.1|(19918932)；和乙酰乳酸合成酶，小亚基（腾冲嗜热杆菌MB4）gi|20806556|ref|NP_621727.1|(20806556)，带有登记号的序列以引用方式并入本文。NCBI中所列ilvB同源体和突变体约为1120种。 
乙酰羟酸还原异构酶是异亮氨酸和缬氨酸生物合成平行途径中的第二个酶。大肠杆菌中的IlvC编码乙酰羟酸还原异构酶。ilvC的同源体和突变体已知，包括如乙酰羟酸还原异构酶（粟酒裂殖酵母972h-）gi|162312317|ref|NP_001018845.2|(162312317)；乙酰羟酸还原异构酶（粟酒裂殖酵母）gi|3116142|emb|CAA18891.1|(3116142)；乙酰羟酸还原异构酶（酿酒酵母YJM789）gi|151940879|gb|EDN59261.1|(151940879)；Ilv5p：乙酰羟酸还原异构酶（酿酒酵母）gi|609403|gb|AAB67753.1|(609403)；ACL198Wp（棉病囊菌ATCC10895）gi|45185490|ref|NP_983206.1|(45185490)；ACL198Wp（棉病囊菌ATCC10895）gi|44981208|gb|AAS51030.1|(44981208)；乙酰羟酸还原异构酶；Ilv5x（酿酒酵母）gi|957238|gb|AAB33579.1||bbm|369068|bbs|165406(957238)；乙酰羟酸还原异构酶；Ilv5g（酿酒酵母）gi|957236|gb|AAB33578.1||bbm|369064|bbs|165405(957236)；和乙酰羟酸还原异构酶（粟酒裂殖酵母）gi|2696654|dbj|BAA24000.1|(2696654)，每个带有登记号的序列均以引用方式并入本文。 
二羟酸脱水酶催化异亮氨酸和缬氨酸生化合成途径中的第四步反应，即2,3-二羟基-异戊酸脱水生成α-酮异戊酸。IlvD和ilv3编码二羟酸脱水酶。二羟酸脱水酶的同源体和突变体已知，包含如IlvD（麻风分枝杆菌）gi|2104594|emb|CAB08798.1|(2104594)；二羟酸脱水酶（Tropheryma whipplei TW08/27）gi|28410848|emb|CAD67234.1|(28410848)；二羟酸脱水酶（麻风分枝 杆菌）gi|13093837|emb|CAC32140.1|(13093837)；二羟酸脱水酶（波罗的海红小梨形菌SH1）gi|32447871|emb|CAD77389.1|(32447871)；和推定的二羟酸脱水酶（金黄色葡萄球菌金黄色亚种MRSA252）gi|49242408|emb|CAG41121.1|(49242408)，每个带有登记号的序列均以引用方式并入本文。 
2-酮酸脱羧酶催化2-酮酸转化为相应醛的反应。例如，2-酮异戊酸脱羧酶催化2-酮异戊酸转化为异丁醛的反应。已知一些2-酮酸脱羧酶,例如由pdc、pdc1、pdc5、pdc6、aro10、thI3、kdcA和kivd基因编码的2-酮酸脱羧酶。对2-酮酸转化为相应醛的反应起催化作用的典型同源体和突变体包含下列登记号所指的序列及已鉴定的酶活性：gi|44921617|gb|AAS49166.1|支链α-酮酸脱羧酶（乳酸乳球菌）；gi|15004729|ref|NP_149189.1|丙酮酸脱羧酶（丙酮丁醇梭菌ATCC824）；gi|82749898|ref|YP_415639.1|可能的丙酮酸脱羧酶（金黄色葡萄糖球菌RF122）；gi|77961217|ref|ZP_00825060.1|COG3961：丙酮酸脱羧酶及相关的硫胺素焦磷酸所需的酶(莫氏耶尔森氏菌ATCC43969)；gi|71065418|ref|YP_264145.1|推定的丙酮酸脱羧酶（北极嗜冷杆菌273-4）；gi|16761331|ref|NP_456948.1|推定的脱羧酶（肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒变异型）CT18）；gi|93005792|ref|YP_580229.1|丙酮酸脱羧酶（cryohalolentis嗜冷杆菌K5）gi|23129016|ref|ZP_00110850.1|COG3961:及相关的硫胺素焦磷酸所需的酶（点形念珠藻PCC73102）；gi|16417060|gb|AAL18557.1|AF354297_1丙酮酸脱羧酶（胃八叠球菌）；gi|15607993|ref|NP_215368.1|可能的丙酮酸或吲哚-3-丙酮酸脱羧酶PDC（结核分枝杆菌H37Rv）；gi|41406881|ref|NP_959717.1|Pdc（鸟分枝杆菌副结核亚种K-10）；gi|91779968|ref|YP_555176.1|推定的丙酮酸脱羧酶（xenovorans伯克氏菌LB400）；gi|15828161|ref|NP_302424.1|丙酮酸（或吲哚丙酮酸）脱羧酶（麻风分枝杆菌TN）；gi|118616174|ref|YP_904506.1|丙酮酸或吲哚-3-丙酮酸脱羧酶Pdc（溃疡分枝杆菌Agy99）；gi|67989660|ref|NP_001018185.1|推定蛋白SPAC3H8.01（粟酒裂殖酵母972h-）；gi|21666011|gb|AAM73540.1|AF282847_1丙酮酸脱羧酶PdcB（米根酶）；gi|69291130|ref|ZP_00619161.1|丙酮酸脱羧酶：丙酮酸脱羧酶（耐辐射Kineococcus SRS30216）；gi|66363022|ref|XP_628477.1|丙酮酸脱羧酶（爱荷华微小隐孢子虫II）；gi|70981398|ref|XP_731481.1|丙酮酸脱羧酶(烟曲霉Af293)；gi|121704274|ref|XP_001270401.1|丙酮酸脱羧酶，推定（棒曲霉NRRL 1）；gi|119467089|ref|XP_001257351.1|丙酮酸脱羧酶，推定（费氏新萨托菌181）；gi|26554143|ref|NP_758077.1|丙酮酸脱羧酶（穿通支原体HF-2）；gi|21666009|gb|AAM73539.1|AF282846_1丙酮酸脱羧酶PdcA(米根酶)。 
醇脱氢酶（adh）催化氨基酸分解代谢的最后一步反应，即醛转化为长链或复杂醇。在此项技术中，各种adh基因已知。如本文所指出的，adhq1同源体和突变体包括如adh2、adh3、adh4、adh5、adh6和sfa1（见SFA(酿酒酵母)gi|288591|emb|CAA48161.1|(288591)；带有登记号的序列以引用方式并入本文中）。 
柠苹酸合成酶催化丙酮酸和乙酸的缩合反应。CimA编码柠苹酸合成酶。同源体和突变体已知，包括如柠苹酸合成酶（双曲钩端螺旋体Patoc变异型）gi|116664687|gb|ABK13757.1|(116664687)；柠苹酸合成酶（双曲钩端螺旋体Monteralerio变异型）gi|116664685|gb|ABK13756.1|(116664685)；柠苹酸合成酶（问号钩端螺旋体Hebdomadis变异型）gi|116664683|gb|ABK13755.1|(116664683)；柠苹酸合成酶（问号钩端螺旋体Pomona变异型）gi|116664681|gb|ABK13754.1|(116664681)；柠苹酸合成酶（问号钩端螺旋体Australis变异型）gi|116664679|gb|ABK13753.1|(116664679)；柠苹酸合成酶（问号钩端螺旋体Autumnalis变异型）gi|116664677|gb|ABK13752.1|(116664677)；柠苹酸合成酶（问号钩端螺旋体Pyrogenes变异型）gi|116664675|gb|ABK13751.1|(116664675)；柠苹酸合成酶（问号钩端螺旋体Canicola变异型）gi|116664673|gb|ABK13750.1|(116664673)；柠苹酸合成酶（问号钩端螺旋体Lai变异型）gi|116664671|gb|ABK13749.1|(116664671)；CimA(梅氏钩端螺旋体Semaranga变异型)gi|119720987|gb|ABL98031.1|(119720987)；(R)-柠苹酸合成酶gi|2492795|sp|Q58787.1|CIMA_METJA(2492795)；(R)-柠苹酸合成酶gi|22095547|sp|P58966.1|CIMA_METMA(22095547)；(R)-柠苹酸合成酶gi|22001554|sp|Q8TJJ1.1|CIMA_METAC(22001554)；(R)-柠苹酸合成酶gi|22001553|sp|O26819.1|CIMA_METTH(22001553)；(R)-柠苹酸合成酶gi|22001555|sp|Q8TYB1.1|CIMA_METKA(22001555)；(R)-柠苹酸合成酶（海沼甲烷球菌S2）gi|45358581|ref|NP_988138.1|(45358581)；(R)-柠苹酸合成酶（海沼甲烷球菌S2）gi|44921339|emb|CAF30574.1|(44921339)；以及与(R)-柠苹酸合成酶相似的酶（Candidatus Kuenenia stuttgartiensis） gi|91203541|emb|CAJ71194.1|(91203541)，每个带有上述登记号的序列以引用的方式并入本文。 
在一实施方案中，本发明提供的微生物可表征为含有rrnBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33DrhaBADLD78（F'转导自XL-1BLUE，以提供lacIq）、ΔadhE、ΔldhA、ΔfrdBC、Δfnr、Δpta和ΔpflB，及pSA55和pSA69的大肠杆菌，其中pSA55是一种从ColE1原点构建的质粒，其含有受PLlacO1调控的kivd（乳酸乳球菌）和adh2（酿酒酵母）基因和一氨苄西林抗性基因，pSA69是一种源自p15A起点的质粒，其含有受PLlacO1调控的alsS（枯草芽孢杆菌）、ilvC（大肠杆菌）和ilvD（大肠杆菌）基因和一卡那霉素抗性基因。 
在另一实施方案中，本发明提供的微生物可表征为含有rrnBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33DrhaBADLD78（F'转导自XL-1BLUE，以提供lacIq）、ΔmetA、Δtdh、ΔilvB、ΔilvI和ΔadhE，及pCS49、pSA62和pSA55I的大肠杆菌，其中pSA55I为从ColE1原点构建的质粒，其含有受PLlacO1调控的kivd（乳酸乳球菌）和adh2（酿酒酵母）基因和一种氨苄西林抗性基因，lacI位于氨苄西林抗性基因之后，pSA62是一种源自p15A起点的质粒，其含有受PLlacO1调控的ilvA（大肠杆菌）和leuABCD（大肠杆菌）基因和一卡那霉素抗性基因，pCS49是一种源自pSC101*起点的质粒，其含有受PLlacO1调控的thrA(fbr)BC（大肠杆菌）基因和一种壮观霉素抗性基因。 
本发明还提供了被保存的微生物。被保存的微生物只是代表性的，根据本发明，本发明所属领域的技术人员能够修饰其他不同种或不同基因型的亲本微生物，以获得本发明提供的能够产生异丁醇和正丁醇的微生物。 
本发明提供了一种被命名为SA237的重组微生物，其ATCC登记号为no.________,于2008年2月7日由ATCC保存。本发明包含微生物的培养物，此培养物含有ATCC登记号为no._____的一种微生物群体，其包括混合培养物。本发明还提供源自ATCC登记号为no.______的多聚核苷酸片段，其用于制备一种生产异丁醇的微生物，产率为每克葡萄糖产出0.12至0.41克异丁醇。例如，此多聚核苷酸片段的碱基对数量可以从1000个左右到数百万个。本发明还包含异丁醇或苯基乙醇生产过程中的生物反应器，此反应器含有一定数量的微生物，这些微生物的ATCC登记号为_________。使用被保 存微生物时，本领域技术人员能够很容易确定被保存微生物或其任何基因片段以及本文所述的多聚核苷酸片段的序列，包括定位敲除或破坏的基因。 
本发明还提供了一种被命名为CRS-BuOH23的重组微生物，其ATCC登记号为no._______,于2008年2月7日由ATCC保存。本发明包含微生物的培养物，此培养物含有一定数量的ATCC登记号为no.的微生物，包括混合培养物。本发明还提供源自ATCC登记号为no.______的多聚核苷酸片段，它将用于制备一种生产正丁醇的微生物。例如，此多聚核苷酸片段的碱基对数量可以从1000个左右到数百万个。本发明还包含正丁醇生产过程中的生物反应器，此反应器含有一定数量的微生物，这些微生物的ATCC登记号为________。使用被保存微生物时，本领域技术人员能够很容易确定被保存微生物或其任何基因片段以及本文所述的多聚核苷酸片段的序列，包括定位基因敲除或基因破坏。 
