CN108368514A - 具有l-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌属某种微生物和使用其生产l-异亮氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及具有L‑异亮氨酸生产能力和包含具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质的棒状杆菌属某种微生物，和通过使用其生产L‑异亮氨酸的方法。

Description

具有L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌属某种微生物和使用其 生产L-异亮氨酸的方法
技术领域
本公开内容涉及具有L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌属的微生物，和使用其生产L-异亮氨酸的方法。
背景技术
支链氨基酸指的是三种氨基酸L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸，并且在工业上被用作食品添加剂、药剂等。具体而言，L-异亮氨酸在肌肉中代谢以生成能量，并且参与血红蛋白的生成同时起缓解疲劳和促进生长的作用。因此，L-异亮氨酸具有作为流体制剂(fluid preparation)、营养补充品等的多种用途，并且其作为锻炼补充品(workoutsupplement)的用途正在增加。
L-异亮氨酸由前体丙酮酸和2-丁酮酸通过三种代谢中间物生物合成(JinhwanPark et al.,Appl.Microbial.Biotechnol.85:491-506,2010)。
但是，在L-异亮氨酸的生物合成中，苏氨酸脱水酶(ilvA基因)，其由L-苏氨酸生成2-丁酮酸，并且然后乙酰羟酸合成酶(ilvBN基因)二者经历L-异亮氨酸的反馈抑制。
因此，已知的是通过解除L-异亮氨酸的反馈抑制，参与生物合成的酶的调节在制备生产高产率的L-异亮氨酸的菌株中是重要的要素(Jinhwan Park et al.,Biotechnology Journal,560-577,2010)。进一步，通过与丙酮酸相同的生物合成途径生成支链氨基酸，并且因此，以高产率大量生产L-异亮氨酸需要在2-丁酮酸之前的步骤中顺利供应L-苏氨酸(韩国专利号10-0823044)。
公开内容
技术问题
本发明人检查了不使用L-苏氨酸作为前体的新型生物合成途径，并且将具有柠苹酸合成酶活性的基因引入L-异亮氨酸的生物合成途径。结果，本发明人确认了该引入提高了L-异亮氨酸的生产，从而完成本公开内容。
技术方案
本公开内容的目标是提供具有引入的新型生物合成途径和具有L-异亮氨酸生产能力的重组微生物。
本公开内容的另一个目标是提供生产L-异亮氨酸的方法，其包括在培养基中培养具有引入的新型生物合成途径的重组微生物；和从微生物或培养基获得L-异亮氨酸。
有益效果
本公开内容的具有L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌属的微生物具有引入的柠苹酸合成酶活性，并且可以通过L-苏氨酸不被用作前体的新型生物合成途径生产高产率的L-异亮氨酸。
本发明的优选实施方式
本公开内容的实现目标的一个方面提供了棒状杆菌属的微生物，其具有L-异亮氨酸生产能力并且包括具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质。
在本公开内容中的术语“L-异亮氨酸”指的是必需氨基酸，并且在结构上指的是式HO2CCH(NH2)CH(CH3)CH2CH3的L-氨基酸，其连同L-缬氨酸和L-亮氨酸对应于支链氨基酸。
在本公开内容中的短语“具有L-异亮氨酸生产能力”指示当在培养基中培养相关微生物时，其展现在培养基或微生物自身中积累L-异亮氨酸的能力。这样的L-异亮氨酸生产能力可以由野生型菌株继承或利用修饰菌株提供或者通过修饰菌株增强。
例如，为了具有L-异亮氨酸生产能力，微生物可以采用用于单独地或组合地修饰微生物的方法，比如获得营养缺陷型的、类似抗性的或代谢控制突变体，或者构建重组菌株，在该重组菌株中参与L-异亮氨酸生物合成的酶的活性被增强。
进一步，在增强参与L-异亮氨酸生物合成的酶的活性的情况下，参与L-异亮氨酸生物合成的靶向基因，具体地ilvG、ilvM、ilvE、ilvD和ilvA基因，可以单独地增强或者两种或更多种基因的组合增强。ilvG、ilvM、ilvE、ilvD和ilvA基因分别编码乙酰羟酸合成酶的同工酶II的大和小亚基、转氨酶、二羟酸脱水酶和苏氨酸脱氨酶。
在本公开内容中的术语“柠苹酸合成酶(EC2.3.1.182)”是用于将乙酰辅酶A和丙酮酸转变为柠苹酸和辅酶A的催化酶。该酶发现于古细菌比如詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)(Howell et al.,J Bacteriol.181:331-333,1999)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interogans)(Xu et al.,J Bacteriol.186:5400-5409,2004)和硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)中，并且参与异亮氨酸的生物合成中的苏氨酸非依赖性途径(Risso et al.,J Bacteriol.190:2266-2274,2008)。该酶对于作为底物的丙酮酸具有高特异性，并且已知为通常被异亮氨酸抑制。
在本公开内容中的术语“具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质”和“编码其的基因”可以非限制性地包括如上面所描述的具有柠苹酸合成酶活性的任何蛋白质和编码其的任何基因。
具体地，具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质可以衍生自甲烷球菌(Methanocaldococcus)，并且更具体地，詹氏甲烷球菌。柠苹酸合成酶具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且编码其的cimA基因具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列。取决于微生物的物种或菌株，显示该活性的蛋白质的氨基酸序列是不同的，或由于遗传密码的简并性，具有相同功能的多种核酸可以编码任何预定的蛋白质，并且因此，序列不限于上面所描述的SEQ IDNO。
进一步，基本上具有柠苹酸合成酶活性的任何蛋白质可以非限制性地包含在本公开内容的范围内，只要该蛋白质基本上具有柠苹酸合成酶的活性，作为显示与SEQ ID NO:170％或更多同源性、具体地与其80％或更多同源性、更具体地与其90％或更多同源性、更具体地与其95％或更多同源性、并且甚至更具体地与其98％或更多同源性的氨基酸序列。
另外地，如果与该序列具有同源性的氨基酸序列基本上具有与SEQ ID NO:1的蛋白质相同或对应的生物学活性，则其部分缺失、修饰、置换或添加的氨基酸序列也显而易见地包含在本公开内容的范围内。
进一步，编码柠苹酸合成酶的基因可以具有编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列。在本文中，由于密码子的简并性或考虑生物体表达蛋白质优选的密码子，多核苷酸可以在蛋白质的氨基酸序列不改变的范围内的编码区中具有多种转变。多核苷酸序列可以，例如，具有SEQ ID NO:2的多核苷酸序列，和与其具有80％或更多同源性、具体地与其具有90％或更多同源性、和更具体地与其具有99％或更多同源性的核苷酸序列，但是不限于此。
进一步，为了获得具有增强的柠苹酸合成酶活性的突变体，本公开内容提供了使用易错PCR获得的CimA(M)的突变体文库作为SEQ ID NO:1的蛋白质的突变体。
具体地，本公开内容的CimA(M)的突变体文库可以包括下列：
CimA(M)m1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(具体地，可能由具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的多核苷酸编码)；
CimA(M)m2，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(具体地，可能由具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列的多核苷酸编码)；
CimA(M)m3，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(具体地，可能由具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的多核苷酸编码)；
CimA(M)m4，其具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列(具体地，可能由具有SEQ ID NO:10的核苷酸序列的多核苷酸编码)；
CimA(M)m5，其具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列(具体地，可能由具有SEQ ID NO:12的核苷酸序列的多核苷酸编码)；
CimA(M)m6，其具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列(具体地，可能由具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的多核苷酸编码)；
CimA(M)m7，其具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列(具体地，可能由具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列的多核苷酸编码)。
进一步，基本上具有柠苹酸合成酶突变体的活性的任何蛋白质可以非限制性地包含在本公开内容的范围内，只要该蛋白质基本上具有柠苹酸合成酶突变体的活性，作为显示与所述SEQ ID NO的氨基酸序列具有具体地80％或更多、更具体地90％或更多、甚至更具体地95％或更多、并且进一步甚至更具体地99％或更多的同源性的氨基酸序列。
在本公开内容中的术语“同源性”指的是与给定氨基酸或核苷酸序列的相似性程度，并且可以表示为百分比。在本公开内容中，具有与给定氨基酸或核苷酸序列相同或相似活性的序列的同源性被表示为“同源性％”。例如，可以使用用于计算参数比如得分、同一性和相似性的标准软件，具体地BLAST 2.0，或通过在限定的严格条件下通过DNA杂交比较序列来鉴定同源性。适合的杂交条件可以在本领域的范围内限定(例如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,1989)，并且可以使用本领域普通技术人员熟知的方法确定。
在具体的实施方式中，本公开内容的微生物可以包括衍生自詹氏甲烷球菌的SEQID NO:1的柠苹酸合成酶，其突变体，和编码选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列的蛋白质的基因。更具体地，期望的基因可以通过将包括每种基因的重组载体转化入微生物来表达。
在本公开内容中的术语“重组载体”指的是DNA构建体，其包含编码期望蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列，其可操作地连接至适合的调控序列以在适合的宿主中表达期望的蛋白质。调控序列包括可以起始转录的启动子、用于调控这种转录的任选的操纵子序列、编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列、和调控转录和翻译的终止的序列。在将重组载体转化入适合的宿主细胞之后，其可以复制或起作用，而不管宿主的基因组如何，并且可以整合入基因组本身。
在本公开内容中使用的重组载体不具体地限制，只要其能够在宿主细胞中复制，并且可以使用本领域中已知的任何载体。常规使用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等。作为质粒载体，可以使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、pET型等。可用于本公开内容的载体不具体地限制，并且可以使用任何已知的表达载体。具体地，可以使用pECCG117、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pUC19、pBR322、pMW118或pCC1BAC载体等。
在示例性实施方式中，宿主细胞可以通过用于染色体插入的载体在染色体中引入编码期望蛋白质的多核苷酸。将多核苷酸引入染色体可以通过本领域中已知的任何方法执行，例如，同源重组，但不限于此。
在本公开内容中的术语“转化”意思是将包含编码靶蛋白的多核苷酸的重组载体引入宿主细胞，使得由该多核苷酸编码的蛋白质可以在宿主细胞中表达。转化的多核苷酸可以是任一种多核苷酸，只要该多核苷酸可以在宿主细胞中表达，而不管该多核苷酸是否被插入染色体或者位于染色体的外部。
另外地，短语“可操作地连接”指的是启动子序列与基因序列之间的功能连接，该启动子序列起始和介导编码本公开内容的靶蛋白的多核苷酸的转录。
同时，在本公开内容的具体的实施方式中，棒状杆菌属的微生物可以进一步包括增强活性的3-异丙基苹果酸脱氢酶和3-异丙基苹果酸脱水酶。
在本公开内容中的短语“蛋白质活性的增强”指的是与野生型或修饰前的蛋白质的活性相比增强的蛋白质活性。具体地，蛋白质活性的增强可以包括活性增加，其起因于编码蛋白质的内源基因的活性的提升、通过内部或外部因子扩增内源基因、用于遏制基因表达的调控因子的缺失、基因拷贝数的增加、外来基因的引入、表达调控序列的修饰特别是启动子的置换或修饰、和基因内的突变。
具体地，3-异丙基苹果酸脱氢酶和3-异丙基苹果酸脱水酶的活性的增强可以通过选自下列的方法执行：
1)增加编码所述蛋白质的多核苷酸的拷贝数；
2)修饰表达调控序列以增加多核苷酸的表达；
3)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强蛋白质的活性；使用于遏制基因表达的调控因子缺失；或
4)其组合；但是，该方法不具体地限于此。
可以以可操作的连接至载体的形式，或者通过插入宿主细胞中的染色体执行增加多核苷酸的拷贝数的方法；但是，方法不具体地限于此。具体地，其可以通过将载体插入宿主细胞进行，其中载体可操作地连接至编码本公开内容的蛋白质的多核苷酸，并且可以复制和起作用，而不管宿主细胞如何。可选地，其可以通过将载体插入宿主细胞增加宿主细胞中染色体内的多核苷酸的拷贝数的方法执行，其中载体可操作地连接至多核苷酸并且能够使得多核苷酸被插入宿主细胞的染色体中。
可以通过在序列上通过核酸序列的缺失、插入、或非保守或保守置换，或其组合诱导突变使得表达调控序列的活性可以增强，或通过将序列替换为具有增强活性的核酸序列，执行修饰表达调控序列以增加多核苷酸的表达的方法；但是，方法不具体地限于此。表达调控序列包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、调控转录和翻译的终止的序列等，但是不具体地限于此。
强的异源启动子代替原始启动子可以在用于多核苷酸表达的单元的上游连接，并且强启动子的实例包括cj7启动子(韩国专利号10-0620092和国际公布号WO 2006/065095)、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子，并且更优选地，作为棒状杆菌源性启动子的cj7启动子可操作地被连接，使得编码蛋白质的多核苷酸的表达速率可以增加。
另外地，可以通过在表达调控序列上通过核酸序列的缺失、插入、或非保守或保守置换，或其组合诱导突变使得多核苷酸序列的活性可以增强，或通过将序列替换为被修饰以具有增强活性的多核苷酸序列，执行修饰染色体上的多核苷酸序列的方法；但是，方法不具体地限于此。
在本公开内容中的术语“3-异丙基苹果酸脱氢酶”和“3-异丙基苹果酸脱水酶”指的是参与L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的生物合成途径的酶。具有该酶活性的蛋白质和编码其的基因可以非限制性地包括具有该酶活性的任何蛋白质和编码其的任何基因。
具体地，在本公开内容中，3-异丙基苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.85)可以衍生自棒状杆菌属的微生物，更具体地，衍生自谷氨酸棒状杆菌。同时，在本公开内容中的3-异丙基苹果酸脱氢酶可以具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。进一步，基本上具有3-异丙基苹果酸脱氢酶活性的作为基本上显示与SEQ ID NO:17具有70％或更多、具体地80％或更多、更具体地90％或更多、甚至更具体地95％或更多、并且进一步甚至更具体地99％或更多的同源性的氨基酸序列的任何蛋白质可以非限制性地包含在本公开内容的范围内。
进一步，编码3-异丙基苹果酸脱氢酶的基因可以具有编码SEQ ID NO:17的氨基酸序列的核苷酸序列。取决于微生物的物种或菌株，显示该活性的蛋白质的氨基酸序列是不同的，或者具有相同功能的多种核酸由于遗传密码的简并性可以编码任何预定的蛋白质，并且因此，基因不限于公开的SEQ ID NO。例如，基因可以具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:18具有80％、具体地90％或更多、和更具体地99％或更多的同源性的核苷酸序列。
另外地，在本公开内容中的3-异丙基苹果酸脱水酶(EC4.2.1.33)可以衍生自棒状杆菌属的微生物，更具体地，衍生自谷氨酸棒状杆菌。同时，在本公开内容中的3-异丙基苹果酸脱水酶由可以具有SEQ ID NO:19和21的氨基酸序列的两个小/大亚基构成。进一步，基本上具有3-异丙基苹果酸脱水酶活性的任何蛋白质可以非限制性地包含在本公开内容的范围中，只要该蛋白质基本上具有3-异丙基苹果酸脱水酶的活性，作为与SEQ ID NO:19和21显示70％或更多、具体地80％或更多、更具体地90％或更多、甚至更具体地95％或更多同源性、并且进一步甚至更具体地99％或更多的同源性的氨基酸序列。
另外地，编码3-异丙基苹果酸脱水酶的基因可以具有编码SEQ ID NO:19和21的氨基酸序列的核苷酸序列。取决于微生物的物种或菌株，显示该活性的蛋白质的氨基酸序列是不同的，或者具有相同功能的多种核酸由于遗传密码的简并性可以编码任何预定的蛋白质，并且因此，基因不限于SEQ ID NO。例如，基因可以具有SEQ ID NO:20和22的核苷酸序列，或者与其具有80％、具体地90％或更多、和更具体地99％或更多的同源性的核苷酸序列。
同时，在本公开内容的具体实施方式中，棒状杆菌属的微生物可以包括参与L-异亮氨酸的生物合成途径的酶，其进一步包括增强的活性。
在本公开内容中，术语“参与L-异亮氨酸的生物合成途径的酶”可以包括天冬氨酸激酶(lysC基因)、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(asd基因)、高丝氨酸脱氢酶(hom基因)、高丝氨酸激酶(thrB基因)、苏氨酸合成酶(thrC基因)、苏氨酸脱水酶(ilvA基因)、氨基转移酶(ilvE基因)等，但是不限于此。
同时，在本公开内容的具体实施方式中，棒状杆菌属的微生物可以进一步包括灭活的丙酮酸脱氢酶。
在本公开内容中的术语“丙酮酸脱氢酶(EC1.2.4.1)”指的是将丙酮酸转化为乙酰辅酶A和CO2的酶。本公开内容可以制备如此菌株：其具有缺失的aceE基因，所述基因编码该酶以增加被用作cimA基因的前体的乙酰辅酶A的供应。
具体地，在本公开内容中的丙酮酸脱氢酶(EC1.2.4.1)可以衍生自棒状杆菌属的微生物，并且更具体地，衍生自谷氨酸棒状杆菌。同时，在本公开内容中的丙酮酸脱氢酶可以具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列。进一步，基本上具有丙酮酸脱氢酶活性的作为基本上显示与SEQ ID NO:25具有70％或更多、具体地80％或更多、更具体地90％或更多、甚至更具体地95％或更多、并且进一步甚至更具体地99％或更多的同源性的氨基酸序列的任何蛋白质可以非限制性地包含在本公开内容的范围内。
另外地，编码丙酮酸脱氢酶的基因可以具有编码SEQ ID NO:25的氨基酸序列的核苷酸序列。取决于微生物的物种或菌株，显示该活性的蛋白质的氨基酸序列是不同的，或者具有相同功能的多种核酸由于遗传密码的简并性可以编码任何预定的蛋白质，并且因此，基因不限于公开的SEQ ID NO。例如，基因可以具有SEQ ID NO:26的核苷酸序列，或者与其具有80％、具体地90％或更多、和更具体地99％或更多的同源性的核苷酸序列。
在本公开内容中的术语“灭活”指的是如下情况：编码相关多肽的基因不表达，由于不完全表达展现活性的降低，或者不产生相关功能多肽——即使基因表达。
另外地，该术语指的是编码相关多肽的基因由于显著低的表达水平而基本上不表达的情况，以及基因被完全灭活的情况。因此，基因的灭活可以是完全的(敲除)或部分的(例如，基因可以是表达低于正常水平的亚效等位基因或者在受基因影响的活性方面显示部分降低的突变基因的产物)。
进一步，在本公开内容中的相关多肽的“灭活”包括与未修饰的菌株相比，多肽活性的消除以及其降低的情况。具体地，在本公开内容中的苏氨酸脱水酶的灭活可以通过选自如下的方法执行：
1)编码该蛋白质的多核苷酸的部分或完全缺失；
2)修饰表达调控序列以降低多核苷酸的表达；
3)修饰染色体上的多核苷酸序列以减弱蛋白质的活性；或
4)其组合；但是，该方法不具体地限于此。
编码蛋白质的多核苷酸的部分或完全缺失的方法可以通过将染色体中编码内源靶蛋白的多核苷酸替换为标记基因或多核苷酸——在其中核酸序列部分缺失——通过用于染色体插入细菌的载体执行。如本文所使用的，术语“部分”可以根据多核苷酸的类型改变，但是可以具体地指1至300个核苷酸，更具体地1至100个核苷酸，和甚至更具体地1至50个核苷酸。
修饰表达调控序列以降低多核苷酸表达的方法可以通过经由核酸序列的缺失、插入或非保守或保守置换或其组合在序列上引入突变，使得表达调控序列的活性可以减弱，或通过将序列替换为具有减弱活性的核酸序列来执行；但是，方法不具体地限于此。表达调控序列包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、调控转录和翻译的终止的序列等；但是不具体地限于此。
进一步，修饰染色体上的多核苷酸序列的方法可以通过经由多核苷酸序列的缺失、插入或非保守或保守置换或其组合在序列上引入突变，或通过将序列替换为被修饰以具有减弱活性的多核苷酸序列来执行；但是方法不限于此。
在本公开内容的另一个具体实施方式中，作为用于生产L-异亮氨酸的微生物的任何微生物可以非限制性地包含在本公开内容的范围内，只要该微生物可以通过引入具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质来表达。微生物的实例可以是埃希氏杆菌属、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠杆菌属(Enterobacter)、耶尔森氏鼠疫杆菌属(Yersinia)、克雷白氏杆菌属(klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)、棒状杆菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、月形单胞菌属(Selenomanas)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、隐秘杆菌属(Arcanobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)等的微生物，并且具体地是棒状杆菌属的微生物，更具体地是谷氨酸棒状杆菌，但是不限于此。
本公开内容的仍另一个方面提供了用于生产L-异亮氨酸的方法，其包括：
在培养基中培养包括具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质的棒状杆菌属的微生物；和
从该微生物或培养基获得L-异亮氨酸，
其中具有引入基因的棒状杆菌属的微生物如上面所描述，该引入基因编码具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质。
简言之，棒状杆菌属的微生物可以具有编码衍生自甲烷球菌的柠苹酸合成酶的引入基因，其中柠苹酸合成酶可以具体地具有选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列。
另外地，在本公开内容中的棒状杆菌属的微生物可以进一步包括增强活性的3-异丙基苹果酸脱氢酶和3-异丙基苹果酸脱水酶。进一步，棒状杆菌属的微生物可以进一步包括灭活的丙酮酸脱氢酶。
具体地，在本公开内容的实例中的棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌，其具有编码柠苹酸合成酶的引入基因。
在该方法中，培养根据本公开内容的棒状杆菌属的微生物可以通过熟知的分批培养、连续培养和补料分批培养来执行，但是不具体地限于此。
具体而言，对于培养条件，适合的pH(例如，5至9的pH，并且具体地，6至8的pH)可以使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)调节，但是不具体地限于此。此外，可以使用消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇酯抑制气泡形成。
氧或含氧的气体混合物可以被引入培养物以维持需氧条件，并且培养物的温度通常为20℃至45℃，具体地25℃至40℃。培养继续直到获得最大量的产生的L-异亮氨酸，并且可以通常花费10小时至160小时以实现这样的目标。L-异亮氨酸可以分泌入培养基或者可以保留在细胞中。
进一步，作为使用的培养基的碳源，可以单独地或组合地使用糖类和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，软脂酸、硬脂酸和亚油酸)、醇类(例如，甘油和乙醇)、有机酸(例如，乙酸)等，但是碳源不限于此。
作为氮源，可以单独地或组合地使用含氮的有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米沉淀物(corn precipitate)、豆粕粉和尿素)、无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等，但是氮源不限于此。
作为磷源，可以单独地或组合地使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、其相应的含钠盐等，但是磷源不限于此。
在本公开内容的具体实施方式中，在用于生产L-异亮氨酸的方法中培养棒状杆菌属的微生物后，可以进一步提供醋酸盐。
对于用于获得通过在方法中培养微生物产生的L-异亮氨酸的方法，可以使用适合的方法从培养液获得目标氨基酸，这取决于本领域中已知的培养方法，例如分批培养、连续培养、补料分批培养等。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱法、结晶、HPLC等，但是用于获得L-异亮氨酸的方法不限于此。
本公开内容的仍另一方面提供了包括具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质的棒状杆菌属的微生物用于生产L-异亮氨酸的用途。
在该用途中，具有引入基因的棒状杆菌属的微生物如上面所描述，该引入基因编码具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质。
如上面所描述的，用于生产本公开内容的L-异亮氨酸的棒状杆菌属的微生物可以通过不使用L-苏氨酸作为前体的新型生物合成途径通过引入柠苹酸合成酶活性生产高产率的L-异亮氨酸。
具体实施方式
实施例1：构建包括衍生自甲烷球菌的cimA基因的重组载体
<1-1>制备衍生自甲烷球菌的cimA基因的片段
为了获得包括编码柠苹酸合成酶的cimA基因(NC_000909.1)的开放阅读框(ORF)的1476bp片段，使用Genomic-tip系统(Qiagen)提取詹氏甲烷球菌DSM 2661的基因组DNA。
衍生自詹氏甲烷球菌DSM 2661的柠苹酸合成酶具有由SEQ ID NO:1表示的491个氨基酸的序列，并且编码其的cimA基因具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
使用提取的基因组DNA(gDNA)作为模板进行聚合酶链反应(下文简称为“PCR”)。在如下条件下使用SEQ ID NO:35和36的引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸60秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得具有期望大小的带，并且产物被标记为“cimA(M)片段”。
引物cimA-5-NdeI(SEQ ID NO:35)：
5′-GCATCATATGATGGTAAGGATATTC-3′
引物cimA-3-XbaI(SEQ ID NO:36)：
5′-CGATCTAGATTAATTCAACAACATGTT-3′
<1-2>构建重组载体p117-cj7-cimA(M)