应当了解，可以对一系列微生物进行修饰，使它们含有适合于生产正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇的重组代谢途径。应当了解，有多种微生物都能作为编码合适目标酶的遗传物质的“来源”，这些目标酶适用于本发明提供的重组微生物。术语“微生物”包括古细菌域、细菌域和真核生物域内的原核和真核微生物物种，后者包括酵母菌和丝状真菌、原生动物、藻类或高级原生生物。术语“微生物细胞”和“微生物(microbe)”可以与“微生物(microorganism)”互换使用。 
术语“原核生物”指本发明所属领域公认的并且指不含细胞核或其他细胞器的细胞。“原核细胞”通常被归为细菌域和古细菌域这两个域中的一个。古细菌域和细菌域的明显区别在于16S核糖体RNA的核苷酸序列间的根本不同。 
术语“古细菌域”指疵壁菌门中的一类微生物，它们通常存在于特殊环境中，并且在许多方面不同于其他原核生物，包括核糖体蛋白的数量以及细胞壁中胞壁酸的缺乏。通过ssrRNA分析，古细菌包含两种在系统进化上截然不同的种群：泉古菌门和广古菌门。根据它们的生理学特征，古细菌可被分为三种类型：产甲烷菌（能产生甲烷的原核生物）；极端嗜盐菌（能在含有极高浓度的盐（Nacl）环境中生存的原核生物）；和极端（超）嗜热菌（能在极高温度环境中生存的原核生物）。这些原核生物除了具有与细菌不同的统一的古细菌特性（例如细胞壁中无胞壁质、细胞膜脂之间由酯质相连，等）外，它们还展 现出独特的结构或生化特性，这使它们能够适应特殊的生境。泉古菌门主要包括超嗜热硫依赖原核生物，广古菌门则包含产甲烷菌和极端嗜盐菌。 
“细菌”或“真细菌”指原核生物域。细菌至少包括以下11个不同种群：（1）革兰氏阳性（gram+）细菌，其中主要有两个分支：（1）高G+C组（放线菌、分枝杆菌、微球菌等）（2）低G+C组（杆菌、梭菌、乳杆菌、葡萄球菌、链球菌、支原体）；（2）变形菌门，例如，紫色光合菌+非光合革兰氏阴性细菌（包括大多数“常见”的革兰氏阴性细菌）；（3）蓝细菌，例如生氧光能菌；（4）螺旋体及相关菌种；（5）浮霉状菌；（6）类杆菌、黄杆菌；（7）衣原体；（8）绿色硫细菌；（9）绿色无硫细菌（也称为厌氧光能菌）；（10）耐辐射微球菌及相关菌种；（11）热袍菌和嗜热栖热腔菌属。 
“革兰氏阴性细菌”包括球菌、非肠道杆菌和肠道杆菌。革兰氏阴性细菌属包括如奈瑟菌、螺旋菌、巴氏杆菌、布鲁氏菌、耶尔森氏菌、弗朗西斯氏菌、嗜血杆菌、博德特氏菌、埃希氏菌属、沙门氏菌、志贺氏菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、弧菌、假单胞菌、类杆菌、醋酸杆菌、产气杆菌、土壤杆菌、固氮菌、螺旋菌、沙雷氏菌、弧菌、根瘤菌、衣原体、立克次氏体、密螺旋体和梭杆菌。 
“革兰氏阳性细菌”包括球菌、无孢杆菌和有孢杆菌。革兰氏阳性细菌属包括如放线菌、杆菌、梭菌、棒状杆菌、丹毒丝菌、乳杆菌、李斯特氏菌、分枝杆菌、粘球菌、诺卡氏菌、葡萄球菌、链球菌和链霉菌。 
术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”在本文中互换使用，指微生物经过基因修饰，用于表达或过度表达内源性多聚核苷酸，或表达非内源性序列如存在于载体的序列或减少表达内源性基因。此多聚核苷酸通常编码与参与产生上述所需的代谢产物的代谢途径的目标酶。因此，本文中描述的重组微生物已经过基因改造，能够表达或过度表达目标酶，此目标酶未被亲本微生物表达或过度表达过。应当了解，术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”不仅指特定的重组微生物，还指此微生物的子代或潜在子代。 
“亲本微生物”指用来制造重组微生物的细胞。术语“亲本微生物”描述了一种自然产生的细胞，即未经过基因修饰的“野生型”细胞。术语“亲本微生物”还描述了一种经过基因修饰的细胞，但是此细胞不能表达或过度表达目标酶，例如参与生物合成途径以能够产生所需的例如以下代谢产物的酶：正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇。例如，一种野 生型微生物通过基因修饰，能够表达或过度表达硫解酶等第一目标酶。此微生物能作为亲本微生物制造修饰微生物，以表达或过度表达第二目标酶，例如羟丁酰CoA脱氢酶。反过来，表达或过度表达如硫解酶和羟丁酰CoA脱氢酶的修饰微生物可经过再修饰，以表达巴豆酸酶等第三目标酶。因此，亲本微生物可作为连续基因修饰的参考细胞。每次修饰通过向参考细胞里引入核酸分子来实现。引入核酸分子有利于表达或过度表达目标酶。应当了解，术语“有利于”包含通过对亲本微生物体内启动子序列的基因修饰来激活编码目标酶的内源性多聚核苷酸。还应了解，术语“有利于”也包含将编码目标酶的外源性多聚核苷酸引入亲本微生物。 
在另一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能将合适的碳底物转化为正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇。此方法包括用编码包括以下多肽的一种或多种重组多聚核苷酸转化一种微生物：例如乙酰羟酸合成酶（如ilvIH操纵子）、乙酰羟酸还原异构酶（如ilvC）、二羟酸脱水酶（如ilvD）、2-酮酸脱羧酶（如PDC6、ARO10、THI3、kivd或pdc）、2-异丙基苹果酸合成酶（如leuA）、β-异丙基苹果酸脱氢酶（如leuB）、异丙基苹果酸异构酶（如leuCD操纵子）、苏氨酸脱水酶（如ilvA）、α-异丙基苹果酸合成酶（如cimA）、β-异丙基苹果酸脱氢酶（如leuB）、异丙基苹果酸异构酶（如leuCD操纵子）、苏氨酸脱水酶（如ilvA）、乙酰乳酸合成酶（如ilvMG或ilvNB）、乙酰羟酸还原异构酶（如ilvC）、二羟酸脱水酶（如ilvD）、β-异丙基苹果酸脱氢酶（如leuB）、分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶（如pheA）、分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶（如tyrA）、2-酮酸脱羧酶（如kivd、PDC6或THI3）和醇脱氢酶活性。编码用于生成代谢物的酶的多聚核苷酸用于重组核酸分子，这些酶包括其同源体、突变体、片段、相关融合蛋白或具有相同功能的物质，所述重组核酸分子引导此类多肽在合适的宿主细胞如细菌或酵母菌细胞内表达。应当了解，如果增加序列不会改变多聚核苷酸的编码活性，例如加入非功能性或非编码序列，则构成对基本核酸的保守性改变。酶的“活性”是测定其催化生成代谢物反应的能力，即“起作用”，可表示为反应生成代谢物的速率。例如，酶活性可用单位时间或单位酶产生的代谢物的量（例如浓度或质量）表示，或用亲和性或电离常数表示。 
“蛋白质”或“多肽”在本文中互换使用，它们包含一条或多条化学结构单元，即通过化学键即肽键联结在一起的氨基酸。“酶”指任何全部或大部分由蛋 白质构成的任何物质，它能在一定程度上特异性地催化或促进一个或多个化学或生化反应。术语“酶”也可指具有催化能力的多聚核苷酸（例如RNA或DNA）。“天然”或“野生型”蛋白质、酶、多聚核苷酸、基因或细胞指自然界中存在的蛋白质、酶、多聚核苷酸、基因或细胞。 
应当了解，上述多聚核苷酸包括“基因”，上述核酸分子包括“载体”或“质粒”。例如，编码酮基硫解酶的多聚核苷酸可由atoB基因或其同源基因编码，或由fadA或其同源基因编码。因此，术语“基因”又称为“结构基因”，指编码特定氨基酸序列的多聚核苷酸，此氨基酸序列构成全部或部分蛋白质或酶，并且可能包含调控的（非转录的）DNA序列，例如启动子序列，此序列决定基因的表达条件。基因的转录区域可能包含非翻译区域，包括内含子、5'-非翻译区域（UTR）、3'-UTR及编码序列。术语“核酸”或“重组核酸”指多聚核苷酸，例如脱氧核糖核酸（DNA）以及在适当的情况下指核糖核酸（RNA）。关于基因序列的“表达”这一术语是指基因的转录，以及在适当的情况下指产生的mRNA转录物翻译为蛋白质这一过程。因此，通过本文可以清楚了解蛋白质的翻译是开放阅读框序列的转录以及翻译的结果。 
术语“操纵子”指从一个共同启动子转录为一个转录单元的两个或多个基因。在某些实施方案中，这些构成操纵子的基因为邻接基因。应当了解，通过修饰共同的启动子可以对整个操纵子的转录进行修饰（如增加、减少或缺失）此外，可以对操纵子内的任何基因或基因组合进行修饰，以改变被编码多肽的功能或活性。修饰可以提高被编码多肽的活性。此外，修饰可以赋予被编码蛋白质新活性。代表性的新活性包括能够使用替代性底物和/或能够在替代性环境条件下起作用。 
“载体”指任何能够在生物体、细胞或细胞组分间传播和/或转移核酸的工具。载体包括病毒、噬菌体、前病毒、质粒、噬菌粒、转座子和人工染色体，例如YACs（酵母菌人工染色体）、BACs（细菌人工染色体）和PLACs（植物人工染色体），及“游离体”类，即能够自主复制或整合进宿主细胞的染色体中。载体也可以是裸体RNA多聚核苷酸、裸体DNA多聚核苷酸、在同一条链上包含DNA和RNA的多聚核苷酸、聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽结合DNA或RNA、脂质体结合DNA，或自然界中不能游离存在的一类多聚核苷酸，或者可以是包含一种或多种上述多聚核苷酸构建体的生物体，例如土壤杆菌或细菌。 
“转化”指将载体引入宿主细胞的过程。可通过包括电穿孔、显微注射、生物弹射（或粒子轰击介导的递送）或农杆菌介导转化的任何一种方式实现转化（或转导、转染）。 
如本发明所属领域的技术人员所公认的，由于遗传密码的简并性，许多具有不同核苷酸序列的DNA化合物可用于编码本发明中的某个氨基酸序列。本文对编码上述生物合成酶的天然DNA序列的引用仅用于描述本发明的一个实施方案，公开的内容包括对本发明提供的方法中利用的酶和多肽的氨基酸序列进行编码的任何序列的DNA化合物。按照类似方式，通常可以允许多肽的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的替代、缺失和插入，而不对其所需的活性造成损害或严重损害。本发明包括具有可置换氨基酸序列的多肽，并且本文所示的DNA序列编码的氨基酸序列仅用于描述本发明的实施方案。 
本发明以重组DNA表达载体或质粒的形式提供核酸分子，如下文详述，此核酸分子编码一种或多种目标酶。一般情况下，此类载体能够在宿主微生物的细胞质内复制或整合进宿主微生物的染色体DNA中。在这两种情况下，此载体是稳定载体（即，即使只存在选择压力，经过多次细胞分裂，此载体仍能存在下去，）或短暂载体（即随着细胞分裂，此载体会逐渐在宿主微生物中丢失）。本发明提供经分离（即不纯，以自然界中没有的丰度和/或浓度存在于制品中）和纯化（即基本上不含污染物质，或基本上不含有自然界中发现的与相应DNA在一起的物质）的DNA分子。 
本文提供一个或多个生物合成基因的异源表达方法以及此方法所用的重组DNA表达载体，这些基因涉及正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和/或2-苯基乙醇的生物合成。因此，包含此类核酸的重组表达载体包括在本发明的范围内。术语“表达载体”指一种能够被引入宿主微生物或无细胞转录和翻译系统的核酸。表达载体可永久或暂时存在于微生物中，不论是作为染色体的一部分或作为其他DNA存在于微生物中或任何细胞器中，例如细胞质中的复制载体。一个表达载体同样含有启动RNA表达的启动子，在微生物或细胞抽提物中RNA通常被翻译成多肽。为了有效地将RNA翻译成蛋白质，表达载体通常还要含有核糖体结合点序列，此序列位于待表达基因编码序列起始密码子的上游。其他元件如增强子、分泌信号序列、转录终止序列以及一个或多个标记基因也可能存在于表达载体中，通过标记基因可以识别和/或选 择含有载体的宿主微生物。当转化细胞在合适的选择培养基中生长时，利用可选标记即具有抗生素抗性或对抗生素敏感的基因赋予转化细胞可选表型。 
表达载体的各种组分可以有很大差异，这取决于载体的用途和供载体进行复制或启动表达的宿主细胞。适用于大肠杆菌、酵母菌、链霉菌及其他常用细胞中基因表达和载体维持的表达载体组分已广为人知，且可以购买。例如，本发明所述的载体含有能够在真核或原核宿主微生物中起作用的合适启动子。启动子可以含有调控序列，来调控与宿主微生物生长有关的表达，或在某种化学或物理刺激下引起基因表达的开启和关闭。对于大肠杆菌和其他细菌宿主而言，可以利用源自生物合成酶、抗生素抗性酶及噬菌体蛋白基因的启动子，这些启动子包括半乳糖启动子、乳糖（lac）启动子、麦芽糖启动子、色氨酸（trp）启动子、β-内酰胺酶（bla）启动子、噬菌体λPL启动子和T5启动子。此外，也可以利用合成启动子，例如tac启动子（第4,551,433号美国专利）。对于大肠杆菌表达载体，包含大肠杆菌的复制起点例如pUC、p1P、p1和pBR是有用的。 
因此，重组表达载体包含至少一个表达系统，反过来，表达系统由至少部分PKS和/或其他可通过操作连结到启动子的生物合成基因编码序列和可选的终止序列组成，启动子和终止序列能够作用，使编码序列在相容的宿主细胞里表达。通过利用本发明所述重组DNA表达载体进行转化，从而对宿主细胞进行修饰，使其含有表达系统序列，此序列可能位于染色体外，或者被整合进染色体中。 
可根据标准PCR扩增技术以及下述实施例中的流程，利用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，并采用合适的低聚核苷酸引物，对本发明所述的核酸进行扩增。被扩增的核酸可被克隆到合适的载体上，并通过DNA序列分析表征。此外，可通过标准技术制备核苷酸序列的相应低聚核苷酸，例如利用DNA自动合成器。 
应当了解，编码与本文所述的酶同源的多肽的分离核苷酸分子，能够通过向编码特定多肽的核苷酸序列引入一个或多个核苷酸置换、增加或缺失制备，这样可向编码蛋白质引入一个或多个氨基酸置换、增加或缺失。可利用标准技术，例如定点诱变和PCR介导诱变，将突变引入多聚核苷酸中。与那些可能需要进行非保守氨基酸置换（见上文）的位点不同，一些位点更适宜进行保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”指用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸。 本发明所属领域对具有相似侧链的氨基酸残基家族进行了定义。这些氨基酸家族包括碱性侧链氨基酸（如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链氨基酸（如天门冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链氨基酸（如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链氨基酸（如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、β-分支侧链氨基酸（如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳烃侧链氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。 
在另一实施方案中，提供了生产正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇的方法。此方法包含存在合适底物的情况下，以及在适于将底物转化为正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基1-丁醇、3-甲基1-丁醇或2-苯基乙醇的条件下，培养本发明提供的重组微生物，可采用技术人员熟知的方法检测本发明提供的微生物产生的醇。此类方法包括质谱法，详见以下说明及表6。适于本发明提供的重组微生物的生长和保存的培养条件见下述实施例。正如技术人员所公认的，此类条件可以根据每种微生物的需求进行修改。 
如前所述，描述本发明所用的包括使用载体、启动子的分子生物学技术以及其他许多相关专题的一般性文档，包括Berger与Kimmel的《分子克隆技术指南》，第152卷《酶学方法》（Academic Press,Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚)("Berger")；Sambrook等的《分子克隆实验手册》第二版，第1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989("Sambrook")和《现代分子生物学实验技术》，F.M.Ausubel等编著，《现代实验技术》，Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.联合出版，（1999年增补）("Ausubel")。足以帮助技术人员掌握体外扩增方法(包括聚合酶链式反应（PCR）、连接酶链式反应（LCR）、Qβ复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导技术（例如NASBA）)以例如用于生产本发明所述的同源核酸的实验技术实例可在以下文献中找到：Mullis等人(1987)U.S.Pat.No.4,683,202;Innis et al.,eds.(1990)PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications(Academic Press Inc.San Diego,Calif.)("Innis");Arnheim&Levinson(Oct.1,1990)C&EN36-47;The Journal Of NIH Research(1991)3:81-94;Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173;Guatelli等人(1990)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA87:1874;Lomell等人(1989)J.Clin.Chem35:1826;Landegren等人(1988)Science241:1077-1080;Van Brunt(1990) Biotechnology8:291-294;Wu and Wallace(1989)Gene4:560;Barringer等人(1990)Gene89:117;and Sooknanan and Malek(1995)Biotechnology13:563-564.Improved methods for cloning in vitro amplified nucleic acids are described in Wallace et al.,U.S.Pat.No.5,426,039.Improved methods for amplifying large nucleic acids by PCR are summarized in Cheng等人(1994)Nature369:684-685及其参考文献，其中产生了高达40kb的PCR扩增子。技术人员会认识到，从本质上讲，任何RNA都能用逆转录酶和聚合酶转变为双链DNA，以适用于限定消化、PCR扩增及测序。详见上述Ausubel、Sambrook和Berger等的文献。 
合适的培养条件包括培养基的pH、离子强度、营养含量等；温度；氧气/CO2/氮气含量；湿度及其允许通过宿主微生物即通过微生物的代谢活动生产化合物的其他培养条件。能够作为宿主细胞的微生物的合适培养条件已熟知。 
本发明通过以下实施例进行阐述，此实施例是以说明的方式而不是限制性的方式提供。 
本发明的代表性微生物根据《布达佩斯条约》于2008年2月7日保存在美国典型菌种保藏中心，地址：美国马纳萨斯弗吉尼亚州20110-2209，大学路10801号，邮编：20108，ATCC号码为PTA-8945（名称为SA237(分类命名：埃希氏杆菌，E.coli)的微生物）和ATCC号码为PTA-8944（名称为CRS-BuOH23(分类命名：埃希氏杆菌，E.coli)的微生物）。保存的微生物存放在经认可的存放处。在保存方最近一次收到发放样本的请求后五年内；或自保存之日起至少三十年内；或处于相关专利的实施寿命内(以最长时间计)，如微生物发生突变、没有活力或遭到破坏，则可对其进行更换。专利一经授权，即会不可撤消地去掉专利申请中关于对公众获得这些细胞系的所有限制。 
实施例 
用于PCR反应的KOD DNA聚合酶购自EMD Chemicals(圣地亚哥，加利福尼亚)。所有限制性内切酶和热敏磷酸酶(antarctic phosphatase)均来自New England Biolabs（伊普斯威奇，马萨诸塞州）。快速DNA连接试剂盒来自Roche（曼海姆，德国）。低聚核苷酸购自Operon（亨茨维尔，阿拉巴马州）培养基中的所有抗生素和试剂均购自Sigma Aldrich（圣路易斯，密苏里州）或Fisher Scientifics（休斯顿，田纳西州）。表10中列出了所使用的低聚核苷酸。 
表10： 
表10采用的菌株、质粒和低聚核苷酸 
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菌株。大肠杆菌BW25113(rrnBT14ΔlacZWJ16hsdR514ΔaraBADAH33ΔrhaBADLD78)在比较时被指定为野生型(WT)(Datsenko and Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97,6640–6645,2000)。在一些异丁醇实验中,JCL16(rrnBT14ΔlacZWJ16hsdR514ΔaraBADAH33ΔrhaBADLD78/F'(traD36,proAB+,lacIq ZΔM15))用作野生型(WT)。利用Keio保藏菌株作为供体，通过P1转导实现宿主metA、tdh、ilvB、ilvI、adhE、pta、ldhA和pflB基因的缺失（Baba等，Mol.Systems Biol.2,2006)。通过位于各连续敲除基因间的pCP20（Datsenko和Wanner，如上所述），以去除被插入到目标基因区域中的kanR。然后，采用合适的引物进行菌落PCR，以验证基因片段的去除情况。XL-1BLUE（Stratagene，拉荷亚，加利福尼亚州CA）用于扩增所有的质粒。 
质粒的构建。按照本文其他地方所述设计和构建pSA40、pSA55和pSA62。用引物lacI SacI f和lacI SacI r从大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增lacI基因。然后，PCR产物经过SacI的消化，并连接到用相同的酶切割过的pSA55开环载体中，切割点位于氨苄西林抗性基因的启动子后，由此生成pSA55I。 
利用大肠杆菌BW25113WT基因组DNA和引物tdcB f Acc65和tdcB r SalIPCR扩增tdcB基因。其PCR产物经过凝胶纯化，并用Acc65和SalI消化。然后，将经过消化的片段连接到用同一对酶切割过的pSA40开放载体中，由此生成pCS14。 
为将pCS14的复制起点从colE1置换为p15A，用SacI和AvrII消化pZA31-luc。较短的片段经过凝胶纯化，被克隆到用相同的酶切割过的pCS14质粒中，由此生成pCS16。 
使用A106和A109作为引物、使用大肠杆菌BW25113基因组DNA作为模板，对操纵子leuABCD进行扩增。其PCR产物经过SalI和BglII的切割，连接到经SalI和BamHI消化过的pCS16中，由此生成pCS20。 
为构建与pSA40相同但具有p15A复制起点的表达质粒，我们将用SacI和AvrII消化pZA31-luc获得的p15A片段克隆到用相同限制性内切酶切割过的pSA40开放载体中，由此生成pCS27。 
采用重叠延伸剪接技术（SOE）以G462Df和G462Dr为引物，大肠杆菌BW25113WT基因组DNA为模板获得leuA*BCD构建leuA*G462D突变体。然后，消化SOE产物，并将其克隆到限制性位点Acc65和XbaI，以此生成PZE_leuABCD。接下来，利用获得的质粒为模板，A106和A109为引物，进行PCR扩增获取leuA*BCD。此产物经过SalI和BglII的切割，连接到经SalI和BamHI消化过的pCS27中，由此生成pCS48。 
以A110和A112为引物，从大肠杆菌BW25113WT基因组DNA扩增出ilvA基因。然后，用Acc65和XhoI切割ilvA基因，并将其连接到用Acc65和SalI消化过的pCS48开放载体中，由此生成pCS51。 
以tdcB f Acc65和tdcB r SalI为引物，从大肠杆菌BW25113WT基因组DNA PCR扩增tdcB基因。得到的PCR产物经过凝胶纯化，并用Acc65和SalI进行消化，然后，连接到用同一对酶切割过的pCS48开放载体中，由此生成pCS50。 