使用包括衍生自已知的棒状杆菌属的微生物的启动子cj7的p117-cj7-gfp(韩国专利号10-0620092)作为模板进行PCR。如本文所使用，术语“p117”表示pECCG117，其是大肠杆菌-棒状杆菌穿梭载体(Biotechnology Letters 13(10):721-726,1991)。在如下条件下使用SEQ ID NO:27和28的引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火20秒和在72℃下延伸30秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得323bp带，并且产物被标记为“cj7片段”。
引物Pcj7-5-KpnI(SEQ ID NO:27)：
5′-GATGGTACCACCCCAGAAACATCCCAGC-3′
引物Pcj7-3NdeI(SEQ ID NO:28)：
5′-CGATCATATGGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG-3′
使用在上面的实施例<1-1>中制备的cj7片段和cimA(M)片段作为模板进行缝合PCR(sewing PCR)。在如下条件下使用SEQ ID NO:27和36的引物对进行缝合PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸60秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得1799bp带，并且产物被标记为“cj7-cimA(M)片段”。
获得的cj7-cimA(M)片段利用限制酶KpnI和XbaI处理，并且然后与利用相同限制酶处理的线性p117片段连接。
使大肠杆菌DH5α细胞热激转化有构建的载体，然后平板接种在含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，并且在37℃下培养过夜。将一接种环培养的菌落接种入3mL的含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中并且培养过夜，并且然后使用质粒小量制备试剂盒(商品目录号27104，Qiagen，下文相同)获得质粒DNA。
通过利用限制酶KpnI和XbaI处理确认重组载体的构建，并且在下列条件下使用SEQ ID NO:29和30的引物对通过进行PCR鉴定克隆：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸90秒组成。获得的重组载体标记为“p117-cj7-cimA(M)”。
引物117-F(SEQ ID NO:29)：
5′-CCACAGCCGACAGGATGGTGA-3′
引物117-R(SEQ ID NO:30)：
5′-CTCAGGGTGTAGCGGTTCGGT-3′
<1-3>参与2-丁酮酸的生物合成途径的leuBCD基因的片段的制备
为了制备用于增强在2-丁酮酸的生物合成途径中的基因的重组载体，如下面所描述制备编码衍生自棒状杆菌属的微生物的3-异丙基苹果酸脱氢酶和3-异丙基苹果酸脱水酶的leuBCD基因的片段。
为了获得包括编码3-异丙基苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.85)的leuB基因的ORF的1359bp片段，使用Genomic-tip系统(Qiagen)提取谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA。
衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的3-异丙基苹果酸脱氢酶具有由SEQ ID NO:17表示的340个氨基酸的序列，并且编码其的leuB基因具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列。
使用提取的gDNA作为模板进行PCR。在如下条件下使用SEQ ID NO:31和32的引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸60秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得具有期望大小的带，并且产物被标记为“leuB片段”。
引物leuB-5-cimA(SEQ ID NO:31)：
5′-TTGTTGAATTAATCTAGAGGTGACACCCCAGTGG-3′
引物leuB-3-leuC(SEQ ID NO:32)：
5′-TCGCAGCTGCCACCGATATTTAGCTTTGCAGCGC-3′
为了获得包括编码3-异丙基苹果酸脱水酶(EC4.2.1.33)的leuCD基因的ORF的2078bp片段，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的gDNA作为模板进行PCR。
LeuC基因编码3-异丙基苹果酸脱水酶的大亚基，并且衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的leuC基因具有编码具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽的SEQ ID NO:20的核苷酸序列。进一步，leuD基因编码3-异丙基苹果酸脱水酶的小亚基，并且衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的leuD基因具有编码具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的多肽的SEQ IDNO:22的核苷酸序列。
在如下条件下使用SEQ ID NO:33和34的引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸80秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得具有期望大小的带，并且产物被标记为“leuCD片段”。
引物leuC-5-leuB(SEQ ID NO:33)：
5′-GCGCTGCAAAGCTAAATATCGGTGGCAGCTGCGA-3′
引物leuD-3-XbaI(SEQ ID NO:34)：
5′-TGGCGGCCGCTCTAGAGCTTTCGCTATCAGACTG-3′
使用上面获得的leuB片段和leuCD片段作为模板进行缝合PCR。在如下条件下使用SEQ ID NO:31和34的引物对进行缝合PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸120秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得3437bp带，并且产物被标记为“leuBCD片段”。
<1-4>重组载体p117-cj7-cimA(M)-leuBCD的构建
为了制备用于增强在2-丁酮酸的生物合成途径中的基因的重组载体，p117-cj7-cimA(M)——其是在上面的实施例<1-2>中构建的重组载体——利用限制酶XbaI处理，在上面的实施例<1-3>中获得的leuBCD片段利用限制酶XbaI处理，并且然后连接两个片段。
使大肠杆菌DH5α细胞热激转化有构建的载体，然后平板接种在含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，并且在37℃下培养过夜。将一接种环培养的菌落接种入3mL的含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中并且培养过夜，并且然后使用质粒小量制备试剂盒获得质粒DNA。
通过利用限制酶XbaI处理确认重组载体的构建，并且在下列条件下使用SEQ IDNO:29和30的引物对通过进行PCR鉴定克隆：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸180秒组成。获得的重组载体标记为“p117-cj7-cimA(M)-leuBCD”。
<1-5>使用易错PCR制备cimA(M)突变体的片段
为了得到将随机突变引入cimA基因的DNA库，使用在上面实施例<1-1>中获得的cimA(M)片段作为模板和多样化PCR随机诱变试剂盒(商品目录号630703，Clonetech)进行PCR。在如下条件下使用SEQ ID NO:35和36的引物对在产品的使用手册中的表III中的诱变反应的条件4中进行PCR：25个循环，每个由在95℃下变性30秒在68℃下延伸30秒组成。
作为PCR的结果，制备了突变的现有(art)cimA DNA库，其随机地引入核苷酸置换的修饰。在1.0％琼脂糖凝胶上使PCR产物(在下文中，其被称为“cimA(M)m片段”)电泳，然后洗脱以回收。
引物cimA-5-NdeI(SEQ ID NO:35)：
5′-GCATCATATGATGGTAAGGATATTC-3′
引物cimA-3-XbaI(SEQ ID NO:36)：
5′-CGATCTAGATTAATTCAACAACATGTT-3′
<1-6>p117-cj7-cimA(M)m的突变体文库的构建
将在上面的实施例<1-2>中构建的重组载体p117-cj7-cimA(M)m利用限制酶NdeI和XbaI处理，并且与在上面的实施例<1-5>中获得并且利用相同限制酶处理的cimA(M)m片段连接在一起。
使大肠杆菌DH5α细胞热激转化有构建的载体，然后平板接种在含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，并且在37℃下培养过夜。聚集培养的菌落，并且然后使用质粒小量制备试剂盒获得质粒DNA，从而构建“p117-cj7-cimA(M)m的突变体文库”。
实施例2：确认通过引入cimA基因导致的L-异亮氨酸生产能力
为了确认当衍生自甲烷球菌的cimA基因被引入至谷氨酸棒状杆菌时，其是否具有L-异亮氨酸生产能力，构建编码苏氨酸脱水酶的ilvA基因被移除的菌株，并且通过将cimA引入至其检查菌株的L-异亮氨酸生产能力的获得。
苏氨酸脱水酶是将L-苏氨酸转化为2-丁酮酸的酶，L-苏氨酸是L-异亮氨酸生物合成的前体。衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的苏氨酸脱水酶具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且编码其的ilvA基因具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列。进一步，具有苏氨酸脱水酶活性的任何蛋白质非限制性地包含在本公开内容的范围内。
<2-1>缺失ilvA基因的载体的构建
为了获得ilvA基因片段，使用利用Genomic-tip系统(Qiagen)提取自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板执行PCR。在如下条件下使用SEQ ID NO:37和38，以及SEQ ID NO:39和40的每个引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸45秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，并且然后洗脱以获得每个PCR的547bp和467bp带。
使用上面获得的ilvA基因的两个片段作为模板执行缝合PCR。在如下条件下使用SEQ ID NO:37和40的引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸60秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得1014bp带，并且获得的ilvA基因缺失的片段被标记为“DilvA”。
利用限制酶XbaI处理上面获得的DilvA片段，利用相同限制酶处理pDZ载体(韩国专利号10-0924065)以获得线性pDZ片段，并且然后将DilvA和线性pDZ片段连接以构建ilvA基因缺失的重组载体。
使大肠杆菌DH5α细胞热激转化有构建的重组载体，然后平板接种在含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，并且在37℃下培养过夜。将一接种环培养的菌落接种入3mL的含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中并且培养过夜，并且然后使用质粒小量制备试剂盒获得质粒DNA。
通过利用限制酶XbaI处理确认重组载体的构建，并且在下列条件下使用SEQ IDNO:41和42的引物对通过进行PCR鉴定克隆：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸90秒组成。获得的重组载体标记为“pDZ-ilvA(Del)”。
引物ilvA-5-XbaI(SEQ ID NO:37)：
5′-GCATCTAGAGAACACGGACAATGCCAC-3′
引物ilvA-Del-R(SEQ ID NO:38)：
5′-CAAACAGCGTGATGTCCTGAGTGAGCTGCGCT-3′
引物ilvA-Del-F(SEQ ID NO:39)：
5′-AGCGCAGCTCACTCAGGACATCACGCTGTTTG-3′
引物ilvA-3-XbaI(SEQ ID NO:40)：
5′-GCATCTAGAACCTGCGGCACACCTTGGGC-3′
引物Topo-F(SEQ ID NO:41)：
5′-GCAGTGAGCGCAACGCAAT-3′
引物Topo-R(SEQ ID NO:42)：
5′-CGTTGTAAAACGACGGCCA-3′
<2-2>缺失ilvA基因的菌株的构建
在上面的实施例<2-1>中构建的重组载体pDZ-ilvA(Del)通过电穿孔被引入作为亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，并且平板接种在包含25μg/mL卡那霉素的固体培养基上以选择单一菌落。从该菌落，通过二次传代选择pDZ-ilvA(Del)载体被引入染色体的每种菌株，并且然后使用从每种选择的菌株获得的gDNA作为模板进行PCR。在下列条件下使用SEQ ID NO:43和44的引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸90秒组成。
作为PCR的结果，获得缺失ilvA基因的菌株，并且标记为“ATCC13032ΔilvA”菌株。
引物CFilvA(SEQ ID NO:43)：
5′-GATCTGTGATGAGGTGATG-3′
引物CRilvA(SEQ ID NO:44)：
5′-CGTCCTTCCATGACTCTCA-3′
<2-3>参与L-异亮氨酸的生物合成途径的基因片段的制备
为了制备用于增强在L-异亮氨酸的生物合成途径中的基因的重组载体，如下面所描述制备衍生自棒状杆菌属的微生物的lysC、asd、hom、thrB、thrC和ilvA基因的片段。