以thrA f Acc65和thrC r HindIII为引物，对WT thrABC进行PCR扩增。获得的产物经过Acc65和HindIII的消化，连接到用同一对酶切割过的pSA40上，由此生成pCS41。 
为将pCS14的复制起点从colE1置换到pSC101，用SacI和AvrII消化pZS24-MCS1。较短的片段经过凝胶纯化，被克隆到用相同的酶切割过的pCS41质粒中，由此生成pCS59。 
以thrA f Acc65和thrC r HindIII为引物，从大量生产苏氨酸的微生物ATCC21277中分离的基因组DNA进行PCR扩增抗反馈抑制突变体thrA*以及thrB和thrC。最终产物经过Acc65和HindIII的消化，连接到用同一对酶切割过的pSA40上，由此生成pCS43。 
为将pCS43的复制起点从colE1置换到pSC101，用SacI和AvrII消化pZS24-MCS1。较短的片段经过凝胶纯化，被克隆到用相同的酶切割过的pCS43质粒中，由此生成pCt49。 
通过P1转导，分别从菌株JWXXX和JWXXX(Baba等)中缺失支链氨基酸转氨酶（由ilvE编码）和酪氨酸转氨酶（由tyrB编码）。 
为了克隆L-缬氨酸生物合成基因i)ilvIHCD(EC)和ii)als(BS)以及ilvCD(EC)，利用SacI和AvrII消化，将pZS24-MCS1中的低拷贝复制起点(ori)转移并连接到i)pSA54和ii)pSA69的相应位点，由此分别生成质粒pIAA1和pIAA11。 
为了从乳酸乳球菌中克隆kivd以及从酿酒酵母中克隆ADH2，利用SacI和AvrII消化以去除pSA55的ColE1复制起点，并用经相同限制性内切酶消化过的pSA54的p15A复制起点置换，由此生成pIAA13。为了更好地控制这些基因的表达，以lacISacIf和lacISacIr为引物，用KOD从大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增lacI，并连接到准备与氨苄西林抗性基因、bla一同表达的pCS22的SacI位点上，由此生成pIAA12质粒。 
为了在染色体的BW25113/F’上过度表达leuABCD操纵子，用PLlacO-1启动子置换天然启动子和前导序列。以lacO1KanSOEf和lacO1LeuA1r为引物，用KOD聚合酶以从pZE12-luc中扩增PLlacO-1启动子。以KanLeuO1f和KanlacO1SOEr为引物，从pKD13中扩增编码抗卡那霉素的基因aph。加入1μL的各反应产物作为模板，并以KanLeuO2f和lacO1LeuA2r为引物，采用SOE技术并以KOD聚合酶进行扩增。以leuKOv1和leuKOv2为引物，从卡那霉素耐受克隆的基因组DNA扩增出所述新构建体，然后，对其进行序列分析以确定克隆的准确性。为了从质粒中过度表达leuABCD操纵子，利用SacI和AvrII去除来自pSA54的p15A复制起点，并连接到pCS22的相应 点位上（ColE1,CmR,PLlacO-1：leuABCD)，由此生成pIAA2质粒。为了更严格的表达，按照前文所述的生成pIAA12的方式对lacI进行扩增，并将其连接到与氯霉素抗性基因cat一同表达的pCS22上，由此生成pIAA15质粒。通过连接经XhoI和NdeI消化过的pIAA15的5.5kb片段以及连接经相同限制性内切酶切割过的pZE12-leuABCD(ColE1,AmpR,PLlacO-1:leuA(G1385A)BCD)2.3kb片段，生成含有编码IPMS(G462D)的leuA(G1385A)的pIAA16质粒。为了控制表达水平，置换pIAA15中的RBS，以与pIAA16相匹配。为此，将经过HindIII和NdeI消化过的pIAA16的5.6kb片段与经相同酶消化过的pIAA15的2.2kb片段连接起来，由此生成pIAA17。 
培养基与培养。对于最初的生产试验，菌株在改良的M9培养基(每升水含6g Na2HPO4，3g KH2PO4，1g NH4Cl，0.5g NaCl，1mM MgSO4，1mM CaCl2，10mg维生素B1)中生长，此培养基包含10g/L的葡萄糖、5g/L的酵母抽提物以及1000X微量金属混合物A5（每升水含2.86g H3BO3，1.81g MnCl2·4H2O，0.222g ZnSO4·7H2O，0.39g Na2MoO4·2H2O，0.079gCuSO4·5H2O，49.4mg Co(NO3)2·6H2O）。-从3ml过夜的LB培养基中取1%接种到置于125mL螺旋盖瓶中的10mL新鲜培养基中，并在37℃旋转摇床上培养4小时。然后，向培养基中加入1ml IPTG在30℃下生长18个小时进行诱导：根据需要加入抗生素（氨苄西林100μg/mL，氯霉素35μg/mL，卡那霉素50μg/mL）。 
对于一些醇发酵实验，从LB平板上挑出单个菌落，并将其接种到含有适量抗生素（氨苄西林100μg/mL、卡那霉素50μg/mL和壮观霉素50μg/mL）的3ml LB培养基中。然后，将此LB培养基置于37℃旋转摇床（250rpm）上过夜培养。之后，再将该过夜培养物接种(1%vol/vol)到置于250ml锥形瓶中的20ml含有以下物质的M9培养基中(6g Na2HPO4，3g KH2PO4，0.5g NaCl，1g NH4Cl，1mM MgSO4，10mg维生素B1和0.1mM CaCl2，每升水)：30g/L的葡萄糖、5g/L的酵母抽提物、适量抗生素以及1000X微量金属混合物A5（每升水含2.86g H3BO3，1.81g MnCl2·4H2O，0.222g ZnSO4·7H2O，0.39gNa2MoO4·2H2O，0.079g CuSO4·5H2O，49.4mg Co(NO3)2·6H2O）。将此培养基置于37℃的旋转摇床（250rpm）上培养，直到其OD600达到0.4～0.6。然后，取12mL培养基转移到250ml螺旋盖锥形瓶中，并加入1mM IPTG进行诱导。将被诱导的培养物置于30℃旋转摇床（240rpm）上培养。在接下来的三到四 天里，打开螺旋盖锥形瓶取样，并采用离心分离或过滤的方式处理培养液，以回收上清液。在所述的一些实验中，在诱导的同时直接加入8g/L苏氨酸到细胞培养物中。 
除非另有说明，所有α-酮酸实验均在“富”氧条件下进行。对于富氧实验，将3mL的LB过夜培养物取1%接种到装在250mL带挡板摇瓶的10mL培养液中。对于缺氧实验，则如前所述对置于125mL螺旋盖烧瓶中的10mL培养液接种。所有培养物都在37℃下培养4小时，并加入1mM IPTG诱导，再在30℃下培养18个小时后收获培养物。 
如前所述执行终产物实验，不同之处为使用置于250mL螺旋盖烧瓶中的20mL含有5g/L葡萄糖的改良M9培养基。 
代谢物检测。用配备火焰离子化检测器的气相色谱仪（GC）对产生的醇类化合物进行定量测定。此系统由5890A GC型（惠普，埃文代尔，宾夕法尼亚州）和7376A型自动进样器、取样器和控制器（惠普）组成。将培养液的上清液（0.1ml）以分流进样模式（分流比为1:15）进样，并使用甲醇作为内标物。 
用购自Agilent Technologies（圣克拉拉，加利福尼亚州）的DB-WAX毛细管柱（30m，0.32mm-内径,0.50μm-膜厚）分离醇产物。初始GC炉温为40℃，保持5min，然后，以15℃/min的梯度逐渐升温，直到升至120℃。接着，以50℃/min的梯度逐渐升温，直到升至230℃，保持4min。以氦气作为载气，进气压力为9.3psi。进样器和检测器保持在225℃。以分流进样模式注射0.5ul培养物上清液，分流比为1:15。使用甲醇作为内标物。 
对于其他分泌的代谢产物，向配备自动取样器（Agilent科技）和BioRad（Biorad实验室，Hercules，加利福尼亚州）Aminex HPX87柱（5mM H2SO4,0.6ml/min,柱温65℃）的Agilent1100HPLC仪载入过滤的上清液（20uL）。通过折光率检测器检测葡萄糖，用光电二极管阵列检测器检测有机酸，检测波长为210nm。对标准曲线应用外推法测定浓度。 
对于其他分泌的代谢产物，将过滤的上清液（0.02mL）加样到配备自动取样器（Agilent科技）和BioRad（Biorad实验室，Hercules，加利福尼亚州）Aminex HPX87柱（0.5mM H2SO4,0.6ml/min,柱温65℃）的Agilent1100HPLC仪上。通过折光率检测器检测葡萄糖，用光电二极管阵列检测器检测有机酸，检测波长为210nm。对标准曲线应用外推法测定浓度。 
L-缬氨酸和L-亮氨酸生物合成途径基因的表达能够产生3-甲基-1-丁醇。为了在大肠杆菌中生成3-甲基-1-丁醇，从丙酮酸到3-甲基-1-丁醇的整条途径都要过度表达。ilvIHCD（大肠杆菌）、kivd（乳酸乳球菌）ADH2（酿酒酵母）都在PLlacO-1启动子的控制下通过质粒（pSA54和pSA55）表达。通过用JCL16中的PLlacO-1启动子置换leuA的上游非编码区域，使leuABCD操纵子得以过度表达。经过18小时的IPTG的诱导，此菌株可生成56mg/L3-甲基-1-丁醇（图47A）。为了提高3-甲基-1-丁醇的产量，使用来自枯草芽孢杆菌的alsS置换ilvIH，置换后显示3-甲基-1-丁醇的产量得以增加（67mg/L）(图47A)。为了增强亮氨酸生物合成途径的表达水平，leuABCD也被克隆到p15A衍生的质粒中，并在PLlacO-1启动子的控制下表达。leuABCD基于质粒的表达提高了含有ilvIH（177mg/L）或alsS(124mg/L)(图47B)菌株中的3-甲基-1-丁醇产量，但alsS的过度表达也导致异丁醇产量的急剧增加。 
宿主中争夺碳和还原能力的途径被缺失。与野生型（WT）背景相比，adhE、frdBC、ldhA、pta、fnr和pflB的缺失提高了大肠杆菌中异丁醇的产量。对于表达alsS的菌株，当3-甲基-1-丁醇途径被转入此菌株时，3-甲基-1-丁醇的最终滴定浓度为76mg/L（图47B）。虽然3-甲基-1-丁醇的累积量减少，但醇产量是由异丁醇决定，其最终浓度超过1.3g/L。由于此过程异丁醇的滴定浓度是目标产物的10倍，因此，对此过程及代谢途径进行检查以解释结果。 
苏氨酸生物合成的去调节。如图50所示，2-酮丁酸和2-酮戊酸分别是正丙醇和正丁醇的前体。2-酮丁酸是源自苏氨酸的常见中间产物，并且是异亮氨酸生物合成的一个前体，2-酮戊酸则是少见的代谢产物，可用于细胞合成非天然氨基酸-正缬氨酸。为了增加用于生产正丁醇的2-酮戊酸累积量，利用质粒pSA62过度表达来自大肠杆菌的基因ilvA和leuABCD以i)引导2-酮丁酸方向的较高代谢通量和ii)使正缬氨酸化学合成途径成为主要的2-酮戊酸生产途径（图50）。Kivd和Adh2也通过pSA55I得以过度表达，使两种酮酸转化为对应的醇。 
除了kivd和ADH2以外，ilvA和leuABCD的过度表达使BW WT中正丙醇和正丁醇的产量提高了5倍，从实际上无法检测的量分别提高到约60mg/L和30mg/L（图51）。然而，氨基酸生物合成在转录和酶水平上的天然反馈调控对苏氨酸的生成有持续影响，从而，导致24小时后正丙醇和正丁醇产量处于稳定状态，异丁醇和乙醇产量则稳步增长，以消耗过量的NADH。 
为了确认苏氨酸限制是不是主要瓶颈，在诱导时向大肠杆菌培养基中加入8g/L苏氨酸。结果证实了此设想：在72小时内，丙醇和丁醇的量逐渐累积并达到2g/L，这两种醇的量大约都增长到了10倍。既然苏氨酸造成的ThrA转录衰减和别构反馈抑制是主要调控机制，在非天然启动子后的ThrA的抗反馈突变体有助于解除对苏氨酸合成的调控，因此能够提高下游醇的产量。抗反馈ThrA（标记为ThrA*，是一种具有超级生产苏氨酸能力的菌株，ATCC21277）。此菌株的thrA*BC操纵子被克隆到pCS49质粒并在PLlacO1启动子的控制下进行表达。为了进行比较，WT thrABC操纵子被克隆到pCS59并在PLlacO1的控制下表达。加入ThrA*BC过度表达后，正丙醇和正丁醇的产量比无ThrA*BC的菌株提高三到四倍（图51）。在相同的BW WT背景下及在BWΔmetA、Δtdh、ΔilvB、ΔilvI,ΔadhE条件下，带有WT ThrABC过度表达的菌株比带有ThrA*BC过度表达的相同菌株的两种目标醇产量低10～20%（图51和图54）。这证实了虽然胞内苏氨酸累积量较少，但仍然能在较低水平上影响WT ThrA的活性。正如异丙醇产量降低所解释的（图51），thrA*BC的存在有助于引导代谢产物通量更多地朝向苏氨酸途径，从而，提高了正丙醇和正丁醇的总生产能力。 
竞争性途径的消除。为了进一步增加丙醇和丁醇生产的滴定浓度，去除参与竞争的不良反应的酶，以避免对期望中间产物的消耗及降解。由于苏氨酸的产生是2-酮丁酸合成中的重要检验点，应首先失活高丝氨酸O-琥珀酰转移酶metA和苏氨酸脱氢酶tdh，以降低期望的蛋氨酸合成前体的损耗，并阻碍苏氨酸生成2-氨基-3-酮丁酸的分解代谢。随着metA和tdh的破坏，正丙醇和正丁醇的总产量增加到约1.2g/L(如图52所示)，其中正丙醇占主要部分。在正丁醇的生产上可以见到这两个基因的缺失影响不太显著，其可能是由于2-酮丁酸被分向参与异亮氨酸途径和/或提供乙酰-CoA的原因。为了进一步保留乙酰-CoA和2-酮丁酸这两个生成正丁醇的主要前体，需破坏缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成中的第一步酶反应。去除乙酰羟酸合成酶同功酶（AHAS I）的大催化亚基（由ilvB编码）以及AHAS III的催化亚基（由ilvI编码）能够导致产生上述氨基酸的营养缺陷体。这两种额外的缺失导致正丁醇产量增加两倍（图52），正丙醇产量保持不变。另外，由于消除了异丁醇和（2-，3-）甲基-丁醇的前体，从而，也几乎中止其生产。异丁醇累积量很少可能是由IlvE催化 的缬氨酸合成途径中最后一步反应的逆反应造成，这一途径导致培养基（补充酵母抽提物）中的缬氨酸被消耗并被反转化为它的前体2-酮基-异戊酸。 
为了降低乙醇产量，需缺失大肠杆菌adhE基因。虽然adhE的破坏未能显著增加C3和C4醇的总产量，但是由于它使醇的生成量从0.25g/L降到0.1g/L左右，因此，实际上增加了特异性。随着这些基因从基因组中消除，最终菌株（ΔmetA、Δtdh、ΔilvB、ΔilvI、ΔadhE）的正丙醇和正丁醇产量比例接近1:1，且乙醇的积累量很少，异丁醇和(2-,3-)甲基-丁醇的产量处于基础水平。 
对替代性抗反馈抑制酶的测定。由于本发明所述的正丙醇和正丁醇的生产强烈依赖于宿主的氨基酸生物合成机器，因此，需要证实苏氨酸下游的必要醇前体不受细胞中存在的各种氨基酸调控机制的限制，特别是异亮氨酸和亮氨酸分别抑制IlvA和LeuA的酶活性。 
TdcB是大肠杆菌的异化苏氨酸脱水酶，其可替代IlvA催化苏氨酸生成2-酮丁酸的脱氨基作用，同时它又天生对异亮氨酸反馈抑制不敏感。为了评估这种替代性酶对生产的益处，tdcB通过pCS20中的leuABCD在PLlacO1后过度表达。结果显示，TdcB催化的两种目标醇产量比IlvA低70%（图53）。很有可能通过添加酵母抽提物产生的微量异亮氨酸对IlvA酶活性的抑制作用并不显著。因此，在给定的实验条件下，TdcB对反馈抑制的不敏感与其自身的酶活相比显得不太重要。 
类似地，存在于酵母抽提物中的亮氨酸对LeuA的反馈抑制可用于构建并检测leuA*反馈不敏感突变体G462D。通过使用SOE进行定点导向诱变，在leuA*上引入点突变，在pCS51质粒中过度表达产生的leuA*BCD操纵子。如图53所示，反馈不敏感的LeuA*未能提高正丙醇和正丁醇的产量。这再次证实了存在于细胞中的亮氨酸的量很可能低于能够对LeuA酶活性起不良作用的抑制水平。 
从CRS-BuOH23共同产生正丙醇和正丁醇及其副产物。图54显示了具有pCS49、pSA62和pSA55I质粒(CRS-BuOH23)的最终菌株BWΔmetA、Δtdh、ΔilvB、ΔilvI、ΔadhE产生醇和代谢产物的时间过程。在72小时内，丙醇和丁醇的产量几乎呈直线上升，到第三天结束时似乎达到高峰。同样的模式也可见于乙醇生产中。ΔadhE背景中生成的乙醇可能是由于Kivd对丙酮酸的亲和性较小所致。另一方面，醇生产阶段后，主要代谢产物乙酸和乳酸的胞外产量继续显著增长，这可能是乙酰-Coa和NADH过量所致。如图54 所示，对葡萄糖的消耗主要发生于醇生产阶段，并且似乎与细胞生长无关。头24小时过后，细胞停止生长，并在醇生产阶段以后的几天似乎仍然保持停止。 
发酵产物的移除及其对生物燃料生产的影响主要的混合酸发酵基因adhE、ldhA、pta、pflB以各种组合形式被缺失，以进一步表征本发明的C3/C4醇生产体系。如表12所示，乙醇的生产主要消耗过量的NADH，而adhE的破坏则导致乳酸更加显著的积累。当IdhA被缺失后，乙醇的分泌量约为1g/L，而乙酸的产量也有所增加。在pta和ldha敲除菌株中均观察到葡萄糖消耗量的减少。adhE、ldhA、pta的缺失及它们的组合的缺失都会导致丙醇和丁醇产量的降低，pflB对这一方面的影响不太显著。这说明乙酰-CoA的大量积累是由丙酮酸脱氢酶复合体（PDHc）而非PflB复合体的活性造成。 
表11 
发酵基因敲除对目标醇及次要副产物水平的影响 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000721
采用本文所述的材料和方法对细胞进行72小时的培养。表中所示为第72小时时间点的数据。 
通过异源kivd和adh2以及大肠杆菌ilvA、leuABCD和thrA*BC的过度表达，本发明阐述了正丙醇和正丁醇的生产。利用2-酮戊酸生产正丁醇不可避免地会涉及到中间产物2-酮基丁酸和非自然的正缬氨酸生物合成途径。由于Kivd对2-酮酸和2-酮丁酸的亲合力相近，并且2-酮丁酸是LeuA的第二底物，所以正丙醇与正丁醇被一同生产出来，且数量也接近。 
对苏氨酸生物合成的去调节以及对metA和tdh催化的分支途径的消除成功地保持了苏氨酸的积累，并且提高了正丙醇和正丁醇生产的滴定浓度。另一方面，赖氨酸生物合成虽然与苏氨酸途径岔开，但是并没有消除其参与细 菌细胞壁合成的重要中间体二氨基庚二酸。然而，要考虑赖氨酸营养缺陷体的重要性。通过合理的设计，苏氨酸超生产也能体现在lysA缺失的有益影响中。通过利用钝化的AHAS I和III中断缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成途径，可以进一步提高正丁醇生产能力，使正丁醇的产量增加两倍，但是对正丙醇没什么效果。这种选择性增加要归因于：i)可利用的2-酮丁酸和乙酰-CoA增多；ii）亮氨酸途径中，其天然底物释放必要的酶LeuABCD。 
如图54所示，在实验条件下，每种醇的产量约为13～15mg/L/hr。菌株对正丙醇和正丁醇耐受性的增强可进一步提高生产能力。 
转录调控与减弱是氨基酸调控的两种主要机制，由于本发明中的所有必要基因被克隆到非天然启动子之后并被表达且不具有前导序列，因此这两种机制对本发明中的关键酶影响很小。另一方面，不能忽略由酶的氨基酸产物特别是IlvA和LeuA引起的酶别构反馈抑制。TdcB是生物降解型苏氨酸脱水酶，它在过量氨基酸和稀少葡萄糖存在情况下为厌氧生长的细胞提供代谢能。它的表达是通过分解代谢物抑制进行转录控制，并通过降低其对苏氨酸的Km值由其别构效应因子AMP进行激活。由于高浓度的丙酮酸和一些2-酮酸（包括2-酮丁酸）会抑制TdcB的酶活，因此当没有足够的AMP来抵消负面影响时，这些中间代谢物的积累对TdcB酶活力有有害影响，并且，当细胞内缺乏足够的AMP水平时，由于TdcB对苏氨酸的Km值比IlvA的高，脱氨基速率会减慢，因此造成醇的总生产能力的下降，见图53（缺乏异亮氨酸的情况下，提纯的大肠杆菌IlvA的Km=8mM，缺乏AMP的情况下，大肠杆菌TdcB的Km=20mM）。对于LeuA*突变体，有可能是在亮氨酸合成途径中朝2-酮基-异戊酸方向选择的G462D突变体导致了它对2-酮丁酸亲合力的降低。 
减少半好氧培养环境中发酵副产物的努力已经引起了对现有生产系统中NADH(P)H平衡的注意。苏氨酸的生物合成需要消耗三分子的NADPH和两分子的ATP，而起始于2-酮基丁酸的正丁醇和正丙醇的生产所消耗的NADH分别为零净分子和一净分子。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶由基因ppc编码，其组成性作用能够补充苏氨酸途径中消耗的草酰乙酸（OAA）并维持TCA循环的进行。在半好氧条件下，TCA循环的部分活性会导致产生过多的还原能力，因此，乙醇和乳酸等发酵产物可用来消耗过多的NADH。如表11所示，乙醇是更好的NADH消耗者，其消耗的NADH比乳酸产生的NADH多一分子。adhE破坏后，乳酸的分泌会更显著；另一方面，当ldhA缺失时，约1g/L乙 醇累积在培养液中。随着氧气逐渐减少造成的TCA循环活力降低，以及涉及糖酵解的下游途径的失效，乙酸的生产似乎是产生ATP的主要来源及消耗过量乙酰-CoA和/或丙酮酸的来源。通过比较图51和54中的WT菌株和CRS-BuOH23菌株，便能解释丁醇生产与乙酸分泌间的负相关性。正如预期的那样，pta的消除降低了葡萄糖的消耗以及细胞在特定培养体系中的生长。然而，不能消除乙酸的生产，原因正在调查。从培养液中甲酸的缺乏及pflB敲除对细菌的丁醇生产能力影响不显著可以看出，PDHc似乎是乙醇生产阶段的乙酰-CoA的主要提供者。 
最初的假设是，正丁醇的产量要远高于3-甲基-1-丁醇的产量，这是由基因产物kivd和leuA对底物α-酮异戊酸的争夺造成。为了验证这一假设，对异丁醇和3-甲基-1-丁醇的α-酮酸前体即kivd底物进行了检查。为了达到这一目的，在PLlacO-1的控制下将leuABCD和alsS-ilvCD在衍生自ColE1的质粒（源自pSC101的质粒）中进行表达。在缺氧及富氧条件下，此异丁醇前体和leuA底物即α-酮异戊酸（KIV）是主要产物（图48A）。KIV的最终浓度分别为0.25和0.29g/L，而3-甲基-1-丁醇前体即α-酮基异己酸（KIC）未检测到（<5mg/L）。为了增加KIC的累积量，我们将RBS的天然序列改变成更加共有的序列来提高leuA的表达水平。leuA基因产物的的增加表达使KIC的浓度增加到0.20g/L，但KIV仍是主要产物（0.37g/L）（图48A）。该结果表明，3-甲基-1-丁醇产量的降低并不完全出于对KIV的争夺，而是由于leuA基因产物（异丙基苹果酸合成酶）活性低造成。 
异丙基苹果酸合成酶（IPMS）催化KIV与乙酰-CoA的缩合反应。α-酮异戊酸的累积可能是由于α-酮基异己酸合成的游离L-苏氨酸引起IPMS反馈抑制造成。为了解除leuA基因产物的反馈抑制，可以采取两种策略：第一种，采用IPMS（IPMS(G462D）的反馈不敏感突变体；第二种，通过缺失ilvE（支链氨基酸转移酶）和tyrB（酪氨酸转氨酶），使L-亮氨酸合成途径的最后一步反应失活，这两种同工酶负责将α-酮基异己酸转化为L-亮氨酸。 
当IPMS（G462D）被表达时，产物的分配明显流向KIC，最终产物浓度为1.61g/L，而KIV累积量减少到0.17g/L（图48A）。在表达WT IPMS的菌株中，ilvE失活使KIC的产量增加到0.53g/L，ilvE和tyrB的缺失则使KIC的累积量进一步增加到1.23g/L（图48B）。ΔilvE和ΔilvEΔtyrB背景下的KIV产量与ilvE+tyrB+菌株中的KIV产量接近，其最终浓度分别为0.40g/L 和0.37g/L。通过将ΔilvE及ΔilvEΔtyrB宿主菌株与IPMS（G462D）的表达结合起来，KIC的产量可分别增加到2.31g/L和1.95g/L（图48B）。 
由于KIC产量增加，所以用WT IPMS或IPMS（G462D）改变丙酮酸生成3-甲基-1-丁醇的整条反应途径。与酮酸生产相似，在ilvE+tyrB+背景下，带有WT IPMS的菌株仍然产生大量异丁醇（169mg/L），但3-甲基-1-丁醇是主要产物（308mg/L）（图49A）。正如预期的那样，当IPMS（G462D）在ilvE+tyrB+背景下表达时，3-甲基-1-丁醇是主要产物，其最终滴定浓度为459mg/L，异丁醇的累积量仅为15mg/L（图49）。通过突变解除IPMS反馈抑制后，产物分配从使用WT IPMS的1.8:1（3-甲基-1-丁醇:异丁醇）变为超过30:1。其他常见代谢副产物包括丙酮酸、延胡索酸和乙酸的积累量极少（表12）。 
表12 
3-甲基-1-丁醇生成菌株的代谢副产物 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000751
aND=未检测到 
其他代谢产物例如乳酸和琥珀酸均未检测到。 
当测定表达WT leuA基因产物的ΔilvEΔtyrB菌株生产的3-甲基-1-丁醇时，测定结果与包含变异IPMS的菌株相似。3-甲基-1-丁醇的最终累积浓度为553mg/L，而异丁醇仅为42mg/L（图49）。这相当于大于13:1的3-甲基-1-丁醇和异丁醇的产物分配比。 