首先，为了获得包括编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的lysC-asd基因的ORF的NDA片段，如在实施例<2-1>中描述的，使用提取自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板进行PCR。在下列条件下使用SEQ ID NO:45和46的引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸90秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得2666bp带，并且将产物标记为“lysC-asd片段”。
引物lysC-5-KpnI(SEQ ID NO:45)：
5′-TGAGGTACCCATGCGATTGTTAATGC-3′
引物asd-3-SfoI(SEQ ID NO:46)：
5′-CTAGGCGCCAGTGTAGCACTCAAGCGGA-3′
为了获得包括编码高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶的hom-thrB基因的ORF的DNA片段，如在实施例<2-1>中描述的，使用提取自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板进行PCR。在下列条件下使用SEQ ID NO:47和48的引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸90秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得2633bp带，并且将产物标记为“hom-thrB片段”。
引物hom-5-BamHI(SEQ ID NO:47)：
5′-CTAGGATCCCTCACCATTCTCAATGGT-3′
引物thrB-3-BamHI(SEQ ID NO:48)：
5′-CTAGGATCCGCCTTCCTTGTTGGGC-3′
为了获得包括编码苏氨酸合成酶的thrC基因的ORF的DNA片段，如在实施例<2-1>中描述的，使用提取自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板进行PCR。在下列条件下使用SEQ ID NO:49和50的引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸60秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得1703bp带，并且将产物标记为“thrC片段”。
引物thrC-5-SpeI(SEQ ID NO:49)：
5′-TGCACTAGTGAGAACATACAGGTTCCA-3′
引物thrC-3-ilvA(SEQ ID NO:50)：
5′-GGCATTGTCCGTGTTCTTACTTCACGGAAGTG-3′
为了获得包括编码苏氨酸脱水酶的ilvA基因的ORF的DNA片段，如在实施例<2-1>中描述的，使用提取自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板进行PCR。在下列条件下使用SEQ ID NO:51和52的引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸60秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得1862bp带，并且将产物标记为“ilvA片段”。
引物ilvA-5-thrC(SEQ ID NO:51)：
5′-CACTTCCGTGAAGTAAGAACACGGACAATGCC-3′
引物ilvA-3-SpeI(SEQ ID NO:52)：
5′-TGCACTAGTACCTGCGGCACACCTTGGGC-3′
使用上面获得的thrC片段和ilvA片段作为模板进行缝合PCR。在下列条件下使用SEQ ID NO:49和52的引物对进行PCR：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸120秒组成。
在1.0％琼脂糖凝胶上使扩增的PCR产物电泳，然后洗脱以获得3565bp带，并且将产物标记为“thrC-ilvA片段”。
<2-4>用于增强在L-异亮氨酸的生物合成途径中的基因的载体的构建
为了制备用于增强在L-异亮氨酸的生物合成途径中的基因的重组载体，将在上面的实施例<2-3>中获得的lysC-asd片段利用限制酶KpnI和SfoI处理，并且然后与利用限制酶KpnI和EcoRV处理的线性p117片段连接。
以与上面的实施例<1-2>相同的方式获得质粒DNA。为了确认重组载体的构建，在下列条件下使用SEQ ID NO:29和30的引物对通过进行PCR鉴定克隆：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸100秒组成。获得的重组载体被标记为“p117-lysC-asd”。
将在上面的实施例<2-3>中获得的hom-thrB片段利用限制酶BamHI处理，并且然后与使用相同限制酶处理的线性p117-lysC-asd片段连接。
以与上面的实施例<1-2>相同的方式获得质粒DNA。为了确认重组载体的构建，在下列条件下使用SEQ ID NO:29和30的引物对通过进行PCR鉴定克隆：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸180秒组成。获得的重组载体被标记为“p117-lysC-asd-hom-thrB”。
将在上面的实施例<2-3>中获得的thrC-ilvA片段利用限制酶SpeI处理，并且然后与利用相同限制酶处理的线性p117-lysC-asd-hom-thrB片段连接。
以与上面的实施例<1-2>相同的方式获得质粒DNA。为了确认重组载体的构建，在下列条件下使用SEQ ID NO:29和30的引物对通过进行PCR鉴定克隆：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸300秒组成。
获得的重组载体被标记为“p117-IBGC(异亮氨酸生物合成基因簇)”，其是用于增强在L-异亮氨酸的生物合成途径中的基因的重组载体，所述基因包括参与L-异亮氨酸的生物合成的六种基因lysC、asd、hom、thrB、thrC和ilvA基因的片段。
<2-5>L-异亮氨酸生产力的比较
将在上面的实施例<1-2>、<1-4>和<2-4>中构建的重组载体p117-cj7-cimA(M)、p117-cj7-cimA(M)-leuBCD和p117-IBGC通过电穿孔引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，并且平板接种在包含25μg/mL卡那霉素的固体培养基上以选择单一菌落。由该菌落，将每种选择的菌株标记为谷氨酸棒状杆菌“ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)”、“ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD”和“ATCC13032/p117-IBGC”。
进一步，将p117-cj7-cimA(M)和p117-cj7-cimA(M)-leuBCD通过电穿孔引入在上面的实施例<2-2>中制备的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032ΔilvA菌株，并且平板接种在包含25μg/mL卡那霉素的固体培养基上以选择单一菌落。由该菌落，将每种选择的菌株标记为谷氨酸棒状杆菌“ATCC13032ΔilvA/p117-cj7-cimA(M)”和“ATCC13032ΔilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD”。
使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、ATCC13032/p117-IBGC、ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)、ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD、ATCC13032ΔilvA、ATCC13032ΔilvA/p117-cj7-cimA(M)和ATCC13032ΔilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD进行L-异亮氨酸生产力的效价评估。
具体地，将每种菌株接种入包含具有在下面的表1中示出的组成的25mL的含葡萄糖的效价培养基的250mL烧瓶内，并且然后在32℃和200rpm下在培养箱中培养30小时。产生的L-异亮氨酸的浓度在下面的表2中示出。
[表1]
[表2]
菌株 L-异亮氨酸(g/L)
ATCC13032 0.02
ATCC13032/p117-IBGC 0.70
ATCC13032/p117-cj7-cimA(M) 0.83
ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 1.25
ATCC13032ΔilvA 0.00
ATCC13032ΔilvA/p117-cj7-cimA(M) 0.08
ATCC13032ΔilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 0.15
如在上面的表2中公开的，具有ilvA基因的野生型菌株ATCC13032生产0.02g/L的L-异亮氨酸，并且ATCC13032/p117-IBGC——同时引入在L-异亮氨酸的生物合成途径中的基因的转化菌株——产生0.70g/L的L-异亮氨酸，这显示了与野生型菌株相比L-异亮氨酸生产力增加3400％。
进一步，转化菌株ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)和ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD分别产生0.83g/L和1.25g/L的L-异亮氨酸，这显示了与野生型菌株相比，L-异亮氨酸生产力分别增加4050％和6150％。
根据该比较，ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)——一种被转化以将cimA基因引入L-异亮氨酸的现有生物合成途径的菌株——的L-异亮氨酸生产力被确认为优于ATCC13032/p117-IBGC——一种被转化以增强L-异亮氨酸自身的生物合成途径的菌株——的生产力。进一步，ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD——一种利用leuBCD基因进一步增强的转化菌株——的L-异亮氨酸生产力被确认为进一步有能力的。
同时，缺失ilvA基因的ATCC13032ΔilvA菌株失去L-异亮氨酸生产力，而引入cimA基因的ATCC13032ΔilvA/p117-cj7-cimA(M)菌株生产0.08g/L的L-异亮氨酸，并且引入cimA基因和增强leuBCD基因的ATCC13032ΔilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD菌株生产0.15g/L的L-异亮氨酸。
上述结果显示使用通过引入cimA基因的L-异亮氨酸的新型生物合成途径——其不是使用L-苏氨酸作为前体的L-异亮氨酸的现有生物合成途径——生产L-异亮氨酸是可能的。
实施例3：转化的重组菌株的制备和L-异亮氨酸生产力的比较
<3-1>使用棒状杆菌属的野生型微生物制备重组菌株
为了提供被用作cimA基因的前体的乙酰辅酶A，制备在其中编码丙酮酸脱氢酶的aceE基因缺失的野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的醋酸盐营养缺陷型菌株，并且被标记为“ATCC13032ΔaceE”(Schreiner et al.,J Bacteriol.187:6005-18,2005)。
衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的丙酮酸脱氢酶具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且编码其的aceE基因具有SEQ ID NO:26的核苷酸序列。
将在上面的实施例1中制备的重组载体p117-cj7-cimA(M)和p117-cj7-cimA(M)m的突变体文库通过电穿孔引入在上面制备的ATCC13032ΔaceE菌株。将构建的菌株分别标记为“ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)”和“ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)m突变体文库”。
将ATCC13032ΔaceE、ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)和ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)m突变体文库平板接种在含有25μg/mL卡那霉素的固体培养基上以选择单一菌落，并且使用选择的菌株进行L-异亮氨酸生产力的效价评估。
具体地，将菌株接种入包含25mL效价培养基的250mL烧瓶内，该培养基包含以醋酸铵形式的醋酸盐，具有在下面的表3中示出的组成，并且然后在培养箱中在32℃和200rpm下培养30小时。结果，选择具有增加的L-异亮氨酸浓度的七种类型菌落，并且在下面的表4中示出其列举和L-异亮氨酸浓度。
[表3]
[表4]
结果，如在上面的表4中所公开的，作为亲本菌株的ATCC13032ΔaceE菌株生产0.05g/L的L-异亮氨酸，并且转化的菌株生产0.84g/L至2.23g/L的L-异亮氨酸，这显示与亲本菌株相比L-异亮氨酸生产力分别增加1580％至4360％。具体而言，与亲本菌株ATCC13032ΔaceE相比，在这些菌株中，转化的菌株ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)m3记载了最高的L-异亮氨酸生产力。
为了鉴定通过在表4中显示的L-异亮氨酸的增加生产力选择的cimA(M)基因的突变体的突变位点和每个突变的置换的氨基酸，进行测序。
结果，作为CimA(M)m突变体文库，
CimA(M)m1具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且可以由具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的多核苷酸编码；
CimA(M)m2具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且可以由具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列的多核苷酸编码；
CimA(M)m3具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且可以由具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的多核苷酸编码；
CimA(M)m4具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且可以由具有SEQ ID NO:10的核苷酸序列的多核苷酸编码；
CimA(M)m5具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且可以由具有SEQ ID NO:12的核苷酸序列的多核苷酸编码；
CimA(M)m6具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且可以由具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的多核苷酸编码；
CimA(M)m7具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且可以由具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列的多核苷酸编码。
<3-2>使用具有最高活性的选择的p117-cimA(M)m突变体文库的p117-cj7-cimA(M)m3制备重组菌株
利用XbaI处理p117-cj7-cimA(M)m3载体，其在上面的实施例<3-1>中被鉴定为具有最高L-异亮氨酸生产力，并且将该载体与通过利用相同限制酶处理在上面的实施例<1-3>中获得的leuBCD片段获得的DNA片段连接。
使大肠杆菌DH5α细胞热激转化有构建的载体，然后平板接种在含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，并且在37℃下培养过夜。将一接种环培养的菌落接种入3mL的含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中并且培养过夜，并且然后使用质粒小量制备试剂盒获得质粒DNA。
通过利用限制酶XbaI处理确认重组载体的构建，并且在下列条件下使用SEQ IDNO:29和30的引物对通过进行PCR鉴定克隆：30个循环，每个由在95℃下变性30秒、在56℃退火30秒和在72℃下延伸180秒组成。获得的重组载体标记为“p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD”。
将上面的实施例<1-2>的17-cj7-cimA(M)、实施例<1-4>的p117-cj7-cimA(M)-leuBCD、实施例<3-1>的p117-cj7-cimA(M)m3和实施例<3-2>的p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD中每种通过电穿孔引入在实施例<3-1>中使用的ATCC13032ΔaceE菌株，并且平板接种在包含25μg/mL的卡那霉素的固体培养基上以选择单一菌落。
将选择的菌株接种入包含具有在上面的表3中示出的组成的25mL的含葡萄糖的效价培养基的250mL烧瓶内，并且然后在培养箱中在32℃和200rpm下培养30小时以检测L-异亮氨酸生产力。结果在下面的表5中示出。
[表5]
菌株 L-异亮氨酸(g/L)
ATCC13032ΔaceE 0.04
ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M) 0.98
ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 2.09
ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)m3 2.22
ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD 3.76
如在上面的表5中公开的，尽管作为亲本菌株的ATCC13032ΔaceE菌株生产0.04g/L的L-异亮氨酸，但转化菌株ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)生产0.98g/L的L-异亮氨酸和ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD生产2.09g/L的L-异亮氨酸，这显示与亲本菌株的L-异亮氨酸生产力相比0.94g/L和2.05g/L的增加。
进一步，包括在实施例<3-1>中获得的cimA(M)m3突变基因的转化菌株ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)m3和ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD分别生产2.22g/L和3.76g/L的L-异亮氨酸，与亲本菌株相比其生产增加5450％和9300％。因此，该结果证明了cimA(M)m3突变体与其野生型菌株相比在L-异亮氨酸生产力的增加方面更有效。
在上面的实施例中获得的转化菌株之中，ATCC13032ΔaceE/p117-cj7-cimA(M)m3被标记为“谷氨酸棒状杆菌CA10-1002”，根据布达佩斯条约在2015年2月27日保藏于韩国微生物保藏中心，并且给予登录号KCCM11672P。
<3-3>使用产L-异亮氨酸的菌株KCCM11248P制备重组菌株
将在实施例<3-1>和<3-2>中使用的重组载体p117-cj7-cimA(M)、p117-cj7-cimA(M)-leuBCD、p117-cj7-cimA(M)m3和p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD中的每种引入谷氨酸棒状杆菌KCCM11248P——一种产L-异亮氨酸的菌株(韩国专利号10-1335789)，并且平板接种在含有25μg/mL卡那霉素的固体培养基上以选择单一菌落。
将选择的菌株中的每种标记为KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)、KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD、KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3和KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD。
使用具有在下面的表6中示出的组成的L-异亮氨酸效价培养基并且如下面所述在烧瓶中培养菌株检查菌株的L-异亮氨酸生产力。
[表6]
组成 浓度(每升)
葡萄糖 45g
BM 10g
KH2PO4 1.1g
(NH4)2SO4 12.5g
MgSO4·7H2O 1.2g
FeSO4·7H2O 180mg
MnSO4·4H2O 180mg
ZnSO4·5H2O 0.9mg
CuSO4·5H2O 0.9mg
硫胺素-HCl 9mg
d-生物素 1.8mg
Ca-泛酸 9mg
NCA 60mg
HSM 20g
碳酸钙 30g
pH 7.0
具体地，将亲本菌株KCCM11248P和转化菌株KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)、KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD、KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3和KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD接种入包含具有在表6中示出的组成的25mL的含葡萄糖的效价培养基的250mL烧瓶内，并且然后在培养箱中在32℃和200rpm下培养60小时以检查L-异亮氨酸生产力。结果在下面的表7中示出。
[表7]
菌株 L-异亮氨酸(g/L)
KCCM11248P 3.33
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M) 4.04
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 4.82
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3 4.71
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD 11.21
如在上面的表7中所公开的，尽管亲本菌株KCCM11248P生产3.33g/L的L-异亮氨酸，但转化菌株KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)生产4.04g/L的L-异亮氨酸，并且KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD生产4.82g/L的L-异亮氨酸，这显示与亲本菌株的L-异亮氨酸生产力相比0.71g/L和1.49g/L的增加。
同时，转化菌株KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3和KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD分别生产4.71g/L和11.21g/L的L-异亮氨酸，其与亲本菌株相比生产增加41.4％和236.6％。
如在使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的实施例<3-2>的结果中显示的，该结果进一步证明了cimA(M)m3突变体与其野生型菌株相比在L-异亮氨酸生产力的增加方面是更有效的。
根据上文，本公开内容所述领域的技术人员将能够理解，本公开内容可以以其它具体的形式体现而不改变本公开内容的技术概念或必要特征。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅出于说明性目的并且不应当被解释为限制本公开内容的范围。相反，本公开内容意欲覆盖不仅示例性实施方式而且可以包含在本公开内容的精神和范围内的各种替代方案、修改、等价方案和其它实施方式，如由所附权利要求书所限定的。
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 具有L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌属某种微生物和使用其生产L-异亮氨酸的方法
<130> OPA16137-PCT
<150> KR 10-2015-0148157
<151> 2015-10-23
<160> 52
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 491
<212> PRT
<213> 来自詹氏甲烷球菌的cimA
<400> 1
Met Met Val Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Thr
1 5 10 15
Pro Gly Val Ser Leu Thr Pro Asn Asp Lys Leu Glu Ile Ala Lys Lys
20 25 30
Leu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Ile Glu Ala Gly Ser Ala Ile Thr
35 40 45
Ser Lys Gly Glu Arg Glu Gly Ile Lys Leu Ile Thr Lys Glu Gly Leu
50 55 60
Asn Ala Glu Ile Cys Ser Phe Val Arg Ala Leu Pro Val Asp Ile Asp
65 70 75 80
Ala Ala Leu Glu Cys Asp Val Asp Ser Val His Leu Val Val Pro Thr
85 90 95
Ser Pro Ile His Met Lys Tyr Lys Leu Arg Lys Thr Glu Asp Glu Val
100 105 110
Leu Glu Thr Ala Leu Lys Ala Val Glu Tyr Ala Lys Glu His Gly Leu
115 120 125
Ile Val Glu Leu Ser Ala Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Val Asn Phe
130 135 140
Leu Ile Lys Leu Phe Asn Glu Gly Glu Lys Val Gly Ala Asp Arg Val
145 150 155 160
Cys Val Cys Asp Thr Val Gly Val Leu Thr Pro Gln Lys Ser Gln Glu
165 170 175
Leu Phe Lys Lys Ile Thr Glu Asn Val Asn Leu Pro Val Ser Val His
180 185 190
Cys His Asn Asp Phe Gly Met Ala Thr Ala Asn Thr Cys Ser Ala Val
195 200 205
Leu Gly Gly Ala Val Gln Cys His Val Thr Val Asn Gly Ile Gly Glu
210 215 220
Arg Ala Gly Asn Ala Ser Leu Glu Glu Val Val Ala Ala Leu Lys Ile
225 230 235 240
Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Lys Ile Lys Met Glu Lys Leu Tyr Glu Val
245 250 255
Ser Arg Ile Val Ser Arg Leu Met Lys Leu Pro Val Pro Pro Asn Lys
260 265 270
Ala Ile Val Gly Asp Asn Ala Phe Ala His Glu Ala Gly Ile His Val
275 280 285
Asp Gly Leu Ile Lys Asn Thr Glu Thr Tyr Glu Pro Ile Lys Pro Glu
290 295 300
Met Val Gly Asn Arg Arg Arg Ile Ile Leu Gly Lys His Ser Gly Arg
305 310 315 320
Lys Ala Leu Lys Tyr Lys Leu Asp Leu Met Gly Ile Asn Val Ser Asp
325 330 335
Glu Gln Leu Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Lys Glu Phe Gly Asp Leu
340 345 350
Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ala Ile Val Arg Glu Val