本发明提供了生产高级醇的合成方法，此醇可以用作下一代生物燃料。本文提供的实施例以大肠杆菌为宿主细胞，对其进行代谢修饰，使其包含重组生物合成途径。但是，应当了解，其他微生物如酿酒酵母也可提供合适的宿主细胞，使其包含重组生物合成途径。这些宿主微生物生长速度快且均为兼性厌氧生物，这就保证了用于大规模生产、灵活经济的工艺设计的可行性。但是， 从其他微生物引入非自然途径这一做法具有一定的缺点：异源途径的表达可能导致代谢失衡，异源代谢产物的累积可能引起细胞毒性。例如，丙酮丁醇梭菌的正丁醇生产途径具有三种带有辅酶A（CoA）的中间代谢产物。这种途径的过度表达会导致游离CoA库被耗尽，从而，扰乱大肠杆菌的代谢。为了实现目标外源产物的高产，需要寻找与宿主相容的途径。本文提供的修饰微生物利用了大肠杆菌的现有代谢能力，以及降解2-酮酸的埃利希途径的最后两步反应的一系列底物，而不是直接将1-丁醇生产的共同途径直接转入非自然宿主大肠杆菌。 
2-酮酸是氨基酸生物合成的中间产物。这些代谢物可通过具有广泛底物范围的2-酮酸脱羧酶（KDC）转化为乙醛，然后，通过醇脱氢酶（ADH）转化为醇。采用这种策略需要两个非天然步骤，即通过将氨基酸生物合成途径的中间代谢物转入醇生产途径来生产生物燃料（图1A）。氨基酸生物合成途径产生各种2-酮酸（图1B）。在当今研究中，有六种不同的2-酮酸用于醇生产。异亮氨酸生物合成途径产生2-酮丁酸和2-酮基-3-甲基-戊酸，它们可分别转化为正丙醇和2-甲基-1-丁醇。缬氨酸生物合成途径产生2-酮基-异戊酸，此化合物是异丁醇的前体。亮氨酸生物合成途径产生2-酮基-4-甲基-戊酸，此化合物是3-甲基-1-丁醇的底物。苯丙氨酸生物合成途径产生苯丙酮酸，此化合物可生成2-苯基乙醇。正缬氨酸生物合成途径是亮氨酸生物合成的副反应，产生正丁醇的底物即2-酮基戊酸。 
2-酮酸脱羧酶活性可由以下基因之一产生：来自酿酒酵母的PDC6；来自乳酸乳球菌的kivd；来自酿酒酵母的THI3(α-酮异己酸脱羧酶)以及来自丙酮丁醇梭菌的pdc。醇脱氢酶（Adh）活性由来自酿酒酵母的ADH2提供。 
缬氨酸由两个丙酮酸分子合成，其反应途径有四步且由四个酶催化，包括AHAS（ilvBN基因产物）、还原异构酶（ilvC基因产物）、二羟酸脱水酶（ilvD基因产物）和转氨酶B（ilvE基因产物）。与其他微生物一样，这些酶也能催化从丙酮酸和2-酮基丙酸生成L-异亮氨酸的合成反应。后者是通过苏氨酸脱水酶（ilvA基因产物）由L-苏氨酸生成。AHAS是支链氨基酸合成的关键酶。缬氨酸引起AHAS I和AHAS III的反馈抑制，前者由ilvBN编码，后者由乙酰羟酸合成酶操纵子ilvIH编码，研究显示其小调控亚基IlvN和IlvH是对缬氨酸的敏感性所必需的。 
此醇类生产策略中的一个酶是KDC，这种酶在植物、酵母和真菌中常见，但是在细菌中比较罕见。产生的乙醛可由Adh转化为醇，Adh存在于许多微生物中。一些KDCs具有广泛的底物范围，另外一些则比较特异。为了测试内源2-酮酸作为大肠杆菌KDC底物的能力，用五种KDC及酿酒酵母的醇脱氢酶2（Adh2）进行了过度生产，这五种KDC包括来自酿酒酵母的Pdc6、Aro10、Thi3；来自乳酸乳球菌的Kivd；以及来自丙酮丁醇梭菌的Pdc。表达这些外源基因的大肠杆菌培养物在含有0.2M葡萄糖的基本培养基中生长。GC-MS分析（见表13）显示，表达kivd或AR010的菌株产生了所有预期的醇。酿酒酵母PDC6和丙酮丁醇梭菌pdc产生的种类没有这么多，而酿酒酵母THI3未表现出预期的活性。 
表13显示了用大肠杆菌KDC和ADH产生的以下醇。 
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结果检测到微量的醛，这说明Adh2具有足够的活性。这个结果证实了Kivd是一种具有活性且功能全面的脱羧酶，因此，适于本发明的目的。 
向表达kivd的大肠杆菌培养物中加入各种2-酮酸（见表12），证实了相应醇类的特异性产量增加2-23倍。2-酮酸的补充也显著降低了其他醇类的产量。结果表明，增加2-酮酸的通量有利于提高醇的生产能力以及醇生产的特异性。 
表13显示在补充以下2-酮酸时的醇产量 
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对现有的大肠杆菌代谢途径进行基因改造，以提高特定2-酮酸的产量，从而生产所需的醇。为了生产异丁醇，对ilvIHCD基因进行扩增，以增强2-酮异戊酸的生物合成（图1B）。大肠杆菌的ilvIH操纵子编码乙酰羟酸合成酶，这是异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成途径中的第一个酶。乙酰羟酸合成酶III同工酶由两个亚基即ilvI基因产物（乙酰乳酸合成酶III的大亚基）和ilvH基因产物（乙酰乳酸合成酶的小亚基）组成，其能够催化大肠杆菌K-12中的异亮氨酸、亮氨酸及缬氨酸的生物合成的第一步共同反应。大肠杆菌的ilvIH操纵子编码乙酰羟酸合成酶，这是异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成途径中的第一个酶。大肠杆菌的ilvC基因编码乙酰羟酸还原异构酶，这是平行进行的异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径中的第二个酶。大肠杆菌的ilvD基因编码二羟酸脱水酶，这是异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径中的第三个酶。 
在质粒中构建由PLlacO1控制的编码ilvI、ilvH、ilvC和ilvD基因的操纵子。然后，将扩增的Ilv途径与合成醇的生产途径合并（Kivd和Adh2）以实现异丁醇生产。作为ilvIHCD途径的表达结果，此菌株产生了23mM异丁醇，此产量比不具备ilvIHCD途径过度表达的菌株的产量高5倍（见下表14和图2A）。 
表14显示通过ilvIHCD途径及其过度表达的醇生产，如下： 
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结果显示此合成途径有效，并且能够为高效的异丁醇生产提供所需的2-酮异戊酸。为了进一步提高异丁醇的产量，缺失一个或多个有助于副产物生成的基因，其中包括adh、ldh、frd、fnr、pflB和/或pta。这些缺失会提高可供ilvIHCD途径使用的丙酮酸水平。事实上，此菌株产出了30mM异丁醇，说明这些缺失有利于异丁醇的生产。此外，此菌株将葡萄糖转化为异丁醇，产率为在16到24小时内每克葡萄糖产生0.21g异丁醇（图2A，右图）。图42所示的其他数据还说明，这些缺失也能增加可供乙酰乳酸合成酶途径使用的丙酮酸水平，从而影响异丁醇的生产，使64小时后异丁醇的产量从JCL16的4.5g/L（61mM)增加到JCL260的13.2g/L（356mM）。结果说明了此策略的潜力，因为产率已达到理论最大值的50%，并且并未对反应途径和生产条件进行详细优化。这种高产率得益于合成途径与宿主细胞生理特性的完全相容。下表中提供了菌株SA237的其他产率数据： 
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30℃ 
M9+0.5%YE 
0.1mM IPTG 
0-112小时内乙醇的产量为0.0037g/g(240mg/L)。 
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起始的36g/L葡萄糖是T=0时的值，在40.1小时时，再向培养基中添加30g葡萄糖。不同小时数的葡萄糖值代表相应时间点的葡萄糖浓度(g/L)（例如，在16小时，约22.8g的葡萄糖被代谢掉）。 
类似的策略被用于制备生产正丁醇的微生物。正丁醇在其天然微生物中的生产途径被用于发酵培养，此途径中的许多酶都是氧气敏感型及CoA依赖型。数据显示，通过在不具有正丁醇发酵途径的大肠杆菌中过度表达kivd或ARO10，此细胞能够在非发酵培养中由葡萄糖生产少量正丁醇（见表13），从而说明此细胞中存在相应的2-酮酸前体即2-酮戊酸。但是，2-酮戊酸不是大肠杆菌的常见代谢物。为了增加2-酮戊酸合成量，利用具有广泛底物特异性的leuABCD途径，此途径的天然底物是2-酮异戊酸（图1B）。通过利用较小的底物如2-酮丁酸-此底物的甲基数比2-酮异戊酸少一个（图1A），可按照与亮氨酸生物合成中类似的转化方式合成2-酮戊酸。2-酮丁酸可由L-苏氨酸在苏氨酸脱水酶的催化下生成，此酶由ilvA基因编码，或采用在问号钩端螺旋体血清型和詹氏甲烷暖球菌中发现的另一种途径，以乙酸和丙酮酸为起始物进行合成。在后一种途径中，2-酮丁酸由柠苹酸通过异丙基苹果酸异构酶（LeuCD）和β-异丙基苹果酸脱氢酶（LeuB）生成。 
为生产正丁醇，我们构建了一种在PLlacO1控制下编码ilvA-leuABCD途径的操纵子。具有ilvA-leuABCD途径的菌株产生了0.6mM正丁醇，这一数量比不具有ilvA-leuABCD途径过度表达的菌株增加了3倍（见下表15和图2B）。 
表15显示通过苏氨酸途径过度表达生产醇 
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此外，当在培养基中补加0.8%的L-苏氨酸时，观察到正丁醇的产量会明显增加到3.2mM，说明可通过IlvA介导的反应（见图2C）由L-苏氨酸生成2-酮戊酸。 
为了进一步提高正丁醇产量，将ilvD基因缺失。此基因编码二羟酸脱水酶-一种既能生成2-酮异戊酸（亮氨酸和缬氨酸的一种前体）又能生成2-酮基-3-甲基戊酸（异亮氨酸的一种前体）的酶。由于以下两个原因此基因的缺失是有益的：首先，ilvD的缺失消除了leuABCD途径的天然底物2-酮异戊酸，从而，减少了竞争性底物抑制；其次，ilvD的缺失消除了Kivd的竞争性底物2-酮基-3-甲基戊酸和2-酮基-4-甲基-戊酸。正如预期的那样，ilvD的缺失提高了正丁醇产量（图2C）。 
由于大肠杆菌中L-苏氨酸的高产已用于商业化生产，所以可以利用上述策略对生产苏氨酸的菌株进行修饰，以制备出能产生正丁醇的菌株。为了进一步改善，有必要增加leuABCD途径对非天然底物2-酮丁酸的活性，并提高Kivd对2-酮戊酸的特异性。由于2-酮丁酸也是正丙醇的底物（图1B），因此， 增加可获得的2-酮丁酸量也能提高正丙醇的产量（图2B和图2C，右图）。从而，增加leuABCD活性及KDC的特异性对正丁醇的高效生产至关重要。 
正丁醇和正丙醇生产菌CRS-BuOH23产生的醇状况和产量如下表所示： 
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合计=正丙醇+正丁醇；最终乙醇：116.2mg/L 
3-甲基-1-丁醇生产菌产生的醇状况和产量如下表所示： 
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两种不同2-甲基-1-丁醇菌产生的醇状况和产率如下表所示： 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000831
大肠杆菌等非天然宿主缺乏对高级醇的耐受性。对微生物而言，异丁醇和正丁醇一样有毒，天然的正丁醇生产菌可以耐受浓度为2%的正丁醇。为了显示耐受性改善的潜在可能，采用连续转移的体外进化法富集能够提高异丙醇耐受性的突变体菌株。数据显示，1.5%的异丁醇抑制野生型大肠杆菌（JCL16）。但是，经过5轮逐步提高异丁醇浓度的继代转移后，在2%的异丁醇中发现了生长的突变体(图3)。这种水平的溶剂耐受性与正丁醇的天然生产菌相似或更好，说明大肠杆菌能够适应高浓度的长链醇。可以利用其它策略如gTME，以进一步改善耐受性。 
本文所述的策略用于用大肠杆菌和其他微生物生产生物燃料。本策略利用了氨基酸生产技术并驱动氨基酸代谢中间物向2-酮酸降解途径进行，以用于醇类的生产。本策略避免了CoA介导的化学反应，此反应存在于天然菌生产正丁醇的途径中，并使工业规模的其他高级复杂醇合成成为可能。生产其他醇的具体策略可根据本文提供的合成路径方便地设计。例如，可通过改变苯丙氨酸的合成途径实现2-苯基乙醇的生产，在大肠杆菌中此途径已被有效扩展。这些策略也可轻松应用于酵母或其他工业微生物。对于异丁醇的合成，其完整的合成途径不依赖于CoA，且仅需丙酮酸作为前体。将这些策略应用于酵母时，这种特性避免了乙酰-CoA的线粒体区室化问题。这些用于异丁醇和正丁醇生产的策略提供的理论产率（0.41g/g葡萄糖）与天然正丁醇产生菌的相同。 