355 360 365
Thr Gly Lys Leu Val Glu Glu Lys Ile Lys Leu Asp Glu Leu Thr Val
370 375 380
Val Ser Gly Asn Lys Ile Thr Pro Ile Ala Ser Val Lys Leu His Tyr
385 390 395 400
Lys Gly Glu Asp Ile Thr Leu Ile Glu Thr Ala Tyr Gly Val Gly Pro
405 410 415
Val Asp Ala Ala Ile Asn Ala Val Arg Lys Ala Ile Ser Gly Val Ala
420 425 430
Asp Ile Lys Leu Val Glu Tyr Arg Val Glu Ala Ile Gly Gly Gly Thr
435 440 445
Asp Ala Leu Ile Glu Val Val Val Lys Leu Arg Lys Gly Thr Glu Ile
450 455 460
Val Glu Val Arg Lys Ser Asp Ala Asp Ile Ile Arg Ala Ser Val Asp
465 470 475 480
Ala Val Met Glu Gly Ile Asn Met Leu Leu Asn
485 490
<210> 2
<211> 1476
<212> DNA
<213> 来自詹氏甲烷球菌的cimA
<400> 2
atgatggtaa ggatatttga tacaacactt agagatggag agcaaacacc aggagtttct 60
ttaacaccaa atgataagtt agagatagca aaaaaattgg atgagcttgg agttgatgtt 120
atagaggcag gttcagctat aacttcaaaa ggagagagag aaggaataaa attaataaca 180
aaagaaggtt taaatgcaga aatctgctca tttgttagag ctttacctgt agatattgat 240
gctgccttag aatgtgatgt agatagtgtc catttagtag tgccaacatc tccaatacac 300
atgaaatata agcttagaaa aacagaagat gaggttttag agacagcttt aaaggctgta 360
gagtatgcta aagaacatgg attgattgtt gagttatctg cagaggatgc aacaagaagt 420
gatgtaaatt tcttaataaa actatttaat gaaggggaaa aggttggagc agacagagtt 480
tgtgtttgtg acacagtagg agttttaact ccacaaaaga gtcaggaatt atttaaaaaa 540
ataactgaaa atgttaattt accggtctca gttcattgcc acaacgactt tggaatggct 600
actgctaata cttgctcagc agttttaggt ggagctgttc agtgccacgt aacagttaat 660
ggtattggag agagagcagg aaatgcctca ttggaagagg ttgttgctgc tttaaaaata 720
ctctatggct atgatactaa gataaagatg gaaaagttat atgaggtttc aagaattgtc 780
tcaagattga tgaaacttcc tgttccacca aataaagcaa ttgttgggga caatgcattt 840
gctcatgaag caggaataca tgttgatgga ttaataaaaa atactgaaac ctatgagcca 900
ataaaaccag aaatggttgg gaatagaaga agaattattt tgggtaagca ttctggtaga 960
aaagctttaa aatacaaact tgatttgatg ggcataaacg ttagtgatga gcaattaaat 1020
aaaatatatg aaagagttaa agaatttggg gatttgggta aatacatttc agacgctgat 1080
ttgttggcta tagttagaga agttactgga aaattggtag aagagaaaat caaattagat 1140
gaattaactg ttgtatctgg aaataaaata acaccaattg catctgttaa actccattat 1200
aaaggagaag atataacttt aatagaaact gcttatggtg ttggaccggt agatgcagca 1260
ataaatgctg tgagaaaggc aataagtgga gttgcagata ttaagttggt agagtataga 1320
gttgaagcaa ttggtggagg aactgatgcg ttaatagagg ttgttgttaa attaagaaaa 1380
ggaactgaaa ttgttgaagt tagaaaatca gacgctgata taataagggc ttctgtagat 1440
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<212> PRT
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<220>
<223> CimA(M)m1
<400> 3
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Ser Pro Ile His Met Lys Tyr Lys Leu Arg Lys Thr Glu Asp Glu Val
100 105 110
Leu Glu Thr Ala Leu Lys Ala Val Glu Tyr Ala Lys Glu His Gly Leu
115 120 125
Ile Val Glu Leu Ser Ala Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Val Asn Phe
130 135 140
Leu Ile Lys Leu Phe Asn Glu Gly Glu Lys Val Gly Ala Asp Arg Val
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ttgttggcta tagttagaga agttactgga aaattggtag aagagaaaat caaattagat 1140
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atggaaaaat ttaccaccta caccggcgtt ggcgttccac tgcagcgatc caacgtggac 60
accgaccaga tcatcccagc cgtctacctc aagcgcgtca cccggaccgg cttcgaagac 120
ggactgtttt ccaactggcg ccaaaacgac cccaactttg tcctcaacac cgacacctac 180
aagaacggct ccgttctcgt agcaggccct gactttggca ccggctcctc ccgcgagcac 240
gccgtctggg cactcatgga ctacggcttc cgcgctgtct tctcctcacg attcgccgac 300
atcttccgcg gcaactccgg aaaagcgggc atgctcaccg gcatcatgga acagtccgac 360
atcgaacttc tgtggaagct catggaacaa accccaggcc tcgaactgac cgtgaacctg 420
gaaaagcaga tcgtcaccgc aggcgacgta gtgatcagct tcgaagttga cccctacatc 480
cgctggcgtt tgatggaagg cctcgacgac gctggcctga ccctgcgcaa gctcgatgaa 540
attgaagact acgaggctaa gcgccctgcg tttaagccac gcactaacgc ttaa 594
<210> 23
<211> 436
<212> PRT
<213> 来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的ilvA
<400> 23
Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg
20 25 30
Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu
35 40 45
Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln
50 55 60
Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln
65 70 75 80
Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly
85 90 95
Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln
100 105 110
Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg
115 120 125
Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn
130 135 140
Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr
145 150 155 160
Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly
165 170 175
Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly
180 185 190
Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu
195 200 205
Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile
210 215 220
Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His
225 230 235 240
Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly
245 250 255
Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys
260 265 270
Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys
275 280 285
Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro
290 295 300
Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro
305 310 315 320
Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu
325 330 335
Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys
340 345 350
His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His
355 360 365
Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Thr Leu Phe Glu
370 375 380
Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile
385 390 395 400
His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu
405 410 415
Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr
420 425 430
Glu Tyr Leu Thr
435
<210> 24
<211> 1311
<212> DNA
<213> 来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的ilvA
<400> 24
atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga tggctagcgg agcggagctg 60
attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt cctccgtcat tgcaccaact 120
ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag cggaaatcta ccttaagcgt 180
gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg cgctgaactc tggagcgcag 240
ctcacccaag agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat ctgcaggtaa ccatgcccag 300
ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac gcatctatgt tcctgtgcag 360
actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg gagagtttgt ctccttggtg 420
gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc atgaagatgc agagcgcacc 480
ggcgcaacgc tgatcgagcc tttcgatgct cgcaacaccg tcatcggtca gggcaccgtg 540
gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga gtgcagatca cgtgatggtt 600
ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct acatggctga tatggcacct 660
cgcactgcga tcgttggtat cgaaccagcg ggagcagcat ccatgcaggc tgcattgcac 720
aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg tggacggcgc agcagtcaaa 780
cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc agggtcgcgt gcacatgatg 840
agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc tttaccaaaa cgaaggcatc 900
atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga aggaaatgtc ctttgcacct 960
ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg atgtgctgcg ttatgcggaa 1020
atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact acttcttggt gaacttcccg 1080
caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc tgggaccgga tgatgacatc 1140
acgctgtttg agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg gtactgcgtt ggtgggtatt 1200
cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac gtatggagga atcggcaatt 1260
gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat acttgaccta a 1311
<210> 25
<211> 922
<212> PRT
<213> 来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的aceE
<400> 25
Met Ala Asp Gln Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp Ser Asn
1 5 10 15
Phe Ala Met Ile Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp
20 25 30
Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gln
35 40 45
Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Leu Glu
50 55 60
Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro Met Thr Ser Thr Asp
65 70 75 80
Tyr Val Asn Thr Ile Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp
85 90 95
Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp Ile Arg Trp Asn Ala Ala
100 105 110
Ile Met Val His Arg Ala Gln Arg Pro Gly Ile Gly Val Gly Gly His
115 120 125
Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Val Gly Phe Asn
130 135 140
His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gln Ile Phe
145 150 155 160
Phe Gln Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu
165 170 175
Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gln Glu Val Ser
180 185 190
Arg Glu Gln Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Met Lys
195 200 205
Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp
210 215 220
Ala Ile Tyr Gln Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly Ile
225 230 235 240
Lys Asp Thr Ser Asp Gln His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu
245 250 255
Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu Ile Gln Gln Ala Ala Leu Asn
260 265 270
Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys Asn Leu Gln Arg Leu
275 280 285
Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile Gln Glu Leu Glu Ser
290 295 300
Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val Ile Lys Val Val Trp Gly Arg
305 310 315 320
Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gln Asp Gly Ala Leu Val Glu
325 330 335
Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ala Asn
340 345 350
Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr
355 360 365
Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu Ile Trp Lys Leu Pro
370 375 380
Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala Ala Tyr Lys Arg Ala
385 390 395 400
Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val Ile Leu Ala His Thr Ile Lys
405 410 415
Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His Gln
420 425 430
Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu Phe Arg Asp Lys Gln
435 440 445
Gly Ile Pro Ile Thr Asp Glu Gln Leu Glu Lys Asp Pro Tyr Leu Pro
450 455 460
Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu Ile Lys Tyr Met Lys
465 470 475 480
Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Glu Arg Arg Glu Asn
485 490 495
Tyr Asp Pro Ile Gln Val Pro Pro Leu Asp Lys Leu Arg Ser Val Arg
500 505 510
Lys Gly Ser Gly Lys Gln Gln Ile Ala Thr Thr Met Ala Thr Val Arg
515 520 525
Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu Ala Asp Arg Leu Val
530 535 540
Pro Ile Ile Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly Leu Asp Ser Trp Phe
545 550 555 560
Pro Thr Leu Lys Ile Tyr Asn Pro His Gly Gln Asn Tyr Val Pro Val
565 570 575
Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala Pro Glu Gly Gln Ile
580 585 590
Leu His Glu Gly Ile Asn Glu Ala Gly Ser Val Ala Ser Phe Ile Ala
595 600 605
Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala Met Ile Pro Leu Tyr
610 615 620
Ile Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gln Arg Thr Gly Asp Ser Ile Trp
625 630 635 640
Ala Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Gly Phe Leu Leu Gly Ala Thr Ala
645 650 655
Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gln His Met Asp Gly His
660 665 670
Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val Glu Thr Tyr Asp Pro
675 680 685
Ser Phe Ala Tyr Glu Ile Ala His Leu Val His Arg Gly Ile Asp Arg
690 695 700
Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val Ile Tyr Tyr Ile Thr Ile
705 710 715 720
Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gln Pro Ala Glu Pro Glu Gly Leu Asp Val
725 730 735
Glu Gly Leu His Lys Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr
740 745 750
Gly His Glu Ala Asn Ile Leu Ala Ser Gly Val Gly Met Gln Trp Ala
755 760 765
Leu Lys Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ala Asp Tyr Gly Val Arg Ala Asn
770 775 780
Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala
785 790 795 800
Arg Asn Lys Ala Gln Leu Arg Asn Pro Gly Ala Asp Ala Gly Glu Ala
805 810 815
Phe Val Thr Thr Gln Leu Lys Gln Thr Ser Gly Pro Tyr Val Ala Val
820 825 830
Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gln Ile Arg Glu Trp Val Pro
835 840 845
Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe Ser Asp Thr
850 855 860
Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn Ile Asp Ala Glu Ser Ile Val
865 870 875 880
Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys Ile Asp Val Ser
885 890 895
Val Ala Ala Gln Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Pro Thr Ser
900 905 910
Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu
915 920
<210> 26
<211> 2769
<212> DNA
<213> 来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的aceE
<400> 26
atggccgatc aagcaaaact tggtggcaag ccctcggatg actctaactt cgcgatgatc 60
cgcgatggcg tggcatctta tttgaacgac tcagatccgg aggagaccaa cgagtggatg 120
gattcactcg acggattact ccaggagtct tctccagaac gtgctcgtta cctcatgctt 180
cgtttgcttg agcgtgcatc tgcaaagcgc gtatctcttc ccccaatgac gtcaaccgac 240
tacgtcaaca ccattccaac ctctatggaa cctgaattcc caggcgatga ggaaatggag 300