利用本发明所属领域的技术人员熟知的方法来完成基因缺失。简而言之，即使用BW25113(rrnBT14ΔlacZWJ16hsdR514ΔaraBADAH33ΔrhaBADLD78)作为亲本（例如，野生型）微生物。如文献中所述，缺失adhE、ldhA、frdBC、fnr、pflB和ilvD序列（Datsenko和Wanner,Proc Natl Acad Sci U.S.A97:6640(2000)）。以JW2294（Baba等人，Mol Syst Biol2:E1–E11(2006)）作为供体，通过P1转导缺失pta序列。从XL-1BLUE转移F＇以提供lacIq。本研究使用的菌种列于表16中。具体地说，为了缺失pta，去除了第2,412,772-2,414,893个核苷酸；为了缺失frdBC，去除了第4,377,400-4,378,540个核苷酸；为了缺失adhE，去除了第1,294,669-1,297,344个核苷酸；为了缺失ldhA，去除了第1,439,878-1,440,867个核苷酸；为了缺失fnr，去除了第1,396,798-1,397,550个核苷酸；为了缺失pflB，去除了第950,508-952,784个核苷酸。 
表16 
菌株 相关基因型
BW25113 rrnBT14ΔlacZWJ16hsdR514ΔaraBADAH33ΔrhaBADLD78
JCL16 BW25113,F'(traD36,proAB+,lacIq ZDM15)
JCL88 JCL16,ΔadhE,ΔldhA-fnr,ΔfrdBC,Δpta
JCL93 JCL16,ΔadhE,ΔldhA,ΔfrdBC
SA203 JCL16ΔilvD
JCL260 JCL16,ΔadhE,ΔldhA-fnr,ΔfrdBC,ΔpflB,Δpta
JCL167 JCL16,ΔadhE,ΔldhA-fnr,ΔfrdBC
JCL274 JCL16,ΔadhE,ΔldhA,ΔfrdBC,Δpta
JCL168 JCL16,ΔadhE,ΔldhA-fnr,ΔfrdBC,ΔpflB
JCL171 JCL16,ΔadhE,ΔldhA,ΔfrdBC,ΔpflB,Δpta
pSA46包含PDC6序列。以A65和A66作为引物，（ATCC）的基因组DNA为PCR模板扩增PDC6序列（见表17），用Acc65I和SphI消化PCR产物。然后，克隆到用同样的酶切割过的pZE12-luc(3)中。 
pSA49包含ADH2序列。以A67和A68为引物，以酿酒酵母（ATCC）的基因组DNA为PCR模板来克隆ADH2（见表17），用SphI和XbaI消化PCR产物。然后，克隆到用同样的酶切割过的pSA46中。 
通过用p15A置换pSA49的复制起点来构建pSA53，用SacI和AvrII消化pZA31-luc。较短的片段经过纯化克隆到用同样的酶切割过的pSA49质粒中。 
pSA55包含kivd序列，此序列通过以A96和A97为引物、以乳酸乳球菌基因组DNA为模板进行PCR反应获取(见表17)。然后，用Acc65I和SphI消化PCR产物，再克隆到用同样的酶切割过的pSA49中。 
pSA56包含ARO10序列。以A98和A99为引物，以酿酒酵母（ATCC）的基因组DNA为PCR模板扩增ARO10序列（见表17）。用Acc65I和SphI消化PCR产物，然后克隆到用同样的酶切割过的pSA49中。 
pSA57包含THI3序列。以A100和A101为引物，以酿酒酵母（ATCC）的基因组DNA为PCR模板扩增THI3序列（见表17）。用Acc65I消化PCR产物。用SphI消化pSA49，用Klenow片段平端化，然后，用Acc65I消化。这条链与PCR产物相连。 
pSA58包含从丙酮丁醇梭菌获得的pdc序列。以A102和A103为引物，以基因组DNA为PCR模板扩增获得pdc序列（见表17），用Acc65I和SphI消化PCR产物。然后，克隆到用同样的酶切割过的pSA49中。 
通过用PLlacO1取代pZE21-MCS1的PLtetO1序列，以构建pSA40。然后，用AatII和Acc65I消化pZE12-luc，较短片段经过纯化并克隆到经相同酶切割过的pZE21-MCS1质粒中。 
pSA45包含ilvC序列。以A71和A72为引物，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为模板，通过PCR反应获得ilvC序列（见表17）。然后，用SalI和XmaI消化PCR产物，再克隆到用同样的酶切割过的pSA40中。 
pSA47包含ilvD序列。以A74和A84为引物，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为模板，通过PCR反应获得ilvD序列（见表17）。然后，用BspEI和MluI消化PCR产物，再克隆到用SalI和MluI酶切割过的pSA45中。 
pSA51包含ilvI和ilvH序列。以A70和A83为引物，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为PCR模板扩增获得该序列（见表17）。然后，用BsaI和SalI消化PCR产物，再克隆到用Acc65I和SalI酶切割过的pSA40中。 
pSA52包含ilvH下游的ilvC和ilvD序列。用SalI和MluI消化pSA47。较短的片段经过纯化，克隆到用同样的酶切割过的pSA51质粒中。 
通过将用SacI和AvrII消化的pZA31-luc的p15A的复制起点转移到pSA52质粒中构建pSA54。 
pSA59包含leuABCD序列。以A106和A109为引物，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为PCR模板扩增该序列（见表17），用SalI和BglII消化PCR产物。然后，克隆到用SalI和BamHI切割过的pSA40中。 
pSA60包含ilvA序列。以A104和A105为引物，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为PCR模板扩增该序列（见表17）。然后，用Acc65I和XhoI消化PCR产物，再克隆到用Acc65I和SalI切割过的pSA59中。 
将pZA31-luc中的p15A复制起点克隆到pSA60质粒中，以构建pSA62。对本文提供的代表性质粒的部分描述列于表18中。 
pSA66包含alsS序列的3’片段。以A123和A124为引物，以枯草芽孢杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR反应获得alsS序列（见表17）。然后，用Acc65I和SalI消化PCR产物，再克隆到用同样的酶切割过的pSA40中。 
pSA67包含alsS序列。以A125和126为引物，以枯草芽孢杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR反应获得alsS序列的5’片段（见表17）。然后，用BsrGI和XbaI消化PCR产物，再克隆到用Acc65I和XbaI切割过的pSA66中。 
pSA68包含alsS下游的ilvC和ilvD序列。用SalI和MluI消化pSA47。较短的片段经过纯化，克隆到用同样的酶切割过的pSA67质粒中。 
用SacI和AvrII消化pZA31-luc中的复制起点p15A，然后，转移至pSA68质粒中，以构建pSA69。 
表18 
质粒 相关基因型
pSA54 Origin of p15A;PLlacO1::ilvIHCD;kanr
pSA55 Origin of ColE1;PLlacO1::kivd-ADH2;ampr
pSA69 Origin of p15A;PLlacO1::alsS-ilvCD;kanr
用于PCR和克隆过程的低聚核苷酸代表性清单见表17。应当了解，可以根据用于PCR和/或克隆过程的特定序列对此代表性性低聚核苷酸进行修饰。 
表17 
Figure DEST_PATH_GDA0000387347510000881
在异丁醇生产的代表性的过程中，用pSA69和pSA55质粒对宿主菌株JCL260进行转化。转化涂板培养基为LB+0.5%葡萄糖+50mg/L卡那霉素+200mg/L氨苄西林。将新鲜转化子接种到2mL培养基中，培养基的成分为：LB+0.5%葡萄糖+50mg/L卡那霉素+200mg/L氨苄西林。然后，在37℃和290rpm转速下对培养物进行过夜培养。 
从过夜培养物中取200μL接种到置于250mL螺旋盖烧瓶的20mL培养基M9+1x微量金属混合物A5+7.2%葡萄糖+3%胰蛋白胨+30mg/L卡那霉素+100mg/L氨苄西林中。然后，将此培养物置于37℃/260rpm下培养。当OD600在1-2(～5hr)之间时，用0.1mM IPTG诱导培养物，再在30℃/260rpm下培养24小时。 
应当通过过滤法（硫胺素）或高压蒸汽消毒灭菌法对上述溶液分别灭菌。培养基采用过滤法灭菌。 
采用气相色谱法测定异丁醇的产量，测定结果见表42-44。在图42中，培养方法如下：制备含有以下物质的M9培养基：7.2%葡萄糖，0.5%酵母提取物，100μg/mL氨苄西林，30μg/mL卡那霉素和1000×微量金属混合物A5。各种包含pSA55和pSA69的敲除菌株在含有3mL LB培养基的试管内于37℃下在旋转摇床（250rpm）上过夜预培养。然后，按1:100的比例将此过夜的培养物稀释到装在250ml螺旋盖锥形瓶的20mL新鲜培养基中。细胞在37℃下生长至OD6002.0左右，然后，添加0.1mM IPTG。添加IPTG后，置于旋转摇床（250rpm）上并在30℃下培养64小时。在16小时、40小时和64小时时打开螺旋盖取样，用GC/FID分析培养样本。在图43中，培养过程如下：制备含有以下物质的M9培养基：3.6%葡萄糖，100μg/mL氨苄 西林，30μg/mL卡那霉素和1000×微量金属混合物A5。SA237（JCL260，包含pSA55和pSA69）在含有3ml LB培养基的试管内在37℃下在旋转摇床（250rpm）上过夜预培养。然后，以1:100的比例将此过夜的培养物稀释到装在250mL螺旋盖锥形瓶（红色）或250ml锥形瓶（蓝色）的20mL新鲜培养基中。细胞在37℃下生长至OD6000.3左右。然后，添加0.1mM IPTG。添加IPTG后，置于旋转摇床（250rpm）上并在30℃下培养72hr。在24小时、48小时和72小时时对培养样本的异丁醇浓度、OD600和pH进行测定。在图45中，培养过程如下：制备用于培养的M9培养基，其含有：3.6%葡萄糖，100μg/mL氨苄西林，30μg/mL卡那霉素和1000×微量金属混合物A5。再向此培养基中添加0.8%酪蛋白氨基酸（红色）、2%胰蛋白胨（绿色）或0.5%酵母提取物（蓝色）。SA237（JCL260，包含pSA55和pSA69）在含有3mL LB培养基的试管内37℃下在旋转摇床上（250rpm）过夜预培养。然后，以1:100的比例将此过夜的培养物稀释到装在250mL螺旋盖锥形瓶的20mL新鲜培养基中。细胞在37℃下生长至OD6000.8左右。然后，添加0.1mM IPTG。添加IPTG后，置于旋转摇床（250rpm）上并在30℃下培养198小时。在每个时间点测定培养物的异丁醇浓度、葡萄糖浓度、OD600和pH。40小时时，向所有培养物中添加1mL的36%葡萄糖。在112小时时，向含有酪蛋白氨基酸的培养物（红色）和含有胰蛋白胨的培养物（绿色）中加入5mL新鲜培养基；在112小时时，向含有酵母提取物的培养物（蓝色）添加5mL新鲜培养基和2mL的36%葡萄糖。 
上述实施例的目的在于向本发明所属领域技术人员完整公开和描述如何制造和使用公开内容中的设备、系统和方法的实施例，不限定发明者所考虑的发明范围。对本发明所属领域的技术人员显而易见的对实施本发明的上述方法的修改涵盖在下列权利要求的范围内。本说明书提到的所有专利和出版物表明了本发明所属领域的技术人员的当前技能水平。本发明引用的所有参考文献以引用方式并入本文中，引用程度如同单独、完整引用各参考文献。 
本发明已对一些实施方案进行了描述。然而，应当了解，可在不偏离本发明精神和范围情况下对其作出各种修改。因此，其他实施方案也在下述权利要求的范围内。 
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Claims (40)

1.重组微生物，其包含具有2-酮酸脱羧酶活性的异源基因和/或和具有醇脱氢酶活性的异源基因，其中所述重组微生物以0.12-0.41g异丁醇/g葡萄糖和/或0.12-0.42g异丁醇/g丙酮酸的产率产生异丁醇。
2.权利要求1的重组微生物，其中所述微生物在112小时的培养后产生低于240mg/L的乙醇。
3.权利要求1或2的重组微生物，其中当在相似的条件下培养时，通过以0.12-0.41g异丁醇/g葡萄糖和/或0.12-0.42g异丁醇/g丙酮酸的产率产生异丁醇，所述微生物的醇生产状况与具有ATCC专利保藏名称PTA-8945(SA237)的微生物的醇生产状况基本相同。
4.权利要求1的重组微生物，其中异丁醇的产率为0.33-0.36g异丁醇/g葡萄糖和/或0.34-0.37g异丁醇/g丙酮酸。