aagcgttacc gtcgttggat tcgctggaac gcagccatca tggttcaccg cgctcagcga 360
ccaggcatcg gcgtcggcgg acacatttcc acttacgcag gcgcagcccc tctgtacgaa 420
gttggcttca accacttctt ccgcggcaag gatcacccag gcggcggcga ccagatcttc 480
ttccagggcc acgcatcacc aggtatgtac gcacgtgcat tcatggaggg tcgcctttct 540
gaagacgatc tcgatggctt ccgtcaggaa gtttcccgtg agcagggtgg cattccgtcc 600
taccctcacc cacacggtat gaaggacttc tgggagttcc caactgtgtc catgggtctt 660
ggcccaatgg atgccattta ccaggcacgt ttcaaccgct acctcgaaaa ccgtggcatc 720
aaggacacct ctgaccagca cgtctgggcc ttccttggcg acggcgaaat ggacgagcca 780
gaatcacgtg gtctcatcca gcaggctgca ctgaacaacc tggacaacct gaccttcgtg 840
gttaactgca acctgcagcg tctcgacgga cctgtccgcg gtaacaccaa gatcatccag 900
gaactcgagt ccttcttccg tggcgcaggc tggtctgtga tcaaggttgt ttggggtcgc 960
gagtgggatg aacttctgga gaaggaccag gatggtgcac ttgttgagat catgaacaac 1020
acctccgatg gtgactacca gaccttcaag gctaacgacg gcgcatatgt tcgtgagcac 1080
ttcttcggac gtgacccacg caccgcaaag ctcgttgaga acatgaccga cgaagaaatc 1140
tggaagcttc cacgtggcgg ccacgattac cgcaaggttt acgcagccta caagcgagct 1200
cttgagacca aggatcgccc aaccgtcatc cttgctcaca ccattaaggg ctacggactc 1260
ggccacaact tcgaaggccg taacgcaacc caccagatga agaagctgac gcttgatgat 1320
ctgaagttgt tccgcgacaa gcagggcatc ccaatcaccg atgagcagct ggagaaggat 1380
ccttaccttc ctccttacta ccacccaggt gaagacgctc ctgaaatcaa gtacatgaag 1440
gaacgtcgcg cagcgctcgg tggctacctg ccagagcgtc gtgagaacta cgatccaatt 1500
caggttccac cactggataa gcttcgctct gtccgtaagg gctccggcaa gcagcagatc 1560
gctaccacca tggcgactgt tcgtaccttc aaggaactga tgcgcgataa gggcttggct 1620
gatcgccttg tcccaatcat tcctgatgag gcacgtacct tcggtcttga ctcttggttc 1680
ccaaccttga agatctacaa cccgcacggt cagaactacg tgcctgttga ccacgacctg 1740
atgctctcct accgtgaggc acctgaagga cagatcctgc acgaaggcat caacgaggct 1800
ggttccgtgg catcgttcat cgctgcgggt acctcctacg ccacccacgg caaggccatg 1860
attccgctgt acatcttcta ctcgatgttc ggattccagc gcaccggtga ctccatctgg 1920
gcagcagccg atcagatggc acgtggcttc ctcttgggcg ctaccgcagg tcgcaccacc 1980
ctgaccggtg aaggcctcca gcacatggat ggacactccc ctgtcttggc ttccaccaac 2040
gagggtgtcg agacctacga cccatccttt gcgtacgaga tcgcacacct ggttcaccgt 2100
ggcatcgacc gcatgtacgg cccaggcaag ggtgaagatg ttatctacta catcaccatc 2160
tacaacgagc caaccccaca gccagctgag ccagaaggac tggacgtaga aggcctgcac 2220
aagggcatct acctctactc ccgcggtgaa ggcaccggcc atgaggcaaa catcttggct 2280
tccggtgttg gtatgcagtg ggctctcaag gctgcatcca tccttgaggc tgactacgga 2340
gttcgtgcca acatttactc cgctacttct tgggttaact tggctcgcga tggcgctgct 2400
cgtaacaagg cacagctgcg caacccaggt gcagatgctg gcgaggcatt cgtaaccacc 2460
cagctgaagc agacctccgg cccatacgtt gcagtgtctg acttctccac tgatctgcca 2520
aaccagatcc gtgaatgggt cccaggcgac tacaccgttc tcggtgcaga tggcttcggt 2580
ttctctgata cccgcccagc tgctcgtcgc ttcttcaaca tcgacgctga gtccattgtt 2640
gttgcagtgc tgaactccct ggcacgcgaa ggcaagatcg acgtctccgt tgctgctcag 2700
gctgctgaga agttcaagtt ggatgatcct acgagtgttt ccgtagatcc aaacgctcct 2760
gaggaataa 2769
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-5-KpnI
<400> 27
gatggtacca ccccagaaac atcccagc 28
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-3 NdeI
<400> 28
cgatcatatg gagtgtttcc tttcgttggg 30
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 117-F
<400> 29
ccacagccga caggatggtg a 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 117-R
<400> 30
ctcagggtgt agcggttcgg t 21
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> leuB-5-cimA
<400> 31
ttgttgaatt aatctagagg tgacacccca gtgg 34
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> leuB-3-leuC
<400> 32
tcgcagctgc caccgatatt tagctttgca gcgc 34
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> leuC-5-leuB
<400> 33
gcgctgcaaa gctaaatatc ggtggcagct gcga 34
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> leuD-3-XbaI
<400> 34
tggcggccgc tctagagctt tcgctatcag actg 34
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cimA-5-NdeI
<400> 35
gcatcatatg atggtaagga tattc 25
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cimA-3-XbaI
<400> 36
cgatctagat taattcaaca acatgtt 27
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA-5-XbaI
<400> 37
gcatctagag aacacggaca atgccac 27
<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA-Del-R
<400> 38
caaacagcgt gatgtcctga gtgagctgcg ct 32
<210> 39
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA-Del-F
<400> 39
agcgcagctc actcaggaca tcacgctgtt tg 32
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA-3-XbaI
<400> 40
gcatctagaa cctgcggcac accttgggc 29
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Topo-F
<400> 41
gcagtgagcg caacgcaat 19
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Topo-R
<400> 42
cgttgtaaaa cgacggcca 19
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CFilvA
<400> 43
gatctgtgat gaggtgatg 19
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRilvA
<400> 44
cgtccttcca tgactctca 19
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC-5-KpnI
<400> 45
tgaggtaccc atgcgattgt taatgc 26
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> asd-3-SfoI
<400> 46
ctaggcgcca gtgtagcact caagcgga 28
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hom-5-BamHI
<400> 47
ctaggatccc tcaccattct caatggt 27
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> thrB-3-BamHI
<400> 48
ctaggatccg ccttccttgt tgggc 25
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> thrC-5-SpeI
<400> 49
tgcactagtg agaacataca ggttcca 27
<210> 50
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> thrC-3-ilvA
<400> 50
ggcattgtcc gtgttcttac ttcacggaag tg 32
<210> 51
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA-5-thrC
<400> 51
cacttccgtg aagtaagaac acggacaatg cc 32
<210> 52
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA-3-SpeI
<400> 52
tgcactagta cctgcggcac accttgggc 29

Claims (12)

1.一种用于生产L-异亮氨酸的方法，其包括：
在培养基中培养包括具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质的棒状杆菌属的微生物；和
从所述微生物或培养基获得L-异亮氨酸。
2.权利要求1所述的方法，其中所述柠苹酸合成酶衍生自甲烷球菌属的微生物。
3.权利要求1所述的方法，其中所述柠苹酸合成酶具有选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的方法，其中所述棒状杆菌属的微生物进一步包括增强活性的3-异丙基苹果酸脱氢酶和3-异丙基苹果酸脱水酶。
5.权利要求1所述的方法，其中所述棒状杆菌属的微生物进一步包括灭活的丙酮酸脱氢酶。
6.权利要求1所述的方法，其中在培养所述棒状杆菌属的微生物中进一步提供醋酸盐。
7.权利要求1所述的方法，其中所述棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌。
8.一种具有L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌属的微生物，其中所述微生物包括具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质。
9.权利要求8所述的微生物，其中所述柠苹酸合成酶具有选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列。
10.权利要求8所述的微生物，其中所述微生物进一步包括增强活性的3-异丙基苹果酸脱氢酶和3-异丙基苹果酸脱水酶。
11.权利要求8所述的微生物，其中所述微生物进一步包括灭活的丙酮酸脱氢酶。
12.权利要求8所述的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。
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