5.权利要求1的重组微生物，其中异丁醇的产率为在16-64小时的培养后0.36-0.40g异丁醇/g葡萄糖和/或在16-64小时的培养后0.34-0.37g异丁醇/g丙酮酸。
6.权利要求4或5的重组微生物，其中每克葡萄糖的乙醇产率为低于0.0037g/g和/或其中每克丙酮酸的乙醇产率为低于0.0038g/g。
7.权利要求1的重组微生物，其中所述重组微生物包含对乙酰CoA至乙醇的转化的降低或抑制。
8.权利要求1或7的重组微生物，其中所述重组微生物包含选自以下的一种或多种修饰：
(a)乙醇脱氢酶的表达减少；
(b)编码乙醇脱氢酶的一种或多种基因的部分缺失；和
(c)编码乙醇脱氢酶的一种或多种基因的敲除。
9.权利要求8的重组微生物，其中所述乙醇脱氢酶是AdhE，其同源体或变体。
10.权利要求1或7的重组微生物，其中所述重组微生物包含转化选自以下反应的一种或多种酶的表达或增加的表达：
(a)从丙酮酸转化为乙酰乳酸
(b)从乙酰乳酸转化为2，3-二羟基异戊酸
(c)从2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸
(d)从α-酮异戊酸转化为异丁醛
(e)从异丁醛转化为异丁醇。
11.权利要求10的重组微生物，其中所述酶是2-酮酸脱羧酶，其选自Pdc、Pdc1、Pdc5、Pdc6、Aro10、Kivd、KdcA、前述各种酶的同源体或突变体，以及与前述任何一种酶具有至少60％同一性且具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。
12.权利要求11的重组微生物，其中所述2-酮酸脱羧酶由kivD基因或其同源基因编码。
13.权利要求11的重组微生物，其中使异丁醛转化为异丁醇的所述酶是醇脱氢酶。
14.权利要求13的重组微生物，其中所述醇脱氢酶选自Sfa1、Adh2、Adh1、Adh3、Adh4、Adh5、Adh6、前述任一酶的同源体或变体以及与前述任何一种酶具有至少60％同一性且具有醇脱氢酶活性的多肽。
15.权利要求1的重组微生物，其中，所述重组微生物包含基因的一处或多处缺失或敲除，所述基因编码酶，所述酶催化：丙酮酸转化为乙醇；乙酰-CoA转化为乙醇；丙酮酸转化为乳酸；延胡索酸转化为琥珀酸；乙酰-CoA和磷酸转化为CoA和乙酰磷酸；乙酰-CoA和甲酸转化为CoA和丙酮酸；乙酰-CoA的乙酰基和3-甲基-2-氧代丁酸(2-氧代异戊酸)的缩合；2-异丙基苹果酸和3-异丙基苹果酸之间的异构化；a-酮酸转化为支链氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或亮氨酸的合成；丙酮酸转化为乙酰-CoA；支链氨基酸的形成；从苏氨酸生成a-酮丁酸；蛋氨酸生物合成的第一步反应；以及苏氨酸的分解代谢。
16.权利要求1或15的重组微生物，其中所述重组微生物包含选自下组基因的一处或多处基因缺失：adhE、ldhA、pflB、frdBC、fnr、pta、leuA、leuB、leuC、leuD、ilvE、tyrB、poxB、ilvB、ilvI、ilvA、metA、tdh和前述任一基因的同源基因及自然产生的变体。
17.权利要求1或15的重组微生物，其中所述重组微生物包含选自下组基因的缺失或敲除：adhE、ldhA、frdB、frdC、fnr、pta、pflB、leuA、ilvE、poxB、ilvA及其任何组合，并进一步包含kivD、ThrABC和adh2的表达或增加的表达。
18.重组微生物，与其亲本微生物相比，包含以下酶的增加的表达或活性：
a)乙酰羟酸合成酶；
b)乙酰羟酸还原异构酶；
c)二羟酸脱水酶；
d)2-酮酸脱羧酶；和
e)醇脱氢酶；
并且其中所述重组微生物包含至少一个编码涉及丙酮酸转化为乙醇的基因的敲除或破坏；
其中，所述重组微生物产生异丁醇。
19.重组微生物，与其亲本微生物相比，包含以下酶的增加的表达或活性：
a)乙酰乳酸合成酶；
b)乙酰羟酸还原异构酶；
c)二羟酸脱水酶；
d)2-酮酸脱羧酶；和
e)醇脱氢酶；
并且其中所述重组微生物含有至少一个编码选自以下酶的基因敲除或破坏：乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、延胡索酸还原酶、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸甲酸裂解酶、甲酸乙酰基转移酶及其任何组合；
其中，所述重组微生物产生异丁醇。
20.产生异丁醇的方法，所述方法包含：
a)提供权利要求1、2、7、10、13、18和19任一项的重组微生物；
b)在存在合适的底物或代谢中间物并且在适于将所述底物转化为异丁醇的条件下培养a)的微生物；
c)基本纯化所述异丁醇。
21.权利要求20的方法，其中所述底物或代谢中间物包括2-酮异戊酸。
22.产生将合适的底物或代谢中间物转化为异丁醇的重组微生物的方法，所述方法包括用一种或多种编码包括以下酶活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物：乙酰羟酸合成酶活性、乙酰羟酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性，并且其中所述重组微生物被工程改造以破坏乙醇脱氢酶活性和/或乳酸脱氢酶。
23.权利要求22的方法，其中通过以0.12-0.41g异丁醇/g葡萄糖和/或0.12-0.42g异丁醇/g丙酮酸的产率产生异丁醇，按照此方法生产的重组微生物包括在存在葡萄糖时产生的醇状况与
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专利保藏名称PTA-8945(命名为SA237)产生的醇状况基本相似。
24.权利要求1、18或19任一项的重组微生物，其中所述重组微生物衍生自选自以下的微生物：埃希氏菌属、棒状杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、沙门氏杆菌属、肠杆菌属、肠球菌属、蓝细菌属、欧文氏菌属、泛菌属、藻类、摩根菌属、果胶杆菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属、酵母属、德克酵母属(dekkera)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)和毕赤氏酵母属。
25.权利要求24的重组微生物，其中所述埃希氏菌属是大肠杆菌。
26.权利要求24的重组微生物，其中所述酵母属是酿酒酵母。
27.产生选自下组的醇类的重组微生物：
(a)正丙醇，
(b)异丁醇，
(c)正丁醇，
(d)2-甲基1-丁醇
(e)3-甲基1-丁醇
(f)2-苯基乙醇
其中
a)醇类从包含2-酮酸的代谢物产生，并且其中所述2-酮酸通过2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶被转化为所述醇；并且其中
b)所述重组微生物包含基因的一处或多处缺失或敲除，所述基因编码酶，所述酶催化：丙酮酸转化为乙醇；乙酰-CoA转化为乙醇；丙酮酸转化为乳酸；延胡索酸转化为琥珀酸；乙酰-CoA和磷酸转化为CoA和乙酰磷酸；乙酰-CoA和甲酸转化为CoA和丙酮酸；乙酰-CoA的乙酰基和3-甲基-2-氧代丁酸(2-氧代异戊酸)的缩合；2-异丙基苹果酸和3-异丙基苹果酸之间的异构化；α-酮酸转化为支链氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或亮氨酸的合成；丙酮酸转化为乙酰-CoA；支链氨基酸的形成；从苏氨酸生成α-酮丁酸；蛋氨酸生物合成的第一步反应；以及苏氨酸的分解代谢。
28.根据权利要求27的重组微生物，与亲本微生物相比，包含以下酶的增加的表达或活性：
a)2-异丙基苹果酸合成酶；
b)β-异丙基苹果酸脱氢酶；
c)异丙基苹果酸异构酶；
d)苏氨酸脱水酶；
其中，所述重组微生物产生正丁醇。
29.产生将合适的底物或代谢中间物转化为正丁醇的重组微生物的方法，所述方法包括用一种或多种编码包括以下酶活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物：2-异丙基苹果酸合成酶活性、β-异丙基苹果酸脱氢酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和苏氨酸脱水酶活性。
30.权利要求29的方法。其中如此产生的所述重组微生物包含在存在葡萄糖时产生的与
Figure FDA00003531632300051
专利保藏名称PTA-8944(命名为CRS-BuOH23)的醇状况基本相似的醇状况。
31.根据权利要求27的重组微生物，与亲本微生物相比，包含以下酶的增加的表达或活性：
a)α-异丙基苹果酸合成酶；
b)β-异丙基苹果酸脱氢酶；
c)异丙基苹果酸异构酶；和
d)苏氨酸脱水酶；
其中，所述重组微生物产生正丙醇。
32.产生将合适的底物或代谢中间物转化为正丙醇的重组微生物的方法，所述方法包含用一种或多种编码包含以下酶活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物：α-异丙基苹果酸合成酶活性、β-异丙基苹果酸脱氢酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和苏氨酸脱水酶活性。
33.根据权利要求27的重组微生物，与亲本微生物相比，包含以下酶的增加的表达或活性：
a)苏氨酸脱水酶；
b)乙酰羟酸合成酶；
c)乙酰羟酸还原异构酶；
d)二羟酸脱水酶；
e)2-酮酸脱羧酶；
f)醇脱氢酶；
其中，所述重组微生物产生2-甲基-1-丁醇。
34.产生将合适的底物或代谢中间物转化为2-甲基-1-丁醇的重组微生物的方法，所述方法包含用一种或多种编码包含以下酶活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物：苏氨酸脱水酶活性、乙酰羟酸合成酶活性、乙酰羟酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。
35.根据权利要求27的重组微生物，与亲本微生物相比，包含以下酶的增加的表达或活性：
a)乙酰羟酸合成酶或乙酰乳酸合成酶；
b)乙酰羟酸还原异构酶；
c)二羟酸脱水酶；
d)2-异丙基苹果酸合成酶；
e)异丙基苹果酸异构酶；
f)β-异丙基苹果酸脱氢酶；
g)2-酮酸脱羧酶；和
h)醇脱氢酶；
其中，所述重组微生物产生3-甲基-1-丁醇。
36.产生将合适的底物或代谢中间物转化为3-甲基-1-丁醇的重组微生物的方法，所述方法包含用一种或多种编码包含以下酶活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物：乙酰羟酸合成酶活性或乙酰乳酸合成酶活性、乙酰羟酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、2-异丙基苹果酸合成酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性、β-异丙基苹果酸脱氢酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。
37.根据权利要求27的重组微生物，与亲本微生物相比，包含以下酶的增加的表达或活性：
a)分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶；
b)分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶；
c)2-酮酸脱羧酶；和
d)醇脱氢酶；
其中，所述重组微生物产生苯基乙醇。
38.产生将合适的底物或代谢中间物转化为苯基乙醇的重组微生物的方法，所述方法包含用一种或多种编码包含以下酶活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物：分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶活性、分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。
39.命名为SA237并具有
Figure FDA00003531632300061
专利保藏名称PTA-8945的重组微生物。
40.命名为CRS-BuOH23并具有
Figure FDA00003531632300071
专利保藏名称PTA-8944的重组微生物。
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